不同抗螨性能东方蜜蜂obp3基因的克隆与表达变化规律的研究 63页

AnhuiAgriculturalUniversityMasterDegreeDissertationAnalysisonCloningandRulesofExpressionChangesofobp3ofApisCeranaFabriciuswithDifferentmiteResistingPropertyPostgraduateYangChenTutorProf.Lin-ShengYuSpeciality:AnimalGeneticBreedingandReproductionDirection:ProtectionandUtilizationofGeneticResourcesJune,2013Hefei,Anhui,P.R.China 摘要本文旨在分析不同抗螨特性的东方蜜蜂的obp3基因的全序列的差异以及obp3基因在不同抗螨性能东方蜜蜂中时空表达变化规律，以寻找obp3基因与蜜蜂抗螨性能的相关性，并制备东方蜜蜂OBP3多克隆抗体，为后续研究提供材料。1.根据NCBI数据库中西方蜜蜂（ApismelliferaL.）obp3（odorantbindingprotein3）基因的cDNA序列设计引物，以东方蜜蜂cDNA为模板克隆并测序获得obp3cDNA基因全序列。结果显示，东方蜜蜂蜂螨易感组和抗螨组除在192位点存在c/t（L/F）的有义突变外,在164位点存在a/g，200位点存在g/a，341位点存在g/a的无义突变；西方蜜蜂与东方蜜蜂螨组相比，前者在51-53位点存在三个碱基cag的缺失使得其编码的氨基酸缺少一个谷氨酰胺（Q），在159，161,201,217,231,234,235,318,321,348,364,367,372,374,452位点存在着a/c(I/L),a/g(I/L),a/t(M/L),g/a(G/D),a/g(M/V),c/t(Q/S),a/c(Q/S),a/g(N/D),g/a(D/N),g/a(V/T),c/g(T/S),a/g(K/R),c/g(L/V),t/c(L/V),a/c(R/S)的有义突变,体现了两者在物种上的差别。2.对不同抗螨性能东方蜜蜂obp3基因进行荧光定量PCR检测，结果表明obp3基因在抗螨组腹部与头部表达量最高，同时与螨易感组在头部与腹部的表达量差异显著，对东方蜜蜂螨易感组不同日龄obp3基因表达量的荧光定量PCR检测结果表明，抗螨组的东方蜜蜂obp3基因在头部与腹部的表达量大体趋势是随日龄增长而增加。东方蜜蜂obp3基因全序列测序结果与时空表达变化研究结果共同表明，抗螨组东方蜜蜂的obp3基因与螨易感组东方蜜蜂的obp3基因不仅在序列上有碱基突变导致的蛋白质变异，并且在obp3基因表达量上差异也很明显，这两点共同说明了obp3基因对东方蜜蜂抗螨性能有影响。3.生物信息学分析结果显示OBP3蛋白共有148个氨基酸，分子式为C766H1221N205O235S16，分子量为17575.3，理论等电点为4.94，估计半衰期为30h。OBP3蛋白属于不稳定蛋白，不稳定指数为40.94，脂肪指数为89.53，亲水指数为-0.311。OBP3蛋白没有卷曲螺旋结构，没有跨膜区。OBP3蛋白疏水性指数最大值为3.244，最小值为-2.944。OBP3蛋白属于全α型蛋白。OBP3蛋白的信号肽具体序列为MKTIVILLFTLCIVSYMQMVRCD，剪切位点位于第22-23位氨基酸。OBP3蛋白定位于分泌通路。4.本实验成功构建pET-OBP3原核表达载体，重组子pET-OBP3经酶切鉴定及测序，电泳结果表明酶切可以切出与obp3基因片段长度相等的片段，测序结果表明序列正确。将重组质粒pET-OBP3转化入大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)中进行表达，用其表达的蛋白作为抗原免疫新西兰大耳兔，获得兔抗蜜蜂OBP3抗血清，经I western-blot分析可见兔抗蜜蜂OBP3抗血清与pET-OBP3抗原发生特异性结合，表明obp3基因已在E.coli中获得表达。东方蜜蜂obp3基因多克隆抗体制备成功。关键词：东方蜜蜂；obp3基因；序列分析；生物信息学分析；原核表达载体；多克隆抗体II AbstractThisassayisaimingatanalyzingthedifferenceofthewholesequenceofobp3(odorantbindingprotein3)betweenvarroa-resistantandnon-varroa-resistantApiscerana,andsearchingforitstemporalandspatialexpressionpatternsbet-weenthetwohoneybeesamples,tofindtherelationshipbetweenobp3andt-hetraitofvarroa-resistanceinhoneybee.Finally,thepolyclonalantibodyagainstrecombinantOBP3waspreparedtoprovidematerialforfurtherresearch.1.PrimersweredesignedaccordingtocDNAsequencesofobp3ofApismelliferaL.inNCBI.ThecDNAsofApisceranaweretakenastemplatestoca-rryoutgenecloningtoobtainthewholesequenceofobp3.Thereexistedthre-enonsensemutationsofa/g,g/a,andg/aandonesensemutationofc/t(L/F)at164bp,200bp,341bpand192locirespectivelyinobp3sequencefromnon-varroa-resistantbeesandvarroa-resistantbees.a/c(I/L),a/g(I/L),a/t(M/L),g/a(G/D),a/g(M/V),c/t(Q/S),a/c(Q/S),a/g(N/D),g/a(D/N),g/a(V/T),c/g(T/S),a/g(K/R),c/g(L/V),t/c(L/V)anda/c(R/S)weredetectedbetweenApisceranaFabriciusandApismel-liferaat59,161,201,217,231,234,235,318,321,348,364,367,372,374and452bplocirespectively.AGln-absencewasdetectedinApismelliferacomparingwithApisceranaduetoabse-nceofthreeconsecutivebasesc、a、g51-53bploci.Itrevealedsequencesdifferrencesofobp3inspecies.2.RT-PCRtestshowedthattherewashighexpressioninabdomenandheadofobp3ofthevarroa-resistingbees.Meanwhile,therewassiginificantdifferenceofobp3expressionlevelbetweenthetwotissuses.Theexpressionlevelofobp3increasedinabdomenandheadwiththeagingofvarroa-resistantApiscerana.Theresultsaboverevealedthatobp3mayaffectvarroaresistanceinApiscerana.3.ResultsofbioinformaticsanalysisshowedthatOBP3has148aminoacids,andthemolecularformulaofOBP3isC766H1221N205O235S16,itsmolecularweightis17575.3,PIis4.94,estimatedhalflifeperiodis30h.OBP3isanunstableprotein,itsstabilityindex,fatindexandhydrophilicindexare40.94,89.53and-0.311,respectively.There’snocoilnortransmembranedomaininOBP3.ThemaximumhydrophobicindexofOBP3is3.244,whiletheminimumis-2.944.OBP3belongstoα-proteins.ThesignalpeptidesequenceofOBP3isMKTIVILLFTLCIVSYMQMVRCD,andthesplicesiteislocatedinthe22-23thaminoacids.OBP3mayparticipateinIII secretorypathway.4.pET-OBP3expressionvectorwassuccessfullyconstructed.Afterdigestionandsequencing,resultshowedtherecombinantpET-OBP3wasconfirmedtohaveafragmentofobp3byenzymedigestionandsequencing.TherecombinantpET-OBP3plasmidwastransformedintoE.colicellstrainRosetta(DE3)topr-oducefusionproteinpET-OBP3,whichwasusedasantiheliontoimmunetherabbitstogetthepolyclonalantibodyagainstrecombinantpET-OBP3.Thepoly-clonalantibodyagainstrecombinantpET-OBP3wasspecificallycombinedwiththeantihelionpET-OBP3revealedbywestern-blot,whichsuggestingtheexpressionofobp3inE.coli.PolyclonalantibodyagainstrecombinantOBP3ofApisceranaFabriciuswassuccessfullyprepared.Keywords：ApisceranaFabricius;obp3;sequenceanalysis;Bioinformaticsanalysis;protokaryonexpressionvector;polyclonalantibodyIV 目录文献综述.....................................................................................................................11蜜蜂的抗螨研究进展...................................................................................11.1螨的危害.......................................................................................................11.2蜜蜂抗螨机制的研究进展..............................................................................22嗅觉在抗螨机制中的作用..........................................................................33OBPs的研究进展..........................................................................................34obp3研究进展................................................................................................85荧光定量技术在基因表达规律中的应用..........................................95.1荧光定量PCR技术的原理.............................................................................95.2荧光定量PCR技术的种类.............................................................................95.3定量方法....................................................................................................105.4荧光定量PCR技术在其它昆虫及蜜蜂研究中的应用...................................106原核表达载体与多克隆抗体概述.........................................................116.1原核表达载体调控原件................................................................................116.2原核表达载体构建......................................................................................126.3多克隆抗体技术.........................................................................................127本研究的目的与意义................................................................................14引言............................................................................................................................151材料与方法..........................................................................................................161.1主要试剂的配制.......................................................................................161.2实验材料.....................................................................................................171.2.1试验动物..................................................................................................171.2.2蜜蜂解剖..................................................................................................171.2.3试剂.........................................................................................................171.3实验方法.....................................................................................................181.3.1总RNA抽提............................................................................................181.3.2cDNA的合成...........................................................................................191.3.3DNA片段的克隆测序...............................................................................191.3.4实时荧光定量PCR...................................................................................211.3.5东方蜜蜂OBP3蛋白生物信息学分析........................................................231.3.6东方蜜蜂obp3多克隆抗体的制备.............................................................23V 2结果与分析.......................................................................................................262.1总RNA的提取与检测...........................................................................262.2东方蜜蜂obp3基因克隆......................................................................262.3不同昆虫obp3基因系统进化树的构建...........................................292.4东方蜜蜂obp3基因mRNA时空表达水平的变化...................302.5生物信息学分析结果.............................................................................342.5.1蛋白质理化性质分析................................................................................342.5.2卷曲螺旋分析..........................................................................................342.5.3跨膜区分析..............................................................................................352.5.4氨基酸疏水性分析...................................................................................352.5.5蛋白质二级结构预测................................................................................362.5.6蛋白质三级结构预测................................................................................362.5.7信号肽预测..............................................................................................372.5.8亚细胞定位..............................................................................................382.6原核表达载体pET-OBP3的酶切鉴定及测序................................392.7Westernblot结果......................................................................................403讨论........................................................................................................................413.1实验材料的选择.......................................................................................413.2obp3基因克隆结果分析讨论...............................................................413.3obp3表达规律...........................................................................................423.4多抗方法.....................................................................................................434结论.........................................................................................................................45参考文献...................................................................................................................46致谢.............................................................................................................................51作者简介...................................................................................................................52研究生阶段发表文章............................................................................................53VI 缩略词（Abbreviation）英文缩写英文全称中文名称obp3Odorant-bindingprotein3气味结合蛋白3CSPsChemosensoryproteins化学感受蛋白家族TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氮基甲烷IgGGimmunoglobulinG免疫球蛋白Gβ-actinBeta-actinβ-肌动蛋白ElisaEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定AmpAmpicillin氨苄西林pHPotentialofhydrogen酸碱度5-Bromo-4-chloro-3-indolyl5-溴-4-氯-3-吲哚X-galβ-D-galactopyranoside-β-D-半乳糖苷异丙基硫代-β-D-半乳IPTGIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside糖苷SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳TEMEDN,N,N",N"-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸cDNAComplementaryDNA互补脱氧核糖核酸RNARibonucleicacid核糖核酸PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RT-PCRReversetranscriptionPCR反转录-聚合酶链式反应pET-OBP3recombinantpET-OBP3plasmid重组pET-OBP3质粒DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯TAETris-acetateEDTAbufferTAE缓冲液EBEthidiumbromide溴化乙锭EDTAEthylenediamine-N,N-tetraaceticacid乙二胺四乙酸DAB3,3’-diaminobenzidine二氨基联苯胺CtCyclethreshold循环阈值ODOpticaldensity吸光度实时荧光定量聚合酶RT-qPCRReal-timequantitativePCR链式反应Ⅶ 文献综述在分类学上，蜜蜂属于昆虫纲（Insecta），膜翅目(Hymenoptera)，细腰亚目（Apoerita）蜜蜂总科（Apoidae），蜜蜂科（Apidae），蜜蜂属（Apis），是重要的经济昆虫，营社会性生活，能被人类驯化饲养[1]。在中国境内，现有两个主要的蜜蜂物种：东方蜜蜂和西方蜜蜂。东方蜜蜂（Apiscerana）为东方蜜蜂的一个亚种，别名中华蜂、中蜂、土蜂，为中国所独有。2006年，东方蜜蜂被列入农业部国家级畜禽遗传资源保护品种。东方蜜蜂飞行敏捷，嗅觉灵敏[2]，对异味反应很敏感，出巢早，归巢迟，造脾能力强，喜欢新脾，爱啃旧脾；抗蜂螨和美洲幼虫腐臭病能力强，但容易感染中蜂囊状幼虫病，易受蜡螟危害；喜欢迁飞，在缺蜜或受病敌害威胁时特别容易弃巢迁居；易发生自然分蜂和盗蜂；东方蜜蜂自身具有对螨的抵抗能力，可使其蜂群与蜂王都不会收到蜂螨的危害。这种抗螨特性是世界上其它蜂种所不具备的；西方蜜蜂(Apismellifera)，为蜜蜂属中型体中等的一种，产于西方，简称西蜂。西方蜜蜂在中国自然生态系统中，在生态位上与中蜂虽然有许多重叠[3]，但其个体特性却有许多差异。西蜂的工蜂嗅觉灵敏度较低，不易发现分散、零星开花的低灌木和草本植物，也不具有抗螨特性，易受螨感染。在中国，东方蜜蜂更加适应自然环境，能为更广泛的本土植物授粉，西方蜜蜂不能完全代替东方蜜蜂生态学上的意义，中蜂养殖是蜜蜂养殖重要的组成部分，需受到重视。1蜜蜂的抗螨研究进展1.1螨的危害狄斯瓦螨是严重危害西方蜜蜂(Apismellifera)的一种体外寄生螨，是威胁世界养蜂业蜜蜂病虫害之一。狄斯瓦螨寄生于成年工蜂体表，影响工蜂的哺育采集防卫等行为；狄斯瓦螨进入巢房底部产卵，进而影响蜂群幼虫的发育；最终影响蜂群的繁殖与生产。周婷等对我国境内蜂群中的大蜂螨进行分类，我国意蜂群中寄生的大蜂螨均属于狄斯瓦螨的朝鲜基因型；中蜂群寄生的瓦螨分别属于狄斯瓦螨的越南基因型、中国基因和中国II基因型[4]。狄氏瓦螨携带与传播众多病原微生物，其中以残翅病毒研究最早最广泛。1999年博温发现瓦螨是残翅病毒(DWV)的寄主[5]，该病毒能在蜂群中大量传播，并危害巨大。陈玉等研究发现携带在瓦螨身上的残翅病毒具有潜伏性，可在蜜蜂发育的各个阶段对其产生感染，其含量在蛹期达到峰值。日本学者Chantawannakul等用定量PCR技术，第一次报道了绝大多数瓦螨可携带与传播蜜蜂克什米尔病毒(KBV)、蜜蜂急性麻痹病毒(APV)、残翅病毒(DWV)、幼蜂皱萎病毒(SBV)和黑蜂王台病毒(BQCV)N[6]。缪青等研究进一步推测了蜂螨的危害途径：它可降低蜂蛹的免疫能力，从而导致那些潜在病毒的感染。许多蜂种因为受到1 这种螨的寄生，使蜂群遭受到严重损失。蜂螨会引起蜜蜂的大量死亡，有时甚至达到百分之七八十的死亡率，以至于整个蜂群被毁灭。1.2蜜蜂抗螨机制的研究进展不同于西方蜜蜂易受螨感染，东方蜜蜂表现出极强的抗蜂螨的能力。这是因为蜂螨的原始寄主是东方蜜蜂，经过长期的自然选择，东方蜜蜂逐渐对蜂螨产生了抗性[7]，虽然在东方蜜蜂蜂群中有所寄生但东方蜜蜂绝少感染蜂螨。以往，研究者普遍认为东方蜜蜂对瓦螨的清理行为是其抗瓦螨的主要原因。其次是东方蜜蜂子的封盖期短，极少有子代螨能在其中发育成熟。近年来国际上又认为螨在东方蜜蜂工蜂蛹房中的不育性或很少产卵是其抗螨性中最值得注意的因素[8]。杨冠煌等提出，中蜂蛹体铜元素含量低和前蛹期保幼激素含量高使中蜂工蜂蛹房中的意蜂瓦螨卵滞育也是中蜂抗瓦螨的原因[9]。还有一些学者认为，狄斯瓦螨在东方蜜蜂工蜂蛹房中的不育性是由其遗传学上的基因型差异所决定的。因此，笼统地认为中蜂工蜂子具有某些抑制瓦螨正常繁育的生理特性是中蜂抗螨的原因，这是不确切的。东方蜜蜂（包括东方蜜蜂）的抗螨行为包括下列3个方面。1对成年蜂体寄生螨的清扫行为（groomingbehavior）；2对螨寄生的幼虫房不予封盖和清除幼虫；3“埋葬”雄蜂房中的寄生螨。上述行为可统称为卫生学特性（hygienictraits）[10]。科学家曾观察过将西蜂瓦螨接种到中蜂工蜂刚封盖的房中并置于蜂群内，几天后有82%以上的幼虫因螨寄生而被清理掉，这也许是因螨体携带的西方蜜蜂表皮碳氢化合物，或其行为和生理特性上的某种“信号”，使中蜂极易发现和清除它们。在蜜蜂抗螨性能的基因研究方面，已进行了大量实验。杨喻晓等研制成功的首张中蜂头部cDNA芯片[11]，该芯片含有717个有效EST探针，包含了中蜂头部的cDNA基本信息。该基因芯片可用于不同蜜蜂种类、不同品系和不同试验样本间的头部基因表达谱差异检测，并对表达谱变化进行全面、系统了解，功能基因挖掘.目前已将该芯片应用于中蜂抗螨性检测和蜜蜂种质评价等相关研究探索。库珀博士对感染螨与未感染螨的蜜蜂的基因组进行了高通量测序[12]，对比结果显示，两者在32条基因上的不同与是否感染了螨有关，而116条基因的不同则与两组蜜蜂本身基因组的不同相关，2条基因的不同与上述两者皆相关。螨的寄生导致调控胚胎发育、细胞新陈代谢与免疫的基因的表达变化。来自4个种群的两组（抗螨与非抗螨）幼虫的32条基因比较结果表明，15条基因(47%)的cDNA上调作用显著，17条基因(53%)的下调作用显著。差异幅度均不大。有一个特例是EST(BB160020A20G03)，在被蜂螨感染的蜜蜂中有20重叠的过度表达。查阅BLAST发现这条EST与残翅病毒(AY292384)吻合[13]。对蜜蜂的基因研究表明，cDNAs的表达随基因型变化，47(40.5%)上调，69(59.5%)下调。Dlic2在不抗螨蜂中下调，在抗螨蜂中上调。Strn-Mlck在两种蜂中都下调。该研究结果表明，2 在抗螨与非抗螨蜜蜂中存在基因差异。对东方蜜蜂抗螨机制的研究将有助于解开蜜蜂抗螨的真正原因，为在养蜂生产上控制蜂螨的危害寻求一条新的路径[14]。2嗅觉在抗螨机制中的作用昆虫具有特殊的嗅觉系统，用来感知外界环境中的气味信号，当气味分子与嗅觉神经元上的受体结合后产生一系列的化学信号，并将其传递到被激活的大脑中枢神经元中，从而对气味做出判断，并进一步调节昆虫相应的行为，如觅食、交配、产卵、同族识别及躲避敌害等[15]。蜜蜂对蜂螨的抗性主要由调控神经发育、神经敏感度以及嗅觉的基因的表达差异来实现。存在于嗅觉和对刺激的敏感度的差异是蜜蜂的两个抗螨的重要指标。存在于嗅觉中的差异可能与清洁行为有关[16]。研究表明东方蜜蜂与其它蜂种相比，具有嗅觉灵敏，善于采集零星的蜜源及抗螨能力强等特点。这种敏锐的嗅觉及特殊的抗螨排异性行为与其发达的化学感受系统密切相关。LeConte对选育的高度抗螨的意大利蜂与普通不抗螨的意蜂脑部基因转录本进行分析，发现在高度抗螨意蜂中表现出同伴照顾行为与抗螨行为的相关性，猜测可能均与嗅觉有关。Navajas等的研究表明，行为比免疫系统的差异，更决定着蜜蜂的抗螨性状差异。蜜蜂对螨的清洁行为与卫生行为是抗螨的两大主要因素，Tsuruda等做了螨侵染实验，发现未表现出对螨有卫生行为及清洁行为的蜜蜂与表现出这些行为的蜜蜂相比，与嗅觉有关的基因的表达量下降[17][18]。大量研究表明清洁行为在嗅觉敏感性强的蜜蜂中表现的更强，从而更易发觉不正常幼虫的气味，即使幼虫气味的刺激信号比较微弱也能被识别出，并将其清除。因此，蜜蜂嗅觉敏感性差异可导致蜜蜂清洁及梳理行为的差异，从而导致抗螨性状的差异[19][20]。3OBPs的研究进展昆虫的嗅觉系统高度灵敏，能准确感受外界环境中气味物质的细微变化。气味结合蛋白(odorantbindingproteins，OBPs)与挥发性的小分子气味物质发生生化反应是昆虫专一性地识别气味的第一步，对昆虫与外界信息交流具有重要意义。人们对昆虫气味结合蛋白的研究是在20世纪80年代初随动物学家研究人的嗅觉感受阀值时才逐步兴起的[21]。气味结合蛋白OBPs序列中包含6个保守的半耽氨酸残基，存在于嗅觉感受器(主要为昆虫触角)内部的胞外空间的淋巴液内，作用即是结合并运送脂溶性的气味分子通过水性的淋巴液到达嗅觉神经元树突，并通过树突膜上存在的嗅觉受体，即具有七螺旋跨膜结构的G蛋白耦联受体(GPCR），引发第二信使介导的级联反应[22]。动物对大量气味化合物的识别和区分是由气味受体神经元调节的[23]。在许多陆生生物中，如哺乳动物和昆虫，化学感受神经元是由一层起保护作用防止其挥发的3 液体环境（主要是脂质细胞）包裹。因此，许多空气传播分子，如疏水气味分子及信息素必须首先由一种可以促进这些分子向嗅觉受体(OR)运输的特化蛋白识别[24]。现在广泛接受这种观点：在昆虫和哺乳动物中，这种功能是由气味结合蛋白(OBPs)提供。除了名字相同，作用相似，昆虫的OBPs与哺乳动物的OBPs表现出系统发生学上的不相干性[25]。昆虫的OBPs是小的水溶性分子，在嗅觉感受器和味觉感受器中以及在其它分化的组织中均表达[26]。线虫与哺乳动物拥有极大数量(~1000)的G蛋白偶联嗅觉受体（Gprotein-coupledORs），但OBPs很少(哺乳动物中有5种，线虫没有)。在这些动物中，嗅觉识别似乎完全建立在ORs的综合作用上，而OBPs即使存在，也仅仅作为普通载体运作[27]。相反地，昆虫拥有更少的ORs(果蝇与冈亚按蚊中大约有7种)以及更丰富的OBPs(这两种双翅目昆虫中都有超过50种)。一些研究揭示不同气味分子和信息素与不同OBPs之间的特定关联[28]；.研究发现除了在嗅觉响应及化学感受神经元的活动中扮演重要角色，OBPs同样可以在气味识别中作为选择性滤器工作[29]，甚至以使气味分子失活的方式参与信号终止工作[30]。这一观点已在最近一项关于果蝇的OBP7的研究中得到支持，该研究表明这一蛋白直接参与到信息素的信号转导中[31]。在昆虫的化学感受机制中，两类化学通讯蛋白在昆虫感受器外围发挥着重要的作用。其中一类称为气味结合蛋白(odorant-bindingproteins，OBPs)，另一类称为化学感受蛋白(chemosensoryproteins，CSPs)，两者存在于不同的化学感受器的淋巴液内，执行着各自的生理功能。两类化学通讯蛋白在气味分子的感受及识别中发挥着重要作用，尽管不同的CSPs功能各异，但是它主要参与异味等化学刺激的感受；而OBPs特异的表达在嗅觉感器中，在气味分子及信息素的嗅觉识别中发挥着作用[32]。Anne等研究了蛾类性信息素信号传递过程，发现OBPs可以结合外界环境中的气味分子，开始蛾类与外界进行化学信息交流的第一步[33]。研究表明，OBP可以根据其结合配体的类型分为信息素结合蛋白(pheromonebindingprotein，PBP)及普通气味结合蛋白(generalodorantbindingprotein，GOBP)。其中PBPs主要参与性信息素的识别；而GOBP在雌性昆虫的触角中含量丰富，参与气味分子的识别[34]。通过研究南方家蚊的嗅觉相关基因表明昆虫嗅觉相关基因有以下几类：气味结合蛋白(OBPs)，加C气味结合蛋白(‘plus-C’OBPs)，化学感受蛋白(CSPs)以及感受神经元膜蛋白(SNMPs)[35]。近期的研究揭示了昆虫OBPs的进化过程。OBPs在结构上的特殊标志表明其高度保守，并且为昆虫所特有[36]。在昆虫OBP家族内部，OBP基因是随种族发展而进化的，或家族特异性进化，其可能与适应自然环境的积极变化有关。这项研究说明OBPs在昆虫广泛的生存环境和各异生活方式中的适应性中扮演重要角色，其4 中之一就是嗅觉。检索NCBI数据库,对昆虫气味结合蛋白基因进行搜索,结果检测出54种昆虫130多条OBPs核苷酸序列。这些昆虫分布于7目20科,主要集中在鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、半翅目。研究发现OBPs主要存在于昆虫的触角之中,Thymianou等1998年报道在地中海实蝇血淋巴中也存在OBPs[37]；Paesen等在黄粉甲雄性附腺找到OBPs[38]；Tuccini等在Carausiusmorasus的触角和跗足中均发现了OBPs[39]；Ozski等也在伏蝇的触角和味觉感受器中同时发现了OBP[40]。研究发现OBPs在昆虫触角化学感器内特异并大量的表达，毫无疑问地表明它与气味识别必定有关[41]。Steinbrecht对于OBPs功能的各种假说做了一下总结[42]，认为OBPs可能具有以下几种功能：1.在水性淋巴液中助溶和运输疏水性气味分子；2.气味识别中通过选择性地结合某些气味分子而起着外周滤器的作用；3.使刺激分子通过特殊途径到达受体蛋白，使信号更易于传导；4.能清除外周感器中不需要或有毒的物质；5.使刺激受体后的气味分子失活。现代科学实验表明，OBPs在昆虫中主要起到嗅觉识别和气味分子区分的作用。昆虫显著的嗅觉能力被认为是由两大蛋白家族的联合作用产生的，即G蛋白偶联嗅觉受体(Gprotein-coupledolfactoryreceptors，ORs)与气味结合蛋白(odorantbindingproteinsOBPs)[43]。在嗅觉感受器中，OBPs运送疏水分子给ORs，但OBPs与ORs在非嗅觉组织中的表达揭示了它们也可在其它发育和生理过程中作为常规载体运作。家蚕具有与其它昆虫相似的OBPs家族，其表达谱显示许多OBPs可能作用于嗅觉与味觉，并可能同样作为常规载体运作。OBP基因亚家族的扩展和序列的不同暗示家蚕OBP家族同时具有功能多样性与功能的局限性[44]。Bath研究发现在昆虫中，多种OBPs都在不同程度上参与嗅觉识别，并且发现OBPs都在嗅觉器官中高丰度表达[45]。Liu对果蝇的研究直接将部分嗅觉神经元的信息素介导的行为与依赖OBPs的生命活动联系起来。与其它昆虫比较结果显示，蜜蜂具有最小的OBPs家族，仅仅21种OBPs。这个数据与冈亚疟蚊（Anophelesgambiae）中超过70种OBPs与果蝇（Drosophilamelanogaster）中超过51种OBPs形成鲜明对比[46]。在蜜蜂中，就像在这两个双翅目昆虫中，这些obps基因排列成簇。研究证实obps结构的进化过程经历了频繁的内含子丢失[47]。蜜蜂中仅有9种OBPs是触角特异性的，其它的OBPs的表达或普遍存在，或在高度分化的组织中或生理过程中被调控。该发现支持了这一观点，即：OBPs的作用并非严格限制在嗅觉功能中，而是可能参与到更广泛的生理功能中去。嗅觉在昆虫一生的各个方面都发挥着重要作用。在高度社会化的物种中，如蜜蜂，嗅觉不仅仅用于识别多种空气传播分子，而是为蜂巢中的蜂群中50,000个个体5 间提供一个用以支持内部联系的感受网络[48]。在这种情形下，感知一些信息素混合物及获得同类识别信号的能力是极其重要的。触角是蜜蜂的嗅觉器官，蜜蜂能够感受到的气味物质多为脂溶性小分子化合物，这些气味物质通过扩散的方式穿过触角上皮细胞之间的孔道到达嗅觉感受器的淋巴液中，但这些脂溶性物质不能直接通过淋巴液的液体环境，触角中的气味结合蛋白在气味物质的传递过程中起着重要的作用[49]。气味结合蛋白是一类低分子质量的水溶性球状蛋白，由120～150个氨基酸残基组成，其主要功能是运输脂溶性的气味物质，通过嗅觉淋巴液到达神经树突膜上的受体，从而使蜜蜂产生嗅觉。目前，张小辉等已经成功克隆出多种昆虫的气味结合蛋白[50]。研究利用PCR方法克隆了东方蜜蜂气味结合蛋白5，9，11，12(OBP5、OBP9、OBP11、OBP12)的基因组序列并进行了多种生物信息学分析，为进一步研究东方蜜蜂敏锐嗅觉的产生机制提供依据。在膜翅目意大利蜜蜂中，目前仅发现了ASP1，ASP2，ASP4(AAL60417)，ASP5(AAL60422)，ASP6(AAL6o421)等五个OBPs。蜜蜂OBPs大小比较一致为15到18kDa，均在5’端观测有信号肽。目前在蜜蜂中所发现的主要的obps一般归簇于第9号染色体并在嗅觉组织中表达。然而这些obps并不完全在同一个调控因子的控制之下，因为该簇中的核心基因obp3，十分不同于其它昆虫，并不在触角表达而在其它器官中表达[51]。根据施沃茨的研究成果，西方蜜蜂的OBP家族及其表达方式都已明确。西方蜜蜂OBP家族共有21个成员，OBP1-OBP21。OBP家族进化树见图1。西方蜜蜂OBPs，与其它昆虫OBPs类似，很可能大量存在于嗅觉感受器内部的淋巴液中，能特异性地结合性信息素分子，溶解、运载其穿过亲水性淋巴液，到达嗅觉神经元受体(olfactoryreceptorneurons，ORNs)，产生嗅觉电位，引发昆虫的行为反应。Obps存在三种表达形式：(1)有些obps在成年蜜蜂的触角内特异性表达(obp1，6 图1西方蜜蜂OPBs家族进化树Fig.1FamilytreeofOBPsofApismelliferaobp2，obp4，obp5，obp6，obp8，obp11，obp15以及obp12)。这些基因在头部和腿部的信号都很弱。在雄蜂中，obp11不表达。(2)第二类表达方式：有些obps在成年蜜蜂身体各部位均表达(obp3，obp16，obp17，obp18，obp19/obp20以及obp21)。这类OBPs在表皮组织中表达量较高。大多数这类OBPs表达于羽化前的大龄蛹期。(3)最后一类obps表达于相对来说分化程度较低的阶段。在蜂王卵巢与早期胚胎时期检测到obp9的表达。类似地，obp7的表达也在蜂王卵巢中检测到obp14及obp15在幼虫期表达，并在蛹期消失。obp10出现在蛹期，并在新出房蜜蜂的脑部达到表达量最高水平[52]。近几年，东方蜜蜂气味结合蛋白类基因已经相继得到克隆，并且该类基因在不同时空及组织中的分布也基本明确[53]。孟飞等利用实时荧光定量PCR技术，发现气味结合蛋白在东方蜜蜂内勤蜂及采集蜂的排异和觅食过程中可能发挥着重要作用。研究表明，OBPs基因参与到蜂巢内异常气味分子的识别和清理，与东方蜜蜂优越的蜜源搜集能力及抗螨排异行为的分子机理有重要的关系。最近，东方蜜蜂化学感受蛋白Acer-CSP1基因的克隆及表达分析也证明了该类基因在东方蜜蜂排异及抗螨过程中的重要性[54]。4obp3研究进展obp3广泛存在于植物、哺乳类动物与各类昆虫中，参与重要生命过程的调控与特点气味分子识别。Kang等发现obp3的过量表达会导致拟南芥等植物的生长损伤，甚至死亡，这为证实obp3基因在生长发育过程中具有重要作用提供了证据[55]。Foley在前人研究的基础上通过洋葱SSH实验发现被obp3基因直接影响跟随其上调和下调基因为orgs（obp3-responsive-genes），其中org1，org2与org3这三个基因均密切参与生理活动，org1和org3还作为转录子运作。这间接表明了obp3基因对生命过程有重要影响[56]。Lobel.D等研究表明，一个类型的气味分子只对应与一种OBP蛋白发生特异性识别，然而对小鼠的研究发现，由于OBP分子某些化学架构的改变，OBP3可与OBP1发生一定程度的折叠，从而使两者识别的气味分子类型都拓宽了[58]。Ko，KJ做了一个很有意义的实验：将大鼠的obp3基因插入哺乳动物表达载体pc-DNA3，并由HEK293细胞分泌。分泌的OBP3蛋白使一种疏水性气味分子（octanal）的可溶性极大提高，而这种分子就是大鼠气味受体17所特定接受的，同时OBP3蛋白也与大鼠气味受体17进行绑定，导致细胞内octanal的信号强度极大提高。这个实验表明OBP3蛋白可以提高基于嗅觉受体的生物感受器的敏感度[59]。Stopkova等发现在仓鼠的性活动中，OBP2与OBP3都扮演了重要角色，与气味识别和接收参与体外信息交换的费洛蒙（在昆虫中则成为信息素）有关，并在仓鼠的7 唾液和尿液中都检测到了该分子[60]。Ward，JM研究发现OBP3在昆虫的信号传播通路中起到调控作用，并在新陈代谢活动中作为抑制剂出现[61]。Pelosi.P克隆了豌豆蚜与另外三种蚜属昆虫的4条obps（obp1，obp3，obp5和obp8）基因，在对比了其它昆虫的obps后，发现有很大不同。大多数昆虫的obps都是十分保守的，同属不同种昆虫间obps的差异极小，但蚜属昆虫之间obps序列差异巨大，只有31%的同源性。配合基结合实验证明蚜虫的OBP1，OBP3与OBP8在生命活动中发挥的重要作用有很大的相似性，并且这三个气味结合蛋白所对应的气味分子也有很大程度重叠。值得一提的是，(E)-beta-farnesene（一种警告信息素）及其相关的化合物法尼醇可被OBP3很好地进行特异性识别，而其它OBPs则没有这种作用。因此，Pelosi.P提出OBP3可以调节蚜虫对警告信息素的应答。Yu，F研究了蝗虫的obp3基因，发现与别的obps相比，obp3多了三个半胱氨酸结构。在蝗虫中，OBP3与OBP2所对应识别的有机化合物是相似的[62]。Lee，SH等发现猪的OBP2与OBP3同样可以使气味分子的可溶性提高，但提高的效率不同[63]。Sophie等对悬铃木方翅网蝽的obp2与obp3进行了cDNA克隆与测序，结果表明这两个基因都与Apisobp3（蜂属obp3）同源性很高（95.8%和98.32%）。并且，悬铃木方翅网蝽的OBP3对(E)-beta-farnesene（一种警告信息素）具有很好的识别作用，甚至可以识别其它物种释放的(E)-beta-farnesene[64]。DeBiasio，F等研究发现在蚜虫属中，同族识别能力强的种类都使用OBP3作为识别异己的气味分子的绑定者，而没有良好同族识别能力的种类则用其它的气味分子识别途径[65]。Hua，JF研究了绿盲蝽，并建立了cDNA文库，扩增出三种obps与一种csp（obp3，obp4，obp6与csp1），并运用荧光定量技术发现其主要在触角、嗅觉器官和腿部，暗示可能与嗅觉和味觉作用有关。而通过配合基结合实验则发现OBP3分子在绿盲蝽中与味觉的相关作用大于嗅觉[66]。Zhang，SG运用电镜扫描技术对桃蚜的obp3基因在触角的染色体上进行了定位，并在触角的染色体上发现了嗅觉感受器，说明这二者在地理位置上具有密切联系[68]。LeConte对意大利蜂的实验发现抗螨与不抗螨的意蜂obp3基因表达量差异显著[69]。据研究，obp3在昆虫中十分保守，obp3的出现早于昆虫纲向不同目的分散进化[70]。YiZhang对东方蜜蜂及西方蜜蜂的幼虫进行感染螨的实验，中蜂未受感染，而西蜂感染明显，结果表明，与信号转导通路相关的基因均上调了，并进行SSH检测发现obp3是与气味感受器相关的基因，在该实验中上调，但在感染螨的西方蜜蜂中下调[71]。西方蜜蜂已成功克隆出了obp3mRNA序列的全长，共459bp。西方蜜蜂obp3基因位于第9号染色体上，上下游端分别有obps家族的另外两个基因obp7与obp4与其相邻。8 5荧光定量技术在基因表达规律中的应用5.1荧光定量PCR技术的原理所谓荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与常规PCR不同的是，荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃[72]。5.2荧光定量PCR技术的种类目前荧光定量PCR技术所使用的荧光化学方法按照荧光产生的原理可分为两大类：即非特异性DNA结合染料法和探针法。5.2.1非特异性DNA结合染料法染料法是在常规PCR反应体系中加入了染料分子，染料具有与DNA双链特异性结合的特点，当它与DNA双链结合时才能在激发光源的照射发出荧光。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，两者结合后被激发出荧光信号。而不掺入链中的染料不会被激发出任何荧光信号。在反应体系中，其信号强度即代表了双链DNA分子的数量。染料法中染料分子dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性。采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增，因此该方法不能应用于多重荧光定量PCR技术（在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况），使定量结果不可靠。因此，其特异性不如探针法，但它可用融解曲线分析区分特异性和非特异性扩增。引物的设计和反应条件的优化对消除非特异性荧光都有很大帮助。研究中常用染料有SYBRGreenⅠ、SYBRGold，EthidiumBromide、溴化乙锭、YO-PRO、YOYO，其中以SYBRGreenⅠ染料应用最广泛。5.2.2探针法探针法荧光定量PCR具有扩增序列特异性的特点。该方法与常规PCR的不同之处在于在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计，因此只能与待检测序列结合。与染料法相比提高了试验的准确性。目前市场上的探针主要种类有Taqman、分子信标(MolecularBeacon)和杂交探针(hybridizationprobe)等，其中以Taqman探针应用最广泛。Taqman技术是PE-ABI公司开发的荧光定量技术[73]，也称为水解寡核苷酸探针。在荧光定量PCR技术反应体系中，除普通PCR所设计的两条引物外，还有1条或2条荧光标记的基因探针。Taqman探针的优点是可以利用多种荧光同时进行多重分析，这是SYBR等DNA结合荧光染料所不具备的优点。5.3定量方法在RT-qPCR中，模板定量有两种策略:相对定量和绝对定量。相对定量指的是9 在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用己知的标准曲线来推算未知的样本的量。相对定量分为标准曲线法的相对定量和比较CT法的相对定量。绝对定量则是基于标准曲线法的绝对定量方法，此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可知的。5.4荧光定量PCR技术在其它昆虫及蜜蜂研究中的应用目前实时荧光定量PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域[74]，在昆虫中也已被普遍应用。李强利用荧光定量PCR技术研究了昆虫肠道芽孢杆菌的绿色荧光蛋白标记及其表达特性[75]。乔鲁芹等建立了美国白蛾Hyphantriacunea核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法，该方法可广泛应用于昆虫核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus)的定量检测[76]。郭庆等应用荧光定量PCR技术的绝对定量方法检测受害土壤中葡萄根瘤蚜含量，研究表明即使将0.25g仅含10头葡萄根瘤蚜的土壤稀释103倍后进行葡萄根瘤蚜的DNA含量检测，检测结果仍为阳性，说明荧光定量PCR技术灵敏并且特异性极强[77]。张清平等运用实时荧光定量PCR技术检测感病蝗虫体内绿僵菌rDNA基因，完成了早期定量检测东亚飞蝗体内病原真菌的数量，确定病原真菌在东亚飞蝗体内的增殖速率和动态变化的方法建立，对于昆虫病原真菌的致病机理研究、真菌生防制剂配方优化都具有重要意义。廖珍等采用实时荧光定量PCR分析家蚕Piwi亚家族蛋白在不同发育阶段和不同组织(头、马氏管、丝腺、消化道、精巢和卵巢)中的表达情况，发现家蚕两个Piwi亚家族蛋白在头部的表达量都相对较高，siwi2基因在头部的表达甚至略高于精巢和卵巢；并利用实时荧光定量PCR分析了Am-aub和Am-ago3在不同蜂型(工蜂、蜂王和雄蜂)中的表达谱，发现两个Piwi基因在雄蜂中的表达量都显著高于工蜂和蜂王，而蜂王和工蜂的表达差异不显著[78]。肖培新等应用实时荧光定量PCR技术揭示了意大利工蜂不同发育时期抗氧化酶基因mRNA表达量的变化，这一研究结果在分子水平上揭示了抗氧化酶基因在蜜蜂不同发育时期的作用[79]。赵柏林在2007年建立了利用实时荧光定量PCR技术检测蜜蜂白垩病的方法，通过敏感性试验、特异性试验和重复性试验表明所建立的PCR方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性，可用于快速诊断白奎病，尤其混合感染的鉴别诊断更为有效[80]。前人研究表明PCR检测方法具有快速、敏感性高、特异性强等优点，不仅可用于快速诊断蜜蜂传染病，且适用于被其污染的蜂产品中的病原的快速检测[81]。通过研制PCR及荧光定量PCR方法可对蜜蜂传染病作出快速准确诊断，正确指导用药，做到早诊断，早治疗，避免盲目用药造成兽药残留超标，在今后蜜蜂研究中具有广阔的应用前景。6原核表达载体与多克隆抗体概述原核表达载体是指能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行表达的载10 体。6.1原核表达载体调控原件6.1.1启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)、lPL(l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。6.1.2SD序列1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10bp处的由3～9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16SrRNA3¢末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。6.1.3终止子在一个基因的3¢末端或是一个操纵子的3"末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrB核糖体RNA的转录终止子。6.2原核表达载体构建6.2.1获得目的基因（1）通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。（2）通过RT-PCR方法：提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。6.2.2构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。（2）PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。11 6.2.3获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。6.3多克隆抗体技术抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；同样一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五类抗体。6.3.1免疫动物供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。抗原是多种多样的，而且千差万别。就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等。对免疫动物注射的Ig纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。6.3.2佐剂的应用对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答[82]。佐剂的类型目前实践中常应用的佐剂有氢氧化铝胶、明矾、弗氏佐剂、脂质体和石蜡油等。也有采用结合杆菌等分枝杆菌、白喉杆菌以及细小棒状杆菌等。乳化将抗原与佐剂混合的过程称为乳化。乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现。免疫方法：根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔时间等。12 免疫途径包括皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射、腹腔注射以及淋巴结内注射等。抗原量少，则一般多采用加佐剂，淋巴结内或淋巴结周围、或足掌、或皮内、皮下多点注射，如抗原量多，则可采用皮下、肌肉、以至静脉注射[83]。注射间隔时间：带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔2～4周免疫一次。不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为1～2周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可5天左右的间隔时间。可以把各种注射途径联合起来应用，最终以达到效价要求为目的。6.3.3抗体的鉴定抗体的效价鉴定。不管是用于诊断还是用于治疗，制备抗体的目的都是要求较高效价。不同的抗原制备的抗体，要求的效价不一。鉴定效价的方法很多，包括有试管凝集反应、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等。常用的抗原所制备的抗体一般都有约成的鉴定效价的方法，以资比较。如制备抗抗体的效价，一般就采用琼脂扩散试验来鉴定。抗体的特异性鉴定。抗体的特异性是指与相应抗原或近似抗原物质的识别能力。抗体的特异性高，它的识别能力就强。抗体的亲和力。是指抗体和抗原结合的牢固程度。亲和力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原决定簇之间立体构型的合适度决定的。有助于维持抗原抗体复合物稳定的分子间力有氢键、疏水键、侧链相反电荷基因的库仑力、范德华力和空间斥力。亲和力常以亲和常数K表示，K的单位是L/mol，通常K的范围在108～1010/mol，也有多达1014/mol。抗体亲和力的测定对抗体的筛选，确定抗体的用途，验证抗体的均一性等均有重要意义。6.3.4抗血清的冻存抗血清收获后，加1/万硫柳汞或1/万的叠氮钠防腐，或加入等量的中性甘油，分装小瓶，置-20℃以下的低温保存，数月至数年内抗体效价无明显变化。注意避免反复冻融。也可将抗血清冷冻干燥后保存。7本研究的目的与意义东方蜜蜂与西方蜜蜂作为两个不同的物种，虽然具有很近的亲缘关系，但在生活习性上有许多不同之处。东方蜜蜂是我国特有的优良地方品种，具有飞行敏捷、嗅觉灵敏等特点，能够有效地利用种类繁多的零星蜜源，特别在抗蜂螨方面，东方蜜蜂具有极强的抗蜂螨的能力，而西方蜜蜂则很容易遭受蜂螨的危害[84]。这是因为蜂螨的原始寄主是东方蜜蜂，经过长期的自然选择，东方蜜蜂逐渐对蜂螨产生了抗性，虽然在东方蜜蜂蜂群中有所寄生但东方蜜蜂绝少感染蜂螨，而后来随着西方蜜蜂被引入亚洲，寄生于东方蜜蜂的蜂螨侵染了西方蜜蜂。如今这一病害已经扩散至除澳大利亚以外的世界各地，成为养蜂业的最主要威胁。到目前为止，抑制狄氏瓦13 螨的方法主要有化学和生物控制两大类。目前在国内主要用化学药物，如螨扑、杀螨剂、硫磺等抑制狄氏瓦螨的侵染，这些方式不仅对蜜蜂本身有所伤害，还会毒害蜂农，并使蜂产品中残留化学药物，进一步危及人类[85]。研究蜜蜂的抗螨机制，寻找抗螨基因，培育抗螨蜂种势在必行。国内外对蜂螨病的研究主要集中在生物学特性、病理学、诊断等方面，而蜜蜂抗螨基因研究的相关报道比较少，特别是对东方蜜蜂抗螨基因的研究则刚刚起步。由于东方蜜蜂和西方蜜蜂有最近的亲缘关系，同时基因水平差异也很小，但这些微小差异决定了它们在行为和生物学特性等方面的差异。基于东方蜜蜂对螨的自发性清洁行为，本实验在影响嗅觉的基因家族中寻找可能直接导致抗螨行为的基因。根据前人研究成果，本实验选择obp3作为抗螨性状相关基因进行研究。并将抗螨与不抗螨的东方蜜蜂obp3基因序列进行比对，以研究两者obp3基因序列上的差别,以证实不同抗螨性状东方蜜蜂的obp3基因存在差别，并进行不同抗螨性状东方蜜蜂不同组织与不同日龄obp3基因荧光定量实验研究，以发现不同抗螨性状东方蜜蜂各组织间obp3基因含量差别，并研究了obp3基因含量随东方蜜蜂日龄变化的规律。引言蜜蜂具有丰富的社会行为、复杂的信息传递功能和顽强的抵抗力，被作为一种模式生物，2006年西方蜜蜂基因组测序宣告完成，蜜蜂研究进入了后基因组时代，使得我们有可能在分子层面研究蜜蜂的外在生物学特性的分子基础，研究它们表达、调控的分子机理[86]。狄斯瓦螨(Varroadestructor)是分布最广、危害最严重的蜜蜂寄生性病害之一，给养蜂生产造成了严重的损失。抗螨蜂种的培育是最为理想的解决方法，已成为国内外众多科研机构的研究目标。据研究抗螨蜂种的抗螨行为由某些抗螨基因控制，表达为一系列对螨的清洁行为，行为学研究表明，东方蜜蜂之所以能抗螨，其一个重要的机理就是东方蜜蜂能咬开封房盖，清理出被蜂螨感染的幼虫；同时通过快速摆动腹部甩掉或用足钩掉体表的蜂螨，还可以跳一种特殊的舞蹈要求同伴帮助清理寄生在并胸腹节和翅膀基部的蜂螨。东方蜜蜂对蜂螨的气味非常敏感，当人为在东方蜜蜂群里引入受蜂螨感染的西方蜜蜂幼虫脾后，东方蜜蜂便表现出很强的反应，它们咬开有蜂螨的房盖，拖出被14 蜂螨感染的幼虫，并自动攻击蜂螨。这一系列的卫生与清洁行为保证了寄生于东方蜜蜂的蜂螨并未对东方蜜蜂产生危害。已有报道东方蜜蜂的气味结合蛋白Apisobp3与嗅觉相关，因此obp3被认为是东方蜜蜂抗螨有关的气味结合蛋白。选择obp基因作为目的基因，对obp3基因的全序列进行分析，以寻找出蜂螨易感的东方蜜蜂与蜂螨不感的东方蜜蜂基因之间的差异，从而为进一步研究东方蜜蜂抗螨的分子机理和为抗螨蜂种的育种提供基础。利用荧光定量PCR技术检测OBP3基因在不同抗螨性能蜜蜂种群的时空表达规律，进一步研究obp3基因的表达量对蜜蜂抗螨性能的影响，结合obp3基因cDNA全序列测定结果，为证明obp3基因是影响蜜蜂抗螨性能的关键基因寻求证据。构建pET-OBP3原核表达载体，成功免疫新西兰大耳兔获得obp3多克隆抗体，为更深入研究蜜蜂obp3基因，进一步探讨重组pET-OBP3的生物学功能奠定坚实基础。1材料与方法1.1主要试剂的配制（1）LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加入蒸馏水800mL用5MNaOH调pH至7.4，然后定容至1000mL,121℃高压灭菌20分钟；（2）LB固体培养基：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaCl5g,琼脂粉7.5g加400mL蒸馏水，5MNaOH调pH至7.4，然后定容至500mL，121℃高压灭菌20分钟；（3）0.1mol/LCaCl2溶液：CaCl21.11g溶于100mL蒸馏水中，过滤除菌，分装，-20℃保存；（4）Amp贮存液：按100mg/mL比例将Amp粉剂溶于蒸馏水中，过滤除菌，分装，-20℃保存；（5）Amp/LB液体培养基：在LB液体培养基中，按照终浓度50μg/mL加入Amp贮存液；（6）Amp/LB固体培养基：高压后的LB固体培养基，冷却至50℃左右，加Amp至终浓度50μg/mL，浇制平板；（7）溶液Ⅰ：葡萄糖4.5g，Tris-cl1.51g，EDTA1.86g，加蒸馏水溶解，定容至500mL，15 浓HCl/NAOH调pH至8.0,高压灭菌，4℃保存；（8）溶液Ⅱ：NaOH4g，加蒸馏水溶解，定容至250mL，配制成0.4MNAOH；SDS5g，加蒸馏水溶解，定容至250mL，配制成0.4MSDS；0.2MNAOH和1%SDS1：1混合，现配现用；（9）溶液Ⅲ：乙酸钾147.2g，溶于300mL水中，冰乙酸57.5mL，加蒸馏水定容至500mL，调pH至5.4，4℃保存；（10）0.1%DEPC处理水：取1mLDEPC溶于1000mL超纯水中，37℃孵育12h，高压灭菌，4℃保存；（11）1MTris缓冲液（pH8.0）：800mLddH2O中加入121.1gTris碱，HCl调节pH至8.0定容至1000mL，分装后高压灭菌；（12）0.5MEDTA（pH8.0）：800mLddH2O中加入186.1gEDTA-Na·2H2O，NAOH调pH至8.0,定容至1000mL，分装后高压灭菌；（13）X-gal：用二甲基甲酰胺溶解X-gal配成20mg/mL的贮存液（无需过滤除菌），避光-20℃保存；（13）IPTG水溶液：1gIPTG溶于5mL双蒸水中，过滤除菌，分装成1mL小份贮存于-20℃；（14）5×SDS-PAGE缓冲液：分别称取Tris15.1g，Glycine94g，SDS5.0g放入烧杯中，倒入800mL的蒸馏水搅拌均匀，然后用容量瓶定容至1000mL；（15）SDS-PAGE所用分离胶与浓缩胶，具体配方见表1-1；（16）电转缓冲液：分别称取Tris5.8g，Glycine2.9g，SDS0.37g放入烧杯中，加入600mL的蒸馏水搅拌均匀，定容至800mL，然后再加入200mL的甲醇。表1-1SDS-PAGE分离胶与浓缩胶配方表Tab.1-1TheformulaofseparationgelandspacergelofSDS-PAGE分离胶(12%5ml)浓缩胶(5%2ml)ddH2O1.0mL1.4mL30%丙烯酰胺混合液Acr-Bis(29:1)2.0mL0.33mL1.5mol/LpH8.8Tris-HCl1.9mL—1.0mol/LpH6.8Tris-HCl—0.25mL10%SDS50μL20μL10%AP(过硫酸铵)50μL20μLTEMED2μL2μL16 1.2实验材料1.2.1试验动物obp3研究用东方蜜蜂（抗螨、螨易感两组，每组100只）由广东省广州市番禹石基镇的广东昆虫研究所的下属实验蜂场提供。将抗螨组东方蜜蜂巢脾取出，刷去多余蜜蜂，关注呈半透明状态即将有蜜蜂出房的工蜂房，待工蜂出房，即用水彩颜料将其标记。每天换用不同颜色颜料标记足够多的新出房蜂。至第19天，此时第一天标记的蜜蜂已达18日龄，第二天的为17日龄，依次类推，第19天当天的为0日龄，分几组（0日龄、1-4日龄、3-12日龄、13-18日龄）装于不同离心管中，保证每组数量有100只。另取封盖蛹、未封盖蛹至相当数量，分别装管。将这些样（除封盖蛹与未封盖蛹外）于液氮中处死，最大程度保存完整RNA，后保存于-70℃备用。封盖蛹与未封盖蛹直接取出提取RNA后-70℃保存备用。新西兰大耳兔2只由文渊阁公司提供。1.2.2蜜蜂解剖将液氮保存的东方蜜蜂（抗螨与螨易感两组，每组100只）取出，将其头部(带触角)与身体其余部分分离，并液氮保存，以备obp3克隆实验用。将液氮保存的东方蜜蜂（抗螨组、感染螨组）取出，按触角、头（不带触角）、胸、腹、腿五个部位分离，并分别收集，-70℃保存备用。1.2.3试剂TrizolReagent、反转录试剂盒、SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)、dNTP、TaqDNA聚合酶、DNAMarkerDL2000、DNAMarkerDL500、PCR切胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、pMD19-T与pET-28a载体均购自TaKaRa宝生物公司。cloneget试剂盒、NheI酶、自诱导培养基购自上海文渊阁公司。DAB试剂盒购自上海生工生物公司。辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体购自上海江莱生物科技有限公司。1.3实验方法1.3.1总RNA抽提（1）玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用超纯水冲洗2遍,180℃烘烤6h；（2）匀浆器、电泳槽等用0.1%的DEPC水冲洗浸泡，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5%的SDS处理；（3）Tip头、EP管用0.1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。（4）取带触角的东方蜜蜂头部（抗螨组、螨感染组，-70℃超低温冰箱中保存，obp3克隆用）；东方蜜蜂解剖后各部位（抗螨组、螨感染组，-70℃超低温冰箱中保存，荧光定量PCR用）；抗螨组东方蜜蜂各日龄阶段的头、腹部（包括封盖期蛹及未封17 盖期蛹，-70℃超低温冰箱中保存，荧光定量PCR用）分别置于已倒入液氮的研钵迅速在液氮中研磨至粉末，转至匀浆器内，加入1mLTrizol，冰浴中快速匀浆后转至1.5mL的离心管中，冰上静置5min；（5）加入0.2mL氯仿，用手剧烈摇15秒混匀，15-30℃孵育2-3min后，于4℃12000rpm离心15分钟，取上层水相于一新的离心管中，加入0.5mL异丙醇，混匀后15-30℃静置10min；（6）12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用现配的75%乙醇洗涤，4℃7500rpm离心5min；（7）弃上清，室温干燥沉淀，干燥后加入30-60μL的去离子甲酰胺以溶解RNA，-70℃保存。（8）ND-1000测定提取的总RNA在260nm和280nm下测吸光度A值,并计算OD260/OD280的值以确认RNA的质量和产量。此值在1.7-2.1之间说明提取的RNA纯度较高，适宜进行下一步的实验（根据样品在260nm波长处的吸光度值确定总RNA提取液中RNA的浓度，以便在反转录的过程中进行定量：1个单位OD260值单链RNA=40μg/mL）；若低于1.7，则说明提取的RNA中可能有蛋白质的污染，可用酚：氯仿抽提去除。（9）电泳槽用RNA清洗液浸泡4-5h，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用。琼脂糖凝胶用1×TBE配制。在5μL上样缓冲液中加入5μL组织总RNA。65℃变性10min后立即放入冰水中2-3min，点样于琼脂糖凝胶中5V/cm电泳，电泳待溴酚蓝至胶2/3处，取下凝胶，GoldView染色，凝胶成像系统检测。1.3.2cDNA的合成根据NCBI检索到的西方蜜蜂obp3（Odorantbindingprotein3）cDNA序列（Accession:NM_001040221，GI:94158728），运用Oligo7软件设计引物（如表1-2），由生工生物工程（上海）有限公司合成。表1-2obp3引物信息Tab.1-2Theprimerinformationofobp3引物名称长度GC含量引物序列（5´-3´）Tm(Name)（bp）（%）(Sequences)（℃）*obp3-F1947.4TGAAGACCATCGTCATCCT55.4obp3-R1952.6CTCTCTTCTTCGCTCGTTG57.6注：软件给出的产物最优解链温度Ta为56℃（最高57.2℃），经梯度PCR体系优化，设定Tm为55.7℃，此时产物特异性和产量最优。根据各样品总RNA的浓度，对各个个体的总RNA进行稀释，使最终浓度为18 100ng/μL。反转录体系为20μL：5×PrimeSriptTMBuffer4µL，PrimeSriptTMRTEnzymeMixⅠ0.5µL，OligodTPrimer(50µM)1µL，Random6mers（100µM）1µL，总RNA4µL，RNaseFreedH2O补足至20μL。37℃15min进行反转录反应，85℃5s使反转录酶失活。所得产物即为cDNA，置于-20℃保存备用。1.3.3DNA片段的克隆测序1.3.3.1DNA片段的回收取100µLPCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳后，用E.Z.N.A.GelExtractionKit进行回收。具体步骤如下：（1）切取含有目的片段的琼脂糖，在滤纸上切碎后转入到1.5mL的离心管内；（2）称取胶块的重量，根据1mg=1µL计算胶块体积；（3）向胶块中加入3倍体积的BindingBuffer，均匀混合后，55-65℃加热融化胶块，此时应不断振荡，使胶块充分融化；（4）将上述操作（3）的溶液转移至SpinColumn，静置2min，12000rpm离心2min，弃去滤液；（5）再加入500µLWashBuffer，12000rpm离心1min，弃去滤液；（6）重复操作步骤（8）；（7）将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入35-50µL的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置2min（把灭菌水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率）；（8）12000rpm离心2分钟洗脱DNA，-20℃保存备用。1.3.3.2CaCl2法制备感受态细胞的制备（1）挑取DH5α大肠杆菌原种，在LB琼脂板上划线培养；（2）挑取培养好的单菌落，接种到3mLLB培养基中，37℃摇菌培养过夜；（3）取1mL培养好的菌液，接种到100mLLB培养基中，37℃摇菌培养至OD600达到0.5-0.6。将菌液转移至预冷的50mL灭菌离心管中，冰浴10-15min；（4）4000rpm,4℃离心10min，弃上清，回收细菌沉淀；（5）加入20mL冰预冷的0.1MCaCl2悬浮细菌沉淀，然后冰浴10-15min，4000rpm，4µL离心10min，弃上清，回收细菌沉淀；（6）加入4mL0.1MCaCl2溶液重新悬浮细菌沉淀，这时的细胞可直接用于转化实验。或加甘油至终浓度为15-20%，混匀，分装成200µL/份，-70℃冻存。PCR产物的T载体连接，pMD19-TVectorsystems，连接体系如下：pMD19-TVector（50ng/µL）1.0µL回收产物4.0µLSolutionⅠ5.0µL19 瞬时离心，于PCR仪中16℃反应12-16小时。1.3.3.3转化（1）从-70℃取出冻存的感受态细胞，置于冰上解冻；（2）200µL感受态细胞中加入5µL连接产物，冰浴30min；（3）42℃水浴精确热激45s，立即冰浴2min；（4）加800µLLB液体培养基，37℃摇床复苏2h；（5）铺200µL转化菌液于含有X-gal（40µL/平板）和IPTG（4µL/平板）的Amp平板上；（6）37℃恒温培养箱培养9-16h，直到出现明显的单菌落；（7）4℃或室温放置数小时，使蓝白斑颜色分明，挑取白斑筛选重组子。1.3.3.4质粒的提取分别挑取白斑接种于含1000µLLB液体培养基的1.5mL离心管中；37℃摇床培养10-12小时后取出200µL菌液保种，其余的用来提取质粒DNA；按质粒抽提试剂盒PlasmidMiniprepKit说明进行，具体步骤如下：（1）保种后的剩余菌液，12000rpm离心3min收集细菌；（2）加250µLBufferS1，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；（3）加250µLBufferS2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤不宜超过5分钟；（4）加300µLBufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000rpm离心10分钟，取上清；（5）小心吸取上清于制备管（置于2mL离心管内）中，12000rpm离心1分钟，弃滤液；（6）将制备管置回离心管中，加入500µLBufferW1，12000rpm离心1分钟，弃滤液；（7）将制备管置回离心管中，加入700µLBufferW2，12000rpm离心1分钟，弃滤液；重复该步骤一次；（8）将制备管置回离心管中，12000rpm离心1分钟；（9）将制备管移入新的1.5mL离心管内，在制备管膜中央加入60µL左右的Eluent或去离子水，室温静置1min，12000rpm离心1分钟；溶解后-20℃保存。1.3.3.5重组质粒的鉴定和测序（1）琼脂糖电泳直接检测吸取2µL提取的质粒DNA（设兰、白对照）进行点样，并选取相应的DNAMarker进行分子量对照，根据质粒DNA片段的大小鉴定外源DNA片段是否插入质粒。（2）质粒PCR鉴定20 用质粒DNA作为模板进行PCR扩增，扩增条件和程序与第一次扩增的相同。然后用1.5%的琼脂糖电泳检测，依据扩增片段有无和大小，鉴定外源DNA片段是否插入质粒。经鉴定确认无误后，向含有保种的200µL菌液的指型管中加入800µLLB液体培养基，37℃摇床培养10-12h，加灭菌甘油100µL，送生物公司进行测序。1.3.3.6序列分析东方蜜蜂螨易感组与抗螨组obp3测序结果经DNAMan7软件进行多重序列比对分析，并与NCBI上西方蜜蜂obp3序列共同比对，得出差异；在NCBI上下载所有昆虫的obp3基因序列，并进行多重比对，使用MEGA5.0构建NJ进化树。1.3.4实时荧光定量PCR1.3.4.1实时荧光定量PCR引物设计根据GenBank中西方蜜蜂(A.mellifera)的obp3(登录号：NM_001040221)和β-actin(登录号：AB023025)外显子序列，利用Oligo7软件设计引物，引物序列见表1-3。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。表1-3obp3基因及管家基因引物信息Tab.1-3Theprimerinformationofobp3geneandhouse-keepinggene引物序列退火温度(℃)长度(bp)(Primers)(Sequences)(Anealingtemp.)(Size)obp35’-CCATCGTCATCCTACTTTTCACAC-3’601005’-GCTTTCTCAGCATTCTTTCACTTTC-3’β-actin5’-TGCCAACACTGTCCTTTCTG-3’601555’-AGAATTGACCCACCAATCCA-3’1.3.4.2扩增效率的鉴定将obp3与β-actin2种重组质粒模板用ND-1000核酸测定仪测定其浓度后进行倍比稀释，分别取每一个数量级稀释液2µL作为PCR模板，即在每个反应体系中相当于含有模板拷贝数分别为101、102、103、104和105，同时设立一个空载体质粒为模板的空白对照制作标准曲线。按下列组份配制PCR反应液：SYBRPremixExTaqTMII(2×)10µL，PCRForwardPrimer(10µmol/L)0.4µL,PCRReversePrimer(10µmol/L)0.4µL,ROXReferenceDyeII(50×)0.4µL，模板2µL，加入ddH2O21 补足到20µL。PCR扩增程序为：95℃热变性1min，然后95℃变性15s，60℃复性15s，72℃延伸34s，40个循环；为分析扩增的特异性，PCR扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析，程序为：95℃，60℃1min；95℃，60℃15s。1.3.4.3以β-actin为内参检测obp3基因表达量采用SYBRGreenⅠ染料法，优化荧光定量PCR的反应条件，确定反应体系（20µL）：SYBRPremixExTaqTMII(2×)10µL上游引物(10mM)0.4µL上游引物(10mM)0.4µLROXReferenceDyeII(50×)0.4µLcDNA2.0µL加RNaseFree水至总体积为20µL以上步骤均为冰上操作。每个样品设3个重复值,设阴性对照。PCR扩增程序为：95℃热变性1min，然后95℃变性15s，60℃复性15s，72℃延伸34s，40个循环；为分析扩增的特异性，PCR扩增结束后采集多个信息点进行溶解曲线分析，程序为：95℃，60℃1min；95℃，60℃15s。1.3.5东方蜜蜂OBP3蛋白生物信息学分析利用BLAST软件分析序列同源性（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），用MEGA7.0构建系统进化树；利用ExPASy网站ProtParam程序进行蛋白质理化性质的分析（http://web.expasy.org/protparam/）；利用ProtScale程序分析蛋白疏水性结构（http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）；蛋白质跨膜结构的预测（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）及信号肽区域的分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；利用COILS进行蛋白质卷曲螺旋分析；（http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）利用TargetP进行OBP3的亚细胞定位（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）；利用SSpro进行蛋白质二级结构预测（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）；利用SWISS-MODEL进行蛋白质三级结构预测（http://us.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODE.html）。1.3.6东方蜜蜂obp3多克隆抗体的制备1.3.6.1原核表达载体PET-OBP3的构建（1）目标DNA的PCR扩增及目标DNA与载体的重组按照cloneget试剂盒要求设计引物，使用cloneget试剂盒进行目标DNA（东方蜜蜂抗螨组obp3）的PCR扩增。选用pET-28a，并用NheI酶进行酶切，使之成为线性化载体。将下列混合物小心加到0.5ml的eppendorf管的管底：线性化载体，0.03～0.22 1pmol，纯化的PCR产物0.06～0.2pmol，10XClonegetBuffer1μl，ClonegetEnzyme1μl，去离子水补足至10μl。将其混合物在25°C保持30分钟，之后在冰上保持5分钟。可立即进行转化，也可-20°C保存，以后再转化。（2）蛋白重组表达与纯化选择自诱导培养基进行蛋白的大量重组表达：1.在无菌器皿中，取出10ml的10×自诱导培养基，用90ml无菌的去离子水将本培养基稀释作为工作液。2.1:1000加入卡那霉素。3.用无菌牙签或枪头挑起一个单菌落，接入该工作液（工作液体积不限）。4.于37ºC摇床，最大转速，培养24h~30h。5.离心收集菌体。重组蛋白纯化：1．取过夜诱导表达的菌液100ml，平均分配于两个离心机专用离心管中，4000rpm离心10分钟。2．取菌体裂解液2毫升，重悬菌体，合并到一个50ml离心管中，放入超声波细胞粉碎机中超声处理3分钟。（超声条件4S超声，6秒间隔共30次，确保超声探头深入液面以下，但不会碰到管底）3．16000rpm，离心10分钟。4．将离心后的上清液转到新的50ml管中，加含上柱缓冲液至20毫升。5．取出镍柱，用上柱缓冲液清洗一次。将步骤四中20ml菌液，流穿镍柱。6．用Washbuffer洗2次，7．用咪唑洗脱液洗2次，并收集，每次加入2毫升咪唑，间隔5分钟。8．用Washbuffer冲洗9．柱子放入4℃冰箱保存，注入缓冲液，盖好盖子。1.3.6.2抗血清的获得2只新西兰大耳兔进行2，2，2，1周期进行免疫。首次免疫使用弗氏完全佐剂，增免使用福氏不完全佐剂。皮下注射兔,每次间隔15d。在第4次免疫后15d,颈动脉采血分离血清，再通过proteinA蛋白去除血清中的杂蛋白获得纯化的免疫球蛋白IGG，最后通过ELISA测定抗体效价。1.3.6.3蛋白检测及免疫学反应（1）SDS-PAGE电泳依次配制分离胶和浓缩胶，本实验分离胶浓度为12%。表1-4不同分离范围分离胶浓度表23 Tab.1-4differentconcentrationofseparationgeltodifferentseparationrangeSDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速用滴管灌胶。灌胶：1.灌分离胶，封一层三蒸水或酒精；2.分离胶凝固好后，倒掉覆盖在分离胶表面的三蒸水，倒置吸净残留的水；3.灌入配制好的浓缩胶，插上梳子。以梳子底部距两层胶分界线1cm为宜。样品处理和加样：1.取适当的蛋白样品，按样：缓冲液=4:1的比例，加入1/4体积的6×LoadingBuffer，混匀后在开水中煮沸5min；2.将胶板置于电泳槽内，把1×SDS-PAGE电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液要盖过胶板顶部，然后用微量加样器将样品15μL加到上样孔内，最后加入8-10μL的预染蛋白marker（注意：装胶板时注意“凹面”朝内）。电泳：接好电极，先调电压为80v/浓缩胶，开始电泳，当指示染料进入分离胶后，将电压增加到120v/分离胶，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约1cm处，停止电泳，断开电源。电泳时间约1h。转膜：准备黑白夹子、2层海绵垫、6-8层滤纸、胶铲、镊子、玻璃棒先放入电转缓冲液中浸泡；将凝胶小心铲出，切掉上层浓缩胶，将下层分离胶小心放入电转液中浸泡；用镊子取PVDF膜（切勿用手），先在甲醇中固定5s，随后放入蒸馏水中泡5min，最后放入电转液中浸泡。然后做“三明治”。将黑白夹子打开，使白色一面垂直黑色一面保持水平；黑板上垫一层海绵垫，用玻棒来回碾压赶走里面的气泡（一手按住垫子一手碾压），再垫3层滤纸，玻棒碾压赶气泡，小心将凝胶盖于滤纸上（凝胶不分正反面，但注意分子量大的朝下放，夹子竖起来后分子量大的就在上面），再放上PVDF膜（膜分正反，所以事先要做好标记）盖住凝胶，再垫3层滤纸，玻棒碾压赶气泡，最后垫上海绵垫，夹紧夹子；电泳：将黑白夹子放入转移电泳槽中，夹子黑色面对槽的黑面，夹子白色面对槽的红面（黑对黑，白对红）。电转时会产热，所以要将电泳槽置于冰上，电转液中放一块冰袋，最后在槽的左中右各放一个冰袋。一般使用60v转移2h。封闭：停止电转过程，如果marker没有成功转移，则继续电转；目的条带对应的marker成功转移到PVDF膜上，则小心用镊子取出膜，蒸馏水冲洗2遍后放入5%的脱脂奶粉中封闭（一次用量30mL）1h（脱色摇床）。24 （2）Western-blot检测将封闭后的膜取出，蒸馏水冲洗2遍，放PBST中摇床洗涤3次，每次摇5min；用兔抗蜜蜂OBP3抗体作为一抗，用PBST稀释至适当浓度（一次用量10mL），将膜放入杂交袋中，加入一抗，封袋，4℃下摇床孵育过夜；一抗孵育结束后将膜取出，蒸馏水冲洗2遍，放PBST中摇床洗涤3次，每次摇5min；将羊抗兔IgG作为二抗用PBST稀释至适当浓度（一次用量10mL），将膜放入杂交袋中，加入二抗，封袋，4℃下摇床孵育一天；二抗孵育结束后将膜取出，蒸馏水冲洗2遍，放PBST中摇床洗涤3次，每次摇5min；DAB显色：使用DAB试剂盒操作。取1.5mL的指形管，加入1mL蒸馏水和A、B、C溶液各一滴，振荡摇匀，闭光显色1min，蒸馏水冲洗终止显色反应。2结果与分析2.1总RNA的提取与检测图2-1总RNA提取的检测Fig.2-1DetectionoftotalRNA1%琼脂糖凝胶电泳结果(图2-1)显示5S，18S，28S三条带清晰无杂带，无基因组条带污染，表明提取的总RNA完整性和纯度均符合反转录要求。25 2.2东方蜜蜂obp3基因克隆分别以东方蜜蜂（螨易感组、抗螨组）头部cDNA为模板进行扩增，将RT-PCR产物经1.0%琼脂糖检测，得到了约450bp目的条带（见图2-2），与预期目的片段大小一致。图2-2.东方蜜蜂头部cDNA模板RT-PCR产物1.0%琼脂糖检测结果Fig.2-2DetectionofRT-PCRofcDNAtemplateoftheheadofApiscerana将目的基因进行T载体连接，并于感受态细胞中进行转化，培养后的菌液进行菌液PCR，得到条带仍在相同位置(图2-3)，与cDNA模版PCR结果一致。经测序，东方蜜蜂感染螨组与抗螨组obp3基因cDNA全序列长为444bp。经过比对，东方蜜蜂obp3基因感染螨组与抗螨组的同源性为92.47%，东方蜜蜂与西方蜜蜂obp3基因同源性为88.46%。图2-3重组质粒后PCR扩增结果Fig.2-3DetectionofPCRofgenerecombinantplasmid26 27 图2-4碱基突变位点及对应氨基酸变异情况Fig2-4Themutantlociandtheircorrespondingaminoacids28 由图2-4可知，东方蜜蜂蜂螨易感组和对照组除在192位点存在c/t（L/F）变异外,在164位点存在a/g，200位点存在g/a，341位点存在g/a的无义突变，西方蜜蜂与东方蜜蜂螨组相比，前者在51-53位点存在三个碱基cag的缺失使得其编码的氨基酸缺少一个谷氨酰胺（Q），在159，161,201,217,231,234,235,318,321,348,364,367,372,374,452位点存在着a/c(I/L),a/g(I/L),a/t(M/L),g/a(G/D),a/g(M/V),c/t(Q/S),a/c(Q/S),a/g(N/D),g/a(D/N),g/a(V/T),c/g(T/S),a/g(K/R),c/g(L/V),t/c(L/V),a/c(R/S)的有义突变；在26,41，164,182,188,197,341位点存在t/c,t/c,g/a,a/g,t/c,,t/c,a/g的无义突变。2.3不同昆虫obp3基因系统进化树的构建为了进一步探讨部分昆虫类obp3基因编码区的进化，特收集了西方蜜蜂，白纹伊蚊，刺舌蝇，葱蝇，甘蓝蚜等25个昆虫的obp3基因编码区序列与东方蜜蜂螨组及东方蜜蜂抗螨组比较，并将核苷酸序列转换为氨基酸序列进行比对，利用MEGA5.0构建NJ进化树(图2-5)。结果如图，大致分为两个不同的群体。东方蜜蜂螨易感组与抗螨组距离最近，聚为一类后又与西方蜜蜂距离最近。该结果符合昆虫的分类，用obp3基因构建进化树是可靠的。图2-5昆虫obp3NJ进化树Fig.2-5TheNJevolutiontreeoftheobp3geneininsects29 2.4东方蜜蜂obp3基因mRNA时空表达水平的变化用RT-PCR对obp3在螨易感组与抗螨组东方蜜蜂的五个组织（触角、头、胸、腹、腿）mRNA的表达量进行分析（图2-12）。每个组织做3次平行实验，得到三个RQ值，取平均数，进行相关性分析。结果显示obp3基因和β-actin基因的RT-qPCR扩增特异产物分别在76.5℃和81℃达到峰值，没有产生非特异产物，也没有产生引物二聚体，整个实验过程无污染，目的基因和管家基因表达稳定。表2-1螨易感组与抗螨组5个组织obp3基因荧光定量结果RQ值分析Tab.2-1AnalysisofRQvaluesofobp3in5tissuesofnon-varroa-resistantApisceranaandvarroa-resistantApiscerana不同组织抗螨组（D）组螨易感组（M）M组D组P值平均RQ值组平均RQ值Std值Std值触角22.234120.4127.5581430.304<0.01头58.43880.4333.2247860.302<0.01胸9.1181370.4056.8034760.321<0.01腹62.431720.4082.9101190.304<0.01腿18.335140.4118.2633370.302<0.01由表2-1可以看出，在五个组织中，螨易感组与抗螨组obp3基因表达量均差异极显著。图2-6实时荧光定量PCRβ-actin的标准曲线Fig.2-6Thestandardcurveofβ-actinintheRT-qPCR30 Slope:-3.435794R2:0.996596图2-7实时荧光定量PCRobp3的标准曲线Fig.2-7Thestandardcurveofobp3intheRT-qPCR图2-8实时荧光定量PCRβ-actin的溶解曲线Fig.2-8Thedissociationcurveofβ-actinintheRT-qPCR31 图2-9实时荧光定量PCRobp3的溶解曲线Fig.2-9Thedissociationcurveofobp3intheRT-qPCR图2-10实时荧光定量PCRobp3的扩增曲线Fig.2-10Theamplificationcurveofobp3intheRT-qPCR图2-11实时荧光定量PCRβ-actin的扩增曲线Fig.2-11Theamplificationcurveofβ-actinintheRT-qPCR32 图2-12东方蜜蜂obp3螨易感组（M组）与抗螨组（D组）各组织RT-qPCR相对定量检测结果Fig.2-12TheresultoftheRT-qPCRtestofobp3geneindifferenttissuesofApisceranainthetwogroupsofvarroa-resistent(groupD)andnon-varroa-resistent(groupM)由图2-12可以看出，东方蜜蜂obp3基因在抗螨组（D组）头部与腹部表达量最高，其次是触角、腿，在胸部表达最少。而螨易感组（M组）的各组织obp3基因表达量都有不同程度的降低，在头部与腹部这两个组织与抗螨组（D组）表达量相差最大。选择抗螨组（D组）进行进一步研究，取obp3基因表达量最大的两个组织头部与腹部进行RT-qPCR实验，得到抗螨组的东方蜜蜂obp3基因表达量随时间变化柱状图。图2-13东方蜜蜂obp3抗螨组（D组）不同日龄腹部与头部RT-qPCR相对定量检测结果Fig.2-13TheresultoftheRT-qPCRtestofobp3geneinheadandabdomenofdifferentagesofApisceranainthegroupofvarroa-resistent(groupD)由图2-13可以看出，除封盖幼虫与未封盖幼虫是作为整体检测，东方蜜蜂obp333 基因在抗螨组各日龄头部与腹部表达量均为头部高于腹部，与东方蜜蜂obp3基因各组织RT-qPCR相对定量检测实验所得结果D组表达量头部高于腹部一致。并且在头部与腹部中，obp3基因表达量变化大体趋势是随日龄增长而增加。由图可以看出，在4-13日龄组，头部的obp3基因表达量达到最大。而在18日龄组，腹部obp3基因表达量达到最大。obp3基因在未封盖幼虫中表达量略高于封盖幼虫。2.5生物信息学分析结果2.5.1蛋白质理化性质分析蛋白质的理化性质分析是蛋白质序列分析的基本内容之一。利用ProtParam服务器对东方蜜蜂OBP3的理化性质进行分析，OBP3蛋白共有148个氨基酸，分子式为C766H1221N205O235S16。分子量为17575.3，理论等电点为4.94，估计半衰期为30h，符合昆虫类半衰期标准。不稳定指数为40.94，因而OBP3蛋白属于不稳定蛋白。脂肪指数为89.53，亲水指数为-0.311。2.5.2卷曲螺旋分析图2-14卷曲螺旋预测结果Fig.2-14Resultofpredictionofcoiledcoils卷曲螺旋是蛋白质中由2-7条α螺旋链互相缠绕形成类似麻花状结构的总称。预测结果显示OBP3蛋白没有卷曲螺旋结构。34 2.5.3跨膜区分析图2-15跨膜区预测结果Fig.2-15Resultofpredictionoftransmembranedomains跨膜区分析结果显示，该蛋白质没有跨膜区，全部在细胞膜外。2.5.4氨基酸疏水性分析图2-16氨基酸疏水性分析预测结果Fig.2-16Resultofpredictionofhydrophobicaminoacidanalysis疏水性氨基酸在蛋白质内部，由于其疏水的相互作用，在保持蛋白质三级结构35 的形成和稳定中起着重要作用。疏水性指数最大值为3.244，位于8,9,10三个位点上。最小值为-2.944，位于90与91两个位点上。2.5.5蛋白质二级结构预测MKTIVILLFTLCIVSYMQMVRCDNVDDISLCLEQENLTLDDIQPLLEDKNERTIRKRGCICCHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCHHHHEACLFHRMALMNGNVFDMQKFDIYLNDMEDNQKENIRNIIQQCVNDAKNEDKCLVAQKFTHHHHHHHCCCEECCEECHHHHHHHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHHHHKCLIDYVKFYIKQFMYSFHSNSTSEEERHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCC预测结果为双行显示，上行为目的序列，下行为预测的二级结构，其中C表示Coil（无规则卷曲），H表示Helix（α-螺旋），E表示Extended（β-折叠）。从预测结果可知，OBP3蛋白二级结构组分中，α-螺旋（H）占60.8%>45%，且β-折叠（E）占2.7%<5%，故OBP3蛋白属于全α型蛋白。2.5.6蛋白质三级结构预测图2-17蛋白质三级结构预测结果Fig.2-17Resultofpredictionofproteintertiarystructure36 2.5.7信号肽预测图2-18信号肽预测结果Fig.2-18Resultofpredictionofthesignalpeptide预测结果显示，S值为0.959>0.5，为分泌蛋白，存在信号肽。OBP3蛋白的信号肽具体序列为MKTIVILLFTLCIVSYMQMVRCD，说明OBP3蛋白可能在跨膜运输中起信号识别作用；剪切位点位于第22-23位氨基酸，表明成熟肽始于第22位氨基酸。信号肽是分泌型蛋白的特征之一,可以引导合成的蛋白进入高尔基体内进行进一步的加工并被准确运输到特定的细胞器中；前人研究结果显示，气味结合蛋白在内质网中合成后被转运到嗅觉细胞淋巴液中。本实验与该研究结果相符。37 2.5.8亚细胞定位图2-19亚细胞定位预测结果Fig.2-19Resultofpredictionofsubcellularlocalization由Loc为S可知，OBP3蛋白质定位于分泌通路，即分泌到细胞间质，极可能是SP（信号肽），这与之前信号肽预测结果吻合。而以往的研究表明，气味结合蛋白在内质网中合成，后经高尔基体运送到致密颗粒中，最后在致密颗粒中进行浓缩，说明了OBP3蛋白质定位于分泌通路的预测符合前人的研究结果。38 图2-20pET-28a质粒图谱Fig.2-20theatlasofpET-28aplasmid2.6原核表达载体pET-OBP3的酶切鉴定及测序重组子pET-OBP3分别用EcoRI和HindIII双酶切,可切出444bp的片段(图2-21),结果与预期一致,表明该重组质粒构建正确,为阳性质粒。将酶切鉴定为阳性的质粒测序，结果表明阳性质粒中插入的obp3序列与已测序出的obp3序列对比完全一样，没有突变碱基。39 图2-21.重组质粒pET-OBP3的酶切鉴定Fig.2-21IdentificationofrecombinantpET-OBP3byenzymedigestion2.7Westernblot结果将重组质粒pET-OBP3转化入大肠杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)中进行表达。obp3序列片段编码148个氨基酸残基，分子量约为16kd,与HIS标签融合后表达蛋白的分子量约为19kd。SDS-PAGE电泳图（图2-22）表明，所表达的pET-OBP3融合蛋白形成了38kd的二聚体。Westernblot分析（图2-23）可见,表达的重组蛋白可以与兔抗蜜蜂OBP3抗体发生了特异性血清学反应,表明东方蜜蜂obp3在E.coli中实现了表达。经ELISA测定，抗体滴度大于40k，为合格抗体。图2-22.pET-OBP3诱导表达结果图2-23.Western-blot结果Fig.2-22TheinducedexpressionofpET-OBP3Fig.2-23Resultofwestern-blot40 3讨论3.1实验材料的选择近年来，关于蜜蜂抗螨机制的研究逐步展开，有科学家选育抗螨西蜂与普通不具备抗螨性能的西蜂对比研究基因差异。然而，人工选育的抗螨西蜂并不完全具备东方蜜蜂完善的抗螨性状，且不同研究选育的抗螨西蜂遗传背景差异较大，限制了研究成果的深入。本实验根据前人研究成果，选择本身具有抗螨特性的东方蜜蜂，同时积极寻找受螨感染的东方蜜蜂，进行两者的基因研究比对，深入研究控制蜜蜂抗螨性状的基因。周婷等在调查我国主要中蜂饲养区蜂螨寄生状态时发现中蜂螨的寄生率极低，绝大部分地区在中蜂群中难觅蜂螨踪迹。本研究组在广东进行东方蜜蜂资源调查时意外发现广州番禹石基镇昆虫研究所下属的实验蜂场有部分感染螨的中蜂群与西蜂的受害情形相同：受害蜂群生产能力下降，成蜂死亡率高，群势极弱，群幼虫羽化率降低，整个蜂群濒临灭亡。这群蜂对研究东方蜜蜂抗螨的分子机制是极为宝贵的资源。同时，该蜂场的其它蜂群都是正常抗螨的，因此在该蜂场内可进行对比取样，研究中蜂抗螨基因。该蜂场多年都未从外场引进中蜂王，完全留用本场蜂王，因此蜂场内的群体为近交群体，为本实验降低了遗传背景差异。蜂场内共有东方蜜蜂蜂群20群，均为活框饲养，其中有5群东方蜜蜂雄蜂房内发现有蜂螨感染，其它15群均未发现蜂螨感染，说明这15群是抗螨的正常中蜂。本实验分别从感染螨的5群和抗螨的15群中各取500只蜜蜂，用于抗螨基因研究。3.2obp3基因克隆结果分析讨论本实验旨在通过克隆出东方蜜蜂螨易感组、抗螨组obp3基因cDNA全长，与NCBI上西方蜜蜂obp3序列相比较，研究这两个物种之间obp3基因上的差异以及东方蜜蜂螨组与抗螨组之间的差异。由于东方蜜蜂的obp3基因从未被克隆出来，没有能够查阅到的序列，而西方蜜蜂与东方蜜蜂的亲缘相近，所以可以认为obp3基因的同源性较高，可以根据西方蜜蜂的obp3cDNA序列来设计东方蜜蜂obp3基因的上下游引物。根据NCBI上西方蜜蜂的obp3基因，利用Oligo7软件设计上下游引物，成功克隆出东方蜜蜂obp3基因cDNA全长，并完成测序，反过来说明这两个物种的obp3基因确实同源性较高，并且在基因cDNA的两端序列相同。经DNAman软件比对结果显示，西方蜜蜂与东方蜜蜂的cDNA序列同源性达到88.46%。东方蜜蜂蜂螨易感组和对照组除在192位点存在c/t（L/F）变异外,在164位点存在a/g，200位点存在g/a，341位点存在g/a的无义突变。192位点的L/F41 突变很可能是导致抗螨差异性状的关键。西方蜜蜂与东方蜜蜂螨组相比在51-53位点存在三个碱基cag的缺失使得其编码的氨基酸缺少一个谷氨酰胺（Q），在159，161,201,217,231,234,235,318,321,348,364,367,372,374位点存在着a/c(I/L),a/g(I/L),a/t(M/L),g/a(G/D),a/g(M/V),c/t(Q/S),a/c(Q/S),a/g(N/D),g/a(D/N),g/a(V/T),c/g(T/S),a/g(K/R),c/g(L/V),t/c(L/V)的有义突变；在26,41，164,182,188,197,341位点存在t/c,t/c,g/a,a/g,t/c,,t/c,a/g的无义突变。西方蜜蜂与东方蜜蜂相比存在碱基的缺失与较多的碱基突变差异，说明两个物种虽然亲缘关系较近，但经过各自的长期进化，基因已有了较大差别。昆虫NJ系统进化树的构建图清楚的显示了obp3随物种演化而发生的变异，同属间的差异较小，在进化树上彼此距离较近，可聚为一类。经生物信息学软件分析OBP3蛋白，更深入的了解了该蛋白的理化性质、卷曲螺旋结构、跨膜区、疏水性以及得到了OBP3蛋白的二级与三级结构，并做了信号肽预测及亚细胞定位。部分预测结果与已有的研究成果相一致，说明了生物信息学预测的合理与可靠性。生物信息学预测是分子生物学研究不可缺少的一部分。3.3obp3表达规律本实验中荧光定量PCR扩增及扩增产物的检测始终在闭合管中进行，避免了样本间的交叉污染，高特异性保证了实时荧光定量PCR能够有效的检测目标基因。荧光定量每管设3个重复，使用优化处理过的耗材和器皿，降低了误差，使实验的准确度提高。本试验构建了含有目的条带的重组质粒作为模板，稀释了5个梯度制作标准曲线。理想的标准曲线相关系数R2的值应大于0.98，越接近于1说明线性越好；斜率在-3.33最佳，定量越准确。本试验结果表明，所建立的obp3基因标准曲线R2=0.997，斜率为-3.44；β-actin标准曲线R2=0.997，斜率为-3.34。以上结果均符合实时荧光定量PCR的要求，说明两重组质粒标准曲线均构建成功，且看家基因β-actin与obp3基因扩增效率基本一致，因此可以以β-actin作为内参基因，用2-ΔΔCT法对obp3基因进行相对定量。根据融解曲线分析可以判断扩增产物是否为特异性目的片断。本实验中溶解曲线均为整齐的单峰，说明实验没有被污染，没有掺入杂质，且PCR过程没有引物二聚体的产生，说明本实验的荧光定量PCR引物设计合理，扩增效果良好；在荧光定量实验的过程中，应十分注意避免污染，全程在超净台中操作，勤换枪头，但同时需关闭光源，避免荧光染料的分解。对不同抗螨性能东方蜜蜂obp3基因进行荧光定量PCR检测，结果表明obp3基因在东方蜜蜂触角、头、胸、腹、腿等不同组织都有表达，表达程度不一，其中在抗螨组头部与腹部表达量最高，其次为触角，SylvainForêtandRyszardMaleszka的研究结果显示，obp3在西方蜜蜂除了触角的各个身体部位都有表达，本研究结果说明obp3在东方蜜蜂中不仅承担着嗅觉功能，同时还可能参与了其他的生理功能，而东方蜜蜂和西方蜜蜂在抗螨性能上的差异提示obp3在两个物种中的功能差异可42 能是导致抗螨性能差异的原因之一。obp3在抗螨组与螨易感组在触角的表达量差异显著，螨易感组的obp3表达量显著降低，说明蜂螨感染导致了obp3基因表达的变化，这与前人研究相一致，提示obp3基因可能与抗螨性能相关。同时对东方蜜蜂抗螨组不同日龄obp3基因表达量的荧光定量PCR检测结果表明，抗螨组的东方蜜蜂obp3基因在头部与腹部的表达量大体趋势是随日龄增长而增加，这与年长蜜蜂比年幼蜜蜂抗螨能力强一致。东方蜜蜂obp3基因cDNA全序列测序结果表明抗螨组东方蜜蜂的obp3基因与螨易感组东方蜜蜂的obp3基因在序列上有碱基突变导致的蛋白质变异，时空表达变化研究结果表明obp3基因表达量上差异显著，说明obp3基因的差异导致了蜂群抗螨行为的差异，提示obp3可能为影响蜜蜂抗螨性能的相关基因。3.4多抗方法免疫用动物的选择常根据抗体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关。如要获得大量的抗体，多采用大动物；如要是获得直接标记诊断的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体；如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备；一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。本实验采用家兔进行免疫，成功获得了obp3的多克隆抗体。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。由于对免疫应答的个别差异，免疫时应同时选用数只动物进行免疫。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原，如要制备用于筛选细菌表达的cDNA文库或免疫印迹的抗血清，最好选用可降解的蛋白质抗原。抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般而言，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1000μg/次，兔为200μg～1000μg/次。加强计量为首次剂量的1/5～2/5。在本实验中，抗原为蛋白质类抗原，给予家兔的免疫剂量为首次500μg。免疫剂量与注射途径有关，一般而言，静脉注射剂量大于皮下注射，而皮下注射又比掌内和跖内皮下注射剂量大，也可采用淋巴结内注射法。加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10倍以上。对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。本实验中对家兔采用了弗氏完全佐剂，相应减少了抗原注射剂量。43 如要制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法。如需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般间隔时间应为5~7天，加佐剂者应为2周左右。本实验成功构建了pET-OBP3原核表达载体，在SDS-PAGE电泳结果图中可见19kd长度的融合表达蛋白形成了38kd的蛋白二聚体。电泳条带较为清晰，但仍可看出有蛋白降解现象。另外电泳条带较宽，说明样品中盐含量较多。电泳中的蛋白降解并不影响兔抗蜜蜂OBP3抗原的成功构建，该抗原可用于免疫学反应。用成功制得的抗原免疫新西兰兔得到抗血清，进行western-blot实验证明抗原与抗血清发生了特异性反应，ELISA实验证明抗血清效价>40k，所以东方蜜蜂obp3多克隆抗体成功制备，并且特异性与效价均良好。该抗体为后续实验提供了丰富的材料，并为更深入研究东方蜜蜂obp3基因奠定了基础。44 4结论本实验根据前人研究成果，选择东方蜜蜂obp3基因作为抗螨相关基因进行研究，得出以下结论：1.克隆并测序获得obp3基因cDNA全序列444bp。将东方蜜蜂蜂螨易感组和抗螨组obp3基因序列进行对比分析发现：除在192位点存在c/t（L/F）变异外,在164位点存在a/g，200位点存在g/a，341位点存在g/a的无义突变。2.对不同抗螨性能东方蜜蜂obp3基因进行表达量研究，结果表明obp3基因在抗螨组头部与腹部表达量最高，其次为触角，并且与螨易感组表达量差异显著，对东方蜜蜂抗螨组不同日龄obp3基因表达量的荧光定量PCR检测结果表明，抗螨组的东方蜜蜂obp3基因在头部与腹部的表达量大体趋势是随日龄增长而增加。3.东方蜜蜂蜂螨抗性群体及易感组obp3基因序列差异及表达差异结果说明obp3基因与东方蜜蜂抗螨性能的差异相关。4.生物信息学分析结果显示OBP3蛋白共有148个氨基酸，分子式为C766H1221N205O235S16。分子量为17575.3，理论等电点为4.94，估计半衰期为30h。OBP3蛋白属于不稳定蛋白，不稳定指数为40.94，脂肪指数为89.53，亲水指数为-0.311。OBP3蛋白没有卷曲螺旋结构，没有跨膜区，全部在细胞膜外。OBP3蛋白疏水性指数最大值为3.244，位于8,9,10三个位点上。最小值为-2.944，位于90与91两个位点上。二级结构预测结果显示，OBP3蛋白属于全α型蛋白。OBP3蛋白的信号肽具体序列为MKTIVILLFTLCIVSYMQMVRCD，剪切位点位于第22-23位氨基酸，表明成熟肽始于第22位氨基酸。亚细胞定位结果显示OBP3蛋白定位于分泌通路。5.本实验成功构建pET-OBP3原核表达载体，并成功制备东方蜜蜂obp3基因多克隆抗体。45 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honeybeeApismellifera.Nature.2006,443:931-949致谢三年研究生生活即将结束，在完成毕业论文的之际，我充满感激地回忆曾经帮助过我的所有人，因为有你们的指导与帮助，我才得以顺利完成实验。首先，特别感谢我的导师余林生教授。大四开始跟随余林生教授实习并获得指导，50 完成本科毕业论文。研究生期间，余教授十分关心学生的学习与生活，经常在繁忙的工作中抽出时间给予指导并提供很多无私帮助。余教授严谨的治学态度、敏锐的思维和洞察力，精益求精的工作作风，为人处事的坦诚以及朴素的生活作风都深深地影响了我，将使我受益终生。在此，向余林生教授致以最崇高的敬意和最衷心的感谢。同时十分感谢师母王老师。在我和吴虹同学一起在安徽农业大学蜂业研究所学习实践期间，王老师始终与我们在一起，亲自指导、帮助我们完成一系列工作。感谢扬州大学吉挺老师，他悉心指导我完成整个毕业论文。无论从我毕业论文的选题、试验设计和具体试验安排，到实验数据的分析、论文的侧重点的确立都凝聚着吉老师的智慧与心血。实验完成后，吉老师精心修改了我的毕业论文，提出了许多好的建议。在此，衷心感谢吉挺老师，他的辛勤和汗水我永不会忘怀，他对待生活的乐观，接人待物的真诚深深影响了我，我将铭记终生。感谢扬州大学蜂学实验室的刘振国博士，殷玲博士。在实验过程中，你们耐心指导、教授了我许多实验方法，为我指明实验方向。并耐心解答我在实验与阅读文献中遇到的疑问，并且在我的毕业论文实验与论文写作中都给予了我极大帮助。同时感谢沈杰师弟、沈芳师妹，你们协助我完成实验并给予诸多帮助。感谢扬州大学的万小颖同学，訾臣同学，你们教我重要的实验方法，并帮助我做实验，没有你们的无私帮助，我不可能顺利完成实验。感谢母校安徽农大的黄思思师姐，程茂盛师兄，琚大伟师兄，与我同级的吴虹同学以及宗超、汪天澍师弟，你们在学习和生活中给予我极大的关心与帮助。感谢我在安徽农大的室友韦培培、何雯雯以及杨欣同学，你们的友爱与帮助使我能有一个温馨的宿舍氛围，我们对学习的探讨与互助使我们可以共同成长。感谢我的家人，他们默默的支持与无私的奉献造就了我的过去、现在和将来。最后，我要向答辩委员会以及论文评阅的专家教授们表示最诚挚的谢意！谢谢！2013年5月于安徽农业大学作者简介陈杨，女，共青团员，1988年9月出生，安徽省马鞍山市人。2006～2010年就读于安徽农业大学动物科技学院应用生物科学专业，2010～2013年于安徽农业大学动物遗传育种与繁殖专业攻读硕士学位。51 研究生阶段发表文章1.陈杨,宗超,余林生等.皖南山区与皖西大别山区东方蜜蜂群体微卫星DNA遗传多样性研究.中国蜂业,2011,62(10)2.陈杨,余林生,申洁琼等.具有不同抗螨特性的东方蜜蜂cDNA文库构建和CSP3基因52 CDs序列分析.江苏农业科学,2013(2)3.吴虹,陈杨,余林生等.新巢蜜与老巢蜜质量检测结果与分析.中国蜂业,2011(4)53