蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响 58页

关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：轨啪丁钏唯轹孙吁日期：知心始．DIIl 缩写MrjpsMrjplROSSODT．AOCPOCYP450JHVgRNAiBLDDnmt3LDs0CP英文名称符号说明Majorroyaljellyprotiens主要王浆蛋白Majorroyaljellyprotein1王浆主蛋白1Reactiveoxygenspecies活性氧Superoxidedismutase超氧化物歧化酶Totalantioxidantcapacity总抗氧化能力PhenoloxidaseCytochromeP450JuvenilehormoneVitellogeninRNAinterferenceBasiclarvaldiet酚氧化酶细胞色素P450保幼激素卵黄原蛋白RNA干扰幼虫基本食物DNAmethtltransferase3DNA甲基转移酶3Medianlethaldose半数致死量CrudeproteinGEGrossenergyDEPCHSP70Diethypyrocarbonate粗蛋白总能焦炭酸二乙酯Heatshock70kDaprotein热休克70kDa蛋白㈣够棚oo㈣称 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯III1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．1蜂群的组成与发育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．2蛋白质对蜜蜂的作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21．2．1蜜蜂的蛋白质来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．2．2蛋白质对蜜蜂的营养生理作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．3蜜蜂蛋白质营养需要研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．3．1蜜蜂幼虫期蛋白质营养需要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．3．2蜜蜂成蜂期蛋白质营养需要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41．3．3蛋白质对蜜蜂生长发育的影响研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．4人工饲养蜜蜂幼虫技术体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．4。1人工饲养蜜蜂幼虫技术的建立与完善⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．81．4．2人工饲养蜜蜂幼虫技术的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．5本研究的目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．112．1酶水解酪素及蛋白水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响⋯⋯⋯⋯⋯1l2．1．1试验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．1．2试验分组及饲粮⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．1．3饲养管理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．1．4测定指标及相关方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1．5数据处理与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2蜂王浆及蛋白水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．1试验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．2试验分组及饲粮⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．3饲养管理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．4测定指标及方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．5数据处理与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19 3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一203．1酶水解酪素及蛋白水平对化蛹率和羽化率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯203．2酶水解酪素及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体重的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯203．3酶水解酪素及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯213．4酶水解酪素及蛋白水平对幼虫血淋巴蛋白、PO和CYP450的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．5酶水解酪素及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂抗氧化能力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．6酶水解酪素及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂相关基因表达量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．7蜂王浆及蛋白水平对化蛹率和羽化率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．8蜂王浆及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体重的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．9蜂王浆及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．10蜂王浆及蛋白水平对幼虫血淋巴蛋白、PO和CYP450的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．11蜂王浆及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂抗氧化能力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．283．12蜂王浆及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂相关基因表达量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．294讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l4．1不同蛋白源对人工饲养条件下意大利蜜蜂发育的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯314．2幼虫食物蛋白水平影响化蛹率和羽化率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯314．3幼虫食物蛋白水平影响蜜蜂发育时期的体重⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯324．4幼虫食物蛋白水平影响蜜蜂发育时期的体蛋白含量及血淋巴蛋白含量⋯⋯⋯⋯⋯334．5幼虫食物蛋白水平影响蜜蜂发育时期的免疫能力与抗氧化能力⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯344．6幼虫食物蛋白水平影响蜜蜂发育时期的相关基因表达量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯365总体结论、创新点及展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．385．1总体结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯385．2创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯385．3研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯386参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．397致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯488攻读学位期间发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．499基金资助⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．50 山东农业大学硕士学位论文中文摘要蜜蜂幼虫期营养尤其是蛋白质营养对其生长发育至为关键。目前，蜜蜂蛋白质营养研究多集中在成蜂上，幼虫期蛋白质营养需要研究较为薄弱。本研究利用人工饲养蜜蜂幼虫技术，分别选用酶水解酪素和新鲜蜂王浆为蛋白源，设置不同蛋白水平的食物人工饲喂幼虫，通过测定其生长发育、生理生化及分子生物学指标并加以分析，以探究蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂发育的影响，并确定意大利蜜蜂幼虫食物的适宜蛋白水平。试验一为酶水解酪素及蛋白水平对意大利蜜蜂生长发育的影响。移取1d意大利蜜蜂幼虫960只置于48孔细胞培养板中，平均分为5组：对照组饲喂幼虫基本食物，蛋白水平为8％；试验组分别饲喂添加酶水解酪素的幼虫食物，使各组蛋白水平为9％、10％、11％和12％。采用人工饲养幼虫技术饲喂幼虫直至羽化出房，并对相关指标进行测定。试验结果表明：1)幼虫食物蛋白水平对化蛹率和羽化率影响显著俨<0．05)，两者均表现为蛋白水平9％组最高，8％～10％组显著高于其他组俨<0．05)；蛋白水平12％组只能少数化蛹，但不能成功羽化。2)幼虫期和蛹期体重受幼虫食物蛋白水平影响显著(P0．05)。3)幼虫食物蛋白水平与蜂体蛋白以及血淋巴蛋白含量大致呈正相关，但只有蛹期体蛋白含量显著受蛋白水平的影响伊0．05)。5)幼虫食物蛋白水平显著影响蜂体SOD活性与T-AOC值伊0．05)；蛋白水平对幼虫期和蛹期Mrjpl表达量影响显著(P<0．05)，表现为9％～10％组显著高于其他组(尸<0．05)；蛋白水平对蜜蜂各发育时期垤表达量均有显著影响俨<0．05)，且在新蜂期，蛋白水平8％～10％组的垤表达量更高(尸<0．05)。本研究表明，人工饲养条件下，两种蛋白源对蜜蜂发育的影响大体一致，幼虫食物蛋白水平显著影响化蛹率、羽化率以及蜜蜂不同发育阶段的体重、体蛋白含量、血淋巴蛋白含量、PO活性、CYP450含量、抗氧化活性以及相关基因mRNA相对表达量。综合分析，意大利蜜蜂幼虫能够健康生长发育的适宜幼虫食物蛋白水平为8％～10％。关键词：意大利蜜蜂；蛋白水平；人工饲养技术；生长发育 山东农业大学硕士学位论文EffectsofProteinSourcesandLevelsonDevelopmentofHoneyBee(ApismelliferaL．)RearedinVitroAbstractNutritionespeciallyproteinnutritioninlarvalstageiscriticaltothegrowthanddevelopmentofhoneybee．Proteinnutritionresearchmainlyfocusedonadultbeesandlarvalproteinnutritionresearchisweak．Inthisstudy，atechnologyfortheinvitrorearingofhoneybeelarvaewasutilized．Weselectedenzymatichydrolysiscaseinandfreshroyaljellyasproteinsourcesandsetdifferentlevelsofproteindietstofeedlarvaeinordertoexploretheeffectsofproteinsourcesandlevelsondevelopmentofhoneybeeandcleartheoptimaldietaryproteinlevelsbymeasuringthegrowth，physiobiochemicandmoleculobiologicalindexes．Exp．1Theeffectsofenzymatichydrolysiscaseinanditsproteinlevelsonhoneybeedevelopment．Ninehundredandsixtyofone-day-oldlarvaewereputin48．wellcellcultureplatesanddividedinto5equalgroups：thecontrolgroupWasfedbasiclarvaldietwiththeproteinlevelof8％；theother4trialgroupswerefedlarvaldietswithproteinlevelsof9％，10％，11％and12％whichaddedenzymehydrolysiscasein．Thetechniqueofhoneybeelarvaerearedinvitrowasusedfromlarvaetonewlyemergedbeesandrelatedindexesweremeasured．Theresultsshowedasfollows：1)Dietaryproteinlevelshadasignificanteffectonpupationandeclosion(P0．05)．6)DietaryproteinlevelshadsignificanteffectsonDnmt3expressionlevelatlarvalstage妒<0．05)，butitwasnotsignificantatpupalandnewlyemergedstages(户I>0．05)；Mrjplexpressionlevelinlarvalandpupalstagesweresignificantlyhigherwithproteinlevelsof9％-10％俨<0．05)；Vgexpressionlevelwassignificantlyaffectedbyproteinlevelsineachstage(P0．05)。Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaseleRermeansignificantlydifferent(P<0．05)．Valueswithsameletterornolettermeannosignificantdifference(P>0．05)．3．2酶水解酪素及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体重的影响酶水解酪素及其蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体重的影响见表9。由表9可见，幼虫食物蛋白水平对6d幼虫体重和3d蛹期体重具有显著影响(尸O．05)。在幼虫期，随着幼虫食物蛋白水平升高，幼虫体重呈现先上升后下降的趋势，且蛋白水平为9％～11％时，幼虫体重相当并显著高于12％组(尸<0．05)；对照组的体重处于中间水平，与各试验组之间差异不显著(P>0．05)。在3d蛹期时，蛋白水平9％～11％组体重显著高于8％组(尸<0．05)。新蜂出房后，幼虫食物蛋白水平对其体重影响不显著(胗0．05)，20 山东农业大学硕士学位论文但随着蛋白水平的升高，新蜂初生重同样表现出先升高后降低的趋势。综合分析表明，酶水解酪素为外源蛋白时，蛋白水平在9％-11％时会增加幼虫和蛹期的体重。表9幼虫食物蛋白水平对幼虫、蛹、新蜂体重的影响Table9Effectsofdietaryproteinlevelonweightoflarvae，pupaeandnewlyemergedbees项目ItemC．P8C．P9C-P10C-P11C-P12P值6d幼虫L6(mg)136．30-a：6．39曲152．744-5．15‘153．244-5．491151．784-5．92。132．73+6．0600．03713d蛹P3(mg)133．364-2．176142．93+1．68。144．364-2．51‘144．68+2．86‘⋯⋯0．00780d新蜂NE(mg)118．634-6．82l18．214-3．92136．574-3．59123．754-5．25⋯⋯0．0993妯同行不同小写字母表示差异显著(P<0．05)，相同字母或不标表示差异不显著(JPl>O．05)。Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(P0．05)．3．3酶水解酪素及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量的影响酶水解酪素及其蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量的影响见表10。由表10可见，幼虫食物蛋白水平对6d幼虫体蛋白含量影响不显著(P>0．05)。但在蛹期，蜂体蛋白含量受食物蛋白水平的影响显著(PO．05)，但随食物蛋白水平升高，新蜂体蛋白含量大致呈升高趋势。综上所述，酶水解酪素为外源蛋白时，随着蛋白水平升高，幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量显著升高或呈现升高趋势。表lO幼虫食物蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量的影响Table10Effectsofdietaryproteinlevelonproteincontentoflarvae，pupaeandnewlyemergedbees项目ItemC．P8C．P9C．P10C—P11C·P12P值6d幼虫L6(g／L)O．384-0．0140．37+0．0270．37+0．0190．444-0．0320．424-0．015O．13183d蛹P3(g／L)0d新蜂NE(g／L)0．“士0．0032c0．524-0．020b0．574-0．0051lb0．59a：0．0388⋯一0．00210．254-0．0190．284-0．0150．34士0．0500．334-0．034O．1320a‘c同行不同小写字母表示差异显著(尸0．05)。Inmesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(P0．05)． 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响3．4酶水解酪素及蛋白水平对幼虫血淋巴蛋白、PO和CYP450的影响酶水解酪素及其蛋白水平对幼虫血淋巴中蛋白含量、PO和CYP450的影响见表11。由表中数据可见，幼虫食物蛋白水平对6d幼虫血淋巴PO活性和CYP450含量影响显著(尸<0．05)，对血淋巴蛋白影响不显著(胗0．05)。就血淋巴蛋白含量而言，幼虫食物蛋白水平对血淋巴蛋白含量影响不显著(尸>0．05)。幼虫血淋巴中PO活性表现为蛋白水平12％组显著低于其他组(P<0．05)；8％～11％组之间差异不显著胗0．05)，但呈现降低趋势。蛋白水平对血淋巴CYP450含量影响显著(P0．05)；且8％～9％组CYP450含量显著高于11％～12％组俨0．05)。Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(P<0．05)．Valueswithsameletterornolettermeannosignificantdifference(P>0．05)．3．5酶水解酪素及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂抗氧化能力的影响酶水解酪素及其蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂抗氧化活性的影响见表12。如表12所示，在不同的发育阶段，幼虫食物蛋白水平对SOD活性均具有显著影响(尸<0．05)；对T-AOC而言，蛋白水平对幼虫和新蜂期影响显著(尸<0．05)，但对蛹期影响不显著(尸>0．05)。在6d幼虫期，随着蛋白水平升高，SOD活性呈现先上升后降低的趋势，且蛋白水平为10％组SOD活性最高，显著高于8％、9％和12％组(尸<0．05)。T-AOC表现为11％组ToAOC值最高，且10％～12％组显著高于8％组(尸0．05)，但与其他组存在显著差异俨<0．05)。ToAOC在3d蛹期差异不显著(尸>0．05)，但是随日粮蛋白水平升高呈现出先升高后降低的趋势。SOD活性在新蜂期与3d蛹期相似，随蛋白水平升高呈降低趋势，且8％与9％组差异不显著(P>0．05)。新蜂期T-AOC值受蛋白水平的影响显著(尸<0．05)，表现为9％组ToAOC值最高，显著高于12％组(P<0．05)，但与其他组差异不显著p0．05)。综合以上结果，酶水解酪素为外源蛋白时，在幼虫期，SOD活性和T-AOC值随蛋白水平升高均呈现先上升后下降的趋势；在蛹期和新蜂期，SOD活性均表现为8％组最高；T-AOC值均表现为9％组最高。可见，随机体发育，幼虫食物蛋白水平为8％～9％时，更能增加机体的抗氧化能力。表12幼虫食物蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂虫体抗氧化活性的影响Table12Effectsofdietaryproteinlevelonantioxidantactivitiesoflarvae，pupaeandnewlyemergedbees项目Item6d幼虫L63d蛹P30d新蜂NESODT．AOCSODT-AOCSODT-AOC!竺!翌鲤竺型(堕塑墅2虫!望生塑2型!竺塑墅2型l堕塑婴2型!型!翌婴2型C·P862．58士2．81b41．68土2．92c91．51+2．22a79．274-2．94123．07+5．08-178．24士11．65aC-P964．74士3．20b47．69士6．10bc84．26士2．30曲83．05士2．78110．23士4．23曲186．8512．98aC-P1075．17士2．01a57．43士3．64ab80．26士2．65bc78．25士-0．8188．39士11．44bc153．66士15．97|bC-P1169．23士2．95ab61．69士4．02a74．65士0．88c77．57士2．0481．90士4．60c132．09士10．92b尸值0．04000．02300．00430．33820．00860．0382“同列不同小写字母表示差异显著(尸<0．05)，相同字母或不标表示差异不显著(P>0．05)。Inthesamecolumn，valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(P<0．05)．Valueswithsameletterornolettermeannosignificantdifference(D-0．05)．3．6酶水解酪素及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂相关基因表达量的影响图6为酶水解酪素及其蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂相关基因相对表达量的影响。如图6所示，酶水解酪素及其蛋白水平对蜜蜂发育各阶段Dnmt3基因相对表达量的影响不显著p0．05)，但随着蛋白水平升高，Dnmt3在各发育阶段均呈现先降低后升高的趋势，且Dnmt3在蛹期的基因表达量最低。就Mrjpl而言，幼虫食物蛋白水平显著影响幼虫期此基因的表达(氏0．05)，表现为蛋白水平9％～10％组显著高于8％组∽0．05)。蛋白水平对蛹期Mrjpl相对表达量的影响没有达到显著水平(胗0．05)。在新蜂 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响期，蛋白水平对Mrjpl表达量影响显著俨<0．05)，表现为9％-10％组显著高于11％组f尸<0．05)。由图6还可看出，强在幼虫期和蛹期的相对表达量很低，在新蜂期急剧升高。蛋白水平显著影响6d幼虫堙相对表达量(尸o—cols8Jdxu《Zg量u^I葛一2f，毫￡q惦佰¨竹住”仲oo，拍”¨仙：宝∞I。>Q—cc育器Jd×。《zgEu^l哥l。k、室 山东农业大学硕士学位论文I，6P3NE图6幼虫食物蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂相关基因表达量的影响Figure6EffectsofdietaryproteinlevelonrelativemRNAexpressionleveloflarvae，pupaeandnewlyemergedbees3．7蜂王浆及蛋白水平对化蛹率和羽化率的影响蜂王浆及其蛋白水平对化蛹率和羽化率的影响见表13。如表13所示，蜂王浆及其蛋白水平对幼虫化蛹率和蛹羽化率均有显著影响(尸<0．05)。就化蛹率而言，蛋白水平8％～1l％组显著高于12％组伊<0．05)。就羽化率而言，12％组同样不能成功羽化，且在蛹的后期全部死亡。具体而言，随蛋白水平升高，羽化率先微弱升高后显著降低，9％组羽化率最高，但与8％组差异不显著(尸>0．05)；11％组的化蛹率较其他组显著降低(尸<0．05)。综合化蛹率和羽化率可得，以蜂王浆为蛋白源时，蛋白水平8％～9％可使化蛹率和羽化率保持较高水平，且蛋白水平为9％时，两者均最佳。蛋白水平超过11％时，幼虫化蛹率显著降低；蛋白水平超过9％特别是10％后，羽化率显著降低。表13幼虫食物蛋白水平对化蛹率和羽化率的影响Table13Effectsofdietaryproteinlevelonthepercentageofpupationandeclosion“同行不同小写字母表示差异显著(尸0．05)。Inthesanlerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(P0．05)．百>u—cols∞2‘Ixo《zgEo^I苦l。L璺 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响3．8蜂王浆及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体重的影响蜂王浆及其蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体重的影响见表14。由表14可见，幼虫食物蛋白水平对幼虫期的体重具有显著影响(尸<0．05)，但对蛹和新蜂体重影响不显著(P>0．05)。在6d幼虫期，蛋白水平8％～10％组的体重显著高于12％组俨<0．05)，11％组与各组之间差异不显著p0．05)。在3d蛹期，体重受蛋白水平影响不显著(P>0．05)，但呈现先升高后降低的趋势。新蜂初生重随蛋白水平升高略微降低，但是各组在数值上较为接近。由此可见，蜂王浆及其蛋白水平为8％～10％时，幼虫期体重显著升高(尸0．05)。Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferentfP<0．05)．ValueswithsameletterornolettermeannosignificantdifferencefP>O．05)．3．9蜂王浆及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量的影响蜂王浆及其蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量的影响见表15。如表15所示，蜜蜂在各发育阶段，蜂体蛋白含量均明显受幼虫食物蛋白水平的影响(尸<0．05)。在6d幼虫期，随食物蛋白水平的升高，虫体蛋白含量大致呈现升高趋势，具体而言，10％和12％组体蛋白含量显著高于8％组旧<0．05)，9％和11％组的体蛋白含量处于中间水平，与其他各组没有显著差异(10>o．05)。在3d蛹期，随蛋白水平升高，体蛋白含量逐步升高，其中10％组体蛋白含量处于中间水平；8％～9％组显著低于11％～12％组(尸<0．05)。在新蜂期，体蛋白含量呈现出与蛹期相似的表现规律，随食物蛋白水平升高而升高。具体而言，蛋白水平8％～9％组的体蛋白含量差异不显著p0．05)，但显著低于10％和11％组(尸<0．05)；11％组体蛋白含量最高，且与其他组之间差异显著(P<0．05)。26 山东农业大学硕士学位论文综合以上分析可得，以蜂王浆为蛋白源时，随着幼虫食物蛋白水平升高，不同时期的蜂体蛋白含量均呈现升高的状态或趋势。表15幼虫食物蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂体蛋白含量的影响Table15Effectsofdietaryproteinlevelonproteincontentoflarvae，pupaeandnewlyemergedbees项目ItemR．P8R．P9R．P10R．P11R．P12P值6d幼虫L6(g／L)0．49士0．04060．56士0．028曲O．58+0．022。0．56-4：0．01l曲0．63+0．019‘O．02383d蛹P3(g／L)0．54士0．020。0．61士0．030k0．68士0．021曲0．73j=0．021。0．76士0．018‘0．00070d新蜂NE(g／L)0．30-士0．036cO．36：￡-0．012。O．45士0．0256O．58--L0．018‘⋯⋯O．0002“同行不同小写字母表示差异显著(P(O．05)，相同字母或不标表示差异不显著(尸>O．05)。Inthesanlerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(P<0．05)．Valueswithsameletterornolettermeannosignificantdifference(尸>0．05)．3．10蜂王浆及蛋白水平对幼虫血淋巴蛋白、PO和CYP450的影响蜂王浆及其蛋白水平对幼虫血淋巴中蛋白含量、PO和CYP450的影响见表16。幼虫食物蛋白水平对6d幼虫血淋巴中的蛋白含量和PO活性具有显著影响伊<0．05)，但对CYP450影响不显著(尸>0．05)。血淋巴中的蛋白含量随幼虫食物蛋白水平的升高而升高，具体而言，蛋白水平10％～11％组处于中间水平，8％～9％组显著低于12％组f尸0．05)。血淋巴中CYP450含量受蛋白水平的影响不显著p0．05)，但是随蛋白水平升高大致呈现先升高后降低的趋势。综合分析，以蜂王浆为蛋白源时，随幼虫食物蛋白水平升高，蛋白含量在血淋巴中的沉积随之增加；PO在蛋白水平80／旷10％特别是8％～9％时，活性较高；CYP450同样在蛋白水平为8％～10％时含量较高。表16幼虫食物蛋白水平对6d幼虫血淋巴的影响Table16Effectsofdietaryproteinlevelonhemolymphof6dlarvae“同行不同小写字母表示差异显著(P0．05)。Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferentf尸<0．05)．ValueswithsameletterornolettermeannosignificantdifferencefP>O．05)． 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响3．11蜂王浆及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂抗氧化能力的影响蜂王浆及其蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂抗氧化活性的影响见表17。如表17所示，幼虫食物蛋白水平对蜂体发育各阶段的抗氧化活性均有不同程度的影响。就6d幼虫而言，虫体SOD活性各组之间差异不显著(尸l>0．05)。虫体T-AOC表现为8％～9％组显著低于11％～12％组(尸<0．05)，10％组与各组之间差异不显著(胗0．05)。在3d蛹期，SOD随蛋白水平升高显著降低(尸<0．05)，且蛋白水平8％～9％组显著高于11％～12％组俨0．05)。蛋白水平对蛹期T-AOC的影响没有达到显著水平(P>0．05)，但随蛋白水平的升高呈先升高后降低的趋势。在新蜂期，蜂体SOD活性随蛋白水平升高而降低，其中8％组与9％组差异不显著(P>0．05)，但显著高于10％～11％组(尸<0．05)。T-AOC随蛋白水平升高而降低，且8％～9％组显著高于11％组(尸<0．05)，10％组与各组之间差异不显著(胗0．05)。总而言之，以蜂王浆为蛋白源时，在6d幼虫期和3d蛹期，蜂体抗氧化活性随幼虫食物蛋白水平升高大致呈现先升高后降低或一直降低的趋势；在新蜂期，随蛋白水平升高，蜂体抗氧化活性逐渐降低，蛋白水平为8％～9％时，有利于蜂体保持较高的抗氧化能力。表17幼虫食物蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂虫体抗氧化活性的影响Table17Effectsofdietaryproteinlevelonantioxidantactivitiesoflarvae，pupaeandnewlyemergedbees项目Item6d幼虫L63d蛹P30d新蜂NESODT-AOCSODT-AOC(U／mgport)(Ulmgport)(U／mgport)一面西———石丽西万——西丽五秀-—聂丽五百-—i再画丽——面石函而F—1五五丽矿R-P9R-P10R-P11R．P12JP值67．14+5．5865．20士3．9059．98士1．7556．54i-0．4l0．40ll90．15+6．36曲76．05+7．10b71．65+1．25b0．0262”。同列不同小写字母表示差异显著(尸<0．05)，相同字母或不标表示差异不显著(尸>0．05)。Inthesamecolumn，valueswithdifferentlowercaseleRermeansignificantlydifferent(P0．05)．28聍埘驴一m姗一凇～吣m卜孙6●一J70●王旬K呲一～触㈣iL098肘妒万专!o一眦心删一拍孔钉弘mJ■5242限m蚶呲删吼niZC 山东农业大学硕士学位论文3．12蜂王浆及蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂相关基因表达量的影响图7为蜂王浆及其蛋白水平对幼虫、蛹和新蜂相关基因表达量的影响。如图7所示，就Dnmt3基因而言，蜂王浆及其蛋白水平显著影响幼虫期此基因的表达俨<0．05)。具体而言，蛋白水平8％～10％组的Dnmt3表达量显著低于12％组俨<0．05)，11％组处于中间水平，除显著高于9％组外(P<0．05)，与其他组差异不显著p0．05)。蛋白水平对蛹期和新蜂期的Dnmt3基因表达影响不显著胗0．05)，但随着蛋白水平升高，均表现出先降低后升高的趋势。就MrjpI基因而言，幼虫食物蛋白水平可显著影响幼虫期和蛹期的表达量(尸0．05)。在新蜂期，蛋白水平对MrjpI的表达没有显著差异(P>0．05)。蜂王浆及其蛋白水平对蜜蜂发育各阶段的垤基因表达量均具有显著影响俨<0．05)。在幼虫期，蛋白水平8％组显著低于11％～12％组俨<0．05)，9％～10％组的垤表达量处于中间水平，与其他组差异不显著胗0．05)。在蛹期，蛋白水平10％表达量最高，显著高于8％和12％组俨<0．05)，但与9％和11％组差异不显著p0．05)。新蜂出房后，蛋白水平8％～9％组显著高于11％组(P<0．05)，但与10％组差异不显著(尸>0．05)。29208642O86420越抽他¨他们¨旺∞艺>u一=oIs竹uJd)cu《弓暑一u^I葛一3Jf，毫￡Q 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响囫R—P8§§§图R—P9E乙刁R—P10E§图R-P11圆R—P12毳虞毳恚卣国酋卤卤卣图,耋a囱ab卤南冀蓁NEl圆R-P9aabj．耋饔羹l眩勿R·P10l冀蓁鋈l区图R·P11l区l翻R-P121aab虞宜疡惑南惑岛溯abL6图7幼虫食物蛋白水平对幼虫、P3NE蛹和新蜂相关基因表达量的影响Figure7EffectsofdietaryproteinlevelonrelativemRNAexpressionleveloflarvae，pupaeandnewlyemergedbees30侣侣¨竹惶”竹98，拍加协加帖∞13>3I口oIS∞uJd"cu《ZEII—u^11813．I、氢。苫咖啪啪m抛∽啪=；拍加”仙¨∞一u>u—co谨∞uJax。《ZE暑u^l葛一u-8一 山东农业大学硕士学位论文4讨论4．1不同蛋白源对人工饲养条件下意大利蜜蜂发育的影响试验一在配制人工幼虫食物时，考虑到常温下酪蛋白在水中仅可溶解O．8‰1．2％，因此本试验选择易溶于水的酶水解酪素，即酶水解的酪蛋白作为外源蛋白。酪蛋白的营养功能研究已久，Sato等(’1991)报道，当给小鼠饲喂含有酪蛋白的日粮时，小鼠腿组织中的钙含量增加，进一步验证了其促钙吸收的有效性。养蜂生产中，酪蛋白常作为饲料补充剂，常用于提高蜂群饲粮的蛋白水平，试验证实，酪蛋白与蔗糖混合，能显著提高新蜂体蛋白含量，有助于蜂群健康(DeGroot，1950；Doulleta1．，1980)。蜂王浆是供应蜂王和蜜蜂小幼虫食用的浆状物，是蜜蜂幼虫人工饲养的主要蛋白来源。目前，蜂王浆的研究主要集中在其功能验证、分子生物学研究、成分测定以及质量评估等方面(季文静和胡福良，2011)。程艳华等(2008)利用不同配比的茶花粉和黄豆粉饲喂蜂群，结果发现，蛋白质营养水平对蜂王浆产量以及粗蛋白含量等均有显著影响。大量研究表明，蜂王浆具有抗菌消炎、调节心血管系统、抗氧化、抗疲劳以及营养作用等，其生物活性主要归因于脂肪酸、蛋白质和酚类物质等(RamadanandAl．Ghamdi，2012)。本研究中，试验一和试验-,JJ用两种蛋白源探究蜜蜂幼虫食物的适宜蛋白水平时，由于试验时间以及测样时间的不同，导致本课题没有把同一蛋白水平下两种蛋白源的差异进行统计学分析，只是在数值上做了简单比较以仅做参考。就化蛹率和羽化率而言，两种蛋白源蛋白水平8％～10％组在数值上较为接近，但是，蜂王浆组在高蛋白水平时的表现要优于酶水解酪素组。蜂王浆组在蜜蜂发育各阶段的体重、体蛋白含量和血淋巴中CYP450含量等大致高于同蛋白水平的酶水解酪素组；在血淋巴蛋白含量、PO活性等指标上，两种蛋白源的表现在数值上接近；在蜜蜂发育各阶段的抗氧化能力等方面，酶水解酪素组大体上高于蜂王浆组。由此可见，两种蛋白源对人工饲养条件下蜜蜂发育的影响各有利弊，但是，考虑到试验时间的不同，总体认为两种蛋白源在各测定指标数值上的差异并不大，粗略判定它们对蜜蜂发育的影响大体一致。4．2幼虫食物蛋白水平影响化蛹率和羽化率蛋白质作为一切生命的物质基础，在蜜蜂生长发育各阶段都发挥着重要作用。蛋白 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响源及蛋白水平对化蛹率和羽化率的影响研究多见于成蜂。例如，Herbert(1980)用蛋白水平分别为43％、58％和90％的蛋白源饲喂蜂群，12周后发现，饲喂蛋白水平为58％的乳清酵母组的子量得到显著提高。李成成等(2011)以多种饲料原料配制成不同蛋白水平的蜜蜂饲粮饲喂蜂群，结果发现，不同蛋白水平的人工代用花粉显著影响蜂群的蜂卵孵化率和幼虫化蛹率，且代用花粉蛋白水平为30％～35％时，孵化率和化蛹率达到最佳水平。此外，蜜蜂是一类全变态发育的社会性昆虫，其在幼虫期和成蜂期的营养物质需要量具有较大差异。Aupinel等(2005)对人工饲养幼虫技术进行了改进，由此化蛹率和羽化率较之前得到提高。Huang(2009)较为系统的阐述了室内饲养幼虫的标准方法，对1～3d幼虫，每天每只饲喂100uL食物，4-6d幼虫每天每只饲喂200uL食物，此方法的幼虫化蛹率可达92．9％，羽化率可达79．2％。本试验中，两种蛋白源的测定结果具有相似之处，均表现为蛋白水平8％～10％组的化蛹率大于85％，蛋白水平8％～9％组的羽化率大于70％，这与Huang(2009)的试验结果接近，化蛹率和羽化率的相对偏低也与环境条件的制约与操作的熟练程度等因素有关。此外，两种蛋白源在化蛹率和羽化率上也表现出不同之处，在蜜蜂生长发育过程中，蜂体对酶水解酪素的蛋白变化较蜂王浆而言更为敏感，当蛋白水平超过10％时，化蛹率开始显著降低，且12％组在化蛹前期全部死亡，可能的原因是蛋白质水平超过适宜范围后会加重机体代谢的负担，蛋白水平过高时不利于幼虫的健康生长，甚至导致幼虫不能成功羽化(王改英等，2011)。当蛋白源为蜂王浆时，蛋白水平12％组同样不能羽化，这也与其食物中不含葡萄糖和果糖有关(Kaftanoglueta1．，2010a)。4．3幼虫食物蛋白水平影晌蜜蜂发育时期的体重通常，蜂王在产卵高峰期，一天可产1500～2000粒卵，蜂卵3天后可孵化成幼虫。刚孵化的幼虫呈蛋清色，重约0．1mg，发育24小时后，体色逐渐变为白色(周冰峰，2002)。试验结果显示，人工饲养条件下，酶水解酪素为蛋白源时，6d幼虫的体重在132．73～153．24mg；蜂王浆为蛋白源时，6d幼虫体重为129．67～170．08mg，这与文献中工蜂幼虫最大体重为144～162mg的试验结果相近(HrassniggandCrmlsheim,2005)，这也证明了Michelette和Soares(1993)的观点，既幼虫阶段是采食的关键阶段，也是体重的快速增长期。幼虫在6d末或7d初开始排便后进入预蛹期，生长代谢活动减弱，且不再有食物供给，所以蛹期体重在一定程度上下降，试验结果符合预期及生物学规律。32 山东农业大学硕士学位论文蜜蜂在不同阶段的重量和体蛋白含量多有报道。但蛋白水平对蜜蜂个体的营养状况影响不大，而蜂体重尤其是新蜂重，明显受蜂群营养状态的影响(Black，2006)。因此，新蜂重是衡量个体质量的重要指标。试验结果显示，人工饲养条件下不同蛋白源的新蜂体重在118．21～136．57mg或者141．70～146．07mg之间，而自然蜂群的工蜂初生重范围是81-151mg(Bowen—WalkerandGunn，2001；PageandPeng，2001)，春繁时期处女王的初生重均大于180mg(K09andKaracaoglu，2004)。结合形态学观察，可认为此方法培育的新蜂全部为工蜂。两种蛋白源的不同蛋白水平对新蜂体重影响不显著，原因可能是经过了较长时间的蛹期，蜜蜂已适应相应的蛋白浓度，只要能够成功羽化，就说明此蛋白水平在一定程度上可被蜜蜂接受。此外，随食物蛋白水平升高，两种蛋白源在各发育时期的体重均表现出先升高后降低的趋势，原因可能是适当的提高食物蛋白水平，有利于营养物质的吸收；但当蛋白水平过高时，采食量降低，代谢负荷加重，蛋白质利用率降低，最终导致体重下降(王改英等，2011)。4．4幼虫食物蛋白水平影晌蜜蜂发育时期的体蛋白含量及血淋巴蛋白含量蜜蜂在幼虫期必须摄入足够的蛋白质，以满足自身正常的生长发育与机体构成，因此，测定蜂体内的蛋白质含量具有重要意义(DeJongeta1．，2009)。郭海坤(2009)发现，不同配比的油菜花粉和黄豆粉混合饲料对3d工蜂幼虫蛋白质含量影响不显著，但对6d幼虫的蛋白质含量影响显著。本试验中，随着幼虫食物蛋白水品的升高，蜂体蛋白含量大致呈现升高趋势，这也符合Schmickl和Crailsheim(2001)的观点，他们研究发现，当蜂房中的花粉较少时，蜂体平均蛋白含量为7．69％，而花粉储存量较高时，体蛋白含量可达8．51％。分析原因，可能是幼虫食物会影响蜜蜂生长发育各阶段的蜂体蛋白质摄入量，且两者呈正相关。也就是说，当幼虫食物蛋白水平在一定范围内升高时，蜂体吸收的蛋白质越多，体蛋白含量越高。研究表明，测定6d工蜂血淋巴蛋白质浓度是检测蜜蜂不同代用花粉饲料中蛋白质营养的有效方法(Cremonezeta1．，1998)，血淋巴蛋白含量反应了代用花粉的质量以及蜜蜂对蛋白质的利用能力。Michelett和Engels(1995)首次测定了非洲化蜜蜂和卡尼鄂拉蜂胚后发育时期的血淋巴蛋白含量，研究表明，在幼虫后期，血淋巴蛋白含量迅速升高，但在预蛹期下降并在蛹蜕皮时达到最低水平；血淋巴蛋白在蛹前期再次升高，并在新蜂羽化后降低。两个蜂种除了5d幼虫的血淋巴蛋白差异显著外，其他时期均表现为 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响差异不显著。而Cappelari等(2009)等对新出房的非洲化蜜蜂和卡尼鄂拉蜂进行笼养，并饲喂蛋白饲粮，结果发现，非洲化蜜蜂的血淋巴蛋白含量显著高于卡尼鄂拉蜂。由此说明，不同蜂种对饲料蛋白质的利用能力并不相同。关于蜜蜂幼虫血淋巴中蛋白含量的研究较少，有学者利用蛋白质组学和质谱方法对工蜂在不同发育阶段的免疫反应进行了研究，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳对不同处理的工蜂幼虫血淋巴进行蛋白质检测，结果发现，人工饲养的蜜蜂幼虫对防腐剂和败血性损伤有显著的体液反应(Randolteta1．，2008)。4．5幼虫食物蛋白水平影晌蜜蜂发育时期的免疫能力与抗氧化能力PO具有较高的免疫活性，由血细胞合成后释放入血淋巴中。Laughton等(2011)研究了不同发育阶段以及不同级型的蜜蜂中PO活性，结果发现，幼虫的PO活性相对较低，蛹期因表皮黑化作用逐步增加；工蜂较雄蜂而言，能产生更强的免疫应答反应，且采集蜂的PO活性较哺育蜂高。有学者指出，昆虫表皮黑化以及免疫功能受日粮蛋白质量的影响(Leeeta1．，2008)，Alaux等(2010)用不同蛋白水平的单一花粉和混合花粉饲喂蜜蜂，发现高蛋白混合花粉组10d蜜蜂的PO活性显著高于蔗糖组，其他花粉组在数值上均大于蔗糖组，但是差异没有达到显著水平。本试验中，幼虫食物蛋白水平可显著影响血淋巴中PO活性，进一步验证了蛋白对PO的影响以及PO在黑化和免疫方面的作用。关于蜜蜂CYP450的研究多集中在分子机理和解毒功能等方面。例如，Evans和Wheeler(2000)研究了蜜蜂在级型分化中的基因表达模式，结果发现，工蜂幼虫和蜂王幼虫存在显著差异，蜂王幼虫过表达一些代谢酶类，而工蜂幼虫过表达CYP450家族等。唐晓伟(2011)利用四种药剂的LC50做药膜，测定处理48h后的工蜂CYP4500．脱乙基活性的变化，结果发现，经药剂处理后的意大利蜜蜂头部、中肠中酶的活性均高于对照组。蜜蜂营养对CYP450的影响研究未见报道，但是营养因素会影响蜂体的抗病力与免疫能力，因此，本研究就蛋白水平对血淋巴中的CYP450的影响进行了初步探索，结果发现，当酶水解酪素为蛋白源时，蛋白水平显著影响CYP450的含量，但是蜂王浆及其蛋白水平对其影响不显著。研究发现，营养抗氧化剂在细胞抗氧化防御体系中发挥着重要作用，主要的营养抗氧化剂包括维生素E、维生素C、D．类胡萝b素、硒、铜以及锌等。此外，日粮蛋白水34 山东农业大学硕士学位论文平也会影响脂质过氧化反应以及抗氧化酶的活性(Yahiaeta1．，2003)。Capearova等(2013)将成年大鼠随机分成三组，对照组不添加花粉，两个试验组分别添加300、500mg／kg的花粉，饲喂90天后发现，500mg／kg组的抗氧化活性显著增加。但Gu等(2008)用20％或60％的大豆蛋白以及酪蛋白饲喂雄性小鼠两周，结果发现，高蛋白组的超氧阴离子以及丙二醛含量升高，SOD活性降低。作者推断，日粮蛋白水平过高时，会导致机体氧化与抗氧化之间的不平衡，从而进一步诱导了机体的氧化应激反应。但当动物机体蛋白质摄入不足时，其抗氧化能力也会下降，氧化应激增强，继而增加感染和活性氧诱导的组织损伤的敏感性(LietaL，2002)。蜜蜂抗氧化能力的研究近年来不断深化。Kumazawa等(2004)比较了14个国家所产蜂胶的抗氧化能力，发现抗氧化能力较强的蜂胶中含有更多的山柰酚和咖啡酸苯乙酯等抗氧化混合物。Buratti等(2007)采用一种新的电化学方法代替传统的分光光度法，对不同植物以及不同地域的蜂蜜、蜂胶和蜂王浆进行抗氧化能力的测定，结果发现，蜂胶抗氧化能力最强，蜂王浆和蜂蜜次之。一般认为，机体为保持较长的寿命，会产生较少的ROS，以增加抗氧化能力，但是研究发现，蜂王的抗氧化基因表达量较工蜂低，由此推断，蜂王以其他途径保持长寿，但具体机理还有待探索(CoronaetaL，2005)。Williams等(2008)测定了哺育蜂和采集蜂的肌肉和头部组织的抗氧化能力，研究发现，采集蜂的肌肉组织含有较高的HSP70和总抗氧化能力。本试验结果显示，人工饲养条件下，机体的抗氧化能力受到幼虫食物蛋白水平的影响。在6d幼虫期，食物蛋白水平为10％或11％组有更高的SOD活性和T—AOC值。但在3d蛹期和0d新蜂期，均表现为8％或9％组SOD活性和T．AOC值最高。由此说明，对6d幼虫而言，食物中蛋白水平提高后，幼虫虫体的抗氧化活性增强。但随着日龄的增加，过高的蛋白水平对蜜蜂的不利影响逐渐显现，蛋白水平为8％～9％时，机体能更好的发挥抗氧化作用。推测原因，可能是适量的蛋白质供给能使机体更有效的清除自由基，以调节机体正常的氧化还原反应(李成成，2011)。本试验还发现，3d蛹期的抗氧化活性高于6d幼虫期，而新蜂活性最高。而一些研究显示，相关抗氧化酶活性在个体发育中呈现先降低后升高的趋势，且蜜蜂的抗氧化酶基因在蛹期表达量最低(InaletaL，2001；肖培新等，2010)。本试验结果与之有出入，这可能与各阶段不同的取样日龄、不同的饲养方式和个体生理代谢等有关。 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响4．6幼虫食物蛋白水平影响蜜蜂发育时期的相关基因表达量2006年，蜜蜂全基因组序列被刊出，其中重大发现之一就是蜜蜂不同于果蝇和线虫，而是与人类相似，具有全部的DNA甲基化转移酶，使其能够通过调控基因表达灵活的适应环境变化。雌性蜜蜂的级型分化与DNA甲基化有关已经得到证实：蜂王和工蜂脑部的DNA甲基化形式并不相同，即蜂王浆影响了其脑部甲基化形式，决定了蜜蜂的级型分化(Lykoeta1．．2010)。Zwier等(2012)通过对金小蜂进行基因组测序，确定了其3种DNA甲基化基因，且PDnmtl、Dnmt2和Dnmt3，并指出DNA甲基化在金小蜂早起发育过程中起重要作用。近年来，随着全基因组DNA甲基化检测技术的发展，营养因素对DNA甲基化的影响研究日益深入。Shi等(2011)研究发现，在相同空间下，随幼虫采食蜂王浆时间的增加，幼虫Dnmt3酶活性、Dnmt3mRNA相对表达量显著降低，幼虫发育成蜂王的比例上升。此外，当营养因素不变时，幼虫Dnmt3酶活性、Dnmt3mRNA相对表达量随发育空间减小而上升，幼虫发育为工蜂的比例增加。本试验中，除了蜂王浆为蛋白源对6d(gJJ虫期Dnmt3表达量影响显著外，其他均表现为蛋白水平对Dnmt3表达量影响不显著。两种蛋白源的不同蛋白水平对新蜂Dnmt3表达量影响不显著，也说明羽化新蜂的级型一致，结合体重指标与形态学观察，进一步说明了羽化新蜂为工蜂。近几年来，Mrjps家族的结构与功能研究日益成为蜜蜂学的研究热点。Mrjps家族是一种多功能蛋白质，在蜜蜂真社会性行为的各方面都发挥着重要作用(Drapeaueta1．，2006)。一般认为，Mrjps的表达与工蜂年龄有关，在蜂群中，工蜂在20d后主要采集花蜜、花粉、水和树脂等，而不再负责巢内工作。而试验表明，较采集蜂而言，Mrjps在哺育蜂的咽下腺表达水平更高。除-[Mrjp8，其他Mrjps均可在蜂王浆或咽下腺中检测到，N_Mrjpl一5的表达更高。这就说明7"Mrjps在蜜蜂营养中的作用，且主要具有营养作用的是Mrjp1-5(Alberteta1．，1999，Buttstedteta1．，2013b)。Mrjpl的分子量约为56-57kda，是一种高度保守的弱酸性糖蛋白，在自然状态下是由非共价键连接而成的低聚体复合物。Mrjpl在蜂王浆中最为丰富，但其在王浆产品中并非含量相同或分布均匀(陶挺等，2008；Tamuraeta1．，2009)。研究表明，Mrjpl除了在工蜂咽下腺中高表达外，在大脑也可表达(Garciaeta1．，2009；Peixotoeta1．，2009)。Majt矗n等(2006)等利用基因工程的方法，在体外表达重组的Mrjpl并进行功能试验，结果发现它能刺激巨噬细胞释放肿瘤细胞坏死因子，从而揭示-了Mrjpl的抗肿瘤作用。Mrjpl还是蜂王浆中决定蜜蜂级型分化的关键生长因子(Kamakura，2011；Kupkeeta1．，2012)，该蛋白可激活脂肪体中表皮生长因子36 山东农业大学硕士学位论文信号通路，引发蜂王特征的出现(柳丹丹等，2012)。基于Mrjpl在Mrjps家族中的重要地位，本研究选择Mrjpl为代表，力求进一步探究Mrjpl在蜜蜂营养中的作用。试验结果表明，幼虫食物蛋白水平可对幼虫期的Mrjpl表达量产生显著影响，两种蛋白源均表现为蛋白水平9％～10％组的Mrjpl表达量较高，新蜂期的规律相似，但是蜂王浆为蛋白源时，新蜂期的Mrjpl表达量没有达到显著水平。王改英(2012)研究发现，代用花粉蛋白质水平对工蜂头部Mrjpl基因mI斟A表达量有显著性影响。由此说明，适宜的蛋白水平会提高Mrjpl的基因表达量。此外，研究发现，Mrjpl在幼虫血淋巴中的表达量显著高于蛹期血淋巴表达量(WoltedjietaL，2013)，与其结果一致，本试验中两种蛋白源均表现为蛹期Mrjpl表达量低于幼虫期。蜜蜂是目前研究垤功能多效性中最为典型的昆虫代表(PageandAmdam，2007)。同位素示踪试验证实了蜜蜂瞻是幼虫食物的来源之一，研究者将14C标记的瞻注射到哺育蜂血淋巴中，结果发现，哺育蜂咽下腺以及其饲喂的幼虫和蜂王体内均能检测出被标记的Vg(Amdameta1．，2003；严盈等，2010)。一般来说，堙的产生与卵黄细胞的成熟有关，因此，相关研究多集中在蜜蜂成蜂期。但是，有报道称，在幼虫期和蛹期的某阶段也可检NNVg表达。对于工蜂幼虫而言，VgmRNA表达量在2~4d具有较高水平，5d后开始下降，以致蛹前期几乎检测不到，但在蛹后期再次升高。蜂王和雄蜂在发育期的瞻表达量与工蜂相似(Guiduglietal．，2005)。本试验中，幼虫期和蛹期VgN对表达量极低，而新蜂期急剧升高，这与前人利用RT-PCR、Northernblot以及Westernblot得到的实验结果相符(Piulachseta1．，2003；Guiduglieta1．，2005)。推测原因，可能与JH和蜕皮激素的调节有关。蜜蜂主要通过JH来调控瞻，而堙对JH同样具有反作用。有研究显示，不同于大多数昆虫，蜜蜂体内JH与瞻呈负相关(Amdameta1．，2006)，也就是说，工蜂体内低剂量的JH是导致瞻水平升高的原因之一。此外，蜕皮激素可上调瞻水平。蜕皮激素在蛹期下降，能够抑制增的合成，使蛹期坛表达量显著降低(Pintoeta1．，2000；Barchuketa1．，2002；李继莲，2009)。试验结果表明，酶水解酪素及其蛋白水平对幼虫期和蛹期的增基因表达具有显著影响，蜂王浆及其蛋白水平对蜜蜂生长发育各阶段的堙表达均影响显著。由此说明，营养状况会影响蜜蜂增表达量，蜜蜂瞻的合成与蛋白质的摄入相关，且适宜的蛋白水平能够提高蜂体喇乏达量(BitondiandSim6es，1996)。 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响5．1总体结论5总体结论、创新点及展望5．1．1人工饲养条件下，幼虫食物蛋白水平影响幼虫化蛹率、蛹羽化率以及蜜蜂不同发育阶段的体重、体蛋白含量、血淋巴蛋白含量、PO活性、CYP450含量、抗氧化能力以及相关基因mRNA相对表达量。5．1．2当添加酶水解酪素或者新鲜蜂王浆作为蛋白源时，意大利蜜蜂幼虫能够健康生长发育的适宜幼虫食物蛋白水平占其鲜重的8％～10％，当幼虫蛋白水平为12％时，幼虫生长发育受阻，且最终均不能成功羽化为新蜂。5．2创新点本试验选用两种不同来源的蛋白质，从生长发育、生理生化以及分子生物学等方面，系统研究了蜜蜂幼虫食物的适宜蛋白水平，并首次将室内人工饲养蜜蜂幼虫技术应用到幼虫蛋白质营养研究中，在人工饲养幼虫技术体系的应用上开辟了新方法，并为人工饲养条件下幼虫食物的配制提供了新思路，从而填补了蜜蜂幼虫营养研究的空白，进一步丰富了蜜蜂营养学研究。5．3研究展望5．3．1本试验得到了人工饲养条件下意大利蜜蜂幼虫食物的适宜蛋白质添加水平，但是设定的蛋白质梯度较少，取样日龄较少，且缺乏对氨基酸种类和比例的深入研究，希望今后的研究更加系统，以更准确的反应幼虫食物的蛋白水平。5．3．2随着蜜蜂全基因组的测定以及分子生物学研究的深入，蜜蜂基因组学、蛋白质组学以及机体信号通路的研究己成为研究者关注的焦点，希望能更深层次的研究蜜蜂蛋白质营养对相关通路的作用机制和影响机理。 山东农业大学硕士学位论文6参考文献程艳华，刘亚男，胡福良，郑火青，金水华．蛋白质营养水平对蜂王浆产量和成分的影响[J]．蜜蜂杂志，2004，4：7-9．董文滨，马兰婷，王颖，李成成，郑本乐，冯倩倩，王改英，李迎军，焦震，刘锋，杨维仁，胥保华．意大利蜜蜂春繁、产浆、越冬和发育阶段营养需要建议标准【J】．动物营养学报，2014，26(2)：342—347．郭海坤．不同配比油菜花粉和黄豆粉混合饲料对意大利蜜蜂工蜂幼虫的影响[D】．福建农林大学，硕士学位论文，2009．胡福良，陈盛禄，林雪珍，苏松坤．意大利蜂工蜂幼虫、蛹的营养价值研究[J]．中国养蜂，1999，50(2)：3—5．江敬皓．室内人工饲养蜜蜂幼虫之研究[D】．台湾大学，硕士学位论文，1999．李成成，杨维仁，胥保华，冯倩倩．意大利蜜蜂生长发育适宜蛋白供给水平及其对幼虫抗氧化活性的影响[J】．中国农业科学，2011，44(22)：4714-4720．李继莲，译．蜜蜂卵黄原蛋白[J】．中国蜂业，2009，60(8)：50-51．季文静，胡福良．2010年国内外蜂王浆研究概况【J】．蜜蜂杂志，2011，5：9-13．刘光楠，曾志将．人工饲养蜜蜂幼虫技术的研究进展【J】．蜜蜂杂志，2010，30(12)：32—34．柳丹丹，肖发，杨晓丽，李玫璐，曾艳军，于张颖，沈立荣，裘卫，尹志红．蜜蜂蜂王不同于工蜂的关键因素．蜂王浆主蛋白l[J]．食品工业科技，2012，33(12)：371-375．乔云芳，邹晓庭．酪蛋白磷酸肽及其在动物营养中的应用【J】．中国饲料，2005，13：18-20．任再金，陈建新．蜜蜂的血液循环[J]．中国养蜂，1989，l：38-39．石元元．营养和空间因素对雌性蜜蜂发育的影响【D】．江西农业大学，硕士学位论文，2011．唐晓伟．西方蜜蜂细胞色素P450单加氧酶特性初步研究【D】．中国农业科学院，硕士学位论文，2011．陶挺，苏松坤，陈盛禄，杜宏沪．蜂王浆蛋白生物学功能的研究[J]．昆虫知识，2008，45(1)：33-37．王改英，吴在富，杨维仁，胥保华．饲粮蛋白质水平对意大利蜜蜂咽下腺发育及产浆量的影响[J】．动物营养学报，2011，23(7)：1147-1152．王改英．意大利蜜蜂产浆期代用花粉中适宜蛋白质水平的研究[D】．山东农业大学，硕士39 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响学位论文，2012．王荫长．昆虫生理学[M】．北京：中国农业出版社，2004．肖培新，吴在富，刘昭华，胥保华．意大利工蜂不同发育时期抗氧化酶基因mRNA表达量的变化[J]．昆虫学报，2010，53(11)：1202—1206．严盈，彭露，万方浩．昆虫卵黄原蛋白功能多效性：以蜜蜂为例【J】．昆虫学报，2010，53(3)：335-348．杨远帆，陈靖刚，倪辉．蜂王浆中蛋白质及肽类物质的研究进展[J】．中国养蜂，2004，55(4)：27—28．余林生，孟祥金．意大利蜜蜂胚后发育的观察与研究[J】．安徽农业大学学报，2001，28(2)：156．160．曾志将．养蜂学[M]．北京：中国农业出版社，2003．张小玉，徐晓宇，张俊彦，王国秀，刘绪生．棉铃虫酚氧化酶原基因的克隆、序列分析和组织表达[J]．昆虫学报，2006，49(3)：363—366．张怡丁，胥保华．蜜蜂的蛋白质及氨基酸营养[J】．中国蜂业，2012，63(4)：27-30．赵亚周，田文礼，胡熠凡，彭文君．蜜蜂蜂王浆主蛋I刍(MRJPs)的研究进展【J]．应用昆虫学报，2012，49(5)：1345。1353．郑火青，胡福良．蜜蜂一新兴的模式生物[J】．昆虫学报，2009，52(2)：210-215．周冰峰．蜜蜂饲养管理学[M]．厦门：厦门大学出版社，2002．AlauxC，DuclozF，CrauserD，ConteYL．Dieteffectsonhoneybeeimmunocompetence．Bi01．Lett．，2010，6(4)：562-565．AlbertS：BhattacharyaD，KlaudinyJ，SchmitzovaJ，SimfthJ．Thefamilyofmajorroyaljellyproteinsanditsevolution．，3401．Ev01．，1999，49(2)：290-297．AmdamGV，NorbergK，HagenA，OmholtSW．Socialexploitationofvitellogenin．Proc．Natl．Acad．Sci．，2003，100(4)：1799-1802．AmdamGV，NorbergK，PageJrRE，ErberJ，ScheinerR．Downregulmionofvitellogeningeneactivityincreasesthegustatoryresponsivenessofhoneybeeworkers(c)．Behav．BrainRes．，2006，169(2)：201-205．AmdamGV，OmholtSW。Theregulatoryanatomyofhoneybeelifespan．』TheorBi01．，2002，216(2)：209-228．AndersenSO，PeterMG，RoepstorffP．Cuticularsclerotizationininsects．Comp．Biochem．PhysioL，1996，1l3(4)：689-705．AupinelP，FortiniD，DufourH，TaseiJN，MichaudB，OdouxJF，Pham-DelegueMH． 山东农业大学硕士学位论文ImprovementofartificialfeedinginastandardinvitromethodforrearingApismelliferalarvae．B．1nsectoL，2005，58(2)：107-111．AupinelP，FortiniD，MichaudB，MarolleauF，TaseiJN，OdouxJF．Toxicityofdimethoateandfenoxycarbtohoneybeebrood(Apismellifera)，usinganewinvitrostandardizedfeedingmethod．PestManag．Sci．，2007，63(11)：1090-1094．BabendreierD，KalbererN，RomeisJ，FluffP，BiglerF．Pollenconsumptioninhoneybeelarvae：astepforwardintheriskassessmentoftransgenicplants．Apidologie，2004，35(3)：293-300．BarchukAR，BitondiMG，Sim6esZLP．EffectsofjuvenilehormoneandecdysoneonthetimingofvitellogeninappearanceinhemolymphofqueenandworkerpupaeofAp／smellifera．，lnsectSci．，2002，2(1)：1-8．BitondiMG，Sim6esZLP．Therelationshipbetweenlevelofpolleninthediet，vitellogeninandjuvenilehormonetitresinAfricanizedApismelliferaworkers．一Apicult．Res．，1996，35(1)：27-37．BlackJ．Honeybeenutrition：reviewofhoneybeenutritionresearchandpractices[M]．Kingston：RIRDC，2006．Bowen-WalkerPL，GunnA．Theeffectoftheectoparasiticmite，Varroadestructoronadultworkerhoneybee(Apismellifera)emergenceweights，water，protein，carbohydrate，andlipidlevels．Entom01．Exp．Appl．，2001，101(3)：207-217．BrodschneiderR，CrailsheimK．Nutritionandhealthinhoneybees．Apidologie，2010，41(3)：278．294．BurattiS，BenedettiS，CosioMS．Evaluationoftheantioxidantpowerofhoney，propolisandroyaljellybyamperometricflowinjectionanalysis．Talanta，2007，71(3)：1387-1392．ButtstedtA，MoritzRFA，ErlerS．Morethanroyalfood—MajorroyaljellyproteingenesinsexualsandworkersofthehoneybeeApismellifera．FronLZ001．，2013a,10：72-82ButtstedtA，MoritzRFA，ErlerS．Originandfunctionofthemajorroyaljellyproteinsofthehoneybee(Apismellifera)asmembersoftheyellowgenefamily．Bi01．Rev．，2013b，doi：10．1111／brv．12052．CapcarovaM，KolesarovaA，KalafovaA，GalikB，SimkoM，JuracekM，TomanR．Theroleofdietarybeepolleninantioxidantpotentialinrats．zVet．Sci．，2013，29(3)：133-137．CappelariFA，TurcattoAP，MoraisMM，DeJongD．AfricanizedhoneybeesmoreefficientlyconvertproteindietsintohemolymphproteinthandoCamiolanbees(Apismelliferacamica)．Genet．M01．Res．，2009，8(4)：1245—1249．ChanMYM．Developmentandapplicationofhoneybeeinvitrosystems[D]．111eUniversity41 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响ofBritishColumbia，Masterthesis，2012．CoronaM，HughesKA，WeaverDB，RobinsonGE．Geneexpressionpattemsassociated、^，itllqueenhoneybeelongevity．Mech．AgeingDev．，2005，126(11)：1230-1238．CrmlsheimK．Theproteinbalanceofhoneybeeworker．Apidologie，1990，2l(5)：417．429．CremonezTM，DeJongD，BitondiMG．Quantificationofhemolymphproteinsasafastmethodfortestingproteindietsforhoneybees(Hymenoptera：Apidae)．，Econ．Entom01．，1998，91(6)：1284-1289．DeFMicheletteER．SoaresAEE．CharacterizationofpreimaginaldevelopmentalstagesinAfricanizedhoneybeeworkers(ApismelliferaL)．Apidologie，1993，24(4)：431-440．DeGrootAP．Theinfluenceoftemperatureandkindoffoodontheincreaseinthenitrogencontentoftheyoungworkerhoneybee(ApismellificaL．)．Zoology，1950，53：560—566．DeJongD，DaSilvaEJ，KevanPG，AtkinsonJL．Pollensubstitutesincreasehoneybeehaemolymphproteinlevelsasmuchasormorethandoespollen．，Apic．Res．，2009，48(1)：34—37．DeGrandi—HoffmanG，ChenYP，HuangE，HuangMH．Theeffectofdietonproteinconcentration，hypopharyngealglanddevelopmentandvirusloadinworkerhoneybees(ApismelliferaL．)．，InsectPhysi01．，2010，56(9)：1184-1191．DoullKM，HancockTW，StandiferLN．Thephysicalcharacteristicsofartificialproteindietsforhoneybees(Apismellifera)．Apidologie，1980，11(3)：209—215DrapeauMD，AlbertS，KucharskiR，PruskoC，MaleszkaR．Evolutionoftheyellow／majorroyaljellyproteinfamilyandtheemergenceofsocialbehaviorinhoneybees．GenomeRes．，2006，16(11)：1385—1394．EvansJD，WheelerDE．Expressionprofilesduringhoneybeecastedetermination．GenomeBi01．，2000，2(1)：1-6．GarciaL，GarciaCHS，CalfibriaLK，DaCruzGCN，PuentesAS，BfioSN，FontesW，RicartCA0，EspindolaFS，DeSousaMV．Proteomicanalysisofhoneybeebrainuponontogeneticandbehavioraldevelopment．，ProteomeRes．，2009，8(3)：1464·1473．GregorcA，EllisJD．Celldeathlocalizationinsituinlaboratoryrearedhoneybee(ApismelliferaL．)larvaetreatedwithpesticides．Pestic．Biochem．Phys．，2011，99(2)：200-207．GuC，ShiY，LeG．Effectofdietaryproteinlevelandoriginontheredoxstatusinthedigestivetractofmice．／nt．∥M01．Sci．，2008，9(4)：464-475．GuidugliKR，PiulachsMD，BelldsX，Louren90AP，Sim6esZLP．VitellogeninexpressioninqueenovariesandinlarvaeofbothsexesofApismellifera．Arch．InsectBiochem．Physi01．，2005，59(4)：211—218．42 山东农业大学硕士学位论文HanleyAV，HuangZY，PeRWL．EffectsofdietarytransgenicBtcornpollenonlarvaeofAp／smelliferaandGalleriamellonella．，Apicult．Res．，2003，42(4)：77-81．HarmanD．Aging：atheorybasedonfreeradicalandradiationchemistry．一Geront01．，1956，11：298．300．HerbertJrEW，ShimanukiH，CaronD．Optimumproteinlevelsrequiredbyhoneybees(Hymenoptera，Apidae)toinitiateandmaintainbroodrearing．Apidologie，1977，8(2)：141．146．HerbertJrEW．Effectofdietontherateofbroodrearingbynaturallyandinstrumentallyinseminatedqueens．Apidologie，1980，11(1)：57—62．HooverSER，HigoHA，WinstonML．Workerhoneybeeovarydevelopment：seasonalvariationandtheinfluenceoflarvalandadultnutrition．ZComp．Physi01．，2006，176(1)：55．63．HrassniggN，CrailsheimK．Differencesindroneandworkerphysiologyinhoneybees(Apismellifera)．Apidologie，2005，36(2)：255-277．HuangZ．Astandardizedprocedurefortheinvitrorearingofhoneybeelarvae[J／OL]．2009，http：／／www．cdpr．ca．gov／docs／registration／reevaluation／larval-protoc01．pdf．．InalME，KanbakG，SunalE．Antioxidantenzymeactivitiesandmalondialdehydelevelsrelatedtoaging．a拥．Chim．Acta，2001，305(1)：75—80．KaftanogluO，LinksvayerTA，PageJrRE．Rearinghoneybees(ApismelliferaL．)invitro：effectsoffeedingintervalsonsurvivalanddevelopment．，Apicult．Res．BeeWorld,2010b，49(4)：311—317．KaftanogluO，LinksvayerTA，PageJrRE．Rearinghoneybees，Ap／smellifera，invitro1：effectsofsugarconcentrationsonsurvivalanddevelopment．■InsectSci．，2010a，11(96)：1．10．KamakuraM，SuenobuN，FukushimaM．Fifty-seven—kDaproteininroyaljellyenhancesproliferationofprimaryculturedrathepatocytesandincreasesalbuminproductionintheabsenceofserum．Biochem．Bioph．Res．Commun．，2001，282(4)：865—874．KamakuraM．Royalactininducesqueendifferentiationinhoneybees．Nature，2011，473(7348)：478—483．KleinschmidtGJ，KondosAC．Influenceofcrudeproteinlevelsoncolonyproduction．砌PAustralasianBeekeeper，1976，78：36—39．K09AU，KaracaogluM．Effectofrearingseasononthequalityofqueenhoneybees(ApismelliferaL．)raisedundertheconditionsofaegeanregion．Mellifera，2004，4(7)：34-37．KucharskiR，MaleszkaJ，ForetS，MaleszkaR．Nutritionalcontrolofreproductivestatusin43 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响honeybeesviaDNAmethylation．Science，2008，319(5871)：1827-1830．KumazawaS，HamasakaT，NakayamaT．Antioxidantactivityofpropolisofvariousgeographicorigins．FoodChem．，2004，84(3)：329-339．KunertK，CrailsheimK．Seasonalchangesincarbohydrate，lipidandproteincontentinemergingworkerhoneybeesandtheirmortality．，Apic．Res．，1988，27：13—21．KupkeJ，SpaetheJ，MuellerMJ，R6sslerW，AlbertS．Molecularandbiochemicalcharacterizationofthemajorroyaljellyproteininbumblebeessuggestanon-nutritivefunction．1nsectBiochem．Molec．，2012，42(9)：647—654．LaughtonAM，BootsM，Siva-JothyMT．Theontogenyofimmunityinthehoneybee，Ap／smelliferaL．followinganimmunechallenge．，InsectPhysi01．，2011，57(7)：1023-1032．LeeKP，SimpsonSJ，WilsonK．Dietaryprotein—qualityinfluencesmelanizationandimmunefunctioninaninsect．Funct．Ec01．，2008，22(6)：1052—1061．LiJ，WangH，StonerGD，BrayTM．Dietarysupplementationwithcysteineprodrugsselectivelyrestorestissueglutathionelevelsandredoxstatusinprotein-malnourishedmice．』Nutr．Biochem．，2002，13(10)：625—633．LykoF，ForetS，KucharskiR，WolfS，FalckenhaynC，MaleszkaR．Thehoneybeeepigenomes：differentialmethylationofbrainDNAinqueensandworkers．PlosBi01．，2010，8(11)：e1000506．MajtfinJ，Kovfi芒ovfiE，BilikovfiK，SimfthJ．Theimmunostimulatoryeffectoftherecombinantapalbumin1-majorhoneybeeroyaljellyprotein--onTNFarelease．／nt．1mmunopharmac01．，2006，6(2)：269-278．MattilaHR，OtisGW．Theeffectsofpollenavailabilityduringlarvaldevelopmentonthebehaviourandphysiologyofspring-rearedhoneybeeworkers．Api&)logie，2006，37(5)：533．546．MicheletteE，EngelsW．ConcentrationofhemolymphproteinsduringpostembryonicworkerdevelopmentofAfricanizedhoneybeesinBrazilandCamiolansinEurope．Apidologie，1995，26(2)：101-108．MichielsC，RaesM，ToussaintO，RemacleJ．ImportanceofSe-glutathioneperoxidase，catalase，andCu／Zn—SODforcellsurvivalagainstoxidativestress．FreeRadBioLMed，1994，17(3)：235-248．MrukDD，SilvestriniB，MoM，ChengCY．Antioxidantsuperoxidedismutase-areview：itsfunction，regulationinthetestis，androleinmalefertility．Contraception，2002，65(4)：305．311．NewtonDC，MichlDJ．Cannibalismasanindicationofpolleninsufficiencyinhoneybees： 山东农业大学硕士学位论文ingestionorrecappingofmanuallyexposedpupae．，Apic．Res．，1974，13，235-241．PageREJr，PengCYS．Aginganddevelopmentinsocialinsects淅tllemphasisonthehoneybee，却西melliferaL．．Exp．Geront01．，2001，36(4)：695—711．PageRE，AmdamGV．Themakingofasocialinsect：developmentalarchitecturesofsocialdesign．Bioessays，2007，29(4)：334-343．PardiniRS．Toxicityofoxygenfromnaturallyoccurringredox—activepro—oxidants．Arch．InsectBiochem．Physi01．，1995，29(2)：101-118．PatelA，FondrkMK，KaflanogluO，EmoreC，HuntG，FrederickK，AmdamGV．Themakingofaqueen：TORpathwayisakeyplayerindipheniccastedevelopment．PlosOne，2007，2(6)：e509．doi：10．137100umal．pone．0000509．PeixotoLG，Cal￡ibriaLK，GarciaL，CapparelliFE，GoulartLR，DeSousaMV，EspindolaFS．IdentificationofmajorroyaljellyproteinsinthebrainofthehoneybeeAp／smellifera．，InsectPhysi01．，2009，55(8)：671—677．PengYSC，MussenE，FongA，MontagueMA，TylerT．Effectofchlortetracyclineofhoneybeeworkerlarvaerearedinvitro．，Invertebr．Path01．，1992，60(2)：127-133．PintoLZ，BitondiMG，Sim6esZLP．InhibitionofvitellogeninsynthesisinApismelliferaworkersbyajuvenilehormoneanalogue，pyriproxyfen．一lnsectPhysi01．，2000，46(2)：153-160．PiulachsMD，OuidugliKR，BarchukAR，CruzJ，Sim6esZLP，BellrsX．Thevitellogeninofthehoneybee，Apismellifera：structuralanalysisofthecDNAandexpressionstudies．InsectBiochem．Molec．，2003，33(4)：459—465．RaikhelAS，BrownMR，BellesX．Hormonalcontrolofreproductiveprocesses．Comp．M01．1nsectSci．，2005，3：433-491．RamadanaMF，A1一GhamdiA．Bioactivecompoundsandhealth-promotingpropertiesofroyaljelly：Areview．一FuncLFoods，2012，4(1)：39—52．RandoltK，GimpleO，Geissend6rferJ，ReindersJ，PruskoC，MuellerMJ，AlbertS，TautzJ，BeierH．Immune—relatedproteinsinducedinthehemolymphafterasepticandsepticinjurydifferinhoneybeeworkerlarvaeandadults．Arch．InsectBiochem．Physi01．，2008，69(4)：155-167．RoulstonTH，CaneJH．TheeffectofpollenproteinconcentrationonbodysizeinthesweatbeeLasioglossumzephyrum(Hymenoptera：Apiformes)．Ev01．Ec01．，2002，16(1)：49-65．SatoR，ShindoM，GunshinH，NoguchiT，NaitoH．Characterizationofphosphopeptidederivedfrombovine13-casein：aninhibitortointra-intestinalprecipitationofcalciumphosphate．BBA—ProteinStruct必1991，1077(3)：413-415．45 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响SchmicklT，CrailsheimK．Cannibalismandearlycapping：strategyofhoneybeecoloniesintimesofexperimentalpollenshortages。一Comp．PhysioL，2001，187(7)：541-547．SchmidtJO，BuchmannSL．PollendigestionandnitrogenutilizationbyApismelliferaL．(Hymenoptera，Apidae)．Comp．Biochem．ehys．，1985，82(3)：499—503．SchmitzovaJ，KlaudinyJ，AlbertS，SchroderW，SchreckengostW，HanesJ，JudovaJ，SimuthJ．Afamilyofmajorroyaljellyproteinsofthehoneybee@ismelliferaL．．Cell．M01．LifeScL，1998，54(9)：1020—1030．ShiYY，HuangZY，ZengZJ，WangZL，WuXB，YanWY．Dietandcellsizebothaffectqueen-workerdifferentiationthroughDNAmethylationinhoneybees(Apismellifera，Apidae)．PlosOne，2011，6(4)：el8808．StegemanJJ，LivingstoneDR．FormsandfunctionsofcytochromeP450．Comp．Biochem．PhysioL，1998，121"1—3．TamuraS，KonoT，HaradaC，YamaguchiK，MoriyamaT．EstimationandcharacterisationofmajorroyaljellyproteinsobtainedfromthehoneybeeApismerifera．FoodChem．，2009，114(4)：1491-1497．Vandenberg3D，ShimanukiH．Techniqueforrearingworkerhoneybeesinthe1aboratory．J．Apic．Res．，1987，26：90—97．WeaverN．Rearingofhoneybeelarvaeonroyaljellyinthelaboratory．Science，1955，121(3145)：509—510．WeirichGF，CollinsAM，WilliamsVP．Antioxidantenzymesinthehoneybee，Apismellifera．Apidologie，2002，33(1)：3—14．WilliamsJB，RobertsSP，ElekonichMM．Ageandnaturalmetabolically—intensivebehavioraffectoxidativestressandantioxidantmechanisms．Exp．Geront01．，2008，43(6)：538-549．WoltedjiD，FangY，HanB，FengM，LiR，LuX，LiJ．Proteomeanalysisofhemolymphchangesduringlarvaltopupaldevelopmentstageofhoneybeeworker(Apismelliferaligustica)．JProteomeRes．，2013，12(11)：5189-5198．WuLM，ZhouJH，XueXF，LiY，ZhaoJ．Fastdeterminationof26aminoacidsandtheircontentchangesinroyaljellyduringstorageusingultra—performanceliquidchromatography．一FoodCompos．Anal．，2009，22(3)：242-249．WyaRGR，DaveyKG．Cellularandmolecularactionsofjuvenilehormone．II．Rolesofjuvenilehormoneinadultinsects．Adv．InsectPhysi01．，1996，26，1—15．YahiaDA，MadaniS，ProstE，ProstJ，BouchenakM，BellevilleJ．Tissueantioxidantstatusdiffersinspontaneouslyhypertensiveratsfedfishproteinorcasein．，Nutr．，2003，133(2)：479．482． 山东农业大学硕士学位论文ZufelatoMS，Louren90AP，Simt3esZLP，JorgeJA，BitondiMG．PhenoloxidaseactivityinApismelliferahoneybeepupae，andecdysteroid—dependentexpressionoftheprophenoloxidasemRNA．1nsectBiochem．Molec．，2004，34(12)：1257-1268．ZwierMV，VerhulstEC，ZwahlenRD，BeukeboomLW，VandeZandeL．DNAmethylationplaysacrucialroleduringearlyNasoniadevelopment．InsectM01．Bi01．，2012，21(1)：129．138．47 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响7致谢本研究是在导师胥保华教授的精心设计和悉心指导下完成的。恩师治学严谨、学识渊博，对待工作实事求是、精益求精，教导学生耐心负责、宽严相济。恩师一丝不苟的敬业精神以及宽以待人的处事风范将永远是我学习的榜样。三年来，我不仅学会了丰富的专业知识和科学的工作方法，还有为人处事、待人接物的道理。值此论文完成之际，谨向胥老师致以我最崇高的敬意和最诚挚的感谢，师恩难忘，永记于心!感谢山东农业大学动物科技学院的各位老师和同学在我求学期间给予的帮助。感谢杨维仁教授、林海教授、王中华教授、李福昌教授、杨在宾教授、康明江副教授、宋志刚副教授、林雪彦副教授、李显耀副教授等老师的支持和建议。感谢师兄师姐孙汝江、刘锋、焦震、刘昭华、郑本乐、李迎军、王改英、李成成、冯倩倩、王颖、马兰婷、吴在富，同级同学杭晓波、张鸽，师弟师妹赵凤奎、王圣伟、李肖、董文滨、张卫星、苏中渠、徐鹏、崔学沛等的帮助与关心；感谢实验室这个团结、和谐的大家庭带给我的温暖与感动。感谢我的研究生同学孙敏敏、张娇、张琪、王甜甜、姚朋波等的包容与照顾，在此一并表示衷心感谢!感谢父母家人对我求学深造的支持和鼓励，以及对我无私的、伟大的爱。将以本论文为最好礼物表达我对他们最由衷的谢意。衷心祝愿我的老师、同学、朋友和家人一生平安，幸福快乐!祝愿母校山东农业大学蒸蒸日上，蓬勃发展148张怡丁2014年6月 山东农业大学硕士学位论文8攻读学位期间发表论文情况1)张怡丁，张卫星，胥保华，刘锋．人工饲养条件下意大利蜜蜂幼虫食物的适宜蛋白水平研究[J]．动物营养学报，外审退改．2)张怡丁，胥保华．蜜蜂的蛋白质及氨基酸营养[J】．中国蜂业，2012，63(4)：27．30．获得奖励2012-2013学年度，硕士生中期考核良好，获得“二等奖学金”。2014年，获得山东农业大学“优秀毕业生”。49 蛋白源及水平对人工饲养条件下意大利蜜蜂生长发育的影响9基金资助本研究由国家蜂产业技术体系建设专项资金(CARS．45)和公益性行业(农业)科研专项“饲料营养价值与畜禽饲养标准研究与应用(200903006)”资助。