蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究 133页

分类号：墨墨密级：公珏中文题目：洳专：≥、唼单位代码：学号：博士学位论文10335】1117003英文题目．—MolecularClo—ningandCharacterizationoftheEnzyme．．duringCasteDevelopment，指导教师：专业名称： 蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究⑧论文作者签名：指导教师签名：论文评阅人l：评阅人2：评阅人3：评阅人4：评阅人5：珈矽话移隐名评审答辩委员会主席：吴杰研究员博导中国农业科学院蜜蜂研究所委员1：张少吾教授博导澳大利亚国立大学生物科学研究院委员2：委员3：堕壁堡塾塑蔓曼塑婆盔茎壅些皇篁塑堇查堂堕胡福良教授博导浙江大学动物科学学院委员4：钟伯雄教授博导浙江大学动物科学学院委员5：时连根教授博导浙江大学动物科学学院委员6：苏松坤研究员博导福建农林大学蜂学学院 ADissertationforDoctorofPhilosophyDegreeSubmittedtoZhejiangUniversityMolecularCloningandCharacterizationoftheEnzymeGenesInvolvedintheFinalStepsofJuvenileHormoneBiosynthesisinap／smellifera，andTheirExpressionduringCasteDevelopmentPh．D．Candidate：LIWenfengDislipline：SpecialEconomicAnimalScienceSupervisor：ProfessorZHONGBoxiongProfessorSUSongkunCollegeofAnimalSciencesZhejiangUniversityHangzhou310058，ChinaSubmissiondate：April，2014 浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝塑太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名苏芳签字日期：必，5D年石月／加学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝婆太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝选太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者始红者签字日期：如，中年舌月f尸日一％；缅政等囝多旺签字日期：确哆年g月夕日 本研究得到：现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS．45．KXJ3)、国家自然科学基金(No．30571409)资助。特此致谢! 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究目习℃摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IV主要英文缩写与译名⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．VIII第1章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l，l蜜蜂级型分化研究概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11-1．1生殖劳动分工⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．2级型分化研究基本问题及研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．1．3待解决的问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41．2蜜蜂级型分化机理研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．2．1诱导蜜蜂级型分化的关键营养因子⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．2．1．1差别饲喂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2．1．2食物组分差异与级型分化的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2．1．3Royalactin与蜂王发育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．2．2蜜蜂级型分化的表观遗传学机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．2．2．1蜜蜂的DNA甲基化系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2．2．2DNA甲基化调控蜜蜂级型分化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2．3内分泌系统对蜜蜂级型分化的调节⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．23．1JH刺激引发蜂王发育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．2．3．2级型发育过程的JH滴度变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．101．2．3．3级型发育过程的Ⅲ合成及代谢调节⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．2．3．4蜕皮激素的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～l31．2．4总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141，3昆虫JH终端合成研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯151．3．1JH概j盎⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．151．3．2昆虫JH终端合成过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．15l-3．3昆虫JH终端合成过程楣关酶基因研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，171．3．3．1√兕4MT基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。171．3．3．2CYPl5基因家族⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，181．3．3．4FAMeT基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯191．3．4总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．201．4本研究的目的、意义及主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l1．4．1本研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯211．4．1．1关于蜜蜂级型分化分子基础⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．211．4．1．2关于蜜蜂新基因预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．221．4．1．3关于蜜蜂m终端合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．221．4．1．4关于蜜蜂健康保护⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，231．4．2本研究的主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24第2章蜜蜂级型分化数字化基因表达谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．2材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄2．2．1蜂群组织和样品采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．262．2．2IⅢA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．2．3标签制各及Solexa测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2．4数据加工和初步统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292。2．5标签比对、基因注释及表达量确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．2．6候选基因预测及其功能注释⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯312．2．7差异表达基因筛选及功能分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．3．1Solexa测序统计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．322．3．2标签表达量分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．3．3标签比对和基因注释⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．3．4DGE基因检测饱和度分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯352．3．5新基因预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．3．6候选基因的功能分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．3．7蜂王与工蜂幼虫表达谱差异⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．3．8差异基因KEGG功能富集分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．452．4讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45第3章蜜蜂JHAMT酶基因克隆、鉴定及其在级型分化过程中的功能⋯⋯⋯473．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯473．2材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483．2．1蜜蜂样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483．2．2RNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．493．2．3AmJHAMT基因eDNA全长克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．503．2．4序列分析和系统发育树构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯523．2．5重组AmJHAMT蛋白的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．523．2．6聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS。PAGE)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．533．2．7多克隆抗体制备与免疫印迹(westernblotting)⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．543．2．8LC．MS／MS验证重组AmJHAMT蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯543．2．9荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯553．2．10免疫印迹法检测AmJHAMT蛋白时序表达谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯573．2．11统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．573．3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯573．3，1AmJHAMT基因克隆与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．573．3．2昆虫JHAMTs的系统发生分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯603．3．3验证重组AmJHAMT蛋白⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．613．3．4蜂王和工蜂4阮嘲懈mRNA和蛋白质时序表达谱⋯⋯⋯⋯⋯643．4讨{仑⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯67第4章蜜蜂CYPl5A1酶基因克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达⋯⋯7l4．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯714．2材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯724．2．1蜜蜂样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯724．2．2鼬寸A提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯724．2．3AmCYPl5A1基因克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73II 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关煞基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究4．2．4序列分析和系统发育树构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯744．2．5qPCR．．⋯．．⋯．．⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯．．．．．⋯．．．⋯．．．⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．⋯754．2．6数据统计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．754。3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯764．3．1AmCYPl5A1基因克隆和序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．764．3．2昆虫CYPl5s系统发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯784．3．3彳mcp7姐J在蜂王和工蜂级型发育过程的时序表达谱⋯⋯⋯．．794．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81第5章蜜蜂FAMeT酶基因克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达⋯⋯⋯845．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯845，2材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯845．2．1蜜蜂样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯845．2．2RNA提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯845。2，3AmFAMeT基因克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．855．2．4序列分析和系统发育树构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯855．2．5qPCR⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯．⋯．．．⋯．⋯．．．⋯⋯，⋯⋯．．．．⋯，⋯⋯．．⋯．，．．．．．⋯．．．⋯865．2．6数据统计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯865．3实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯865．3，1AmFAMeT基因克隆和序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一875．3．2FAMeTs系统发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。895．3．3AmFAMeT在蜂王和工蜂级型发育过程的时序表达谱⋯⋯⋯⋯．．905．3．4综合比较AmJHAMT、AmCYPl5A1及AmFAMeT的表达⋯⋯⋯925．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯94第6章全文总结、刨新点和后续研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。976．1全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯976．2创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．986．3后续研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯98参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．995f}录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．109博士期间发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯115国际交流及会议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯116致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．117Ill 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究摘要蜜蜂Apismellifera作为高度真社会性昆虫，已成为社会生物学研究的模式生物。社会性昆虫的生殖劳动分工具有重要的进化意义，而级型分化是形成生殖劳动分工的基础。已有的研究成果为人们描绘出一个相对完善的级型分化调控网络。然而，仍有许多问题值得进一步探索，例如：影响级型分化各分表型——个体大小、发育时长、卵巢大小一一的具体分子机制；保幼激素等重要内分泌因子的产生和作用的具体分子途径等。本研究借助瓤一代高通量测序技术，检测了蜜蜂蜂王和工蜂幼虫级型发育过程基因表达谱。同时，克隆和鉴定了蜜蜂保幼激素fjuvenilehormone，JH)生物合成终端步骤相关3种酶基因——保幼激素酸甲基转移酶基因AmJHAMT,细胞色素P45015A1基因AmCYPl5A1和法尼酸甲基转移酶基因AmFAMeT,并结合蜜蜂级型发育过程分析了这3个基因可能发挥的功能。主要研究结果如下：1．基于新一代测序技术的蜜蜂级型分化数字化基因表达谱本研究采用基于Illumina／Solexa高通量测序技术的数字化基因表达谱方法(digitalgeneexpressionprofile，DGE)，检测了蓖方蜜蜂蜂王和工蜂幼虫级型发育表达谱。分别从蜂王和工蜂两个DGE测序文库中获得了约760万和890万的可靠标签，相应的独立标签数目分别约为8．7万和10．0万。差异基因表达分析揭示，在蜂王幼虫中分别有1278个显著上调表达基因以及1451个显著下调表达基因，在最显著上调的50个基因中，多数是代谢酶类基因，同时还包括2个参与保幼激素合成的基因—一，硎^仃和CYPISAl。相对地，工蜂幼虫最显著上调的基因仅有少数是代谢酶类基因。有62，417个无法比对到参考标签数据库的独立标签唯一比对到蜜蜂基因组序列中，运用Genscan对它们进行基因预测，获得了9,258个候选基因，其中有3，566个候选基因长度超过300nt。GO分析揭示这些候选基因可能参与胚后发育、生殖发育和有性生殖等生理过程。2。蜜蜂JlqAMT酶基因分子克隆、鉴定及其在级型分化中的功能研究保幼激素酸甲基转移酶(iuvenilehormoneacidmethyltransferase，JHAMT)是一种参与昆虫体内保幼激素终端合成步骤的酶，它将来源于S一腺苷．L．甲硫氨 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究酸(S．adenosyl-L．methionine，SAM)的甲基转移到法尼酸(famesoicacid，FA)(或保幼激素酸，juvenilehormoneacid，JHA)的羧基上。运用RACE技术克隆了西方’蜜蜂JHAMT基因一卅耽恻^砑的全长eDNA，其长度为1253bp，编码一个278aa的蛋白质，该蛋白与己知的JHAMT蛋白有32％．36％的序列一致性。AmJHAMT包含在SAM依赖性甲基转移酶超家族中保守的SAM结合基序——“基序I”。它的二级结构同样包含SAM甲基转移酶超家族成员典型的核心折叠。同时，那些与SAM及酶促底物一一FA或JHA一一结合的活性位点在AmJHAMT序列中仍然保守。在大肠杆菌中表达了AmJHAMT蛋白，并用重组蛋白制备了相应的多克隆抗体；运用免疫印迹和质谱技术迸一步验证了预测的AmJHAMT蛋白氨基酸序列的正确性。荧光定量PCR和免疫印迹分析显示，在级型发育过程中，蜂王比工蜂表达更多的爿删肘rmRNA和蛋白质；同时，蜂王与工蜂的AmJHAMTmRNA和蛋白质时序表达谱与JH滴度变化保持相似的波动模式。3．蜜蜂CYPl5A1酶基因分子克隆、鉴定及其在级型分化过程中的表达细胞色素P450超家族(cytochromeP450superfamily,CYP)的CYPl5家族成员(如CYPl5A1)催化昆虫JH终端合成步骤的环氧化反应(oxidation)，使甲基法尼酯(methylfamesoate，MF)转变为Ⅲ。本研究从西方蜜蜂幼虫中克隆了包含完整ORF的CYPl5A1基因一叫聊C冲J鲥|，，其ORF长为1515bD，编码含504aa的蛋白。多重比对分析发现，AmCYPl5A1与多数昆虫CYPl5序列一致性低于50％，然而AmCYPl5A1以及其他昆虫CYPl5蛋白都含有构成CYP蛋白一般结构折叠相应的基序，以及N端膜锚及铰链等CYPs特征结构。系统发生分析显示，AmCYPl5A1先后与来自膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、蜚蠊目、半翅目以及虱目昆虫的CYPl5s聚集成为一个主进化枝，而鳞翅目昆虫CYPl5s独立构成另一个主进化枝。在级型发育过程的绝大多数时期，蜂王中的AmCYPISAlmRNA表达丰度显著高于工蜂，尤其是在级型发育的关键窗口期(也称JH敏感期)。另一方面，从表达趋势上来看，无论是在蜂王，还是在工蜂中，AmCYPl5A1基因表达丰度均在幼虫L5F时期达到峰值，随后迅速下降，直至Pw期呈现很低的表达水平，这与末龄期．蛹期过程JH滴度变化保持一致。4．蜜蜂FAMeT酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达II 浙江大学博士学位论文蜜蜂像幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究法尼酸甲基转移酶(FamesoicacidO．methyltransferase，FAMeT)被认为参与Ⅲ终端合成过程——FAMeT以SAM为辅助因子催化FA转变为MF。本研究从西方蜜蜂幼虫中成功克隆得到FAMeT基因——Am刚五钯L其eDNAORF长为891bp，编码含296aa蛋白。多重比对分析表明，AmFAMeT与来自昆虫的FAMeT序列具有更高的一致性(54％一85％)，而与甲壳动物的序列一致性较低(<50％)。比较AmFAMeT基因在蜂王和工蜂幼虫相同发育阶段的表达丰度可知，在多数情况下，二者AmFAMeT表达水平无显著差异，同时，基因表达趋势互不一致，且与JH滴度变化也无明显一致性。综上所述，蜜蜂级型分化是一个伴随着剧烈基因差异表达的过程。Am．IHAMT与AmCYPl5A1分别是蜜蜂中真实存在的JHAMT酶基因及CYPl5酶基因，它们通过调控m终端生物合成而参与级型分化调节。AmFAMeT与蜜蜂级型分化无关联，可能已失去了催化JH合成的功能。关键词：蜜蜂；级型分化；Solexa测序；数字化基因表达谱(DGE)；保幼激素(JH)；保幼激素酸甲基转移酶(JHAMT)；细胞色素P45015A1(CYPl5A1)；法尼酸甲基转移酶(FAMeT)III 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究AbstractAsahighlyeusocialinsect，thehoneybee，却括mellifera，hasbecomeamodelorganisminsociobiology．Thereproductivedivisionoflaborinsocialinsects，basedoncastedifferentiation，isofgreatsignificanceinevolution．Peoplehavebeenabletobuildarelativelycompleteregulatorynetworkofhoneybeecastedifferentiationwiththeexitingresults．However，therearestillmanyissuesworthyoffurtherexploration，suchasthemolecularmechanismsdeterminingtheexpressionofsub—phenotypeslikebodysize，developmentalduration，andovarysize，aswellasthemolecularpathwaysinvolvedinthebiosynthesisandactionsoftheimportantendocrinefactorssuchasJuvenilehormone(JH)．Inthisstudy,thenext—generationsequencing(NGS)technologywasemployedtodetectthegeneexpressionprofilesofqueenandworkercastedevelopment．ThreegenesAmJHAMT,AmCYPl5A1andAmFAMeTinvolvedinthefinalStepsofJHbiosynthesisinhoneybeeswereclonedandcharacterized，andtheirputativefunctionsforhoneybeecastedevelopmentwereinvestigated．Themainfindingswereasfollows：1．Next-generatioⅡsequencing-baseddigitalgeneexpressionprofilesduringhoneybeecastedifferentiationInthisstudy,thedigitalgeneexpressionprofiling(DGE)wasusedtodetectgeneexpressionprofilesrespondingtothequeenandworkercastedevelopment．About7．6millionand8．9millioncleantags，with87，000and100，000distincttagswereobtainedfromthequeenandworkerDGEsequencinglibrary,respectively．1,278andt，451geneswerefoundtobesignificantlyup-regulatedanddown·regulatedinqueenlarvaecomparedwithworkerlarvae．Themajorityofthetop50significantlyup-regulatedgenesinqueenlarvaeweremetabolicenzymes，andtwojuvenilehormonesynthesis-relatedgenes，JHAMTandCYPl5A1werealsoincludedinthisset．Incontrast，onlyafewmetabolicenzymesweredetectedinthe50mostsignificantlyup-regulatedgenelistofworkerlarvae．Therewere62，417entitiesuniquelymappedIV 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究tothehoneybeegenome，whichfailedtomaptothereferencetagdatabase，and9,258candidategeneswereobtainedbygenepredictionfromtheseentitiesusingGenscanprogram，ofwhich3,566candidategeneswerelongerthan300nt．GOanalysisrevealedthatthesecandidategenesmightbeinvolvedintheembryonicdevelopment，reproductivedevelopmentandsexualreproduction．2．MolecularcloningandcharacterizationofJHAMTinA．mellifera．anditsfunctionsduringcastedifferentiationJuvenilehormoneacidmethyltransferase(JHAMnisanenzymeinvolvedinoneofthefinalstepsofjuvenilehormonebiosynthesisininsects，whichtransfersamethylgroupfromS-adenosyl-L-methionine(SAM)tothecarboxylgroupofeitherfarnesoicacid(FA)orJI-Iacid(JHA)．RACEamplificationmethodwasusedtocloneJHAMTeDNAfromthehoneybee，Ap／smellifera似mJnaM7)．ThefulllengtheDNAofAmJHAMTwas1253bplongandencodeda278-aaproteinthatshared32％·36％identitywithknownJHAMTs．ASAM-bindingmotif,conservedintheSAM-dependentmethyltransferase(SAM-MTlsuperfamily,waspresentinAmJHAMT．ItssecondarystructurealsocontainedatypicalSAM-MTfold．MostoftheactivesitesboundwithSAMandsubstrates(JHAorFA)wereconservedinAmJHAMTasinotherJHAMTorthologs．PurifiedrecombinantAmJHAMTproteinexpressedinE．coHwasusedtoproducepolyclonalantibodies．andtheidentityofAmJHAMTwasverifiedlatterbyimmunoblottingandmassspectrometry。QuantitativeRT-PCRandimmunoblottinganalysesrevealedthatqueenlarvaecontainedsignificantlyhigherlevelsofAmJHAMTmRNAandproteinthanworkerlarvaedudngtheperiodsofcastedevelopment．ThetemporalprofilesofbothAmJHAMTmRNAandproteininqueensandworkersshowedasimilarpatternastheJHbiosynthesis．3．MolecularcloningandcharacterizationofCYPl5AIinA．mellifera，anditsexpressionduringcastedifferentiationTheCYPl5familymemberslikeCYPl5A1ofCytochromeP450superfamilyV 浙江大学博士学位论文蜜蜂傈幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究(eve)catalyzetheepoxidationreactionofthefinalstepsofJHbiosynthesisininsects，whichtransfersmethylfarnesoate(MF)toJH．Inthisstudy,aputativeCYPl5AIgene，namedAmCYPl5A1，wasclonedfromthequeenlarvaeofA．mellifera．Itcontainedan1515bpORF,whichencodedan504aaprotein．MultiplealignmentanalysisshowedarelativelylowidentitybetweenAmCYPl5A1withmostotherinsectCYPI5s(<50％)．However,AmCYPl5A1andtheotherinsectCYPl5sallcontainedthemotifsconstitutingthegeneralCYPstructurefold，andsomeothercharacteristicstructuresofCYPs，likeN-terminalmembraneanchorandhingesandSOon．PhylogeneticanalysisdisplayedthatAmCYPl5A1wassuccessivelyclusteredwiththeCYPl5orthologsofinsectsfromHymenoptera，Diptera,Coleoptera,Orthoptera，Blattodea,andHemiptera,whichfinallyformedamajorclade．However,theothermajorcladewasconstitutedonlybyLepidopteranCYP15s．ThegeneexpressionlevelofAmCYPl5A1wasdeterminedbyqPCR，andtheresultshowedthattheAmCYPl5A1mRNAexpressionlevelsinqueensweresignificantlyhigherthanthoseinworkersduringmostofdevelopmentalstages，especiallyforthephysiologicallycriticaltemporalwindowofcastedifferentiation(alsoknownasJH-sensitiveperiod)．Ontheotherhand，theAmCYPl5A1mRNAlevelsofbothqueensandworkerspeakedinthefeedingstageofthe5血instar,andthendecreasedrapidlytoalowleveluntilthewhite—eyedpupalstage，whichwasconsistwithJHbiosynthesisactivity．4．MolecularcloningandcharacterizationofFAMeTinA．mellifera，anditsexpressionduringcastedevelopmentFarnesoicacidmethyltransferases(FAMeT)arethoughttobeinvolvedintheterminalstepsofJHbiosynthesis，whichcatalyzesthemethylationofFAtoMFusingthecofactorSAM．Inthisstudy,aputativeFAMeTgene，namelyAmFAMeT,wasclonedfromthequeenlarvaeofwesternhoneybees．Itcontainedan891bpORFwhichencodedan504aaprotein．MultiplealignmentanalysisindicatedthatAmFAMeThadahigheridentitywithinsectsFAMeTs(54％-85％)whencomparedwithcrustaceanones(<50％)．ComparisonofAmFAMeTexpressionabundancebetweenqueenandworkersshowedthattherewerenosignificantdifferencesfortheVI 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究mostofcastedevelopmentalstages．Meanwhile，-thetrendsofgeneexpressiondifferedbetweenthetwocastes．andwerebothnotconsistwiththeJHbiosynthesis．Inaword，ourresultssuggestthat：1)Honeybeecastedifferentiationisaprocesswithsignificantlydifferentialgeneexpression；2)AmdHAMTandAmCYPl5A1arerealJHAMTandCYP15enzymegenesinA．mellifera，whichinvolveintheregulationofcastedifferentiationbycontroltheterminalbiosynthesisofJH；3)AmFAMeTisnotrelatedtothecastedevelopment，andmaylosethefunctionofcatalyzingfinalreactionsofJHbiosynthesis。Kqwords：Apismellifera；castedifferentiation；Solexasequencing；digitalgeneexpressionprofile(DGE)；juvenilehormone(J哪；juvenilehormoneacidmethyltransferase(JHAMT)；CytochromeP45015A1(CYPl5A1)；FarnesoicacidO-methyltransferase(FAMeT)VII 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宠主要英文缩写与译名ILlroyaljelly蜂王浆WJworkerjelly工蜂浆Egfrepidermalgrowthfactorreceptor表皮生长因子受体IISinsulin／insulin—likesignalingpathway胰岛素／胰岛素类似物信号通路TORtargetofrapamycin雷帕霉素靶标JHjuvenilehormone保幼激素10-I-IDA10一hydroxy-2-decenoicAcid10．羟基．癸烯酸miRNAmicroRNA小RNARNAiRNAinterferenceRNA干扰DMGsdifferentiallymethylatedgenes差异甲基化基因CAcorpofaallata咽侧体MFmethylfarnesoate甲基法尼酯JHEJuvenilehormoneesterase保幼激素酯酶Ecdecdysteroid蜕皮激素CAcorpusallatum咽侧体FAfamesoicacid法尼酸CYPcytochromeP450superfamily细胞色素P450超家族JHAMTjuvenilehormoneacidmethyltransferase保幼激素酸甲基转移酶bpBasepak碱基对JHAjuvenilehormoneacid保幼激素酸SAMS-adenosyl-L·methionines．腺苷．L．甲硫氨酸SAM-MTS-adenosyl—L-methionine-dependentS．腺苷．L．甲硫氨酸依赖性甲基meflayltmnsferase转移酶FAMetFamesoicacidO-methyltransferase法尼酸甲基转移酶DGEDigitalgeneexpressionprofiling数字化基因表达谱FDRFalsediscoveryrate错误发现率GOGeneontology基因本体KEGGKyotoencyclopediaofgenesand京都基因与基因组百科全书genomesvIII 浙江大学博士学位论文蜜蜂傈幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达硪宠第1章文献综述蜜蜂在分类学上隶属于节肢动物门(Arthropoda)、昆虫纲(Insecta)、膜翅目(aymenoptera)、细腰亚目(Apocrita)、蜜蜂总科(Apoidae)、蜜蜂亚科(Apidae)、蜜蜂属(Apis)。目前世界上公认的蜜蜂种有东方蜜蜂(彳．cerana)、西方蜜蜂(Amellifera)、大蜜蜂(彳．dorsata)、小蜜蜂(Aflorea)、黑小蜜蜂(彳．andrenifom如)、黑大蜜蜂(4．1aboriosa)、沙巴蜜蜂(4．koschevnikovi)、绿努蜂似．nuluensis)和印尼蜂口．nigrocincta)等(陈盛禄2001)。蜜蜂属的蜜蜂有以下三个方面共同的生物学习性：即营社会性生活；泌蜡筑造双面具有六角形巢房的巢脾；贮蜜积极(曾志将2007)。蜜蜂广泛分布于全世界，在为农作物授粉方面发挥着重要作用，具有极高的经济和生态学价值。蜜蜂产品，如蜂蜜、蜂王浆、蜂胶等，是维护人类健康不可多得的天然产品，创造了可观的社会和经济效益(陈盛禄2001)。同时，蜜蜂具有复杂而精细的社会结构和丰富多样的行为特征，目前已发展成为一种新的模式生物，用以探究昆虫社会性、神经生理与行为以及级型分化等(Deardeneta1．2009)。对蜜蜂级型分化的研究主要集中于西方蜜蜂。人们很早即认识到，蜂群中的雌性个体——蜂王与工蜂可由遗传上相同的受精卵发育而来，而它们的表型却存在巨大差异，是截然不同的两种级型，同时还明确雌性蜜蜂的这种非遗传多型性(polyphenism)现象是由不同营养条件(或称差异性饲喂)引起的(ShuelandDixon1960)。截止目前，蜜蜂级型分化研究已经历了一段漫长的历史，同时陆续取得了一系列重要的研究成果，不断深化着人们对这一复杂现象的认识。1．1蜜蜂级型分化研究概述1．1．1生殖劳动分工社会性昆虫，如白蚁(termites)、胡蜂(wasps)、蚂蚁(ants)、蜜蜂(bees)等之所以能取得生态上的巨大成功，其高效而精细的劳动分工(divisionoflabor)发挥了关键的作用(Wilson1985)。对于高度真社会性昆虫，不同形式的劳动分工 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究存在于群体之中，其中生殖劳动分工(reproductivedivisionoflabor)发生于雌性个体之间(Robinson1992)。西方蜜蜂属于典型的真社会性昆虫。蜂群中的雌性蜜蜂个体分化为两种级型——蜂王和工蜂，尽管二者均由二倍体受精卵发育而来，但彼此差别明显。这种差异表现在不同层面上，如形态上，蜂王较工蜂体形更大，体重也更大，二者后足分化明显，工蜂拥有花粉篮结构，蜂王则无；内部生理解剖方面，最大的区别在于蜂王具有发育成熟的卵巢，为可育个体，而工蜂卵巢发育不全，属于不可育个体：个体寿命方面，蜂王通常拥有长达1～2年的寿命，是工蜂的十倍(PageandPeng2001)：神经生理和行为方面，工蜂表现出更加多种多样的行为特征和卓越的学>--j记忆能力(Menzel2001)；社会职能方面，蜂王独享蜂群社会的生殖权，专司产卵而不参与其他工作，在繁殖季节蜂王每天能产下约2000粒受精卵及少量未受精卵，而工蜂则从事维持蜂群生存和发展相关的一系列工作，如清理巢房、哺育后代、防御、采集等，基本不参与生殖(Wilson1971)。由此可见，蜂王与工蜂是分化明显的两种级型。可塑性(plasticity)是社会性昆虫劳动分工的重要特征之--(Robinson1992)，而生殖劳动分工的可塑性表现在级型发育的调节过程。级型发育通常不是遗传上固定的，而是可接受外在环境因子调节的过程，如营养的摄入一一哺育蜂饲喂不同的食物给雌性蜜蜂小幼虫，而决定了幼虫的发育轨迹。级型发育的差异调节引起级型分化，最终导致生殖分工的发生(HartfelderandEngels1998)。1．1．2级型分化研究基本问题及研究现状蜜蜂级型分化具体是指蜜蜂受精卵或雌性蜜蜂小幼虫既可发育为可育的蜂王个体也可成为不可育的工蜂个体的现象。早在19世纪初，生物学家们就已经提出了营养差异决定雌性蜜蜂幼虫发育命运的观点0VlelampyandWillis1939)。长期以来，人们对级型分化现象的探索始终围绕着两个核心问题进行：1)引发级型分化的营养因子是什么；2)级型发育的调节是通过哪些途径实现的(ShuelandDixon1960)。经历长期不间断的研究，目前人们已对这一复杂、有趣且意义重大的发育现象形成了比较全面的认识(图1．1)。总的看来，蜜蜂级型分化是一个渐进发展的 过程，其终点是建立差异明显的雌性二态性(Weaver1966；Dedejetal1998)。这个过程起始干差别饲喂导致的营养差异，其中Roya]actin足关键营养因子。营养差异决定幼虫发育命运呈现两种不同轨迹：一种是蜂王轨迹，另外一种是工蜂轨迹，自然状志下二者非此即彼。以蜂芏轨迹为例，持续丰富的营养物磺(即蜂王浆．royaljelly,RJ)作用于幼虫脂肪体细胞。通过由表皮生长幽子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,Egfr)介导的信号通路(也可能还有胰岛素，胰岛素类似物信号通路，insulin／insulin-likesignalingpathway,IIS)及下游雷帕霉素靶标(targetofrapamycin．TOR)等信号通路产生一系列分子细胞生理效应，并进一步作用于神经内分泌系统(脑、咽侧体等)促进保幼激素(juvenilehormone，JH)等激素合成，进而促进身体生长、卵巢发育及其他蜂上特有器官发育，同时缩短发育时间，抑制神经发生以及工蜂特异器官发生．摄终产生蜂王个体。级型分化过程伴随着全局性基因差异表达(EvansandWheeler1999；EvansandWheeler2000；Barchuketal2007；Chene／aL20121，而基因组DNA甲基化通过调控基因表达而紧密参与级型分化过程。慧惹<二二二二二==>蛐¨“i《口{蛐-“州跨诿俄iI饕鬟●#§Pr-⋯一晚l薹嚣t馨嚣1孽藩图1．1蜜蜂级型分化的一般模型(修改自Banhuk“札2007；Maleszka2008)FIg1．1Generalmodelofhoneyb神c3skdiffelcnfiation(momⅡ叫fromBarchuketal．2007；Mal器zka2008)豢警∞网豳V▲—一m_t．于鸯⑧一 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究1．1．3待解决的问题尽管人们对蜜蜂级型分化的研究已经取得了很大进展，但仍有许多问题值得进一步探讨，例如：对参与级型发育调节的具体信号通路及其作用范围，不同学者之间仍存在较大分歧。胰岛素信号通路IIS是进化上保守的调控后生动物躯体大小、器官生长、代谢、生殖以及寿命的重要机制之一(Brogioloela1．2001：Garofaio2002；OldhamandHafen2003；Edgar2006)。然而，Kamakura(2011)研究发现IIs通路并不参与Royalactin对果蝇和蜜蜂幼虫的发育调控过程。另有研究通过对比分析级型分化关键期IIS通路相关基因在蜂王和工蜂幼虫的表达发现，胰岛素样多肽．1(insulin—likepeptide一．『，卿一J)和胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate,1RS)(Wheelereta1．2006)以及胰岛素受体(insulinreceptor,InR)(deAzevedoandHartfelder2008)基因在蜂王幼虫中的表达水平均显著高于工蜂幼虫；RNAi抑制蜜蜂幼虫1RS基因表达能导致蜂王幼虫转而发育为工蜂(Muttieta1．2011；Wolschineta1．2011)。TOR是一种营养和能量敏感的蛋白激酶，能响应不同营养状态并调控细胞和有机体的生长(0IdhamandHafen2003；Soulardeta1．2009)。近来有研究报道，Royalactin通过Egfr介导的信号通路激活TOR而提高幼虫及出房个体大小，但不影响其他表型，如发育时长和卵巢大小(以卵巢管数目衡量)(Kamakura2011)。其他的相关研究也证实了TOR信号通路在蜜蜂级型分化过程中的关键作用，但不同的是，这些研究表明：TOR不仅影响出房个体大小，还与发育时间和卵巢大小调节有关，即对蜂王发育产生综合性影n向(Pateleta1．2007；Muttieta1．2011)。综上所述，学术界对于蜜蜂级型分化分子机制的有关细节问题尚无定论，后续研究有必要深入探索上述存在矛盾之处，以期达到统一认识。另一方面，虽然Kamakura(2011)已经绘制了较为细致而完整的分子机制网络，但影响级型分化各分表型，如个体大小、发育时长、卵巢大小等的具体分子机制，以及JH等重要内分泌因子生成及作用的具体分子过程等仍有待进一步验证、发掘和完善。此外，如何将基因组甲基化作用与信号通路网络整合起来也是亟待解决的问题。1．2蜜蜂级型分化机理研究进展 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程串的表达研宄1．2．1诱导蜜蜂级型分化的关键营养因子1．2．1．1差别饲喂蜜蜂幼虫在整个发育过程中基本处于不动的状态，因此它们所需的营养只能单纯由哺育蜂饲喂提供。事实上，级型分化过程也是一个差别饲喂的过程(ShuelandDixon1960；HartfelderandEngels1998)。具体情形是，哺育蜂分泌大量的蜂王浆并持续饲喂给蜂王幼虫，直到幼虫期结束，而工蜂幼虫只在前3日龄得到充足的食物——同样由哺育蜂分泌且与蜂王浆类似的工蜂浆(workerjelly,WJ)，而之后取食有限的经修饰过的工蜂浆(modifiedWJ)一一除了腺体分泌物外，还加入蜂蜜和花粉。因此，蜂王和工蜂幼虫获得不同的营养——不仅食物总量差别悬殊，而且食物组分也不同，其中组分差异主要体现在3日龄以后的食物上(ShuelandDixon1960；Haydak1970)。幼虫培养实验证明，食物量不同仅仅增强了级型发育闻的差异，而食物组分的差别才是引发级型分化的根本原因(Weaver1955；ShuelandDixon1960；Weaver1966)。1．2．1．2食物组分差异与级型分化的关系比较分析蜂王食物(蜂王浆)和工蜂食物的化学组成发现，二者在主要成分，如水分、糖类、蛋白质和脂类等，以及微量成分，如生物蝶呤、B族维生素等均存在显著差异(ShuelandDixon1960；Haydak1970)。Asencot和Lensky(1976；1988)迸一步研究表明，向以工蜂浆为基础的食物配方中添加葡萄糖和果糖以提高食物的糖分含量，能获得更高比例的蜂王个体；储存的蜂王浆易产生糖分结晶．向其中添加与结晶等量的葡萄糖和果糖也能提高蜂王出房比例。究其原因，糖分发挥着诱食剂的作用，增加食物的糖分含量能提高幼虫进食率和发育速率。然而，糖分并非引发级型分化的关键因素，而是起到辅助和增强分化过程的作用(HartfelderandEngels1998)。1O．羟基一癸烯酸(10-hydroxy．2一decenoicAcid，10．ItDA)是蜜蜂幼虫食物中的特有成分，由哺育蜂上颚腺分泌而来，且蜂王浆中的10-HDA含量显著高于工蜂幼虫食物(Barkereta1．1959)。表观遗传调控是蜜蜂级型分化的重要机制之一(Kucharskieta1．2008)。细胞学研究证实，10．HDA具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研字己(histonedeacetylaseinhibitor,HDACi)活性，因此，蜂王发育的表观遗传调控可能由蜂王浆中的10．HDA引发(Spannhoffeta1．2011)，但目前仍缺乏支持该观点的直接实验证据。MieroRNAs(miRNAs)是一类长度约22nt的内源性非编码RNA，能够在转录后水平对基因表达产生负调控作ff](Bartel2004)。miRNAs在生命活动具有广泛而重要的功能，例如影响动植物生长发育、表观遗传、疾病发生等fEsquela-KerscherandSlack2006；Rassoulzadeganeta1．2006；Barrel2009)。利用高通量测序技术检测蜜蜂幼虫食物中的miRNAs发现，无论是来自东方蜜蜂的蜂王浆，还是西方蜜蜂的蜂王浆，都含有丰富的miRNAs，且两种蜂王浆的miRNAs在种类和丰度上都存在显著差异；使用这两种蜂王浆分别培养西方蜜蜂幼虫能引发不同的基因表达结果(Shieta1．2012)：同样地，在西方蜜蜂工蜂幼虫食物中也检测到大量miRNAs，而且其miRNAs种类数和丰度均显著高于同物种蜂王浆的miRNAs；向蜂王浆中人为添加某些在工蜂浆中显著高表达的miRNAs(如miR-184)，能影响所培养幼虫的基因表达以及出房后的形态特征，但并不能完全改变幼虫的发育轨迹(Guoeta1．2013)。总之，关于幼虫食物的miRNAs能在多大程度上影响蜜蜂级型分化过程，目前尚无定论。其他差异成分对蜜蜂级型分化均无显著影响，其可能仅仅作为维持幼虫发育的基本营养物质，或发挥其他方面的功能(Ha庀FelderandEngels1998)。1．2．1．3Royalactin与蜂王发育蜂王浆成分十分复杂而不利于从其中直接寻找决定级型分化的关键营养因子，因此，对蜂王浆进行分部分析不失为一种可行的选择(Remboldeta1．1974b)。对蜂王浆进行透析处理后，将析出物划分为若干组分，然后分别探索各组分对蜂王发育的影响。结果表明其中某一组分对蜂王发育是必需的，向蜂王浆的剩余部分添加高浓度的该组分并以此培养蜜蜂幼虫，能获得更多的蜂王个体；另外，这一组分在哺育蜂头部组织中也被检测到，且十分不稳定(Weaver1966)。蜂王浆在储存过程中同样表现出化学组成不稳定性，其57．kDa蛋白(也称王浆主蛋白l，MRJPl)随着储存温度上升和储存时间延长而成比例降解，但10．HDA和其他几种维生素在不同储存条件下仍表现稳定，因此，57．kDa蛋白可 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子吏隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究作为一种评价蜂王浆新鲜度的指标(Kamakuraeta1．2001a；Kamakura2011)。57．kDa蛋白还显示出显著的体外生理效应，如促进肝脏再生，保护肝细胞等(Kamakuraeta1．2001b；Kamakura2002)。最新的研究揭示了Royalactin(即57一kDa蛋白)与蜜蜂级型分化的密切关系——Royalactin可诱导蜂王的发育(Kamakura2011)。选择40℃下储存30d的蜂王浆(此时Royalactin已完全降解)作为基础食物在实验室培养蜜蜂幼虫，当向该食物中分别添加2％分离自蜂王浆的Royalactin或者通过原核表达生产的Royalactin时，实验培养所得个体均为蜂王，且与使用新鲜蜂王浆培养的结果一致：而等量添加酪蛋白或不添加其他成分的对照组只得到工蜂个体，并且，Royalactin诱导蜜蜂级型分化的能力与其在食物中的含量成正相关(Kamakura2011)。由于蜜蜂本身不具备成熟的遗传操作工具，直接探索Royalactin诱导蜂王发育的分子机制存在困难。另一方面，黑腹果蝇Drosophilamelanogaster作为经典的遗传学模式生物，在遗传操作方面具有先天优势，并己开发出多种多样的突变体(Adamsetal，2000)。那么，若希望利用果蝇模型探宄Royalactin作用的分子机制，则须查明Royalactin能否对果蝇发育产生类似于影响蜂王发育的效果。实验证明Royalactin的确能影响果蝇发育。在基础食物中添加Royalactin可以显著缩短果蝇幼虫发育时间，增大成年个体的体积，提高雌蝇的繁殖力，以及延长其寿命等，这些效应与诱导蜂王发育过程基本一致，由此表明可以利用果蝇模型探索Royalactin诱导级型分化的分子机制(Kamakura2011)。借助于果蝇突变体研究发现，Royalactin(或蜂王浆)通过脂肪体细胞表皮生长因子受体Egfr介导的信号通路影响果蝇发育并产生上述一系列表型：RNA干扰(RNAinterference，RNAi)抑制蜜蜂幼虫Egfr基因的表达则显著减小了出房个体的初生重和卵巢体积而延长了发育时间，由此表明，与果蝇类似，Royalactin通过由Egfr介导的信号通路诱导蜂王发育(Kamakura2011)。1．2．2蜜蜂级型分化的表观遗传学机制广义上讲，表观遗传学(epigenetics)研究的是不改变DNA序列而影响某一基因位点或者染色体的最终表达结果的现象(Goldbergeta1．2007)。DNA甲基 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究化(DNAmethylation)和组蛋白修饰(histonemodification)是目前发现的最要的两种表观遗传机制，且与个体发育和疾病发生紧密关联(JonesandBaylin2002；DawsonandKouzafides2012)。1．2．2．1蜜蜂的DNA甲基化系统DNA甲基化现象普遍存在于动物界中，而不同动物的基因组DNA甲基化水平和模式差别明显(Bird2002)。哺乳动物有着完善的DNA甲基化系统和高水平的基因组甲基化，且5．甲基胞嘧啶(m5C)分散存在于基因组的大部分区域∞ird2002)，而果蝇表现出十分有限的甲基化，仅在胚胎发育早期检测到相对显著的基因组甲基化水平，且DNA甲基化大多数发生在CpT二核苷酸而不是哺乳动物中常见的CpG二核苷酸上(Lykoeta1．2000)，这归因于果蝇仅有唯一的DNA甲基转移酶家族成员Dnmt2(Kunerteta1．2003)。蜜蜂基因组测序的完成极大地促进了蜜蜂生物学的发展(TheHoneybeeGenomeSequencingConsortium2006)，同时有利于从全基因组层面探索和发掘蜜蜂DNA甲基化系统。与果蝇不同，蜜蜂具有和哺乳动物类似的全功能DNA甲基化系统(Wangeta1．2006；SchaeferandLyko2007)。除了Dnmt2之外，从蜜蜂基因组中还发现有负责从头甲基化(denOVOmethylation)的Dnmt3直系同源物一加，zm乃，以及参与维持甲基化(maintenancemethylmion)的直系同源物—卅舰D胛mf．f口和AmDnmtlb。此外，蜜蜂还有与甲基化DNA结合域蛋白家族(methyl—DNAbindingdomain，MBD)同源的基因，其可变剪接体之一——AmMBD．1包含MBD的高度保守氨基酸残基，同时在体外能与甲基化DNA互作(Wangeta1．2006)。上述研究表明蜜蜂具有完善的DNA甲基化系统，该系统为蜜蜂发育调控提供了强大的表观遗传工具。1．2．2．2DNA甲基化调控蜜蜂级型分化Shuel和Dixon(1960)指出雌性蜜蜂二态性(dimorphism)的建立不是由遗传决定的，而是一个表观遗传过程，营养是控制蜜蜂级型表达的主要环境外因。研究证实环境因子(如食物等)可借助于表观遗传机制改变基因表达而调控哺乳动物个体发育及疾病发生(JaenischandBird2003；Vercelli2004；Feil2006)，这种 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究环境与基因之间的互作机制也存在于蜜蜂等非脊椎动物dP(Kucharskieta1．2008；Mackerteta1．2008)。Kucharski等(2008)通过沉默雌性蜜蜂小幼虫的DNA甲基化，获得了与营养影响早期幼虫发育命运的类似效果。与对照组相比，抑制刚孵化幼虫的Dnmt3基因表达使大多数幼虫转而发育为具有完全发育卵巢的蜂王个体。dynactinp62基因已证实在蜜蜂幼虫发育过程中被差异甲基化(Wangeta1．2006)，以该基因为例验证沉默Dnmt3基因表达引起的基因序列甲基化改变，结果表明Dnmt3基因表达沉默的个体，dynactinp62基因甲基化水平显著降低，这与自然蜂群内蜂王幼虫基因甲基化水平显著低于工蜂幼虫的事实保持一致(Kucharskieta1．2008)。伴随着Dnmt3基因表达沉默，幼虫体内Dnmt3酶活性也显著降低；同时，除了卵巢完全发育之外，出房个体其他形态指标也向着蜂王方向发生改变(石元元等2011)。对幼虫取食蜂王浆的时间进行人为控制，随着取食蜂王浆时间延长，幼虫Dnmt3酶活性、Dnmt3基因表达量和dynactinp62基因甲基化水平都逐渐降低，而蜂王个体比例逐步提高(Shieta1．2011)。局莎基因介导Royalactin发挥蜂王诱导作用，事实上，Zgfr基因同样发生了DNA甲基化，并且幼虫个体无论是实验室培养，还是自然蜂群培育所得，蜂王幼虫彩≯基因的甲基化水平均显著低于工蜂幼虫(Kamakura2011)。了解基因组甲基化模式(genomicmethylationpattems)对于评价DNA甲基化在蜜蜂中的作用及意义显得尤为重要(Wangetal．2006；Kucharskietal．2008)。根据CpG二核苷酸在序列中含量不同，可将蜜蜂基因分为两类一低CpG基因和高CpG基I因(Elangoeta1．2009)。低CpG基因在生殖系(germline)中呈现超甲基化(hypermethylated)，并富集到基本生物学过程相关功能中；而高CpG基因在生殖系中呈现次甲基化(hypomethylated)，并富集到发育过程相关功能中，表明DNA甲基化与蜜蜂发育密切相关。另外，对已知级型分化过程差异表达基因的分析发现，这些基因中绝大多数都属于高CpG基因类别，进一步表明DNA甲基化等表观修饰与蜜蜂级型形成紧密关联(Elangoeta1．2009)。联合甲基化组(methylome)和转录组(transcriptome)进行研究能够在基因组范围把握DNA甲基化对相关生物学过程的表观调控作用。对蜜蜂级型分化过程比较研究发现，蜂王和工蜂幼虫头部的差异甲基化基因(differentiallymethylatedgenes，DMGs)数量远高于成年蜂脑部的DMGs(2399VS．560)(Foreteta1．2012)，而且工蜂幼9 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄虫的上调甲基化基因显著多于蜂王幼虫，显示出更高的基因组甲基化水平(Foreteta1．2012；Shieta1．2013)。一些高度保守的代谢和信号通路富集到甲基化基因中，凸显了食物摄入和代谢流动之间的联系。另外，发现已报道的级型分化过程差异表达基因(Barchuketa1．2007)都经历DNA甲基化修饰，且许多是DMGs，同时，响应保幼激素作用的基因都是甲基化基因，且有些也属于DMGs(Formeta1．2012)。综上所述，基因组甲基化是蜜蜂级型分化的重要调控机制之一。1．2．3内分泌系统对蜜蜂级型分化的调节1．2．3．1JH刺激引发蜂王发育JH是一类倍半萜衍生物，普遍存在于昆虫、甲壳动物和部分植物体内(嵇保中等2007)。JH对昆虫的幼虫生长、蛹期变态、成虫生殖以及其他生长和发育过程均发挥极为重要的作用，是最重要的一类昆虫激素(李胜等2004；刘影等2008)。对于昆虫变态而言，昆虫体内的激素平衡(hormonebalance)至关重要(Wigglesworth1954)。Shuel和Dixon(1960)将这一概念扩展到级型分化命题上来，并推断：早期幼虫期建立的激素平衡差别可作为媒介因子将营养和级型分化联系起来。20世纪70年代，成功实现了人工合成娜为验证这一假说提供了物质基础。Wirtz和Beetsma(1972)首先证实，对5龄西方蜜蜂工蜂幼虫体表施用JH或JH类似物能引起个体分化出蜂王特征，且当JH应用于4龄和5龄早期工蜂幼虫时，JH表现出的蜂王诱导作用最为显著，因此，该发育阶段被认为是级型发育的关键窗1：3期(physiologicallycriticaltemporalwindow)，也是m敏感期(JH—sensitiveperiod)(HartfelderandEngels1998)。除了能改变工蜂幼虫的发育轨迹2AI-，JI-I对蜂王幼虫自身发育也有调节作用，向西方蜜蜂(或东方蜜蜂)蜂王幼虫食物中添加一定浓度的Ⅲ类似物能够显著延长幼虫未封盖期，提高个体初生重，促进卵巢发育等(周冰峰等1995a；1995b；2002)。1．2．3．2级型发育过程的JH滴度变化在蜜蜂体内，JH滴度是不断变化着的。这种变化受到发育阶段、环境条件10 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激熹终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究等因素的影响，且对于蜂王与工蜂之间的变化趋势区别明显。幼虫期是级型分化的决定时期。幼虫期，蜂王与工蜂的JH滴度均有两次上升过程(图1．2)，但蜂王的上升幅度明显大于工蜂。上升的过程与级型特异性分化过程紧密关联。在第一个上升期中，JH滴度表现出一个阈值，有研究表明，在分化的关键时期，使幼虫m滴度提高至阈值以上，将发育成蜂qZ(Barchuketa1．2007)；第二个上升过程发生在幼虫发育的最后日龄，而此时也是幼虫卵巢发生级型特异性分化的关键时期，对于将要发育成蜂王的幼虫，所有卵巢管内均形成了众多带有完好发育融合体的生殖细胞簇，两对于将要发育成工蜂的幼虫，卵巢管内正发生着细胞程序性死亡(programmedcelldeath)(HartfelderandSteinbrfick1997)，可以推测幼虫最后日龄的m滴度差异与卵巢发育分化紧密关联。运用BrdU和TUNEL标记技术研究发现，JH处理能阻止最后日龄工蜂幼虫卵巢管内的细胞程序性死亡过程，由此揭示了JH滴度差异与卵巢发育分化之间的关系(CapellaandHartfelder1998)。燧戆￡’1日龄2日龄3日龄4日龄5日龄图1．2西方蜜蜂蜂王与工蜂幼虫期JH滴度(修改自Barchuket以．2007)Fig．1．2JHtitersiIlthequeenandworkerlarvaeofApismellifera(modifiedfromBarchuketal,2007) 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究1．2．3．3级型发育过程的JH合成及代谢调节Ⅲ的生物合成是昆虫生理学研究的重要内容。目前，对昆虫JH合成过程及相关酶已了解清楚，并正在进行着更加深入的相关研究(刘艳等2007)。咽侧体(corporaallataCA)是昆虫JH合成场所。咽侧体活性(CAactivity)调控着JH的合成及滴度变化(TobeandStay1985)，而一些神经肽类，如咽侧体促进素(allatotropin)和咽侧体抑制素(allatostatin)，对咽侧体活性发挥着调节作用(stayandWoodhead1993；Stayeta1．1994；Stay2000)。Rachinsky和Feldlaufer(2000)检测了5种神经肽对蜜蜂工蜂幼虫咽侧体的作用，并运用体外放射化学分析法评价了这些肽类影响mIII及其直接前体——甲基法尼酯的生物合成的能力，这5种神经肽在其他昆虫体内具有促咽侧体或抑咽侧体活性。在最后幼虫日龄，参与检测的咽侧体抑制素均对JHIII的生物合成没有产生影响，而在一种特定时期和剂量依赖性方式下，Manducasextaallatotropin(Mas-AT，一种咽侧体促进素)促进了JH的生物合成。Mas．AT可以显著地增加JH前体含量，但不能克服在JH合成最终步骤中特定时期的阻滞作用(RachinskyandFeldlaufer2000)。进一步运用Mas．AT和JH前体——法尼酸对5日龄工蜂幼虫作用的研究发现，在较发育初期更长时间范围内法尼酸能对咽下腺产生刺激作用，而Mas．AT对咽下腺活性的刺激作用到结茧期末停止下来，此时咽下腺变得突然不敏感，说明工蜂幼虫JH合成终端酶步骤调节的重要变化发生在从结茧期向前蛹期转变的过程中(Rachinskyeta1．2000)。尽管昆虫体内JH滴度变化主要受到JH生物合成过程的控制，但其他生化过程，如JH代谢也发挥着相应的调节作用(Gilberteta1．2000)。昆虫体内的JH代谢是一系列酶促反应过程，其中m酯酶、JH环氧水解酶和JH二醇激酶发挥着重要作用f李胜等2004)。PrI酯酶(JHesterase，JHE)是JH代谢通路的成员之一，JH在JHE作用下转变为JH酸(JHacid，JHA)，并进一步代谢为其他产物(Gilberteta1．2000；李胜等2004)。目前己从西方蜜蜂基因组中鉴定得到JI-IE基因Amjhe-like，RNAi沉默Amjhe．1ike基因表达导致成年工蜂体内JH滴度增长6倍，由此可以判定么柳he．以恕基因是蜜蜂体内真实的JI-IE基因(Mackerteta1．2008)。在工蜂胚后发育期和成年12 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究生活中，Amjhe．1ike基因表达水平与血淋巴中JH滴度变化均保持高度负相关性，这印证了其JH降解属性(Mackerteta1．2008)，而JHE活性随着工蜂日龄增长而逐渐降低，尤其表现在哺育蜂向采集蜂行为转变过程中，这与同期蹦滴度变化也保持协同相关(颜伟玉等2004)。此外，Amjhe—like受到来自JH和蜕皮激素(ecdysteroid，Ecd)的双重调节：JH诱导Amjhe—like表达，而Ecd则抑制Amjhe．矗妇表达(Mackerceta1．2008)。由此表明，Amjhe—like基因参与JH在蜜蜂体内的代谢过程并影响JH滴度的变化，该基因可能是级型分化内分泌调节的一个重要靶点。1．2．3．4蜕皮激素的作用在昆虫体内，蜕皮激素(ecdysteroid，Ecd)与m协同作用，共同调控着昆虫的发育和变态(李胜等2004)。最近研究发现，Ecd在蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum卵黄蛋白合成中发挥重要作用，并被视为卵黄生成的主导调节激素(Dongela1．2009)。对蜜蜂Ecd的研究，目前主要集中在与级型相关的滴度变化及其作用机制方面。如同JH一样，在蜜蜂血淋巴中，Ecd滴度也呈现出一种波动变化的过程，且在蜂王与工蜂两种级型中的变化趋势不一。在蛹期(图1．3)，蜂王Ecd滴度较工蜂更早达到峰值，这可能是由引发级型分化的最初阶段刺激的不同性质决定的，随后两者均下降，在蛹期后半段，蜂王Ecd滴度发生一次小的上升过程后下降，但一直较工蜂Ecd滴度高，这可能与级型特异性组织分化(包括色素沉积)过程有关(Pinto倒a1．2002)。蜜蜂级型分化的许多方面是由激素调控不同基因表达引发的(Barchuketa1．2007)。Guiduglil等(2004)运用差别显示逆转录PCR技术，从5日龄末工蜂卵巢中筛选得到一系列受到Ecd调节的编码代谢酶类的ESTs，并进一步获得了一种编码短链脱氢酶／还原酶(SDR)基因的完整序列，结果表明，在5日龄幼虫早期该基因开始高度表达，而在前蛹期停止，其中工蜂幼虫的表达水平较蜂王幼虫高，进一步实验证实，这是级型特异性Ecd滴度对该基因负调节的结果(Guiduglig￡a1．2004)。 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究田燕目一I、翌一I鲤霹l瞢_蓉67湃踟Pp的确P咖削黼稠陵慑图1．3西方蜜蜂蜂王与工蜂蛹期Ecd滴度(修改自Pintoeta1．2002)Fig．1．3Ecdysteroidtitersinthequeenandworkerpupaeofwesternbees(modifiedfromPintoeta1．2002)1．2．4总结近年来，对蜜蜂级型分化机理的研究已经取得了许多重要成果，发现了食物中诱导蜂王发育的关键营养因子及其作用机制；从表观遗传学角度阐述了级型发育的调节机理；同时，在原有基础上进一步揭示了内分泌系统在级型分化过程中的重要作用。这些成果帮助人们对蜜蜂级型分化现象形成了系统而深入的认识。然而，正如前面提到的，有关蜜蜂级型分化机理的研究仍然存在许多问题和不足，这需要在未来通过继续加强研究，不断丰富级型发育调控网络，以及在昆虫社会性、遗传进化的层面取得更多认识，最终实现对蜜蜂级型分化现象的统一而全面阐述。虽然蜜蜂已经发展成为生物学研究的模式生物之一，但与果蝇相比，蜜蜂研究仍缺乏有效而多样化的遗传操作手段，客观上给进一步探索相关生物学课题造成了极大的困难。所幸的是，这个问题正在被着手解决，例如，在蜜蜂转基因方法研究方面已经取得一些进展(Ando鲥a1．2007；Schulteeta1．2013)。在不久的将来，人们将能够获得更多先进的蜜蜂遗传操作手段，同时结合愈发成熟的深度测序技术及生物信息学方法，最终为解决上述问题打开胜利之门。这些问题的解决14绷湖雠锄锵萋|耄o 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究将使得蜜蜂级型分化的调控机理更加清晰和完备。并且，由于生殖劳动分工在进化上具有重要意义，从级型分化过程和机理中探索社会性昆虫生殖劳动分工的进化起源及机制势必会带来许多值得人们期待的重要发现。1．3昆虫JlI终端合成研究进展1．3．1JH概述JH是一类倍半萜(sesquiterpenoid)衍生物，在昆虫、甲壳动物以及部分植物等广泛生物物种中均发现JH的存在(嵇保中等2007)。在不同种昆虫中发现存在多种JH同系物，例如JH0、JHI、4-methylJHI、ⅢII和JHIII等，这些同系物有共同的主链碳架结构，区别在于侧链甲基、乙基数目不同(GoodmanandGranger2005；嵇保中等2007)。截止目前，在西方蜜蜂里仅发现一种JH同系物，即JI-IIII(Flurieta1．1982；Robinsoneta1．1989)。JH被认为是最为重要的一类昆虫激素，在昆虫胚后生活的许多方面，如发育、变态、生殖等都发挥着基础性作用(Riddiford1994；WyattandDavey1996；GoodmanandGranger2005)。特别地，对于社会性昆虫，Ⅲ还调节群体内的劳动分工和级型分化等(Robinson1992；HartfelderandEngels1998)。随着研究的不断深入，JH展现出更广泛的作用，对昆虫代谢、滞育、抗逆性、衰老等诸多方面都有显著影nl匈(Flatteta1．2005)。1．3．2昆虫JH终端合成过程JH的重要作用引起一系列关于其合成、代谢及相应调节过程的探索。昆虫中，Ⅲ是在一种特化的内分泌腺——咽侧体(corpusallatum，CA)中从头合成的(GoodmanandGranger2005)。总体而言，昆虫通过甲羟戊酸途径(mevalonatepathway)合成．m，这是一个由多种酶参与催化的复杂过程(GoodmanandGranger2005；刘艳等2007)。具体以昆虫中普遍存在的JHIII为例，其完整合成过程可分为5大步骤：乙酰辅酶A一甲羟戊酸一异戊烯醇焦磷酸(isopentenylpyrophosphate，IPP)一法尼基焦磷酸(famesylpyrophosphate，FPP)一法尼酸(famesoicacid，FA)_JHIII。前3个步骤属于经典甲羟戊酸途径(胆固醇及固醇类物质的合成途径)，而自法尼焦 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究磷酸生成以后的反应则是昆虫和甲壳动物所特有(BellSseta1．2005)。首先，FPP被法尼基二磷酸焦磷酸酶水解成法尼醇；然后，法尼醇先后经法尼醇氧化酶和法尼醛脱氢酶分别氧化为法尼醛和FA；最后，FA在两步催化反应作用下转变为有活性的JHIII。这两步反应分别是由细胞色素P450超家族(cytochromeP450superfamily,CYP)的CYPl5家族成员(如CYPl5AI)催化的发生在碳10和ll位的环氧化反应(oxidation)，以及由保幼激素酸甲基转移酶(juvenilehormoneacidmethyltransferase。JHAMT)催化的羧酸基团酯化反应(esterifieation)(也称甲基化反应，methylation)(Bell6seta1．2005)。上述两个酶促反应发生的先后顺序因昆虫种类而异，使得昆虫Ⅲ终端合成过程产生两种不同的途径(图1．4)：一种是酯化反应在前，环氧化反应在后，如鳞翅目昆虫(Lepidoptera)；另一种恰好相反，环氧化反应先于酯化反应发生，如直翅目(Orthoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)及网翅目(Dictyoptera)等多数昆虫种类(Defelipeetal．2011；Marchaletal．2011)。目前尚不清楚膜翅目昆虫(包括蜜蜂等)具体经由哪一途径实现JHIII终端合成。鳓、人～冬／U。／＼cO⋯rthopt眦era埘,Di嘶pte。ra岬,渔≯‰黪棼、、№刚氛胤蛐t。＼。一、≮一t8riN∥?／E#㈨阳lJ／七八止太更。／716 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究1．3．3昆虫JH终端合成过程相关酶基因研究进展1．3．3。1JHAMT基因近些年来，分子生物学方法在小合成酶类研究方面的应用日益广泛，尤其是对于昆虫特有的m合成相关酶，应用分子克隆技术等极大地促进了有关酶的鉴定工作。JHAMT是参与JH终端合成步骤的酶之一。第一个JHAMT基因BmJHAMT是从家蚕Bombyxmori的咽侧体中克隆得到的。经鉴定，该基因属于S-腺苷．L-甲硫氨酸(S-adenosyl—L．methionine，SAM)依赖性甲基转移酶超家族(ShinodaandItoyama2003)。从大肠杆菌Escherichiacoli中表达得到的重组BmJHAMT蛋白可将SAM的甲基基团转移至JHA(或FA)，生产相应的甲酯——JHIII(或MF)fShinodaandItoyama2003)。BmJHAMT基因表达水平与保幼激素生物合成率呈现强的相关性(ShinodaandItoyama2003)。另外发现BmJHAMT的转录抑制对启动昆虫变态有关键作用(ShinodaandItoyama2003；Kinjoheta1．2007)。若干昆虫的JHAMT直系同源物随后陆续得到克隆和鉴定。这些直系同源物也主要在咽侧体中表达，同时表现出与BmJHAMT类似的催化特性，即可转移来源于SAM的甲基至JHA(或FA)，生成JHIII(或MF)，且与BmJHAMT一样，这些JHAMTs都无法催化其他脂肪酸，如棕榈酸、肉桂酸等，显示出一定的底物特异性(Minakuchieta1．2008；Niwaeta1．2008；Shengeta1．2008；Mayoralela1．2009；Marchaletat．2011)。所有研究都揭示JHAMTs表达水平与傈幼激素生物合成率保持高度相关性。有关JHAMT基因的活体功能研究也陆续报道出来。在模式昆虫果蝇体内过表达JHAMT基因大大延长了其蛹期发育时间，并导致隐成虫致命性和雄性外生殖器旋转缺陷(Niwaeta1．2008)。对闲游3龄期(wandering3订instar)野生型幼虫体表旋加JH或JH类似物后也能观察到与上述一致结果(Niwaetat．2008)。对拟赤谷盗Triboliumcastaneum开展由RNA干扰介导的表达抑制引发了个体早熟性变态，而JH或JH类似物处理能治愈该发育问题(Minakuchietal．2008)。另一项研究对沙漠飞蝗Schistocercagregaria的JHAMT基因实施了RNA干扰，抑制基因表达水平显著减少了小释放，并导致基底卵母细胞体积变小，这表明 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究JHAMT基因参与雌性沙漠飞蝗的生殖调节(Marchaleta1．2011)。上述一系列的功能研究证明，JHAMT基因调控着昆虫发育、变态以及生殖过程。1．3．3．2CYPl5基因家族CYPl5家族成员是另一类参与昆虫Ⅲ终端合成过程的酶。昆虫CYPl5家族的首个基因——CyPJ鲥J是从太平洋折翅蠊Diplopterapunctata中得到克隆和鉴定的(Helvigeta1．2004)。利用表达序列标签(expressedsequencetags，ESTs)技术成功从太平洋折翅蠊CA中克隆了一种新的CYPl5基因——C，PJ剐J。该基因在昆虫咽侧体中以及在m合成高峰期特异性表达，且其mRNA表达水平与CA中的JH合成活性高度相关(Helvigetal．2004)。通过原核表达得到的CYPl5A1蛋白能在体外高效而特异地催化MF发生环氧化产生mIII，该环氧化反应表现很高的对映选择性，反应偏好产生IOR型环氧化物对映异构体(IOR：IOS=98：2)，这与原有的生化实验结果相符(Hammock1975；Feyereiseneta1．1981)。另外，CYPl5A1显示很强的底物特异性，能够高效催化自然底物MF，但几乎不能催化MF同分异构体，以及其他萜类化合物，如法尼醇、法尼醛、FA及ⅢIII等(Helvigeta1．2004)。从沙漠飞蝗的CA中克隆得到另一个CYPl5A1基因一一SgCYPl5A1(Marchaleta1．2011)。SgCYPl5A1全长cDNA编码含484个氨基酸残基的蛋白，蛋白氨基酸序列与太平洋折翅蠊的CYPl5A1保持58％的一致性，且通过序列特征分析知SgCYPl5A1属于CYP超家族。与太平洋折翅蠊CYPl5AI基因一样，SgCYPl5AI也主要在CA中表达，且表达水平与m合成显著相关。通过RNAi作用该基因能显著降低成虫mIII释放率(Marchaleta1．2011)。另外，该研究还证实，沙漠飞蝗Ⅲ终端合成过程的确是先经过由JHAMT催化的FA至MF的酯化过程，再经过由CYPl5A1催化的MF至JH的环氧化过程实现JH的终端合成(Marchaleta1．2011)。，最近，Daimon等(2012)从家蚕中发现并鉴定了首个鳞翅目昆虫的CYPl5A1直系同源基因——c’，P，，a。该基因是造成家蚕dimolting仰D力突变体的根源(mod突变体的幼虫发生过早的幼虫．蛹变态)(Daimoneta1．2012)。由于mod突变体的CYPl5C1基因编码区发生了无效突变(nullmutation)，导致在血淋巴中 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究无法检测到JHs(家蚕中为JHI和JHII)，因此，CYPl5CI是家蚕JH生物合成过程所不可或缺的酶(Daimoneta1．2012)。和已知的两种CYPISAI一样，家蚕CYPl5CI也在CA中特异表达；然而，不同的是，CYPl5C1在CA中随发育过程更为本质地表达，即CYPl5C1mRNA始终维持在一个相当的水平，而没有随m合成活动发生明显波动。与此相对，JHAMTmRNA水平与体内JH生物合成保持着高的相关性(ShinodaandItoyama2003；Daimoneta1．2012)。另外，在家蚕幼虫中过表达CYPl5C1不影响幼虫的正常生长及发育，而过表达JHAMT导致在末龄幼虫期产生幼虫停滞表型(arrestphenotype)，以上结果表明JHAMT是家蚕JH生物合成的限速酶，而非CYPl5C1(DaimonandShinoda2013)。与其他两种已知的CYPl5s相比，CYPl5C1的另一个不同之处是，由CYPl5CI催化的环氧化反应偏好的底物是FA而不是MF，最终产生Jr认(Daimonetal．2012)。由于已证实在不同昆虫中，JHAMT都能以相近的效率同时催化FA和JH发生酯化反应(ShinodaandItoyama2003；Minakuchieta1．2008；Niwaeta1．2008)，那么，可以借助CYPl5酶的底物特异性来解释不同昆虫JH终端合成步骤的发生顺序：由于鳞翅目昆虫(如家蚕)的CYPl5酶偏好FA使得反应顺序为，环氧化反应在前，酯化反应在后；而其他多数目的昆虫(如太平洋折翅蠊、沙漠飞蝗等)的CYPl5酶更偏向与作用MF而使得酯化反应在前，环氧化反应在后(Defelipeetal．2011：DaimonandShinoda2013)。1．3．3．4FAMeT基因除JHAMT和CYPl5外，法尼酸甲基转移酶(FamesoicacidO．methyltransferase，FAMeT)也可能参与JH终端合成过程——_FAMeT以SAM为辅助因子催化FA转变为MF，而且FAMeT所参与的反应可能是JH生物合成过程的限速步骤(YagietaL1991；WilliamsonetaL2001)。在甲壳动物中，MF是由颚器官(mandibularorgan。MO)分泌的，非环氧化mIII类似物(Laufereta1．1987；Tobeetat．1989)。FAMeT参与甲壳动物MF终端合成过程——在SAM辅助下，FAMeT催化FA羧酸基团的甲基化，生成MF(WainwfightetaL1998)。从刀额新对虾Metapenaeusensis中克隆和鉴定了首个FAMeT基因，该基因 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究在虾的多种组织中表达，但主要集中于神经系统(SilvaGunawardeneeta1．2001；SilvaGunawardeneeta1．2002)。体外放射化学分析表明，重组FAMeT能催化FA转变为MF(SilvaGunawardeneeta1．2002)。随后，从多种甲壳动物中克隆得到FAMeT基因，如从美洲龙虾Homarusamericanus克隆得到潜在的FAMeT基因，进一步使用该重组蛋白进行体外催化实验表明：单独的重组蛋白不具有催化活性，而将重组蛋白添加至MO匀浆中能显著提高酶的催化活性，说明需要额外的辅助因子或修饰步骤以激活该蛋t刍(Holfordeta1．2004)。从昆虫中也陆续发现并克隆了潜在的FAMeT基因。在无刺蜂Meliponascutellaris中，存在两种FAMeT基因亚型，分别为MsFAMeT-1和MsFAMeT-2，分析表明它们是由可变剪接造成的，基因表达分析揭示两种亚型在不同级型个体间都存在显著的表达差异(Vieiraeta1．2008)。从地中海实蝇Ceratitiscapitata也鉴定到FAMeT基因，实验证实其可能参与该物种生殖过程(Vanninieta1．2010a；Vanninieta1．2010b)。然而，另有研究得出了不一样的结果，如通过原核表达获得的果蝇重组FAMeT单独或与CA提取物一起作用，没有表现出任何体外催化活性；且FAMeT基因缺陷突变体与野生型相比，MF，JHIII或JHbisepoxide的合成没有显著降低；同时，FAMeT对果蝇的生存和繁殖也非必需的(Burtenshaweta1．2008；ZhangetaL2010)。截止目前，人们对FAMeT基因在昆虫中的具体功能仍存在分歧。1．3．4总结JH作为最为重要的一类昆虫激素，调控着在昆虫生理机能的多个方面，如发育、变态、生殖等(Riddiford1994；WyattandDavey1996；GoodmanandGranger2005)。JH还调节社会性昆虫群体内的劳动分工和级型分化等(Robinson1992；HartfelderandEngels1998)。JH生物合成是一个由多种酶参与的复杂过程。目前基本明确了各合成步骤所涉及的酶类。其中，参与Ⅲ终端合成过程的酶，如JHAMT、CYPl5家族等，均为昆虫所特有，因此有必要着重研究。借助于多种多样的分子生物学手段，已经从多种昆虫中克隆和鉴定了相关酶基因，大大提高了人们对这些酶的认识，但是仍有许多问题有待进一步探索和解决，尤其对于蜜蜂而言，由于现有对相关酶 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究的分子研究几乎为空白，因此，更有必要加紧研究，相信明确蜜蜂JH终端合成过程将十分有利于提高对蜜蜂级型分化内分泌调节的认识。1．4本研究的目的、意义及主要研究内容1．4．1本研究的目的和意义1．4．1．1关于蜜蜂级型分化分子基础长期以来，蜜蜂级型分化都是蜂学研究领域的热点之一。级型分化研究隶属于昆虫社会性的劳动分工研究范畴。级型分化的遗传学本质是非遗传多型性，是一个典型的表观遗传过程。长期不懈的研究和探索，尤其是近些年所取得的若干重要成果，帮助人们对蜜蜂级型分化过程形成了较为完整、深刻的认识(图1．1)。然而，尽管对蜜蜂级型分化的研究已经取得了很大进展，但仍有许多问题值得进一步探索，例如，对参与级型发育调节的具体信号通路及其作用范围，不同学者之间存在较大分歧，后续研究有必要深入探索这些存在矛盾之处，以期达到统一认识。另一方面，虽然己经建立起较为细致而完整的级型分化分子机制网络，但影响级型分化各分表型，如个体大小、发育时长、卵巢大小等的具体分子机制，以及JH等重要内分泌因子生成及作用的具体分子过程等仍有待进一步验证、发掘和完善。此外，如何将基因组甲基化作用与信号通路网络整合起来也是亟待解决的问题。先进技术能成倍地推动科学研究向前发展。近年来快速发展起来的第二代测序技术(next．generationsequencing，NGS)正以前所未有的方式推动着基因组学研究(MorozovaandMarra2008；Metzker2010)。基于NGS技术已成功开发出多种基因组学研究方法，包括应用于基因表达研究的数字化基因表达谱(digitalgeneexpressionprofiling，DGE)等。事实证明，与基因芯片(Microarray)等传统基因表达谱研究技术相比，基于NGS技术的DGE分析方法具有三个无与比拟的优势，分别是数字化信号，极强的检测能力和获取未知转录本(、Hoeneta1．2008)。利用该方法已经在不同物种研究中获得了丰富可靠的基因转录数据(ttHoeneta1．2008；Hegeduseta1．2009；Morrissyetal，2009)。本研究借助Illumina／Solexa第二代高通量测序平台，采用DGE方法比较研 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄究蜂王和工蜂级型发育表达谱。分别对来自蜂王和工蜂幼虫的DGE文库进行高通量测序，获得丰富的测序数据，然后通过一系列生物信息学分析明确蜂王和工蜂级型发育过程的差异表达基因等信息。利用这些丰富的基因差异表达信息，一方面，可以验证现有的级型分化机理研究结论；另一方面，有利于寻找可能参与级型发育调节的新的信号通路。最终将极大丰富和完善级型分化相关分子基础研究，增进人们对级型分化过程的理解，同时对后续深入挖掘相关基因功能打下坚实基础。1．4．1．2关于蜜蜂新基因预测目前己成功完成了西方蜜蜂基因组测序(TheHoneybeeGenomeSequencingConsortium2006)，该工作极大地推动了蜜蜂科学研究。从官方基因库(OfficialGeneSet，OGS)公布的信息可知，西方蜜蜂基因总数约为100，000条(Elsiketal．2007)，明显低于其他已完成基因组测序的昆虫物种(Adamseta1．2000；Holteta1．2002；Xiaetal．2004)。普遍认为蜜蜂基因总数是被低估的，原因可能包括蜜蜂现有EST及cDNA数据有限，蜜蜂与其他已完成基因组测序的物种间进化距离较大等(TheHoneybeeGenomeSequencingConsortium2006)，因此，获得大量、准确的基因转录数据将有利于蜜蜂新基因挖掘及注释。本研究采用利用Illumina／Solexa测序平台分别对建立自4-6日龄蜂王和工蜂幼虫样本的DGE文库进行高通量测序，获得数百万的测序标签数据，这些数据代表着丰富的幼虫发育过程基因转录信息。借助于基因转录信息，运用生物信息学方法，以蜜蜂基因组为参考进行新基因预测。本研究开展的基于大量转录数据的新基因预测将有利于完善蜜蜂基因组基因发掘及注释，间接促进蜜蜂分子生物学等相关研究。1．4．1．3关于蜜蜂JH终端合成m是一类倍半萜衍生物，普遍存在于昆虫、甲壳动物和部分植物体内(嵇保中等2007)。JH对昆虫的发育、变态、生殖等生理过程均发挥极为重要的作用(李胜等2004；刘影等2008)。JH与蜜蜂级型分化关系密切，研究表明在幼虫期，尤其是级型分化关键时期，蜂王幼虫体内m滴度均显著高于工蜂幼虫(Barchuket 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究a1．2007)：对5龄西方蜜蜂工蜂幼虫体表施用JH或JH类似物能引起个体分化出蜂王特征，且当JH应用于4龄和5龄早期工蜂幼虫时，JH表现出的蜂王诱导作用最为显著(wirtzandBeetsma1972)。以上事实表明，内分泌系统通过调节幼虫体内的JH滴度控制级型分化的发生(HartfelderandEngels1998)。昆虫体内JH滴度变化主要受JH生物合成活动调控(Gilberteta1．2000)。小生物合成是由一系列酶参与催化的复杂过程(GoodmanandGranger2005；刘艳等2007)。以昆虫中普遍存在的JHIII为例，其完整合成过程包含5大步骤，而自法尼焦磷酸生成以后的反应(包括JH终端合成步骤)是昆虫和甲壳动物所特有(Bell6seta1．2005)，因此，参与这些过程的酶，如JHAMT,CYPl5家族，FAMeT等，对昆虫而言具有特殊意义，从生物化学及分子生物学角度对上述酶进行了许多研究。目前已从多个物种中克隆并鉴定了JHAMT,CYPl5，FAMeT基因，并证明了JHAMT与CYPl5与JH生物合成高度相关性，同时发现其参与昆虫发育、变态及生殖等生理过程(ShinodaandItoyama2003；Helvigeta1．2004；MinakuchietaL2008；Niwaeta1．2008；Mayoraleta1．2009；Marchaleta1．2011)。然而，目前，对蜜蜂而言，对上述酶的研究基本处于空白。本研究借助分子生物学方法，对参与蜜蜂JH终端合成步骤的酶基因一，删脚、CYPl5、FAMeT进行系统研究。从蜜蜂幼虫中克隆得到完整的JHAMT,CYPl5、FAMeT基因并进行序列分析与鉴定；结合蜜蜂级型分化过程，探索JHAMT,CYPl5、FAMeT基因对级型分化可能的调节功能。这些研究将首次系统揭示蜜蜂JH生物合成终端步骤相关酶基因的本质，丰富和完善对蜜蜂JH合成过程的认识，同时深化对内分泌系统，尤其是m对蜜蜂级型分化的调节作用的理解。1．4．1．4关于蜜蜂健康保护有关Ⅲ合成的研究之所以受到人们广泛关注，其重要原因之一在于人们希望从JH合成过程中寻找作用靶点以开发高效农药，防治农业害虫。m之于昆虫生理的重要性以及JH生物合成终端步骤相关酶的特殊性，使它们成为农药设计的理想靶,点(ShinodaandItoyama2003；Helvigeta1．2004)。近些年来，世界各地陆续报道了蜂群崩溃失调症(colonycollapsedisorder, 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究CCD)的严重危害(RatnieksandCarreek20LO)，表明蜜蜂正受到前所未有的生存威胁。在目前看来，这种威胁可能包含多方面的因素，而农药是其中之一。越来越多的报道表明，新烟碱类杀虫剂(neonicotinoidinsecticide)对蜜蜂个体及群体健康都造成了严重的伤害(Henryeta1．2012；Whitehometa1．2012；Brydeneta1．2013；DiPriscoeta1．2013；Matsumoto2013)。因此，有必要设法避免农药对蜜蜂的影响。本研究通过对蜜蜂JH生物合成终端步骤相关酶基因的系统研究，为今后人们利用JH及其合成酶基因开发农药靶点时，尽量避免造成对蜜蜂的伤害提供一定的理论参考。1．4．2本研究的主要研究内容1)构建蜂王和工蜂幼虫的DGE测序文库分别利用来自4-6日龄的意大利蜜蜂蜂王与工蜂幼虫样本构建相应的DGE测序文库。2)开展Illumina／Solexa高通量测序借助Illumina／Solexa第二代高通量测序平台，对上述DGE文库进行高通量测序，获得测序原始数据。3)对测序数据进行的生物信息学分析包括原始数据过滤处理、标签总量及分布统计、标签比对、新基因预测、差异表达基因检测、GO和KEGG基因功能富集分析等。4)开展蜜蜂JI-五4MT基因全长克隆、鉴定及功能分析利用RACE技术克隆JHAMT基因全长eDNA；利用JHAMT基因相应氨基酸序列进行多重比对分析；构建系统发生树；进行JHAMT蛋白原核表达；重组蛋白纯化及质谱鉴定；JHAMT多克隆抗体制备；qPCR分别检测蜂王、工蜂级型发育过程JHAMT基因mRNA表达水平；通过免疫印迹检测蜂王、工蜂级型发育过程JHAMT蛋白质丰度差异。5)开展蜜蜂CYPl5基因克隆、鉴定及功能分析克隆包含完整ORF的CYPl5基因cDNA；进行氨基酸序列多重比对分析；开展系统发生分析；比较分析蜂王和工蜂级型发育过程CYPl5基因mRNA表达 浙江大学博士学位论文蜜蜂像幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级翌发育过程中的表达研究差异。6)开展蜜蜂FAMeT基因克隆、鉴定及功能分析克隆包含完整ORF的FAMeT基因eDNA；开展序列多重比对分析；构建系统发生树；比较分析蜂王和工蜂级型发育过程FAMeT基因mRNA表达差异。 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究第2章蜜蜂级型分化数字化基因表达谱2．1引言蜜蜂之所以在许多生物学研究领域都已成为一种重要的模式生物，是因为它们拥有复杂的社会行为，显著的级型发育差异，惊人的学习记忆能力等(TheHoneybeeGenomeSequencingConsortium2006)。正常情况下，每个蜂群仅有一只蜂王，蜂王在繁殖季节每天约能产下2000粒受精卵，且通常拥有长达1到2年的寿命，是工蜂的十倍(PageandPeng2001)，而成千上万的工蜂则表现出非凡的学习记忆能力(Menzel2001)。尽管蜂王和工蜂都是由受精卵发育而来的雌性蜜蜂，但二者截然不同，造成这种巨大差异的原因主要是不同的营养摄入，激素介导以及差异基因表达(EvansandWheeler2001)。运用基因芯片等方法己发现蜂王与工蜂幼虫的基因表达谱存在显著差异(EvansandWheeler2000；Barchuketal。2007)。然而，基因芯片等传统的方法无法实现对生物体完整表达谱的评估，从而不能充分捕捉到其他一些涉及级型发育过程的有用信息。第二代测序技术已成为后基因组时代探索基因功能的强大工具(MorozovaandMarra2008；Metzker2010)。基于第二代高通量测序技术开发的基因表达研究方法，如数字化基因表达谱DGE等，已成功应用于多个物种相关研究，并获得了丰富、可靠的基因转录数据CtHoeneta1．2008；Ctoonanelat．2008；Morrissyeta1．2009)。本研究应用基于Solexa第二代测序平台的DGE技术检测了蜂王和工蜂幼虫的表达谱，并试图通过这项新技术从蜜蜂基因组中预测新的编码基因。2．2材料和方法2．2．I蜂群组织和样品采集在浙江大学华家池校区组织3群各10张脾的“浙农大l号”蜜蜂蜂群一一该蜂种是一种王浆蜂蜜高产型意蜂品种(Cheneta1．2002)。分别将每群蜜蜂的蜂王限制在一张空脾上产卵24h。然后，把上述带有新产下受精卵的巢脾全部转移至一培养箱中(34．5℃，70％RH)。66h之后，从每张巢脾中分别随机转移150 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究只工蜂幼虫至人造台基中并组成育王框(此时幼虫虫龄为孵化后Oh．18h)，然后将各育王框及含剩余工蜂幼虫的巢脾同时放入相应实验蜂群的继箱中培育蜂王和工蜂幼虫。分别在第4d(孵化后72h．90h)、第5d(孵化后96h．114h)、第6d(孵化后120h．138h)从每群中各收集30只工蜂幼虫和30只蜂王幼虫，并将收集到的幼虫样品立即置于液氮中冻结，然后于．80。C冰箱中贮存。2．2．2RNA提取首先，将来自3个蜂群的蜜蜂幼虫样品按照不同日龄与级型分别等量(10只)混合，得到6份幼虫样品，即4日龄、5日龄、6日龄蜂王幼虫及相应日龄的工蜂幼虫样品。使用TRIzol(invitrogen)试剂按照厂家说明对6份样品分别进行总RNA提取。具体提取方法及步骤如下：1)用液氮充分冷却研钵及杵，在液氮中将冰冻的幼虫组织研磨成粉末状，趁液氮尚未完全挥发，将粉末转移至EP管中。2)按照lmlTRIzol／50mg-100mg组织的标准向EP管中加入TRJzol，并剧烈振荡，充分匀浆。3)匀浆后，于室温下放置5rain，使核蛋白复合体充分解离。4)加入氯仿(V氯仿：VTRIzol=1：5)，剧烈振荡30S，室温放置3rain后于4"C，12，000g离心15min。离心后，混合物分为三相：下层红色的酚一氯仿相，中问相，上层水相。RNA绝大部分存留于水相中。5)将上清液转移至一新管中，加入异丙醇(V异丙醇：VTRIzoI-1：2)，混匀，室温放置10min。6)4。C-F，12，000g，离心10min，离心后，RNA形成胶状颗粒物沉积于管底和管壁(如发现RNA沉积不完全，以15，000岛加离5min)。71移去上清液，用75％乙醇(V乙醇：VTR均I=1：1)洗涤，40C，7，500g，离心5min，重复上述操作一次。8)RNA沉淀于空气干燥5～10min。9)加入无RNase水，反复吹打以溶解RNA。如RNA较难溶解，可置于55～60。C助溶5min-lOrain。10)用NanoDrop2000(ThermoFisherScientific)钡,lJ定样品RNA浓度及OD260／28027 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄比值(要求该比值在1．9～2．1之间)。11)总RNA保存于．80。C。2．2．3标签制备及Solexa测序将上述6份总RNA样品按照不同级型进行等量混合，最终得到2份总RNA样品——蜂王幼虫总RNA样品(代表4、5、6日年龄蜂王幼虫)与工蜂幼虫总RNA样品(代表4、5、6日年龄工蜂幼虫)。对这两份总RNA样品分别利用llllumina基因表达样品制备试剂盒(Illumina)进行标签(Tag)制备(图2．1)，之后利用Solexa／Illumina第二代基因组分析系统(Illumina)对标签文库(taglibrary)进行深度测序。具体操作方法和流程如下：1)将6Pg总RNA与oligo．dT磁珠混合孵育以捕获mRNA，并在oligo—dT磁珠引导下同时进行第一链和第二链cDNA合成。2)使用限制性内切酶NlaIII(识别并切断cDNA上的CATG位点)消化结合磁珠的cDNA，得到从最靠近3’端的CATG位点至poly(A)尾之间的片段，并清洗去除其他片段。3)利用磁珠沉淀纯化带有cDNA3’端的片段，并在其5’末端连接Illumina接头l。4)使用限制性内切酶MineI(识别lllumina接头1与CATG位点的结合处，并切断下游17bp处CATG位点)处理cDNA，产生带有接头l的标签。5)通过磁珠沉淀去除3’片段后，在标签3’末端连接lllumina接头2，获得两端连有不同的接头序列的2lbp标签文库。6)经过12个循环的PCR线性扩增后，利用6％TBEPAGE胶电泳纯化85碱基条带。7)解链并将单链分子加到Solexa测序芯片(flowcell)上固定，每条分子经过原位扩增成为一个单分子簇(cluster)的测序模板。8)加入4色荧光标记的4种核苷酸，采用边合成边测序法(sequencingbysynthesis，SBS)测序，每个通道产生数百万条原始Reads，Reads的测序读长为35bp。 *n^}■±}n*i女＆Ⅸ∞m《#*☆＆目*目§目*f≈№、42＆#*镕Ⅲ#Hn＆÷∞《#ⅢE：二=：==：：：蕊·NI^"l⋯I∞iil兰=========-j⋯m一匝五互：===：：掣lLmⅧ“2一，‘】j·运￡=====—而i■—』!二——l。。：一⋯“crt■■■■■■■[亘i五=====五j巫i口圈2．1标签制备的原理和步骤(刘芳2012)F电．2．1Theprinciplemndstepsoftagpreparation(Liu201Z)2．2．4数据加工和初步统计分析运用basecalling方法将Solexa测序所得的原始图像数据转化为碱基序列数据(raw=cads)。根据数字化基因表达谱数据分析流程(图2,2)，对测序数据进行一系列的深入分析。由于这些原始序列都带有一段3’接头序列，且不可避免地含有少量低质量序列及其他杂质成分，因此．需要提前对原始序列进行一系列数据加工而获得可靠标签(CleanTag)。具体数据加工的过程如下：夺去除3’接头序列：夺去除空载reads，即只含3’接头而找不到T她序列的reads：夺去除低质量标箍．即含有低质量分的碱基和未知碱基N的标签审去陈长度过大和过小的标箍，只保留2lnt长度的标签：夺去除拷贝数为1的标签：夺获得可靠标签。在获得了可靠标签数据后．对数据进行如下统汁分析：1)表达量分布统计． 浙江大学博士学位论文蜜蜂像幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究按照不同的拷贝数区间分别统计各区间内包含的总标签数目(totaltagnumber，是指拷贝数在某一区间内的所有Tags的总数，指示表达量信息)以及独立标签数目(distincttagnumber，指除去冗余的所有唯一标签的总数，即拷贝数在某一区间内的所有标签的种类)：2)测序饱和度分析，检验随着测序量(总标签数量)不断增加，标签的种类(唯一标签数量)是否随之继续上升。图2．2数字化基因表达谱实验及数据分析流程Fig．2．2TheprocessofexperimentanddataanalysisofDGE2．2．5标签比对、基因注释及表达量确定标签比对是一个由一系列步骤构成的复杂流程(图2．3)。首先，通过检索GenBank数据库中的西方蜜蜂基因记录，如refseq，mRNA及ESTs等，建立起一个西方蜜蜂参考基因数据库(referencegenedatabase)，并进一步生成一个镜像库，然后利用软件检索mRNA上所有的CATG位点(不仅仅只搜索3’端的一个位点)，生成CATGfN)17的参考标签数据库(referencetagdatabase)。接着，将所有的可靠标签与参考标签数据库进行比对(只允许至多发生一个核苷酸错配)，过滤掉那些比对到多个基因的标签，对比对到单一基因的唯一性标签(unambiguoustags)进行基因注释，统计每个基因对应的原始可靠标签数目，并对原始可靠标 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究签数目做标准化处理，获得标准化的基因表达量(TPM，transcriptpermillioncleantags)，用以衡量该基因的相对表达水平。标准化方法是把可靠标签的总数标准化到一百万，然后计算每种可靠标签的相对数值。图2．3标签比对流程Fig．2．3Theprocessoftagmapping2．2．6候选基因预测及其功能注释对于那些无法比对到参考标签数据库的标签，则进一步将它们与蜜蜂基因组(Apismelliferagenome4．0)进行比对，并挑选出成功比对到基因组且在上、下游与均已注释基因相距2kb以上的独立标签。运用Genscan(http：／／doc．bioperl．org／releases／bioperl-1．0／Bio／Tools／Genscan．html)对这些独立标签及其上、下游2kb范围内的序列进行基因编码潜能预测，筛选出可能的候选基因。由于缺乏直接的功能预测，采用序列相似性搜索策略(sequencesimilaritysearching)和GO注释方法对候选基因进行功能注释。具体地，利用Blast2GO程序(GStzeta1．2008)来实现此类基于序列相似性的分子功能注释。 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究2．2．7差异表达基因筛选及功能分析基于Audic和Claverie(1997)发表的数字化基因表达谱差异基因检测方法，对蜂王幼虫和工蜂幼虫DGE表达谱进行差异表达基因筛选。具体分析过程中，参照Benjamini和Hochberg(1995)的报道，通过控制FDR(falsediscoveryrate)的数值决定基因差异表达检验尸值(Pvaluve)的阈值。对筛选得到的差异表达基因，首先进行GeneOntology(GO)功能显著性富集分析，具体地，运用超几何分布(hypergeometriedistribution)，将所有差异表达基因映射至GO数据库(http：／／www．geneontology．org／)的条目(term)中，计算每个条目包含的基因数目，并以整个数据库的基因为背景，找出与西方蜜蜂基因组相比，在差异表达基因中显著富集的GO条目。然后，进行KEGG通路(pathway)显著富集分析，以KEGG通路为单位，计算差异表达基因与通路的超几何分布关系，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的通路。2．3结果2．3．1Solexa测序统计基于Illumina／Solexa第二代高通量测序平台，对两个DGE文库开展了深度测序，分别获得了约770万(蜂王)和910万的rawreads(工蜂)(表2．I)。对rawreads进行一番数据J3nm后，最终得到约760万(蜂王)和890万的可靠标签(7-蜂)，而相应的独立标签数目分别约为8．7万(蜂王)和10．0万(工蜂)(表2．1)。表2．1DGE文库测序统计Table2．1StatisticsofDGElibrarysequencing *口^≠*±}＆*女i#％∞*t##e＆Ⅷ*■t目#}女＆、#t＆#＆g■&inR÷∞&8ⅢR2．3．2标签表达量分布一般而言，细胞中mRNA的表达呈现异质性和冗余性，即一小部分mRNA具有很高丰度的表达，而绝大多数mRNA的表达量都很低。分别对两个DGE文库的可靠标签和独立标签随标签拷贝数的分布情形分析表明，少于8％的独立标签拥有高表达水平(拷贝数大于100)，其表达量之和接近总‘ag表达丰度的90％；超过50％的独立标签处于低表达水平(拷贝数小于5)，其表达量之和不足总tag表达丰度的2％(图2．4和图25)，这进一步证实了生物体mRNA表达的特点。l一202I～505I～100’100Tagcopynumber图2．4工蜂幼虫DGE标签分布Fig．2．4DistributionofDGEtagsfromworkerlarvae一_-J笋一未一躲Ⅱ吐帅跚加∞∞∞如如moOj0O0j0O0 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究2．3．3标签比对和基因注释通过检索GenBank数据库中的西方蜜蜂基因记录，生成了一个包含9,929条基因的西方蜜蜂参考基因数据库(referencegenedatabase)，同时进一步获得了含有51,614个参考标签(referencetag)及45，869个唯一性参考标签(unambiguousreferencetags)的参考标签数据库(表2．2)。将所有测序标签比对到该数据库，发现在蜂王和工蜂幼虫DGE文库中分别有33，098(38．19％)和36，711(36．72％)的独立标签成功比对到参考基因中，而对于唯一比对到某一基因的标签，即唯一性标签(unambiguoustag)，则分别有29，666(34．23％)和33，045(33．06％)独立标签唯一比对到参考基因中，由此鉴定得到6，129(62．36％)和6,200(62．44％)个基因(表2．3)。对这些基因进行基因注释，同时计算与任一基因相对应独立标签总拷贝数并标准化至TPM，从而得到该基因的相对表达水平。表2．3标签比对统计Table2．3StatisticsoftagmappingSummaryQueenWorkerAllTagsMappedtoGenesAllTagsMappedtoGenesAllTagsMappedtoGenesAllTagsMappedtoGenesTotalnumberTotal％oftagDist洒ctnumberDistinct％oftagUnambiguousTagsMappedtoGenesTotalnumberUnambiguousTagsMappedtoGenesTotal％oftagUnambiguousTagsMappedtoGenesDistinctnumberUnambiguousTagsMappedtoGenesDistinct％oftagTag-mappedGenesnumber4，326，8865，049，90057．20％56．75％33，09836，71138．19％36．72％2，995，8883，561，73239．60％40．02％29，66633，04534．23％33。06％7．0027．014％ofrefgenes70．52％70．64％UnambiguousTag-mappedGenesnumber6．1296,200UnambiguousTag-mappedGenes％ofrefgenes62．36％62．44％34 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究表2．2参考标签数据库Table2．2Referencetagdatabase2．3．4DGE基因检测饱和度分析通过标签比对，已鉴定到了数千个蜜蜂基因，但仍无法肯定基因检测是否达到饱和状态。因此，开展了基因检测饱和度分析。研究发现，对于两个DGE文库，当总标签数目达到6百万之后，基因检测的百分比不再显著上升，即已基本达到饱和水平(图2．6和图2．7)，这表明本次实验的DGE测序深度足以检测给定样本的几乎所有基因mRNA转录本。掌吾呸芒∞至∞o芑m昱窖凸．TotalTagNumber(X100K}图2．6工蜂幼虫基因检测Fig．2．6Geneidentificationinworkerlarvaelibrary 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究TotalTagNumber(XlOOK)图2．7蜂王幼虫基因检测Fig．2．7Geneidentificationinqueenlarvae2．3．5新基因预测两个DGE文库中一共有78，938个独立标签无法比对到参考标签数据库而比对到基因组中，其中包括62，417个唯一比对的独立标签和16，521个多比对的独立标签。运用Genscan对这些唯一比对的独立标签上下游2kb范围的序列进行编码基因预测，获得了9,258个候选基因，其中有3，566个长度超过300nt，这些候选基因被视为黄金候选基因(Goldencandidategenes)，其编码的蛋白质序列平均长159aa，最大长度为631aa。另外5，692个候选基因的编码蛋白序列短于100aa，其中有5,673个转录本可能因逃脱了Genscan分析而无法得到预测，它们可能是mRNA样非编码RNA(mRNA．1ikenoncodingRNAs)。2．3．6候选基因的功能分析通过BLAST检索，发现497个候选基因与其他已注释序列具有高的相似性(图2．8)，其中有211个候选基因通过GO比对或InterProScan(Hunteretal。2009)分析成功得到注释，而长度越长的序列获得注释的可能性越高(附图2．1)。对候选基因进行GO功能分类分析表明，这些基因参与许多发育相关过程，如组织结ooro田o∞o寸oNo一摹一廿∞蓦c∞p1∞c∞oJoa6佑lu啦世廿n 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究构发育、细胞增殖、胚胎发育、胚后发育、生长、多细胞有机体发育等，还有代谢、生殖等生物学过程(图2．9)。进一步对候选基因进行KEGG功能富集分析表明，这些候选基因参与若干代谢通路之中，如细胞循环(cellcycle)、长时程增强(10ng．termpotentiation)、黏着连接(adherensjunction)、TGF．beta信号通路(TGF—betasignalingpathway)、Wnt信号通路(Wntsignalingpmhway)、Notch信号通路(Notchsignalingpathway)等(附图2．2)。A爱Ⅺ鬏∞嫡O4∞篮O誊搬2502∞150100∞OB翳O荸∞毒50碡∞350曼瑚‘瑚2∞15D’∞50O筠∞751∞125eValus(1争蛉图2．8候选基因比对相似性分析。A)候选基因比对相似性分布；B)候选基因比对E值分布。Fig．2．8Analysisofsimilarityofmappingforgenecandidates．A)Similaritydistributionofmappmggenecandidates；B)E-valuedistributionofmappmggenecandidates． 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄C雌¨甜C0m∞mm¨嘲o“缸FmetionI]id叼ie,alP阳。啦s图2．9候选基因功能分类Fig．2．9Functionaldassificafionofgenecandidates2．3．7蜂王与工蜂幼虫表达谱差异为了揭示蜂王和工蜂幼虫级型发育过程在分子水平的差异，需要检测两个文库的显著差异表达基因。利用Audic和Claverie(1997)发表的分析方法发现在蜂王幼虫中分别有1，278个上调表达基因以及1，451个下调表达基因(P<0．05)，而在P<0．01水平，则有935个上调表达基因以及1，116个下调表达基因(图2．10)。表2．4和表2．5分别罗列了在蜂王和工蜂幼虫中最显著上调的50个基因。从表中可以看出，在蜂王幼虫发育过程中最显著上调的基因多数是代谢酶类基因，如Y．谷氨酰基羧化酶、脂肪酶、葡糖脑苷脂酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶及葡萄糖．甲醇一胆碱氧化还原酶等，还包括4种组蛋白编码基因(HistoneH2A，H2B，H3，H4)；另外，特别发现2个参与保幼激素合成的基因一一保幼激素酸甲基转移酶基因JHAMT和细胞色素P45015A1基因CYPl5A1，以及保幼激素诱导蛋白∞￡＆IoL●t3Z *Ⅱ★}*±≠＆☆i女#*自№i#《☆＆Ⅷ*目￡目*}≈№、*《＆#E‰■#ina十∞女镕ⅢR26(Juvenilehormone．inducibleprotein26)基因。相对地，工蜂幼虫发育过程中最显著上调的基因仅有少数代谢酶类基因，如短链脱氢酶／还原酶(Short-chaindehydrogenase／reductase，SDR)、静葡糖苷酶及酮戊二酸脱氢酶等；储存蛋白hexamerin110(hexll0)具有显著高的表达水平；还有3个细胞色素P450家族基因呈现高表达；另有若干昆虫表皮蛋白基因(insecteuticularproteins)也显著上调表达。蜂王和1=蜂幼虫级型发育过程伴随着强烈的差异性基因表达。Ur10‘b202、JU∞10L0TP¨J圈2IO蜂王与工蜂幼虫基因差异表选。上部和下部的红点分别表示在蜂王幼虫中显著上调和显著下谓的基因。Fig2．10DifferentialgeneexpressionbetweenqaeealarvaeandworkerlarvaeTheupperandlowerreddotsrespectivelyshowthesigeifi吼ntly“p-anddown-”gulatedgenesinqueenkv锵(P(0nI)ThM雌dotsindicatetheg黜s咻s唧m盟ntIyeopnsE耐be附eent№∞似ogroups伊)0．011 oNhh．=葛一N一。tN々N罱一HI>-No寸《uJ】oIo呐一．u瓢峪】3=o鲁c辱皇ouupl苦jug：Ipo竹ol与llEls晕。专，a毫皇气弋舀∞-LuHo山虿‰《否_g‘(nNNIIt，uo，1一《每．∞一。嫦ouo_"IB『一昌一∞每^避运基忠≈飞一口∞■u_o∞《山《石篮量叠∞_l卜∞o寸uo，I—Vd-0叽N∞E)o兰《6『l_IeIT鲁锡口kA啬鼍u11．皇q飞一Q∞卜uH口皿匠～《Z盛暑‘(卜一N”一正．uo—v卜_叫竹N卜uorI暑譬。Jd葛3l一2；od堂口-S≮u窭皇导一o∞卜u—o阻瞄．I《Zg昌IB一=∞鱼‘(n寸∞口N卜uoJ一、i，d．孙卜卜寸口uu呐罟u∞h蓉荤叶一plB∞Hu矗。矗D二0l童IⅢIs望是专基薯a弋～口∞一譬口岂山《Z瞄巨‘(乱甘tro；uorlvdrd-cn—trouo_每II暑Is色‘山备≈～鞋皇也气一口∞hu_Q山瓦(I《Z筐￡‘(∞onnN卜uorI一。寸‘．∞一心一n口uolk卫一—ul∞安山、暮u嚣鼍飞一Q∞一u_口基‘I《萏暑芯芝。；u01)。的罟Q呻oJ口空等譬ou：10皇童lm惕塞山≥葛莲盘乱鼍口衄卜譬口岂山<，复暑杂。高；u01)—，d-瓮c6口uo：四IIⅢl∞是A窨al≈皇≈鼍口叫hu一凸兽山对p二．E崔o，(g旦高1llu鬲譬～山窨芝≈童屯飞一口∞■uH口星厶《Z《看^nN寸N玖uorI—vd．8一呐小ou3毒II量Is譬避，，，羔鼍鼍导一o∞LLuHo∞篮II《Z篮置ln寸∞N；u01)一_盆盘】B>苞l|。蚺仁窖_．vd{NAo_【ou暑高IlgIs≈k尝f，u基皇氢飞一凸∞卜uH凸m趸tI《弓H暑矗乱。卜昏。寸uorI)∞苗口u寸扣卫鲁lIg一曲窖§～毫盘乱飞～口∞}uH口m瓦‘l《丕岳l‘(z。导NS01)《吾oJ墨．vd丧N∞【0旦皇军墨3l黑∞口；IIⅧIs是惑专‘，鼍鼍。鲁u_Q盘(I《Z岛暑‘(nnn一一寸uoJ一．銮-I￡．∞一n口u3h卫一uIls≈、S，，v蓬兽乱弋一o∞卜u一口基【l、，ZE量‘(西∞∞一”nuo一-7，p是_■日}IdIJ。曲l_。—，d_瓮昏cIouo∞量奢(，q訇。暑暑墨；一曲矗暑昌B暑0l矗II量∞9、墨专誉皇q弋YⅡ曲huH凸基山口9．∞磊．≈t，I．∞一6．母no．∞一N．口”o．瞄寸o．，，nI．∞一o．n∞e．衄∞寸_2．∞o■”小o．∞n甘．∞NI-固()tn啦拳．∞_l_乙．一^o．∞2．tln1．山No．n：．∞nA．，”o．叫∞¨．N=．叫，节口ncIooo．o”卜∞o．n∞∞!．n乱一Nnn直一Nnm争崞寸气n∞nN，n口t『n乜non∞唧n寸N卜婚．nn卜的9叶n卜∞o．寸n乱oN．寸甘卜o∞．甘寸1)∞o．呐cIN■n寸N卜崎．n一9∞∞．n∞noc．口凸NNnN卜tr寸N罱卜一=卜n∞NN一∞n寸也一n寸_l寸A卜苦拳翟d13嚣盎。暑_0o；lB≯．‘(JQ，ILo触，=嚣；F一口=蜃N∞。一葺oo暑守Lo=k掌车．I、『llLL。窆厶一蕾爵>-I矗一昌∞∞宙叮暑一曲p二Q咖电p：l矗一昌呻u-。盛暑h墨盅嗣u《一昌卧啊朝oⅥ盘o-Q蛊■t’．Np—o—篁函粥七。岍盆器叫榔嘎嚼壬q蠡H鹫气N群硬童蚓氍S哥释捌忸赵科疑H球赵娃鲥，理性卜隶甄蛾避枨罂键姬臻毒事髅蟋暴噬嵫踟斟g趔扑书煎扑K15瘵 导口一高器葛∞∞∞∞∞器掣卜心一一、。nn∽⋯_一n口一<弓Hg‘(卜卜∞∞o寸uo厂I一《宕-盘os一．《牛∞_l_【∞ou口口一耋。苗时go=卫一g惕口k迫≤鞋≈盘氩弋一口∞hu一凸嘲出‘I《Z笛g‘(N寸n母N卜uo广I一—‘-c一崞一nouo_每一一gIs曼篷≈∞誉鱼缸弋一Q∞卜uIⅡ日出山《Z笛g‘(oN”心N卜uo广lv寸}{譬lo苗IIlIB薯一——薯u咖o_h三一—皇∞要M——逞u基鼍A弋一Q衄卜u_凸衄岛‘I《Z《暑‘(昏卜_【一”nuoJ一一_【《”_山}u一_l《2o帅t，山og宝工u旦^。9娄吣善暑鱼飞一Q∞一u一凸目_jl山．(oo呐∞o寸uorIv_l鼍皇鲁>ldIJ葛=兽_，Vd矗嫱naoun嚣ls^II|盘∞zo_亮11吕一呐≈k哎运∞S鼍q弋‘(nnt，一nnu01)^_白厶_)-o∞_Ijuu‘盘《弓H骞一Q∞卜U—o目凹山《Z目吕焉一葚口。甓矗吕(，∞I．3p量j∞!p暑∞10J‘lo一向II暑ls寸k淫，，舢蓬盘皂弋一口∞ho—o∞酲tI《Z醚暑‘(寸寸小o；u01)t_一言ldou2日2nI南昌oJ一声∽_}∞矗。暑u暑uj—g舞．qns．I芒ocl富暑与o#u协冷。叫乌Ip蜀Iq-d-I≮2JBlI暑胃窭山≥∞莲岳奇一Q山巨u—Q山屈k《z岳lII‘(N_I卜吼。甘uo一一—，d^。小nou。_高一一直Is尊^嫂≤舢莲息导一口m目u_口m盈‘王《Z笛吕‘(N卜心心N卜uo，Iv—，d．卜婚￡，nou唪Ng一拦9Id。IqI。喜勺qI_u口。暑_I(’工卫一；Q》Il一口_．1BI一基Is窭山』：≤警霉童导一Q衄bu—o越瞄厶《Z崔昌‘(∞_N々Nhu01)vd-0nn卜一oo∞∞芒世∞c害=h暑。巨pl。日∞二。盅c窖一∞=口∞》jf-宴JB一一gls§、心暮u基皇导一Q山目u_o衄岳山厶净已卜IB。。n寸‘Iu旨oJ二u2huo一。母。2(Io_J口号UI坼冉～哎誊舢基皇良飞一(】m【上u-Q∞盈厶《Z崔暑‘(N∞就△o寸u01)《耳onHNr)u皇急一一g一坼芏山≈，，址基壹≈飞一口衄【工ul『Q啦岳■《Z瞄暑l口。一叼N卜uorI)《山．A∞一”_Iou昏一sI七∞oop斋一一g≮qk警≈坠≈皇；飞¨o∞j．uHo盈‘l呐可u3IQId暑(’u．《Z凹吕一。一一×Q8o一一uIJa—_哥x譬一警～山§≮g盘导“=凶∞”．t，ononI丑窨，￡．o寸寸t，o．嘧．乱An一．∞．卜∞∞6-皤．卜∞nc．o一。口嶂nt．一h2nlcH暑oIIdl-篇u口。o-o■；i>．～(J盖-o圭o--；r—o=再昌N蛐。一皇-p；守．|、I(1h．I-—lJo事．窆II■o昂>-曩一．Io葺．Io薹．皇一∞Q蜀oM々o-爵一昌眦o．I．盘昌h=口最3IJI昌眦一晴盎m臣o-o置卜呐．No一直_酋区醐÷o呐蛊器叫讯吲嚼岳嚼蠡辫H岍．z碟《Z篮旨‘(口hNnN^uod—a一312△互In口∞一一器时=u∞oJ勺h工u≈、，。o-Ib套：二一茸苗量矗．奢0J【ph车c)^}{口《王_H＆皂一H_∞厶jD冷=u劬2口^工u屯《拳u-lh譬．cx。_I々釜-￡v一。＆扫∞∞霉占鼬2口h二号《口u-lh譬h×DJqhII．n。u哥一一昌一的9～弓，掣≈s皇钆弋～口∞hu_口皿岳(I《Zg基‘(cI。。一寸uo—v—c毒。帆=ouNcIa_oJ厶叫匕Ip；Iq。§13i。n一暑器一厶。譬嚣∞。卅高【【暑Isek§，，址g盘≈弋一凸山卜。一凸啦蓝山《Z匣宣‘(n卜。心N卜uo一一《吕-0Jo叽一。—c^”一w—ou)l。一苫．uj旦2荡宴高IIgls乜kA窨警≈皇^岢一Q∞一uH口诅瞄I王、，Z盛暑‘(nn∞吼ot，u01)—c．0崞一nou旦鲁一一昌Is是文|『，∞娶皇乱飞一口∞卜uHQ各‘I《z醪暑一曩焉厶^n寸N卜H卜uoJ一—，d品趴n可ou口『l旨l191sq．，§≈v|II皇(，飞一o∞卜u_o∞nllI0．99(图3．8)，表明本次实验所选用的引物对均满足要求。AB∞Ahamt柏y=·3．3451x+33．966一-09939E=10‘坼I”I一1=0．99oIZJ1b50123436Log(Quantity)LogIQuantity】图3．8关于qPCR引物对的检验。使用一系列8倍稀释的cDNA样品作为模板绘制相对标准曲线，并计算和列出了回归方程、决定系数(r2)与PCR扩增效率(E)。A)对目的基因AmJHAMT扩增引物对的测试；B)对参考基因actin扩增引物对的测试。Fig．3．8TestsontheqPCRprimerpairs．Serial8xdilutionsofcDNAsampleswereusedastemplatestogeneraterelativestandardcurves．Theregressionequation，determinationcoefficient(，)andPCRamplificationefficiency④werecalculatedandpresented．A)testontheprimerpairforthetargetgeneA柑HAMT；B)testontheprimerpairforthereferencegeneactin．借助于qPCR分析，检测了爿删胛基因在工蜂和蜂王发育过程的mRNA表达谱。用于检测的样品代表了蜜蜂蜂王与工蜂自小幼虫期直到蛹期早期的发育j；}∞o廿己>u∞一oL-¨∞ct|"LⅪ掉∞O∞p^u弓一o‘∽∞．1c．L *Ⅱ^#*±}＆*女★#*#*tg*自＆¨*目§目H}女＆、g《＆#＆gⅢ￡in8÷∞女t*E过程，由于1龄小幼虫被转移至王台以培育蜂王．故1龄期发育期并没有包含在检测范围之内。结果表明，几乎在所有发育阶段，蜂王都比工蜂表达更丰富的AmJHAMTmRNA(图3．9)。具体地，显著高的基因表达水平位于如下几个时期：2龄期(f=562，df-4，P=O006)，5龄进食期O=798，dr=4，P0．99(图4．3)，因此，引物对满足要求。由于actin基因扩增引物对此前已得到验证并符合要求，故不再验证。79 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究柚tog(锄nut,t}图4．3AmCYPl5AIqPCR引物对验证。使用一系列8倍稀释的cDNA样品作为模板绘制相对标准曲线，并计算和列出了回归方程、决定系数(，)与PCR扩增效率(E)。Fig．4．3TestsontheAmCYPl5A1qPCRprimerpair．Serial8xdilutionsofcDNAsampleswereusedastemplatestogeneraterelativestandardcurves．Theregressionequation，determinationcoefficient(一)andPCRamplificationefficiency回werecalculatedandpresented．此次qPCR分析检测了如下样本的AmCYPl5A1基因表达情况：2龄(L2)、3龄(L3)、4龄(L4)、5龄(L5，进一步划分为进食期L5F、结茧期L5S和前蛹期L5PP)蜂王和工蜂幼虫，以及白眼蛹期(Pw)蜂王和工蜂个体，共14个样本点，分别代表了较为完整的蜂王和工蜂级型发育各不同阶段。从比较分析结果来看，总体上，AmCYPl5A1基因在蜂王和工蜂级型发育过程表达差异明显，且在蜂王中具有更高的表达水平(图4．4)；具体而言，在如下几个发育阶段，蜂王AmCYPl5A1较工蜂均显著高表达：L4(t=9．422，df=4，P0．99(图5．3)，表明该引物对满足实验要求。由于actin基因扩增引物对此前己得到验证并符合要求，故不再验证。棚图5．3AmFAMeTqPCR引物对检验。使用一系列8倍稀释的eDNA样品作为模板绘制相对标准曲线，并计算和列出了回归方程、决定系数(r2)与PCR扩增效率(E)。Fig．5．3TestsontheAmFAMeTqPCRprimerpair．Serial8xdilutionsofeDNAsampleswereusedastemplatestogeneraterelativestandardcurves．Theregressionequation，determinationcoefficient(一)andPCRamplificationefficiency④werecalculatedandpresented．随后，对如下蜜蜂样品进行4m尉胁丁基因表达qPCR定量分析：2龄(L2)、3龄(L3)、4龄(L4)、5龄(L5，进一步划分为进食期L5F、结茧期L5S和前蛹期L5PP)蜂王和工蜂幼虫，以及蜂王和工蜂白眼蛹期(Pw)个体，上述样本基本涵盖了蜂王和工蜂级型发育的完整过程。比较AmFAMeT基因在蜂王和工蜂相同胚后发育阶段的表达丰度可知，在多数情况下，二者AmFAMeT表达水平无显著差异，而只在2个时期差异表达：L4时期，工蜂AmFAMeT高表达(f=一4．286，df=4，P=0．013)；L5PP时期，蜂王高表达(户6．210，df=4，P=O．003)(图5．4)。在表达趋势来看，AmFAMeT在蜂王幼虫5龄末期一一L5PP期呈现表达峰值，随后表达丰度下降，但至Pw时仍维持较高的水平，而AmFAMeT的表达对工蜂发育过程无明显变化规律(图5．4)。∞扣Ⅲ奇p分!皇奎LLL MⅡ★{*±{＆mi女#*自女t#《☆m月*＆*目*f≈R#2A#＆aⅢ￡*de十*&4ⅢRDevelODmenlaIstage田5．4AmFAMeT基因在蜂王和工蜂级型发育过程的表达谱。率研究涵盖了从早期幼虫期至蛹期开始阶段的完整发育过程。具体包括2龄(L2)、3龄(L3)、4龄(L4)、5龄(L5)以匣白眼蛹期(Pw)．其中L5进‘步划分为进食期(L5F)、结茧期(L5S)和前蛹期(LSPP)。数值表示为均值±标准误抽；3)。统计学显著性差异用星号标出(独立样本f检验，+P<005，+‘P<001)。Fig5AAmFAMeTexpressionprofilesduringqueenandworkercnskdevelopment．Thestudycoveredearlylanaistagetoinitialpupalstage，uacludingthesecond(L2)，third(L3)，fourth(L4)，fiRh(L5)instarlarvaeandwhit}eyedpupae(Pw)TheL5w∞subdividedintothreestagesknownasthefeedingn89e(LSF)，spi∞ingstage(L5S)，andprepupalstage(LSPP)Valuesa”expressedasmcan±SEM“23)Statisticallysignific皿tdifferencesarcindicatedbyasterisks(independent-sampleptesg+P<005，¨P<0OI)5．3．4综合比较AmJHAMT，AmCYPl5A1及AmFAMeT的表达通过qPCR检测分析，先后获得了AmJHAMT．AmCYPl5AI及AmFAMeT等3个基因在蜂王以及工蜂级型发育过程各特定阶段的基因表达情况。分别对蜂王和工蜂发育过程，综合比较分析AraJHAMT、AmCYPl5A1及AmFAMeT基因表达cols*eQ×mo>；日DE 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究特征，结果表明：AmJHAMT在蜂王和工蜂发育过程中具有相近的表达趋势，在特定阶段先后出现两个表达峰值，同时在幼虫期与蛹期转变过程中，表达水平显著降低，上述特征与JH滴度变化过程基本相符：类似地，AmCYPl5A1在蜂王和工蜂发育过程中也呈现相近的表达趋势，在5龄前期(L5F)都出现表达峰值，且在幼虫．蛹变态过程表达丰度显著下降；相对的，AmFAMeT在蜂王和工蜂发育过程中表达趋势差别较大，同时，AmFAMeT在蜂王和工蜂个体变态过程中仍维持较高的表达丰度，这与JH滴度变化过程不相符(图5．5)。AWOrkerBL2L3L4L5FL5SL5PPPw1．2L3L‘L5FL5SLSPPPwDevelopmentalstage图5．5AmJHAMT，AmCYPl5A1及AmFAMeT在蜂王或工蜂级型发育过程的表达。发育阶段包括2龄(L2)、3龄(L3)、4龄(L4)、5龄(L5)以及白眼蛹期(Pw)，其中L5进一步划分为进食期(L5F)、结茧期(L5S)和前蛹期(L5PP)。实心黑色方块、红色圆及蓝色85432co一臻ed蔷雪口卫星柏∞col鹪巴dx口9^|Ie|∞《 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究三角分别指示AmdHAMT、AmCYPl5A1及AmFAMeT的表达丰度。数值表示为均值±标准误(n=3)。A)3个基因在工蜂发育过程中的表达情况，各基因在不同时期的表达水平均以L2阶段工蜂幼虫AmCYPISAl的△CT平均值为基准进行相对定量：B)3个基因在工蜂发育过程中的表达情况，各基因在不同时期的表达水平均以L2阶段蜂王幼虫AmCYPISAl的ACT平均值为基准进行相对定量。Fig．5．5TheexpressionofAmJHAMT,AmCYPl5A1，andAmFAMeTduringqueenorworkercastedevelopment．Thedevelopmentalstagesaleasfollows：thesecond皿2)，third(L3)，fourth(L4)，fifth皿5)instarlarvaeandwhite-eyedpupae(Pw)．TheL5Wassubdividedintothreestagesknownasthefeedingstage(L5F)，spinningstage(L5S)，andprepupalstage(L5PP)．Thesolidblackbox，redcircle,andbluetrianglerespectivelyindicatetheexpressionabundanceofAmJHAMEAmCYPl5A1，andAmFAMeT．Valuesareexpressedasmean4-SEM∽23)．A)Theexpressionofthesethreegenesduringworkerdevelopment．TheACTmeanofAmCYPl5A1inL2stageofworkerlarvaeissetasacalibratortocalculatetherelativeexpressionabundanceofallgenes．B)Theexpressionofthesethreegenesduringqueendevelopment．TheACTmeanofAmCYPl5A1inL2stageofqueenlarvaeissetasacalibratortocalculatetherelativeexpressionabundanceofallgenes．5．4讨论在甲壳动物中，MF是由颚器官(mandibularorgan，MO)分泌的，非环氧化JHIII类似物(Lauferetal．1987；Tobeetal．1989)。与JHIII在昆虫中的作用相似，MF调节甲壳动物的发育、生殖、蜕皮等生理过程(Nagaraju2007)。FAMeT参与甲壳动物MF终端合成过程——在SAM辅助下，FAMeT催化FA羧酸基团的甲基化，生成MF(Wainwrighteta1．1998)。从刀额新对虾Mensis中克隆和鉴定了首个FAMeT基因，该基因mRNA在多种组织中表达，但主要集中于神经系统(SilvaGunawardeneeta1．2001；SilvaGunawardeneeta1．2002)。体外放射化学分析表明，重组FAMeT能催化FA转变为MF(SilvaGunawardeneeta1．20021。随后，在甲壳动物中陆续克隆和鉴定多种FAMeT基因，同时，也有若干昆虫FAMeT基因研究报道出来(Holfordeta1．2004；Burtenshaweta1．2008；Huieta1．2008； 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄Vieiraeta1．2008；LiuetaL2010；Vanniniela1．2010b；Marchaleta1．20111。本研究首次克隆了西方蜜蜂A．mellifera潜在的FAMeT基因(AmFAMeT)，4m尉^庇rcDNA包含一个完整的长891bp的ORF，编码含296aa的蛋白。通过联合分析AmFAMeT与其他来自昆虫和甲壳动物的多个FAMeT基因相应编码蛋白的氨基酸序列，进一步分析与鉴定所得AmFAMeT基因。结果表明，AmFAMeT与昆虫FAMeT基因具有更高的一致性(>50％)，而与甲壳动物一致性较低(<50％)，可能的原因是：与甲壳动物相比，昆虫除了包含共有的Methyltansf．FA保守域之外，还有其他一些特有保守域，如DM9(smart00696)，DUF3421(pfamll901)(图5．1)。基于FAMeTs氨基酸序列构建的系统发生树，从进化角度显示了昆虫与甲壳动物的差异，二者基本形成两个独立的主进化枝，而例外的是，原本属于甲壳动物类别的水蚤D．pulex在进化树中位于甲壳动物和昆虫之间，但最终与昆虫种类聚集在一起，这说明水蚤可能是处于甲壳动物与昆虫之间的过渡型(图5．2)。目前在节肢动物中发现存在多种FAMeT亚型，如在与蜜蜂亲缘关系相近的无刺蜂Mscutellaris中有两种亚型，分别为MsFAMeT-1(CAM35481)和MsFAMeT-2(CAM35482)(Vieimeta1．2008)，这可能是不同进化机制产生的结果(Huieta1．2010)，不过本次研究并未在蜜蜂中发现类似的FAMeT亚型。鉴于FAMeT与MF合成的密切关系，推测AmFAMeT基因可能参与蜜蜂级型分化的调节。为了揭示与蜜蜂级型分化的关系，调查了AmFAMeT基因随蜂王与工蜂级型发育过程的表达谱。然而，在多数情况下，AmFAMeT在蜂王和工蜂中的表达水平无显著差异，AmFAMeT在蜂王和工蜂中的总体表达趋势也不同(图5．5)。结合m滴度变化过程分析，AmFAMeT基因表达与JH生物合成不具有相关性。因此，可推断AmFAMeT基因不参与蜜蜂级型分化的调节，也可能与蜜蜂体内JH合成无关。与此类似的情形同样发生在其他昆虫中，如：原核表达获得的果蝇D．melanogaster重组FAMeT单独或与CA提取物一起作用，都没有表现出任何体外催化活性；FAMeT基因缺陷突变体与野生型相比，MF,JHIII或JHbisepoxide的合成没有显著降低；同时，FAMeT对果蝇的生存和繁殖也不是必需的(BurtenshawetaL2008；Zhangeta1．2010)。尽管褐飞虱Ⅳlugens中FAMeT基因 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄(NlFAMeT)在CA中高表达，但朋撇丁mRNA转录与JH滴度没有相关性化iuetal．2010)。沙漠飞蝗&gregaria的FAMeT基因(SgFAMeT)除了在CA中高表达外，在神经系统多个部分都有显著表达；RNAi干扰SgFAMeT表达对JH释放并没有产生显著的抑制作用(Marehaleta1．2011)。综上所述，与甲壳动物不同，FAMeT基因可能不参与昆虫JH终端合成过程。因此，AmFAMeT基因与AmJHAMT及AmCYPl5A1基因不同，它并不直接参与蜜蜂JH合成以及级型分化调节。 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄第6章全文总结、创新点和后续研究展望6．1全文总结本研究从基因表达谱分析入手，借助基于高通量测序的DGE方法，分别从级型分化关键期的蜂王和工蜂幼虫DGE文库中检测到数百万的表达标签。差异表达分析表明，级型分化过程伴随着剧烈的基因差异表达，其中蜂王幼虫多上调代谢酶类基因，而工蜂幼虫基因仅有少数代谢酶类基因相对高表达。特别地，与保幼激素相关基因一_．7=黝MACYPl5A1及保幼激素诱导蛋白26基因，在蜂王幼虫中显著高表达。利用已获得的丰富的基因转录信息，从西方蜜蜂基因组中还预测得到9,258个新的候选基因，其中有3,566个候选基因被确定为黄金候选基因(Goldencandidategenes)，GO分析表明这些候选基因可能参与胚后发育，生殖发育等生理过程。基于Ⅲ的重要调控作用，以及现有表达谱分析结果，最终挑选出了3个与JH终端合成过程相关的酶基因——。瑰4^仃、CYPl5A1和FAMeT，进行深入研究。首先，成功克隆了西方蜜蜂的JHAMT基因——4棚。删^仃全长cDNA，以及包含完整OIlY的C冲J鲥卜一，4mCyP，鲥，和FAMeT基因_4m尉坛r。一系列序列分析表明，上述克隆所得基因均为蜜蜂中真实存在的相应的酶基因。进一步结合级型发育过程研究发现，在多数时期，尤其是级型发育关键窗口期，与工蜂幼虫相比，蜂王具有显著高的AmJHAMT和AmCYPl5A1mRNA表达水平，以及更高的AmJHAMT蛋白水平。同时，AmJHAMT和AmCYPl5A1的时序表达谱与保幼激素滴度变化过程表现出一致性。因此，AmdHAMT和AmCYPl5A1可通过影响小合成而调节蜜蜂级型分化。与上述两个基因不同，在蜂王和工蜂发育过程的多数时期，二者AmFAMeT基因表达水平无显著差异，且从表达趋势来看，AmFAMeTmRNA转录与JH合成过程无明显一致性。因此，AmFAMeT可能并不参与蜜蜂JH合成以及级型分化调节。此外，对于蜜蜂的m终端合成过程具体细节，根据已有文献报道和现有序列进化分析结果，可作出如下推断：AmJHAMT和AmCYPl5A1分别催化蜜蜂JH终端合成的酯化反应和环氧化反应，其中，ArnJHAMT是JH合成过程的 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究限速酶，而AmCYPl5A1则决定蜜蜂JH终端合成途径——与多数昆虫一样，蜜蜂中JH终端合成经历“先酯化后环氧化”的过程。6．2创新点(1)本研究首次采用基于高通量测序技术的DGE方法，检测分析了蜂王与工蜂级型发育表达谱，获得了许多重要的差异表达基因信息。同时根据获得的大量mRNA转录数据预测了西方蜜蜂基因组可能存在的新基因。(2)本研究首次系统克隆和鉴定了参与蜜蜂JH终端合成步骤的有关酶基因——4m。删册和AmCYPl5A1，以及另一个可能相关的酶基因AmFAMeT，并结合蜜蜂级型发育过程，分析了3个基因的功能。6．3后续研究展望(1)运用其他有效的基因功能研究手段，如RNAi等，进一步分析AmJHAMT和AmCYPl5A1在蜜蜂级型分化过程的功能：(2)运用生物化学方法研究AmJHAMT、AmCYPl5A1及AmFAMeT蛋白的体外催化活性，进一步明确它们的化学本质；(3)综合运用生物化学及基因功能研究方法，探索AmJHAMT和AmCYPl5A1在蜜蜂JH终端合成过程的具体作用，明确蜜蜂JH终端合成的实际途径。 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄参考文献‘tHoen，P．A．C．，Ariyurek，Y．，Thygesen，H．H．，ela1．Deepsequencing-basedexpressionanalysisshowsmajoradvancesinrobustness，resolutionandinter-labportabilityoverfivemicroarrayplatforms[J]．NucleicAcidsResearch，2008：gkn705．Adams，M．D．Cekniker,S．E．Holt，R．A．，ela1．ThegenomesequenceofDrosophilamelanogaster[J]．Science，2000，287(5461)：2185-2195．Altschul，S．F．，Gish，W．，Miller,、Ⅳ．，eta1．Basiclocalalignmentsearchtool[J]．JournalofMolecularBiology,1990．215(3)：403·410．Ando，T．，Fujiyuki，T．，Kawashima,T．，eta1．Inrivegenetransferintothehoneybeeusinganucleopolyhedrovirusvector[J]．BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2007，352(2)：335-340，Asencot．M．andLensky,Y111eeffectofsugarsandjuvenilehormoneonthedifferentiationofthefemalehoneybeelarvae(L-)toqueens[J]．L／feScience,1976，18(7)：693-699．Asencot，M．andLensky,Y-Theeffectofsolublesugarsinstoredroyaljellyonthedifferentiationoffemalehoneybee(ap／smelliferaL．)larvaetOqueens[J]．1nsectBiochemistry,1988，18(2)：12％133．Audic，S．andClaverie，J．M．Thesignificanceofdigitalgeneexpressionprofiles[J]．GenomeResearch，1997，7(10)：986-995．Barchuk，A．，Cristino，A．，Kucharski，R．，ela1．Moleculardeterminantsofcastedifferentiationinthehighlyeusocialhoneybee却括mellifera[J]．BMCDevelopmentalBiology,2007，7(1)：70，Barker,S．A．，Foster,A．B．，Lamb，D．C．，eta1．Biologicaloriginandconfigurationof10一hydroxy-2·decenoicacid[J]．Nature，1959，184(4686)：634—634．Bartel，D．P-MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction[J]．Cell,2004，116(2)：28卜297．Bartel，D．P．MicroRNAs：targetrecognitionandregulatoryfunctions[J]，Ce／／,2009，136(2)：215-233．Bellds，X．，Martin，D．，andPiulachs，M．D．Themevalonatepathwayandthesynthesisofjuvenilehormoneininsects[J]．AnnualReviewofEntomology，2005，50(1)：181—199．Benjamini，Y．andHochbcrg，YControllingthefalsediscoveryrate：apracticalandpowerfulapproachtomultipletesting[J]．JournaloftheRoyalStatisticalSocietySeriesB(Methodological)，1995，57(1)：289—300．Bird,A．DNAmethylationpatternsandepigeneticmemory[J]．Genes＆Development，2002，16(1)：6-21．Brogiolo，W．，Stocker,H．，Ikeya,T．，eta1．AnevolutionarilyconservedfunctionoftheDrosophilainsulinreceptorandinsulin-likepeptidesingrowthcontrol[J]．CurrentBiology,2001，1l(4)：213-221．Bryden，J．，Gill，R㈦JMitton，R．A．A．，eta1．nicsublethalstresscausesbeecolonyfailure[J]．EcologyLetters，2013，16(12)：1463-1469．Burtenshaw,S．M．，Su，P．E，Zhang,J．R．，eta1．AputativefamesoicacidO-methyltransferase(FAMeT)orthologueinDrosophilamelanogaster(CGl0527)：relationshiptOjuvenilehormonebiosynthesis[J]?Peptides，2008，29(2)：242·251． 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究Bustin，S．A．，Benes，、，．，Garson，J．A．，eta1．TheMIQEguidelines：minimuminformationforpublicationofquantitativereal-timePCRexperiments[J]．ClinicalChemistry,2009，55(4)：611．622．Capella,I．C．S．andHarffelder,K．JuvenilehormoneeffectonDNAsynthesisandapoptosisincaste。specificdifferentiationofthelarvalhoneybee(ApismelliferaL．)ovary[J]．JournalofInsectP协，iology,1998，44(5_6)：385-391．Chen，S．，Su，S．，andLin，X．AnintroductiontOhigh·yieldingroyaljellyproductionmethodsinChina[J]．BeeWorld,2002，83：69．77．Chen，X．，Hu，Y，Zheng，H．，eta1．Transcriptomecomparisonbetweenhoneybeequeen．andworker-destinedlarvae．InsectBiochemistryandMolecularBiology，2012，42(9)：665．673．Cloonan，N．，Forrest,A．R．R．，Kolle，Q，ela1．Stemcelltranscriptomeprofilingviamassive．scalemRNAsequencing[J]．NatureMethods，2008，5(7)：613．619．Cole，C．，Barber,J．D．，andBarton，GJ．TheJpred3secondarystructurepredictionserver[J]．NuckicAcidsResearch，2008，36(suppl2)：W197-W201．Daimon，T．，Kozaki，T．，Niwa，R．，eta1．Precociousmetamorphosisinthejuvenilehormone--deficientmutantofthesilkworm，Bombyxmori[J]．PLoSGenetics，2012，8(3)：e1002486．Daimon，T．andShinoda，T．Function，diversity,andapplicationofinsectjuvenilehormoneepoxidases(CYPl5)[J】．BiotechnologyandAppliedBiochemistry，2013，60(1)：82-91．Dawson，MarkA．andKouzarides，T．Cancerepigenetics：frommechanismtotherapy[J]．Ce／／,2012．150(1)：12·27．deAzcvedo，S．v．andHartfelder,K．Theinsulinsignalingpathwayinhoneybee(Apismellifera、castedevelopment--differentialexpressionofinsulin-likepeptidesandinsulinreceptorsinqueenandworkerlarvae[J]．JournaloflnsectPhysiology,2008，54(6)：1064-1071．Dearden，P．K．，Duncan，E⋯JandWilson，M．J．ThehoneybeeAp／smellifera[J]．co肠SpringHarborProtocols，2009，2009(6)：pdb．em0123．Dedej，S．，Hartfelder,K．，Aumeier,P．，eta1．CastedeterminationiSasequentialprocess：efrectoflarvalageatgraftingonovariolenumber,hindlegsizeandcephalicvolatilesinthehoneybee(Ap／smelliferacarnica)[J]．JournalofApiculturalResearch，1998，37(3)：183-190．Defelipe，L．A．，Dolghih，E．，Roitberg，A．E．eta1．Juvenilehormonesynthesis：‘‘esterifythenepoxidize”or“epoxidizethenesterify”?Insightsfromthestructuralcharacterizationofjuvenilehormoneacidmethyltransferase[J]．InsectBiochemistryandMolecularBiology，2011，41(4)：228-235．DiPrisco，G，Cavaliere，v．，Annoscia,D．，eta1．Neonieotinoidclothianidinadverselya仃jctsinsectimmunityandpromotesreplicationofaviralpathogeninhoneybees[J]．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2013，110(46)：18466-18471．Dietz,A．，Hermann，H．R．，andBlum，M．S．TheroleofexogenousJHI，mIIIandAnti—m(precoceneII)onqueeninductionof4．5一day—oldworkerhoneybeelarvae[J]．JournaloflnsectPhysiology,1979，25(6)：503·512．Dong，S．Z．，Ye，GY．，Guo，J．Y．，eta1．Rolesofecdyrsteroidandjuvenilehormoneinvitellogenesisinallendoparasiticwasp，Pteromaluspuparum(Hymenoptera：Pteromalidae)．GeneralandComparativeEndocrinology，2009，160(1)：l02-108．Edgar,B．A．Howfliesgettheirsize：geneticsmeetsphysiology[J]．NatureReviewGenetics，2006，7(12)：907-916．】00 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄Elango，N．，Hunt，B．G，Goodisman，M．A．D．，ela1．DNAmethylationiswidespreadandassociatedwithdifferentialgeneexpressionincastesofthehoneybee，Apismellifera[J]．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2009，106(271：11206-11211．Elsik，C．，Mackey,A．，Reese，J．，eta1．Creatingahoneybeeconsensusgeneset[J]．GenomeBiology，2007，8(1)：R13．Esquela-Kerscher,A．andSlack，F．J．Oncomks—microRNAswitharoleincancer[J]．NatureReviewCancer,2006，6(4)：259·269．Evans，J．D．andWheeler,D．E．Differentialgeneexpressionbetweendevelopingqueensandworkersinthehoneybee，却西mellifera[J]．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1999，96(10)：5575-5580．Evans．J．D。andWheeler,D．E．Expressionprofilesduringhoneybeecastedetermination[J]．GenomeBiology，2000，2(1)：research0001．0001-research0001．0006．Evans，JD．andWheeler,D．E．Geneexpressionandtheevolutionofinsectpolyphenisms[J]．Bioessays，2001，23：62—68．Feil，R．Environmentalandnutritionaleffectsontheepigeneticregulationofgenes[J]．MutationResearch／FundamentalandMolecularMechanismsofMutagenesis，2006，600(1-2)：46—57。Feyereisen，R．，Pratt，G．E．，andHamnett，A．EEnzymicsynthesisofjuvenilehormoneinlocustcorporaallata：EvidenceforamicrosomalcytochromeP-450linkedmethylfamesoateepoxidase[J]．EuropeanJournalofBiochemistry，1981，118(2)：231-238．Flatt，T．，Tu，M．E，andTatar,M．HormonalpleiotropyandthejuvenilehormoneregulationofDrosophiladevelopmentandlifehistory[J]．Bioessays，2005，27(10)：999·1010．Fluff，P．，Lnscher，M．，Wille，H．，eta1．Changesinweightofthepharyngealglandandhaemolymphtitresofjuvenilehormone，proteinandvitellogenininworkerhoneybees[J]．JournaloflnsectPhysiology，1982，28(1)：61-68．Foret，S．，Kucharski，R．，Pellegrini，M．，eta1．DNAmethylationdynamics，metabolicfluxes，genesplicing，andalternativephenotypesinhoneybees[J]．Proceedingso／theNationalAcademyofSciences，2012，109(131：4968-4973．G6tz，S．，Garcia-G6mez，J．M．，Terol，J．，甜口，．Hjgh·throughputfunctionalannotationanddataminingwiththeBlast2GOsuite[J]．NucleicAcidsResearch，2008，36(10)：3420—3435．Garofalo，R．S．GeneticanalysisofinsulinsignalinginDrosophila[J]．TrendsinEndocrinologyandMetabolism，2002，13(4)：156—162．Gasteiger,E．，Hoogland,C，，Gattiker,A．，ela1．ProteinidentificationandanalysistoolsontheExPASyServer[M]．inTheProteomicsProtocolsHandbook(ed．J．M．Walker)．HumanaPress，2005，PP．571-607．Gilbert，L．I．，A．Granger’N．，andRoe，R．M．Thejuvenilehormones：historicalfactsandspeculationsonfutureresearchdirections[J]．InsectBiochemistryandMolecularBiology，2000，30(8-9)：617-644．Goldberg,A．D．，Allis，C．D．，andBernstein，E．Epigenetics：alandscapetakesshape．Cell,2007，128(4)：635-638．Goodman．w：GandGranger"N．A．Thejuvenilehormones[M]．inComprehensiveMolecularlnsectScience(ed．I．QLawrence，I．Kostas，andS．GSarjeet)．Elsevier，Amsterd锄，2005，PP．319-408。Graham，S．E．andPeterson，J．A．HowsimilarareP450sandwhatCantheirdifferencesteach10I 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄us【J】?ArchivesofBiochemistryandBiophysics，1999，369(1)：24·29．Guidugli，K⋯RHepperle，C．，andHartfelder,K．Amemberoftheshort．chaindehydrogenase／reductase(SDR)superfamilyisatargetoftheeedysoneresponseinhoneybee(Apismellifera)castedevelopment[J]．Apidologie，2004，35(1)：37-47．Guo，X．，Su，S．，Skogerboe，Geta1．Recipeforabusybee：microRNAsinhoneybeecastedetermination[J]．PLoSOne，2013，8(12)：e81661．Hammock，B．D．NADPHdependentepoxidationofmethylfarnesoatetoiuvenilehormoneinthecockroachBlaberusgiganteusL．[J】．LifeSciences，1975，17(3)：323-328．Hartfelder,K．andEngels．W：Socialinsectpolymorphism：hormonalregulationofplasticityindevelopmentandreproductioninthehoneybee[M]．inCurrentTopicsinDevelopmentalBiology(ed．R．A．PedersenandG．ESchaRen)．AcademicPress，1998，PP．45-77．Hartfelder,K．andSteinbrOck．GGermcellclusterformationandcelldeatharealternativesincaste-specificdifferentiationofthelarvalhoneybeeovary[J]．InvertebrateReproduction＆Development,1997，3l(1)：237-250．Haydak，M．H．Honeybeenutrition．AnnualReviewofEntomology,1970，15(1)：143-156．He，P．，He，H．Z．，Dai，J．，eta1．Thehumanplasmaproteome：analysisofChineseserumusingshotgunstrategy[J]．Proteomics，2005，5(13)：3442-3453．Hegedus，Z．，Zakrzcwska,A．，Agoston，V．C．，eta1．Deepsequencingofthezebrafishtranscriptomeresponsetomycobacteriuminfection[J]．MolecularImmunology，2009，46(15)：2918-2930．Helvig，C．，Koener,J．F．，Unnithan，G．C．，eta1．CYPl5A1，thecytochromeP450thatcatalyzesepoxidationofmethylfarnesoatetojuvenilehormoneIIIincockroachcorporaallata[J]．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2004，101(12)：4024-4029．Henry,M．，Bdguin，M．，Requier’F．，eta1．Acommonpesticidedecreasesforagingsuccessandsurvivalinhoneybees．Science，2012，336(6079)：348-350．Holford,K．C．，Edwards，K．A．，Bendena，W．G，“a1．PurificationandcharacterizationofamandibularorganproteinfromtheAmeriCanlobster,Homarusamericanus：aputativefarnesoicacidO-methyltransferase．1nsectBiochemistryandMolecularBiology，2004，34(8)：785·798．Holt，R．A．Subramanian，GM．Halpem，A．，“a1．ThegenomesequenceofthemalariamosquitoAnophelesgambiae[J]．Science，2002，298(5591)：129-149．Hui，J．H．L．，Hayward,A．，Bendena,W．G，“a1．Evolutionandfunctionaldivergenceofenzymesinvolvedinsesquiterpenoidhormonebiosynthesisincrustaceansandinsects[J]．Peptides，2010，31(3)：451-455．Hui，J．H⋯LTobe，S．S．，andChan，S．M．CharacterizationoftheputativefarnesoicacidO-methyltransferase(LvFAMeT)eDNAfromwhiteshrimp，Litopenaeusvannamei：evidenceforitsroleinmolting[J]．Peptides，2008，29(2)：252·260．Hunter,S．，Apweiler,R．，Attwood,T．K．，eta1．InterPro：theintegrativeproteinsignaturedatabase[J]．NucleicAcidsResearch，2009，37(suppl1)：D21l-D215．Jaenisch,R．andBird，A．Epigeneticregulationofgeneexpression：howthegenomeintegratesintrinsicandenvironmentalsignals[J]．NatureGenetics，2003，33：245-254．Jones．D．T．Proteinsecondarystructurepredictionbasedonposition-specificscoringmatrices[J]．JournalofMolecularBiology,1999，292(2)：195-202．102 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研宄Jones，P．A．andBaylin，S．B．111efundamentalroleofepigeneticeventsincancer[J]．NatureReviewGenetfcs，2002，3(6)：415-428．Kagan，R．M．andClarke，S．WidespreadoccurrenceofthreesequencemotifsindiverseS-adenosylmethionine—dependentmethyltransferasessuggestsacornmonstructurefortheseenzymes[J]．ArchivesofBiochemistryandBiophysics，1994，3lO(2)：417-427．Kamakura,M．Signaltransductionmechanismleadingtoenhancedproliferationofprimaryculturedadultrathepatocytestreatedwithroyaljelly57一kDaprotein[J]．Journalo，Biochemistry,2002，132(6)：91l-919．Kamakura，M．Royalactininducesqueendifferentiationinhoneybees[J]．Nature，201l，473(7348)：478-483．Kamakura，M．，Fukuda,T．，Fukushima,M．，eta1．Storage-dependentdegradationof57·kDaproteininroyaljelly：apossiblemarkerforfreshness[J]．Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry,2001a,65(2)：277-284．Kamakura，M．，Suenobu，N．，andFukushima,M．Fifty-seven·kDaproteininroyaljellyenhancesproliferationofprimaryculturedrathepatocytesandincreasesalbuminproductionintheabsenceofserum[J]．BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2001b，282(4)：865-874．K叫oh，T．，Kaneko，Y．，Itoyama，K．，eta1．ControlofjuvenilehormonebiosynthesisinBombyxmori：cloningoftheenzymesinthemevalonatepathwayandassessmentoftheirdevelopmentalexpressioninthecorporaallata[J]．InsectBiochemistryandMolecularBiology，2007，37(8)：808-818．Kucharski，R．，Maleszka,J．，Foret，S．，eta1．NutritionalcontrolofreproductivestatusinhoneybeesviaDNAmethylation[J]．Science，2008，319：1827-1830．Kunert，N．，Marhold,J．，Stanke，J．“口，．ADnmt2-likeproteinmediatesDNAmethylationinDrosophila[J]．Development,2003，130(21)：5083-5090．Laemmli，U．K．CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbaeteriophageT4．Nature，1970，227(5259)：680-685．Larkin，M．A．，Blackshields，Ct，Brown，N．P．，eta1．ClustalWandClustalXversion2．O[J】．Bioinformatics，2007，23(21)：2947—2948．Laufer,H．，Borst，D．，Baker,F．C．，eta1．Identificationofajuvenilehormone-likecompoundinacrustacean[J]．Science,1987，235(4785)：202-205．Liu，S．，Zhang，C．，Yang，B．，eta1．CloningandcharacterizationofaputativefarnesoicacidO-methyltransferasegenefromthebrownplanthopper,Nilaparvatalugens[J]．JournaloflnsectScience，2010，10(103)：l—11．Livak,K．J．andSchmittgen，T．D．Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2-AACTmethod[J]．Methods，2001，25(4)：402-408．Lyko，F．，Ramsahoye，B．H．，andJaenisch，R．DNAmethylationinDrosophilamelanogaster[J]．Nature，2000，408(6812)：538—540．Mackert，A．，doNascimento，A．M．，Bitondi，M．M．G，ela1．Identificationofajuvenilehormoneesterase-likegeneinthehoneybee，ApismelliferaL．——expressionanalysisandfunctionalassays[J]．ComparativeBiochemistryandPhysiologyPartB：BiochemistryandMolecularBiology，2008，150(1)：33_44．Maleszka,R．Epigeneticintegrationofenvironmentalandgenomicsignalsinhoneybees：thecriticalinterplayofnutritional，brainandreproductivenetworks[J]．Epigenetics，2008，3(4)：103 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究188-192．Marchal，E．，Zhang，J．，Badisco，L．，eta1．Finalstepsinjuvenilehormonebiosynthesisinthedesertlocust，Schistocercagregaria[J]．InsectBiochemistryandMolecularBiology，2011，4l(4)：219-227．Marchler-Baner,A．，Lu，S．，Anderson，J．B．，eta1．CDD：aConservedDomainDatabaseforthefunctionalannotationofproteins[J]．NucleicAcidsResearch，201l，39(suppl1)：D225-D229．Martin,J．L．andMcMillan，F．M．SAM(dependent)IAM：theS-adenosylmethionine-dependentmethyltransferasefold[J]．CurrentOpinioninStructuralBiology,2002，12(6)：783-793．Matsumoto，TReductioninhomingflightsinthehoneybeeap／smelliferaaRerasublethaldoseofneonicotinoidinsecticides[J]．Bulletinoflnsectology，2013，66(1)：1-9．Mayoral，J．G，Nouzova，M．，Yoshiyama,M．，eta1．Molecularandfunctionalcharacterizationofajuvenilehormoneacidmethyltransferaseexpressedinthecorporaallataofmosquitoes[J]．InsectBiochemistryandMolecularBiology,2009，39(1)：31-37．Melampy,R．M．andWillis，E．R．Respiratorymetabolismduringlarvalandpupaldevelopmentofthefemalehoneybee㈨括mellificaL．)[J】．PhysiologicalZoology，1939，12(3)：302-311．Menzel，R．Searchingforthememorytraceinamini-brain，thehoneybee[J]．Learning＆Memory,2001，8(2)：53·62．Metzker,M．L．Sequencingtechnologies——thenextgeneration[J]．NatureReviewGenetics，2010，ll(1)：31．46．Michelette，E．R．D．andSoares，A．E．E．Characterizationofpreimaginaldevelopmentalstagesinafricanizedhoneybeeworkers04p括melliferaL．)【J】Apidologie，1993，24(4)：431-440．Minakuchi，c．，Namiki，T．，Yoshiyama,M．，etal，RNAi—medimedknockdownofjuvenilehormoneacid0-methyltransfcrasegenecausesprecociousmetamorphosisintheredflourbeetleIHboliumcastaneum[J]．FEBSJournal,2008，275(11)：2919·2931．Morozova，0．andMarra，M．A．Applicationsofnext-generationsequencingtechnologiesinfunctionalgenomics[J]．Genomics，2008，92(5)：255-264．Morrissy,A．S．，Morin，R．D．，Delaney,A．eta1．Next-generationtagsequencingforcancergeneexpressionprofiling[J]．GenomeResearch，2009，19(10)：1825·1835．Mutti，N．S．，Dolezal，A．G，Wolschin，F．，eta1．IRSandTORnutrient-signalingpathwaysactviajuvenilehormonetoinfluencehoneybeecastefate[J]．TheJournalofExperimentalBiology,2011，214(23)：3977·3984．Nagaraju,G．RC．Ismethylfarnesoateacrustaceanhormone?Aquaculture，2007，272(1-4)：39．54．Niwa,R．，Niimi，T．，Honda，N．eta1．JuvenilehormoneacidO-methyltransferaseinDrosophilamelanogaster[J]．1nsectBiochemistryandMolecularBiology,2008，38(7)：714·720．Old．ham，S．andHafen，E．Insulin／IGFandtargetofrapamycinsignaling：aTORdeforceingrowthcontrol[J]．TrendsinCellBiology,2003，13(2)：79-85．Page，R．E．andPeng，C．Y．S．Aginganddevelopmentinsocialinsectswithemphasisonthehoneybee，ap／smelliferaL．[J】．ExperimentalGerontology,2001，36(4-6)：695-711．Patel，A．，Fondrk,M．K．，Kaftanoglu，0．，eta1．Themakingofaqueen：TORpathwayisakeyplayerindipheniccastedevelopment[J]．PLoSONE,2007，2(6)：e509．Petersen，T．N．，Branak,S．，yonHeUne，G，eta1．SignalP4．O：discriminatingsignalpeptidesfromtransmembraneregions[J]．NatureMethods，201l，800)：785-786．104 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究Pinto，L．Z．，Hartfelder,K．，Bitondi，M．M．G，eta1．Ecdysteroidtitersinpupaeofhighlysocialbeesrelatetodistinctmodesofcastedevelopment[J]．JournalofInsectPhysiology,2002，48(8)：783·790．Rachinsky,A．andFeldlaufer,M．F．Responsivenessofhoneybee(ApismelliferaL．、corporaallatatoallatoregulatorypeptidesfromfourinsectspecies[J]．JournaloflnsectPhysiology，2000，46(1)：41-46．Rachinsky,A．，Strambi，C．，Strarnbi，A．eta1．Casteandmetamorphosis：hemolymphtitersofjuvenilehormoneandecdysteroidsinlastinstarhoneybeelarvae[J]．GeneralandComparativeEndocrinology，1990，79(1)：31-38．Rachinsky,A．，Tobe，S⋯SandFeldlaufer,M．F．TerminalstepsinJHbiosynthesisinthehoneybee(ApismelliferaL．)：developmentalchangesinsensitivitytoJI-Iprecursorandallatotropin[J]．InsectBiochemistryandMolecularBiology，2000，30(8-9)：729-737．Rassoulzadegan，M．，Grandjean，V，Gotmon，E，eta1．RNA-mediatednon-mendelianinheritanceofanepigeneticchangeinthemouse[J]．Nature，2006，441(7092)：469-474．Ratnieks，F．L．W．andCarreck，N．L．ClarityonHoneyBeeCollapse[J]?Science，2010，327(5962)：l52．153．Rembold，H．，Czoppeh，C．，Grane，M．eta1．，ed．Juvenilehormonetitersduringhoneybeeembryogenesisandmetamorphosis[M]．inInsectJuvenileHormoneResearch(ed．B．Mauchamp，E．Couillaud，andJ．C．Baehr)．InstituteNmionaldelaRechercheAgronomique，Paris，1992，PP．37-43．Rembold,H．，Czoppelt,C．，andRao，P．J．Effectofjuvenilehormonetreatmentoncastedifferentiationinthehoneybee，和妇mellifera[J]．JournalofInsectPhysiology，1974a’20(7)：1193-1202．Remboid，H．，Lackner,B．，andGeistbeck，I．Thechemicalbasisofhoneybee，却西mellifera，casteformation．Partialpurificationofqueenbeedeterminatorfi"omroyaljelly[J]．JournalofInsectPhysiology,1974b，20(2)：307-314．Riddiford．L．M．CellularandMolecularActionsofJuvenileHormoneI．GeneralConsiderationsandPremetamorphicActions[M]．inAdvancesinlnsectPhysiology(ed．P．D．Evans)．AcademicPress，1994，PP．213·274一Robinson，CtE．Regulationofdivisionoflaborininsectsocieties[J]．AnnualReviewofEntomology,1992，37(1)：637-665．Robinson，G．E．，Page，R．E．，Strambi，C．，ela1．Hormonalandgeneticcontrolofbehavioralintegrationinhoneybeecolonies[J]．Science，1989，246(4926)：109·112．Rost，B．，Yachdav’G，andLiu，J．ThePredictProteinserver[J]．NucleicAcidsResearch，2004，32(suppl21：W321-W326．Schaefer,M．andLyko，F．DNAmethylationwithasting：anactiveDNAmethylationsysteminthehoneybee[J]．Bioessays，2007，29(3)：208—211．Schulte，C．，Leboulle，G，Otte，M．，eta1．Honeybeepromotersequencesfortargetedgeneexpression[J]．1nsectMolecularBiology，2013，22(4)：399·410．Sheng，Z．，Ma,L．，Can，M．-X．eta1．JuvenilehormoneacidmethyltransferaseisakeyregulatoryenzymeforjuvenilehormonesynthesisintheErisilkworm，Samiacynthicaricini[J]．ArchivesoflnsectBiochemistryandPhysiology，2008，69(3)：143·154．Shi，Y．，Yan，w．，Huang，Z．，eta1．Genomewideanalysisindicatesthatqueenlarvaehavelowermethylationlevelsinthehoneybee(Apismellifera)【J】．Naturwissenschafien，2013，100(2)：105 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究193-19’7．Shi，YY，Huang，Z．Y-，Zeng，Z．J．，“a1．Dietandcellsizebothaffectqueen—workerdifferentiationthrou【ghDNAMethylationinhoneybees(Apismellifera，Apidae)【J】．PLoSONE,2011，6(4)：e18808．Shi，Y．Y，Wu,X．B．，Huang，Z．Y．，eta1．Epigeneticmodificationofgeneexpressioninhoneybeesbyheterospecificglandsecretions[J]．PLoSONE,2012，7(8)：e43727．Shinoda，T．andItoyama，K．Juvenilehormoneacidmethyltransferase：akeyregulatoryenzymeforinsectmetamorphosis[J]．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2003，100(21)：11986·11991．Shuel，R．andDixon，S．neearlyestablishmentofdimorphisminthefemalehoneybee，却豇melliferaL．【J]．InsectesSociaux，1960，7(3)：265-282．SilvaGunawardene，Y．I．N．，Chow,B．K⋯CHe，J．Ct，eta1．TheshrimpFAMeTcDNAiSencodedforaputativeenzymeinvolvedinthemethylfarnesoate(ME)biosyntheticpathwayandistemporallyexpressedintheeyestalkofdifferentsexes[J]．InsectBiochemistryandMolecularBiology,2001，31(11)：1115-1124．SilvaGunawardene，Y．I．N．，Tbbe，S．S．，Bendena,W．G，eta1．Functionandcellular10calizationoffamesoicacidO·methyltransferase(FAMeT)intheshrimp，Metapenaeusensis[J]．EuropeanJournalofBiochemistry,2002，269(t4)：3587-3595．Soulard,A．，Cohen，A．，andHall，M．N．TORsignalingininvertebrates[J]．CurrentOpinioninCellBiology，2009，21(6)：825-836．Spannhoif,A．，Kim，Y．K．，Raynal，N．J．M．，eta1．Histonedeacetylaseinhibitoractivityinroyaljellymightfacilitatecasteswitchinginbees[J]．EMBOReports，201l，12(3)：238-243．Stay,B．Areviewoftheroleofneurosecretioninthecontrolofjuvenilehormonesynthesis：atributetoBertaScharrer[J]．InsectBiochemistryandMolecularBiology，2000，30(s-9)：653．662．Stay,B．，Tobe，S．S．，andBendena,W．GAUatostatins：identification，primarystructures，functionsanddistribution[J]．AdvancesinInsectPhysiology,1994，25：267·337．Stay,B．andWoodhead,A．Neuropeprideregulatorsofinsectcorporaallata[J]．AmericanZoology，1993，33(3)：357-364．Tamura,K．，Dudley,J．，Nei，M．，eta1．MEGA4：molecularevolutionarygeneticsanalysis(MEGA)softwareversion4．0[J】．MolecularBiologyandEvolution，2007，24(8)：1596．1599．111eHoneybeeGenomeSequencingConsortium．InsightsintosocialinsectsfromthegenomeofthehoneybeeApismellifera[J]．Nature，2006，443(7114)：931-949．Tobe，S．S．andStay,B．Structureandregulationofthecorpusallatum[M]．AcademicPress，1985．Tobe，S．S．，Young，D．A．，Khoo，H．W．，eta1．Farnesoicacidasamajorproductofreleasefromcrustaceanmandibularorgansinvitro[J]．JournalofExperimentalZoology，1989，249(2)：165-171．Vannini，L．，Ciolfi⋯SDatlai，R．，ela1．Putative-famesoicacidO-methyltransferase(FAMeT)inmedflyreproduction[J]．ArchivesofInsectBiochem括tryandPhysiology,2010a，75(2)：92．106．Vannini，L．，Ciolfi，S．，Spinsanti，G，ela1．111eputative-famesoicacidO-methyltransferase(FAMeT)geneofCeratitiscapitata：characterizationandpre-imaginallifeexpression[J]．106 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究ArchivesofInsectBiochemistryandPhysiology，2010b，73(2)：106-117．Vercelli，D．Genetics，epigenetics，andtheenvironment：switching,buffeting，releasing[J]．JournalofAllergyandClinicalImmunology，2004，1130)：381-386．Vieira，C．U．，BoneaLA．M．，Sim6es，Z．L．P．，eta1．FamesoicacidO-methylU"ansferase(FAMeT)isoforms：conservedtraitsandgeneexpressionpatternsrelatedtocastedifferentiationinthestinglessbee，Meliponascutellaris[J]．ArchivesofInsectBiochemistryandPhysiology,2008，67(2)：97-106．Wainwright，Q，Webster"S．G，andRees，H．H．Neuropeptideregulationofbiosynthesisofthejuvenoid，methylfarnesoate，intheediblecrab，Cancerpagurus[J]．BiochemicalJournal，1998，334(3)：651—657．Wang，Y．，Jorda,M．，Jones，P．L．，甜a1．FunctionalCpGmethylationsysteminasocialinsect[J]．Science，2006，314(5799)：645·647．Weaver"N．Rearingofhoneybeelarvae011royaljellyinthelaboratory[J]．Science，1955，121(3145)：509·510．Weaver,N．Physiologyofcastedetermination[J]．AnnualReviewofEntomology,1966，1l(1)：79．102．Werck—Reichhart，D．andFeyereisen，R．CytochromesP450：asncc．七SSstory[J]．GenomeBiology，2000，1(6)：reviews3003．3001-reviews3003．3009．Wheeler,D．E．，Buck,N．，andEvans，J．D．Expressionofinsulinpathwaygenesduringtheperiodofcastedeterminationinthehoneybee，Apismellifera[J]．1nsectMolecularBiology，2006，15(5)：597-602．Whitehorn，ER．，O’Connor,S．，Wackers，F．L．，甜a1．Neonicotinoidpesticidereducesbumblebeecolonygrowthandqueenproduction[J]．Science，2012，336(6079)：351-352．Wigglesworth，V．B．Thephisiologyofinsectmetamorphosis[M]．CambridgeUniversityPress，1954．Williamson，M．，Lenz，C．，Winther,A．M．E．eta1．Molecularcloning，genomicorganization，andexpressionofaC-type(manducasexta-type)allatostatinpreprohormonefromDrosophilamelanogaster[J]．BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2001，282(1)：124—130．Wilson，E．O．Theinsectsocieties[M]．BelknapMarvardUniv．Press，Cambridge，MA，1971．Wilson，E．O．Thesociogenesisofinsectcolonies[J]．Science，1985，228(4707)：1489-1495．Wirtz,EandBeetsma，J．Inductionofcastedifferentiationinthehoneybeeby{uvenilehormone[J]．EntomologiaExperimentalisetApplicata，1972，15(4)：517—520．Wolschin，F．，Mutti，N．S．，andAmdam，GVInsulinreceptorsubs仃ateinfluencesfemalecastedevelopmentinhoneybees[J】．BiologyLetters，2011，7(1)：112-l15．Wyatt，G．R．andDavey,K．GCellularandMolecularactionsofjuvenilehormoneII．rolesofjuvenilehormoneinadultinsects[M]．inAdvancesinInsectPhysiology(ed．P．D．Evans)．AcademicPress，1996，PP．1-155．Xia，Q．，Zhou，Z．，Lu，C．，eta1．Adraftsequenceforthegenomeofthedomesticatedsilkworm(Bombyxmori)【J】．Science，2004，306(5703)：1937·1940．Yagi，K．J．，Konz，K．G，Stay,B．，eta1．ProductionandutilizationoffarnesoicacidinthejuvenilehormonebiosyntheticpathwaybycorporaallataoflarvalDiplopterapunctata[J]．GeneralandComparativeEndocrinology，1991，81(2)：284-294．Zhang，H．，Tian，L．，"lobe，S．，eta1．DrosophilaCGl0527mutantsareresistanttOjuvenile107 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究hormoneanditsanalogmethoprene[J]．BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，2010，401(2)：182-187．陈盛禄．中国蜜蜂学【M】．北京：中国农业出版社，2001．嵇保中，刘曙雯，田铃，等．保幼激素生物合成研究进展【J]．兰绷f喾2007，19(1)：90．96．李胜，蒋容静，和曹梅讯．保幼激素的代谢[J】．层尘学援2004，47(3)：389．393．刘芳．意蜂哺育蜂与采集蜂头部mRNAs与miRNAs表达谱Solexa测序比较分析及其调控网络研究[D]．杭州：浙江大学，2012．刘艳，胜振涛，蒋容静，等．保幼激素合成的研究进展【J】．昌盛学菝，2007，50(12)：1285．1292．刘影，胜振涛，和李胜．保幼激素的分子作用机制川．屠盈学戒2008，51(9)：974．978．石元元，曾志将，吴小波，等．人工注射Dnmt3siRNA对意大利蜜蜂雌蜂发育的影响[J】．屠篮学撼2011，54(3)：272．278．颜伟玉，许标，谢宪兵，等．化学放射法测定蜜蜂保幼激素酯酶活性【J】．扛西名e咝力描等掘2004，26(5)：785-786曾志将．蜜蜂生物学[M】．北京：中国农业出版社，2007．周冰峰，鲍秀良，龚蜜，等．保幼激素类似物ZR512对蜜蜂蜂王初生重的影响[J】．瘤罄衣也力学蝴：1995a"24(1)：109．112．周冰峰，龚蜜，鲍秀良，等．保幼激素类似物ZR512对蜜蜂蜂王胚后发育的调控作用【J】．杀亨罄农比力学学援1995b，24(2)：227．230．周冰峰，张淑娟，周碧青，等．保幼激素类似物ZR-512对蜂王生殖系统发育和生理的影响【J]．乒留步麓螭2002，53(1)：6-8． 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究附录i|iiil}l¨i。jijIj。m附图2．1不同长度的序列获得注释的百分比SupplementaryFig．2．1Annotationpercentageofsequenceswithdifferentlength．109 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼澈素终端合成相关酶基因分子克睦、鉴定及其在级型发育过程中的表达研咒附图2．2候选基因富集的代谢通路IlO 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过控中的表达研究续附图2．2 塑兰查兰堕圭兰些堡苎壅丝堡竺塑茎竺塑鱼壁塑苎堕苎里坌王塞堕：兰壅墨苎童丝翌茎曼垫望!竺耋些里塞续附图2．2112 续附图2．2113 浙江大学博士学位论文蜜蛙保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究续附图2．2燃％k要：器回q啦、一臣；：．·盘五亘阍巍；‘蓄挚手二蕊，，i1节去王壹辣彗唑匣·匝。．_I■一。．一——。!，’。’”訾I冒r3。．1l；J一砷，；‘1璺违兰一。吖型—o商二——一鞋．．濠、蔡涵4_"¨-旦雹～&-’一_--点：亡冀、-§争⋯·A一三：I．上lI‘目。：j甲二’=一氢卞一’I一。二、t‘!皇矍．’⋯i0i仁盯●⋯，·盥￡一。：．哪，!，，l“_cT审_^""，n-Tc_I①f、Ok●一一114 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究博士期间发表的论文Li，W，Huang，zY,Liu，F，Li，Z，Yan，L，Zhang，S，Chen，S，Zhong，BandSu，S(2013)MolecularCloningandCharacterizationofJuvenileHormoneAcidMethyltransferaseintheHoneyBee，Ap／smellifera，andItsDifferentialExpressionduringCasteDifferentiation．PLoSONE8：e68544．Guo，X，Su，S，Skogerboe，GDai，S，Li，W，Li，Z，Liu，F"Ni，R，Guo，YChen，S，Zhang，SandChen，R(2013)RecipeforaBusyBee：MicroRNAsinHoneyBeeCasteDetermination．PLoSONE8：e81661．Li，Z，Chen，YZhang，S，Chen，S，Li，W，Yan，L，Shi，L，Wu，L，Sohr，AandSu，S(2013)ViralInfectionAffectsSucroseResponsivenessandHomingAbilityofForagerHoneyBees，和妇melliferaL．PLoSONE8：e77354．Li，L，Liu，F，Li，W，Li，Z，Pan，J，Yan，L，Zhang，S，Huang，ZYandSu，S(2012)DifferencesinmicroRNAsandtheirexpressionsbetweenforaginganddancinghoneybees，ApismelliferaL．JoumalofInsectPhysiology58：1438-1443．Li，Z，Liu，F，Li，W，Zhang，S，Niu，D，Xu，H，Hong，Q，Chen，SandSu，S(2012b)Differentialtranscriptomeprofilesofheadsfromforagers：comparisonbetweenApismelliferaligusticaandApisceranacerana．Apidologie43：487-500．Liu，F，Li，w，Li，Z，Zhang，S，Chen，SandSu，S(2011)High-abundancemRNAsinApismellifera：Comparisonbetweennursesandforagers．JournalofInsectPhysiology57：274-279．Liu，F，Peng，W，Li，Z，Li，W，Li，L，Pan，J，Zhang，S，Miao，YChen，SandSu，S(2012)Next-generationsmallRNAsequencingformicroRNAsprofilinginApismellifera：comparisonbetweennursesandforagers．InsectMolecularBiology21：297．303．李文峰，钟伯雄，苏松坤(2014)蜜蜂级型分化机理．昆虫学报57：248．256．李莉，刘芳，李文峰，苏松坤．(2012)蜜蜂采集及其信息传递的行为机制研究进展．应用昆虫学报49(6)：1710．1718．刘芳，李志国，李文峰，苏松坤．(2011)RNAi技术在蜂学研究中的应用．应用昆虫学报48(2)：417_420．李文峰，李志国，刘芳，苏松坤．(2010)蜜蜂级型分化相关生理因子研究进展．昆虫知识47：856．861．115 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素搀端合成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究国际交流及会议1)第43届国际养蜂大会(Apimondia)，2013年9月29日至10月4目，乌克兰基辅。本人论文：Juvenilehormoneacidmethyltransferaseinthehoneybee，Ap／smellifera。口头报告。2)第七届国际认知科学大会(ICCS2010)，2010年8月17日至8月20日，中国北京本人论文：Deepsequencing—basedtranscriptomiccomparisonbetweenforagersanddancerofhoneybees(ApismelliferaL．)116 浙江大学博士学位论文蜜蜂保幼激素终端台成相关酶基因分子克隆、鉴定及其在级型发育过程中的表达研究致谢依稀还记得刚来浙大读研时的情景，一切都感觉那么新鲜——新的环境，新的阶段，新的机遇和挑战⋯⋯难掩内心的激动和对未来的遐想，就这样我开始了我的研究生生涯。转眼间，五年光阴如流水般从指尖悄然滑过，却把一段深刻的烙印牢牢地打在了我的脑海里，它承载着我奋斗的青春和艰辛的成长。如今，我己经圆满完成了我的学业，在即将告别之际，我选择小心地把这一切封存在记忆的海底，作为我终身的财富。对于在浙大求学的五年，我首先需要感谢的是我的导师苏松坤教授。这五年，准确地说是自本科实习和毕业设计起，无论是学习和科研，还是生活和家庭方面，我都得到了苏老师悉心的指导和教诲，以及无微不至的关怀和帮助。苏老师朴实勤俭、平易近入、治学严谨、敬业奉献，这些优良的精神品质使我耳濡目染，受益终身，我希望在今后的人生道路上以导师为榜样，勤奋工作，刻苦钻研，以优异的成绩奉献社会和人民。我还需要感谢我的另一位导师钟伯雄教授，他以深厚的学术造诣和严谨的工作作风深深影响了我：同时，在我的科研实践中也得到钟老师给予的许多指导和帮助，谢谢钟老师!衷心感谢浙江大学动物科学学院领导及工作人员、陈盛禄教授、胡福良教授、郑火青副教授等在我研究生学习期间给予的大力支持和帮助!衷心感谢澳大利亚国立大学张少吾教授、美国密歇根州立大学黄智勇教授给予我学习和科研上的指导和帮助!感谢陈勤师母在后勤和生活上的关心与照顾。本论文能顺利完成离不开身边许多同学、朋友的大力支持和热心帮助。感谢刘芳、李志国、晏励民、李莉、潘娇、胡云娟、戴双进等实验室成员的无私相助。感谢魏文挺、牛德芳、程昌勇、王凯等同学、好友对我支持和帮助。特别感谢父、母亲多年来的养育之恩和默默的支持；感谢姐姐、姐夫等家人、亲戚朋友的支持和帮助；尤其感谢我的妻子苏小晶的一路陪伴和精心照顾!最后，再次感谢所有关心和帮助过我的人，谢谢你们!