酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略 67页

中国科学院大学UniVersityofChineseAcademyofSciences硕士学位论文2013年5月 StrategyforimproⅥnger90sterolproductionfrommolassesby勋c拍口加彬妒卵cP陀怯渤PByShaojieWrangAThesisSubmittedtoTheUniversi够ofCllineseAcademyofSciencesInpartial伽fmmentofthereqllirementForthedegreeofMasterofBiologicalEngineeringInstituteofMicrobiologyMay’2013 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文不包含任何其他个人或集体已经发表或未发表的成果、数据或撰写过的科研成果，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书己使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。申请学位的论文与资料若有不实之处，本人愿承担一切责任。学位论文作者签名：王纭方yJ己年箩月魄日学位论文使用授权声明本人完全了解中国科学院大学及微生物研究所关于提交、保存和使用学位论文的规定。同意研究所保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸制版和电子版，允许论文被查阅和借阅；论文保存单位及借阅人有义务保护论文作者及单位的知识产权。本论文的成果归中国科学院微生物研究所所有；本人离所后发表、使用本学位论文或与本论文直接相关的学术成果时，第一署名单位仍然为中国科学院微生物研究所。(保密论文在解密后遵守此规定)作者签名：易事苗錾日期：阳哆年r月硼日导师签名：百7蛴日期．山吩年j、．月文毋日 摘要麦角甾醇是真菌产生的具有重要生物活性的代谢物，不但在真菌细胞内具有多方面的生理功能，而且还是一种具有重要经济价值的代谢产物，是生产维生素D2、黄体酮、氢化可的松、芸苔素内酯及新型抗癌药物的重要前体。麦角甾醇主要来源于酵母菌发酵。但目前国内外使用的酵母菌种麦角甾醇含量较低、发酵工艺落后是限制麦角甾醇工业生产水平的关键因素。随着对麦角甾醇合成代谢及其调控机制认识的不断深入，为通过对代谢途径改造提高酵母细胞麦角甾醇合成能力奠定了重要理论基础。在实验室前期工作中，通过综合运用传统微生物育种技术及代谢途径定向优化技术获得麦角甾醇合成能力明显提高的酵母菌YEH56(pHXA42)。为了促进该酵母菌在麦角甾醇生产中的产业化应用，本研究以制糖工业副产物一糖蜜为主要原料，对发酵培养基及主要的发酵工艺条件进行了优化。采用响应面分析法分别考察了影响酵母菌YEH560HxA42)细胞生物量、麦角甾醇含量和麦角甾醇产量的显著影响因素，发现硫酸铜、磷酸氢二钾和发酵起始pH是影响麦角甾醇产量的显著因素，建立了以麦角甾醇产量为响应值的预测模型，获得优化培养基配方，即：糖蜜83．3g／L，KH2P041g／L，K2HP041．86g／L，CuS04’5H2017．5m{∥L，FeS04’7H2013．9m{∥L，MgS04‘5H2012．3m{；／L，玉米浆10mI，／I，，起始pH6．5。利用优化培养基进行摇瓶发酵，麦角甾醇产量达到371．56mg／L，比优化前提高了29．5％。利用优化培养基在5L发酵罐进行发酵放大试验，麦角甾醇产量达到438．95mj扎，比摇瓶试验提高了18．1％；进一步比较了采用不同的pH控制策略对酵母细胞生长及麦角甾醇合成的影响，发现发酵过程pH控制在6．5左右可以明显提高细胞生物量，但对细胞麦角甾醇含量影响不大；采用pH6．5控制策略进行分批发酵38h，细胞麦角甾醇产量达到601．45mg／L，比没有pH控制的分批发酵提高了37％。在pH控制策略基础上，发酵培养基中添加氧载体液体石蜡，可以明显提高发酵中期发酵液的溶氧水平，并导致酵母菌YEH56(pHxA42)细胞麦角甾醇合成速率的提高。发酵培养基中添加3％液体石蜡，细胞麦角甾醇含量提高了16．4％，T 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略麦角甾醇产量提高了20．4％，尤其在发酵14．22h时间段内，溶氧条件的改善，使细胞麦角甾醇合成速率达到1．75叫泡h～，是不添加液体石蜡的2．3倍分析比较了不同的糖蜜流加补料方式对细胞生长和麦角甾醇合成的影响，发现发酵过程中依据细胞生长规律，采用糖蜜变速流加补料策略，对酵母菌YEH56(pHⅪ蚪2)细胞生长和麦角甾醇合成均有明显的促进作用，发酵38h，麦角甾醇产量达到1953．85m∥L，是分批发酵的3．2倍，而且麦角甾醇产率比分批发酵提高了42．7％。本研究综合采用培养基配方优化、发酵过程pH恒定控制、改善溶氧水平及底物变速流加补料策略，使酵母菌YEH56(pm【A42)麦角甾醇产量和产率明显提高，将为进一步的工艺放大和产业化应用提供重要的理论参考与依据。关键词：酿酒酵母，糖蜜，麦角甾醇，响应面分析法，发酵工艺优化II 摘要AbstractS廿ategiesforimproviIlgergostcr01produ曲n舶mmolassesby勋c幽口加删c船ce俐iSineW．angShaojie(BiologicalengiIleeriIlg)D沁ctedbyDr．HeXiupir培Ergost锄lisaniInportantmetaboliteproducedbymngi，whichw11ich旬lfilsseveralessentialfIlnCtionSiIlstructl鹏meml)rane，suchasnuiditMp踟[IleabilityandthcactiVityofnlenlbr锄eboundprote豳．E玛oSterolisalsoaneconoIIlicallyhnport狃tmet籼1ite，whiChiswidelyusedastheprecursorofVit眦iIlD2，thcmaillmaterialforproduCtionofsteroldmgs(suchasconisone，progesteroneandanticancerdrugs)andthe危edadditive．Indust渤lproductionofe唱oster01ismmyperfomedbyeukaryoticIIlicrobialfementation．AInongthemI培i，-铴c幽口加，，吵c酷c口肥1，妇砌eisthedomillantproducerof鹕oster01．Lowergosterolcontenti11industrialyeaststr咖sa11dtlleine伍ciem佗rmentationprocessarethema证limiting自ctors如rpresentiIl(1ustrialproductionofe玛oster01．Theh远he唱osterol-produciI培&cP彤V括肠eⅦH56(pHXA42)wascoIlstmctedi11ourpreviousstu以ToiIIlproVetheproductionofergosterolby＆cP陀1，括施eⅦH56(pHXA42)的mmolasses，ache印觚dregenerativematerial，iIiff硪ntstrategieswere印pliediIlthisstu蚵Firstly，P1ac；kett．BllImaniIes远nwasusedtoscreenthes培nif记ant伍ctorSiIlfermentationInediumusillgbiomass，e糟osterolcontentandergosterolyieldastherespoIlseValuesrespectiVely．№ngthetestedVar讪1es，CuS04，K2HP04and础ialpHwereprovcdtobethedominam血ctorsfore玛osterolyield．ApredictivemodelwasconStmcted南rergosterolyieldbyreSponsesurfacemethod0109y．Theergosta．olyieldreached371．56m∥LbyusingtheoptiIllalferInemationmedium(m01asses83．3g／L，KH2P041g／L，K2HP041．86g／L，CuS04‘5H2017．5叫L，FeS04‘7H2013．9mg／L，MgS04’5H2012．3n耀皿，comste印liquor10IIll儿，iIlitialpH6．5)iIlⅡI 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略shake-naskculture，whichwasiIlcreasedby29．5％comparedwiththeinitialcuhure．Second堍诧mentationwasconductedin5LbioreactorusiI培theoptin：lalmedium，438．95mg／Lofe略oster01wasobtailled，whichwasillcreasedby18．1％coInparedwiththeshake-flaskculture．ApH—controlstrategywasusediIl5Lbioreactor，e玛osterolyieldreached601．45mg／L，whichwasiIlcreasedby37％whencomparedwithf．ememationwithoutpHcOntr0LThedissolvedoxygeninfermentationbrothwasiInproVedla玛elybyadditionofliquidparaff．m，whichledtotheobviousiIlcreaseofe玛oster01bios皿hesisiIlyeastYEH56(pHⅪⅥ2)，aIldthee唱osterol姐eldwasincreasedby20．4％．ThirdUthee略osterolproductionwasiIllproVedmrtherbyusiIlgmolassesfeedingstrategy．Af【er38h诧mentationusiIlgm01assesfeediIlgstrategywithVariablefeediIlgspeed，e唱oster01)rieldreaChed1953．85m∥L，whichwas3．2tiInesofthatiIlbatch诧加∞ntation．Meanwllile，e昭oster01productionratewasincreaseby42．7％comp锄狙withthebatchcunure．Di任Ierentstrategieswcreamlyzedandcomparedinthis咖dytoiInproVethee昭osterolproductionof＆ce陀1，西砌eYEH560HXA42)usillg11101assesasthemiIlmaterial，whichwilldirecttheapplicationofYEH56(pHXA42)iIlcommercialproductionofe唱oster01．Keywords：勋cc五日m删c钌cP陀V西施e，Molasses，Er90sterol，Responsesu】而cemethodology，0ptirIlizationoffementationconditionsⅣ 目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IAbs仃act⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．ⅡI第一部分引言及文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1弓I言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1第一章麦角甾醇的生物功能及其应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．1麦角甾醇的生物功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2麦角甾醇的应用价值⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4第二章酵母菌麦角甾醇生物合成途径⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52．1从乙酰辅酶A到甲羟戊酸⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52．2从甲羟戊酸到焦磷酸法呢酯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．62．3从焦磷酸法呢酯到麦角甾醇⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6第三章提高酵母菌麦角甾醇产量策略⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．83．1优良菌株的选育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯83．2发酵条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93．2．1培养基配方优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．93．2．2发酵工艺参数优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11第四章响应面分析法及其应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯134．1响应面分析法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．134．2响应面分析法在微生物发酵条件优化中的应用⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14第五章本研究的目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14第二部分研究工作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16第一章实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．1．1菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．161．1．2培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯161．1．3试齐0⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．161．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．17 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略1．2．1糖蜜中总糖含量的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171．2．2酵母菌发酵培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯181．2-3细胞生物量的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．2．4麦角甾醇的提取与测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．2．5麦角甾醇产量的计算⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．2．6发酵液中残糖和乙醇的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20第二章实验结果和讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．1酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的培养基优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2l2．1．1单因素试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．1．1．1糖蜜糖浓度对细胞生长和麦角甾醇合成的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯212．1．1．2氮源对细胞生长和麦角甾醇合成的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1．1．3无机盐对细胞生长和麦角甾醇合成的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1．2响应面分析法优化发酵培养基配方⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232．1．2．1以细胞生物量为响应值的Placke仕-B删mn试验设计及结果分析⋯⋯⋯⋯232．1．2．2以麦角甾醇含量为响应值的Plack甜．B1】瑚an试验设计及结果分析⋯⋯⋯252．1．2．3以麦角甾醇产量为响应值的响应面试验设计及结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2发酵罐水平的发酵条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．332．2．1发酵罐水平的优化验证试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．2．2pH对酵母菌细胞生长和麦角甾醇合成的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．2．3溶氧水平对酵母菌细胞生长和麦角甾醇合成的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．2．4底物流加补料方式对酵母菌细胞生长和麦角甾醇合成的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41结论与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．45致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．57II 第一部分引言及文献综述引言甾醇类化合物广泛存在，在许多生命过程中扮演着重要的角色。麦角甾醇是丝状真菌和酵母菌中的主要甾醇，它不但负责细胞膜的多种生物学功能，还是细胞内多种生物学过程的重要调控因子，因此被称为酵母细胞的“Honnone"。更为重要的是，麦角甾醇及其生物合成途径中的一些中间体是具有重要经济价值的代谢产物。在传统医药工业中，麦角甾醇主要作为维生素D2的前体及合成甾体类激素药物的主要原料。而近年来的研究发现了其新的功能，麦角甾醇的氧化产物对一些致病菌具有抑制活性，其中的四羟基甾醇具有明显的抗肿瘤活性【1】。一些具有抗HIV活性的化合物是麦角甾醇的结构类似物【2】。因此麦角甾醇是开发新型抗癌药物和抗爱滋病药物的重要前体物，具有非常广阔的应用前景。麦角甾醇主要有两个来源，一是从丝状真菌发酵后的废菌丝体中提取【31，但由于麦角甾醇含量很低，提取成本很高，而且环境污染的压力大，影响了规模化生产。酵母菌发酵则是麦角甾醇的主要来源，在众多的酵母菌中，以酿酒酵母(勋c幽口加聊yc嚣cP馏1，括妇e)麦角甾醇的含量最高【4】，因而成为发酵法生产麦角甾醇的优选菌种。但目前国内外生产上使用的酵母菌种麦角甾醇含量较低(1．5．2．0％)、发酵工艺落后，是限制麦角甾醇生产的主要因素。在麦角甾醇高产菌株的选育中，传统的微生物育种技术，如诱变、原生质体融合和细胞杂交等【5】，曾发挥了重要的作用。但随着对麦角甾醇生物合成途径的遗传学基础及相关的代谢调控机制了解的不断深入，通过分子育种技术调控麦角甾醇生物合成关键基因的功能成为定向改变代谢流的有效手段。本研究组在国内率先开展了麦角甾醇高产酵母菌的分子育种技术，发现催化代谢途径最后两步反应的甾醇C．24(28)还原酶(ERG4编码产物)和甾醇酰基转移酶(么兄融编码产物)活性提高可以显著增强细胞合成麦角甾醇的能力[6，7】，在此基础上，结合传统的杂交育种技术，获得麦角甾醇产量指标比原始菌株有明显提高的重组酵母菌。优良特性的呈现是菌株遗传特性和环境因素共同作用的结果，培养基组分及发酵条件对细胞生长和麦角甾醇合成均有重要 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略的影响[81，通过发酵条件的优化可以使菌株具有的优良特性得到充分的展现，实现麦角甾醇产量的提高。以葡萄糖和酵母粉等为主要原料的发酵条件优化已有较多报道[5，9，101。但通常情况下，发酵培养基约占发酵成本的50％，实现廉价、可再生原料的替代是新型发酵工业的发展趋势【n】。糖蜜作为制糖工业的副产物，富含蔗糖、葡萄糖和果糖等碳源，以及维生素和无机盐，是发酵工业中一种经济易得的原料[12，13】。在我们前期研究中，对甘蔗糖蜜为主要原料的酵母菌发酵法生产麦角甾醇发酵条件进行了初步分析[14】。本研究将在已有工作基础上，对利用麦角甾醇高产菌株发酵糖蜜产麦角甾醇的培养基的组分和发酵过程进行进一步的优化。响应面分析法(RespollseSur也ceMethod0109MRSM)是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优条件参数，解决多变量问题的一种统计方法【1扪。本研究将以甘蔗糖蜜为主要原料，通过Plackett．Bu珊an试验设计和中心组合试验设计对酵母菌发酵产麦角甾醇培养基进行优化，结合响应面分析获得优化培养基参数；在此基础上进行5L发酵罐的发酵实验及发酵条件的进一步优化，以期为以糖蜜为主要原料的酵母菌发酵法生产麦角甾醇工业化应用奠定基础。 第一章麦角甾醇的生物功能及其应用1．1麦角甾醇的生物功能甾醇是一类以环戊烷多氢菲和侧链为基本结构骨架，在C．3位上有一个羟基的化合物(图1)。甾醇类化合物只存在于真核生物中，在原核生物中藿烷类化合物的功能与真核生物中甾醇的功能类似。在不同的真核生物中都有其特异的甾醇组分，如豆甾醇和谷甾醇主要存在于植物中、胆固醇主要存在于动物中，而真菌中主要的甾醇类物质为麦角甾醇。甾醇作为真核生物细胞膜结构的重要组成成分，在细胞膜功能的执行过程中起着重要的作用‘16，17，181，而且不同甾醇之间可以进行功能替换，但每种甾醇又具有独特的生理功能，这种特殊功能与甾醇结构密切相关【19，201。H甾醇基本骨架麦角甾醇结构图1甾醇基本骨架及麦角甾醇结构Fig．1Generals眦nlreofstefolsandspecifics缸1lctIlreofel苫ostefol麦角甾醇作为酵母菌的主要甾醇成分，可以通过与磷脂的结合稳定膜结构，并且具有调控膜结构流动性、通透性、与膜结合酶的活性，以及物质运输等方面的功能‘21，22’23】；还以酯类的形式存在于细胞质的脂肪滴中，作为酵母细胞甾醇的备用库，维持酵母细胞内甾醇的平衡【81。麦角甾醇可以通过影响与膜结合的ATP酶的活性，进而影响细胞对营养物质的吸收与利用，通过调节细胞膜的流动性影响到磷脂转移酶的转移效率【241。有研究表明酵母细胞膜上麦角甾醇含量的高低与细胞对外界不良环境的抵抗力有重要关系[251。应用酵母菌甾醇缺陷突变株进行的研究表明具有特定结构的甾醇对细胞内 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略多种生物学过程具有调控作用[26，27，281。麦角甾醇可以提高磷脂酰肌醇磷酸的合成，并提高细胞增殖速率，而甾醇缺失细胞生停止长，锁定在不长芽的G1期，当补充一定量的麦角甾醇后，一种与劳斯肉瘤病毒的转化蛋白pp60v’泓具有抗原相关性的蛋白激酶被激活，细胞恢复发芽和增殖，表明麦角甾醇参与了与细胞周期调控有关的蛋白激酶介导的信号转导过程[29，301。此外，麦角甾醇对DNA复制、线粒体内腺苷酸转运蛋白的功能和ATP的形成均有调控作用【31，321。因此麦角甾醇是酵母细胞生命活动所必需的代谢产物。1．2麦角甾醇的应用价值麦角甾醇的生物合成不仅是酵母菌生长发育所必需的生物学过程，而且麦角甾醇还是具有重要经济价值的代谢产物。首先，麦角甾醇经紫外线照射可以转化为维生素D2，因此是合成维生素D2的前体【331，维生素D是哺乳动物生长发育所必需的维生素，是预防和治疗佝偻病、软骨病、龋齿、手足抽搐症、甲状旁腺功能衰退及老年骨质疏松症的重要药品【34，351，而且在预防心脏病、高血压[36】、精神分裂症及多种癌症等方面具有重要作用[37】，因此在药品、食品和饲料添加剂等领域有着非常广泛的应用【38】。麦角甾醇还是生产氢化可的松、黄体酮、芸苔素内酯等甾醇类药物的重要原料。Subbiall等的研究表明麦角甾醇或其氧化产物对人乳腺癌细胞的生长有明显的抑制作用，而对正常细胞的生长抑制不明显[391。Russo等研究发现麦角甾醇的过氧化物在微摩尔水平对人类前列腺癌细胞LNCaP和DU．145的生长就表现出较为明显的抑制作用。进一步的研究发现，在麦角甾醇过氧化物的作用下，两种细胞中的天冬氨酸水解酶的活性显著提高，而该酶活性与细胞凋亡密切相关，从而造成LNCaP和DU．145细胞的细胞膜发生裂解，DNA碎片明显增多，引发细胞的凋亡【40】。毗eiT等从食用蘑菇中提取了脂溶性物质，并将该物质以0．1I吲IIlL的浓度水平添加到人类白血病细胞HL60的细胞培养基中，检测发现HL60细胞出现了细胞膜裂解、核酸降解等细胞凋亡的现象；通过核磁共振和质谱分析的方法发现该脂溶性物质为麦角甾醇的过氧化物[4l】。上述研究表明麦角甾醇不仅是非常重要的传统医药中间体，而且是开发新型抗癌药物的重要原料。另外麦角甾醇及其生物合成途径是许多抗真菌药物的作用靶点，对抗真菌药4 第一章麦角甾醇的生物功能及其应用物的筛选具有重要意义【42】。如制霉菌素和两性霉素B等多烯类抗真菌药物，通过与细胞膜上的麦角甾醇锚定，使细胞膜的通透性发生改变，导致细胞的死亡[43舭】。氮唑类抗真菌药物主要通过影响甾醇C．140【去甲基化酶的活性和功能，使羊毛甾醇C．14位去甲基化的反应受阻，导致麦角甾醇合成减少，从而影响真菌细胞膜的流动性和细胞活性【451。麦角甾醇合成途径中的角鲨烯环氧化酶催化角鲨烯环氧化成为2，3．氧化角鲨烯，该反应是麦角甾醇合成途径中重要的限速步骤。角鲨烯环氧化酶受到丙烯胺类化合物的抑制，麦角甾醇的生物合成途径被阻断，细胞因不能合成麦角甾醇而失去活性【46’4刀。因此酵母菌中麦角甾醇及其合成途径是抗真菌药物筛选及其作用机制研究的重要模型系统。第二章酵母菌麦角甾醇生物合成途径酵母菌作为最简单的真核生物，尽管与其他高等真核生物相比合成的甾醇终产物不同，但其基本的代谢途径是相似的，相关基因间具有高度的同源性，可以实现功能的互换，因此酵母菌，尤其是酿酒酵母，是研究甾醇生物合成途径及其调控的理想模式系统。甾醇的生物合成过程非常复杂，以麦角甾醇为例，至少涉及23步反应，需要25种酶的参与；同时还是一个高度耗能的生物学过程，每形成一分子的麦角甾醇至少需要消耗24个ATP和16个NADPH分子【48】。所有真核生物甾醇类物质的合成都是从乙酰辅酶A(乙酰CoA)起始的。酵母菌中，从乙酰CoA到麦角甾醇的生物合成途径可以分为三个阶段，分别发生在细胞内不同的位置。2．1从乙酰辅酶A到甲羟戊酸两分子乙酰CoA在乙酰乙酰CoA硫解酶(E玛10p)的催化下生成乙酰乙酰CoA，这一步骤是在液泡中进行的；乙酰乙酰CoA与乙酰CoA在甲羟戊二酸单酰CoA(HMG．CoA)合成酶(E玛13p)催化下生成HMG．CoA，而后在HMG．CoA还原酶(HIn91p，Hm92p)的作用下生成甲羟戊酸，这两个反应发生在线粒体中(图2A)。上述反应中，删G．CoA还原酶催化的是甾醇生物合成途径中一个非常重 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略要的限速步骤，酶活性受到多种因子的调控，如终产物麦角甾醇的反馈抑制H91、葡萄糖和不饱和脂肪酸的诱导激活瞪01、内质网蛋白降解机制的调控[511、以及血红素对基因表达的激活【521等。2．2从甲羟戊酸到焦磷酸法呢酯从甲羟戊酸到焦磷酸法呢酯共有6步反应，全部在胞液中进行【541，分别被甲羟戊酸激酶(E唱12p)、磷酸甲羟戊酸激酶①玛8p)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(E玛19p)、异戊烯二磷酸异构酶(Idilp)、拢牛儿焦磷酸合成酶(E玛20p)和焦磷酸法呢酯合成酶(E玛20p)所催化(图2B)。焦磷酸法呢酯是生物体内一个非常关键的代谢中间产物，可以在不同酶的催化下，启动不同的合成代谢途径，是生物体内合成甾醇、苯醌、血红素和多萜醇等代谢产物的共同中间体。焦磷酸法呢酯的合成受到抑制会导致细胞不能合成很多重要的代谢产物而导致细胞的死亡。在焦磷酸法呢酯合成缺陷的酵母菌株中，40％的焦磷酸法呢酯合成酶活性得到恢复就可以满足细胞正常生长的需要，当焦磷酸法呢酯合成酶的活性从20％降到3％时，细胞中麦角甾醇的含量基本不变，但是细胞生长的延滞期变长，细胞生物量明显下降【551。提高酵母细胞中焦磷酸法呢酯合成酶活性则使细胞麦角甾醇含量提高32％[56】。2．3从焦磷酸法呢酯到麦角甾醇从焦磷酸法呢酯到麦角甾醇共有15步酶催化反应，首先在角鲨烯合成酶(E玛9p)催化下，以NADPH为辅酶，两分子焦磷酸法呢酯缩合成角鲨烯，然后在角鲨烯环氧化酶(E玛1p)、羊毛甾醇合成酶①e97p)、甾醇C．14去甲基化酶(E唱11p)、甾醇C-24甲基转移酶(E玛6p)、甾醇C．8异构酶①玛2p)、甾醇C．5去饱和酶(E唱3p)、甾醇C-22去饱和酶(E玛5p)和甾醇C一24(28)还原酶(Er94p)的催化下，经过一系列甾醇中间体形成终产物麦角甾醇，上述反应主要在内质网完成(图2C1。 第二章酵母菌麦角甾醇生物合成途径ABC图2酵母菌麦角甾醇生物合成途径及其相关基因[53】Fig2Biosymh舐cpanlwayofergosterolin勋cc^口，D叼，c嚣傀，洲西缸e7 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略在上述反应中，有些是麦角甾醇合成途径的限速步骤，这些步骤反应活性的提高对细胞麦角甾醇合成的影响可能与其在代谢途径中的位置有关。职G』J『基因编码甾醇C．14去甲基化酶，该基因高表达对细胞麦角甾醇含量的影响并不明显，但酵母甾醇、表甾醇等中间体的含量都有所提高[57，581。ERG6基因编码的甾醇C．24甲基转移酶催化酵母甾醇的甲基化反应生成粪甾醇，该基因高表达使酵母细胞粪甾醇、表甾醇和麦角甾醇的含量提高；但编码甾醇C．8异构酶的职G2基因高表达对麦角甾醇合成却产生了抑制作用【59】。职G5编码甾醇C．22去饱和酶活性提高导致细胞麦角甾醇含量降低，但中间体甾醇组分如酵母甾醇、羊毛甾醇、表甾醇均有所增加[60】。ERG4编码的甾醇C一24(28)还原酶催化麦角甾醇合成途径最后一步反应，该基因高表达可以明显提高细胞麦角甾醇含量【6】。通过研究不同基因高表达后对细胞甾醇组分和含量的影响将为代谢途径的全局调控和改造提供重要的理论指导。第三章提高酵母菌麦角甾醇产量策略3．1优良菌株的选育优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键。麦角甾醇主要存在于酵母菌和丝状真菌中，但丝状真菌中麦角甾醇含量较低[4，611，因此工业化应用的潜力不大。酵母菌发酵法是麦角甾醇的主要工业生产方式。在众多酵母菌中，以酿酒酵母麦角甾醇合成能力最强。麦角甾醇产量同时受到酵母细胞生长速率和细胞麦角甾醇合成能力的影响，在野生型酵母菌中细胞生长与麦角甾醇合成之间常表现出一种相互制约的关系，即细胞生长速率高的酵母菌合成麦角甾醇的能力较低，而麦角甾醇合成能力较强的酵母菌细胞生长速率较低[5"91。因此采用自然筛选的方式很难获得麦角甾醇高产的酵母菌株。传统的微生物育种技术(如诱变、细胞杂交、原生质体融合等)可以在保留菌株优良特性的基础上提升目标性状或整合亲株所具有的优良特性，因此在麦角甾醇高产酵母菌株的选育中发挥了重要作用。王纪等通过离子注入诱变的方法筛选到麦角甾醇高产的酵母菌株，细胞生物量与出发菌株相比下降了5％，麦角甾醇含量提高了65％，麦角甾醇产量比出发菌株提高了55％【62】。本实验室利用原生质体融合技术、细胞群体杂交技术获得麦角甾醇 第三章提高酵母菌麦角甾醇产量策略产量分别是原始亲株1．5和1．9倍的酵母菌株【63】。随着对麦角甾醇生物合成途径的遗传学基础及相关的代谢调控机制了解的不断深入，通过调控麦角甾醇生物合成途径关键基因的表达水平成为定向改变甾醇合成代谢流的有效手段。TecllnischeUniversitatBerlin大学的研究者通过在酵母细胞内过量表达除去氨基端跨膜序列的截断的Ⅷ订G．CoA还原酶，不但引起中间产物角鲨烯的大量积累，同时一些甾醇中间体，如羊毛甾醇和酵母甾醇的含量也有所提高，但终产物麦角甾醇含量没有明显变化【64】；在此基础上，他们进一步提高甾醇酰基转移酶(舭2p)活性，结果使角鲨烯积累减少，而处于甾醇合成途径末端的酵母甾醇、粪甾醇、表甾醇和麦角甾醇含量均有所提高，其中麦角甾醇含量提高了32％【651。本实验室在利用细胞群体杂交技术获得麦角甾醇产量提高的酵母菌基础上，过量表达甾醇C一24(28)还原酶(E唱4p)，使细胞麦角甾醇含量提高了30．5％【6】；进一步进行甾醇C．24(28)还原酶(Er94p)和甾醇酰基转移酶(Are2p)的共表达，使细胞麦角甾醇含量比原始菌株提高了45．6％【14】。宫莉等‘66】克隆了麦角甾醇合成途径中的角鲨烯环氧化酶基因愀GJ)，该基因编码的角鲨烯环氧化酶是麦角甾醇合成途径中的限速酶，通过构建含有该基因的表达载体并转化酿酒酵母，构建了麦角甾醇基因工程菌株，结果发现，发酵16小时，细胞生物量可以达到14．34g／L，麦角甾醇含量达到3．05％。3．2发酵条件优化酵母菌株优良特性的呈现是菌株遗传特性和环境因素共同作用的结果，培养基组分和发酵条件对于酵母细胞的生长和麦角甾醇的合成均有重要的影响，并且通过发酵条件的优化可以适当的协调细胞生长和麦角甾醇合成之间的相互制约，实现麦角甾醇产量的提高。3．2．1培养基配方优化培养基为微生物细胞生长和代谢提供了基本的营养供给，其组分、各组分含量及其平衡决定着细胞的优良特性能否充分呈现。培养基组分通常主要包括碳源、氮源、无机盐等。碳既是构成酵母菌体成分的重要元素，又是产生各种代谢产物的主要原料， 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略还是酵母菌生长的能量来源，所以碳源的种类和浓度对酵母细胞的生长和麦角甾醇的合成有着重要的影响。通过酵母菌发酵法生产麦角甾醇常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉水解液和糖蜜等。Patricia等认为葡萄糖作为碳源对麦角甾醇的生产最有利【67】。目前对以葡萄糖为碳源的培养基优化已有较多研究。如江宏文等通过响应面分析法对酵母菌发酵产麦角甾醇条件进行优化时发现在葡萄糖浓度为8．97％时麦角甾醇产量最耐68】；本实验室对原生质体融合菌株的研究发现，酵母细胞生物量随糖浓度的增加而增加，但糖浓度过高对麦角甾醇合成有抑制作用，在糖浓度为12％时，麦角甾醇产量最高【69】；而对通过细胞群体杂交技术构建的麦角甾醇高产酵母菌的研究发现，不同的碳源对细胞生物量没有明显的影响，但麦角甾醇含量差异较大，以葡萄糖为最佳碳源，当葡萄糖浓度为8％时，细胞生物量达到最高，而麦角甾醇含量在葡萄糖浓度为16％时达到最高，在糖浓度为8％时麦角甾醇产量最高【63】。而对于有些酵母菌株，蔗糖、麦芽汁或玉米水解液才是麦角甾醇合成的最适碳源[70，71，721。发酵培养基组成对发酵成本有很大影响，有时会占到总成本的50％，因此研究开发廉价可再生的发酵原料是发酵工业新的发展趋势。糖蜜作为制糖工业的副产物，不但含有大量糖类，还含有维生素和矿物元素，其作为相对廉价的发酵原料己受到广泛的关注和应用。王纪等研究发现高浓度的糖蜜可以明显促进细胞生长，但细胞麦角甾醇含量有所下降【62】；黄时海等【73】的研究同样发现细胞生物量的增加与糖蜜的消耗有对应关系，但麦角甾醇的含量随糖蜜浓度的增加而降低。本实验室前期研究发现细胞生物量随糖蜜浓度增高而逐渐升高，但细胞麦角甾醇含量在糖蜜总糖为60g／L时达最高【l钔。可见，不同菌种由于遗其传特性的不同，最有利于细胞生长和麦角甾醇合成的碳源及其浓度水平也不尽相同，所以在实际应用中应根据菌种的特性来选择合适的碳源及浓度，还要综合考虑原料成本、目标产物的产量和发酵设备的利用率等方面的影响。氮是酵母细胞蛋白质和核酸的主要成分，培养基中氮源的种类和含量对酵母细胞的生长和代谢产物的合成具有重要的影响【9’741。酵母菌发酵中常用的氮源主要有硝酸盐、铵盐、氨水、尿素、蛋白胨、酵母粉、玉米浆等[751。培养基中添加氮源通常能够促进酵母细胞的生长，但不利于细胞中麦角甾醇的合成【14，63，76，77】；因此氮源种类及其添加量的合理控制对协调细胞生长和麦角甾醇合成10 第三章提高酵母菌麦角甾醇产量策略之间的关系，提高麦角甾醇产量至关重要。同时，在实际的工业发酵过程中，还要考虑所添加的氮源成分对于发酵液pH等控制参数的影响。无机盐对于微生物有着重要的生理作用，如构成菌体成分，作为酶的激活剂，调节渗透压等。在麦角甾醇生物合成途径中，镁离子是甲羟戊酸(删激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的激活剂，在培养基中添加镁盐，对酵母细胞的生长及麦角甾醇的合成均有促进作用【66，69，781。铜离子能够诱导甾醇合成途径中嬲J基因的表达[79】，培养基中添加硫酸铜可以提高细胞甾醇合成能力【801。此外，铁离子、磷酸根离子等对酵母菌细胞生长及麦角甾醇合成均有一定的影响【78】。3．2．2发酵工艺参数优化3．2．2．1温度对细胞生长及麦角甾醇合成的影响温度对微生物的生长和发酵有着重要的影响，不同的微生物均有其最适的生长温度。发酵过程中，温度还可以通过改变发酵液的溶氧而对发酵效率产生影响。酵母菌发酵法产麦角甾醇通常在30℃左右进行，温度的小范围变化，对细胞生长和麦角甾醇合成没有明显影响【62"69，701。在40℃高温条件下，角鲨烯和甾醇的合成量只有在最适温度下的32％～35％，高温下，角鲨烯的环氧化作用，羊毛甾醇的脱甲基过程，麦角5，7，24(28)．麦角三烯醇的还原过程都受到阻碍，导致从角鲨烯到麦角甾醇的合成途径关闭【81】。3．2．2．2pH对细胞生长及麦角甾醇合成的影响pH是微生物生长和产物合成非常重要的参数。发酵过程中控制一定的pH不仅能保证微生物细胞的正常生长，还可以被用来防止发酵过程中杂菌的污染。如酵母菌的最适pH范围为3．8～6．O。同一种微生物在不同pH条件下生长繁殖，产生的发酵产物也会有所不刚82】。pH对酵母菌生长和麦角甾醇合成的影响具有菌株特异性。对于职GJ基因高表达的基因工程菌株(YDH／pQ姬1．SCERGl)，pH对酵母细胞生物量无明显影响，但是对麦角甾醇含量影响较大，pH值在6．5时麦角甾醇含量最高【661。许旭萍‘701在研究无名球拟酵母生产麦角甾醇时同样发现pH对酵母细胞生物量影响不大，而麦角甾醇合成的最适pH值为5．5。本研究室】】 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略【63】在对采用原生质体融合方法构建的麦角甾醇高产菌株研究发现，当发酵培养基初始pH为6．0时，所用酵母菌麦角甾醇含量最高，而细胞生物量在pH为6．5时达到最高。在红酵母菌中，pH对于菌体中脂质的积累有明显影响，培养基pH从3．O升高到6．0时，麦角甾醇含量降低了30％【83】。3．2．2．3溶氧对细胞生长及麦角甾醇合成的影响在许多发酵过程中，通气速率是影响微生物细胞生长和代谢产物合成的关键影响因素之一【84】。酵母菌中麦角甾醇的合成途径是一个需氧过程[851，角鲨烯环氧化酶(E玛1p)、羊毛甾醇合成酶(Ee97p)、甾醇C-14去甲基化酶(E略11p)和甾醇C．22去饱和酶(Er95p)催化的反应均需要分子氧的参与【861。微生物一般只能利用溶解于液体中的氧，而氧在水中的溶解度很低，因此，溶氧成为发酵过程中重要的控制因素。在对数生长期，即使发酵液中的溶氧能达到100％空气饱和度，如果此时终止氧气的供应，那么发酵液中的溶氧可以在几分钟之内消耗完，使溶氧成为限制因素。在发酵过程中，提高搅拌速度是提高溶氧的有效措施，调节补料速率也可以调节发酵罐中的溶氧水平。对于不同的发酵菌株，其在合成麦角甾醇时对氧的需求也有所不同。谭天伟等[87，881研究发现采用溶氧控制脉冲分批补料的方法可以显著提高麦角甾醇的产量，相比于其它控制方法，麦角甾醇产量平均提高了20％。3．2．2．4补料方式对麦角甾醇发酵的影响补料发酵(Fed．BatchFementatioll)就是指在分批发酵的过程中，间歇或连续地补加含有限制性营养成分的新鲜培养基。早期的补料方式完全是凭经验进行的，即发酵到一定时间，经验性的向发酵培养基中添加一定量的营养物质。这种补料方式的特点是补料成分简单、补加的数量少，操作上简单易行，但是这种方式往往无法有效控制发酵。合适的补料工艺能够有效的控制微生物的代谢过程，使之向着有利于代谢产物积累的方向发展。补料发酵工艺有利于降低培养基中有毒底物对菌体生长的抑制、解除高浓度营养物和分解代谢物引起的阻遏作用、实现菌体的高密度培养[89"901，同时有利于对发酵过程pH控制、发酵液黏度、氧传递系数等物性系数的控制。谭天伟等【87】比较了不同补料方式对酵母菌发酵产麦 第三章提高酵母菌麦角甾醇产量策略角甾醇的影响，发现采用恒速补料方式，基质流加速率保持在中等流加速率不变，在这种补料方式下，由于发酵初期细胞生物量较低，而发酵液中糖含量相对较高，造成细胞呼吸作用剧烈，还会造成基质抑制。而在发酵后期，由于细胞生物量较高，而糖含量相对较低，又无法满足细胞的生长代谢需求：采用恒残糖反馈补料方式，由于无法实时测定发酵液中的糖浓度，所以补料存在一定的滞后性，酵母细胞的生长趋势跟预测的不太一致；采用指数补料模式，在发酵前期，酵母细胞生物量与麦角甾醇含量均有很大的提高，但是由于后期菌体浓度较大，而由于设备的转速和通气量不可能无限制的增大，所以造成发酵液中的溶氧不足，限制了酵母细胞生物量和麦角甾醇含量的增加。何秀萍等【14】利用糖蜜补料分批发酵使麦角甾醇产量达到一般分批发酵的3．1倍。可见，采用合适的流加补料方式对提高麦角甾醇发酵产率有重要意义，但对不同的酵母菌而言，最佳的补料方式也不尽相同，因此需要从菌株的特性和目标产物的合成两个方面综合考虑，确定最佳的补料方法。4．1响应面分析法第四章响应面分析法及其应用响应面分析法(】RJesponseSurf．aceMethod0109y"R-sM)是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优条件参数，解决多变量问题的一种统计方法【l51。它包括实验设计、建模、因子效应评估以及寻求因子最佳水平等步骤。响应面分析法一般首先通过P1ackett．B1】咖an试验或正交试验设计等方法从众多的待考察因素中筛选出对目标产物影响达到显著水平的因素，然后采用最陡爬坡的方法大致确定各个显著因素的最佳浓度范围，最后通过Box．BehIll【en试验设计来确定各显著影响因素的最佳水平，从而得到一个优化的最佳发酵条件。 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略4．2响应面分析法在微生物发酵条件优化中的应用目前，响应面分析法已在多种发酵过程和生物反应过程的优化中得到广泛应用。F"rancis等【9l】采用P1ackett．BWmn试验设计对影响0【．淀粉酶产量的九种营养物质进行了显著性筛选，发现大豆粉、氯化钙和硫酸镁为显著影响因素；并采用响应面分析法确定了孵化温度、基质湿度和装液量的最佳水平。在优化的条件下，cc．淀粉酶的产量提高了20％。Nikerel等【92】采用响应面分析的方法对重组大肠杆菌发酵培养基进行了优化，确定了葡萄糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾和七水合硫酸镁的最佳浓度水平，在优化条件下，重组菌株细胞生物量是优化前的1．9倍。Vimal等【93】采用响应面分析的方法优化了产葡糖淀粉酶发酵培养基，使葡糖淀粉酶的产量提高了32％。第五章本研究的目的与意义麦角甾醇是一种具有重要经济价值的代谢产物，是合成维生素D2的前体和生产可的松、黄体酮、云台素内酯和抗癌药物等甾醇类药物的重要原料【39，941。国内外麦角甾醇的生产大多采用酿酒酵母发酵的方法。因此，对其发酵条件和发酵工艺的优化极其重要。酵母菌麦角甾醇产量同时受到细胞生长速率和细胞麦角甾醇合成能力的影响，但野生型酵母细胞生长和麦角甾醇合成之间常表现出一种相互制约的关系，细胞生长速率高的酵母菌合成麦角甾醇的能力较低，而麦角甾醇合成能力强的酵母菌细胞生长速率较低【5，9】。利用传统的微生物育种技术(如细胞杂交或原生质体融合)，并结合代谢途径的定向优化，可以在一定程度上从菌种层面突破细胞生长和麦角甾醇合成之间的相互制约，提高麦角甾醇产量【5"6】。优良特性的呈现是菌株遗传特性和环境因素共同作用的结果，培养基组分及发酵条件对酵母细胞生长和麦角甾醇合成均有重要的影响，通过发酵条件的优化可以适当协调细胞生长和麦角甾醇合成之间的制约关系，实现麦角甾醇产量的提高。以葡萄糖和酵母粉等为主要原料的发酵条件优化已有较多报道【5，9，10】。但通常情况下，发酵培养基约占发酵成本的50％，实现廉价、可再生原料的替代是新型发酵工业的发展趋势【111。糖蜜作为制糖工业的副产物，富含蔗糖、葡萄糖等碳源，以及维生素和无14 第五章本研究的目的与意义机盐，是发酵工业中一种经济易得的原料【12，13】。在我们前期研究中，对甘蔗糖蜜为主要原料的酵母菌发酵法生产麦角甾醇发酵条件进行了初步分析。本研究将在已有工作基础上，对培养基的组分和发酵过程进行更加精确的优化。响应面分析法作为解决多变量问题的一种统计方法，目前已应用于多种发酵过程和生物反应过程的优化[91，92，931。本研究将以甘蔗糖蜜为主要原料，通过P1ackett．B伽嗽n(PB)实验设计和中心组合实验设计对酵母菌发酵产麦角甾醇培养基进行优化，结合响应面分析获得优化培养基参数；在此基础上进行5L发酵罐的发酵实验及发酵条件的进一步优化，以期为以糖蜜为主要原料的酵母菌发酵法生产麦角甾醇工业化应用奠定基础。 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略1．1实验材料1．1．1菌株第二部分研究工作第一章实验材料与方法酿酒酵母勋cc办口加，缈cesce陀’，捌口eⅦH56(皿ⅨA42)，是在本实验室利用传统的细胞群体杂交技术构建的麦角甾醇高产菌株YEH．56【51中过量表达甾醇C．24(28)还原酶基因础G4和甾醇酰基转移酶基因么兄酗获得的麦角甾醇高产酿酒酵母菌株㈣。1．1．2培养基YEPD培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，溶于蒸馏水，定容至1000111L，自然pH。固体培养基按1％(w／v)加入琼脂粉。8磅，30分钟湿热灭菌。初始发酵培养基：糖蜜83．3g，磷酸1．68g，尿素2．Og，溶于蒸馏水中，用氢氧化钠调pH至5．4，定容至1000lnL。优化后的发酵培养基：糖蜜83．3g，KH2P041g，K2HP041．86g，CuS04‘5H2017．5mg，FeS04’7H2013．9n玛，MgS04‘5H2012．3mg，玉米浆10mL，溶于蒸馏水中，调pH至6．5，定容至1000IIlL。糖蜜流加补料发酵基础培养基：糖蜜41．6g，KH2P041g，K2HP041．86g，CuS04‘5H2017．5n培，FeS04‘7H2013．9n冯，MgS04‘5H2012．3Ing，玉米浆10111L，溶于蒸馏水中，调pH至6．5，定容至1000lllL。1．1．3试剂甘蔗糖蜜(含糖量为48％，w／w)购自北京市海昌鑫霖有限公司；玉米浆购自北京保乐吉生物科技有限公司；麦角甾醇标准品购自Sigma公司；其他试剂均为 第一章实验材料与方法国产分析纯试剂。糖蜜总糖含量测定试剂：盐酸溶液：6In01／L氢氧化钠溶液：5m01／L甲基红指示液：称取甲基红O．1g，用少量乙醇溶解后，定容至100mL。DNS(二硝基水杨酸溶液)：称取1g3，5．二硝基水杨酸，溶解于20mL2Ino儿的氢氧化钠溶液中，再加入30g四水合酒石酸钾钠，加蒸馏水定容至100mL，存放于避光密闭的容器中。甾醇提取用试剂：皂化试剂：50％氢氧化钾溶液(8．9Ino㈣，无水乙醇(分析纯)。萃取试剂：正庚烷(分析纯)。分析试剂：无水乙醇(分析纯)、石油醚(色谱纯)、四氢呋喃(色谱纯)。1．2实验方法1．2．1糖蜜中总糖含量的测定(1)样品处理取两份适当稀释度的样品各50mL，分别置于100IIlL容量瓶中，其中一份加入5lllL盐酸溶液，在68～70℃水浴中加热15lIlin，冷却后加两滴甲基红指示液，用氢氧化钠溶液(200㈣中和至中性，加水定容，混匀。另一份直接加水稀释至100mL。(2)葡萄糖标准曲线的制作准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，获得浓度为2mg／mI，的葡萄糖标准溶液。对标准溶液进行梯度稀释，获得浓度在0—2mg／nlL的系列葡萄糖溶液。在上述试管中分别加入1mLDNS溶液，在沸水浴中加热10I血进行显色，然后用流动水迅速冷却，并加入4IIlL蒸馏水，摇匀，测定540姗的吸光值。以葡萄糖含量(叫mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。(3)样品测定取一定量的样品处理液，用蒸馏水补体积至1IIlL，分别加入1111LDNS溶】7 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略液，在沸水浴中加热10min进行显色，然后用流动水迅速冷却，各加入4Il儿蒸馏水，摇匀，测定540m的吸光值，通过标准曲线计算样品中还原糖的浓度。(4)总糖的计算以葡萄糖为标准溶液时，试样中蔗糖的含量按如下公式计算：X=(R2-R1)×O．95其中x一试样中蔗糖含量(g／L)R2一水解处理后还原糖含量(g／L)R1一不经水解处理还原糖含量(g／L)O．95一还原糖(以葡萄糖计)和蔗糖的换算系数。1．2．2酵母菌发酵培养(1)摇瓶发酵培养从保存的菌种斜面上挑一环菌，转接到装有50IIlL种子培养基YEPD的250lIlL三角瓶中，30℃、200r／miIl培养18h，获得种子培养液；按10％(vM接种量将种子液转接到装有45111L发酵培养基的250IllL三角瓶中，30℃、200r／miIl培养36h。(2)发酵罐中分批发酵从保存的菌种斜面上挑一环菌，转接到装有5mLYEPD液体培养基的大试管中，30℃、200r／IIliIl培养16h，然后转接到200IIlLYEPD液体培养基中，30℃、200r／mill培养18h，获得种子培养液；按10％(vM接种量将种子培养液转接至装有2L发酵培养基的5．L发酵罐(上海保兴生物工程设备有限公司，上海，中国)中进行发酵，发酵温度为30℃，转速400r／min，通气量4L／I血。当测定pH控制对酵母菌ⅦH56QHⅪⅥ2)发酵性能影响时，利用NaoH和HCl对发酵过程pH进行控制。(3)发酵罐中流加补料分批发酵如上获得种子培养液，按10％(v～)接种量将种子培养液转接到装有1．8L糖蜜流加补料发酵基础培养基中，发酵温度30℃，发酵12h前转速400r／miIl、通气量4L／I山；发酵12．30h，转速550r／miIl，通气量6L／mill；发酵末期恢复到初期转速和通气量。流加底物为含糖量300g／L的糖蜜，分别采用恒定速度流加 第一章实验材料与方法模式和变速流加模式。1．2．3细胞生物量的测定取50IIlL培养至一定时间的菌液，6000r／Inin离心5miIl，收集菌体，用蒸馏水洗两次，离心，控干水分后，称重，然后换算成1L发酵液中的菌体量，即为菌体湿重；将菌体在60℃恒温鼓风干燥箱中烘干，直至恒重。细胞生物量为每升发酵液收获的细胞干重(g／L)。1．2．4麦角甾醇的提取与测定(1)麦角甾醇标准曲线的绘制以S培ma公司麦角甾醇为标准品，在无水乙醇中配制一系列麦角甾醇浓度的标准样品，测定标准溶液在280m的吸光值。根据测定结果绘制标准曲线(图1—1)。曼口。图1．1麦角甾醇标准曲线Fig．1—1TllestaIldardcllⅣeofergosterol(2)甾醇的提取离心收集菌体，用蒸馏水洗两次，菌体称重。准确称O．5g湿菌体，置于100IIlL蒸馏瓶中，加入10IllL皂化剂(50％氢氧化钾：无水乙醇=2：3)，88℃水浴处理3h。冷却至室温，加入等体积的正庚烷，震荡器上快速萃取5I血，室温静置20～19 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略30n血，使其充分分层。(3)紫外分光光度法测定麦角甾醇含量取0．5IIlL上层萃取液，用无水乙醇稀释10倍，混匀，测定280m的光吸收值，根据标准曲线计算样品中麦角甾醇含量，麦角甾醇含量为每克干细胞所含麦角甾醇的毫克数(叫g)。(4)高效液相色谱法(HPLC)测定麦角甾醇含量以S逸ma公司麦角甾醇为标准品，配置不同浓度系列标准溶液，利用Agilent1260LC高效液相色谱仪和紫外检测器对标准溶液进行分析。分析条件：C．18反向色谱柱(245×4．6衄，5肛m)，流动相为石油醚和四氢呋喃(85：15，V／v)，流速为1．OII“miIl。紫外检测波长为28011IIl。建立麦角甾醇浓度和峰面积标准曲线。对麦角甾醇萃取液进行适当稀释后，按上述方法测定和计算样品中麦角甾醇含量。1．2．5麦角甾醇产量的计算麦角甾醇产量由细胞生物量和细胞麦角甾醇含量两个因素决定，为每升发酵液收获的细胞中麦角甾醇的含量，单位m∥L。1．2．6发酵液中残糖和乙醇的测定残糖的测定方法同1．2．1糖蜜中总糖含量的测定。乙醇的测定主要通过SBA．40C型生物传感分析仪进行，具体如下：(1)配制lg／L的乙醇标准溶液。(2)取适量发酵液，6000r／miIl离心5miIl，取上清液稀释10倍。稀释后的溶液作为待测样品。(3)打开机器，进样灯亮后，用进样器取25此乙醇标准溶液，立即进样，若进样灯不再闪烁，说明定标完成，此时可以进行样品的测定。(4)用进样器取25此待测样品，进样，记录数据。每个样品测定三次。(5)各样品测定值乘以稀释倍数即为样品中乙醇的浓度。20 第二章实验结果和讨论2．1酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的培养基优化2．1．1单因素试验2．1．1．1糖蜜糖浓度对细胞生长和麦角甾醇合成的影响以甘蔗糖蜜为碳源，考察了不同糖浓度的糖蜜对酵母菌YEH56QHⅪⅥ2)细胞生长及麦角甾醇合成的影响，发现糖蜜糖浓度对酵母细胞生长有明显的促进作用，酵母细胞生物量随糖蜜糖浓度的提高而增加；而细胞麦角甾醇含量在糖蜜糖浓度为40g／L时达到最高，在高浓度糖蜜培养基中，细胞麦角甾醇含量明显降低(图2．1)，表明过高的糖浓度会抑制酵母菌YEH56QHxA42)麦角甾醇的合成。IBioma站．臣趸勿E唱ostemlcontentj广．广广．广2040∞801∞Sugarconc明tII曩tion(g／L)图2．1糖蜜糖浓度对细胞生长和麦角甾醇合成的影响Fig．2一lEfI的tofsuglrconcen廿ationoncell伊o、Ⅳthandel驾osterolbios)mthesisin＆ce，℃V括缸PYEH56(pHXA42)．Valuesarc删ofthreer印licatede砌eri眦nts士standarddeViation．蚰於如巧加”m，0Q／暑昌v苫3葺o。_9缸葛鱼闺^1，暑)n∞矗昌。自酋 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略2．1．1．2氮源对细胞生长和麦角甾醇合成的影响分别在总糖为40g／L的糖蜜中添加2∥L的蛋白胨、酵母粉、尿素、硫酸铵、氯化铵或10Ⅱ“L玉米浆，考察不同氮源对酵母菌YEH56QHⅪⅥ2)细胞生长及麦角甾醇合成的影响。结果发现在糖蜜中添加不同氮源对细胞生长均有一定的促进作用，以尿素、氯化铵、酵母粉和玉米浆的影响最为明显；但除玉米浆外，其他氮源添加对酵母细胞麦角甾醇的合成均产生了明显的抑制作用，使细胞麦角甾醇含量明显降低(图2．2)。综合考虑成本及产量指标，玉米浆为较适宜的氮源。柏^35篙昌30量藿zs鏊呈：oil{15bD自1050c∞n嘲u咐(NH．bso‘NH．cI1咖，tonc嘲Ex呲tcomst唧Iiqw图2．2氮源对细胞生长和麦角甾醇合成的影响Fig．2-2Eff＆tofnin．ogenaddi缸ononcell可owthaIlde唱osterolbiosynthesisin＆cP陀1，细．口PYEH5劬瞅．A42)．Valuesaremea璐ofthreer印licatedexp甜ments士standarddeViation．2．1．1．3无机盐对细胞生长和麦角甾醇合成的影响在含有10札／L玉米浆、总糖浓度为40g／L的糖蜜中，分别添加浓度为0．6皿nol／L的硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铜、氯化锰、硫酸锌、磷酸二氢钾和氯化钠，以考察它们对酵母菌YEH56(pHⅪⅥ2)细胞生长及及麦角甾醇合成的影响。从图2．3可以看出，糖蜜中添加硫酸亚铁和硫酸铜对酵母细胞麦角甾醇的合成均有促进作用，但对细胞生长表现出一定的抑制作用；添加磷酸二氢钾、氯化钙或氯化锰对酵母细胞生长没有明显影响，但使细胞麦角甾醇含量明显降低；硫酸镁、氯化钠或硫酸锌的添加对酵母细胞生长和麦角甾醇合成均没有明显影响。 第二章实验结果和讨论在麦角甾醇生物合成途径中，甲羟戊酸(㈣激酶、甲羟戊酸磷酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶等酶活性的呈现均需要镁离子的存在，本研究中，在培养基中添加硫酸镁对酵母细胞生长及麦角甾醇合成均没有明显的影响，可能是由于原料糖蜜所含有的镁离子浓度能够满足细胞生长和代谢的需要；铜离子和亚铁离子对甾醇合成途径中一些基因的表达或酶活性的呈现均有诱导作用【79’801，在本研究所用培养基中添加硫酸铜或硫酸亚铁可以提高细胞麦角甾醇合成能力，但对细胞生长表现出一定的毒性，因此需要选择合适的无机盐浓度协调细胞生长和麦角甾醇合成之间的关系，实现麦角甾醇产率的提高。con订删Mgs04啦Pu4F。sU4c“12cu踟4M叫J2№uZnsu4图2．3无机盐对细胞生长和麦角甾醇合成的影响Fig．2-3E脓tof111ineralsaltsoncellgrowmandergosterolbios州hesisin＆ce陀1，西砌PYEH56@ⅨA42)．valuesaremea璐of缸eer印licatedexp耐ments士s协ndarddeviation．2．1．2响应面分析法优化发酵培养基配方2．1．2．1以细胞生物量为响应值的Phckett．B1】彻an试验设计及结果分析1、PlaCkett．Bur眦n试验设计依据上述单因素试验结果，同时考虑到影响酵母菌生长的一般因素，本研究选取糖蜜糖浓度、硫酸镁、硫酸亚铁、玉米浆、磷酸二氢钾和初始pH值等为考察因素，每个因素取高(+1)和低(-1)两个水平(表2．1)，以酵母菌YEH56QHxA42)细胞生物量为响应值，利用Des螗n-EXpen7．1．3软件进行试验次数为N．_12的23如帖柏於∞嚣加：。m，O^曲，暑昌一苗3日ou_e甚苗。普瞄^总一器矗昌eⅢ∞ 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略P1ackctt-Bu砌an试验设计(表2．2)，每组试验设置3个重复。表2．1Plake仕．BurInan试验设计因素水平与编码1’able2-1hVelsandcodesofvariablesforP1acke仕一Bumandesi舭2、Plackett．B1】man试验结果及分析表2．2Plackett—B眦mn试验设计及结果Table2-2Expefimentaldesi伊ofPlacke伽Bu订mn锄dco玎espondingresultsRlHl蜀恐玛尼局托Biomass(g／L)7．595．526．448．055．757．825．988．747．595．755．068．74按表2．2试验设计在250IIlL摇瓶中进行发酵试验，获得不同培养基配方下24HJ0●o0●J0J0●，●0Jo●0●J123456789mn抡 第二章实验结果和讨论细胞生物量，采用DesignExpen7．1．3软件对表2．2中数据进行回归分析，得到不同影响因素的回归系数及贡献值(表2．3)，发现本试验获得模型的“Prob>F”为0．0005，通常“Prob涸”值小于O．05视为显著，说明本试验模型显著。对各考察因素而言，其“Prob涸”小于0．05，就说明对响应值的影响达到了显著水平。因此，本试验中因素噩(糖蜜糖浓度)、五(玉米浆浓度)、‰(初始pH)为影响酵母菌YEH56(pHⅪ蚪2)细胞生物量的显著因素。表2．3各因素对细胞生物量影响效果分析1’able2-3Analysisofe妇瓷tofdi任打entVariablesonbiomassi11Plackett-BurIllandesi驴经过影响因素的筛选，得到以酵母细胞生物量为响应值的多元线性回归方程：Y=6．92+1．17蜀-0．096恐一0．09饯+O．29函-0．09绒+O．25忍其中Y为酵母细胞生物量，该模型的相关系数R2=O．9783，表明97．83％的试验数据的变异性可以用此回归模型来解释；校正决定系数A由嘏2=0．9522，说明该模型相关性良好。对细胞生物量影响显著(P<0．05)的3个因素全部为正效应。2．1．2．2以麦角甾醇含量为响应值的Pkkett．BurImn试验设计及结果分析1、Plackett．Blm呦n试验设计依据上述单因素试验结果及影响酵母菌麦角甾醇合成的一般因素，本研究选取糖蜜糖浓度、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸镁、玉米浆、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略和初始pH值等为考察因素，每个因素取高(+1)和低(．1)两个水平(表2．4)，以酵母菌YEH56(pHⅪⅥ2)麦角甾醇含量为响应值，利用Des追n-Expen7．1．3软件进行试验次数为N=12的P1ackett．B1】nI】an试验设计(表2．5)，每组试验设置3个重复。表2．4Plackett．Bunmn试验设计因素水平及编码Table2-4LeVelsandcodesofⅦriablesforPlackett-Bunmndesi弘2、Pkkett．BurHlan试验结果及分析按表2．4试验设计在250111L摇瓶中进行发酵试验，获得不同培养基配方下酵母菌ⅦH56(pHXA42)的麦角警醇含量。采用DesignExpen7．1．3软件对表2．5中试验数据进行回归分析，得到各影响因素的回归系数及贡献值(表2．6)，在考察的各因素中，只有因素恐(硫酸铜)的“Prob外”小于0．05，说明硫酸铜是影响酵母菌YEH56(pHx斛2)麦角甾醇含量的显著因素。对试验结果进行分析，得到以麦角甾醇含量为响应值的多元线性回归方程：Y=18．88-1．07蜀+9．9Q噩+1．23恐+O．2瓯+O．15玛+o．3域+0．25而-0．38凰其中Y为酵母细胞麦角甾醇含量。该模型的相关系数R2为O．9914，表明99．14％的试验数据的变异性可用此回归模型来解释。校正决定系数为0．9684，表明相关性良好。显著因素硫酸铜对酵母菌ⅦH56QHXA42)麦角甾醇含量的影响为正效应。26 第二章实验结果和讨论表2．5P1acke仕．Bur蚴n试验设计和结果Table2-5Experimentaldesi弘ofPlackett—B眦mnandcorre驴砌ngresultsRun五局玛局墨拖局凰Eqgosterolcontl斌(II叫曲1．11．1l1．1128．329．576．4910．8328．0724．778．4230．628．5310．0932．6628．23表2．6各因素对细胞麦角甾醇含量影响效果分析Table2-6Analysisofe妇‰tofdi妇陆eIltvariablesone玛osterolcontentinPlackett·B1】mandesi印27●J●J●J●0o●0●Jo，●0●J●0●0●0●0J●0●0●0●0oJ●，J●o0●0●J0123456789mn屹 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略2．1．2．3以麦角甾醇产量为响应值的响应面试验设计及结果分析1、Plackett．B硼啪Ian试验设计依据上述单因素试验结果及以细胞生物量和麦角甾醇含量分别为响应值的显著因素考察试验结果，选取糖蜜、KH2P04、K2HP04、CuS04、FeS04、MgS04、玉米浆和pH为考察因素，同时设三个虚拟因素，每个因素设2个水平，以麦角甾醇产量(mjg／L)为响应值，利用Des追n-Expen7．1．3软件进行试验次数为N=12的Plackett．Bunmn试验设计，具体因素水平及编码见表2．7。表2．7Plackett．B1】man试验设计因素水平及编码1’able2-7LeVelsandcodesofVariables矗)rP1acke仕一B硼mandesi盟2、Plackett．Burman试验结果及分析按表2．8的Plackett．Bu彻an试验设计进行了12组试验，每组试验设置3个重复，获得不同试验条件下，酵母菌YEH56(pHXA42)的麦角甾醇产量。利用DesignExpen7．1．3软件对表2．8中的试验数据进行分析，发现本试验获得的模型的“Prob翘”为0．0024，说明本试验模型显著(表2．9)。 第二章实验结果和讨论表2．8Placke仕-B删mn试验设计和结果Table2-8EXperimentaldesi弘ofPlacke仕-Bunmnalldco仃espondingrcsultsRun墨施局五玛托局．，Er{弘sterolyield凰。316．28143．57206．11242．29303．69320．50171．45334．24190．59233．76322．17336．56表2．9各因素对麦角甾醇产量影响效果分析1"able2—9Analysisofe妇‰tofdi妇衙entV撕abl鼯one玛oster01)，ieldinPlacke位-Bllr|mnd韶i弘0J●J●J●J●0●0●o0J●0●0●J●oJ●o●0，J0●0●J●0J●J●J0●J●J●，o●0●0●Jo，●，0●J0J123456789mn他 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略对试验结果进行分析，得到以麦角甾醇产量为响应值的多元线性回归方程：Y=260．10-0．047噩+62．14弼+7．83恐+5．1弧汁4．29％+10．8域+6．8呱+18．81凰其中Y为麦角甾醇产量。该模型的决定系数和校正决定系数分别为O．9948和O．9811，说明相关性良好。其中影响酵母菌YEH56(pHⅪ锚2)麦角甾醇产量的显著因素为CuS04C尸=0。0002)、K2HP04(．P=0．0301)和pH(IP=0．0066)，而其他被考察因素影响不显著(表2．9)。因此选择CuS04、K2HP04、初始pH这三个因素，进一步考察其变化及相互作用对酵母菌ⅦH56(pHⅪⅥ2)麦角甾醇产量的影响。其他考察因素取Plackett．B1】man设计中的高水平。3、以麦角甾醇产量为响应值的中心组合试验设计及结果分析依据Plackett．Bunmn试验结果和Box-Behlll(en中心组合设计原理，对筛选出的显著影响麦角甾醇产量的CuS04、K2HP04和初始pH三个关键因素进行中心组合设计，3因素取3水平共设计17组试验，每组试验重复3次。各因素水平及试验结果见表2．10。利用Design．EXpen7．1．3软件对中心组合试验结果进行分析，得到以麦角甾醇产量为响应值(Ⅵ的拟合二次多项式回归方程：降343．64+13．20蜀．1．3％+3．8蹒+2．67％蜀．1．O锅咒+9．11Ⅸ15．29．02墨2．6．64恐2．2．9&恐2对回归方程进行分析(表2．11)，发现该模型极显著俨<0．o001)，多元相关系数R2=0．9805，说明98．05％麦角甾醇产量产生的变化可由此模型解释，仅有4．45％的变异不能由该模型解释(Adj．尺2=0．9555)，模型与实际情况拟合很好，可用来对响应值进行预测；模型的失拟相的P值为0．8038，大于0．05，说明失拟项不显著，表明模型拟合的较好。在模型参数中，五(CuS04)对麦角甾醇产量的线性效应极显著妒pH=6．0>pH=5．5>pH=5．0。其中发酵过程pH保持在6．5左右，有利于酵母菌YEH56(pHXA42)细胞的快速生长，不但细胞生物量在整个发酵过程中都要高于其他pH条件，而且在发酵26h时，细胞生物量就达到最高值。在pH为6．5条件下，细胞生长速率为0．51g／Lh-1，比发酵过程采用自然pH条件提高了54．4％，分别比pH控制在5．0、5．5、6．O条件下提高了21．4％、27．5％和50．4％。 第二章实验结果和讨论lO152025303540t(h)图2-6pH对酵母细胞生物量的影响Fig．2·6EfI＆tofpHonthebiomass10152025303540tm)图2．7pH对麦角甾醇含量的影响Fig．2—7E丘bctofpHonthe啷ostefolcontent不同pH条件下，酵母菌YEH56(p删2)细胞麦角甾醇含量随发酵时间的变化趋势基本相同；但在特定时间段，不同pH条件下细胞麦角甾醇含量的变化不尽相同(图2．7)。当发酵过程pH控制在6．5左右时，发酵38h，细胞麦角甾醇含量达到最高，为45．12叫g，与发酵过程采用自然pH条件相比，麦角甾醇含642O8642O^J罱v∞器暑e¨蕾∞钙∞於如筋加埒m，O(暑／暑昌v苫3目ou_2。芑。鑫J阔 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略量提高了12．6％。700600毫500昌；400∞蓄300∞§200■囡100O10152025303540tm)图2．8pH对麦角甾醇产量的影响Fig．2-8EnbctofpHontheergOster01)rleld综合前述pH对酵母菌YEH56QHⅪⅥ2)细胞生物量和麦角甾醇含量的影响，发现发酵过程pH控制在6．5左右，麦角甾醇产量在整个发酵过程均高于其他pH条件，发酵38h，麦角甾醇产量达到601．45吲L(图2．8)。与发酵过程采用自然pH条件相比，麦角甾醇产量提高了37％。pH作为发酵过程的重要控制参数，对麦角甾醇的发酵生产有着重要的影响，合适的pH控制是促进酵母菌YEH56(pHⅪⅥ2)细胞生长和麦角甾醇合成的重要策略。对提高生产效率和设备利用率，降低发酵成本具有重要意义。2．2．3溶氧水平对酵母菌细胞生长和麦角甾醇合成的影响酵母菌麦角甾醇的生物合成是一个需氧过程，其中多步反应需要分子氧的参与，因此发酵过程溶氧水平对细胞生长和麦角甾醇合成可能有重要影响。在前述pH控制试验中，发现在发酵13～2lh时，发酵液中溶氧几乎为零(图2．9)，相应地，细胞麦角甾醇含量在此时间段提高速率有所降低(图2．11)。一些有机溶剂(如液体石蜡、正十二烷、正己烷)可以作为氧载体提高发酵液中的溶氧水平【951。因此在采用pH控制策略(pH6．5)的基础上，考察了在发酵培养基中添加3％液体石蜡对酵母菌YEH56(pHⅪⅥ2)细胞生长和麦角甾醇合成的影响。 第二章实验结果和讨论10080§600盆4020O图2．9添加液体石蜡对发酵过程中溶氧的影响Fig．2—9E妇眈tofliquidparamnondissolvedoXygenconcen触don(％)“ng触ntation．Dateswerepooled丘．omⅡlreeind印endentexpenments．砌，．6口坶r印resenttheSDofthemean．在分批发酵过程中，由于在酵母细胞的指数生长期对氧气的需求量较大，而氧在水中的溶解度较低，所以在发酵过程会出现某段时间发酵罐中溶氧接近于零的状况，这种情况不仅限制了细胞的生长，而且不利于麦角甾醇的合成。在添加液体石蜡后，虽然发酵过程中溶氧变化趋势基本与没有液体石蜡相似，但发酵液的溶氧水平有了明显的改善，尤其在发酵12．21h时间段内，发酵液的溶氧可以保持在20％以上(图2．9)。添加氧载体提高发酵罐中的溶氧水平对酵母菌YEH56①HⅪⅥ2)细胞生物量并没有明显的影响，但液体石蜡的添加使酵母细胞生长速率降低了21．6％(图2．10)。添加氧载体对麦角甾醇的合成有较为明显的促进作用，发酵培养基中添加3％的液体石蜡后，酵母菌YEH56QHⅪⅥ2)麦角甾醇含量在30h时达到最高，为52．52m{扛，比不添加液体石蜡时的最高麦角甾醇含量提高了16．6％，而且麦角甾醇合成速率提高了47．1％；尤其在发酵14—22h时间段内，发酵培养基中添加液体石蜡后，酵母细胞麦角甾醇合成速率达到1．75m∥gh-1，是不添加液体石蜡的2．3倍(图2．11)。由于液体石蜡是一种惰性的有机溶剂，不参与麦角甾醇的合成，因此添加液体石蜡后发酵液溶氧状况的改善是促进酵母菌麦角甾醇合成能力提升的主要原因。 161410864t(h)图，2．10添加液体石蜡对酵母细胞生物量的影响Fig．2·l0E任．ectofliquidpam伍nonbiomass．Dat懿werepooled仔omthreeind印endent鲁邑苗尝呈2营占experiments．上》阳，．6口坶representtheSDofthem翩n．15202530t(h)图2—11添加液体石蜡对麦角甾醇含量的影响Fig．2-11E恐ctofliquidpara街nonErgosterolcoment．Dateswerepooled丘omtllreeiIldependenteXperirmnts．上》加，．6口坶r印∞senttheSDofthem既n．^1，暑v∞∞嚣昌oⅢ宙∞如∞加m0 第二章实验结果和讨论忌邑毛三2尝昏回图2一12添加液体石蜡对麦角甾醇产量的影响Fig．2-12E任融ofli删dpm衄onErgosterolproduction．D椭wercpooled舶mthreeiIldep∞dentcxp耐ments．E，．加，．施腮r印∞senttheSDofthcm％n．发酵培养基中添加液体石蜡能明显提高酵母菌YEH56(pIⅨA42)麦角甾醇产量，麦角甾醇产量在34h时达到最高，为724．34mg／L，而在不添加氧载体的情况下，麦角甾醇的产量在38h达最高，为60l。45mg几，麦角甾醇产率提高了34．8％(图2．12)。这主要是因为添加氧载体之后发酵液中溶氧状况的改善，促进了麦角甾醇的合成。2．2．4底物流加补料方式对酵母菌细胞生长和麦角甾醇合成的影响1、恒速补料分批发酵在恒速补料分批发酵时，发酵罐初始装液量为1．8L发酵基础培养基。该发酵基础培养基为利用响应面分析法获得的优化培养基。补料液为含糖量300g／L的糖蜜，在发酵开始后10h开始补料，流加速度为22m“h，直到发酵结束为止。发酵O～12h搅拌转速为400r／miIl，通气量4L／min；在12～30h，搅拌转速为550r／mill，通气量6I．／m毗发酵末期恢复到初期转速和通气量。 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略毫i叠．宝∞鲁邑苫暑呈2尝§回t(h)毫邑专至2丧章囡图2．13糖蜜恒速流加补料发酵Fig．2—13Fed．batch向mentationwimcollstantfeedrate采用恒速流加补料模式进行分批发酵，酵母菌ⅦH56QHⅪⅥ2)细胞生物量在发酵过程中一直呈增加趋势，且增长速率基本保持不变；细胞麦角甾醇含量在10～18h内增长迅速，18h后增速有所降低；至发酵38h，酵母细胞生物量达到20．77g／L，比非流加模式发酵提高了53．3％；麦角甾醇含量达到42．23m∥g，比非流加模式发酵降低了6．4％；而麦角甾醇产量达到877．09Ⅱ叫L，比非流加模式发酵提高了45．8％(图2．13)。2、变速补料分批发酵按恒速流加补料模式进行前期发酵培养，在发酵开始后5h，以10111】L／h的速度进行糖蜜(含糖量为300g／L)的流加发酵，从第10h开始糖蜜流加速度增加到20lIl】讹，直到发酵结束为止。发酵0～12h搅拌转速为400r／min，通气量4I，／m衄在12h～30h，搅拌转速为550r／miIl，通气量6L／miIl；发酵末期恢复到初期转速和通气量。定时取样、测定细胞生物量和麦角甾醇含量，计算麦角甾醇产量。图2．14结果表明，在发酵的前18h细胞生长速率较低，而细胞麦角甾醇含量迅速升高：在18．30h细胞生长速率提高，细胞麦角甾醇合成速率有所降低；继续延长发酵时间，细胞生长和麦角甾醇合成速率均有所降低，其中细胞麦角甾醇含量在发酵34h时达到最高，而细胞生物量在发酵38h时达到最高；发酵38h，酵母菌YEH56QHXA42)麦角甾醇产量为1953．85ml；／L，是采用恒速流加补料40 第二章实验结果和讨论的2．2倍，是非流加补料分批发酵的3．2倍。其中流加补料发酵试验中糖蜜到麦角甾醇的转化率为10．32mg儋、麦角甾醇产率为0．28mg儋h，均比分批发酵提高了42．7％。2．3讨论垦器g参鲁邑营售；喜鱼囡tm)图2．14糖蜜变速流加补料发酵Fig．2一14Fed-batch触rnationwithvariablef-eedrate毫邑号詈喜章囡麦角甾醇的生物合成是一个多酶催化的复杂的代谢过程。对于麦角甾醇生物合成途径及其相关基因的研究为高产麦角甾醇菌株的选育奠定了基础。本实验室通过分子育种的方法获得了麦角甾醇产量指标比原始菌株明显提高的重组酵母菌株。高产麦角甾醇酵母菌株优良遗传特性的展现需要给予细胞合适的生长条件，因此对高产麦角甾醇酵母菌株发酵工艺进行优化十分必要。麦角甾醇的产量受细胞生长和麦角甾醇合成两方面因素的影响，并且细胞生长和麦角甾醇合成之间常表现出一定的相互制约关系。因此，直接以麦角甾醇的产量为响应值，通过响应面分析法研究对麦角甾醇产量影响显著的因素，并确定其最佳浓度水平，在一定程度上可以缓解细胞生长和麦角甾醇合成之间的矛盾。试验结果显示，硫酸铜、磷酸氢二钾和pH是影响酵母菌ⅦH560}ⅨA42)发酵糖蜜产麦角甾醇产量的三个显著影响因素，其最佳水平分别为O．07皿nol／L、41：2∞鲐如钙∞弱∞巧加：2m，O 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略1．82g／L和6．50。在优化条件下，麦角甾醇产量与优化前相比提高了29．5％。表明响应面分析法可以有效的应用于麦角甾醇发酵培养基的优化中。利用优化后培养基，在5L发酵罐对发酵条件进行进一步优化，确定了发酵过程pH控制在6．5、进行底物糖蜜的变速流加补料、以及提高溶氧等策略可以极大提升酵母菌YEH560HⅪ蝌2)发酵糖蜜生产麦角甾醇的产量。为麦角甾醇的工业化生产奠定了重要基础。 结论与展望在发酵产品的工业化生产中，目标产物的产量、目标产物对底物的产率和底物消耗速率是关系到发酵成本与生产效益的关键因素。较高的目标产物产量有利于产物的后提取，而高产率则有利于降低发酵原料成本，如果再获得较高产量和产率的基础上加快底物的消耗，就能够缩短发酵周期，降低能耗，提高发酵设备的利用效率。发酵培养基组成是影响发酵成本和发酵效率的重要因素，利用廉价可再生的原料是发酵工业未来发展的重要趋势．本研究以制糖工业副产物．糖蜜为主原料，应用Plackett．Burman试验设计及响应面分析法对酵母菌YEH56QHⅪⅥ2)发酵生产麦角甾醇的发酵培养基进行优化，为了克服细胞生长和麦角甾醇合成之间的相互制约，以麦角甾醇产量为响应值筛选出显著影响因素及其最适水平，建立了相应的预测模型，获得优化的发酵培养基配方，即糖蜜总糖40g／L，KH2P041g／L，K2HP041．86g／L，CuS04。5H2017．5m{∥L(0．07mInol／L)，FeS04‘7H2013．9m∥L(O．05姗no儿)，MgS04’5H2012．3mg／L(O．05IIlIn01／L)，玉米浆10龇，pH6．5。在上述条件下，试验所得麦角甾醇产量与模型预测值接近，预测准确度为93．8％，证明利用本研究建立的模型可以实现对试验结果的预测。优化后麦角甾醇产量提高了29．5％。利用优化后的培养基配方，在5L发酵罐进行分批发酵放大试验，通过发酵过程pH恒定策略及改善溶氧环境策略，使麦角甾醇产量提高到摇瓶试验的1．95倍。发酵培养基中添加液体石蜡可以有效改善发酵液溶氧水平，进一步将分析比较不同氧载体及浓度对酵母菌YEH56QHxA42)细胞生长及麦角甾醇合成的影响，从而实现对发酵过程溶氧的精确调控。分析比较了不同的糖蜜流加补料方式对细胞生长和麦角甾醇合成的影响，发现发酵过程中依据细胞生长规律，采用糖蜜变速流加补料策略，对酵母菌YEH56(pHⅪⅥ2)细胞生长和麦角甾醇合成均有明显的促进作用，发酵38h，麦角甾醇产量达到1953．85叫L，是分批发酵的3．2倍，而且麦角甾醇产率比分批发酵提高了42．7％。本研究综合采用培养基配方优化、发酵过程pH恒定控制、改善溶氧水平及 酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的工艺条件优化策略底物变速流加补料策略，使酵母菌YEH56(p删2)麦角甾醇产量和产率明显提高，将为进一步的工艺放大和产业化应用提供重要的理论参考与依据。 参考文献[1]KoboriM，YoshidaM，KameyamaM，T扯eiT"Sh洒motoH．5a，80c-Epidioxy·22E-e唱osta-6，9(11)，22-仃记n-3p—01丘oma11EdibleMushroomSuppressesGro讯hofHL60LeukemiaandHT29C010nAdenocarc劬IIlaCells．BfD抛fc口，口以—P办口力l，z口ce“ffc口ZB“胞ff即，2006，29(4)：755-759．【2]Z№ngA-L，LiuL-P"W．angM，GaoJ—M．Bioactivee略oster01de晰ativesis01ated丘omthe血ngus三口c纪一螂砌8甜如恐．国e聊括砂Q厂№砌朋ZCD叩D“行幽，2007，43(5)：637-638．[3】NeWellSYMmer巾，FallonRD．E略osterolcontentofsalt-111arsh如ngi：e脏ctofgro叭hConditioIlsandmyCelialage．岣，cD厶唧口，1987，79(5)：688-695．[4】Pas姐cnA-L，Yli-PietilaK，PasanenP"KalliokoskiP，T锄觚enJ．Ergosterolcontenti11Variousmngalspeciesandbiocont觚血atedbu埘iIlgmaterials．铆比d口以勘V加以me，l细Z脚c加6fD魄y，1999，65(1)：138—142．[5】HeX，HuaiW；TicC，LiuYZhaI培B．BreediIlgofhighe唱osterol—producingyeaststra缸．乃“朋口，矿砌加砌Z埘亡加6扬魄沙册dBfD纪砌甩D矗)I眇，2000，25(1)：39-44．[6】HeX，ZhangB，RmH．OverexpressionofasterolC-24(28)reductaseincreasese玛osterolproductioniIl勋∞^口阳彬班‰，cP陀1，括f口P．B胁胞幽以D，6秒三P弛P坶，2003，25(10)：773-778．[7]HeX，G．uoX，ZIm培B，1hH．E舱ctof0VerexpressionofSterol-acylTransferaseonE玛osterolProductioniIlYeastS昀iIls．4c勉施c加6面锄咖口跏而∞，2004，44(1)：67-71．[8】ShobayashiM，MitsuedaS-I，AgoM，FujiiT，1washitaKIe蜘iH．E舵ctsofculturecollditionsone玛osterolbios叫hesisby．5bcc五以加彬c鲫ce，℃V括缸P．B加c把刀∞B幻泐Ijl，lD魄够册dB幻c^绷如缈，2005，69(12)：2381-2388．【9】AmezederC，HampelW．Innuenceof铲oWthrateontheaccumulationofe唱osteroliIlyeast-ceUsiIlaphosphatelimitedcontilluouscultlJre．曰幻纪c办刀D如∥45 参考文献三P抛坶，1991，13(2)：97—100．[10】S呱F’WenS，WangX，T觚T．High-cell-densityfennent灿nforergoster01productionby勋cc五日加彬妒时∞愆1，妇妇e．如“朋口Z矿Bf∞c把，z卯口，zdB面e，z∥，zge—略，2006，101(1)：38-41．[11]、厂ANHOEKP，AristidouA，HahnJ，PatistA．Fementationgoesla略e-scale．C忍e聊fc口Z互垤拥ee，‘f，曙跏97℃ss，2003，99(1)：37—42．[12]VedyasllkillaT"RevillVGogotoVI．OptiIIliziIlgtheconditionsofdextmsymhesisbythebact曲m三P“cD，zDs幻c聊嚣绷纪加矗Z鲫growni11amolasses—comaillillgrnedium．4印厅ed曰面c^硎括幻，口，zdM配加6扬，9∥，2005，41(4)：361-364．【13】BaIlil(R，SanthiaguA，U．padllyayS．OptiIllizationofnutrientsforgellangumpro(hlctionby印乃晒，，lD刀口sp口“c打打D6f以jATCC一31461inmolassesbasedmediumusillgrespollsesurfacemethod0109yBfD聊D“脱死c五加垤l，，2007，98(4)：792—797．[14】HeX，GuoX，LiuN，Zhar培B．E玛ostefolproduction舶mmolassesbygeneticanymodified勋cc办口加，砂c劣∞愆V西f口P．4印Zf耐^衙cm6fDZ9∥口耐B面搬咖，zD如秒，2007，75(4)：55-60．[15】Montgome呵DC．Des远nandanalysisofeXperiIIlents，Wiley，2008．[16】SzolderitsGHemetterA，PahaufF，DaumGMelll_branepropeniesrnodulatetheaCtivityofaphosphatidylillositoltraIlsferprotein丘omtheyeastsncchnmmyceSce"eviSine．BiochimicnetBiophySicnActn(BBA)一BiomembmneS，1989，986(2)：301-309．[17]B砌M，LeesN，B1】n．owsL，ⅪeiIlllansF．Di虢rencesiIlcrystalVioletuptakearldcation．iIlduceddeamaIllongyeaststerolmutams．JrD“M讲矿口口c把一DZo母，，1978，135(3)：1146-1148．[18】LeesND，BardM，KbmpleMD，Haal【RA，ⅪeiIlllansFWESRdetemIiIlationofmelIl_braneorderparaIIleter洫yeastster01mutants．B面c7i伽z记口“Bf叩，必记口4c细删培fDmem6旭，z钌，1979，553(3)：469-475．【19】BottemaCD，McLean-BowenCA，ParksLWRoleofsterolstmctureiIlthethemotropicbehaViorofplasmamembranesof&zcc办口加，砂c酗ce彤V西缸g．46 参考文献BfDc办砌良"口甜Bf印矗声池z彳c幻僻酬坷fDm绷6朋刀鲫，1983，734(2)：235-248．【20]Bott伽[1aCD，RodriguezRJ，P孤妇LWInnuenceofsterolstmctureonyeastplasmameml缸aneproperties．BfDc砌咒f∞甜Bf印，咖泐彳c幻删坷面聊Pm6m，z鲫，1985，813(2)：313—320．[21]DupontS，LemetaisGFe玎e油T，CayotP，GeⅣaisP’BeneyL．E玛osterolbios叫hesis：af．ungalpathwayforHfeonland?跏觑肋以，2012，66(9)：2961-2968．【22]KmrnpeKFmmkiIlI，Herz逸YmmonN，OzbalciC，BrnggerB，I己印印ortD，SchuldiIlerM．E昭oster01contentspecif论sta略etiI培oftail—anchoredproteiIlstomitochondrialoutermeInbranes．胁跆c“肠，．曰面如秒旷历e＆朋，2012，23(20)：3927-3935．【23】LeesND，BardM，KirschDR．Biochemist巧andm01ecularbi0109yofster01s)眦hesisi11．5hcc办口加，哆)，c鲫ce馏1，西施P．B幻c办绷括f砂口刀dFh，lc加以Q厂龇，D如，1999，34(1)：33-47．[24】孤mgYQ，Ga蚴mS，Garcia—E胁nGP破S，PerlinDS，RaoR．Requnmentfore玛osteroliIlV-ATPasemnCtionunderliesantmngalactivityofaz01edrugs．兕DS砌砌9舻，15，2010，6(6)：elo00939．[25】MariscoGSaitoS，GandaI，BrendelM，Pungartn墩C．Lowe昭osterolcontenti11yeastamll砌t趾tenllanceschitillInaldistrfbution龇ldsensitivitytoparaquat-i11ducedoxidativestress．瑟珊毛2011，28(5)：363—373．[26】P酞sLWBottemaCD，Ro∞guezRJ，LewisTA．Yeaststerols：Yeastmut肌tsast001sforthesmdyofsterolInetabolism．胞砌D凼砌互》印榭D，匆∥，1985，11l：333．346．【27]Crowlcym，ToveS，P锄妇L，WAcalcium-d印endentergosterolInut觚tof．％c如口m删c甜∞陀v厶妇P．Ckr，卿fG绷Pff岱，1998，34(2)：93—99．[28】H远giIlsVJ，Becl【llouseAG01iverAD，RogersPJ，DawesIWYeastgeIloIne—wideeXpression舡lalysisidentifiesas仃onge唱osterol甜1doxidativestressrespollsed1】riI塔tllei11itialstagesofani11dllstrial1agerfementation．锄矗ed彳刀d—Z勋1，f，1D，lme刀f口，^垄五c，iD6玉，正99)，，2003，69(8)：4777-4787．[29】DalllJS，DahlCE．Stimul灿nofcellpmlifera：tionandpo蛳hospllo劬sitide 参考文献metabolismi11勋c幽口加彬妒鲫cP删括f口eGL7byergoster01．B面c五绷fc口，么耐B玉叼p噍声记口，R∈l，e口，|c^CDm，，z甜，zfc口打D，zs，1985，133(3)：844-850．[30]DahlC，BiemannH—P，DahlJ．AproteiIlkillaseant远enicallyrelatedtopp60V-srcpossiblyiIlVolvedillyeastceUcyclecontr01：positiveiIlViVoregulationbyster01．mcP螂矿砌e№肋以口Z彳∞如，砂矿&把，zc四，1987，84(12)：4012-4016．【3l】HaslamJ，AstinAM，Nicll01sWW：TheeffectsofalteredsterolcompositionontheIIlitochondrialadenillenucleotidetrallsporterof&zc幽口加彬弦鲫ce陀1，西施e．点f勿c|jl绷fc口Z．，D“，咒口厶1977，166(3)：559—563．[32】Quesney-HuneeusVWileyMH，SipersteinMD．Essentialr01eformeValonates洲hesisi11DNAr印hca：tion．m∞砌咿矿砌e航ffD门口，彳c口如删矿＆fe聆c卵，1979，76(10)：5056—5060．[33】H01ickMF．Vit锄i11Ddeficiency肫w励加以乃“m以，矿胞舭讹2007，357(3)：266-281．[34]HolickMFⅥtamillD：irnportanCeinthepreventionofcanCers，type1diabetes，hean弛ease，andosteoporosiS．刀le彳聊e廊口，洳“朋口，Q厂Cf拥良ⅥZM删砌刀，2004，79(3)：362-371．[35】PaurfittA，GanagherJ，HeaIleyR，J0hnstonC，NeerRWhedonGⅥtamiIlDaIldbonehealIhiIlthcelderly．砀e彳聊e廊册力“M口Z矿踟fc以，mf删肋刀，1982，36(5)：1014一1031．[36】HolickMF．EvolutionandfIlnCtionofVitamiIlD．VitamiIlD舢1alogsiIlCancerPreVentionandTher印y：Spr崦er，2003，l64：3—28．[37】L印pem，Trawrs-Gusta自onD，DaviesKM，ReckerRR，He趾ey腿Vita幽Da11dcalciumsupplememationreducescancerrisk：resultsofa啪domizedt渤1．砀口彳聊e虎口甩乃“厢口，矿C‰fc口ZMf洲ffD刀，2007，85(6)：1586-1591．【38】YetleyEA．Assess吨theVitamiIlDstatusoftheUSpopulation．刀le4聊e成绷如“瑚口ZQ厂C‰把口，№所砌，z，2008，88(2)：558S一564S．[39]IⅢiSubbiahM，AbplanalpWErgost啪l(majorsterolofbakdsandbrewer’syeastextracts)i1111ibitsthe伊。叭hofhumanbreastcallcercellsiIlvitroandthepotentialroleofitsoxidationproducts．砌纪，行口玎D咒口，JrD“，w口Z加厂所缸m拥口以d^／hf珂ffD刀RB，e口，℃Jjl，2003，73(1)：19-23． 参考文献[40]RussoA，C鲫扭eVPioⅦnoM，CaggiaS，EspiIlozaC，Garbar．Ⅱ10J．Pro—apoptoticactivityofer90sterolperoxiI此and(22E)-er90sta-7，22-dien-5a-hydroxy_3，6一dionei11huImnprostatecancercens．C锄emfcD—B面如gfc口，砌纪磁cffD，zJ，2010，184(3)：352-358．【41】T钛eiT，Y0shidaM，Omshi—Kamey锄aM，KoboriM．Ergosterolperoxide，anapoptosis—induciI喀coInponentisolated丘．omSarcodonaspratus(EIerk．)S．Ito．Bfosc把刀cBB细胞cJjl，lD匆蹦口，ld召国cJjlP肌括砂，2005，69(1)：212-215．【42]Georgop印adakouNH，WakIhTJ．HlHnan删闪oses：dmgsandta玛ets南reIneEgillgpathogens．．毙把，zce，1994，264(5157)：371—373．[43】OddsFC，BrownAJ，GowNA．AntifIlngalagents：mechanismsofaction．讹行西新』凯阳6面如秒，2003，11(6)：272-279．[44]B删tburgJ，PowderlyWK曲ayashiGMedoIjfG灿nphotericiIlB：curre∞tunderstandingofmechanismsofaction．彳，l坊押记加6胁Z彳鲈玎细口，zdC锄8mD砌e，叼秒，1990，34(2)：183-188．[45】SaIlglardD，IscherF，KoymIlsL，BillcJ．山：IlinoacidsubstmioIlsiIlthecytochromeP-450lanosteroll40【一demethylase(CYP51A1)丘omazole—resistant(么，zd埘a口舾fc口甩sclinicalisolatescont同)utetoresistancetoazoleanti血ngalagents．么玎砌记加6砌，彳酽咒窍口以劬绷D历绷彩，1998，42(2)：241-253．[46]R．yderNS．Squalene印oxidaseastheta玛etofantif．ungalallyl锄ines．鼢如娩＆把刀∞，1987，21(4)：281—288．[47]BosscheHVLau、ⅣersWWilleIIlsensGMaricllalP，ComelissenF，CoolsWMoleCularbasis内rtheamiIIlyCotiCandantibacterialactivityofN-substitutediInidazolesandtr沈oles：TheiIlllibitionofisoprelloidbiosynthesis．鼢如此跑．兜fP胛c8，1984，15(2)：188-198．【48】Parl【sLW：Ad锄：lsBGMetdb01ismofsterolsinyeast．CHffI锨ZRevfe懈f玎舭6面如秒，1978，6(4)：301—341．[49]BardM，DowningJF．GelleticandbiochemicalaspectsofyeaststerolregulationinVolviIlg3一hydro)【y-3-methylglutarylcoerIzymeAreduCtase．J_D材朋口ZQ厂I：琵刀e，。口Z』凯，1D6fD五99y，1981，125(2)：415—420．[50】BemdtJ，BonM，L6welM，GaumertR．Regulationofster01biosynthesisi1149 参考文献yeast：iIlductionof3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductasebyglucose．B面c^em￡∞，口，ldBf印矗声记日，尺鲫B口，如Camm“，zfc以ffD扮s，1973，51(4)：843-848．[51]HalllptonIW：ER—associatedde伊adationiIlproteiIlqualitycontrolarldcellularregulation．仇鹏，zf印切fo，z砌＆刀Bfo魄少，2002，14(4)：476·482．[52]ThorsnessM，SchaferWD’撕L，RineJ．PositiveandnegativetmscriptiomlcomrolbyhemeofgenesencodiIlg3一h)心oxy-3-methylglutarylcoenzymeAreductaseiIlSaCcllaromycescereVisiae．^佑彪c“肠，口，zdC已Z觑肠rBfD，D∥，1989，9(12)：5702-5712．[53】VeenM，LaJlgC．InteractioIlsoftheergoster01bios州heticpathwaywithotherlipidpathways．B幻c五e聊纪讲．Sbcfe纱乃．口行J口c打D咒s，2005，33(5)：1178—1181．[54]Shim屯mI，NagaiJ，HstsnakaH，SaitoE，Katsul【iH．Subcellular10calizationof3-hydroxy．3一meth姐91utaryl-CoAreductasein勋cc愚口加，砂ces钟陀v括f口P．．，，D甜，‘拧口，Q厂正『面c^e聊办}f砂，1971，70(1)：175-177．[55】I；缸stF，P10chockaD，MeyerS，SzkopiIlskaA．FamesyldiphosphatesyntllaseaCtivityan’ectse玛osterol1evelandprolif．erationofyeast＆cc办口加，砂c钌ce，P1，西口e．C匆刀B如fn秒砌绝，7z口肋，z口，，2004，28(3)：193—197．[56】Szkopi矗skaA，Swie之ewskaE，胁stF．TlleRegulationofActiVityofMaillMeⅦlonicAcidPathwayE11zyInes：F撇esylDiphosphateS叫llase，3一Hydroxy-3-methylglutaryl-CoAReductase，andSqualeneSymhaseiIlYeastSncchnr0，，IyceSce}IeviSine．BtochemicntnndB{0phySicnlReSe口，℃hCDmm“行玉c口ffD，zs，2000，267(1)：473—477．【57]VeenM，StalllU，LangC．CombiIledoVereXpressionofgenesoftheerjgosterolbiosynth或icpathway1eadstoac饥mmlationofster01si11．％cc办口加，哆)，c鲫cP愆v括缸e．凡E!^zS殄傩f尺鲫e以陀而，2003，4(1)：87-95．【58]Tainal【aH，Hashimot0H，Ao)，amaYY，0shidaY．E妇融ctsofeleVatedeXpressionoftheCYP51(P450-14DM)geneonthesterolcontemsof勋cc乃口加叼，c钌ce，℃V括f口e．．，D“，玎口，Q厂．F匆门竹e，zf口砌刀口以dBfDe，zg切ee，。打曙，1995，79(1)：64-66．[59】张振颖，何秀萍，李巍巍，卢莹，王肇悦，张博润．甾醇C．24甲基转移酶和甾醇C．8异构酶在酿酒酵母麦角甾醇生物合成中的调控作用．缴竺谚撑 参考文献旎2009，49(8)：1063-1068．[60]蔡鹏丽，何秀萍，刘楠，张博润．甾醇C．22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响．缴生物学掘2007，47(2)：274．279．[61】BentzBJ，Si】(DL．Er90sterolcontentof缸lgiassociatedwithDendroctonusponderosaeandDendroctonusm邱enllis(Coleoptera：CurCulionidae，ScoMinac)．彳，l，z口西矿砌e砌幻mD厶枇口，勋c抬纱矿彳聊e，．良以，2006，99(2)：189-194．[62]王纪，薛小莉．离子注入麦角甾醇酵母选育及发酵工艺．磁望纺学荣，亳1998，18(4)：25-28．[63】张博润，何秀萍，铁翠娟，刘玉方．麦角固醇高产菌株的构建及其培养优化条件的研充生纺功蝴1999，15(1)：46．51．[64】Pola玉∞wskiT，StalllU，LangC．0Verexpressionofacytosolichydroxymetllylglutaryl一CoAreductaseleadstosqualeneaccumulationiIlyeast．4印矗耐M记加6幻如∥口以B勿纪幽，zD如秒，1998，49(1)：66—71．[65]PolakowskiT’B删R，St枷U，L雒gC．Ellllancedsterol—acyltraIls向aseactivitypromotesster01accumulationiIl勋ccJjl口m彬弦嚣ce陀1，括砌e．4印厅ed』慨，钞6幻五D暑y口刀d曰fD西即厅以D比惶少，1999，53(1)：30-35．[66】宫莉，吴洪发，宋公明，丛娟，李晓玲，裴轶琨，薛冬桦．麦角甾醇酵母基因工程菌株的发酵培养条件．手稀尤学钧铝偿蝴，2010，4(36)：807．810．【67]Sta玎PR，P池L．Somefactorsa舵ct崦ster01fom蚍ioniIlSaccharomyCescereVisiae．。，D“，7z口ZQ7r6口cfP砌五口暑y，1962，83(5)：1042-1046．【68】江宏文，张毅，李娜，林晓珊．酵母菌株产麦角固醇发酵条件优化．功行贪晶鸦皈j2009，7(25)：800-803．[69】谭天伟，张博润．用酵母生产麦角固醇发酵工艺的研究．微生纺学通规1996，23(2)：88-91．[70]许旭萍，李惠珍，佘晨兴．麦角固醇产生菌乃础讹筘括丘聊口纪优化发酵条件的研究．生物学杂丧2002，18(2)：15．17．[71】蒋岚，于士军，张莹，张琛，樊美珍，李春如．古尼拟青霉麦角甾醇高产液体培养条件及提取工艺的优化．蔚物学掘2012，31(3)：413．421． 参考文献[72】宋公明，马丽娟，王红蕾，王晓俊，薛冬桦．玉米秸秆液态发酵制备麦角甾醇的研究．≠厚笙纺绣!杂，赢2008，28(12)：47．51．[73]黄时海，李灿明，夏小斌，吴孔阳，汪晟，陈桂光，梁智群，李湘萍．甘蔗糖蜜发酵生产麦角固醇工艺研究．食品乙此群：蓖2009，30(4)：147．148．【74】To埔aMaJ，BenrallGNoVoM，PobletM，RozesN，Guillam6nJM，MasA．E彘ctofthenitrogensourCeonthef；myacidcompositionof勋cc办口，D，砂c卯cP陀V函泐e．月DDd施cm6fD匆∥，2003，20(3)：255-258．[75]M觚g劬tC，RoustaIlJ，Sabl帅1lesJ．Ni!trogendenlandofdi仃eI．entyeaststraillsd11rillgalcoh01ic诧mentation．ImportanceofthestationaI-yphase．上jrz2习旧聍e口，zd埘c，D6励，死c办玎D五99)，，1998，23(7)：511—517．[76]JollIlsonVSin曲M，Y矾avN．hlnuenceof铲。讯hconditionsontheaccumula：tionofergoster01byR^D如幻删肠咖砌括．肋蒯乃“埘口，矿施c加6面Z9∥口胛d曰面纪c办，zD如秒，1994，10(1)：114-115．[77】ShangF，W．enS，WmgX，1’觚T．E舵ctofnitrogenlimitationontheergosterolproductionbyfed-batchcuhureofS口cc^口加，，吵c缈ce陀V括f口e．Jro“，7l口ZQ厂B面纪c办刀DZ9秒，2006，122(3)：285—292．[78]惠丰立，褚学英，魏明卉．无机盐对酵母菌产麦角固醇的影响．赢孵痧滋学臃学赧f，自然群学饲，2003，6(2)：61．63．【79]SVenssonPA，EnglundMC，MarkstI．6mE，OhlssonBGJem瓠M，Bill远H，To玛ersonJS，Wjl【lllndO，CarlssonL，CarlssonB．Copperinducesthe唧ressionofcholesterogenicgenesiIlhumannlacropllages．彳砌e，1∞c如加姗，2003，169(1)：71-76．[80]何秀萍，郭雪娜，张博润，谭华荣．甾醇酰基转移酶基因高表达对酵母菌麦角甾醇合成的影响．缴生物学掘2004，44(1)：67．71．【81]SHIMl2UI，＆虹S切阻H．E能ctoft锄peratureone玛oster01biosymhesisiIlyeast．如“朋口Z矿曰fDc办e聊括砂，1975，77(5)：1023—1027．【82】刘彦丽，刘永东，王艳辉，王云山，苏志国，马润宇。毕赤酵母发酵生产重组人血清白蛋白高密度培养条件的研究．花苈纪工大学学按，2003，30(4)：25-28．[83]JohnsonVS崦hM，SailliVSistaVY．adavN．E妇FectofpHon1ipid52 参考文献aCcu舢l批nbyanoleag曲usyeast：RhodotomlaglutiIlisIIP-30．肋删乃“埘口，Q厂M七m6面如秒口，2dB幻胞幽，zD触眇，1992，8(4)：382-384．【84】ShuCH，ChouPEHsuI．E妇Fectsofmo印hologyandoxygensupplyonsch娩ophyllan白rmationby＆扬扬叩，纱Z觑mcD，，zm“玎eusingapeUets娩econtroUingbioreactoL如“m口ZQ厂国e聊fc口，死幽珂D^强7口以B幻纪幽，zD厶固，，2005，80(12)：1383-1388．[85】DulaneyEL，StapleyE，S呻fK．Studiesone唱ost啪1productionbyyeasts．锄矗甜M配m6面砌眇，1954，2(6)：371-379．[86】RattrayJ，SchibeciA，KidbyDK．Lipidsofyeasts．曰口c纪，．如如g记口，R81，few，，1975，39(3)：197—231．[87】高桦，唐芳，谭天伟．麦角固醇发酵不同流加方式的比较．石纽学掘2002，53(12)：1232-1237．【88】T趾T，Z尬lngM，GaoH．Ergosterolproductionbyfed-batchfermentationof．铴cc办口，jD，，1)，c∈塔ce，℃1，良7缸e．正jrz刁硎P口，zd．^衙c，钞6f口，乃c办，zD正99)，，2003，33(4)：366-370．[89]EzejiTC，QureshjN，B1ascllekHP．Bioproductionofbut锄ol舶mbiomass：丘Dmgenestobioreactors．国鹏珂f印加面咒砌BzD舰办，zD忱少，2007，18(3)：220一227．[90】Ez句iTC，QureslliN，BlaschekHP．ButaIl01fe皿舱mationresearch：upstre锄anddowIlstre锄ma啷ulations．砌e∞绷泐Z尺PcD砚2004，4(5)：305-314．[91】FrancisF’Sa_buA，NaHlp00t虹iⅪvI，RarnachandranS，Gh0ShS，SzakacsGPandeyA．UseofresponsesurfacemethodologyforoptiIn娩iIlgprocessparametersfortheproductionof0【-amylaseby彳印P曙f以协D叫嬲P．BiDcI}lemfc口Z五抛f，lee，．白喀．，．D“，。挖口Z，2003，15(2)：107—115．【92]Nil(ereliE，OnerE，KirdarB，YildirimR．OptimizationofmediumcompositionforbiomassproductionofrecoII】lbiIlant上西c办P廊^记∞厅cellsusillgresp01lsesWfacemethodol0盱BfD幽emfc口ZE略伽e洲略乃“聊口Z，2006，32(1)：1—6．【93】PrajapatiVS，TI如ediUB，PatelKC．OptiIIl娩ationofglucoamylasepro(1uctionbyColletotrichumsp．KCP1usillgstatisticalmethod0109y．肋Dd＆把刀ce口材B面纪c五甩DZp秒，2013，22(1)：31—38．[94】KellyDE，KellySL．Rewmgyeast斯dmgs皿hesis．讹m陀B勿纪砌刀D如秒， 参考文献2003，21(2)：133-134．【95】NanaU’RoyS，勋nwarSS，AzIIliWImproVedproductionofL-asparagiIlasebyB口cf朋协6陀1，括cuhiVatediIlthepresenceofo砷驾en-vectors．B面，邪D“∞死c办，zD，9∥，2011，102(2)：2083—2085． 作者简介及在学期间发表的学术论文及研究成果作者简历：1988年7月21日出生于河南濮阳。2006年9月．2010年6月，在河南大学获得学士学位。2010年9月．2013年6月，在中国科学院微生物研究所攻读硕士学位。获奖情况：无工作经历：无已正式接受的学术论文：王绍杰，郭雪娜，何秀萍，张博润。酵母菌利用糖蜜发酵产麦角甾醇的工艺条件优化策略。生物工程学报，2013，己录用 作者简介及在学期间发表的学术论文及研究成果酵母菌利用糖蜜发酵产麦角甾醇的工艺条件优化策略王绍杰1，一，郭雪娜1，何秀萍1，张博润11中国科学院微生物研究所酵母菌分子遗传与育种实验室，北京10010112中国科学院大学。北京100049摘要：麦角甾醇是由酵母菌产生的具有重要经济价值的代谢产物。为了提高酵母菌利用糖蜜发酵生产麦角甾醇的产量。通过响应面分析法优化了发酵培养基配方，并在5L发酵罐对发酵过程pH控制和底物流加补料方式进行了优化。结果表明，利用优化后的发酵培养基。即糖蜜总糖40g／L，KH2P041g／L，K2肿D41．86g／L，CuS04·5H2017．5mg／L，FeS04‘7H2013．9mg／L，MgS04’5H2012．3mg／L，玉米浆10mUL，麦角甾醇产量比优化前提高了29．5％：在此基础上，利用恒定pH控制策略，在5L发酵罐进行分批发酵。使麦角甾醇产量提高了62．1％：进一步采用底物流加补料策略，使麦角甾醇产■达到1953．85mg／L，是分批发酵的3．2倍。而且麦角甾醇产率比分批发酵提高了42．7％。为酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的产业化应用奠定了基础。关健词：酿酒酵母，糖蜜。麦角甾醇，响应面分析法。底物流加补料叁i地rategytorimpr0Ⅵnger90SterolproduCtlontrom—J·一●1J●■’molassesby鼬c幽口加刀秒c嚣cP陀协缸PShaojieWan91”，XuemGu01，XiupingHel，andBomnZhan91lkbormtory西M0teclllarGenecicSandBreed{ng西Ye口st，Instittlle西M{cmbiology"un如ers渺嘭Ch}n∞eA∞denlyo，&把疗c哦眈咖曙10010l，C^f撇2um咒rSny西ChineseA∞de狞ly嘭Sciences．Be珏inglO∞49，ChinaAbstract：Ergosterolisaneconomicallyimportantmetaboliteproduccdbyye硒t．ToimproVethepro“ctionoflRecei、，ed：April28，2013；Accepted：S叩ponedby：FoundadonOfTechnolOgyTr妣s衙OfInstinJte0fMicrobiol0懿ChineseAcademyOfSciencesCorresponmngauthor：xi岍ngHe．1’el：+86-lO搿807356；E-mail：hexp@im．ac．cn中国科学院微生物研究所科技成果转化基金56 致谢本论文是在导师何秀萍老师的悉心指导下完成的。从论文选题、试验设计到结果分析都凝结着何老师的大量心血。何老师深厚的学术造诣、敏锐的洞察力和严谨的治学态度，都将使我终身受益。在即将毕业之际，谨向何老师表达深深的谢意!感谢张博润老师在实验和工作中给予的建议与指导。张老师在工作中对我们的严格管理和一丝不苟的工作态度使我受益匪浅。在此向张老师表示诚挚的谢意!感谢实验室王肇悦老师、郭雪娜老师、程艳飞老师、白雪晶老师、傅秀辉老师、乌云达来老师在工作上的帮助和生活上的关心，在此表示深深的感谢!感谢实验室常琦、岳峰、杜昭励、宋盼盼、陈先锐、朱卉、刘莎等同学在实验中的热情帮助，我会永远珍惜这段友谊，谢谢你们!感谢我的家人多年来对我的信任与支持!谨向所有给予我支持和帮助的人表示深深的谢意! 编号：萨130219《生物工程学报》论文录用通知书收稿日期：2013．04．28文题：酵母菌利用糖蜜发酵产麦角甾醇的工艺条件优化策略作者：王绍杰，郭雪娜，何秀萍，张博润单位：中国科学院微生物研究所；中国科学院大学尊稿己通过我刊最终审稿，同意录用，预计在本刊2013年第l1期上刊登(每月25日出版)，请勿再投他刊。特此通知。4本刊被数据库收录情况美国化学文摘美国医学索引<环压，MEDLINE>俄罗斯文摘日本科学技术社数据库qST>英国国际农业与生物科学研究文摘《ABI>美国剑桥科学文摘(自然科学卷)波兰哥白尼索引荷兰Elsevier的荷兰医学文摘中国生物学文摘中国科学引文数据库中国科技期刊光盘版中国知网CNKI中国自然科学核心期刊《h却：，／jo啪als．im．ac．cn／cjbcnE-majl：cjb@im．ac．cnT℃l：010—64807509Fa，(：OlO一64807327北京朝阳区北辰西路l号院3号中国科学院微生物研究所(100101)