陆地棉和毛棉种间ssr遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位 81页

CONSTRUCTIONOFLINKAGEMAPBASEDONSSRM睑RKERSANDLOCALIZATIONOFTRICHOMEANDNECTARYTRAITSININTERSPECIFICF2POPULATIONOF(G月!=凇【刀Y7=ML×GZ℃砸Ⅳ2US之胁夕NUTTEXSEEM)byHouMeiying_一AThesisSubmittedtoNanjingAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheMasterDegreeSupervisedbyProf．ZhouBaoliangDepartmentofGeneticsandCropBreedingNanjingAgriculturalUniversityNanjing210095，P．R．ChinaJune2012 原创性声明mm舢咖圳Ⅲ啪ⅢⅢ0舢删Y2360454本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：傻么反≯r2年莎月-方日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后使用本授权书。本学位论文属于不保密口。(请在以上方框内打“√’’)学位论文作者(需亲笔)签名：谈夏袭如协年6月刁日导师签名：沙p年‘月r8日 目录摘要目录主要缩略词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。第一部分文献综述第一章四倍体棉花的研究进展I11四倍体棉花起源和应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12毛棉的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2第二章棉花分子遗传图谱的构建⋯。51遗传图谱分子标记的类型及其应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．1RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。61．2RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．3SSR(SimpleSequenceRepeat)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．4AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82遗传图谱的作图群体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．1非固定性分离群体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2永久性分离群体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯103棉花遗传图谱的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．103．1海陆种间遗传图谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。113．2陆地棉种内遗传图谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．123．3陆地棉和毛棉种间遗传图谱的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．133．4整合遗传图谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯134偏分离位点产生的机制及分布特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯165毛棉有关性状的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．175．1叶片茸毛的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．175．2蜜腺的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18本研究的目的和意义⋯⋯⋯．第二部分研究报告⋯⋯2021第三章陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．221．1供试材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．221．2供试引物及其来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22 陆地棉和毛棉种间ssR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位1．3多态位点的命名⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1作图群体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．2表型性状调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。232．3棉花基因组DNA的提取方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．4SSR分子标记分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．5数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．263结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．273．1性状在F2分离群体中的变异⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．2多态性引物筛选和群体分子标记基因型的分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．273．3定位到棉花基因组上标记及图谱特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．293．4与高密度遗传图谱比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．353．5与第一张陆地棉和毛棉种间遗传图谱比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．363．6形态标记的定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．7未定位到棉花相应染色体上的标记及图谱特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．50zl讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．!；：14．1作图亲本和群体的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．524．2作图标记类型的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．524．3标记偏分离现象及其应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．544．4叶表茸毛和蜜腺基因的定位⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．55本文结论及创新点参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．致谢．．5759 摘要陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位摘要近年来，尽管棉花分子育种在世界各国都取得了巨大成就，但与育种需求仍存在较大差距，尤其是遗传基础狭窄已经成为目前限制栽培种陆地棉遗传改良的主要因素。在生产上则表现为栽培棉花品种的遗传同质性日益严重，品种对不良自然环境忍耐性日益脆弱，为了探究拓宽棉花遗传基础，提高棉花的遗传多样性以提高棉花品种的产量、品质、抗逆性等，广泛利用能被棉花育种利用的棉属野生种，开展远缘杂交研究变得显为重要。毛棉是四倍体野生种，具有多毛、无蜜腺等抗虫性状，以及抗旱、纤维品质优良等性状。为了有效发掘和利用毛棉优异基因资源，将毛棉的优良基因向陆地棉高效转移，本研究开展了利用分子标记技术构建以PCR为基础的陆地棉与毛棉种间SSR分子标记遗传图谱，并进行了毛棉重要性状的基因定位。利用高产品系陆地棉08N2162与毛棉杂交，Fl自交，得到了包含93个单株的F2群体，利用该F2群体开展分子遗传图谱的构建，并与高密度海陆种间遗传图谱进行比较，探讨了不同棉种间的染色体组分化。对茸毛基因(T1)和蜜腺基因(Nel)进行了定位。结果如下：1．棉花种间F2群体SSR标记遗传连锁图谱的构建利用8488对SSR引物进行亲本多态性筛选，获得亲本间存在多态性的引物1347对，将其用于F2群体扩增，共产生了1800个多态SSR位点。5108对eSSR引物中，有807对引物在亲本间表现多态，扩增产生1045个多态位点，多态率为15．8％；3380对gSSR引物中，有540对引物在亲本间表现多态，扩增产生755个多态位点，多态率为16．0％。在1800个多态SSR位点中，双亲共显性位点682个，陆地棉显性位点458个，毛棉显性位点660个。用作图软件Joinmap3．0进行分子标记的连锁遗传分析，以LOD值>--4，构建了遗传图谱，1312个标记位点包括2个形态标记进入定位到棉花基因组26条染色体，46个连锁群，图谱全长3752．3cM，标记间的平均遗传距离为2．86cM；另有26个标记建立了12个短连锁群，不能确定定位到棉花具体染色体上；其余464个标记没有进入任何连锁群。在所有定位到棉花基因组26条染色体的位点中，At亚组有620个位点，全长为1888．9cM，标记间的平均遗传距离为3．05cM；Dt亚组有692个位点，全长为1863．4cM， 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位标记间的平均遗传距离为2．69cM。A5染色体含的标记位点最多，有91个，A7最少，有30个标记位点；A6覆盖的遗传距离最大，为224．8cM，A4覆盖的遗传距离最小，为90．1cM。所有多态性标记中有506个标记表现偏分离，占总标记数的28．1％；其中255个(14．1％)偏分离标记被定位到棉花己知染色体上，偏分离热点区域(SDR)有24个，偏分离标记位点在A、D染色体亚组间分布很不均匀，At亚组上的偏分离标记位点数(89)和SDR数(7)明显少于Dt亚组上的偏分离标记位点数(166)和SDR数(17)。5个偏分离位点定位到12个短连锁群上。2．与高密度海陆种间遗传图谱比较通过将本研究所构建的陆地棉和毛棉种间遗传连锁图谱与高密度海陆种间遗传图谱(Guoeta1．，2008)进行比较，我们发现了442个同源标记位点，204个分布在At亚组，238个分布在Dt亚组，相应染色体的大部分同源位点存在共线性，两图谱都发现A亚组存在两个相互易位，涉及A2／A3和A4／A5四条染色体。本研究所构建图谱的偏分离标记所占比率较高，除A13外，其余所有的染色体都有分布，D5上最多，有21个偏分离位点；而海陆种间遗传图谱上的偏分离位点只分布在少数染色体上，大多集中在A7和D7两个同源染色体上。3．棉花叶表茸毛争蜜腺基因的定位利用构建的陆地棉和毛棉种问遗传图谱，将叶表茸毛基因定位在A6染色体上，离最近的标记NAU2417-400的遗传距离为0．49cM；蜜腺基因定位在D12染色体上，离最近的标记NAU3897．160的遗传距离为0．39cM。关键词：毛棉；SSR；遗传连锁图；叶表茸毛；蜜腺；定位II CONSTRUCTIONOFLINKAGEMAPBASEDONSSRMARKERsANDLOCALI乙蛆IONOFT砒CHOMEANDNECTARYTI乙UTSININTERSPECIFICF2POPULATIONOF(G月吣彤?聊L×GTOMENTOSUMNUTTEXSEEM)ABSTRACTInrecentyears，therehasstillbeenawidegapbetweencottonmolecularresearchanditsdemandforbreeding，despitecottonmolecularbreedinghasmadegreatachievements．IntraspecificnarrowgeneticbasehasbecomeamainproblemforgeneticimprovementofGossypiumhirsutumespecially,leadingtothehighgeneticuniformityaccompanyingthegeneticvulnerabilitytoadversenaturalconditions．Tobroadencottongeneticbaseandincreasegeneticdiversitytocontinuouslyimprovecottonyield，fiberquality,resistancetobioticstressandtolerancetoabioticstress，wideutilizationofwildspeciesfordistanthybridizationmaybeofimportanceincottonbreeding．Gtomentosum，atetraploidspecies．possessesmanydesirabletraits，suchasmorphologicalresistancetoinsectpest(heavyleafhairandnectarlessleaf)，droughttoleranceandfiberquality．ToeffectivelydiscoverandutilizemorefavorablegenesfromGtomentosumintrogressintoGhirsutumbackground．thelinkagemapbasedonSSRmarkersWasconstructedfirstlyandimportantuniquetraitsfromGtomentosumweremapped．Inthisstudy,apopulationof93F2individualsWasdevelopedbysingleseeddescendedfromthecrossbetweenGhirsutumCV08N2162andGtome玎tos“，竹．BasedonmeF2populationestablishedageneticmappingwithSSRmarkers，therelationshipbetweenthecottongenomeandthehomologouschromosomeswerestudiedatthemolecularlevelbycomparativemappingwiththegeneticmap(Guoeta1．，2008)．Furthermore，thegenesconferringleaftrichomeandleafnectar),weretagged．Theresultswereasthefollowing：1·ConstructionofgeneticlinkagemapWasperformedusinginterspecificcrosspopulationofcottonwithSSRmarkersInthisstudy,atotalof8488SSRmarkerswereemployedtoscreenpolymorphismsbetweentwoparents，approximately15．9％(1347／8488)ofallSSRmarkersshowingIII 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位polymorphicbandsandyielding1800polymorphiclociinF2population．Amongoftheabove1800polymorphicloci，therewere1045and755polymorphiclocigeneratedby5108gSSRsand3380eSSRs，respectively．Andpolymorphicpercentageswere15．8％(807／5108)and16．0％(540／3380)．682lociarecodominant,458locidominanttoGhirsutumand660lOCitoGtomentosum．GeneticMappingwereperformedinJoinMap3．0software，and1312lociincludingtwophenotypictraitshadbeenmappedonto26chromosomesofcottongenomeataLOD>4，including46linkagegroups．111etotallengthofthemapis3752．3cM，andtheaveragedistancebetweenadjacentmarkersis2．86cM．Therewere12shortlinkagegroupsestablishedby26markers，notbeinglocatedonchromosomesyet．Another464markersdidnotbemappedonanylinkagegroups．Therewere620and692markersanchoredonA--subgenomesandD··subgenomesrespectively．Averagedistanceofadjacentmarkerswas3．05cMinAtgenomecovering1888．9cM；2．69eMinDtgenomecovering1863．4cM．Therewere91markersonA5，whosepolymorphiclociwerethemostamong26chromosomesofcotton．ChromosomewiththeleastmarkersWasA7witll30polymorphicloci．A6hadthelongestlengthandcovered224．8cM，comparedtotheshortestgeneticdistanceof90．1cMonA4．Therewere506(28．1％)markersshowedsegregationdistortion,ofwhich255(14．1％)markerslocatedand24SDRstotallyweredetected．砀edistributionofdistortedmarkerlociwereveryunevenbetweenAtandDtsubgenomes，lessdistortedmarkerlociwerelocatedintoAt(89)thanDsub-genome(166)，7SDRsappearedintheAtand17SDRsappearedintheDt．Fivedistortedmarkerslocatedon12shortlinkagegroups．2．Comparisonwithhigh-densit)，molecularmapbetweenUplandcottonandSea-islandcotton(船)BycomparativeanalysisbetweentheHTmapandthehigh—densitymolecularHBmap，442commonmarkerswerefound，ofwhich204markerslocatedinAtand238markerslocatedinDt．Comparisonsamongallcommonmarkersrevealedthatthedistributionoflocilargelywerecollinearinhomologouschromosomesaccompaniedwimsomeinversions．TworeeiprocaitranslocationsafterpolyploidizationwerefurtherconfirmedbetweenA2andA3，andbetweenA4andA5chromosomesonbothgeneticmaps．mpercentageofsegregationdistortionmarkersinHTWashigherthaninHB，segregationdistortionmarkersweredistributedonallchromosomesexceptA13andthemostweredistributedonD5谢t1121loci，whilesegregationdistortionmarkerswereIV distributedinonlyafewchromosomesinHBandmostofsegregationdistortionmarkerswereonA7anditshomoeologouschromosomeD7．3．LocationofgenescontrollingleaftrichomeandleafnectaryUsingtheHTgeneticlinkagemapobtained，thegenecontrollingleaftrichome(T1)wasmappedasadiscretemarkerandwaslocatedinthecentralregionofA6，0．49cMfromthenearestlocusNAU2417-400．NectarilessnessfNe1)WaslocatedinthecentralregionofD12．0．39cMfromthenearestlOCHSNAU3897．160．KEYWORDS：Gossypiumtomentosum；SSR；Geneticlinkagemap；Trichome；Nectary；LocationV 主要缩略词AFLPChrCTABdNTPcMDNADHEDT．AeSSRESTgSSRLOD13-MePAGEPCRPopRAPDRFLPSSRTBETETEMEDTrisAmplifiedfragmentlengthpolymorphismChromosomeCetyl·-Trimethyl·-AmmoniumBromideDeoxynucleoSideTriphosphateCenti-Morgan(s)DeoxyribonucleicacidDoubledHaploidEthylenediaminetetraAceticAcidEST．SSRExpressedSequenceTaggenome-SSRLogarithmsofOddsRatio13-MercaptoethanolPolyacrylamidedelGelElectrophoresisPolymeraseChainReactionpopulationRandomAmplifiedPolymorphicDNARestrictionFragmentLengthPolymorphismSimpleSequenceRepeatsTris．BorateEDTATris．EDTATetramethylethylenediamine2-amino一2-(hydromethyl)propane一1，3diolVII 第一部分文献综述第一章四倍体棉花的研究进展棉花(Gossypium)是我国重要的经济作物，它不仅提供了世界上绝大部分的天然纤维，而且也是重要的食用油来源，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要意义。棉花属于被子植物门(Angiospermae)、双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、锦葵目(Malvales)、棉葵科(Malvaceae)、棉族(Gossypieae)、棉属(Gossypium)。Beasley(1940，1942)根据地理分布、形态、染色体数目、染色体配对及结构的不同，将棉属分成A、B、C、D、E五个染色体组。Fryxell(1979，1992)认为原产于非洲、澳洲、中美州、南美洲、印度次大陆、阿拉伯半岛、加拉帕戈斯群岛和夏威夷岛的干旱和半干旱地区的棉花，包含45个二倍体种(n--x=13)及5个异源四倍体种(n=2x=26)，其中仅有4个栽培种，包括两个二倍体种亚洲棉俺arboreum)和草棉俺herbaceum)，两个异源四倍体种陆地棉佑hirrsutum)和海岛棉俺barbadensO，在四个栽培棉种中，陆地棉的棉花产量占世界棉花产量的90％，海岛棉棉花产量约5％～8％左右，而二倍体种亚洲棉和草棉的棉花产量只有2％"--5％左右。1四倍体棉花起源和应用四倍体棉种的起源途径曾是棉属系统发育中的中心问题之一。多数科学家的研究表明四倍体棉种是由染色体组A和染色体组D结合而成，Gerstell(1958)和Phillipsl(1964)采用观察杂交合成的多倍体在减数分裂时的染色体配对情况的方法，Saha(1998)等根据同工酶标记分析的方法，Brubaker等(1999)、R0ng等(2004))根据遗传学作图的分析方法，对四倍体和二倍体棉花进行了比较遗传作图，将四倍体棉花的AD基因组染色体分别对应到了其二倍体祖先A和D基因组染色体，从而从基因组水平上证明了栽培四倍体棉种的起源。Cronn(2002)等人根据DNA序列比较分析等方法对四倍体棉种的起源进行了研究，结果都证实了四倍体棉种是异源多倍体起源的理论。棉属有5个四倍体棉种，其中陆地棉和海岛棉为栽培种，达尔文棉(Gdarwinii)、黄褐棉(Gmustelinum)和毛棉(Gtomentosum)为野生种。目前世界上分布最广的四倍体棉种是陆地棉，其次是海岛棉。陆地棉在美洲发现以后，在全世界广泛扩展，中国的陆地棉最早是从境外传入华南和新疆。公元前3世纪的战国时期，海南岛已经有一年生草本棉的栽培和加工。13世纪长江流域和黄河流域已种植陆地棉，主要种植的是亚 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位洲棉。此后的很长时期内在中国主要种植亚洲棉和非洲棉，非洲棉主要种植在新疆。19世纪70年代从美国引进陆地棉。目前我国除了新疆种植部分海岛棉外，全部种植陆地棉。海岛棉种多样化的热带类型分布在秘鲁及南美其它国家亚热带类型分布在美国、埃及、西印度群岛等地。其它四倍体棉种中，达尔文氏棉主要分布在加拉帕哥斯群岛，黄褐棉主要分布在巴西东北部，毛棉主要分布在夏威夷(Fryxell，1979)。所有四倍体棉花的染色体基数都是13，进行两两配对(Kimber，1961)，并且所有四倍体棉花的基因组大小都相似，大约2．2-2．9Gb(Wendeleta1．，2002)。异源四倍体栽培棉种陆地棉和海岛棉分别属于(AD)I和(AD)2染色体组，毛棉属于(AD)3染色体组，属于野生种。近年来，棉花研究人员还对棉属野生种及种系的有益性状及其育种潜力进行了鉴定，用于指导育种实践。根据育种需要，棉属野生种的育种潜力可分为以下若干方面：1、提高丰产性：提高棉花的结铃性、提高铃重和增加衣分：2、改良纤维品质：毛棉和其他野生种系具有提高纤维长度、提高纤维强度和改善棉花的纤维细度；3、提高棉花的抗性：提高抗病性如抗黄萎病和抗枯萎病：提高棉花的抗虫性和抗逆性；4、细胞质雄性不育系的培育：一些野生棉种的细胞质常具有不育性，通过种间杂交可以选育出带有野生种的细胞质而其细胞核为陆地棉的细胞质雄性不育系，如具有陆地棉栽培种所缺少的许多优良性状，是棉花遗传育种的宝贵资源。异源四倍体栽培棉种的染色体组型为AADD，基因组DNA的绝对含量为2．0pg，其中A基因组DNA含量为1．32pg，D基因组DNA含量为0．68pg，约为前者的1／2。由于棉花染色体数目多达52条，平均每条染色体含量为0．038pg。因此棉花染色体相对较小，这也是造成棉花分子生物学研究比较困难的原因之一。2毛棉的研究进展毛棉属于四倍体野生棉种。可以与美洲两个棉花栽培种进行杂交，具有一些独特的基因(Hutchison，SilowandStephens，1947)。Stephens(1964)报道说毛棉可能起源于夏威夷岛远古火山爆发的岩层而不是松散的土壤，是唯一抗夏威夷岛干旱气候的棉种(CenterforPlantConservation，2006)，是最耐热物种之一(Percivaleta1．，1999；Akhtareta1．，1996)。毛棉的棉纤维稀疏且比较粗，棉絮卷曲，可以在许多非纺织品种中得以利用，这些特性引起了早期物种驯化者的关注(Brubakereta1．，19990Wendel和Cronn(2003)认为黄褐棉是一个独立的分支，毛棉与陆地棉的亲缘关系最近。而高伟(2010)通过95个SSR标记对60份四倍体棉种的多样性研究，结果表明毛棉和陆地棉的亲缘关系较远，与宋国立(1999)利用RAPD对四倍体棉种的研究结 第一部分文献综述第一章四倍体棉花的研究进展果相同。导致两种结果不同的原因可能与两者采用的研究方法不同有关，Wendel等(2003)是从系统发育方面结合地理分布及细胞学研究，认为毛棉和陆地棉的亲缘关系更近，而宋国立和高伟则是采用分子标记的方法对四倍体棉种进行研究；也可能是各研究所用毛棉材料的差异，经过多年的生长进化，各地选取的毛棉材料可能发生较大的变异所致。毛棉与其他棉种在形态学上有很大的差异，它的叶片表面有茸毛，叶片性状呈手掌状，颜色从银绿色到灰绿色呈现多样化，花冠亮黄色，柱头外露。棉桃分化为三瓣，每一瓣含有6-12粒种子，由短红棕色的棉纤维包被在周围。而且毛棉的叶片、苞叶和花都不含有蜜腺(MeyerandMeyer，1961；MeyerandMeredith，1978；DeJoodeandWendel，1992；Akhtareta1．，1996；Percivaleta1．，1999)。由于毛棉具有多毛、无蜜腺等抗虫性状，以及抗旱、纤维品质优良等性状，所以成为陆地棉品种改良的优良种质资源(Fryxell，1992)。从19世纪60年代起，世界各产棉国的遗传育种学家，对毛棉的有利性状导入陆地棉作了许多研究。其中，Meyer(1974)6将无蜜腺性状转育到陆地棉栽培品种上。彭锁堂等(1997)研究发现陆地棉和毛棉杂种Fl植株营养生长和生殖生长均旺盛；毛棉的高强纤维性状在杂种早代得到表达，可望通过轮回选择提高现有陆地棉品种的纤维强度；杂种Fl花粉母细胞减数分裂时染色体配对正常，其后代不育原因可能由生理因素不协调造成；杂种后代短日照性强；陆地棉与毛棉亲缘关系比较近，仅在部分染色体间发生分化，存在染色体结构上的差异。Saha等(2006)以非整倍体陆地棉为母本，毛棉为父本进行杂交得到杂种一代，通过减数分裂染色体代换方法研究(陆地棉×毛棉)F1群体的形态变化，为进一步探索陆地棉和毛棉染色体组提供了理论依据，便于一些共显性基因或者显性基因的定位。张巧等(2010)对毛棉体细胞胚胎发生与植株再生进行了研究，研究发现与四倍体陆地棉(Coker201)相比，毛棉体细胞培养难度较大，且体细胞胚畸形严重，萌发困难，但通过培养条件的调控可以得到大量胚状体和少量再生植株。初步建立了适于四倍体野生棉种的愈伤组织诱导、体细胞胚胎发生和植株再生体系。当今，种质资源的发掘和利用对作物遗传改良和突破性育种成就起着重大的作用(张大勇，1999)，由于夏威夷岛沿海地区的快速发展，当地适于毛棉生长的区域已遭到破坏，毛棉存在灭绝的危险，所以对该棉种的全面研究和保护优良种质资源的多样性存在时间紧迫性。 第一部分文献综述第二章棉花分子遗传图谱的构建第二章棉花分子遗传图谱的构建1遗传图谱分子标记的类型及其应用遗传标记(Geneticmarker)是指可追踪染色体、染色体某一节段或者某一个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有2个基本特征，即可遗传性和可识别性。因此，生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。随着遗传学的不断发展，遗传标记的种类和数量也不断增加。目前，应用较为广泛的遗传标记有形态标记(Morphologicalmarker)、细胞标记(Cytologicalmarker)、生化标记(Biochemicalmarker)和分子标记(Molecularmarker)(刘光兴，2007)。由于前三种遗传标记数量少、多态性低、对环境敏感等缺点，从而限制了其在遗传研究中的应用。理想的遗传标记应具备多态性高、遗传稳定、遗传行为简单、能检测整个基因组、不受外界环境影响、操作经济简单等基本特征。生物技术的发展给作物遗传育种研究带来了巨大的变化，DNA分子标记技术的应用是其中最显著的变化之一(Beckmann，1983)。DNA标记是DNA水平上遗传变异的直接反映，最能稳定遗传且信息量大，许多多态性标记在非编码区表现选择“中性”，不受内、外环境影响，与基因是否表达无关，检测迅速，操作也方便。因此，DNA分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题，因而在品种鉴定、图谱构建方面展示了广阔的应用前景。从1980年RFLP概念的首次提出(Botstein)及1985年PCR技术的诞生至今分子标记经历了三代，可分为四类：第一代是基于分子杂交技术的分子标记，代表性技术为限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)；．第二代是基于PCR技术的分子标记，可分为两类：一为基于PCR的DNA分子标记，包括随机引物及特意引物，随机引物主要有随机扩增多态性(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)(Williamseta1．，1990)及简单序列重复间区(Intersimplesequencerepeat，ISSR)；特意引物主要有简单序列重复(simplesequencerepeats，SSR)(LittandLuty，1989)及序列标签位点(sequencetaggedsite，STS)(Fregeaueta1．，1993)。序列特异性扩增IR"(sequencecharacterizedamplifiedregions，SCAR)(Guptaeta1．，1994)是由RAPD标记转化来的；二为基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记，包括限制性酶切片段的选择性扩增，即扩增片段长度多态性(amplificationfragmentlengthpolymorphismAFLP)(ZabeauandVos，1993)；PCR扩展片段的限制性酶切，即放大剪切序列多态性(Cleaved 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位amplifiedpolymorphicsequence,CAPs)。第三代是基于单个核苷酸多态性DNA标记，即单核苷酸多态性(SingleNucletidePolymorphisms，SNPs)(Lander，1996)。近年来，发展了一些新型的分子标记技术。包括：序列相关扩增多态性(sequences．relatedamplifiedpolymorphism，SRAP)(Redayeta1．，2001)及由其演变来的靶位区域扩增多态性标记(targetregionamplifiedpolymorphism，TRAP)；基于反转座子的标记技术(R]m．basedmarkertechnology，RTNmolecularmarker)包括，序列特异扩增多态性(sequence-specificamplificationpolymorphism，SSAP)及反转录转座子微卫星扩增多态性(retrotransposon-microsatelliteamplifiedpolymorphism，REMAP)(Kalendareta1．，1999)等。1．1RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)RFLP指用DNA限制性内切酶酶切不同个体基因组后，含同源序列的酶切片段在长度上的差异，是Bostein等人于1980年发明的标记。这类酶切片段长度多态性要利用放射性同位素或某些非放射性物质标记探针依靠分子杂交检测。RFLP标记的特点：(1)无表型效应。(2)一般表现为共显性。(3)RFLP具有种族特异性，它对于分析一个分离群体的不同来源的染色体片段具有重要价值。(4)标记范围遍及全基因组。但是成本较高，标记要求高，存放和制备都较麻烦，利用放射性同位素，易造成污染，利用非同位素标记其杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低得多。目前，RFLP标记很难直接用于育种。RFLP标记是最早使用的分子标记。在棉花上，Wendel(1989)等利用I江LP对四倍体棉种和A、D染色体组的二倍体棉种的叶绿体DNA(cpDNA)进行研究，研究表明：四倍体棉种细胞质中的cpDNA与A染色体组的二倍体棉种类似，在棉花多倍化的过程中，’cpDNA具有明显的保守性。Brubaker(1999)利用RFLP技术分析了不同棉花品种的遗传多样性，均认为陆地棉品种与棉属其它品种相比遗传多样性水平较低。1994年Brubaker对栽培陆地棉和海岛棉不同类型的cpDNA和核基因组DNA(gDNA)进行了RFLP分析，他们认为陆海两个棉种的种质渗透模式不同，核基因的渗透量远远超过胞质基因。1．2RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)Williams等(1990)基于PCR技术发明了随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记技术。它是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物(长度为10个核苷酸)，通过PCR扩增染色体组中的DNA所获得的长度不同的多态性DNA片段。同时，另外一个实验室 第一部分文献综述第二章棉花分子遗传图谱的构建也发明了相同的技术，称为任意引物PCR(ArbitaryprimerPCR)即AP-PCR(WelshJ，1990)。基因组在特定引物结合区域发生DNA片段插入，缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合位点分布发生相应变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化；若PCR产物增加或缺少，则产生显性的RAPD标记，若PCR产物发生分子量变化则产生共显性的RAPD标记；通过电泳分析可检测出引物对基因组DNA扩增产物的多态性。由于RAPD标记使用随机引物，具有简便快捷、安全和费用较低的优点，而且不同的物种都可以共用一套引物。一般的实验室可以非常方便地建立起RAPD检测的技术体系，因此RAPD标记已被广泛应用于遗传作图。RAPD标记已经用于棉花的遗传多样性研究(Tatinenieta1．，1996；Iqbal，1997；张天真等，1996；王坤波等，1998)、棉花品种或杂交种纯度的鉴定(郭旺珍等，1996；Guo等，1998；张天真等，1997)、棉花的一些重要农艺性状的标记与定位。1．3SSR(SimpleSequenceRepeat)SSR为简单序列重复，又称微卫星(microsatellite)或短首尾重复(shorttandemrepeat)。是一类由几个核苷酸(1．6个，一般为2．5个)为重复单位组成的简单串联重复序列，其长度一般较短，其重复次数在物种间、品种间甚至个体间具有非常大的变异性。SSR广泛分布于基因组的不同位置，其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。SSR首先在人类遗传研究中发现。1982年Hamada等在人心肌肌动蛋[刍(Ha-25)的内含子中发现了一个重复25次的AT序列；Weber等(1989)对人类基因数据库中的SSR进行了系统的研究，发现其重复次数具高度变异性。SSR标记的特点：(1)多态性丰富，一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)为共显性标记；(3)结果重复性高，稳定可靠。为了提高分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，它可检测出单拷贝差异；(4)兼具PCR反应的优点，即所需DNA样品量少，对DNA质量要求亦不苟刻。SSR标记因其具有多态性高、稳定性好、共显性遗传、分布广泛等优点，而且覆盖整个基因组的编码区和非编码区，非常适于遗传图谱的构建(Kashieta1．，1997；R6dereta1．，1998a，b)。但使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息，这可以在其它种的DNA数据库中查询，但更多的是必须针对每个染色体座位的微卫星，从其基因组文库中发现可用的克隆，进行测序，以其两端的单拷贝序列设计引物，这为微卫星标记的开发带来了一定的困难。目前，SSR标记技术已经在棉花基因组进化(郭旺珍等，2003)、基因定位(张天真等，2001；Yu等，2000；Karaca等，2002；Ren等，2002；柳李旺等，2003；Zhang等，2003；Liu等，2003)、遗传多样性分析(Liu等，2000；武耀廷等，2001)和分子 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位遗传图谱构建(Yu等，1997；Liu等，2000；Qureshi等，2001；Zhang等，2002；Lacape等，2003：Nguyen等，2004：Mei等，2004)等方面得到广泛应用。SSR分子标记方法对物种种质资源进行遗传多样性分析，确定遗传距离，阐明亲缘关系对种质资源的有效利用、遗传学研究及育种实践都有重要意义。Liu等(2000)用SSR研究了用回交转育获得的光周期中性系(BC4F4)的遗传多态性，比较了轮回亲本的恢复程度和供体亲本的连锁累赘状况，指出用SSR标记辅助回交可以加快轮回亲本的恢复进度，减少连锁累赘。Rongwen等(1995)应用SSR标记技术对96种大豆基因型进行聚类分析，并将其结果与RFLP标记法进行比较，结果表明SSR标记比RFLP标记多态性高，较适合用于大豆遗传特性分析。由于SSR标记的共显性、多态率高且位点稳定等特点，在图谱构建上一般将其作为锚定标记，有助于图谱连锁群或染色体的归并和不同连锁群的整合。Dai等(2010)通过SSR连锁定位结合候选基因筛查的方法，证实了家蚕乙酰转移酶基因BmiAANAT突变决定了家蚕暗化型(mln)突变。Akkaya等通过大豆近等基因系杂交得到含有60个单株的F2群体，用40个SSR标记对这个分离群体进行多态性筛选，通过遗传图谱构建了29个连锁群，结果表明有34个标记定位于在其中的18个上，以及13个传统性状中的9个性状和7个同工酶座位中的2个连锁。Ma等(2008)对2个二倍体亚州棉杂交后的189个F2单株群体，用6029对SSR引物构建了一张二倍体棉A基因组的种内遗传图谱。该图谱全长2508．7cM、含13个连锁群A基因组的连锁图谱，并发现A基因组与At和Dt2个亚基因组的染色体共线。SSR标记在陆地棉野生种系及四倍体棉种间均可以反映较多的遗传多样性信息，所以应用于棉花品种、杂交种的鉴定和种子纯度检测，具有很大的优越性。此外，SSR标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体，而且结果更加可靠，方法简单，省时省力。实践证实，它可以被广泛应用于生物遗传多样性、遗传图谱构建、目的基因定位、分子标记辅助育种以及种子纯度和真伪鉴定等许多研究领域中，是可靠高效的标记技术。1．4AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)AFLP为扩增限制性片段长度多态性，是由限制性内切酶酶切基因组DNA产生的，可利用PCR技术来检测酶切产生的特异片段(ZabeauM，1993；VosP，1995)。利用两种不同的限制性内切酶切割基因组DNA，通过将酶切片段两端接上不同的接头(adapter)序列(已知的寡核苷酸序列)，即可作为PCR反应的模板。PCR引物由三部分组成，5’端对应于接头序列，中间对应于酶切位点，3’端为选择性碱基(1．3个)，引物长度一般为(18．20个碱基)。通过选用两种限制性内切酶和3’端选择性碱基的组合选择性地对酶切片段进行扩增。扩增产物利用测序凝胶放射自显影方法检测多态性。由 第一部分文献综述第二章棉花分子遗传图谱的构建于AFLP是限制性内切酶与PCR相结合的一种技术，因此RFLP技术具有多态性丰富、稳定性好和重复性高的特点。且与RFLP相比，AFLP不需要Southern杂交，故只需少量DNA。因此被认为是迄今为止作图效率最高的分子标记。但AFLP技术需要放射性同位素或非放射性的荧火标记或生物素标记引物，相对比较费时费力。近几年AFLP在植物遗传多样性方面的研究非常多，在棉花的遗传多样性分析、基因组作图和QTL标记定位研究中已被广泛采用(Altaf,1997；Altaf，1998；AbdaUa，2001；Iqbal，2001；Lacape，2003；Mei，2004；方卫国等，2000)。王省芬等(2004)利用AFLP技术对黄河流域棉区72个抗病品种和长江流域棉区29个抗病品种进行多样性分析，发现两棉区品种的遗传多样性水平相近。2遗传图谱的作图群体构建遗传图谱的遗传材料是分离群体，即作图群体。按其遗传稳定性可分为两大类：一是非固定性分离群体或暂时性群体(F2、F3、F4、BC群体、三交群体)，其最主要的特点是易于在短期内构建具充足大小的作图群体。二是永久性或固定性的作图群体，DH和RIL为永久性的作图群体，它们克服了暂时性群体的不足之处，但构建这样的群体不是难度大，就是耗时长。2．1非固定性分离群体非固定性分离群体，是指遗传物质在个体中还不稳定，不同个体基因型不同，有杂合体，也有纯合体。群体一旦自交就会改变其遗传组成，只能使用一次，无法永久使用。这类群体有单交组合所产生的F2代，及其衍生的F2：3家系，BCl群体。F2群体易于配置，所需时间短，所提供的遗传信息丰富，可以估算加性效应及显性效应。但其致命弱点是F2单株提供的材料(叶片、种子)有限，很难用其进行连续性的研究，也无法满足不同的实验室对同一材料的合作研究。为了延长F2群体的使用时间，一种方法是对其进行无性繁殖如：组培扩繁，但并不是所有的植物都适用，且耗资费工。另一种方法是用F2：3家系，但这无疑会增加工作量和取样的误差。棉花基因组的研究中，多用这类群体进行棉花产量、棉纤维品质及抗性QTLs的定位(Shen等，2005；王娟等，2007；胡文静等，2008；Li等，2008；Yang，2008)。回交群体就是对杂交Fl代用轮回亲本回交一次，短时间即可建立一个回交群体。回交群体只能使用一次，重组交换的信息量比F2群体少。同一组合回交的正反交可以组合成同质的群体，用于研究相同细胞质的不同核基因的差别。为了弥补回交群体的不足，现在多采用先回交再多代自交的方式。BCl群体构建的图谱有(Lacape等，2005；Song等，2005)。 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位2．2永久性分离群体固定性的作图群体也称永久性群体，该群体系间存在基因型差异，系内个体间基因型相同，自交不分离，可永久使用。这类群体常见的有重组自交系(RIL)及单倍体加倍∞m群体等。重组自交系∞L)由连续多代自交或姊妹交产生，这会使得染色体间重组的机会增加，可以更加精确地定位那些紧密连锁的基因位点。该系建立过程中经历多次减数分裂，重组程度高于DH群体和F2群体，解析度高，系内基因型纯合稳定，可以永久使用，可获取不同时间不同地点的田间试验数据，是应用较多的作图群体之--(LacaPeetaleta1．，2009)。但是，由于RIL群体的构建花费很长的时间，如果仅是为了图谱构建的话，选用RIL群体是不明智的。而且，对于存在自交衰退及自交不结实现象的异花授粉植物而言，建立RIL群体也比较困难。DH群体是通过诱导F1产生单倍体再加倍形成的群体，群体内基因型完全纯合，群体间的差异构成了分离群体的遗传特性，DH群体可以不须经过许多世代即可获得大量的实验材料，是研究基因型和环境互作的理想材料。但是DH群体也存在一定的缺点：现在多数DH群体是由花粉(花药)培养再生的单倍体植株经加倍培育而成的，从理论上讲花培中的配子基因型选择将会造成群体的偏态分离。再者有些植物的花药培养非常困难，无法通过花培来建立DH群体。作图群体的选择应根据研究的目的并依据材料的特性进行，如莴苣、水稻等一般都利用F2群体，拟南芥利用F3或F4家系，马铃薯利用BC群体，拟南芥和玉米的重组近交系(PdL)群体，水稻、大麦等利用花粉培养得到的DH群体。现在棉花的遗传作图一般都是BCl群体和F2群体。3棉花遗传图谱的研究进展遗传图谱(geneticmap)最P遗传连锁图谱，是基因组研究中的一个重要组成部分，它是指基因组中基因以及专一的多态性标记之间相对位置的图谱。即通过两点测验和三点测验对统计的各种带型个体数进行连锁分析计算，建立连锁群。也可从第二个标记开始，测验与前一个标记是否协同分离。根据分离资料，用最大似然法估计不同标记位点间的重组率数值并转换成遗传距离，连锁的遗传标记间距离，一般用cM表示，lcM为同源染色体配对期望交换值1％的染色体长度。随着计算机技术的发展，目前已有多个构建遗传图谱的软件，研究者用的较多的软件主要有MapMaker(Landereta1．，1987)及JoinMap3．0(VanOoijenandVoorrips，2001)。棉花分子遗传连锁图谱的构建落后于其它作物。早期，棉花分子生物学研究中存10 第一部分文献综述第二章棉花分子遗传图谱的构建在一系列的技术难关，尤其是难以快速提取棉花高质量DNA，使得人们在分子水平上改良棉花的农节性状及经济性状显得力不从心。然而，自从棉花DNA提取方法成熟(ReinischAJ，1994)后，分子标记在棉花上的探索与应用便取得了长足快速的发展。第一张棉花经典遗传图谱是Endrizzi等(1985)通过研究了198个棉花突变体构建的，在这些突变体中发现了61个形态性状标记位点，对这些位点间的连锁关系进行了分析，构建了一张包含16个连锁群的图谱，并通过单、端体材料将其中的11个连锁群定位到相应的染色体上。后来，又研究了这些形态标记与11种农艺性状之间的相互关系，发现携带不同形态标记基因的等基因系表现不同的农艺性状(Kohel等，1971)。随着分子标记的快速发展，世界上已经有多个实验室采用不同类型的DNA分子标记及作图群体，构建了多张棉花遗传图谱(Ulloaeta1．，2000：Ulloaeta1．，2002；Zhang等，2002；Lacapeeta1．，2003；Rongeta1．，2004；Mei等，2004；Zhang等，2005；Frelichowskieta1．，2006)，并取得了重大进展。迄今为止构建的棉花基因组遗传图谱，大致可分为海陆种间遗传图谱、陆地棉种内遗传图谱以及陆地棉和毛棉种间遗传图：监旧o3．1海陆种问遗传图谱由于海岛棉和陆地棉都是主要的栽培棉种，所以多为研究者采用作为构建图谱的亲本，目前已公开发表了多张海陆种间遗传图谱：Reinisch等(1994)构建了第一张棉花分子标记遗传图谱，作图群体为PalmerixKl01的F2群体，该群体包括57个单株，构建的一张RFLP图谱。该图谱含683个标记位点，分布在41个连锁群上，覆盖了为4675cM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为7．1cM。重复的RFLP位点表明大多数部分同源群包含了来源于不同亚组的染色体，由此推测110．190万年前二倍体棉种发生了染色体加倍的事件。棉花基因组lcM大约相当于400kb的DNA，因此在异源四倍体棉种中图位克隆基因策略是完全可行的。Paterson课题组的Ibng等(2004)在Reinisch等(1994)的基础上构建了一张高密度的四倍体种间遗传图谱。该图谱以RFLP标记为主，包含2584个位点，分布在26个连锁群上，约每774kb上有1个分子标记，覆盖了4447．9eM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为1．72cM，相邻位点间的遗传距离>10cM的gap有41个。同时，在Brubaker等(1999)的基础上构建了一张二倍体图谱，图谱包含763个位点，分布在13个连锁群，覆盖了1493．3cM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为1．96cM。研究发现二倍体和四倍体的图谱都存在双交换、负干扰，有丰富的双重组；在四倍体的At亚组之间发现2个相互易位及几个转换，四倍体中Dt亚组和二倍体D基因组之间没 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位有发现主要的结构变化，位点的复制模式证实了13个部分同源群的关系，从而进一步证明在600．1100万年前A．D分化之前存在一次多倍体化事件。法国Lacape课题组的Nguyen等(2004)在Lacape等(2003)的基础上，利用Guazuneh02xVH8．4602的BCl群体为作图群体，该群体包括75个单株，主要利用AFLP、SSR、RFLP三种标记类型构建了一张棉花种间图谱，该图谱包含1160个位点，总长5519cM，标记间的平均遗传距离为4．8cM。Lin等(2005)在林忠旭等(2003)的基础上利用邯郸208xPima90的F2群体构建图谱。构建的图谱包含566个位点，分布在41个连锁群上，覆盖了5141．8eM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为9．08cM。Guo等(2007)以(TM．1xHm7124)×TM．1的BCl群体的141个单株为作图群体，在Song等(2004)建立的的图谱基础上，设计了2218对EST-SSRs引物，对原图谱进行了加密、整合，得到了长度为3425．8cM，26个连锁群，1790个多态性位点的遗传连锁图谱，标记间平均距离为1．71cM，同时对四倍体棉花的起源与进化进行了系统的分析。Guo等(2008)在前人的基础上构建了一张包含功能标记最多的高密度遗传图谱。该图谱包含2247个位点，覆盖了3540．4cM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为1．58cM，全部分布于26个连锁群上(Song等，2005；Hart等，2004，2006；Guo等2007，2008)。该研究进一步通过BAC．FISH技术，利用从陆地棉遗传标准系TM．1的BAC文库中筛选获得的与己知连锁群相关的单克隆为探针，与不同染色体易位杂交体的中期染色体分裂相杂交，将6条连锁群定位在相应的染色体上，从而在国际上首次完成了四倍体栽培棉种染色体和26条连锁群的完全整合(Wang等，2006)。之后，蔡彩平等(2009)37．．进一步利用新开发的引物，在作图亲本TM．1及Hm7124之间筛选多态性，进行图谱的加密工作，得到一张拥有多个遗传背景且最为高密度的海陆整合图谱。整合后的图谱包含2577个位点，覆盖了3591．0cM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为1．39cM，全部分布于26条染色体上。这为基因组结构的认识，为功能基因的发掘、功能基因间互作、功能基因与环境互作以及功能基因与优质纤维QTLs关系奠定了基础。Yu等(2011)建立了一张包含有2318个完全基于SSR分子标记的海陆种间遗传连锁图谱，图谱全长4418．9eM，图谱中标记间平均距离1．91cM。3．2陆地棉种内遗传图谱如果要对目前世界上主要的栽培种陆地棉的重要农艺性状进行精确定位，则需要构建覆盖全基因组的陆地棉种内遗传图谱，但陆地棉种内遗传图谱的构建工作则远远滞后于高密度的种间遗传图谱。Shappley等、Ulloa等、Zhang等、Shen等、Guo等利用陆地棉品种内杂交群体 第一部分文献综述第二章棉花分子遗传图谱的构建构建遗传图谱的基因组覆盖率远落后于种间图谱，其主要原因是陆地棉品种间的遗传差异少，分子标记的多态性低。因此开发大量新型分子标记，构建覆盖陆地棉全基因组的遗传图谱，对陆地棉纤维品质、产量、抗病等性状的基因QTL进行定位就显得更加重要。迄今为止，已构建了多张种内遗传图谱(Shen等，2005；Ulloaetal．，2000，2005；Zhang等，2005)。但是，由于陆地棉种种内遗传多态率低，陆地棉种内遗传图谱的构建工作远远滞后于高密度的种间遗传图谱。Lin等(2008)构建了一张高密度的陆地棉种内遗传图谱。该图谱主要利用SRAP、SSR、RAPD及RGAP标记类型，包含506个位点，覆盖了3070．2cM的遗传距离。高密度遗传图谱的构建是植物基因组研究的基础，构建高密度的陆地棉种内遗传图谱可以为棉花产量、棉纤维品质及抗性相关QTL的定位提供理论依据，有利于棉花分子育种的发展。3．3陆地棉和毛棉种间遗传图谱的构建陆地棉和毛棉种间遗传图谱的构建工作远远落后于陆地棉和海岛棉种间遗传图谱的构建。近年来，随着栽培棉种遗传同质性提高，其对抗自然环境的的特性逐渐消失，拓宽棉花基因组遗传多态性以提高棉花育种质量变得尤为重要(USDANASS，1998；Raybumeta1．，1999)。所以构建陆地棉和毛棉种间遗传图谱对提高棉花育种有着重要意义。Waghmare等(2005)公开发表了第一张也是唯一一张陆地棉和毛棉种间遗传图谱，该图谱是在LOD---4的情况下构建，该图谱包含589个位点，另外还有26个位点没有整合到图谱上。其中共显性标记位点有326个，陆地棉显性标记有141个，毛棉显性标记有122个，分布在52个连锁群上，覆盖了4259．4eM的遗传距离，由于染色体连锁群存在缺口，每个缺口大概为30cM，所以作者估计遗传距离大概为4979．4cM。标记间平均距离为8．45cM，各个染色体密度不同，最密集的为4号染色体，标记平均距离为5．80cM；最稀疏的为22号染色体，标记平均距离为14．31cM。Waghmare等将该图谱与R0ng等(2004)发表的陆海种间遗传图谱进行比较，发现有165个相同标记位点。此外笔者还对毛棉的无蜜腺性状进行的基因定位，将控制叶片蜜腺的基因定在了26号染色体上，对以后毛棉的研究提供了理论基础。3．4整合遗传图谱迄今为止许多棉花遗传图谱已被构建，但是由于这些图谱是在不同的群体下利用不同的标记下构建的，它们并没有得到充分的利用，每个单独的图谱都存在着潜在的限制性，不同程度的染色体复制、倒位、复杂的重组使图谱复杂化，许多经济性状如 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位抗病性状可能不能被识别或被错误的定位，所以对不同图谱的整合是十分必要的(T．Foote，1997；EHart，1998)。第一张整合图谱是由Ulloa等(2002)构建的，利用Joinmap软件将其实验室的四张RFLP图谱整合为一张遗传图谱。整合后的图谱包含284个位点，覆盖了1502．6cM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为5．3cM，分布在47个连锁群上。本实验室蔡彩平等(2009)在前人工作的基础上，通过共有的SSR标记，首次将本实验室以前构建的18张陆地棉图谱整合为一张高密度的陆地棉种内遗传图谱。该图谱包含67个连锁群，694个位点，覆盖了3552．8cM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为5．12cM，并将67个连锁群全部定位到相应的26条染色体上，几乎覆盖了整个四倍体棉种基因组。Yu等(2010)对在2009年前公开发表的28(表2．1)张棉花遗传图谱进行了整合，这张图谱包含7424个位点，覆盖了以上28张图谱93％的遗传信息，这张综合性遗传图谱将有利于QTLs和候选基因的识别和定位，为基因组序列的拼接提供了基础框架。14 畦■●^-≈，zbS≈∞莲旦鬯价．【忡oo¨奄辇心恩由毽由∽℃嚣田婕．qo‘f譬妻葛黑l，辽嚣君盘．qo．(30N)燃卜ooN．焉．苗，z．k多．0；o寸ooN．一对oQ‘．∞．f．I卫∞≈，oIIu一一2■∞ooN．育．苗，凸．}{．u—o寸ooN．rB．苗：≯dMgp≈∞寸66一．rBou，^．《．IIu∞一口一星66小．【焉甚：^《_最置≥noo一．rB．苗，^．嚣口。酲nooq葛．苗，^面g醋卜6IoN．I对ou，II．口．o}{∞oloN．焉．苗，u．嚣_哥≯∞8N．rBoD，q咖磊净∞QQgoQ9I上noo一．rB．苗，=．f．o旨譬j∞ooN．I时oQ，×．h．曲—_∞IIN卜ooN．写．苗．．力oIlo000奠焉苫，咖_哥lf∞岔A_．rB．苗，咖I__再一^卜ooN．IB．苗，．，乒．f．j≯寸ooN．嗣．苗oE．IQ鼍、I卜—poN．I对．_p，】(．口QII∞ol西nN06厶INNn一寸一∞崞N峪noN卜冀NnonnNn西No一西寸西N—o—nA崎N一∞△∞寸n卜nNn寸No卜。一一nNnN一山，I与_^孑，_笛∞苗∞∞留∞∞酲∞∞．}{甾《o=山一臣^H《u誓∽∞．山J盘山一昆山一h趸厶一‰笛Q^Iv厶誓∞∞．^孑宙∞酲∞∞g∞∞配∞∞．厶rI‰≮山一鼻1山一＆西∞∞．士刁盈。苫名∞∞醋∞∞．王∥H笛o_五‰，I臣山，I‰笛山一吗《．屯弋山∞．^H5LI．誓∞∞．I{gHo苫名∞∞．d1昆．山一吗气匣∞∞．Q^孑1篮N卜I-NN∞￡In∞一o∞N心。寸卜n02-6一_寸N一寸2乱口∞N一口△_享。要=葛n卜一t，一一nNo∞一一卜N咕∞一寸吼∞nN岳t匝啦剿巾求挂罂盆僻撼∞茁d∞一U∞JH出U≥寸N‰茁一‰N‰d嚣‰岔一U∞No∞一U∞o《o一_笛l-N滕t9-s对g一山__式二oo盎-盘．寸N_卜．I爵}{．小厶-n_吼∞∞)cnn一寸。∞g。IIN卜卜一．阻一ol-譬n岔N∞．n∞2一厶暑∞．N∞2Idg∞．心oN2一厶g∞IIo．NII【Io．g—o吼南IIIIdI-_哥一g口j^一．口盘暑IIll^No母叮的}{>Noo寸∞}{>甙0n—o厶．％】‘，_x七DD时o∞≈暑ls_时D∞蓉oql岱∞勺_≈Is_一u∞寸N_卜-I对|10∞对gId_．!iI-茎LLI-蔓FNI-写一g一∞)cn．乌盘暑Is口o．3I∞一矗量i厶々∞对暑Id0∞日暑Id，∞对gId∞oN．磊口暮I{寸NH，蛋}{寸N_，蛋}{≈oIlu薯甚哥joN-0tlu=agjoNN．趸一g∞_岭6口一Q暑奄Q_∞6II一§百Q∞。Q，寻U峪n．rHUU寸寸．爵一时u鼋nnN卜oo／IIo二o／IIooo／IIo上o／qoIlo／qo【Io／qoDo／qoIIo，qoIIn}／声oop，lIo口o／IIoDo，lIoIIo，qo口p，【Io叠o／tIooo／lIooo／IloIIo，【Io议蜒g嚣}匝啦鲷忤求撄罂褂¨捺硝骠藿议冬锭1昧 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位4偏分离位点产生的机制及分布特征偏分离是指观察到的基因型比例偏离预期的孟德尔分离规律，无法用传统的遗传理论和方法加以分析(Lu等，2002)。偏分离位点在图谱中的分布主要有两种情况：一种为散布的偏分离位点，可以偏向任何亲本或杂合子，广泛分布在不同的连锁群上；另一种为成簇分布的偏分离位点，在连锁群上成簇分布且多数偏分离方向一致。这些区段被称为偏分离热点区域(Segregationdistortionregion，SDR)。这种类型的偏分离往往与偏分离位点的存在有关。在SDR上，标记偏分离的方向(亲本或杂合体)与相应偏分离基因位点的作用类型有关。产生偏分离的原因很多，根据偏分离基因位点起作用的时间不同，可以分为：配子体选择(包括：花粉致死、花粉管竞争及选择性受精)与合子选择。可能分别受到受精前和受精后起作用的偏分离基因位点的控制。受精前起作用的偏分离位点只能通过影响配子的比例间接影响合子的基因型比例；受精后起作用的偏分离位点则直接对合子的基因型比例起作用。许多情况下的偏分离是由上述两种选择作用引起的(PerfecttiandPascual，1996)。除此之外环境因素、非同源重组、基因转换、转座因子，甚至作图群体亲本某些位点的杂合等都有可能是导致标记偏向杂合体的原因(Knoxeta1．，1987)。偏分离在图谱中的比例、程度、来源、遗传效应等因物种、群体类型、杂交组合、标记类型等的不同而有很大变化(宋宪亮等，2006)。在水稻中报道偏分离较多，张玉山等(2008)以水稻重组自交系F6群体为作图群体，32．2％的标记表现偏分离。沈希宏等(2006)用协优9308的母本协青早A的保持系协青早B和父本恢复系中恢9308杂交，建立RIL作图群体，48．5％的标记表现偏分离。在玉米中已经检测到了14个SDRs，其中有，，个SDR与已经定位的配子体基因在位置上有较好的对应关系，在这些区域可能有与偏分离相关的特定基因(严建兵等，2003)。Anhalt等(2008)研究黑麦分子标记偏分离与遗传重组关系，通过建立图谱发现在两个群体中标记问的距离普遍存在且显著不同，以F2群体建立的图谱明显长于以Fl衍生群体建立的图谱。利用分子标记技术研究棉花偏分离遗传方面相对滞后。LiIl等(2005)检测到的四倍体棉花种间群体偏分离比例为18％。在棉花上，有研究认为在同源转化群Chrl2．Chr26上存在致死或导致雌雄配子部分败育的基因位点张al(aIlieta1．，1999)。张艳欣等(2008)在研究海岛棉和陆地棉杂交BCI群体遗传图谱结果表明：约有17％的偏分离标记分布在连锁群的末端区域，有13个偏分离标记分布在连锁群的中心或接近中心的区域。在棉花染色体Chr02、和Chrl6上分布的偏分离标记位点数较多，分别为11和20个， 第一部分文献综述第二章棉花分子遗传图谱的构建SDR共有11个。张艳欣(2008)认为若亲本之间遗传差异较大，则获取标记信息较为容易，但杂交后代同源染色体之间的配对与重组受到影响，导致连锁基因之间的重组率偏低，使偏分离程度的变大。作图群体亲本间亲缘关系愈远，偏分离现象愈发严重。为了提高作图亲本间的性状差异程度和多态性水平，进而提高图谱密度和QTL的检测能力，研究者往往采用栽培种与野生种间、亚种间，甚至种间杂交群体进行遗传作图。这会引起非同源重组、染色体重排等基因组结构变异，从而发生严重的偏分离现象(KianianandQuiros，1992)。5毛棉有关性状的研究毛棉是四倍体野生棉种，其染色体组与栽培陆地棉和海岛棉相同，均为AADD染色体组。毛棉具有多毛、无蜜腺等形态特性，研究表明植株茸毛性状、无蜜腺性状对减少虫害，提高抗旱性具有重要的关系。植物抗虫性的利用一直被誉为最经济、有效的害虫治理策略，国内外学者在植物抗虫性研究与利用方面取得了重大进展。在不污染环境和保持基因组完整性的情况下，为了提高棉花的产量和品质，挖掘抗虫性、抗病性、抗逆性种质资源，选育具有多种抗逆性基因的棉花品种至关重要。5．1叶片茸毛的研究叶片的表皮毛是叶片表皮层的一部分表皮细胞突起形成的。叶表茸毛是叶片表面影响昆虫取食为害的重要因子，与植物抗虫性有着密切关系，其表面茸毛的有无、数量(密度)、长度、软硬、生长方向或形状都可能与抗虫性有关(孙祖东等，2001)。除此之外。植物茸毛能完成许多关键性的生理和生态机能，特别是那些与水分持有有关的机能，所以也是二种抗旱性的形态特征。杨国枝等(1980)通过形态指标鉴定了花生茎节茸毛与抗旱性的关系指出，花生中上部茎节茸毛密度与抗旱性有关，茎节茸毛密的品种抗旱性强，茸毛长度与抗旱性无明显关系。杜雄明等(1994)研究了棉属33个野生种和6个四倍体种的棉种茸毛与地理分布的关系，结果表明，分布于热带棉区的棉种，植株都密布茸毛，而分布于亚热带地区的棉种则光滑无毛，纬度越低，棉种植株茸毛越多，随纬度增高，植株茸毛逐渐减少。棉花的茸毛性状与多种害虫的发生为害程度有关，有报道指出棉花多茸毛能够抗蚜虫和叶蝉(I处an，1984；Naveed，1995)。陈旭升等(1994)选用引自美国的多毛材料陆地棉2001和全株光滑品系SP21作为遗传研究亲本，在F2群体的分离比是3：l，发现控制棉花各器官多毛性状的基因是同一个基因，表现为1对显性主基因控制的简单遗传方式。 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位Mursal等(1994)研究发现拥有鸡脚叶、无蜜腺、叶片多毛等性状的棉花具有抗虫性(Knight&Sadd，1954；Mursal，1994；Rahman，2002)。尚亚南等研究棉花多毛性状的遗传时认为棉花多毛性状由H1和H2二个主效基因和三个修饰基因的复合体所控制。H1是从陆地棉、海岛棉、亚洲棉中提取的(Knight，1955)，它是一个关键基因，对各种程度的茸毛性状均有重要作用。H1基因表现茸毛稀而长，需在修饰基因存在时才产生密毛，且若没有一个适合的遗传背景，H1也不能产生茸毛。H2是从毛棉中提取的(Knight，1955；Knight&Sadd，1954)，H2基因表现茸毛密而短，无其它修饰基因时也产生密毛。Rahman(2002)通过对H2基因4个操纵子序列的筛选，发现了一个茸毛突变基因片段OPC．08700；舢i等(2009)鉴定了8个与其多态性一致的RAPD标记引物，结合SSR引物进行遗传作图，包含一个SSR引物和9个RAPD引物，其中有4个RAPD引物定在了H2基因所在区域。Desal等(2008)以亚洲棉为母本、草棉为父本进行杂交，对其F2后代176个单株进行研究，发现叶片光滑无毛植株与叶片有毛植株比例基本符合孟德尔定律。分别取每个植株的嫩叶和展开的成熟叶片，在显微镜下观察叶片表皮茸毛的密度，将其控制叶片茸毛的QTLs基因定位在6号染色体上。5．2蜜腺的研究蜜腺位于植物体的花和营养体上。徐万林等(2010)对蜜腺植物进行了统计，结果表明约80％的被子植物都有蜜腺。大多数植物每片叶子上有1．3个蜜腺，多者可达5个，以中裂片主脉蜜腺最大，其分泌物也最多。棉叶脉蜜腺位于叶背面叶脉上，离叶基约1cm处呈窝状凹陷，窝内有许多棒状突起，分泌蜜汁。棉花由于蜜腺多、蜜期长、蜜物多而成为导致虫害的原因之一。因为蜜腺是某些害虫的重要食料来源，无蜜腺性状则可减少害虫生长发育所需要的养料和水分，故无蜜腺具有一定的抗虫性。而毛棉是拥有无蜜腺性状的野生棉种，是研究棉花无蜜腺抗虫性状的优良种质资源。近年来，对棉花叶片蜜腺的研究已经很多，但大多是研究棉花无蜜腺性状的形态学和细胞学特征，很少对其进行分子水平的研究。如吴征彬等(1991)研究了鸡脚叶无蜜腺棉若干性状，结果表明鸡脚叶棉的红铃虫落卵量、虫花率、青铃受害率均低于正常叶棉近等基因系，其种子虫害率相对减少20％左右；同样，无蜜腺棉的种子虫害率均低于有蜜腺近等基因系和亲本其减少受害程度一般在20％以上。朱四元等(2010)对陆地棉无蜜腺性状的形态学和细胞学特征进行了研究。朱四元等(2007)用SSR引物对无蜜腺品种97014和有蜜腺品种TM．1进行筛选， 第一部分文献综述第二章棉花分子遗传图谱的构建共筛选出在两品种间扩增差异的引物10对。采用BSA法在F2群体中选用10株有蜜腺的单株和10株无蜜腺的单株DNA组成有、无蜜腺基因池，从有差异的10对引物中筛选出在有蜜腺亲本、有蜜腺基因池和无蜜腺亲本、无蜜腺基因池之间表现多态性的1对SSR引物为BNLl673，用该多态性引物对组合TM．1、97014的283株F2单株进行检验，通过Mapmaker3．0软件的遗传连锁分析，用Kosambi函数将重组率转换成遗传距离(cM)，发现标记BNLl673193与无蜜腺性状基因的遗传距离为1．3296cM。吴征兵等(1999)研究发现，以无蜜腺棉与转Bt基因品种(系)杂交获得的杂交种在产量、品质和抗虫性方面表现最好，是一种理想的抗虫新材料。而且，由于形态和Bt抗虫棉材料在若干性状上呈现互补的特点，可以预见，将Bt基因棉与常规的形态抗虫棉杂交，将现代生物技术与常规育种技术相结合，选育既高产优质、又具有多种复合抗虫的棉花品种(系)，将是未来抗虫棉研究的主要方向之一。Waghmare等(2005)在构建陆地棉和毛棉种间遗传图谱的同时，对这控制棉花叶脉蜜腺性状的基因进行了初步定位，将这一基因定位在26号染色体上，但是Nel位点与最近的标记位点相距11．2cM，两个最近标记位点的遗传距离为24．6cM，还没有达到精细定位。 陆地棉和毛棉种问SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位本研究的目的和意义中国是一个农业大国，棉花产业对中国经济发展具有十分重要的作用。棉属中包括51个棉种，陆地棉、草棉、海岛棉和亚洲棉属于栽培种，其余47个棉种为野生种，这些棉种多数本身不具长纤维，但具有高纤维品质潜力，如异常棉、雷蒙德氏棉等(钱思颖，1995；彭跃进，1987)是棉花育种的重要种质资源。毛棉是野生棉的一种，具有陆地棉没有的一些优质性状，如耐旱、耐热和抗虫性，棉花抗虫性的利用一直被誉为最经济、有效的、害虫治理策略。毛棉和陆地棉一样都是四倍体，杂交障碍小杂交较易成功，和陆地棉之间基因渗透相对容易。棉花的遗传图谱是基因组研究的基础，它不仅在研究基因组组织结构和棉种的起源进化方面具有重要的理论和应用价值，对重要的农艺性状的标记、定位和分子标记辅助选择也有重要意义。目前，棉花遗传图谱已经有多张，但大多是陆地棉和海岛棉种间遗传图谱，只有一张公开发表的陆地棉和毛棉种间遗传图谱(Waghmare，2005)，但含有的位点不多，密度较低，在实际利用中有很多的局限性，所以构建高密度的陆地棉和毛棉种间遗传图谱是利用毛棉优质资源、选育优质棉花新品种的重要任务。由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列，可以设计为引物用于PCR扩增，通过电泳能显示出不同样品间重复次数的差异，它具有较高的多态性、共显性分离、位点专化性、标记覆盖整个基因组且分布均匀、DNA样本用量少等优点，有不少学者利用SSR分子标记技术对一些棉花品种进行过研究(郭旺珍，2003)，成为构建遗传图谱常用的一种分子标记。本研究完全基于PCR的SSR分子标记，以陆地棉和毛棉为亲本进行杂交后代的F2为作图群体，构建陆地棉和毛棉种间遗传连锁图谱，并在此基础上，对棉花叶表茸毛和蜜腺形态性状进行基因定位，对重要农艺性状基因的定位和种质资源的利用奠定了基础。‘一。⋯一一一⋯⋯⋯’ 第二部分研究报告第三章陆地棉和毛棉种间ssR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位第二部分研究报告第三章陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及茸毛和蜜腺基因的染色体定位棉花(Gossypiumspp．)是一种主要的经济作物，是世界上纺织工业中重要的天然纤维来源及重要的食用油资源。棉属包括5个四倍体棉种，其中陆地棉和海岛棉为栽培种，达尔文棉、黄褐棉和毛棉为野生种。异源四倍体栽培棉种陆地棉和海岛棉分别属于(AD)I和(AD)2染色体组，毛棉属于(AD)3染色体组，它和其他棉花种类有部分同源性，并且带有一些独特的基因(Hutchison，SilowandStephens，1947)。近年来，随着栽培棉种遗传同质性的提高，其对抗自然环境的的特性日益脆弱，拓宽棉花遗传基础以提高棉花育种水平变得显为重要(USDANASS，1998)。毛棉与其他棉种在形态学上有很大的差异，它的叶片表面有绒毛，叶片性状呈手掌状，颜色从银绿色到灰绿色呈现多样化，花冠亮黄色，柱头外露。且毛棉的叶片、苞叶和花都不含有蜜腺。由于毛棉具有多毛、无蜜腺等抗虫性状，以及抗旱、纤维品质优良等性状，所以成为棉花遗传育种的宝贵资源。遗传连锁图谱在作物遗传学和作物育种学研究中对比较基因组学研究、基因的图位克隆、优良性状的定位、种质资源创新、起源与进化、分子标记辅助选择育种等领域都有广泛的应用。种间遗传图谱所用到的亲本亲缘关系比较远，比较容易获得覆盖整个四倍体棉种基因组的多态位点，在研究全基因组结构方面具有重要的意义。虽然棉花分子遗传图谱已有很多张，但陆地棉和毛棉种间遗传图谱还很少，Waghmare等(2005)公开发表了第一张也是唯一一张陆地棉和夏威夷棉种间遗传图谱，该图谱包含589个位点，其中共显性标记位点有326个，陆地棉显性标记有141个，毛棉显性标记有122个，分布在52个连锁群上，覆盖了4259．4cM的遗传距离，标记间平均距离为8．45cM。此外笔者对控制蜜腺性状的基因进行了初步定位，为今后棉花无蜜腺品种育种提供了理论基础。本研究以(陆地棉08N2162x毛棉)的F2群体为作图群体，构建了一张陆地棉和毛棉种间遗传图谱，并对棉花叶表茸毛和蜜腺基因进行了定位，对棉花分子标记辅助育种，重要性状精细定位、有关棉花纤维产量、品质等基因的分离与克隆，棉花遗传资源的创新都具有十分重要的意义。 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位1材料1．1供试材料本研究所用的作图群体(08N2162x毛棉)的F2群体，群体大小为93个单株。其中08N2162是一高产优质的陆地棉栽培品系，毛棉是具有多毛、无蜜腺等抗虫性状，以及抗旱、纤维品质优良等性状的野生棉种植资源。1．2供试引物及其来源筛选了由本实验室和其他实验室设计的SSR引物8488对，SSR引物来源如下：BNL编号的来自美国ResearchGenetics公司(Huntsville，AL，USA，http：／／www．res．gen．corn)；S．Ⅳ、MUCS-MUSS及Gh编号的引物从(http：／／www．coRonmarker．or90网站下载。JESPR来自Reddy等(2001)公布的序列；TM序列由美国农业部南方平原农业研究中心的JohnYu博士惠赠(USDA．ARS，CropsGermplasmResearchUnit，Texas，USA)；CIR来自Nguyen等(2004)。Cer、shin、cgr、cot、dc及dPL编号的引物来自美国Monsanto公司；HAU编号的引物由华中农业大学提供；NAU编号的引物由本实验室自主开发。1．3多态位点的命名SSR多态位点的命名方法：如NAU系列的SSR引物：NAU引物编号．分子量。其中：NAU代表南京农业大学，分子量为该引物在作图亲本08N2162及毛棉之间差异位点扩增片段的长度，即陆地棉08N2162显性和共显性位点的分子量是陆地棉扩增片段的长度，毛棉显性位点的分子量是毛棉扩增片段的长度，例如：‘"NAU7576．270”指编号为7576的南京农业大学SSR引物产生的多态位点，该位点在亲本中扩增产物大小为270bp。2方法2．1作图群体的构建于2008年冬季在海南三亚选择08N2162单株作母本，毛棉单株作父本(花粉取自中国农业科学院棉花研究所海南野生棉种植园)，进行对株杂交，收获F1种子，并对亲本单株进行自交收获自交种子。2009年夏季在南京江浦种植亲本和Fl，用Fl自交获得F2种子。2010年夏季在南京江浦种植亲本和F2，育苗移栽，苗龄30天时移至大田，行距80cm，株距40cm，共获得93个F2单株。 第二部分研究报告第三章陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位2．2表型性状调查调查了2项农艺性状，即叶片茸毛和蜜腺的有无，在构建的F2群体中：在苗期，根据时’片茸毛和叶脉蜜腺有无情况，逐株挂牌调查群体的每个单株，5．8月间共重复调查4次，以验证结果。2．2．1叶片茸毛性状的调查母本08N2162的叶表光滑无茸毛；毛棉的叶片上茸毛稠密；Fl一代植株的叶片茸毛稠密度酷似父本毛棉，表明了多毛性状的显性遗传特征。茸毛性状在F2群体中有所分离，多数植株的叶片茸毛稠密，有的植株叶片的茸毛稀疏，有的植株叶表光滑无茸毛，总之F2群体单株的叶表茸毛稠密度不同，鉴于亲本的表现，我们认为：叶表有茸毛的植株视为有茸毛植株，记为1；叶表光滑的植株视为叶表无茸毛植株，记为0。有茸毛和无茸毛植株的形态差异(图3．1)。、。誉一。|。|礴每≮1_“*’札，1‘挚?各￡-i’，笺惹．．。_重，jt．+／一⋯鲣纂、≯。I。慕≯。lI。，《≯；图3-1棉花叶表有无茸毛性状的形态差异注：a．叶表光滑叶片b．叶表茸毛叶片Figure3—1CottonmorphologicaldifferencebetweensmoothandtrichomeleavesNote：a．smoothleavesb．trichomeleaves2．2．2叶片蜜腺性状的调查母本08N2162的叶片主脉五分之一处有蜜腺；毛棉的叶片无蜜腺；Fl一代植株的叶片叶片主脉五分之一处均有蜜腺，这与母本相同，而异于父本，表明了蜜腺的显性遗传特征。叶脉蜜腺性状在F2群体中有所分离，约有三分之二的植株叶片的主脉处有蜜腺，记为1；其余植株叶片主脉处无蜜腺，记为0；叶片有无蜜腺性状形态差异(图3．2)。 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位匿b图3-2棉花有无蜜腺性状的形态差异注：a．无蜜腺b．有蜜腺Figure3-2CottonmorphologicaldifferencebetweennectarilessandnectaryleavesNote：nectarilessb．nectary2．3棉花基因组DNA的提取方法从亲本和群体单株上采集顶部刚展平的新生叶片2．3片，装入离心管中，立即放入冰盒，带回实验室放入．20。C冰箱备用。按照Paterson(1993)发表的CTAB方法提取DNA，在某些细节上稍作调整，具体步骤如下：1)将1．2片未完全展开的幼嫩棉花叶片放入1．5ml的离心管中，加入0．6ml提取缓冲液(缓冲液配制见表3．1)，电钻磨碎。10000rpm(Eppendor0离心15min(4*C)，弃上清；2)于沉淀中加入0．6ml65℃预热的裂解缓冲液(缓冲液配制见表3．2)，并用牙签搅拌混匀，65℃水浴30min；3)加入3ml的氯仿：异戊醇(24：1)，翻转50次以上，12000rpm离心20min(15。C)，将上清转入10ml的离心管中。4)加0．6倍体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10分钟，10000rpm，lOmin(RT)。于沉淀中加入2ml70％的乙醇洗涤，并转入5m1的离心管中，10000rpm离心5分钟。倒掉上清液，通风干燥20分钟。5)加2mlTE缓冲液溶解，65℃培养10．30分钟。6)抽提：加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，15，000rpm离心10min。7)上清液转入5ml离心管中，加0．1倍体积的3M醋酸钠(pn5．2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30分钟，10，000rpm离心5分钟。弃上清液，加1ml70％乙醇洗DNA小团，转入1．5ml的离心管中，10，000rpm离心5分钟。弃上清液，自然通风干燥DNA小团。24 第二部分研究报告第三章陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位8)加100I-tlTE缓冲液QH8．0)4℃溶解。取部分定容到20ng／uIDNA，4℃保存进行标记分析，其余DNA．20"C保存。表3-1DNA提取缓冲液配制Table3．1ExtractionsolutionstoDNA工作液存储液W0rkingSOIutionmlStockSolution0．35MGlucoseO．1M"Iris．HCl5mMNajED弘34．6895056．9369101Glucose1．0MTris．HCI(pn8．O)O．5MEDTA(pH8．0)2％PVP1002010％PVP1％(V～)p-Me51LiquidddWater34068l12垡iQQ巴!!!塑!!!以上为乳状溶液，加13一Me(巯基乙醇)后在4℃可以保存1”2周，使用时最好置于冰上表3-2裂解缓冲液配制Table3．2LysissolutionstoDNA工作液一存储液WorkingSolutionmlStockSolutionMNaCI40908988169NaCI1．4．．1O．1MTris．HCI50101．0MTris．HCI(pH8．0)20mMNa．EDTA2040．5MNa．EDTA(pH8．0)2％CTAB1002010％CTAB2％PVP1002010％PVP1％(VⅣ)13-Me51．0LiquidddWater22545|以上溶液清亮，室温可保存1—2周，用前加13一Me(巯基乙醇)。2．4SSR分子标记分析2．4．1SSR的PCR扩增SSR的反应体系见表3．3。 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位表3-3SSR反应体系Table3-3SSRreactionsystem组分用量兰殳竺旦竺!!!!旦竖曼旦垒!曼堕lOxbuffer1．OlaL2．5mMMgCl21．OlaLlOmMdNTPs0．21aLPrimerRPrimerFTaqaseTemplateDNAddH20总体积1．OlaL1．OoL0．1laL20ng4．79L10．OlaL2．4．2PCR程序PCR反应在PTC．100(MJresearch)热循环仪上进行，反应程序为：94。C预变性5min；94。C变性45s，57。C退火45s，72℃延伸lmin，35个循环；72℃延伸7min。2．4．3PAGE／银染分析电泳结束后，凝胶用蒸馏水稍冲洗，然后银染。银染参考张军等(2000)介绍的方法(略做修改)，按以下程序进行：固定(10％乙醇、O．5％冰乙酸)10min；渗透(0．2％硝酸银水溶液)10～12min；蒸馏水漂洗8See；显色(1．5％氢氧化钠、0．4％甲醛)5min后，即可终止显色(张军等，2000)，待显色完全后，放入保存液，待观察。2．5数据分析2．5．1标记基因型数据收集和分离比检测SSR引物先在两亲本之间筛选多态性，选择具有多态性的引物，在F2群体中扩增进行分子标记数据收集与分析。将F2群体中与08N2162、毛棉和F1具有相同带型的个体，分别赋值为1、2和3；如F2群体中只有两种带型，则该标记为显性标记，其中与08N2162带型相同的记为1：与毛棉和Fl相同的记为4；另一种情况与毛棉带型相同的记为2，与08N2162和F1相同的记为5，以上情况与带型不能确定或缺失的赋值为．。将F2群体中标记的基因型的实际观察数目，逐一与其分离的孟德尔理论比率1：3或1：2：1进行#适合性检验，推断是否存在偏分离现象，并对结果进行统计分析。 第二部分研究报告第三章陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位2．5．2遗传图谱的构建对于在F2群体中扩增出的每个标记位点基因型的分离比例，先用X2检测标记基因型比例是否符合孟德尔式分离方式，不符合的属于偏分离标记，当连续3个或3个以上分子标记都表现偏分离时，就定义它们所处的染色体或连锁群区域为偏分离热点区域(segregationdistortionregion，SDR)。采用作图软件JoinMap3．0(VanOoijenandVoorrips，2001)进行标记连锁分析，LOD_>4．0，最大遗传距离为40cM。在LOD值较高的情况下依据发表的高密度海陆遗传连锁图谱(Guoeta1．，2008；Yueta1．，2011)对连锁群进行分组，用统计学的软件计算相同染色体不同连锁群上标记的两两的重组率，用虚线连接遗传距离最近的连锁群，使染色体上标记顺序达到最佳。图谱的绘制用Mapchart(voorrips2002)来完成。染色体定位参照发表的高密度海陆遗传连锁图谱(Guoeta1．，2008：Yueta1．，2011)，根据共同的标记将连锁群与染色体建立联系，将所有连锁标记定位到相应的26条染色体上，用A++和D++表示两个基因组染色体序号；对于未定位到相应染色体上连锁群，将引物标记序列与公布的雷蒙德氏棉序列(DD)进行比对，进行初步定位，用LG++表示。3结果与分析3．1性状在F2分离群体中的变异对两个农艺性状即叶片茸毛性状和蜜腺性状有无进行调查，在F2群体中两个性状都有分离，其中67株叶片有茸毛，26株叶片光滑，卡方值0．29；71株叶脉处有蜜腺，21株叶脉处无蜜腺，卡方值O．03。结果表明，两性状在F2群体中的分离比都符合孟德尔定律。3．2多态性引物筛选和群体分子标记基因型的分析本研究中，用8488对SSR引物对两亲本及F2群体的多态性进行检测，筛选至U1347对SSR弓I物在两亲本及F2群体间表现多态，产生了1800个多态位点。其中：eSSR弓I物5108对，可用于陆地棉和毛棉种问遗传图谱构建的有807对，多态率为15．79％，共产生1045个多态位点；gSSR弓]物3380对，可用于遗传图谱构建的有540对，多态率为15．97％，共产生755个多态位点(表3．4、图3．3)。在1800个多态位点中，1118(62．11％)个位点为显性标记，其@458个(25．44％)位点为陆地棉08N2162显性带，660个(36．67％)位点为毛棉显性带，682个(37．89％)位点为两亲本共显性标记。此外，来自父本毛棉的显性叶片茸毛基I天I(T1)和来自母本08N2162的叶脉蜜腺基因(Nel)都被用来作为标记检 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位测群体基因型，这样总位点数达至01802个。NAU747-NAU759NAU761一NAUl606NAU2000-NAU2523NAU2552·NAU4105NAU4112-NAU4727NAU4850．NAU5S13NAU5901．NAU6092NAU6093·NAU6123NAU6720-NAU6771NAU6933-NAU7229NAU7657-NAU7663NAU8316．NAU8342NAU8343-NAU8660w1073．w1075TotaleSSR引物NAU001-NAU217NAU218，219，316-NAU506NAU220-NAU746NAU413-NAU760NAUl607-NAUl998NAU2524-NAU2551．NAU4106·NAU4111NAU5514-NAU5900NAU6124-NAU6701NAU6772·NAU6930NAU7230·NAU7656NAU7664．NAU8060NAU8061-NAU8082NAU8083-NAU8136NAU8137-NAU8315TotalgSSR引物NAUMUCS-MUSSNAUs1、，NAUCershinHAUWBNLTMJESPRNAUCIRNAUBNLNAUGhNAUcgrcotdcdPL6．orboreum6．hirsutum7235，Xul426．raimondii6．orboreumG．hirsutumacc．n●卜1．Xul426．hirsutum6．borbadensecv．Hai71246-barbodensecv．Hai71246．barbodensecv．Hai7124Monsanto6-barbadensecv．Hai71246．hirsutumacc．TM．16．hirsutumJohnYu博士Reddy等(2001)6．arboreumNguyen等(2004lBAC-SSR6．hirsutumG．hirsutum以Maxxacotton数据库6．roimondiiMonsanto138464891S546166641923】=522977273182510821711030711739228638757815942739722541793380315551299308245353013328077619281839312270S64397521425403193713963711045493016721045902446195032249375531636307775528 第二部分研究报告第三章陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位400bp300bp250bp200bp图3-3部分SSR弓I@J在亲本08N2162和毛棉之间进行多态性筛选的电泳图注：M．markerP1陆地棉08N2162P2．毛棉Figure3-3TheelectrophoresisPatternofParentalPolymorphismsofsomeSSRPrimersNote：M．markerP1．08N2162P2．Gtomentosum在所有的多态SSR引物中，278对SSR引物(20．63％)产生2个多态位点，61(4．52％)对SSR引物产生3个多态位点，7对SSR引物产生4个多态位点，6对SSR引物产生5个多态位点。图3．4所示为SSR标记dpL0010在F2群体部分单株中扩增图。豳爨瀚燕瀚雕鬻i攀j掣攀辫麟攀麓攀警图3．4SSR引物dpL0010在的F2扩增图谱电泳图注：M．markerP1陆地棉08N2162P2毛棉．一．．Fig34TheamplificationresultofSSRprimersprimercgr6934inF2individuals(arrowsshowpolymorphicbands)．Note：M．markerP1．08N2162P2．Gtomentosum3．3定位到棉花基因组上标记及图谱特征本研究中，所有的8488对SSR引物在F2群体中扩增共得到1800个多态性位点，其中eSSR位点1045个，gSSR位点755个，采用作图软件JoinMap3．0进行标记连锁分析，LOD_->4．0，能定位到棉花26条染色体的连锁群的排列按At亚组和Dt亚组即A1到A13，D1到D13的顺序进行编号；不能定位到棉花相应染色体上的连锁群的排列按LG01到LGl2的顺序进行编号。经分析F2群体中所获得的1800个多态性位点，1310个标记位点能够定位到陆地棉和毛棉种间遗传图谱中，其中：804个eSSR位点，506个gSSR位点，加上两个形态标记该图谱共含有1312个标记位点，这些位点全部分布于26条染色体上，覆盖了3752．3cM的遗传距离，标记间的平均遗传距离为2．86cM；另有26个标记建立了12个短连锁群，目前还不能确定其位于棉花基因组的哪一条染色体上；其余464个标记没有进入任何连锁群。在新构建的陆地棉和毛棉种间遗传图谱中At亚组有620个位点，Dt亚组有692个位点，定位于A亚基因组的标记少于D亚基因组的标记，其原因可能是用于该图 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位谱构建的引物中大多是本实验室自主开发的SSR引物即NAU系列的引物，而NAU系列EST-SSR标记开发时的EST序列来源D亚基因组雷蒙德氏棉(D5)的多(Guoeta1．，2007)。At亚组覆盖了1888．9cM，标记间的平均遗传距离为3．05eM；Dt亚组覆盖了1863．4cM，标记间的平均遗传距离为2．69cM。前人研究结果认为At亚组长于Dt亚组，本研究中At亚组的的总长度比Dt亚组的总长度长9．0cM，这可能是因为Dt亚组中的标记数较多而At亚组的标记数相对来说较少，标记数的差异使At和Dt两亚组的长度基本接近。该图谱由46个连锁群组成，A6、A9、A12及D13各有3个连锁群，12个染色体包括2个连锁群，其他1O个染色体包括一个连锁群。每条染色体含有的标记位点数不同，A5含的标记位点最多，有91个，A7最少，有30个；A6覆盖的遗传距离最大，为224．8cM，A4覆盖的遗传距离最小，为90．1cM；各染色体的标记密度也不同，A7标记间的平均遗传距离最大，为4．02cM，D10标记间的平均遗传距离最小，为1．70cM，整个图谱标记间平均距离为2．86cM。图谱中相邻位点间的遗传距离>10cM的gap有52个，At亚组中有26个，Dt亚组中有26个，最大的gap为36．3cM，在D3上，A13中最短，为7．6cM；A4、A5、A13、D4、D10出现标记间最大距离都小于10cM(表3．5、图3．51。在本研究构建的图谱上，有95对SSR引物产生了2个或2个以上的多态位点，其中52对SSR引物扩增产生的重复位点可以在棉花基因组的13个部分同源群上检测N(m3．5)。A1／D1上有3个，A2／D2上有1个，A3／D3上有5个，A4／D4上有5个，A5／D5上有1个，A6／D6上有5个，A7／D7上有5个，AS／D8上有4个，A9／D9上有13个，A10／D10上有7个，A11／D11上有2个，A12／D12上有3个，A13／D13上有2个。部分引物产生的不同位点在图谱中聚在一起，这可能是因为亲本关系复杂及作图群体小，具有或缺失某个位点的植株少，如果群体大小大大扩增，这些同一引物产生的不同位点在图谱中会散开，成为独立位点。在四倍体栽培棉种中A2和A3，A5和A4之间存在易位情况，本图谱中检测到6对重复位点分别分布在A2／D3(2)，A3／D2(1)，及AS／D4(3)。从分子水平上验证了，进一步验证了在四倍体棉种形成过程中，A亚组的A2／A3和A4／A5之间的确发生过相互易位(图3．5)。 第二部分研究报告第三章陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位表3．5F2群体建立的SSRs遗传图谱各染色体的位点数及遗传距离Table3-5LocicompositionandrecombinationdistancesofchromosomesbasedonSSRsintheF2P2P坐型2翌染色体连锁群数位点数遗传距离标记间平均距离>10cM的gap数(最大的gap)曼坠：!塾翌!!：2型12虫兰堕!堂2坐竺坚!!壁竺!!l型2塑2：21墨望!：!!堂f!型堡2A-SubgenomeA1A2A3A4A5A6A7A8A9A10AllA12A13At．TotalD·SubgenomeDlD2D3D4D5D6D7D8D9DlODllD12D13Dt-Toral4533329l5730336433705149620158．7102．212490．1199．6224．8120．694．2170．197．9210．9198．697．21888．93．533．13．872．8l2．193．94．022．862．662．973．Ol3．891．983．055(32．4)1(20．6)2(24．9)0(9．82)0(7．91)5(26．014(13．9)2(10．411(15．8)l(10．311(10．2)4(16．2、0(7．6126(32．4)46141．43．073(14．6)50123．62．472(22．7)45162．23．613(36．3146116．42．530(9．98153125．22．361(11．8)56168．93．024(16．6)64200．13．444(18．915095．61．912(11．9)47l80．63．843(22．7)711211．70(9．93)5l123．52．42l(11．6)48162．43．382(14．3)65142．5～2．191(12．9)6921863．42．6926(36．31Total4613123752．32．8652(36．313．3．1eSSRs标记在陆地棉和毛棉种间遗传图谱中的定位情况5108对eSSR引物中可用于本实验室陆地棉和毛棉F2作图群体的多态引物有807对，共产生1045个多态位点，对1045个多态位点进行Z检测，得到298个偏分离位点。由691对eSSR引物产生的804个位点(包括164个偏分离位点)能够定位到遗传图谱中，这些位点包括：619个NAU位点，At亚组295，Dt亚组333，At：Dt=l：1．1；147个HAU位点，At亚组78，Dt亚组69，At：Dt=1：1．1。At亚组共有379个eSSR312l1232l3l232笱2l2l2l2l3引 陆地棉和毛棉种间SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位引物标记位点，Dt亚组共有425个eSSR引物标记位点，At：Dr=1：1．1。经统计表明eSSR引物均匀分布在At和Dt两个亚组中(表3．6)。表3—6不同编号的eSSRs在染色体中的分布Tahie3-6Chromosomestal毽inginformationofdifferentN0．eSSRs染色纠F／Chr．NAUHAUOtherstotalAl204024A2175224A3243O27A4137222A5477l55A6222327A7172019A8185l24A925513lA10ll5O16All4010l5lA12228232A13196227TotalinA-subgenome2956915379Dl229233D2289O37D3303O33D4236l30D5338142D6214227D7335240D8268034D917312lDlO268l35D11164l2lD12304236D13287l36TotalinD-subgenome3337814425Total62814729804At：Dt1：1．1l：1．11．1：1l：1．13．3．2gSSRs标记在陆地棉和毛棉种间遗传图谱中的定位情况在本研究所用到的3380对gSSR引物中，共有540对多态引物可用于本实验室陆地棉和毛棉F2作图群体图谱构建，产生735个多态位点。对该735个多态位点进行矛检测，得到202个偏分离位点。由425对gSSR引物产生的506个位点(包括83个偏分离位点)能够定位到遗传图谱中，其中240个定位在At亚组，266个定位在Dt亚组，At：Dt=1：1．1。 第二部分研究报告第三章陆地棉和毛棉种问SSR遗传图谱构建及其茸毛和蜜腺基因的染色体定位定位到遗传图谱中的506个gSSR位点，包括：81个BNL位点，At亚组29，Dt亚组52，At：Dt=1：1．8；23个TM位点，At亚组14，Dt亚组9，At：Dt=1．6：1；40个JESPR位点，At亚组16，Dt亚组24，At：Dt=1：1．5；116个NAU位点，At亚组38，Dt亚组78，At：Dr=1：2．1；34个C瓜位点，At亚组17，Dt亚组17，At：Dt=1：1；65个Gh位点，At亚组38，Dt亚组27，At：Dt=1．4：1；101个egr位点，At亚组65，Dt亚组36，At：Dt=1．8：1(表3．7)。表3—7不同来源的gSSRs在染色体中的分布!垡!宝i：!竺墅巴212翌宝!望竖业i堕磐堑2翌21璺!墅g型堡12竖宝鲢兰坠染色体／Chr．BNLTMJESPRNAUCIRGhcgrothersTotal3．3．3定位到棉花基因组上的偏分离位点分析本研究中，所有8488对SSR引物在F2群体中扩增共得到1800个多态位点中，经卡方检测，有506个(占总标记数28．1％)标记表现偏分离(P