蜜蜂以色列急性麻痹病毒的分子检测、流行传播及其对蜜蜂行为的影响 130页

分类号：S8中文论文题目：英文论文题洳≥：J～暗博士学位论文单位代码：10335学号：11117004指导教师：专业名称：研究方向：所在学院：中国·杭州 论文作者签名：⑧前钏司指导教师签名：塑幺鱼．鱼论文评阅人1：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：答辩委员会主席：昱态班塞虽熊昱主国盔些型堂暄童蝰巫宜压委员1：毖尘置熬援接昱遗盍型垩垦童盔堂生物抖堂班宣医委员2--陵壁逯熬援盟昱逝江盔堂盔些皇生物挂苤堂暄委员3：塑叠睦熬援擅昱逝、江盔堂动物猎堂堂医委员4．-鲑伯雄塾援擅昱逝江太堂动物抖堂堂瞳委员5：盟整褪麴握蝗昱逝江太堂麴物抖堂堂瞳委员6．-蒸松垃盟荭旦煎昱福建壅拄太堂蝰堂堂瞳 Moleculardetection，prevalenceandtransmissionofIsraeliacuteparalysisvirusanditseffectsonhoneybeebehaviors⑧ADissertationforDoctoralDegreeSubmittedtoZhejiangUniversityPh．D．Candidate：ZhiguoLiSupervisor：Prof．LiangenShiProf．SongkunSuCollegeofAnimalSciences，ZhejiangUniversity,Hangzhou，Zhejiang，ChinaApril,2014 浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿态堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：。闫签字日期：pcl【年白∥日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘生有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：劫．J猢新签名：f＼≈十毫t／签字日期：似I叫年6月嵋日签字日期：九lf年6月，7日 本研究得到现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS．45一KXJ3)、国家自然科学基金(No．30671593)、浙江省自然科学基金(No．113080306)及国家留学基金委的资助。特此致谢lI! 目录Ej录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．I摘墨E⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯vAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．VIII第1章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1蜜蜂健康及其主要影响因素的研究概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．1大蜂螨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1．2病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．1．3蜜蜂微孢子虫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．1．4真菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．1．5杀虫剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．1．6营养不良⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．2蜜蜂的免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．2．1社会性免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．2．2个体免疫⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111．3蜜蜂以色列急性麻痹病毒(pLPv)的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．3．1IAPV与CCD的相关性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．121．3．2IAPV的分子生物学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．121．3．3IAPV非结构性多聚蛋白编码特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．3．4IAPV结构性多聚蛋白编码特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．3．5IAPV的分类学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．141．3．6IAPV的致病机理及预防机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．4基于伸吻反应(PER)的蜜蜂行为研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．151．4．1对蔗糖溶液刺激的应答性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯151．4．2基于PER的两种学习模式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．161．4．3影响蜜蜂PER行为的因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．171．5蜜蜂归巢能力的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．18 1．6研究意义与主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．6．1研究意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。191．6．2主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．20第2章浙江省蜜蜂病毒的检测及蜂群健康的调查分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1．1主要试剂及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1．2样品的采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1．3RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．232．1．4逆转录反应，第一链cDNA的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232．1．5PCR检测常见六种蜜蜂病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242．1．6琼脂糖凝胶电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．1．7中、意蜂蜂群健康调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．252．1．8中、意蜂头部基因表达谱差异分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2．1六种蜜蜂病毒的检测结果及其组织嗜性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．2．2意大利蜜蜂、中华蜜蜂免疫相关基因的差异表达分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．3讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36第3章蜜蜂以色列急性麻痹病毒新传播载体的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．383．1实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．1．1主要试剂及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．383．1．2MY一20培养基的配制方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．1．3蜜蜂球囊茵的培养方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．1．4蜜蜂球囊菌DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．393．1．5通过PCR对球囊茵进一步确认⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．403．1．6菌丝总RNA的抽提⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．413．1．7第一链cDNA的合成，用于病毒正义链的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯413．1．8常见七种蜜蜂病毒的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯413．1．9PCR产物纯化⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．433．1．10第一链eDNA的合成，用于病毒反义链的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．433．1．11PCR检测蜜蜂病毒反义链⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44 3．2实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．2．1蜜蜂球囊菌中蜜蜂病毒的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．2．2蜜蜂球囊菌的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．453．2_3蜜蜂球囊菌中蜜蜂病毒反义链的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．473．2．4蜜蜂病毒的系统进化树分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483．3讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．53第4章蜜蜂以色列急性麻痹病毒对蜜蜂行为的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．554．1实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯554．1．1主要试剂及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯554．1．2健康蜂群的筛选及采集蜂的抓取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．564．1．3IAPV的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．564．1．4蜜蜂蔗糖反应性行为实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯574．1．5蜜蜂致敏化反应行为实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．1．6蜜蜂习惯化反应行为实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．1．7绝对定量qPCR反应中蜜蜂病毒IAPV标准曲线的绘制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．1．8RT．PCR及qPCR检测IAPV⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一604．1．9蜜蜂存活率分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯614．1．10归巢行为实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯624．1．11数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯644．2实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯644．2．1IAPV对蜜蜂蔗糖反应性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯644．2．2IAPV对蜜蜂致敏化反应的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯664．2．3IAPV对蜜蜂习惯化反应的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯674．2．4病毒的检测及头部病毒qPCR分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯684．2．5被IAPV感染蜜蜂与对照组蜜蜂存活率分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．714．2．6IAPV对蜜蜂归巢能力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．724．3讨论⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．74第5章蜜蜂以色列急性麻痹病毒、东方蜜蜂徼孢子虫及瓦螨交互关系的初步研究．775．1实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．775．1．1主要试剂及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯77 5．1．2蜜蜂微孢子虫(Nosemaspp．)的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．785．1．3蜜蜂微孢子虫计数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯785．1．4蜜蜂微孢子虫种的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．795．1．5蜂螨的收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯795．1．6蜂螨、微孢子虫对蜜蜂的侵染实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯795．1．7RNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．805．1．8cDNA合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯805．1．9qPCR检测IAPV及免疫基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯825．1．10qPCR扩增效率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯825．2实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．835．2．1qPCR扩增效率的验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯835．2，2IAPV及相关差异表达基因的分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．855．3j寸论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．89第6章主要结论、创新及后续研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．906．1主要结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一906．2本论文的创新点、不足之处及研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．94博士期间发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～⋯⋯⋯112国际交流及会议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1131目c谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．114Iv 摘要近年来，全球部分地区蜂群数量的减少，尤其是2006年冬季至2007年春季，美国发生的大范围的蜜蜂突然消失现象——蜂群崩溃失调症(colonycollapsedisorder，CCD)，类似的情况也发生在欧洲的部分地区，引发了严重的授粉危机。初步的研究表明以色列急性麻痹病毒(Israeliacuteparalysisvirus，IAPV)很可能是CCD的致病因素，尽管对于CCD的病因依然并未明确，现在普遍认为蜜蜂的健康主要受到蜂螨、病毒、蜜蜂微孢子虫、杀虫剂残留及营养不良等因素的影响，这些因素之间的交互作用或许是近年来世界范围内蜂群损失的原因。本研究调查了IAPV等常见蜜蜂病毒在浙江省地区的流行情况，描述了中、意蜂病害类别的差异进而分析了中、意蜂等与免疫相关基因的表达差异；通过分子检测发现了IAPV等蜜蜂病毒另一新的传播载体——蜜蜂球囊菌，揭示了IAPV等蜜蜂病毒新的生物学特征；基于蜜蜂伸吻反应(proboscisextensionresponse，PER)行为实验及射频识别(radiofxcquencyidentification，I强D)技术，研究了IAPV对花粉采集蜂的梯度蔗糖溶液反应性及归巢能力的影响：初步研究了东方蜜蜂微孢子虫、蜂螨协同侵染对蜜蜂体内IAPV滴度及相关免疫基因表达的影响。主要结果如下：1．浙江省常见蜜蜂病毒的流行情况及中、意蜂病害类别的比较及其基因表达差异从浙江省七个地区的38个意蜂蜂场采集蜜蜂样品用于常见六种蜜蜂病毒的检测。IAPV，蜜蜂残翅病毒(Deformedwingvires，DWV)的检测率最高，分别为29％、27％；克什米尔蜜蜂病毒(Kashmirbeevirus，KSV)，囊状幼虫病毒(Sacbroodvirus，SBV)的检测率为5％；慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronicbeeparalysisvirus，CBPV)、急性蜜蜂麻痹病毒(Acutebeeparalysisvirus，ABPV)的检测率分别为4％、3％。病毒的组织嗜性调查发现，相较于头部，爬蜂及死蜂的胸部、腹部被病毒感染的可能性更大。通过对141个意大利蜜蜂(ApismelliferaL．)蜂场的调查，发现80％的蜂场存在不同程度的蜂螨侵染；21％的蜂场发现白垩病；18％的蜂场遭受了因农药中毒而引发的蜂群损失事件；6％的蜂场存在幼虫腐臭病；5％的蜂场发生了不明原因的蜂群消失事件。与意蜂蜂群相比，通过对39个中华蜜蜂口p豇ceranacerana)蜂场的调查，发现中蜂蜂V 场不存在蜂群消失事件且不存在蜂螨寄生蜜蜂的问题；近90％的蜂场存在不同程度地被大蜡螟危害的现象。鉴于上述中华蜜蜂、意大利蜜蜂生物学及病害类别方面的差异，我们通过高通量测序技术分析了中、意蜂头部基因的差异表达情况，发现了约2,370个与代谢、免疫、应激反应相关的差异表达基因。中、意蜂之间编码抗菌肽基因的差异表达表明了中、意蜂在抵御病害方面存在的分子机制差异。2．首次在蜜蜂球囊苗中检测到IAPV等蜜蜂病毒及病毒反义链蜜蜂球囊菌(Ascosphaera印括，A．ap／s)是蜜蜂的一种真菌性病原，可以感染蜜蜂幼虫并引起白垩病。已有研究表明真菌病毒存在于所有的主要真菌门类。本研究从白垩病虫尸中培养、分离蜜蜂球囊菌。通过RT．PCR检测所收集的球囊菌菌丝中常见7种蜜蜂病毒的存在情况。我们发现IAPV、黑蜂王台病毒(Blackqueencellvirus，BQCV)及DWV这三种病毒可以在球囊菌丝中被检测出，此外，这些病毒对应的反义链亦可以被检测出，说明球囊菌可能是IAPV、BQCV及DWV新的传播载体，这一发现揭示了蜜蜂病毒的一个新的生物学特征。系统进化分析发现源于蜜蜂、球囊菌的病毒序列形成了一个单源的进化关系，但形成两个很明显的不同的进化簇。区别于蜜蜂病毒序列，来自于球囊茵的病毒基因序列组成了一个很明显的谱系。3．IAPV感染影响蜜蜂的蔗糖反应性行为及蜜蜂的归巢能力本研究通过蜜蜂PER行为和RFID技术两个方面来研究IAPV对意大利蜜蜂采集行为及归巢能力的影响。来源于健康蜂群(无可检测水平的蜜蜂病毒感染)的花粉采集蜂被人为地注射IAPV以诱导病毒感染的状态。结果表明，与未被IAPV感染的蜜蜂相比，被IAPV感染的蜜蜂对低浓度的糖水反应性更强。两天后，在被IAPV感染的蜜蜂头部可检测到大约lO‘7拷贝的病毒粒子。此外，与未被IAPV感染的蜜蜂相比，被IAPV感染的蜜蜂的归巢能力显著降低(p<0．05)。然而，IAPV感染不影响蜜蜂的致敏化反应及习惯化反应。实验数据表明IAPV在蜜蜂头部的感染或许使得IAPV能够让蜜蜂的采集行为发生紊乱并扰乱蜜蜂大脑负责学习、导航及定位的功能，结果使得蜜蜂对蔗糖溶液的反应阈值降低并在归巢的途中迷失。4．东方蜜蜂徼孢子虫、蜂螨共同侵染蜜蜂对蜜蜂体内IAPV滴度及相关免疫基因表达影响的初步研究 蜜蜂微孢子虫(Nosemaeeranae)、蜂螨(Varroadestructor)对蜜蜂的协同侵染可以影响蜜蜂体内IAPV滴度及蜜蜂抗菌肽、Eater、卵黄蛋白原等免疫相关基因的表达，但免疫基因表达的变化趋势不是很明显，有的甚至呈相反的表达趋势，这些初步的数据显示蜜蜂微孢子虫、蜂螨、IAPV及蜜蜂之间相互作用关系的复杂性。关键词：西方蜜蜂；以色列急性麻痹病毒；采集行为；归巢行为；差异基因表达；球囊菌；狄氏瓦螨；东方蜜蜂微孢子虫 AbstractThehoneybeecolonylossesacrosspartsoftheworldinrecentyearsandthathoneybeecoloniesdisappearedabruptlyintheUSandpartsofEuropefromwinter2006tospring2007havetriggeredpollinationcrisis．Thesuddencollapseofhoneybeecoloniesisknownascolonycollapsedisorder(CCD)andWaSinitiallythoughttObecausedbyIsraeliacuteparalysisvirus(认PⅥ．Followingmoreresearch，itisgenerallyacceptedthatavarietyoffactorsincludingVarroadestructor，viruses，Nosemaspp．，pesticideresiduesandpoornutritionmaycauseCCD．Besides，interactionsbetweentheseproposedfactorsmayberesponsibleforthecolonylossesreportedworldwideinrecentyearsViralprevalenceofcommonhoneybeevirusesincludingIAPV，Deformedwingvirus(DWV)，Chronicbeeparalysisvirus(CBPV)，Acutebeeparalysisvirus(ABPV)，Sacbroodvirus(SBV)andKashmirbeevirus(KBV)wassurveyedinpartsofZhejiangprovince，andcomparisonsbetweenAp话melliferaandApisceranaforpathogendiversityanddifferentialexpressionofimmunegeneswerefurtheredanalyzedinthestudy；fLrStdetectionofhoneybeevirusesincludingIAPV，BlackqueencellVIRUS(BQCV)andDWVandtheirreplicationinthefungiAscosphaeraapis口．ap／s)uncoversanewbiologicalfeatureofhoneybeeviruses；effectsofIAPVonsucroseresponsivenessandhomingabilityofpollenforagerswereinvestigatedbasedonproboscisextensionresponse(PER)andradiofrequencyidentification(RFID)techniques；synergisticeffectsoftwopathogensincludingVarroamitesandNosemaceranaeonIAPVtiterdynamicsandexpressionofimmunegenesinhoneybeeswerealSOstudied．TheseresultsWe：l"esummarizedasfollows：1．AsurveyofsixhoneybeevirusesinZhejiangprovinceandcomparisonsbetweenApismelliferaandApisceranaforpathogendiversityandmolecularmechanismsunderlyingthedifferentialresponsetopathogensSamplescollectedfrom38typicalapiarieslocatedin7differentregionsofZhejiangprovinceweretestedforpresenceofsixcommonhoneybeeviruses．ThemostprevalentviruswasIAPV．withthedetectionrateof29％inallsamples，followedbyDWV(27％)，KBVV (5％)，SBV(5％)，CBPV(4％)andABPV(3％)．Examinationoftissuetropismofthevirusesshowedthatthoraxandabdomenofcrawlingbeesanddeadbeesweremorelikelytobepositiveforviruses．Aregionalsurveycoveringhoneybeeviruses，miteandWaXmothinfestation，pesticidepoisoning，foulbrood，chalkbrood，whicharedetrimentaltothehealthofcolonieswascarriedoutinthestudy．Of141apiarylocationsconsistingofcoloniesofApismelliferaligustica∞m0，5％ofapiariessufferedfrominexplicablecolonylosses．Honeybeecoloniesfromabout80％ofapiarieswereobservedwithdifferentlevelsofVarroamiteinfestation．21％ofapiarieshadchalkbrood．and6％ofapiarieshadfoulbrood．18％ofapiariesunderwentcolonylossesresultingfrompesticidepoisoning．39apiariesraisingA．ceranacerana(Ace)didnotconfrontwithcolonymortalityorVarroamitescomparedwithA．mellifera．Nearly90％ofAceapiariesweremoreorlessinfectedwiththegreaterwaxmoth(Galleriamellonella)，followedbyfoulbroodpositiveapiaries(18％)．GiventhedifferencesinbiologyandpathogendiversitybetweenAceandAml，wefirstusedtheUlumina—SolexadeepsequencingtechnologytodescribethedifferencesintheheadsofAceandAmlforagersatthegeneexpressionlevel，andfoundabout2,370differentiallyexpressedgenesrelatedtometabolism，immuneandstressresponsebetweenAceandAml．ThedifferentialexpressionofantimicrobialpeptidegenessuggestedthatthedefensemechanismsagainstpathogenicmicrobesinAceandAmlaredifferentfromeachother．Thatmaybeareasonwhytherewerenoreportsabouttheunusualmortalityofeasternhoneybee似cc)coloniesincomparisontothedrasticlossofwesternhoneybee@．mellifera)thathasbeenoccurringworldwideinrecentyears．2．FirstdetectionofhoneybeevirusesandtheirreplicationinthefungiAscosphaeraTheAscosphaera印蠡口．ap／s)isafungalpathogenofhoneybeescausingchalkbroodinhoneybeelarvaeandithasbeenshownthatfungalvirusesormycoviruseshavebeenfoundtobewidespreadinallmajorfungaltaxa．Therefore，thechalkbroodmummiesfromwhichtheA．apiswasculturedandisolated,andthemyceliumofA．ap／swereful"therused fordetectingthecommonhoneybeevirusesinthepresentstudy．WedemonstratedthathoneybeevirusesincludingDWV，Blackqueencellvirus(BQCV)andIAPVcouldinfectandreplicateinthefungalpathogenA．印括thatcauseshoneybeechalkbrooddisease，revealinganovelbiologicalfeatureofhoneybeevimses．ReplicationofhoneybeevirusesinA．ap／sindicatedthatA．apismayactasapossiblevectorduringhoneybeevirusestransmission．Thephylogeneticanalysisshowedthatphylogeneficrelationshipsbetweenvirusesoffungalandhoneybeeoriginsareallmonophylefic，formingtwoclustersinthephylogenetictreesdistinctly．VirusesfromA．ap／sconstituteadistinctivelineage，separatedfromthecladesofvirusesidentifiedinhoneybees．Furtherstudiesarewarrantedtoinvestigatetheimpactofthevirusesonthefitnessoftheirfungalhostandphenotypiceffectsthevirus-funguscombinationhasonhoneybeehosts．3．Viralinfectionaffectssucroseresponsivenessandhomingabilityofforagerhoneybees，ApesmelliferaL．Inthepresentstudy,theeffectsofahoneybeevirus，IAPV，ontheforagingbehaviorsandhomingabilityofEuropeanhoneybees(ApismellifeFaL．)wereinvestigatedbasedonPERassaysandRFIDsystems．ThepollenforagerhoneybeesoriginatedfromcoloniesthathadnodetectablelevelofhoneybeevirusesandweremanuallyinoculatedwithIAPVtoinducetheviralinfection．TheresultsshowedthatIAPV—inoculatedhoneybeesweremoreresponsivetolowsucrosesolutionscomparedtothatofnon—infectedforagers．Aftertwodaysofinfection，around107copiesofIAPVweredetectedintheheadsofthesehoneybees．ThehomingabilityofIAPV—infectedforagerswasdepressedsignificantlyincomparisontothehomingabilityofuninfectedforagers．However，sensitizationtestandhabituationtest，twopatternsofnonassociativelearning，showednosignificantdifferencebetweenforagersinfectedwithIAPVandforagersinfectedwithPBS．Thedataprovidedevidencethat／APVinfectionintheheadsmayenablethevirustodisorderforagingrolesofhoneybeesandtointerferewithbrainfunctionsthatareresponsiblelearning，navigation,andorientationinX thehoneybees，thus，makinghoneybeeshavealowerresponsethresholdtosucroseandlosetheirwaybacktohive4．EffectsofVarroamitesandNosemaceranaeonIAPVfiterdynamicsandexpressionofimmunegenesinhoneybeesIAPVliterdynamicsandexpressionofAbaecin，EaterandVitellogenin(Vg)inhoneybeesCanbeaffectedbyCO-infectionwithVarroamitesandNosemaceranae．However，110obvioustrendregardingexpressionofilrlnaunegeneswasfoundinstudy．Someim_rllunegenesshowedtrendsoppositeexpecttrends．ThispreliminarystudyindicatedthatcomplicatedinteractionsbeweenNosemaceranae、mites、IAPVandhoneybees．Furtherstudyisneededregardingcomplicatedinteractions．Keywords：ApismeHifera；Israeliacuteparalysisvirus；foragingbehavior；homingability；differentialgeneexpression；Ascosphaera印括；Varroadestructor；Nosemaceranae 第1章文献综述1．1蜜蜂健康及其主要影响因素的研究概述作为重要的社会性昆虫，蜜蜂(apismeUifera，昆虫纲：膜翅目)在个体水平与群体水平都表现出重要的行为及生物学特征[1]。尤其在2006年蜜蜂基因组测序工作的完成后【21，蜜蜂已成为遗传学、病理学、行为学等研究领域的重要模式生物之一。蜜蜂在采集过程中表现出的舞蹈行为，蜜蜂个体间的交哺行为，在蜂群水平上表现出的劳动分工行为及蜜蜂在个体水平与群体水平表现出不同的防御行为等[1】。这些重要的行为及生物学特征使得蜜蜂成为生物学研究中的重要研究对象。此外，作为全球蜂群数量最多的蜂种，西方蜜蜂(apismelliferaL．)对植物的授粉作用对全球的食品生产及经济发展亦有重要的贡献。全球范围内，约35％的农作物一定程度上均需要依赖授粉作用【3]，而杏仁、苹果、向日葵、苜蓿等农作物几乎完全(90％一100％)依靠蜜蜂授粉【41。据美国农业部估计金美每年通过蜜蜂授粉而增加的产值在150．200亿美元[5】。据初步计算，蜜蜂授粉每年给中国农业生产增值约3，000亿人民币，占全国农业总产值约12％[6]。无论是从科学研究方面还是在实际生产中，蜜蜂都具有极其重要的价值。然而，近年来，全球范围内发生了不同程度的蜂群减少的事件[71，其中，美国有约30％的蜂群损失，欧洲则有1．8％．53％的蜂群损失，虽然自1961年以来，全球的蜂群数量增加了约45％，但这种欧美等国家地区性的蜂群损失事件仍然引起了科学家的关注并引发人们对授粉危机的担忧[7，81。尤其是2006年冬至2007年春，美国发生了大范围的蜜蜂突然消失的现象，区别于早春蜂群群势减弱的正常现象，这次蜜蜂损失数量竟占整个蜂群总数的80％．100％，同样的现象也发生在欧洲的部分养蜂场。科学家将其定义为蜂群崩溃失调症(colonycollapsedisorder，CCD)。表面看起来很健康的蜂群短时间内大量成年工蜂突然消失，在巢脾上只剩下蜂王、幼虫和一些未成年工蜂以及花粉等残留食物，且在蜂箱内并无死亡蜜蜂的残存尸体，也没有寄生害虫的存在[91。蜜蜂的大量突然消失，在美国、欧洲等国家引发了严重的授粉危机‘10，11】。自CCD于2006年冬至2007年春在美国发生以来，关于引发CCD的原因至今仍在调查之中，到目前为止，科学家们对CCD的各种可能的致病因素一一做了研究分析，推测了包括以色列急性麻痹病毒(Israeliacuteparalysisvirus，IAVV)、蜂螨、农业杀虫剂、转基因作物、真菌、营养甚至手机辐射等各种可能的致病因素【12’14】。现在则普遍认 为是多种因素(蜂螨、杀虫剂、病毒等)之间的协同作用而导致蜂群的大量损失‘8，13】，病害的协同侵染加速了蜂群的消亡。影响蜜蜂健康的因素主要有生物因素与非生物因素，主要的生物因素有大蜂螨(Varroadestructor)，病毒，蜜蜂微孢子虫(Nosemaspp．)，白垩病(Chalkbrood)等；非生物因素则主要有杀虫剂，营养不良等。有的病害只侵染成年蜜蜂如：蜜蜂微孢子虫；有的病害只侵染蜜蜂幼虫如引起幼虫白垩病、美洲幼虫腐臭病(AmericanFoulbrood)等病原微生物；而有的病害则既侵染幼虫发育阶段也侵染成年蜜蜂如蜂螨、病毒。1．1．1大蜂螨在所有蜜蜂病害中，蜂螨是养蜂业中最为普遍且最为严重的蜜蜂寄生性病害【”]。蜂螨的最初寄主是东方蜜蜂(Apiscerana)，后来转移至新的寄主西方蜜蜂【l郇。东方蜜蜂通过自身一系列的清洁行为如：自我清理行为、互相清理行为、群体清理行为等可以有效地去除掉身上的蜂螨，这些被清除掉的蜂螨随后在几秒至几分钟的时间内被杀死并从蜂箱内清理出去[17】。与东方蜜蜂相比，西方蜜蜂与蜂螨之间缺乏长期协同进化的过程，最终导致蜂螨寄生在蜜蜂身上并导致蜜蜂的死亡【18】。通过抑制蜜蜂体内的大分子尤其是蛋白质的代谢，从而使得蜜蜂不能获得花粉中的蛋白质营养¨9】。蜂螨通过吸食蜜蜂的血淋巴而寄生于成年工蜂、蜜蜂幼虫及蜂蛹上，发育中的蜜蜂幼虫或者蜂蛹若被蜂螨寄生则会导致新出房蜜蜂体重的减轻[”]，蜂螨寄生成年工蜂则会导致工蜂过早地从事采集活动进而缩减工蜂的寿命‘20，211。此外，蜂螨的寄生还会影响蜜蜂的行为，使得被侵染工蜂的非联想学习能力减弱‘221，降低被侵染工蜂的归巢能力[231。蜂螨还可以与其它致病病害或因子协同侵染蜜蜂进而影响蜜蜂的健康。蜂螨对蜜蜂的寄生抑制了蜜蜂的免疫能力口41，一方面更利于蜂螨以吸食蜜蜂血淋巴的方式寄生于蜜蜂身上[251，另一方面促进了其它病害如病毒、东方蜜蜂微孢子虫等对蜜蜂的侵染，同时也促进了环境因素如农药、天气因素等对蜜蜂的影响【15】。蜂螨在促进病毒对蜜蜂感染的同时，其自身亦是多种蜜蜂病毒的传播载体【15，26，271。此外，在蜂螨未侵染西方蜜蜂之前，病毒对蜜蜂感染的不利影响较小[15,28]。蜂螨通过对蜜蜂血淋巴的吸食，向蜜蜂体内注入了蜂螨自身含有蛋白质的唾液分泌物同时向蜜蜂传播了其自身所携带的病毒(如IAPV等)并激活了蜜蜂身上潜伏性感染的病毒，从而造成被侵染蜜蜂表现出残翅、腹部短小等一系列典型症状[29,30]。 1．1．2病毒病毒已成为威胁蜜蜂健康的重要病原之一，尤其是当病毒与蜂螨协同侵染蜜蜂时，对蜂群健康的影响更为严重㈦311。到目前为止，已在蜜蜂身上检测、分离到约20种不同的病毒，绝大部分属于单股正链RNA病毒，具有基因组较小、突变率高等特征。且绝大多数是由西方蜜蜂身上分离出，少部分是从东方蜜蜂身上分离出。常见病毒主要包括急性蜜蜂麻痹病毒(Acutebeeparalysisvirus，ABPV)、黑蜂王台病毒(Blackqueencellvirus，BQCV)、蜜蜂慢性麻痹病病毒(chronicbeeparalysisvirus，CBPV)、蜜蜂残翅病毒(Deformedwingvirus，DWV)、克什米尔蜜蜂病毒(Kashmirbeevirus，KBV)，囊状幼虫病毒(Sacbroodvirus，SBV)及IAPV等[31-33】。1．1．2．1病毒的遗传结构特征在已发现的病毒中，除了蜜蜂线病毒(filamentousvirus，FV)与蜜蜂虹彩病毒似．iridescentvirus)为DNA病毒，其它蜜蜂病毒都属于单股正链RNA病毒，大部分蜜蜂病毒被归类至两个科中：传染性软化病毒科(Ifiaviridae)、双顺反子病毒科(Dicistroviridae)[341。均具有类似微RNA病毒目(Picomavirales)病毒的基本特征：1)基因组为一蛋白质外壳包围着一条正链RNA；2)区别于细胞内mRNA5’端与甲基化鸟嘌呤核苷相连，病毒RNA基因组的5’端与病毒末端结合蛋白VPg(genome—linkedviralprotein，VPg)相连，VPg起着稳定RNA基因组5’端的作用并作为复制、转录的引物；3)5’端存在一包含有三叶草形二级结构的较长的非编码区域(untranslatedregion，UTR)，参与启动翻译的过程；4)3’端则与多聚腺苷酸poly㈥相连，不同病毒的多聚腺苷酸的长度并不一致。基因组RNA的3’端序列则会折叠成茎环结构，参与病毒RNA的复制过程‘3¨。衣壳蛋白可以保护病毒RNA免遭RNA酶(RNase)、不利环境等因素对RNA的降解反应，在决定病毒宿主特异性及组织嗜性方面，衣壳蛋白也起着重要的作用。蜜蜂病毒衣壳蛋白外壳是由60个重复的原聚体组成，每个原聚体是由单个分子的三类亚基VP2、VP3及VPl组成。除了这三个亚基外，还存在一个较小的分子蛋白质VP4，其存在于BQCV、ABPV等病毒粒子中[35，361。VP4并不存在病毒粒子的外表面，而是位于VPl下面五重轴的内表面上。此外，双顺反子病毒(dicistroviruses)与传染性软化病病毒(iflavimses)之间的VP4蛋白的位置是不同的。 到目前为止，七种蜜蜂病毒的全基因组序列已经测出，它们是ABPV[351，BQCVt361，CBPV[371，DWV[381，IAPV[331，KBV[391，Kskugovirus(KV)t加1，SBV【411。除去poly(A)的长度。上述常见蜜蜂病毒基因组的长度在5,980．10，140bp之间。根据它们的基因组结构及复制酶的特征，它们都属于小核糖核酸病毒总科(Picornaviridae)，Picornaviridae总科的大部分病毒仅有一个大的开放读码框(ORF)，其5’端编码衣壳蛋白，3’端编码复制酶【311。虽然Dicistroviridae科属于Picornaviridae总科，但是Dicistroviridae科病毒成员的遗传结构特征明显不同于Picornaviridae总科的其它病毒成员【31，331。BQCV，KBV，IAPV及ABPV属于Dicistroviridae科，ABPV，KBV，IAPV是Dicistroviridae科中亲缘关系很近的三种病毒【421。与dicistrovims中的其它病毒成员一样，ABPV、BQCV、IAPV、KBV的基因组为单组分双顺反子(monopartitebieistronic)，近5’端的ORF编码非结构蛋白，近3’端的ORF编码结构蛋白。这两个开放读码框被一称作基因间区域(intergenicregion，IGRl的非编码区隔开，5"-UTR与IGR包含有可以发挥内部核糖体进入位点(internalribosomalentrysite，IRES)功能的RNA序列，IRES序列高度保守，其可以促进帽不依赖翻译(CAP．independenttranslation)病毒蛋白机制的启动。IGR中所含有的IRES是Dicistroviridae科病毒的一个显著特征，IRES亦存在于小核糖核酸病毒及其它dicistroviruses的5"-UTR。它被认为是病毒避免及可能干扰宿主的帽依赖性信使RNA翻译机制(CAP．dependentmRNAtranslation)的一种方式，因为与帽依赖性的翻译机制相比，IRES介导的翻译机制需要非常少的宿主因素‘31，421。SBV与DWV则属于Iflaviridae科，SBV、DWV、KV具有典型的iflaviruses单组分单顺反子(monopartitemonocistronic)基因组结构，近5，端的ORF编码结构性蛋白，近3’端的ORF编码非结构性蛋白m341。CBPV、KV等蜜蜂病毒还未被正式分类【431。1．1．2．2病毒的传播途径及便染机制病毒是专性细胞内寄生物，只能利用宿主细胞的代谢系统进行增殖，为了存活，病毒必须要感染并传播至新的宿主。病毒传播的途径主要有水平传播和垂直传播。水平传播则为病毒在同代蜜蜂的不同个体间进行传播，垂直传播则为病毒由母代通过卵传至子代蜜蜂个体[3I]。水平传播的方式主要有：通过污染食物介导的传播(如含有病毒的花粉)，粪．口传播，性传播，空气介导的传播，媒介生物介导的传播(如蜂螨)。垂直传播的方式可以进一步分为：卵表传播(transovumtransmission)，即病毒经卵的表面而进行的传播：介卵性传播(transovariantransmission)，即病毒经卵的内部而进行的传引31】。值得 一提的是，花粉不仅可以传播蜜蜂病毒，植物花粉所含有的植物病毒还可以传播至蜜蜂及蜂螨体内【441，在蜜蜂体内不仅检测到烟草环斑病毒(tobaccoringspotvirus，TRSV)并检测到了TRSV的反义链，在蜂螨体内亦检测到TRSV，为病毒跨界传播提供了证据。蜜蜂病毒完全在宿主的细胞质内进行复制，病毒粒子黏附于宿主细胞的表面并与细胞膜表面的受体发生相互作用进而将自身的RNA基因组释放至宿主细胞内。在宿主细胞内，病毒的RNA基因组起着3个重要的作用：1)作为mRNA翻译转录成蛋白质；2)作为病毒复制的模板；3)复制成的新的RNA基因组与结构蛋白一起组装新的子代病毒粒子。刚进入宿主细胞内，充当mRNA功能的RNA基因组被翻译转录成蛋白质前体，后经一系列剪切过程而形成结构性蛋白与用于RNA复制过程的功能性蛋白。在RNA依赖性RNA聚合酶(RNA—dependentRNApolymerase，RdRP)的作用下，正链RNA基因组被复制形成一个反义链，后以此反义链为模板复制形成新的RNA基因组，RNA基因组与结构性蛋白组装形成新的子代病毒粒子[3¨。由于稳定蜜蜂细胞系的缺乏，尽管近年来蜜蜂细胞培养技术取得了进展‘45，461，但细胞水平上病毒侵染机制的研究依然缺乏。潜伏性感染、持续性感染是病毒感染蜜蜂的主要表现形式，病毒感染较少出现急性疾病或者致死性疾病，这或许是蜜蜂自身免疫反应与病毒毒力达到一个平衡状态的结果[311。在蜂群中，有些蜜蜂通常会被几种蜜蜂病毒同时感染，此外被病毒感染的蜜蜂通常亦被其它病原或者寄生性病害侵染(如蜂螨、蜜蜂微孢子虫)，所以很难将某一特定症状与病毒感染结合起来‘311。通过分子技术手段如RT．PCR，qRT．PCR可以将病毒对蜜蜂的感染现象进行量化，以便发现病毒感染蜜蜂的初步规律，如不仅在残翅蜜蜂身上检测到DWV的百分比为100％，在一些表面看起来健康的蜜蜂身上检测到DWV的概率为70％，具有明显疾病症状蜜蜂身上的DWV量比表面看起来健康的蜜蜂身上的DWV量高4．4倍[471。此外，虽然在整只蜜蜂身上检测到Dwv的百分比较高，但在蜜蜂的头部检测到DWV等常见病毒的百分比却很小，之前的研究表明在蜜蜂头部检测到DWV表明DWV呈显性感染状态，其也是由DWV感染导致蜂群损失的一个标志‘48巧o]。通过患病蜜蜂与健康蜜蜂受损体壁绒毛的细胞质之间的相互接触，KBV，CBPV及ABPV等病毒可以从被感染蜜蜂传染至健康蜜蜂【5¨。虽然病毒感染蜜蜂的最初位置一般 都是在受损的体壁或者肠腔，但病毒可以通过血淋巴循环或者神经系统而扩散并感染其它组织【5I】。由于病毒编码的RNA聚合酶缺乏3’一5’核酸外切酶的校正活力嗍，RNA病毒具有很高的突变率以适应新的环境及扩展宿主范副53，5钔。除了在膜翅目昆虫(意大利蜜蜂、中华蜜蜂)检测到蜜蜂病毒[55，561，在非膜翅目昆虫(独居蜜蜂、熊蜂、胡蜂等)也检测到蜜蜂病毒的存在[56，571。蜜蜂病毒可以感染不同物种的宿主反映了遗传的变异性及蜜蜂病毒的准种(quasispecies)特性。当病毒扩展至不同的生态位并感染新的宿主时，适应新环境的病毒变异体或许已经形成并存在于病毒群体中[311。1．1．3蜜蜂微孢子虫微孢子虫是昆虫及其它无脊椎动物常见的一类专门寄生于细胞内的微生物‘581。西方蜜蜂微孢子虫(Nosema印括)与东方蜜蜂微孢子虫(Nosemaceranae)是侵染蜜蜂的两种微孢子虫，它们只侵染成年蜜蜂的消化道而引起蜜蜂肠道方面方面的疾病，它们在蜜蜂中肠上皮细胞中进行繁殖，最终可形成多至数百万的孢子[59，删。Nosemaapis是感染西方蜜蜂(Apismellifera)的微孢子虫，虽然在西方蜜蜂中流行广泛，但一般认为Nosemaapis对蜜蜂的危害并不是很大[611。近年来，Nosemaceranae成为侵染西方蜜蜂的主要微孢子虫‘62删，并成为欧洲部分地区蜂群损失的原因之一【651。可能是由于Nosemaceranae与西方蜜蜂之间缺乏协同进化的过程，Nosemaceranae对蜜蜂的毒力比Nosemaapis对蜜蜂的毒力更强‘661。同时在其它蜂种如：熊蜂(Bombusspp．)、大蜜蜂(Apesdorsata)、小蜜蜂(Apisflorea)中也发现了东方蜜蜂微孢子虫的存在【67’6引。与对照组蜜蜂相比，被Nosemaceranae感染蜜蜂血淋巴中的海藻糖浓度不仅较低，且海藻糖浓度消退地速度也较快，这或许是被感染蜜蜂飞行能力较差的原因‘691；被Nosema#eral．1口P感染蜜蜂对低浓度糖水的反应性更强[701，寿命缩短，并出现过早进行采集活动的现象，影响被感染蜜蜂的归巢能力[711。且对蜜蜂的卵黄蛋白原基因(vitellogenin，Vg)表达产生不利影响：正常蜜蜂在8日龄时Vg基因的相对表达水平达到顶峰，而被Nosemaceranae感染蜜蜂在8日龄时Vg基因的相对表达水平减少3．5倍；此外，被Nosemaceranae感染蜜蜂血淋巴内的保幼激素(Juvenilehormone，JH)滴度增加了1．4倍，且在8日龄时比对照组蜜蜂血淋巴内的JH滴度增加2．1倍‘591。被Nosemaceranae感染的工蜂亦可通过水平传播的方式将孢子传播给蜂王[721，被感染蜂王的Vg 基因的相对表达水平同样发生了改变‘731。此外，被低浓度吡虫啉(浓度低于可以影响蜜蜂寿命或者采集行为的剂量)处理过的蜂群的蜜蜂的微孢子的数量显著增加[74]。Nosemaceranae与病毒感染(DWV，BQCV)的关系可能是协同侵染对蜜蜂健康造成更大危害或者呈负相关的关系抑或是没有关系[75-77]。1．1．4真菌蜜蜂的真菌性疾病主要包括白垩病、蜜蜂曲霉病，它们只感染蜜蜂的幼虫，白垩病是由蜜蜂球囊茵(Ascosphaeraapis，爿．印括)引起的，而蜜蜂曲霉病则是由曲霉菌(Aspergillusspp．)引起的[7引。蜜蜂曲霉病在蜂群中发现的较少，研究的较少。白垩病则是蜜蜂幼虫发现较早的，最为常见的真菌性疾病[791，由于低温、潮湿的天气利于真菌的生长，所以白垩病主要在春季流行【801，在夏季，由于温度的升高，白垩病的发病率及流行率都有所降低[811。通过取食被孢子污染的食物，蜜蜂球囊茵通过幼虫肠道而进入幼虫体内，在被侵染的幼虫中，菌丝穿透肠壁进而在幼虫体腔内生长、繁殖。几天后，菌丝从幼虫腹部刺出而其头部仍然完整【J78】，进而在蜜蜂幼虫体表形成棉花状的白色菌丝，随后，在气生菌丝上形成孢子囊。孢子囊内则含有蜜蜂球囊菌孢子，孢子可以在环境中呈休眠状态并在数年内保持活力182]。作为引起蜜蜂幼虫疾病的病原，蜜蜂球囊菌一般仅会感染蜂群中的一小部分幼虫，具有卫生学行为的工蜂可以发现并将患病幼虫从蜂群中拖出，群势较强的蜂群亦可以从白垩病症状中恢复【83】。尽管在整个蜂群水平上，蜜蜂球囊菌对蜜蜂幼虫的影响通常并不是很严重，但不同菌株的蜜蜂球囊菌对蜂群的侵染表现出不同的毒力，在实验室培养幼虫的条件下，有的菌株可以导致12％．14％的幼虫死亡率，而有的菌株则可以导致71％一92％的幼虫死亡率，但这种不同菌株对不同蜂群幼虫毒力的差异也体现了蜜蜂遗传背景的差异对抵御病原的重要性[841，这也为培育抗白垩病蜂种提供了依据。通过数量性状遗传位点(Quantitativetraitloci，QTL)分析具抗白垩病性状的幼虫发现在蜜蜂第1t染色体上存在了该性状的相关遗传信息[85】。此外，蜜蜂球囊菌对幼虫的影响与幼虫的日龄也有一定的关系，1-2d的幼虫被球囊菌侵染后，很快停止取食并可以存活36—48h，在出现明显症状前死亡。3-4d的幼虫被球囊茵侵染后，可以继续取食，但取食量有所减少，可以在感染约72h后看到幼虫体表长出的菌丝[8¨。通过对球囊菌的转录组分析发现了球囊菌的基因参与、涉及了多个功能类别，如：真菌的繁殖、细胞内信号转导、应激反应， 对宿主的毒力性及逃脱宿主免疫反应的机制等，但其具体的分子机制仍有待于进一步研究【82】。1．1．5杀虫剂近年来，新烟碱类(neonicotinoid)等杀虫剂对蜜蜂健康的影响，越来越引起人们的关注。新烟碱类杀虫剂包括吡虫啉(imidacloprid)、啶虫脒(acetamiprid)、噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻虫啉(thiacloprid)、呋虫胺(dinotefuran)及烯啶虫胺(nitenpyram)。作为神经毒素，它们主要作为昆虫烟碱型乙酰胆碱受体OAChR)的拮抗剂r86，87】。一些研究已表明经由吡虫啉处理过的向日葵(Helianthusannuusl种子长成向日葵植物后，可以在向曰葵的花蜜、花粉中检测到吡虫啉的存在[88】，而这些烟碱类杀虫剂最终会出现在蜂粮、蜂蜜、蜂蜡等蜂产品中，进而可能对蜜蜂造成危害、进而对人类的健康造成影响。杀虫剂对蜜蜂的急性或慢性致死毒性危害取决于杀虫剂的剂量及给药途径。通过饲喂的方式给药比体壁接触的方式毒性大【891。急性致死毒性的评估主要是基于给药24．48h后，观察死亡蜜蜂的数量进而计算出对应的致死中量(LD50或LC50)‘891。根据24h后对LD50的计算，不同烟碱类杀虫剂具有不同的急性致死剂量：吡虫啉(18ng／只)、噻虫胺(22rig／只)、噻虫嗪(30ng／只)、呋虫胺(75ng／只)、烯啶虫胺(138ng／只)、啶虫脒(7ug／只)、噻虫啉(15ug／只)∽】。慢性致死毒性则观察的时间较长，通过饲喂或体壁接触的方式给药10．11d后，啶虫脒(1ug／只)、噻虫嗪(1ng／只)对蜜蜂的死亡率没有显著性影响[911。烟碱类杀虫剂对蜜蜂行为的影响比较明显，与正常的蜜蜂相比，亚致死剂量的吡虫啉(50ug／L一1，200ug／L)影响蜜蜂的采集行为，被亚致死剂量吡虫啉处理过的蜜蜂的采集时间间隔变长，归巢时间变长，有的蜜蜂采集后并不归巢【92]。被非致死剂量(1．34ng溶于20ul蔗糖溶液)的噻虫嗪则会影响蜜蜂的归巢能力【93】。此外，杀虫剂还会对蜜蜂的繁殖、越冬蜂的健康产生不利影响[891。除了杀虫剂本身对蜜蜂健康的危害，杀虫剂亦会促进其它病害(蜜蜂微孢子虫、病毒)在蜜蜂体内繁殖并与这些病害协同作用而对蜜蜂进行侵染‘941。对被亚致死剂量吡虫啉处理过的蜜蜂饲喂蜜蜂微孢子虫10天后，蜜蜂体内的微孢子数量显著性增加【741。亚致死剂量的噻虫胺、吡虫啉可提高对NF．kB免疫信号通路产生负调节作用的抑制剂的基因表达水平进而对蜜蜂的抗病毒免疫能力产生不利影响，导致蜜蜂体内病毒(D唧 拷贝数的提高f951。此外，与果蝇(Drosophilamelanogaster)、冈比亚按蚊(Anophelesgambiael相比，蜜蜂基因组中编码异源物质解毒酶基因的数量较少。编码谷胱甘肽一S．转移酶(glutathione．S．transfcrascs，GSTs)、细胞色素P450单氧化酶(cytochromeP450monooxygenases，P450s)、羧基／胆碱酯酶(carboxyl／cholinesterases，CCEs)等蛋白基因的数量约是果蝇、冈比亚按蚊的一半，这也从基因组水平上部分解释了蜜蜂对杀虫剂敏感的原因[96]。1．1．6营养不良充足的营养是蜂群生存、发展的基础，蜂群的健康不仅仅指没有疾病，而且指蜂群中营养健全的个体能够产生抵抗寄生性病害、病毒、杀虫剂等外界不良因素的子代个体[971。营养的缺乏将会导致个体对各种病害抵抗能力的下降【98‘99]。充足的营养则有助于蜜蜂降低对杀虫剂的敏感性，提高蜜蜂抵抗诸如蜜蜂徽孢子虫、细菌及病毒等病害的能力并改善蜜蜂自身的免疫功剿14，100郴31。蛋白质食物对蜜蜂健康的影响通常通过测定血细胞浓度、脂肪体含量、酚氧化酶活力、葡萄糖氧化酶等生理参数来反映。血细胞浓度间接地反映了蜜蜂的细胞免疫能力，脂肪体含量则反映了蜜蜂的体液免疫能力，酚氧化酶活力则同时反映了细胞免疫能力和体液免疫能力，葡萄糖氧化酶被蜜蜂用于蜂群及幼虫食物杀菌的过程，其可作为反映蜂群社会免疫能力的参数[1031。给蜜蜂饲喂含有蛋白质的食物可以改善蜜蜂的个体免疫能力、社会免疫能力，且食物的多样性可以提高蜜蜂的免疫能力。与单一植物纯花粉相比，多种植物混合花粉可以提高葡萄糖氧化酶的活力【∞孙。这些蛋白质营养改善了蜜蜂的免疫能力进而提高蜜蜂的抗病能力。与取食花粉的蜜蜂相比，仅食用糖水的蜜蜂头部蛋白质溶度较低、咽下腺比较小，体内DWV的病毒量较高【141。此外，花粉(蛋白质)增强了蜜蜂体内的大分子代谢活力并激活了组织生长、发育必需的TOR代谢路径，花粉中的营养成分同时促进了蜜蜂体内编码抗氧化蛋白质(卵黄蛋白原、超氧化物歧化酶)等基因的表达[191。1．2蜜蜂的免疫昆虫个体抵御外源性物质或者病原的侵入主要依靠先天性免疫，其包括体液免疫、细胞免疫(如：吞噬作用、黑化作用及抗菌肽的分泌)‘1041。而作为社会性昆虫，蜜蜂对 病害的侵染表现出了独特的且为多层次的防御特征。蜜蜂不仅依靠个体免疫(individualimmunity)，而且依赖蜂群作为一个整体来发挥抵抗寄生虫、病害等的功能，这种群体水平的防御行为被称为社会性免疫(socialimmunity)t1051。1．2．1社会性免疫社会性昆虫(如蜜蜂、白蚁等)一方面通过劳动分工使得群体内部高效地运转，但另一方面群体生活及个体间的接触亦增加了一些病害(如病毒、细菌、真菌等)在群体内部传播的几率。虽然蜜蜂与一些独居性昆虫(如果蝇、蚊子及飞蛾等)的基因组相比，蜜蜂中的免疫基因的数量仅为这些独居昆虫的三分之一[1061，但面对不同类别的病害，蜜蜂在一定程度上仍能对它们进行有效的抵御。除了个体水平的防御之外，蜂群作为一个整体亦可对病害作出有效的防御，这些社会免疫包括巢房清洁行为、蜂群发热行为、使用环境中的抗茵物质(如树脂)构建巢房，互相清理行为等【105，107枷91。蜜蜂的卫生学行为(hygienicbehavior，HB)主要表现为发现并清除患病幼虫，这些患病幼虫可能源于不同病害的侵染，如细菌、真菌、蜂螨等【1091。通过比较卫生学行为表现良好(valToa．sensitivehygiene，VSH+)的蜜蜂与卫生学行为表现较差(VSH一)蜜蜂的脑部基因表达谱发现这两类蜜蜂脑部存在39个差异表达的基因(FDR4d)的长时记忆(Long．termmemory，LTM)[140，148,1491。这种方法对于建立条件反射行为是最为有效的。反之，US先于CS或者CS、US在PER反应过程中未成对出现，都会对蜜蜂的学习记忆能力产生抑制作用【140，148]。1．4．2．2非联想性学习致敏化反应(sensitization)与习惯化反应(habituation)是蜜蜂非联想性学习的两种主要形式‘1“，1481。 蔗糖溶液对蜜蜂的刺激会短暂地引起蜜蜂与取食相关反应的致敏化现象，此即为致敏化反应，如影响蜜蜂PER的可能性及强度。致敏化反应取决于蔗糖溶液刺激的次数、间隔时间及刺激位点(触角、吻或者同时刺激触角、吻)[1481。当用低浓度的蔗糖溶液反复刺激蜜蜂的一边触角时，蜜蜂不再伸吻，短时间内表现出习惯化反应，当用高浓度的蔗糖溶液反复刺激蜜蜂触角时，其习惯化反应形成的时间会长些。蜜蜂的习惯化反应仅局限于被刺激一侧的触角，当用高浓度蔗糖溶液刺激蜜蜂的另一侧触角时，蜜蜂的习惯化反应将被解除‘140，1481。一次实验刺激引起的蜜蜂习惯化反应持续的时间较短(<10min)，多次实验刺激引起的蜜蜂习惯化反应持续的时间较长(大约24h)t1481。习惯化反应的特征是反复刺激同一个触角，PER反应会逐渐减退以至最终消失，通过刺激另一个触角，可以恢复蜜蜂的PER行为反应【”03。习惯化反应中，反复刺激不会影响到对侧脑半球的生理功能，参与习惯化反应的神经回路可能仅局限于单一的脑半球。刺激强度和蜜蜂的饥饿程度是影响蜜蜂习惯化反应的两个重要因素。蜜蜂的习惯化反应与蜜蜂的状态也有关系，与饱食状态的蜜蜂相比，饥饿状态的蜜蜂PER反应会以更慢的速度消退，产生习惯化反应所需的试验次数也会更多[1501。1．4．3影响蜜蜂PER行为的因素影响PER行为的因素除了蜜蜂自身的遗传背景、目龄及在蜂群中的劳动分工状态等因素之外‘1451，还受到外源性的一些生物性因素(如：病毒、蜂螨等)、非生物性因素(如：杀虫剂等)的影响。Iqbal和Mueller通过注射的方式让蜜蜂感染DWV，与对照相比，被DWV感染的蜜蜂对低浓度糖水的反应性显著性增强，但对照组与被DWV感染的蜜蜂对高浓度糖水的反应性差异不显著。此外，被DWV感染蜜蜂的联想性学习能力亦受到抑制，但非联想性学习未受到影响[144]。Kralj等的研究指出蜂螨(Varroadestructor)对蜜蜂的寄生不影响蜜蜂对蔗糖溶液的反应行为【221。这也表明病毒和蜂螨对蜜蜂侵染可能存在的机制上的差异。Thany与Gauthier通过显微注射的方式将尼古丁注射到蜜蜂的触角神经叶并发现10。3M与104M浓度的尼古丁可以显著性地提高蜜蜂对蔗糖溶液反应的敏感度[15¨。Lambin等通过在蜜蜂胸部施以不同浓度的吡虫啉(新烟碱类杀虫剂，与昆虫的烟碱乙酰胆碱受体相互作用)以研究该杀虫剂对蜜蜂习惯化反应的影响，发现当每只蜜蜂被施 以1．25ng吡虫啉处理的时候，可以促进蜜蜂习惯化反应的形成，即蜜蜂形成习惯化反应所需的刺激次数变少‘”21。Ramirez—Romero等研究了由Bt玉米表达的CrylAb蛋白对蜜蜂学习能力的影响，结果表明蜜蜂在食用含有5000ppbCrylAb蛋白的糖浆后，蜜蜂的学习能力被打乱，在缺少食物奖赏的情况下，蜜蜂仍然会对气味刺激作出伸吻反应，最终有可能影响蜜蜂的采集效率‘”31。1．5蜜蜂归巢能力的研究蜜蜂通过“舞蹈语言”传递食物的信息，蜜蜂采集及归巢的行为活动受多种因素影响‘1541．如环境标志、采集地距离巢房的远近及蜜蜂自身的飞行、采集经验、方向等[1551。在定向飞行的过程中，蜜蜂会记住巢房、巢房周边及该地段范围内的环境标志【”51，在蜜蜂出巢飞行的过程中，通过感知“光流，，而估计飞行的距离[1551。在一定距离范围内，蜜蜂的定向飞行主要依靠学习、记忆环境中的标志来进行【1561，但当蜜蜂被置于一个新的环境中时，没有环境标志可以进行导航时。蜜蜂通过；‘路径整合’’来实现归巢飞行[1571。在归巢飞行的过程中，蜜蜂表现出一系列的行为特征：直接飞行至最近一次其所在的位置，然后频繁的改变飞行方向，努力寻找归巢的正确方向，最后快速的飞行至蜂巢。这些行为现象说明蜜蜂的空间记忆能力具有类似“地图”的组织形式并通过这样的空间记忆能力实现在熟悉地域定向飞行的能力【1581。近年来，RFID技术及谐波雷达(harmonicradar)技术被越来越多的应用于蜜蜂采集、归巢行为的研究当中，并通过这些技术手段，得到了关于归巢率、归巢速度、最大归巢距离、采集活力等采集行为的数据【”5，158J601。目前，越来越多的研究已证实亚致死剂量的吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺等杀虫剂影响蜜蜂的采集行为、采集活力及归巢能力【92·93,160,161]。Bortolotti等研究了三组不同亚致死剂量的吡虫啉(100ppb，500ppb及1000ppb)对蜜蜂采集能力及归巢能力的影响，与含有100ppb吡虫啉剂量的50％E糖溶液相比，蜜蜂对含有500ppb及1000ppb吡虫啉剂量的50％蔗糖溶液有排斥反应，在这两组蔗糖溶液上采食的蜜蜂数量较少。与对照组相比，蜜蜂在采食含有100ppb吡虫啉剂量的50％蔗糖溶液后也可以成功返回蜂巢，但24h后，这些蜜蜂才重新出来采集。蜜蜂在采食含有500ppb及1000ppb吡虫啉剂量的50％蔗糖溶液后则完全消失了，不能成功返回蜂巢【M11。正常蜜蜂在同一饲喂器两次采集之间的时间间隔在300S以内，被亚致死剂量吡虫啉(50ug／L)处理过的蜜蜂两次采集之间的时间间隔则大于300s。此外， 当蜜蜂被高剂量吡虫啉(>1200ug／L)处理时，一些蜜蜂消失，一些蜜蜂出现再次采集等反常行为陋】。在被亚致死剂量噻虫胺(>=O．5ng／只蜜蜂)、吡虫啉(>=1．5ng／只蜜蜂)处理后3h的蜜蜂的采集活力显著性降低及采集飞行所需的时间变长[160】。1．6研究意义与主要研究内容1．6．1研究意义蜜蜂是地球上宝贵的资源昆虫之一，不仅提供人类以蜂蜜、蜂蜡等蜂产品，而且全球约45％的食物依赖于蜜蜂的授粉‘31。发展中国家约22．6％的农产品直接依赖于蜜蜂授粉，在发达国家，农产品对蜜蜂授粉的依存度为14．7％【162】。尽管全球蜂群数量较50年前增加了约64％，但依然满足不了日益增长的授粉需求【163】。此外，近年来，欧洲、北美等地区出现了不同程度的蜂群损失事件，分别损失约26．5％、49．5％的蜂群数量‘1631。由于CCD的爆发，在2007年、2008年，美国损失了32％、36％的蜂群[1631。蜂群数量的减少。引发了美国等地区严重的授粉危机[1641。影响蜂群健康并造成蜂群数量下降或者群势减弱的因素很多，包括蜂螨、病毒、蜜蜂微孢子虫、细菌性病原、真菌性病原等，这些因素单独或者同时影响着蜜蜂的健康。我国是世界上蜂群数量最多的国家‘165]，蜂群数量约为820万群，而浙江省是我国第一养蜂大省，蜂群数量约为100万箱[166]，对浙江省养蜂地区进行包括IAPV在内的蜜蜂病毒的调查，可以为蜂群健康的评估、维护提供理论依据。此外，近年来所报道的蜂群损失、蜜蜂大量死亡等事件涉及的都是意大利蜜蜂，而我国的本地蜂种中华蜜蜂则鲜有报道，中、意蜂之间遗传背景、生物学等方面均有较大差异，与西方蜜蜂相比，中蜂嗅觉灵敏，善于采集零星蜜源，具有抗螨、抗白垩病等疾病能力强，抵御胡蜂侵袭的能力较引167】，但两者之间分子水平上基因表达的差异却较少报道，本研究通过高通量测序技术得到了中、意蜂之间大量差异表达的基因，重点对与免疫相关基因的差异表达进行了分析，为后续进一步研究中、意蜂抗病害分子机制的差异打下基础。上述提及影响蜜蜂健康的因素很多，包括生物性的及非生物性的如杀虫剂、环境等，且这些病害如蜂螨、病毒协同作用而危害蜜蜂的健康‘1631。真菌性病原(蜜蜂球囊菌)与蜜蜂病毒(nPV)都可以通过污染的食物(如花粉)而进入蜜蜂体内，侵染蜜蜂幼虫的中肠[83，1681，球囊菌与IAPV的关系及其共同侵染对蜜蜂幼虫的影响依然未知。此外， 20世纪60年代首次在真菌中发现病毒‘㈣]，在真菌的四大门类中都发现有病毒的存在[1701。蜜蜂病毒研究中，这方面报道的迄今没有，基于蜜蜂球囊茵可能是蜜蜂病毒传播过程中的载体，起到了类似蜂螨充当蜜蜂病毒传播载体的作用，对球囊菌中包括IAPV在内的常见7种蜜蜂病毒的存在情况进行分子检测并检测其反义链，说明蜜蜂球囊菌确实是IAPV等病毒的载体，但球囊菌在蜜蜂病毒的传播过程中所起的作用仍需进一步研究；此外，进一步说明IAPV等病毒不仅仅是蜜蜂病毒，它们还可能是真菌病毒。这一发现为蜜蜂病毒新的生物学特征提供了证据。现阶段蜜蜂病毒的研究主要是病毒的检测及新的检测方法的建立、病毒的分子遗传结构特征的说明、蜜蜂的流行病学特征等，病毒对蜜蜂健康的影响主要基于对患病蜜蜂症状的观察等。作为典型的社会性昆虫，蜜蜂表现出来精细、复杂的劳动分工行为特征：工蜂幼年时在蜂群内从事清理、哺育幼虫等，成年工蜂则外出进行采集活动等行为特征[171]；蜜蜂“舞蹈语言”的行为特征11541；蜜蜂的伸吻反应[1411、蜜蜂的归巢能力等行为特征‘155，1561。2007年，Iqbal等首次报道了DWV可以影响蜜蜂基于伸吻反应的行为，与对照组蜜蜂相比，被DWV感染的蜜蜂对低浓度的蔗糖溶液反应性更强，被感染蜜蜂的联想性学习能力亦有所降低[144]。本实验中，不仅研究了IAPV对蜜蜂基于伸吻反应行为的影响，也首次应用RFID技术研究了IAPV对蜜蜂y-2巢能力行为的影响，为病毒对蜜蜂健康的影响提供最直接的证据，首次报道发现病毒在蜜蜂头部的感染可以影响蜜蜂的归巢能力，也印证了蜂螨、病毒、杀虫剂等共同作用可能是导致全球部分地区蜂群损失的重要因素。越来越多的证据表明单一病害对蜜蜂健康的影响已无法解释曰益严峻的蜂群健康问题【163]，病害对蜜蜂的协同侵染及病害之间的相互作用或许是近年来蜂群损失的重要原因。本研究初步探索了蜂螨、东方蜜蜂微孢子虫对蜜蜂的协同侵染对蜜蜂体内IAPV滴度及AmEater、VgMC、Abaecin等免疫基因表达的影响，为以后进一步深入研究奠定基础。1．6．2主要研究内容(1)对浙江省7个不同养蜂地区进行蜜蜂病毒流行情况检测、调查包括IAPV在内的6种常见蜜蜂病毒在浙江省的流行情况；基于浙江、江苏及云南等地蜂群健康的调查数据分析中、意蜂蜂群健康情况及影响蜜蜂健康的主要病虫害；通过高通量测序技术所得 数据分析中、意蜂采集蜂头部与免疫相关基因表达的差异，从分子水平说明中、意蜂在抵御病害的机制上可能存在的差异。(2)蜜蜂球囊菌与IAPV等常见蜜蜂病毒等相互作用关系的研究。(3)基于蜜蜂的PER与归巢行为这两种行为，从行为角度方面说明IAPV对蜜蜂健康存在的影响。(4)在蜂群中，蜜蜂主要受到蜂螨、病毒、蜜蜂微孢子虫等3种病害的影响，本实验初步研究了蜂螨——-IAPV一东方蜜蜂微孢子虫三者之间的关系及对蜜蜂免疫相关基因表达的影响作一初步分析。 第2章浙江省蜜蜂病毒的检测及蜂群健康的调查分析近年来，世界各地发生了不同程度地蜂群损失事件[7】，对养蜂业的健康发展造成了巨大威胁。杀虫剂、病原微生物、寄生性害虫等各种外界因子对蜜蜂的健康产生了不利影响。其中，蜜蜂被病毒感染被认为是影响蜜蜂健康的一个不容忽视的因素之一。我国是世界蜂群数量最多的国家，饲养约820万群的蜜蜂，其中大部分是西方蜜蜂(ApismelliferaLigustica，Am／)，而浙江省饲养的蜜蜂约占全国的12％，因此，本研究拟通过对浙江省蜜蜂病毒病的调查而对我国蜂群被病毒感染的情况做一评估并通过结合浙江、江苏及云南地区蜂群健康调查的分析，以期为我国蜜蜂健康的维护提供理论基础。此外，我国约有200万群的中华蜜蜂(Apisceranacerana，Acc)，与西方蜜蜂相比，中蜂嗅觉灵敏，善于采集零星蜜源，具有抗螨、抗白垩病等疾病能力强，抵御胡蜂侵袭的能力较强‘1671。在蜜蜂病毒调查及蜂群健康调查的基础上，本研究利用Illumina—Solexa高通量测序对意大利蜜蜂与中华蜜蜂差异表达基因进行了分析，发现了中、意蜂与免疫相关基因的差异表达。2．1实验材料与方法2．1．1主要试剂及仪器TRizol试剂(invitrogen)、SuperScriptIIreversetransc邱tase、TaqDNApolymerase(Takara)、琼脂糖、DNAmarker(SangonBiotech)、Goldview(赛百盛)、高速冷冻离心机(Eppendorf)、PCR仪(AppliedBiosystemsVeritVM)、NanoDrop2000分光光度计(ThermoFisher)等。2．1．2样品的采集从2010年6月至2011年4月，从浙江省的桐庐、新昌、江山、金华、慈溪、兰溪及湖州等7个不同地区的38个蜂场采集167份蜜蜂样品，样品包括表面健康蜂(采集于蜂箱巢门口)、雄蜂、患病蜂群中的蜜蜂幼虫(从患白垩病、烂子病及群势很弱的蜂群中采集的蜜蜂幼虫)、爬蜂及死蜂。从蜂场采集的蜜蜂样品立即保存于干冰中，随后转移至．80。C冰箱备用。 2．1．3RNA的提取每份样品中取约15只蜜蜂用于总RNA提取及RT—PCR检测IAPV、DWV、KBV、SBV、CBPV、ABPV等六种常见蜜蜂病毒及PCR产物的纯化、测序以进一步证实。此外，从检测到蜜蜂病毒的样品(30份)中，再各取约15只蜜蜂并分为头、胸、腹三部分，分别进行总RNA提取及RT．PCR检测上述六种常见蜜蜂病毒以分析蜜蜂病毒的组织嗜性。(1)将约15只蜜蜂放入研钵中，加入适量液氮，并用力研磨至粉末状，然后将粉末转移至50ml离心管，于离心管中加入较多量的TRizol(一般每只蜜蜂加lml左右，以防抽提不完全)，用匀浆仪或振荡器进行振荡、匀浆处理。(2)将匀浆样品在室温放置10min，使核酸蛋白质复合物完全分离。(3)4"C12，0009离心10min，取上清。(4)于上清中加入氯仿，剧烈振S，室温放置3min(每使用lmlTmzol，加入0．2ml氯仿)。(5)4℃12，0009离心15rain。样品分四层：红色的底层，苯酚．氯仿相，相的交界面，无色的最上层水相。RNA主要在最上层水相中，将水相转移至新的离心管中。(6)用异丙醇沉淀水相中的RNA，每使用lmlTRizol，加入O．5m1异丙醇，室温放置10min。(7)4℃12，0009离心10min。管侧和管底出现胶状沉淀，弃上清。(8)75％乙醇(冰预泠，DEPC水配制)洗涤RNA沉淀。每使用lmlTRizol至少加lml75％乙醇，温和的地振荡几下，不超过7，5009离心5rain，弃上清。(9)室温干燥10min，加入适量无核酸酶的水溶解，用枪头吸打几次，55℃放置6—8min，使RNA溶解。(10)用Nanodrop8000测定RNA的质量与浓度。OD260／OD280的比值在1．8—2．1之间。2．1．4逆转录反应，第一链eDNA的合成(1)在微量离心管中配制下列混合液：OligodTPrimer(50uM)：1ul：dNTPMixture(10Mmeach)：1ul或者dNTPMixture(2．5Mmeach)：4ul：TotalRNA：Xug(注TotalRNA的使用量小于5ug，2．5ug左右即可，根据所提RNA的浓度来确定所加的RNA的量)：用RNasefleedH20加至总反应体积为10ul。 (2)65。C5min后，冰上急泠，准备用于后续反应(3)在上述微量离心管中配制下列混合液上述反应完成液(变性、退火后反应液)：10ul；5XPrimerScriptBuffer：4ul；KNaseInhibitor(40U／u1)：0．5ul；PrimerScriptRTase(200U／u1)：1ul；RNasefreedH20：4．5ul总计：20ul(4)42。C50rain；95。C5min，后置于一20℃备用2．1．5PCR检测常见六种蜜蜂病毒(1)在微量离心管中配制下列混合液(共50u1)：上述cDNA反应完成液：3ul；10xTaqbuffer：5ul；10mMdNTP：1ul或者2．5mMdNTP4ul；6种蜜蜂病毒引物对(10uM)：各加2．5ul(表2．1)；Taq酶2．5U(5U／u1)：0．5ul；加RNasefreedH20至反应总体积为50ul(2)PCR过程：95。C，2mira40个循环反应：95。C，30s．56。C，45s．72。C，lmin；72。C，10min；4。C，保存。2．1．6琼脂糖凝胶电泳(1)用1xTBE缓冲液配1．5％(每100ml的lxTBE缓冲液加琼脂糖1．5g)的琼脂糖溶液，于微波炉中加热至沸腾，打开微波炉稍微振荡几下，以便使琼脂糖完全充分溶解。然后，按每100ml琼脂糖溶液加7．5ulGoldViewer。让琼脂糖溶液凝固至少30min。(2)将上述PCR反应完成液与适量的加样缓冲液(10adingbuffer)混匀，准备加样。按8—10ul的PCR反应完成液与2ul的加样缓冲液混匀。(3)预先配DNAMarker，按公司提供的说明书进行。(4)5．10V／cm进行电泳，电压不可太高，一般电泳50min左右。(5)于紫外灯下观察有无目标条带。，4 (6)有目标条带的话，拍照及送样品(PCR产物)至公司测序，测序所得序列经NCBI中比对(BLAST)，以进一步确定所检测的蜜蜂病毒。2．1．7中、意蜂蜂群健康调查通过从2009年7月至2011年4月在浙江、江苏及云南进行的区域性蜂群健康调查数据(问卷调查了141个饲养意大利蜜蜂的蜂场、39个饲养中华蜜蜂的蜂场)，通过整理、分析这些数据，评估中、意蜂蜂群健康状况，比较中、意蜂蜂场病害类别的差异。2．1．8中、意蜂头部基因表达谱差异分析中、意蜂头部表达谱差异分析的采样方法为：浙大实验蜂场中，分别从3群中华蜜蜂、3群意大利蜜蜂各取30只花粉采集蜂并立即保存于液氮中以尽量减少RNA的降解。90只中华蜜蜂的头部、90只意大利蜜蜂的头部分别用于提取总RNA，Illumina．Solexa高通量测序工作及部分数据分析主要在华大基因(http：llwww．genomics．cn／index)完成。2．2实验结果2．2．1六种蜜蜂病毒的检测结果及其组织嗜性分析六种常见蜜蜂病毒在浙江省地区均有被检测到(图2．1)，但被检测到的百分率有所差异。87％的蜂场存在病毒感染。疑似CCD的致病因子，IAPV的检测百分比为29％。DWV的检测百分比为27％，接着是KBV，5％、SBV，5％、CBPV，4％及ABPV，3％。57％的爬蜂检测到病毒，42％的死蜂检测到病毒，24％的表面健康蜂、32％的雄蜂及62％患病蜂群的幼虫检测到蜜蜂病毒的存在。22％的蜜蜂被一种病毒感染，16％的蜜蜂被两种病毒感染，3％的蜜蜂被三种病毒感染，2％的蜜蜂被四种蜜蜂病毒感染(表2．2)。在1个爬蜂样品中，甚至检测发现了六种蜜蜂病毒。 表2．1检测常见六种蜜蜂病毒所用的引物Table2．1ListofprimersusedfordetectionofABPV，CBPV,D、W，IAPV,KBVandSBV26 bD000S00400D、、‘、’L～pVlApVf∞、图2．1被检测到的常见六种蜜蜂病毒Fig．2．1DetectionofsixhoneybeevirusesinZhejiangprovince表2．2不同类型蜜蜂样品的病毒检测类别及百分比Table2．2Frequenciesofcoinfectionofvirusesinthefivetypesofhoneybeesamples样品类型病毒数病毒类别样品数量百分比(％)患病蜂群幼虫OCBPVD、7ⅣL～PV452DWV，IAPV3IAPV，SBV23CBPV，DWV，IAPV384 表2．2续CominueTable2．2样品类型病毒数病毒类别样品数量百分比(％)爬蜂OABPVCBPVDWVIAPVSBV62DWV．IAPV63ABPV，DWV，IAPV4ABPV，DWV，IAPV，KBV6ABPV，CBPV，DWV表面健康蜂OlAPV，KBV，SBV432976DW弋，3IAPV2DⅥ兀，．IAPV4528 表2．2续CominueTable2．2样品类型病毒数病毒类别样品数量百分比(％)死蜂02258认PV2ABPV，IAPVCBPV．DW弋，3DWV，IAPV3DWV，SBV2IAPV．KBVCBPV，IAPV，KBVDWV，IAPV，KBV24DWV，IAPV，KBV，SBV2雄蜂0DWVIAPV2CBPV，IAPVD、VV．IAPV229353547 此外，55％(30／55)春季采集的蜜蜂样品检测到病毒，29％(13／45)夏季采集的蜜蜂样品检测到病毒，42％(22／52)秋季采集的蜜蜂样品检测到病毒，40％(6／15)冬季采集的蜜蜂样品检测到病毒(表2．3)用于蜜蜂病毒组织嗜性分析的蜜蜂样品主要是爬蜂与死蜂，在这些蜜蜂的头部、胸部、腹部分别检测到了六种蜜蜂病毒的存在(圈2．2)。与胸部及头部相比，在蜜蜂头部的病毒检测百分比是最低的，差异极显著(单因素方差分析；幸p<0．05)，而在蜜蜂胸部、腹部的病毒检测百分比则相近，差异不显著(单因素方差分析；料P>0．05)。圈2．2童蜂头、脚及腹部的六种病毒检测百分比Fig．2．2Sixhoneybeevirusesweredetectedintheheads，thoraxesandabdomenswithvarieddetectionrates2．2．2意大利蜜蜂、中华蜜蜂免疫相关基因的差异裹达分析中、意蜂两者之间约2，370个与代谢、发育及信号转导相关的基因表达存在显著性差异(FDR<0．001，2倍差异)，表2．4列出了25个8倍以上差异表达的基因。244个基因在意蜂中显著性表达，而在中蜂中没有发现。同样的，125个基因在中蜂中显著性表30 达，而在意蜂中没有发现。此外，1,287个基因在中蜂中上调表达，1,083个基因在意蜂中上调表达。约4,946个基因在中、意蜂间的表达差异不显著(图2．3)。表2．32010牟6月至2011年4月，不同季节的蜜蜂样品病毒检测百分比Table2．3ThevirusdetectionratesassociatedwithmajornectarplantsfromJune2010toApril2011圈2．3中(Acc)、意蜂(am／)差异表达基因分析。TPM(TranscriptPerMillioncleantags)：是一个标准亿的数值，其表示每一百万cleantag中包含该种转录本胸持贝数Fig．2．3GeneexpressionlevelofA．ceranacerana(acc)VSA．melliferaligustica(am／)．TPM：astandardizedvalueindicatingthetotalamountoftranscriptcopiesperonemillioncleantags31 表2．4中(Acc)、意蜂似刖，)中25个差异表达8倍以上的基因Table2．4Alistof25mostdifferentiallyexpressedannotatedgeneswithmorethanGeneID8-foiddifferencebetweenAccandA埘，TPM-AccTPM-AmlGenedescriptiongil941587171rei]NM一001040206．1IO．01730．OlApismellifemodorantbindingprotein21(Obp21)，mRNAgil585851871rcflNM_001011622．1lO．01291．63Apismelliferamajorroyaljellyprotein6(Mrjp6)，mRNA百[58585117IretTNM』01011589．10．01145．58Apismelliferaodorantbindingprotein4(Obp4)，mRNAgir941587081ret]NM一001040205．1lO．叭53．43Apismelliferaodorantbindingprotein16(Obpl6)，mRNAgil941587281ret]NM一001040221．10．叭45．49Apismelliferaodorantbindingprotein3(Obp3)，mRNAgil941588121ret]NM001040222．110．叭22．16Apismelliferaodorantbindingprotein20(Obp20)，mRNAgil94158710昨flNM_001040207．1IO．叭21．46Apismelliferaodorantbindingprotein17(Obpl7)，rnRNA酉1585851251reflNM_001011593．1IO．叭14．46Apismelliferaodorantbindingprotein6(Obp6)，mRNAgil941586671reflNM一001040208．1lO．0111．9Apismelliferaodorantbindingprotein15(0bpl5)，mRNAgil94158841IreflNM_001040226．10．015．83Apismelliferaodorantbindingprotein11(Obpll)，mRNAgil58585107lreflNM_001011580．1I12．685580．4Apismelliferamajorroyaljellyprotein2(Mrjp2)，mRNA画158585251Iref]NM一00101】653．1『0．014．2ApismelliferatroponinCtypella(TpnCIIa)，mRNA百158585141lret]NM_001011601．10．55215．11Apismelliferamajorroyaljellyprotein3(Mrjp3)，mRNAgil585851691reflNM一001011610．1l1．1328．96Apismelliferamajorroyaljellyprotein4(Mrjp4)，mRNAgil585851371reflNM_001011599．1I112．1813312．34Apismelliferamajorroyaljellyprotein5(M0p5)，mRNAgil585851211reflNM一001011591．110．5546．19Apismellifcraodorantbindingprotein2(Obp2)，mRNA 表2．4续ContinueTable2．4通过GO(GeneOntology)功能显著性富集分析发现中、意蜂之间在所富集的6个GO节点(term)上的基因数量存在显著性差异(图2．4)。结果显示，这些差异表达的基因主要富集至生物过程(biologicalprocess)与所处的细胞位置(cellularcomponent)这两大功能类别，而没有基因富集至分子功能(molecularfunction)(p>o．05)。5个GO节点都与线粒体功能有关，表明这些差异表达的基因在蜜蜂的能量代谢过程中可能起到很重要的作用。与中蜂相比。与能量代谢相关的基因在意蜂中都是上调表达：4个编码肌钙蛋白C与肌钙蛋白T的基因，在意蜂中都是显著性高表达，其中有1个基因在中蜂中并未表达。肌钙蛋白T表达量的增加可能有助于与飞行行为相关能力的改善(如：采集频率、每次采集食物的重量)[1771。结合肌钙蛋白表达量的差异及上述线粒体基因表达量的差异，表明中、意蜂在飞行行为能量代谢方面可能存在显著性差异，这或许源于意 蜂的蜜囊体积比中蜂的大，意蜂每次采集的花蜜、花粉量都比中蜂多。意蜂每次可采集约19．3mg的花粉，而中蜂每次可采集约16．17mg的花粉‘1671。仅有的1个GO节点与对应激性的反应相关，在中蜂中上调表达的基因数量显著性高于意蜂中的，显示它们在抗逆性(如抗螨、抗白垩病、抗病毒等)的机制方面可能存在的差异。H堪∞n5e10懿ressr喃ochDndnallkq]2c!nmto咖嘣a-m舭i-6912151821％o『genes(dusterfrequency}图2．4中acc)、意蜂omD差异表达基因的GO(GeneOntology)功能显著性謇集分析。横坐标表示富集至每个特定GO节点(term)的基因百分比，纵坐标表示各个GO节点，中、意蜂富集至各个特定GO节点基因的数量差异均显著(p<0．05)。Fig．2．4SignificantenrichmentofGOtermswithindifferentiallyexpressedgenesbetweenA．ceranacerana似cc)andA．melliferaligustica(Am／)．TheabscissarepresentsthepercentageofgenesannotatedtoeachspecificGotermandtheordinaterepresentstheGOterms．AlltheprocessesareshownwithPvalue<0．05．通过代谢途径(Pathway)的显著性富集分析发现，两者间1,670个差异表达基因可以被比对至213条代谢途径中，其中中、意蜂在22条代谢途径上表现出显著性差异。与中蜂相比，参与了16条代谢途径的基因在意蜂中都是上调表达，相反，与6条代谢途径相关的基因在中蜂中上调表达(图2．5)。与己内酰胺降解有关的差异表达基因数量为7个，仅有1个在中蜂中上调表达。代谢途径(Metabolicpathways)涉及到325个差异表达基因，其中，180个基因在意蜂中上调表达；淀粉和蔗糖代谢途径(Starchandsucrosemetabolism)涉及到21个差异表达基因，其中，13个基因在意蜂中上调表达。一；_‘ 匿窭弱up-regulate0．05)。致敏化反应、习惯化反应是蜜蜂非联想性学习(non—associativelearning)的两种主要形式，结果表明IAPV感染蜜蜂不会影响蜜蜂的非联想学习能力。 图4．7用于蜜蜂归巢能力实验中的RFID系统示意图。蜜蜂归巢能力实验中的射频识别(RadioFrequencyIdentification，RFID)技术设备。两个RFID检测探头(readers)被固定于装有3个巢脾蜂箱的特制蜜蜂进出通道上(A)；一只胸部贴有电子标签(RFIDtag)的蜜蜂后足携带采集的花粉回到蜂巢(B)。Fig．4．7TheRFIDsystemusedinhomingexperiment．(A)TwoRFIDreaderswereplacedatthecustomizedtunnelentranceofanucleushivewith3frames．(B)AhoneybeewiththeRFIDtaggluedtoitsthoraxcarryingpollenonitshindlegsreturnstothehive．4．2．4病毒的检测及头部病毒qPCR分析A固呻5盯B呻 bD1000500300200CD图4．8蜜蜂被注射lul用PBS稀释500倍的IAPV后不同时问段lit．PCR病毒检测结果Fig．4．8DetectionofIA／"Vinhoneybeesamplescollectedatday0，day1，day2andday3afterinjectionswith1ulofIAPV(1：200dilution)and1uiofPBSrespectivelyA、B、C、D图中最左边为]00-bpDNAladder；A：0-6h收集的蜜蜂样品检测结果；B：20．26h收集的蜜蜂样品检测结果；C：42．48h收集的蜜蜂样品检测结果；D：66．72h收集的蜜蜂样品检测结果。泳道1为注射IAPV组蜜蜂样品；泳道4为注射PBS组蜜蜂样品；泳道2(无RNA模板)、3(无Reversetranseriptase)为注射IAPV组蜜蜂样品检测的阴性对照；泳道5(无RNA模板)、6(无Reversetranscdptase)为注射PBS组蜜蜂样品检测的阴性对照。堆∞∞∞∞t07531 1sldayspost-injection图4．9蜜蜂头部IAPv拷贝数的检测。被注射lul用PBS稀释200倍的IAPV及其对应的PBS对照组蜜蜂头部在注射后当天、1天、2天后的病毒检测结果，误差线表示为标准差Fig4．9TheexactnumberofcopiesofIAPVinheadsofhoneybees．TheexactnumberofcopiesofIAPVinheadsofhoneybeescollectedatday0，dayandday2afterinjectionswithulofIAPVf1：200dilution)andulofPBSrespectively．ErrorbarsshowSD通过将qPCR中所得的Ct值与标准曲线(图4．11)相联系并计算分析，注射IAPV后当天蜜蜂头部大约有48拷贝数的病毒粒子；注射后1d，在蜜蜂头部能检测到大约6．9x106拷贝数的病毒粒子：注射后2d，在蜜蜂头部能检测到大约1．2x107拷贝数的病毒粒子。在注射PBS蜜蜂的头部末检测到IAPV。在IAPV注射后1d，病毒拷贝数的增加的非常明显；但是，蜜蜂头部IAPV的拷贝数在注射后第1d、第2d之间无明显的增加。70>山《一苟曲∞Idoo01．a0I 4．2．5被IAPV感染蜜蜂与对照组蜜蜂存活率分析对照组蜜蜂与注射IAPV的蜜蜂在接受处理24h、48h后，两组蜜蜂在存活率上没有表现出显著性差异(图4．10)。在接受处理24h后，对照组与注射IAPV的蜜蜂的存活率分别为98．1％，88．o％(independentsamplest-test，t=2．025，df--3．933，p>o．05)；在接受处理48h后，对照组与注射IAPV的蜜蜂的存活率分别为68．1％，61．4％(independentsamplest-test，t=2．012，d仁6，p>0．05)。120口controI■●lAPV24h48hsurvivalrateofbeesat24，48hoursafterinjection图4．10被注射lul用PBS稀释200倍的IAPV及其对应的PISS对照组蜜蜂24h、48h的存活率比较分析。数据来源于四个独立的实验并用平均数-I-SD表示。Fig．4．10Analysisofsurvivalrates．ComparisonofsurvivalratesbetweenhoneybeesinjectedwithIAPVandhoneybeesofthecontrolgroupsat24，48hoursafterinjection．Thedataareexpressedasmean4-SDoffourindependentexperiments．72．一零一一罚>一>-l了∽_c∞n∑mcI Y=-3．39l‘IoglOtx)，37．52；R2=0_．998；Ej匿=97．20／00l23456L0910Cop3Ntmlber图4．11以梯度稀释的重组IAPV质粒作为qPCR反应的模板并绘制的用于SYBRGreenqPCR中IAPV绝对定量的标准曲线Fig．4．11ThestandardcurveforIAPVobtainedusingSYBRGreenqPCRandserialdilutedplasmidastemplate4．2．6IAPV对蜜蜂归巢能力的影响在蜜蜂归巢能力实验(homingability)中，注射IAPV的蜜蜂，对照组蜜蜂分别为180只，整个实验过程中，总计有4只蜜蜂在放飞处未能在5min之内起飞，故这几只蜜蜂被淘汰，不用于数据收集[1551。由圈4．12可知，与对照组蜜蜂相比，注射IAPV的蜜蜂的归巢能力受到了显著性的抑制影响。注射后的当天、1天及4天后，对照组与注射1APV的蜜蜂在归巢蜜蜂百分数上没有差异(Kruskal-WallistestfollowedbyDumalsmultiplecomparisontest，p>0，05)；然而，注射后第2天①k<|j—o。_ue】面△ 表5．2Actin、IAPV及相关免疫基因引物序列Table5．2PrimersequencesusedforanalyzingIAPVtiteranddifferentialexpressionofgenes 5．2．2]APV及相关差异表达基因的分析ACE爹爹爹梦≯矿Day5Do甜treatment窜对梦对BDF．J里西山￡《芑亡oIs曲oJ西(m∞暑耍m芷C—u毒^_m-oCoIs坼m．jn寸(。m；；耍—w芏∞J。}}l^dV—a^要星L8Ie山戛芑uoIms。蚤ma^!lel芝u=曲>芑uoIs卿∞．J量m8^重m芷c一。8∞凸m-oco鬲坼m‘n异m舢^I一耍m9_． G爹梦矿梦梦，Day5post打eatmemH梦爹萝爹梦≯’Day5postbeatmenI图5．3东方蜜蜂徼孢子虫、蜂螨便染蜜蜂5天后，对IAPV相对滴度及Abaecin、AmEater及VgMC等免疫基因相对表达量的影响，统计方法为方差分析。¨p<0．01；舟p¨oco丽∞∞．I受啦氅暑eI叠 爹爹爹爹萝爹Day10posttreatment爹≯爹梦矿矿Day10posttreatment梦梦≯梦梦萝’点盘{15量客窭窘兰蔓罡BD爹梦爹梦矿≯Day10posttreatmentF≯梦≯爹梦萝、Day10posttrea们ent∞．181；>正《一a^霉娈。芷 G爹爹矿爹梦萝Day10postVeatmentH爹爹矿≯梦萝Day10posttreatment图5．4东方蜜蜂锹孢子虫、蜂螨侵染蜜蜂lo天后，对IAPV相对滴度及Abaecin、AmEater及VgMC等免疫基因相对表达量的影响，统计方法为方差分析，姓p<0．01；舟pdV—a^；旦m芷。乏西>芑uols∞m．j9啦a^萤粤u 5．3讨论基于所得初步的结果，蜂螨——微孢子虫一APV及相关免疫基因的关系较为复杂。相同免疫基因在不同处理组的相对表达量并没有表现出很明显的趋势，且有的呈完全相反的关系。当蜂螨的侵染数量一定，孢子虫侵染五天、十天后，Abaecin、Eater基因呈完全相反的表达趋势。当未被孢子侵染时，随着蜂螨数的增加，侵染五天、十天后，Eater基因表现出相同的变化趋势，均为下调表达。当被105的微孢子感染时，随着蜂螨数的增加，侵染五天、十天后，Eater基因却表现出相反的表达趋势。此外，源于不同蜂群蜜蜂个体的差异、及蜂螨是否携带IAPV也是本实验的重要影响因子。这些初步的数据表明蜜蜂病害协同作用机制的复杂性。不同病害之间相互作用的方式及对蜜蜂健康影响的机制仍需进一步研究。 第6章主要结论、创新及后续研究展望作为重要的经济昆虫，蜜蜂不仅为人类提供蜂蜜、蜂王浆等蜂产品，同时，蜜蜂是农作物最重要的授粉昆虫。蜜蜂在为人类服务并作出巨大贡献的同时，蜜蜂的健康正遭受着前所未有的威胁与挑战是不争的事实。蜂螨、杀虫剂、病毒等是影响蜜蜂健康的主要因素，蜜蜂健康及蜜蜂病害亦是近年来蜜蜂科学研究的热点之一，本研究以蜜蜂病毒(IAPV)为研究中心，初步探究了IAPV的流行、对蜜蜂健康的影响及其新的传播载体的鉴定，但依然有很多问题亟待进一步研究。本章中主要概述了本论文所得到的主要结论，本论文的创新点、不足之处及研究展望。6．1主要结论(1)IAPV、DWV是浙江省地区最普遍流行的两种常见蜜蜂病毒；行为、分子水平上抵御病害方式及机制的差异或许是中蜂未出现不明原因蜂群群势下降或者消亡的原因虽然蜜蜂病毒有约20种左右，但常见的病毒为七种左右。在本研究中，浙江省地区的主要病毒种类为IAPV、DWV，它们的检测率分别为29％、27％。不同的样品类型，病毒的检测率也有所差异，57％的爬蜂检测到病毒，42％的死蜂检测到病毒，24％的表面健康蜂、32％的雄蜂及62％患病蜂群的幼虫检测到蜜蜂病毒的存在。蜜蜂被两种或两种以上病毒感染的情况也会出现：22％的蜜蜂被一种病毒感染，16％的蜜蜂被两种病毒感染，3％的蜜蜂被三种病毒感染，2％的蜜蜂被四种蜜蜂病毒感染。在1个爬蜂样品中，甚至检测发现了六种蜜蜂病毒。此外，不同季节所采集样品的病毒检测率亦有所差异。在蜜蜂的头、胸、腹部均检测到蜜蜂病毒的存在，但蜜蜂头部的病毒检测率远低于在胸部、腹部的病毒检测率。中、意蜂两者之间约2,370个与代谢、免疫及信号转导相关的基因表达存在显著性差异(FDR