贵州省天麻主产区蜜环菌多样性研究及优良菌株筛选 77页

SoUTHWESTUNlVERSITYTHESISoFMASTERDEGREETheselectionofgoodstrainsandresearchofbiodiversityaboutArmillariacollectedfromthemainproducingareasofGastrodiainGuizhouCandidate：HuangWanbingSupervisor：A．P．LiuChaoguiProf．ZhuGuoshengMajor：MicrobiologySpecialty：ApplyMicrobiology1一一一一一一Chongqing，ChinaMay2014 独创性声明学位论文题目：塞趔笪丞鏖圭主匡窒丕萱垒搓丝婴窒区位睦萱挂篮垫本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了标注。学位论文作者：黄7{是签字日期：≯t垆年／月易日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。／／(保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：骄保密，口保密期限至年月止)。学位论文作者签名：莨葡乒新签名：训谚凄签字日期：如乒年f月p日签字日期：知f中年舌月乡日 目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．III缩略符号⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯VII第一章引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1蜜环菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．1蜜环菌的生态多样性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．2蜜环菌的生物种多样性研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．3蜜环菌的遗传多样性研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21-1．4蜜环菌的形态多样性．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．．．⋯41．2天麻与蜜环菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2．1天麻的分类及生活史⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．2．2蜜环菌与天麻共生关系的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．2．3蜜环菌酶活性研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．61．2．4促进天麻生长的优良蜜环菌研究进展⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．71．3本研究目的及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8第二章蜜环菌的采样与分离方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．1采样地点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．2实验材料及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．2．1材料⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2．2主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．2．3培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．3方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102．3．1采样及保存方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102．3．2菌株的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．102．3．3分离菌株的液体培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．4实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l2．4．1蜜环菌采集及保存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．112．4．2蜜环菌的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11第三章蜜环菌菌丝菌索的形态多样性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯133．1材料与仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．133．1．1菌株⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯133．1．2培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯133．1．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．133．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．143．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．14第四章蜜环菌遗传多样性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．194．1材料及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．191 4．1．1供试菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．194．1．2主要试剂和仪器．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯194．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．204．2．1DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．204．2．2rDNA-ITS的扩增⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．204．2．3rDNA—IGS的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯204．2．4Tefl-a序列的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯．．．204．2．5TA克隆及测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．2l4．2．6序列分析⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．214．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．214．3．1rDNA—ITS的测序结果与两两比较⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯．．．．2l4．3．2rDNA—IGS的测序结果与两两比较⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯224．3．3Tefl-a的测序结果与两两比较⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯．．．．274．3．4参试蜜环菌的生物种分子鉴定与系统发育分析⋯⋯⋯⋯．．29第五章促进天麻生长的优良蜜环菌筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯355．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．355．1．1供试菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．355．1．2天麻蒴果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．355．1．3蜜环菌三级固体种的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．355．1．4蜜环菌、萌发菌与天麻蒴果的有性栽培⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．365．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．375．2．1不同菌株问红天麻产量统计与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯375．2．2不同菌株间乌天麻产量统计与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯385．2．3不同菌株间绿天麻产量统计与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯385．2．3不同蜜环菌生物种对天麻生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39第六章优良蜜环菌发酵液胞外酶研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．416．1材料与仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4l6．1．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．．．．⋯．⋯⋯⋯．．⋯．．416．1．2培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯416．1．3供试菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．416．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．426．2．1标准曲线的制备．⋯⋯⋯．．⋯．．．．⋯⋯⋯．⋯．．⋯⋯426．2．2液体菌种的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯426．2．3粗酶液的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．426．2．4木聚糖酶酶活性测定．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．426．2．5CMC酶活性测定⋯⋯⋯．．．⋯．．．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯426．2．6漆酶酶活性测定⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．426．2．7酶活力计算⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．426．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．436．3．1标准曲线⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯436．3．2木聚糖酶活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯436．3．3CMC酶活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．．⋯．．⋯⋯．．446．3．4漆酶活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．45 6．3．53种胞外酶之间酶活比较与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．45第七章优良蜜环菌的栽培种培养基筛选：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．477．1材料与仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．477．1．1供试菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．477．1．2主要试剂与仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．⋯⋯．477．1．3培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．477．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．487．2．1栽培种培养基制各⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯．．487．2．2菌种制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯487．2．3生长速度的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．⋯．487．2．5标准曲线制各⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯487．2．6木聚糖酶酶活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯487．2．7CMC酶活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．487．2．8漆酶酶活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．497．2．9酶活力的计算⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．497．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．497．3．1标准曲线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．497．3．2不同培养基对DJl生长速度的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯497．3．3不同培养基中蜜环菌DJl的CMC酶活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5l7．3．4不同培养基中蜜环菌DJl的木聚糖酶活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l7．3．5不同培养基中蜜环菌DJl的漆酶活性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．517．3．6不同培养基对蜜环菌DJl的胞外酶和生长的影响⋯⋯⋯⋯52第八章讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53第九章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．57致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6l发表论文及参加课题一览表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．63 4 摘要贵州省天麻主产区蜜环菌多样性研究及优良菌株筛选微生物学专业硕士研究生黄万兵指导教师刘朝贵副教授朱国胜研究员蜜环菌系伞菌目、膨瑚菌科、蜜环菌属的兼性寄生性真菌，广泛分布于世界各地。它是一类具有重要经济价值的高等真菌，不仅具有清目、利肺、益肠胃、抗痉挛、镇静、扩张血管、降血压等药理作用，且子实体、菌丝、菌索都可以入药。此外，名贵中药猪苓和天麻必须依靠蜜环菌提供营养才能生长繁殖。目前全球通过互交不育性实验鉴定的蜜环菌生物种多达40种，国内鉴定约15种，主要分布在东北、华中、西南地区。贵州蜜环菌生物种鉴定与分布调查尚处于起步阶段，天麻种植采用蜜环菌主要从陕西汉中、中国科学院引进，贵州本土蜜环菌资源基本未开发。本试验从贵州天麻主产区德江等地采集分离蜜环菌，结合菌丝、菌索形态与Tefl—a等分子标记研究其地理分布特征、形态多样性、物种多样性与遗传多样性，同时筛选促进天麻生长的贵卅I本土优良蜜环菌。为推动蜜环菌形态与遗传多样性研究，开发贵州蜜环菌资源及探索适合天麻生长的贵州本地蜜环菌提供理论基础与帮助。试验结果如下：①蜜环菌菌索的有效分离培养基为蛋白胨2g，硫酸镁0．5g，葡萄糖20g，琼脂7g，磷酸二氢钾0．46g，磷酸氢二钾1g，青霉素10万单位，庆大霉素20万单位，水1000mL，pH自然。其中抗生素是在培养基灭菌后(121℃、30min)冷却至40一50℃时加入。75％酒精中浸泡消毒时，幼嫩菌索1min、老化菌索约2min为佳。②贵州天麻主产区的蜜环菌在PDA培养基上形态多样，依据形态特征和生长势大致可划分为9个形态群。同时shannon多样性指数表明贵州天麻主产区的蜜环菌形态多样、菌群分布均匀，其中形态群Ⅵ占绝对优势，其次是形态群Ⅷ。③生物种分子鉴定时，贵州天麻主产区的蜜环菌基本为爿彻』』』a，如gallica、Armillariamellea、Armiiariacepistipes，其中Armi1ariagallicaj屠多．且多分布在海拔1500m左右的地区。蜜环菌在rDNA—ITS、rDNA-IGS、Tefl-a序列上的多样性依次递增，不论是序列间的两两比较还是系统发育分析，rDNA—ITS都 西南大学硕士学位论文不能很好地区分开／rmillariagallica和爿脚j』-玎妇cepistipOS，但能将它们与砌j』』a，如mellea明显分开。rDNA—IGS的情况与rDNA—ITS类似，但rDNA—IGS在月埘j』』盯妇gallica、爿册j』』a，妇cepistipes菌株间的差异性要略大于rDNA—ITS。Tefl-a在蜜环菌中差异显著，遗传多样性极丰富。它不仅能区分爿脚j』』a，妇mollea、月脚j--a，厶gallica、月瑚-j』』ar幽cepistipes，甚至能区分同种属的菌株。④筛选促进天麻生长的优良蜜环菌时，属于月埘j』』a订a印』』jca的菌株DJl对三种天麻都有很好的促进作用，而与Armillariamolloa关系较近的菌株基本不能促进天麻生长。菌株DJ与三种天麻有性栽培半年后，红天麻产量为1473．39／m2、乌麻产量为484．79／m2、绿天麻产量为1706．79／m2，均显著性地大于对照和其它菌株。⑤液体发酵时，各菌株胞外酶活性变化趋势均是先升后降；各酶在不同菌株间达到最大酶活的时间、最大酶活持续时间、最大酶活性值存在明显差异；优良菌株DJl生长最快，4天就能结束发酵，达到最大酶活时间最短、持续时间也长。⑥优良蜜环菌DJl在栽培种培养基一上生长速度最快为0．42cm／d，显著性地大于其它培养基中的生长速度。此外，栽培种培养基含木屑越多，菌株DJl活力就越好，越不易形成老化的红褐色菌索。蜜环菌的生长速度与胞外酶活性有紧密的联系，培养基成分确定菌株胞外酶活性，胞外酶决定菌株的生长速度。关键词：蜜环菌；生物种；多样性；优良菌株；天麻Il ABSTRACTTheselectionofgoodstrainsandresearchofbiodiversityaboutArmillariacollectedfromthemainproducingareasofGastrodiainGuizhouCandidate：HuangWanbingSupervisor：A．P．LiuChaoguiProf．ZhuGuosheng(CollegeofHorticultureandLandscapeArchitecture，SouthwestUniversity，Chongqing400715，China)ABSTRACTArmillariaarefacultativeparasitic劬gus，whichbelongtoAgaricales，Physalacriaceae，armillariageneraandarewidelydistributedaroundtheworld．Theyareflimportantkindoffimgiwhichhavehighereconomicvalue．Armillariahavesomepharmacologicaleffectssuchasimprovingeyesight，protectinglungsandstomach，reducingspasticity，sedation，dilatingvessels，hypotensiveeffectandthefruitbody，mycelium．rhizomorphCanbeused嬲medicines．ChinesetraditionalmedicineGastrodiaelataandGrifo／amustrelyonArmillariawhichcouldprovidenutrientstotheirgrow．Now,thereareabout40kindsbiologicalspeciesinArmillariawhichhadbeenidentifiedthroughintercrossingsterilitytestintheworld．15specieswereidentifiedbychinese，whichmainlydistributeinnortheaSt，centralChina,southwestregion．ArmillariabiologicalspeciesidentificationandinvestigationinGuizhouareattheearlystage．ArmillariastriansusedtoplantGastrodiaelataweremainlyintroducedfromHanzhongandtheChineseacademyofsciences，TheresourcesofArmillariainGuizhouarestillundeveloped．ThisexperimentintendstocollectandisolateArmillariafromthemainproducingareaSofGastrodiaelatainGuizhou；combinemorphology，biologicalspeciesidentificationandmolecularmarkerstostudythegeographicdistribution，ecologicaldiversity，speciesdiversityandgeneticdiversity；Screenexcelentstrainswhichcanrapidlypromotegrowthofgastrodiaelataandareguizhoulocal．ThisprojectwillprovidetheoreticalbaSisforthedevelopmentofGuizhouarmillariaandchooseGuizhoulocalexcelentstrainswhichCanrapidlypromotegrowthofgastrodiaelata．Atthesametime，theprojectCanalsopromotethelTT 西南大学硕士学位论文researchofgeneticdiversityaboutbiologicalspecies．Themainexperimentalresultsareasfollows．@TheingredientsofeffectivemediumwhichisusedtoisolateArmillariaarepeptone29，magnesiumsulfate0．5g，glucose209，gelatine79，potassiumdihydrogenphosphateO．46g，potassiumhydrogenphosphate1g，100000unitsofpenicillin，gentamicin，200000units，1000mLwater．Whenthemediumcoolto40-50℃(sterilization121℃，30min)，antibioticsshouldbeaddtothemedium．Whenusing75％alcoholtosoakdisinfection，theimmersiontimeofyoungrhizomorphshouldbe1min，andtheimmersiontimeaboutoldrhizomorphis2min．②WhenculturedinPDAmedium，theArmillarillacollectedfromthemainproducingareasofGastrodiaelatainGuizhouownedabundantmorphologicinformation．Accordingtothemorphologicalcharacteristicsandgrowthpotential，theyweredividedintoninemorphologicalgroups．Atthemeantime，theshannonindexalsoshowedtheArmillarillaownedabundantmorphologicinformationandthedistributionofthemorphologicalgroupswasuniform．thedominantmorphologicalgroupswastypeVI，followedbytypeVIII．③Inthemolecularidentificationofbiologicalspecies，theArmillarillacollectedfromtheMainProducingAreasofGastrodiaelatainGuizhouweredividedintoArmillariagallica，Armillariamellea，Armillariacepistipes．Furthermore，themainwereArmillariagallicaanddistributeattheregionswhosealtitudearenearerto1500m．ThediversityofrDNA—ITS，rDNA—IGS，Tefl一aintheArmillariaareincreasinginturn．Intwocomparisonsbetweensequenceandphylogeneticanalysis，rDNA-ITSwasnotexcellenttodistinguishArmillariagallicaandArmillariacepistipes．ButitcoulddistinguishthemwithArmillariamelleaobviously．ThesituationofrDNA—IGSwassimilartorDNA．ITS．ButthedifferentiationofrDNA—IGSwhichwereinArmillariagallica，Armillariacepistipes,ArmillariamelleawasslightlygreaterthanrDNA-ITS．Tefl-aintheArmillariahadsignificantdifferenceandextremelyrichgeneticdiversity．ItcouldnotonlydistinguishArmillariamellea4rmillariagallica4rmillariacepistipes，butalsocoulddistinguishthestrainswhichwerethesalTlebiologicalspecies．④Screeninggoodstrainswhichcanrapidlypromotegrowthofgastrodiaelata，wefoudthestrianDJ1whichbelongtoArmillariagallicahadverygoodpromotingeffectonthreekindsofGastrodiaelata．ButthestrianssimilartoArmillariamelleacouldnotpromotethegrowthofGastrodiaelata．Aftersixmonths，tTV ABS-lRACIheyieldofthreekindsofgastrodiawhosesexualcultivationutilizedDJ1weresignificantlygreaterthancheckandotherstrainsandtheyieldofG．elataBI．f．elata，G．elataBI．f．glaucaS．Chow,G．elataBI．f．viridisMak．respectivelywas1473．39／m2，484．79／m2,1706．7g／m2．@Whenallstrianswereintheliquidfermentation，Thechangeruleoftheextracellulardifferentenzymeactivityweresame．Theyallroseatfirstandloweredlater．Themaximumenzymeactivityandthetimewhenenzymeactivityreachmaximumbetweendifferentstrainswerealsoobviousdifference．ThefinestrainsD儿couldendfermentationOnthefourthday．Itsmaximumenzymeactivitywasalwaystheearliesttoappearandatthelatesttodisappear．⑨Cultivatedinthefirstmediuml，GoodstrainDJlhadafastestspeedwhichwas0．42cm／dandsignificantlygreaterthanthegrowthrateinothermediums．Inaddition，themorewoodchipstheculturemediumcontained，thebetterthevitalityofDJ1wasandthemoredifficulttoformreddish—brownrhizomorph．ThegrowthspeedofArmillariaandtheextracellularenzymeactivityarecloselylinked．Theingredientsofculturemediumascertaintheextracellularenzymeactivity,extraceUularenzymedeterminethegrowthspeedoftheArmillariastrains．Keywords：Armillaria，biologicalspecies，diversity,goodstrains，GastrodiaV 西南大学硕士学位论文Vl 缩略符号爿．G．VBpHDNAITSIGSTefmbp(INTPATGCIPTGmol／LhrainSr／mlnCmmLp．LArmillariaGastrodiaVitaminB蜜环菌属名天麻属名维生素Bhydrogenionconcentration氢离子浓度指数deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸InternalTranscribedSpacer内转录间隔区intergenicspacer转录单元间隔区Translationelongationfactormeterbasepair延伸因子米碱基对deoxyribonucleosidetriphosphates三磷酸碱基脱氧核苷酸adeninethymineguaninecytosine腺嘌呤胸腺嘧啶鸟嘌呤胞嘧啶Isopropyl13-D-Thiogalactoside异丙基一B—D一硫代吡喃半乳糖苷mole／literhourminutesecondrevolutionsperminutecentimetermillilitermicrolitermmol／Lmillimole／literImaol／Lmicromole／literMmole／liter摩尔／井小时分钟秒辕}食厘米毫升微升毫摩尔／升微摩尔／升摩尔／升VII 西南大学硕士学位论文UUnit酶单位ggram克CMCCarboxymethylCellulose羧甲基纤维素ODopticaldensitycm／dcentimeter／dayVIII光密度厘米／天 引言第一章引言弟一旱jI百蜜环菌[Armillaria(vaiil：Fr．)Kunllner]又名榛蘑，系伞菌目、膨瑚菌科、蜜环菌属的一种兼性寄生性真菌，广泛分布于世界各地林区。11。自1790年由Vahl鉴定该种后，国外最早报道蜜环菌可引起多种针叶树及阔叶树根腐病，其寄主植物达300属。作为一种重要的森林病原菌，国内外对其致病机理研究较多‘2_引。除此之外，蜜环菌有清目、利肺、益肠胃、抗痉挛、镇静、扩张血管、降血压等作用，且子实体、菌丝、菌索都是可以入药的，是一类具有重要经济价值的高等真菌H1。名贵中药天麻及猪苓必须依靠蜜环菌侵染提供营养才能生长繁殖矗’⋯。1．1蜜环菌1．1．1蜜环菌的生态多样性蜜环菌寄主范围广，能寄生于全球寒温带和温带600多种树木之上，有的甚至腐生在泥炭沼泽中，它的生态环境十分多样。孙立夫等(2007)发现蜜环菌在黑龙江的寄生树种至少有10个针叶和阔叶树种一。。邓艳芹(2007)仅调查湖北西部的蜜环菌就发现它在海拔1100—2000m之间的山地均有分布，周边土壤类型至少分为黄棕壤、黑腐殖土、灰包土三类‘8|。吴兴亮等(2003)通过对贵州省宽阔水自然保护区的蜜环菌资源调查，大致将蜜环菌的生态环境分为了低山、中山、山顶三个垂直带。其中低山垂直带海拔在1400—1550m之间，植被多为亮叶水青冈一石栎混交林，混生方竹、柃木、山矾、杜鹃、箭竹、南烛等，该区域气候温和，雨量充沛，地势平坦；中山垂直带海拔分布在1550—1700m之间，植被为亮叶水青冈一多脉青冈混林，还有硬斗栎、厚皮丝栗、贵州润楠等，森林完整，树种复杂，该区域气候凉爽，雨水多；山顶垂直带海拔约为1700—1750m，植被为亮叶水青冈一箭竹林，混生石栎、多脉青冈、榨槭等，该分布带坡陡，排水快，裸露面积大，风较大，相对湿度小旧1。1．1．2蜜环菌的生物种多样性研究进展自1819年Fries建立Armillarilla族至今，基于形态学的蜜环菌属分类一直比较混乱，全世界曾有250多个种划分该属，曾经容纳蜜环菌的现代伞菌属达44个之多，而又有一些应该是蜜环菌属的真菌被分到其他属中川。Hintikka(1973)发现蜜环菌的四极性异宗配合机制和单双倍体的菌落形态差异后，使得能够利用交配 西南大学硕士学位论文实验进行生物种的鉴定。KariKohorhen(1978)和Anderson&U1lrich(1979)等分别利用单倍体交配方法发现了欧洲和北美的蜜环菌互交不育群即生物种⋯3。此后，互交不育性实验成为鉴定生物种和划分不同未知菌株到生物种的通用方法。目前全世界通过互交不育性实验己鉴定蜜环菌生物种多达40种。以地区为单位，目前，欧洲共有7个生物种，其中，54"有环的：A．gallica、A．ostoyae、A．cepistipes、A．用e』-朗、A．borealis，两个无环的：A．tabescens、A．ectypa；北美洲共发现了10个蜜环菌生物种，其中，9个有环的：A．ostoyae、A．gemina、A．ca]vescens、A．sinapYna、A．mellea、A．gallica、A．BabsBoB8、NABSX、A．cepistipes，1个无环的：A．tabescens；亚洲共发表了20个蜜环菌生物种，其中，有菌环的为20个：A．sinapina、A．gallica、A．ostoyae、A，singula、A．mellea、A。borealis、A。nabsnona、A．cepistipes、A。jazoensislCBSC、CBSF、CBSH、CBSJ、CBSL、CBSN、CBS0、CBSP、Nag．E、CBSG、A．melleasubsp．Nipponica，1个无环的是A．tabescens；总体而言，非洲蜜环菌生物种有6个：A．heimii、A．melleasubsp．Nipponica、Armillariasp．、Armillariasp．和可能从北半球传入的A．gallica、A．mellea；澳大利亚，新西兰及附近南太平洋诸岛，新几内亚和斐济岛先后报道了7个蜜环菌生物种：A．[ellea、A．fumosa、A．1imonea、A．1uteobubalina、A．novae-zelandiae、A．pallidula、A．hinnulea㈣。我国鉴定的蜜环菌生物种约有15种，主要分布在东北、华中、西南地区。杨祝良等(2003)通过形态学鉴定了西南地区4种蜜环菌：A．cepistipes、A．mellea、A．ostoyae、A．tabescens。3I。王汉臣等(2008)在湖北、西藏等地通过互交不育性实验鉴定了蜜环菌新种CBSP，发现西南地区是以CBSJ为分布中心n“。但是，国内各省份详细的蜜环菌互交不育性实验未见相关报道。关于贵州省内蜜环菌生物种的研究，吴兴亮等(2003)通过形态学鉴定了雷公山自然保护区等地的两个生物种A．mellea、A．tabescens田1，秦国夫等(2002)利用互交不育性实验鉴定了宽阔水自然保护区的两个新种A．korhonenii并DCBSL“引。A．korhonenii、CBSL分布于宽阔水自然保护区；A．mellea分布于宽阔水自然保护区、坡岗自然保护区、雷公山自然保护区、独山、贵阳乌当；A．tabescens分布于贵阳乌当、习水自然保护区。1．1．3蜜环菌的遗传多样性研究进展， 引言互交不育性实验虽然准确度高，但是蜜环菌子实体和单核菌丝的获得难度大、周期长。分子标记作为系统发生和遗传多样性研究的重要手段，也使快速鉴定蜜环菌生物种和遗传多样性研究成为可能。rDNA-ITS分子标记就曾多次成功地被运用到蜜环菌遗传多样性分析中。Anderson和Stasovski(1992)等通过rDNA—ITS确定A．mellea、A．tabescens-专A．sinapina、A．calvescens、A．gallica、A．cepistipes明显不是一个系统发育系“⋯。Chillali等(1998)用欧洲菌株研究表明，ITS序列也可以用来进行蜜环菌种间的系统发育关系研究“7|。Coetzee等(2000)对全球的A．mellea进行了IGS和ITS的DNA序列分析，并指出在ITS序列上，亚洲群体与西北美的系统发育关系比较近，欧洲的A．mellea与亚洲和北美的关系比较远n8|。秦国夫(2002)利用ITS、IGS等片段的测序、PCR—RFLP、RAMS等分子标记研究了中国蜜环菌的遗传学与系统学研究。王汉臣(2008)选取世界各地同宗配合的蜜环菌和我国部分存在疑问的异宗配合的蜜环菌生物种菌株进行了部分B—Tubulin序列测定，在此基础上进行了系统发育分析，探讨了各生物种问的系统发育关系，对一些疑难问题进行了讨论。1⋯。孙立夫等(2011)利用ISSR分子标记对我国东北地区3个法国蜜环菌A．gallica居群共53个菌株的遗传多样性进行了分析，表明ISSR在蜜环菌中存在较高的多态性’2⋯。Antonin等(2009)根据基因译码延伸因子(Tefa)卜a指出月．cepistipPs与A．gallica虽然相似性较高，但二者种间的杂交是不可能发生的。2“。N．Matsushita等(1996)参照北半球的蜜环菌生物种，用同工酶对日本蜜环菌进行了鉴定，在用于检测日本蜜环菌生物种的25个不同的被试酶中，乳酸盐脱氢酶、葡糖脱氢酶和天门冬氨酸氨基转移酶表现了非常好的稳定性和可靠性，这些同工酶在双倍体和单倍体菌丝间，甚至在不同培养条件下几乎没有变化。通过这几个酶的联合使用可以清楚地区分不同蜜环菌生物种的特征。将它们用于欧洲蜜环菌生物种中，整个同工酶模式也表现得很稳定‘22|。J．P．Ride和E．Mwenje(1996)用同工酶标记对津巴布韦的蜜环菌生物种进行了比较研究，培养中的形态特征和生化特性变化被用来对20个从津巴布韦不同地区和寄主采集来的蜜环菌菌株进行分群。结果发现，形态特征能将这些菌株划分为3个不同的群组。通过等电聚焦研究蛋白质和同工酶的生化性质也表明了所得的3个群组与形态学研究所得的3个群组正好吻合。果胶裂合酶、非特异性酯酶、13-1，3一葡聚酶、果胶甲酯酶等在菌 西南大学硕士学位论文株分组中起着重要作用。23|：J．P．Ride和E．Mwenje(1997)又对非洲蜜环菌果胶酶的利用进行了探讨，认为果胶酶的同工酶分析可用于比较26个欧洲和26个热带非洲蜜环菌菌株，再次证明果胶酶，特别是果胶甲酯酶和果胶裂解酶在分群组时是非常有用的呛引。I．Robene-Soustrade等(1997)利用漆酶同工酶模式对过滤培养和从林木组织分离而得到的欧洲蜜环菌进行了研究，结果表明聚丙烯酞胺等电聚焦可使实验欧洲蜜环菌的漆酶特征化，这可作为区分蜜环菌的参考妲⋯。1．1．4蜜环菌的形态多样性随着分子生物学的发展及其对各个生物学科的渗透，Anderson和Stasovski(1992)以及Miller等(1994)基于形态学基础和DNA数据分析等分子系统学的研究结果，将北半球温带地区中的蜜环菌生物种分成了5个族Ⅱ6’捌。Korhonen(1995)综合上述研究成果并进行了总结，他将北半球的蜜环菌生物种也划分成5个族矧。秦国夫等(2002)在这个分类框架中又加上了中国近年来报道的种类。(一)高卢蜜环菌族：包括9个种，分别是A，gallica、A．cepistipes、A．calvescens、A．sinapina、A．singular、A．jazoensis、A．nabsnona、NABSX、A．1uteopileata。该族具有基部膨大的菌柄和丝膜状的菌环，担子基部具有锁状联合，生活史基本上为双倍体一双核体类型，根状菌索比较薄，单轴分枝，杆状，大多数生物种在土壤中产生发达的网状菌索。它们主要营腐生或弱寄生生活。(二)奥氏蜜环菌族：包括3个种，分别是A．ostoyae、A．borealis、A．gemina。本族蜜环菌菌环厚，发育良好：菌柄基部不膨大，菌盖上的鳞片相对较大：菌索二叉分枝，担子具锁状联合，生活史为双倍体一双核体类型。本族蜜环菌致病性较强。(三)蜜环菌族：包括2个种，分别是A．mellea、CBSG。该族具有金黄色的子实体，较厚的环，担子无锁状联合，生活史为简单双倍体类型。在阔叶树上具有较强的致病性。(四)假蜜环菌族：包括2个种，分别是A．tabescens、A．monadelpha。主要特点是无菌环，担子有一个锁状联合，生活史为双倍体一双核体类型。它们也在阔叶树上具有较强的致病性。(五)棘皮蜜环菌族，仅含1个同宗配合种A．ectypa。其生态特点在蜜环菌属 引言中极为特殊，它的担子具锁状联合，并且是从双核菌丝发育而来的，腐生在泥炭沼泽中。1．2天麻与蜜环菌1．2．1天麻的分类及生活史天麻(GastrodiaelataBI)又名定风草，系树兰亚科、天麻属，是多年生异养草本植物。目前，全球己发现天麻属植物约30种，我国己发现天麻属植物6个种：原天麻(岔angustas．Chows．C．Chen)、疣天麻(岔tubercuJata．F．Y．LiuetS．C．Chen)、细天麻(岔gracilisBI)、南天麻(岔力vanicaBI．Lindi)、天麻(岔elataBI)，及台湾省的(岔f]abilabellaS．s．Ying)控8|。其中，我国天麻产区主要分布的是天麻(6：elataBI)。根据天麻块茎含水量、块茎形状、花的颜色、花茎颜色的不同又可将天麻(岔elataBI)分为6个变形：红天麻(岔e]ataBI．f．elata)、乌天麻(岔elataBI．f．glaucaS．Chow)、绿天麻(￡e]ataBI．f．viridisMak．)、黄天麻(岔elataBI．f．flavidaS．Chow)、毛天麻(Ee]ataBI．f．piliferaTuyama)、绿天麻(岔eiataBI．f．viridisMak．)、松天麻(岔elataBI．f．albaS．Chow)卫9。。贵州省天麻主产区种植的天麻主要为乌天麻、红天麻、绿天麻。天麻无根无绿叶片，不能进行光合作用，是多年生草本植物。它是自营养生活，其营养主要依靠同化侵入体内的一些真菌而获得。天麻生活史大致如下：在有性繁殖即用种子繁殖阶段，必须与萌发菌(紫萁小菇、石斛小菇等)建立共生关系，然后种子才能获得营养而萌发；萌发后形成的原球茎又必须同化蜜环菌才能正常生长发育成米麻、白麻；此后，米麻、白麻与蜜环菌一起进入无性繁殖阶段直至形成箭麻。形成的箭麻抽蔓开花后就会产生种子，这一过程仅靠箭麻自身的营养来完成，至此天麻完成了从种子到种子的全部生活史。与萌发菌、蜜环菌先后共生完成其生活史，是天麻生长发育的主要特点‘咖。1．2．2蜜环菌与天麻共生关系的研究进展天麻与蜜环菌存在着特殊的共生关系，它们之间有竞争，也有互利，在不同的生长阶段，彼此间的利益也不是对等的。在天麻的不同生长阶段，它与蜜环菌的关系要经历拒菌、控菌、开放三个阶段。拒菌期即天麻的新生球茎开始形成时，这时天麻会抵抗蜜环菌的侵入，体表和内部均无蜜环菌。控菌期出现在天麻的次级球茎出现时，此时蜜环菌的活动会受到严格控制。天麻将蜜环菌控制在表皮组5 西南大学硕士学位论文织或接菌组织中，进行胞内消化和分解从而构成天麻内生菌根的特殊结构。开放期即天麻次级球茎发育完全后，原来的球茎完成使命，此时天麻对蜜环菌完全开放‘3¨。兰进等(1994)通过同位素放射性自显影研究表明，蜜环菌与天麻之间存在营养物质的相互交流，天麻可以吸收蜜环菌的营养，也可供给蜜环菌营养_1。王贺等(1997)发现天麻块茎皮层内具有三种染菌细胞：消化细胞、通道细胞和寄主细胞。三种细胞的超微结构研究表明，消化细胞能反寄生于真菌并从真菌获取营养物质，通道细胞会被真菌破坏，而寄主细胞则与真菌保持共生。消化细胞先释放溶酶体小泡消化、降解真菌，然后内吞泡和内吞管则吸收菌丝降解后的有机可溶性大分子物质，最后消化泡进一步消化和吞噬菌丝细胞壁等不溶性物质Ⅲ1。刘炳仁等(2003)认为，初期蜜环菌是以菌索形式网结在越冬后种麻的栓皮上，菌索分枝穿过栓皮，生长至消化层，靠吸收天麻表皮组织的营养而生活。然后，菌索产生分散的菌丝，从消化层的皮层细胞向四周扩散，分解利用天麻表皮细胞的原生质。但是菌丝进一步侵染天麻的消化细胞时，则被消化细胞所降解、吸收，于是种麻会源源不断地吸收蜜环菌的营养为子麻提供养分，直至子麻形成或停止生长。另外，随着种麻养分的耗尽，其消化吸收蜜环菌的生理功能逐渐减弱，种麻的残躯又会为蜜环菌提供营养物质∞3|。杨增明等(1990)从天麻中分离出一种功能性蛋白质，命名为天麻抗真菌蛋白，简称GAFP。这种蛋白对腐生真菌均有很强的抑制作用，但对寄生性真菌的抗性作用则很弱门圳。胡忠等(2003)则对天麻抗真菌蛋白进行了测序与基因克隆∞5|。1．2．3蜜环菌酶活性研究进展与菌物生长发育有关的各种酶活变动可能是蜜环菌的一个基本变化。在诱导菌索形成过程中，乙醇脱氢酶无论在同工酶数量还是在酶活性上都有增加，但这在菌丝中并没出现过(Mallet＆Cofotelo，1984)口6|。尽管乙醇脱氢酶在乙醇代谢过程中必不可少，但其在菌索形态发生中的作用还不清楚。漆酶也刺激着菌索的形成和发育(Robene--Soustrade＆Lung—Escarmant，1997)。”1。并且在菌索发育过程中其活性是逐渐累积性的(Rehman＆Thurston，1992)_8|，同时它也被乙醇和其它能诱导菌索生长的物质所诱导。Curir(1997)鉴定了一个具有致病性的狭义蜜环菌分泌的漆酶。漆酶刚好在第一根菌索出现之前 引言就能检测到，它在菌索生长到最大速度时达到高峰，当菌索生长停止时它也消失。研究还发现，在不形成菌索的培养基上无法检测到漆酶，菌索的产生数量会由于一些漆酶活性抑制剂的作用而减少昭⋯。国内蜜环菌的酶活性研究主要集中在不同菌株、不同阶段的一些常规酶活的测定及方法评比。吴涓等(2001)研究了几种漆酶分光光度测定法在蜜环菌胞外漆酶测定时的长短处，根据底物专一性、经济性，灵敏度高，认为丁香醛连氮值得采用_⋯。李福后等(2006)测定5株蜜环菌在液体培养过程中滤纸纤维素酶、漆酶、多酚氧化酶的酶活变化，为分析不同菌株间的生物降解能力、蜜环菌菌株选育奠定了一定基础。4“。焦迎春等(2010)研究了黄绿蜜环菌液体培养中CMC酶等6种胞外酶活性变化规律，为黄绿蜜环菌的液体培养优化提供了一定的理论知识。42|。蜜环菌的生长与胞外酶活性有着密切关系。蜜环菌为木腐菌，木材中90％的主要成分为半纤维素、纤维素、木质素，其分泌的胞外酶可降解半纤维素、纤维素、木质素等来满足自身生长繁殖所需的营养。本实验研究了贵州蜜环菌发酵液中漆酶等胞外酶活性变化规律，探索了液体发酵中胞外酶与蜜环菌生长势的关系。1．2．4促进天麻生长的优良蜜环菌研究进展一些研究发现，不同生物种的蜜环菌与天麻的共生关系也不同。A．gallica菌索粗壮、发达，生长迅速，寄生性不强，有利于天麻的栽培生产。CHA等(1995)收集了一些来自天麻生长区附近和天麻块茎的蜜环菌菌株进行生物种鉴定和栽培试验，结果表明A．gal]ica的共生作用相对要好一些。433。KIM等(1997)收集了一些来自不同地区的蜜环菌进行栽培试验并对表现相对较好的菌株进行了生物种鉴定，结果同样表明A．ga]Jica的共生效果最好H“。其次，A．gallica菌索细密，生长势好，有利于有性繁殖培养米麻。A．ostoyae和A．mellea具有很强的侵染力，是多种林木的致病菌，A．taboscens是华北地区果树的病原菌。5|，它们如果用于天麻栽培，不仅不能为天麻的生长提供所需的养分，反而天麻会被这些蜜环菌给吃掉，造成事与愿违的结果。一些有菌环的蜜环菌实际上是一个复合种类。46|，它们之间互交不育、相互拮抗。在天麻生产中，由于使用不当的蜜环菌的种类，经常造成天麻被“吃掉”，产生“空窝”的现象。因此，蜜环菌菌种已经成为目前天麻栽培产业的瓶颈，严重制约着天麻栽培业的发展。国内，王秋颖等(2001)采用不同来源的蜜环菌进行天麻栽培，结果表明，不 西南大学硕士学位论文同菌株对天麻的影响是不同的，天麻的产量和菌株的生长速度成正相关H”。陈明义等(2004)、孙士青等(2003，2004)利用不同菌株进行的天麻栽培试验结果与王秋颖等的结论一致‘48’493。薛梅(2004)报道了一株不能与天麻共生的蜜环菌在生理生化水平、形态学上的一些差异嵋0|。王晓玲等(2005)研究表明选用未栽培过天麻的蜜环菌有利于天麻的生长剐。研究还表明，不同性质的蜜环菌对天麻素含量和天麻产量都有较大的影响∞2|，这可能是因为不同的菌株具有不同的生物学特性。以上研究结论为我们下面筛选促进天麻生长的优良蜜环菌指明了光明方向。1．3本研究目的及意义贵州地势高低悬殊，气候多样，物种资源较多。本论文拟通过平皿培养及Tell．a等分子标记进行贵州天麻主产区蜜环菌表型多样性及遗传多样性研究，试图通过分子标记鉴定贵州天麻主产区蜜环菌的生物种类型，研究其平皿上的形态规律、了解贵州蜜环菌生物种的地理分布特点与系统发育关系。天麻佳品出贵州，贵州天麻在产量和质量上素有美誉。但贵州种植天麻的蜜环菌多引进于中科院和陕西汉中，本土蜜环菌菌种极少!本论文拟通过蜜环菌与天麻的有性栽培试验，从贵州天麻主产区野生蜜环菌中筛选出适合天麻生长的本土优良菌株。同时在液体摇瓶及栽培种培养时，研究各优良菌株的胞外酶活、生长速度等生理特性。为开发贵州蜜环菌资源及探索适合天麻生长的本地蜜环菌提供理论基础。 蜜环菌的采样与分离方法第二章蜜环菌的采样与分离方法2．1采样地点蜜环菌采样以贵州天麻主产区德江县、大方县为重心，并辐射周边天麻产区，共计8个县(图2—1)。图2-1采样点示意图Fig．2-1Theschematicdiagramofsamplingpoints2．2实验材料及仪器2．2．1材料长约20cm的直径2—15cm的青杠树木材、阔叶树木花、545．415．295的塑料周转箱、75％的医用酒精等。2．2．2主要仪器 西南大学硕士学位论文SW2CJ21F型超净无菌工作台，苏州安泰空气技术有限公司；250B型生化培养箱，天津泰斯特公司；MG758E型GPS仪，北京合众思壮科技股份有限公司；MLS一3750型高压灭菌锅，日本三洋电机公司；ThermoFisherMax484P型恒温摇床。2．2．3培养基分离培养基采用双抗培养基，成分为蛋白胨2g，硫酸镁0．5g，葡萄糖20g，琼脂7g，磷酸二氢钾0．46g，磷酸氢二钾1g，青霉素10万单位，庆大霉素20万单位，水1000mL，pH自然。液体培养基成分为葡萄糖46g，无水乙醇24g，酵母膏5g，蛋白胨13g，硫酸镁2g，磷酸二氢钾lg，VBl0．01g，VB20．03g，水1000mL，pH自然畸引。其中抗生素、维生素是在培养基灭菌后(121℃、30min)冷却至40-50℃时加入。2．3方法2．3．1采样及保存方法在各采样县份选好野生天麻出现较多的地方，顺山脉或溪流每隔1000m采集蜜环菌子实体或菌索，同时记录采样点的海拔，经纬度等。采回的子实体4度保存并及时分离。至于采回的蜜环菌菌索则混合青杠树木材，用浸透水的阔叶树木花填充、种植于己垫薄膜(穿孔)的塑料周转箱。最后盖好薄膜，保存于贵州省现代中药材研究所的塑料大棚中，待其长出幼嫩蜜环菌菌索或子实体后再进行菌株分离m3。2．3．2菌株的分离取筐栽菌索或长出的幼嫩菌索，冲洗干净，于超净工作台中用纯水浸泡20min后，放入75％酒精中浸泡，然后用无菌水浸泡30S，无菌滤纸吸干菌索，剪成长0．5cm左右的小段，在每个含有分离培养基的平皿中放置5根菌索小段后置于18。C生化培养箱中黑暗培养。期间将分离培养基中有菌丝萌动的菌索转移至i]PDA培养基中25℃1n 蜜环菌的采样与分离方法暗培养2周，期间肉眼观察菌丝、新生菌索形态的一致性，若有形态差异，进行二次分离。蜜环菌子实体、含有菌索的天麻块茎分离方法：具体见刘景圣和肖波的分离方法矗5’蚓。2．3．3分离菌株的液体培养超净工作台中切取已经分离的长0．5cm的菌索尖端接入含有150IIIL液体培养基的250mL三角瓶中(每个三角瓶中接入3段菌索)，置于水平摇床上25℃、160r／min暗培养[571。2．4实验结果2．4．1蜜环菌采集及保存在德江、大方等地共采集并保存蜜环菌菌株约150株，其中作者采样为台江县26株、绥阳县33株、开阳县20株、德江县15株。采用菌索筐栽保存能有效延长菌索分离时间，在春秋季节还能得到蜜环菌子实体。2．4．2蜜环菌的分离菌索在75％酒精中浸泡消毒时，消毒时间的掌握极为重要。消毒时间过长菌索会失去活力，时间过短则消毒不彻底易感染杂菌，幼嫩菌索lmin、老化菌索约2min为佳。菌索分离时18"C暗培养能有效避免木霉的感染，分离培养基中的抗生素能有效减少细菌的感染。依据上述蜜环菌样本保存及菌株分离方法，分离蜜环菌约100株，其中作者分离23株(表2一1)。分离的菌索在液体摇瓶时，约4—15天菌丝就能长满三角瓶(图2—2)。 西南大学硕士学位论文A骂C图2—2分离菌索时不同的生长阶段A：萌动的菌丝；B：新生菌索；c：摇瓶的菌丝．Fig·2-2Differentgrowthstagesofrhizomorphisolates．A：newbornArmillariamycelium；B：newbornrhizomorph；C．Armillariamyceliumculturedbyliquidmedium．12表2-1作者亲自分离菌株信息Tab．2一lnejnformationoftheisolates，尊采集点Colleefionsite海拔经纬度L0ngimdeandStrataAltimdelatitIld。DFlDafang(大方县)1693．7E105。52’9．1”N027。24·35．7”DF2Dafang(大方县)2100．0E105。52"27．2”N027。l8"23．8”DF3Dafang(大方县)1750．9E105。38·13．2”N027。07t28．5”DJIDejiang(德江县)1】63．0E108。05·40．5”N028。27t18．1”HZ2Hezhang(赫章县)2060．9E104。47’38．2”N027。06·34．0”KYIKaiyang(开阳县)1329．0E】06052·30”N026。59·36”KY2Kaiyang(开阳县)1435．9E106。50·29．9”N027。01·43．1”LSlLeishan(雷山县)1324．6E108。13，9．0”N026。25·10．2”LS5Leishan(雷山县)1575．5E108。12·52．4”N026。25t4．4”LS3Leishan(雷山县)1512．IE108。13·59”N026。24"22．3”SB4Shibing(施秉县)783．0E108。03·10”N027。05·5．7”SB3Shibing(施秉县)795．0E108003·05”N027。05·55”SY7Suiyang(绥阳县)1524．9E107。10’45．3”N028。13·23．4，，SY5Suiyang(绥阳县)1550．9E107。09’10．9”N028。14·22．6”SY4Suiyang(绥阳县)1555．0E107010·13．9”N028014·4．1，，SY3Suiyang(绥阳县)1537．0E107。10。39．4”N028。13·34．5”SY6Suiyang(绥阳县)1570．2E107009·57．8”N028014t16．9”SY2Suiyang(绥阳县)1519．4E107。09—5．5”N028。14·31．3”TJ!Ta日iang(台江县)1597．8E108018t7．9”N026。32·49．3，，TJ2Taijiang(台江县)1295．5E108016t15．7”N02603l·17．9”TJ3Taijiang(台江县)1400．1E108016-30．1”N026。3l·19．8”TJ4Taijiang(台江县)1574．9E108017t48．5”N026032·58-3，，TJ5Taijiang(台江县)1590．5E108。18·5．7”N026。32·50．4” 蜜环菌菌丝菌索的形态多样性研究第三章蜜环菌菌丝菌索的形态多样性研究3．1材料与仪器3．1．1菌株供试菌株为贵州省现代中药材研究所重点实验室分离保存的35株蜜环菌(表3-1)。表3-1供试蜜环菌的来源Tab．3．1TheSOUrCeof35Armillariastrians菌株采集点分离来源菌株采集点分离来源StrainCollectionsiteSourceStrainCollectionsiteSourceDFI大方Dafang菌索rhizomorphKY4开阳Kaiyang子实体fruitbodyDF2大方Dafang菌索rhizomorphKY5开阳Kaiyang子实体fruitbodyDF3大方Dafang菌索rhizomorphSYI绥阳Suiyang菌索rhizomorphDF4大方Dafang菌索rhizomorphSY2绥阳Suiyang菌索rhizomorphDF5大方Dafang菌索rhizomorphSY3绥阳Suiyang菌索rhizomorphDJ1德江Dejiang菌索rhizomorphSY4绥阳Suiyang菌索rhizomorphDJ2德江Dejiang菌索rhizomorphSY5绥阳Suiyang菌索rhizomorphDJ3德江Dejiang菌索rhizomorphLS1雷山Leishan菌索rhizomorphDJ4德江Dejiang菌索rhizomorphLS2雷山Leishan天麻块茎GastrodiadatatuberDJ5德江Dejiang天麻块茎GastrodiaelatatuberLS3雷山Leishan子实体fruitbodyHZI赫章Hezhang天麻块茎GastrodiaelatatuberLS4雷山Leishan子实体fruitbodyHZ2赫章Hezhang菌索rhizomorphLS5雷山Leishan菌索rhizomorphHZ3赫章Hezhang天麻块茎GastrodiaelatatuberSBi施秉Shibing菌索rhizomorphHZ4赫章Hezhang菌索rhizomorpbSB2施秉Shibing菌索rhizomorphHZ5赫章Hezhang菌索rhizomorphSB3施秉Shibing菌索rhizomorphKYI开阳Kaiyang菌索rhizomorphSB4施秉ShYing菌索rhizomorphKY2开阳Kaiyang菌索rhizomorphSB5麓秉Shibing菌索rhizomorphKY3开阳Kaiyang菌索rhizomorph3．1．2培养基培养基为PDA培养基，成分为：马铃薯20克，葡萄糖2克，琼脂7克纯水1000毫升，pH自然。3．1．3主要仪器SW2CJ21F型超净无菌工作台，苏州安泰空气技术有限公司； 西南大学硕士学位论文250B型生化培养箱，天津泰斯特公司；MLS-3750型高压灭菌锅，日本三洋电机公司。3．2方法超净工作台中切取已经分离的长0．5cm的菌索尖端，并接入含有15毫升PDA培养基的直径为15mm的玻璃培养皿中(在每个培养皿中心接入1段菌索)。记录菌株形态指标陋1(表3—2)直至菌索长满平皿，每个菌株设置3个重复。其中菌丝或菌索的颜色以菌丝、菌索萌动后五天内不变的颜色为准。表3-2蜜环菌表型性状Tab．3-2PhenotypiccharactersofArmillaria3．3结果与分析根据各菌株在PDA固体培养基上的新生菌丝颜色、新生菌索颜色、菌索顶端 蜜环菌菌丝菌索的形态多样性研究分叉形式、菌索形状、菌索延伸形态，可将供试的35株蜜环菌划分为9个形态群(图3-1)。其中数量性状(菌索直径、生长速度)记录少不满足方差分析不适合用于分组；某些质量性状(菌丝稠密度、菌索分支数量、次级菌素着生度)记录时主观因素过多不能用于形态群划分。各地菌株的形态群划分依据详见表3—3。基于菌株的形态群划分，各采样点的多样性指数如下：开阳、绥阳、赫章的Shannon—wienerindex(H‘)、pielou均匀度指数(E)相同，分别为H’=1．33，E=O．96：德江、施秉的H、、E相同，分别为H、=1．61，E=I；雷山的H、=0．95，E-O．86；大方的H、=1．05，E=O．96。这表明贵州天麻主产区的蜜环菌形态多样、菌群分布均匀，其中形态群Ⅵ占绝对优势，其次是形态群Ⅷ。 富己>亭N-n造S—oN口n∞Nn∞NnlnNnIn—NN净∞，N≯)王Nh口二≯2n∞一m山口，n∞∞n一出，n≯∽n∞广I，寸∞J一∞，I，N∞∞寸≯∞n∞∽，n净)ln≯∞蠢^口寸N}I，”N}I寸∞∽N‰凸，寸山口一≯∽nN}I，n，0_【N}I，寸扣)王一‘凸，n山o_l∞∞N∞rI，寸一oNN}王二I-口一Nvn．N．一一nN．N—n．N—n心．I)N∞．一曲冀一一n啦．一一N．z．n．1：^n心．I)∞口．q∞I．一一吨_【v也．I-N．一一01．_【一■_【一．o—n啦．一一△．一毒．一^口∞．一一^四∞．_|一^口卜．一一一乱n．一一一_卜．一一n．N．一寸．N．∞_1．H小．_【．∞．oN．_【一_l一一卜9．I)^t，卜I)^寸_l一一nc．岜一N．_【峙∞，N．寸_I．一卜．一．N．一n．N—c)一n1N一^寸I)一nqH一一n￡．N—nn．一∞n．一．”一．一∞．一．n．一n．N—n卜．一一一n．一一^寸卜．一一一∞_1．_【一一n卜．N—n．q—n．一n．N-1．_【n．I．∞．on．N一_【一一N一一心t1)一寸．_【一一nn．_【一一n，N，一口N．N．n￡．一∞．一．∞．oN，一一N一一_【N．_l一一呐心．I)一■N—n，一N口气一晶m．oN．q一．一n．N焉uIJ日口一iu兰甚罡荡们Tl0920Ⅵ。Ip盘≥oJqII≥o_Io一砖u一．I口口一一hu口o>．Ioo∞T10_【IIo：loIIu一口口≥o_IDIl，^_—o．Io一时u一_I≈口一一hU_II眦11N扫∽一心一口o△oIIo—置口≥oJaII≥oJa一再u芑勺口一一hU勺uAJTlu一矗一口oQo口o—II—H，≯o．Io——亭o．I声焉3IJp口Il}U哥^JTlo趸pod0IIo吕∞=tI亭宣亭oJq一一u一．I勺IIll*Uao>_Ijo∞T10—口o_o乌。一口—军o．Io一再u一．I口口llhU_丘“州譬_∞一时一勺oaoIlo—葛o=皇≥口亭oJqo_暑≥一硝uIJ≈LIll^o≈∞>-ju—d一日o‘Ieco尸=皇、；o-‘l∞名上；口o^JTlo的110u1010c。I口。一一皇≥up三≥嚣恒姐固lII营扛∞巡州删裁巡嘲半划憾祖怕谶铽醚嘣求椭酶粗《蛞似求憾粗^p-93)o甚翅删峭粗巡龆器刈粗箕龄耋蓦粗晕烈酶粗释肾懈悃卸瞪酶粗印骚刹悃。口h|I8专是．I∞l；【—≥o_Io—g暑io苗辱IQ扫Is皇up．苫u导专．g皇譬。扫∞口。一瓮u．1置商|010丫匣810u．=赫均到∞4r12∞一8I暑。一。；dJ。=【Sull一再>c8旨、sJ30霉四LIQ∞T120Lu拿cQ若苫o∞ojd2暑盲口焉扫∞§kS～誉．f飞翟芎oo窃arIo＆高u一眦oIoIIcLIog咱。们2董矗占一％二uQ上一n．c．鲁，工^姆嚣阱雹葵掣删簌副怡龄雌扭旨韫懈￡占强晕{；副僻琼隧妻譬怡龄船粗髀御n_￡搽仪$迥扑书隧扑长怔目 蜜环菌菌丝菌索的形态多样性研究BHECF图3-1分离蜜环菌的9种形态群A、B、C、D、E、F、G、H、I：形态群I、形态群l|、形态群⋯、形态群|V、形态群V、形态群Vl、形态群V¨、形态群VⅢ、形态群Ix的菌株形态特征．Fig．3—1The9kindsofmorphologicalgroupsofArmillariaisolates．A，B，C，D，E，F,G，H，I：morphologicalcharacteristicsofmorphologicalgroupsI，morphologicalgroupsII，morphologicalgroupsIII，morphologicalgroupsIV,morphologicalgroupsv，morphologicalgroupsVI，morphologicalgroupsVII，morphologicalgroupsVIII，morphologicalgroupsIX．17 西南大学硕士学位论文18 蜜环菌遗传多样性研究第四章蜜环菌遗传多样性研究4．1材料及仪器4．1．1供试菌株供试菌株为贵州省现代中药材研究所重点实验室分离保存的35株蜜环菌(表4—1)。其中菌丝型材料是依据第二章2．3．3的液体摇瓶方法制得的液体菌丝，菌索型材料是分离菌株接种到含有PDA固体培养基中的菌索。表4-1供试蜜环菌T￡lb．4．1TheselectedArmillariastriarts菌株采集点材料类型菌株采集点材料类型StrainCollectionsiteMaterialtypeStrainCollectionsiteMaterialtypeDFI大方Dafang菌丝myceliaLS2雷山Leishan菌丝myeeliaDF2大方Dafang菌素rhizomorphLS3雷山Leishan菌丝myceliaDF3大方Dafang菌索rhizomorphLS5雷山Leishan菌丝myceliaDF4大方Dafang菌丝myceliaSB3施秉Shibing菌丝myceliaDJl德江Dejiang菌丝myceliaSB4施秉Shibing菌丝myceliaDJ3德江Dejiang菌索rhizomorphSYI绥阳Suiyang菌丝myeeliaDJ4德江Dejiang菌丝myceliaSY2绥阳Suiyang菌丝myceliaDJ5德江Dejiang菌丝myceliaSY3绥阳Suiyang菌索rhizomorphHZI赫章Hezhang菌索rhizomorphSY4绥阳Suiyang菌素rhizomorphHZ2赫章Hezhang菌丝myceliaSY5绥阳Suiyang菌索rhizomorphHZ3赫章Hezhang菌丝myceliaSY6绥阳Suiyang菌索rhizomorphHZ4赫章Hezhang菌索rhizomorphSY7绥阳Suiyang菌索rhizomorphHZ5赫章Hezhang菌索rhizomorphTJl台江Taijiang菌索rhizomorphKYI开阳Kaiyang菌素rhizomorphTJ2台江Taijiang菌索rhizomorphKY2开阳Kaiyang菌丝myceliaTJ3台江Taijiang菌索rhizomorphKY4开阳Kaiyang菌丝myceliaTJ4台江Taijiang菌索rhizomorphKY5开阳Kaiyang菌丝myeeliaTJ5台江Taijiang菌索rhizomorphLSI雷山Leishan菌索rhizomorph4．1．2主要试剂和仪器常规试剂购于北京鼎国生物有限公司；PMDl9一T载体购于日本TaKaRa公司；PCR试剂购于上海生工生物工程技术服务有限公司；琼脂糖为HyAgaroseTM；PCR扩增仪(BIO—PAD美国)；电泳仪(北京六一)；凝胶成像仪(Syngene英国)。实验使用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 西南大学硕士学位论文4．2方法4．2．1DNA的提取液体菌丝材料先真空抽滤收集，再用纯水冲洗2次，最后抽滤除尽水分并至于-70。C冻存备用，总DNA提取采用黄宏文的方法进行=583。菌索型材料先于-20。C完全冷冻，再于37。C恒温水浴，使PDA培养基与菌索分离。然后用纯水冲洗菌索，滤纸吸干菌索水分，提取DNA则采用陈昆松的改良CTAB法阻9。。4．2．2rDNA-lTs的扩增PCR反应体系采用通用引物ITSl(5’一TCCGTAGGTGAACCTGCGG～3‘)和ITS4(5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3’)。PCR反应体系(2512L)：10×PCRBuffer2．5uL，dNTP(各10mmol／L)1．0uL，模板DNh溶液1．0pL，5u／uL的Taq酶0．3uL，10umol／L的ITSl和ITS4弓I物各1uL，加超纯水补足。PCR反应条件：95℃，预变性，3min；35个循环(94℃，变性，lmin；52℃，退火，lmin；72℃，延伸，1．5min)；72℃，延伸，10min。PCR产物经1．5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTekeCorporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。4．2．3rDNA—IGS的扩增PCR反应体系采用通用引物CNLl2(5"-CTGAACGCCTCTAAGTCAG一3’)和5SA(5’-CAGAGTCCTATGGCCGTGGAT-3’)。PCR反应体系(25pL)：10×PCRBuffer2．5uL，clNTP(各10mmol／L)1．0pL，模板DNA溶液1．0pL，5U／pL的Taq酶0．3uL，10umol／L的CNLl2和5sA引物各1laL，加超纯水补足。PCR反应条件：94℃，预变性，3min；35个循环(94。C，变性，40s；58．9"C，退火，40s；72。C，延伸，lOOs)；72"C，延伸，lOmin阳州。PCR产物经1．5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTekeCorporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。4．2．4Tell—a序列的扩增Tefl—a序列的扩增采用类似巢式PCR的程序分两步进行。第一步PCR反应体系采用通用引物EF526F(5一GTCGTYGTYATYGGHCAYGT一3’)和EFl567R(5’一ACHGTRCCRATACCACCRATCTT一3‘)。PCR反压立体系(25uL)：l0xPCRBuffer2．5uL，dNTP(各10mmol／L)O．5uL，模板DNA溶液1．0uL，5U／uL的Taq酶0．25uL，10umol／L的EF526F和EFl567RiJI物各0．5uL，加超纯水补足。PCR反应条件：94℃，预变性，5min：10个循环(94℃，变性，30s；63。C一54。C每个循环下降一度，退火，55s；72℃，延伸，1．5min)；35个循环(94℃，变性，30s；53℃，退火，55s；72℃，延伸，1．5min)；72℃，延伸，lOmin。PER产物经1．5％的琼脂糖凝胶电泳检测，有清晰目的条带的无需做下一步PCR扩增，无明显条带的则直20 蜜环菌遗传多样性研究接作为下一步PCR反应的模板。第二步PCR反应体系采用通用引物EF595F(5。CGTGACTTCATC从GAACATG一3’)和EFll60R(5’-CCGATCTTGTAGACGTCCTG一3’)。PCR反应体系(25lJL)：10×PCRBuffer2．5uL，dNTP(各10mmol／L)0．5uL，模板(第一步PCR产物)1．OuL，5U／uL的Taq酶O．2uL，10umol／L的EF595F和EFll60R弓l物各1uL，加超纯水补足。PCR反应条件：94。C，预变性，3min；35个循环(94℃，变性，30s；53．5。C，退火，30s；72。C，延伸，1．5min)；72"C，延伸，lOmin。PCR产物经1．5％的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的DNA片段，用BioTekeCorporation凝胶纯化试剂盒回收目的DNA片段，操作方法按试剂盒的使用说明进行。4．2．5TA克隆及测序按试剂盒的操作方法将纯化回收的PCR产物连接到PMDl9一T载体上，转入DH5a感受态细胞中，活化1h后涂布于含有氨苄、IPTG、x—gal的LB固体培养基中，37℃倒置培养过夜后挑选阳性克隆菌落于含有氨苄的LB液体培养基培养4h，菌液PCR检测阳性克隆后，送上海生工生物工程技术服务有限公司做双向测序。每个菌株测序时设两个重复’“"623。菌液PCR反应体系采用通用引物M13F(5’一CGCCAGGGTTTTcccAGTCACGAC一3’)和M13R(5’一AGCGGATAACAATTTCACACAGGA一3’)。PCR反压立体系(15uL)：10×PCRBuffer1．5ul，dNTP(各lOmmol／L)1．2uL，模板菌液0．5uL，5U／uL的Taq酶0．15laL，10umol／L的M13F和M13R弓I物各0．3pL，加超纯水补足。PCR反应条件：95℃，预变性，5min；35个循环(94℃，变性，30s；52℃，退火，30s；72"C，延伸，30s)；72℃，延伸，lOmin。”。。4．2．6序列分析测序结果经SeqMan软件去除两端的PMDl9-T载体或修正，反复校对、拼接组装后提交GenBank数据库并比对、鉴定各菌株。获得序列两两比较采用软件Megalign，GC含量、长度等分析采用软件Editseq。实验获得的序列及在GenBank中下载的参照序列，使用MEGA5．1软件寻找最佳参数模型、利用MaximumLikelihood(最大似然法)构建系统发育树，并经bootstrap1000次循环检验系统树的可靠性』“。分子鉴定和系统发育分析时的参照序列选择遵循种属明确、序列准确可信且己发表文章的原则。4．3结果与分析4．3．1rDNA-lTs的测序结果与两两比较测序后的rDNA—ITS序列经拼接加工后，己提交GenBank，序列登陆号见表4-2。35株蜜环菌的rDNA—ITS长度在855—909bp之间，Gc含量在42．13％一45．22％之间(表4—2)。rDNA-ITS序列长度为868—870bp的有21个菌株之多，而rDNA—ITS序列长度，1 西南大学硕士学位论文相同菌株的Gc含量也基本相同，基本在44％左右。．在实验菌株的rDNA-ITS序列两两比较中，序列相似性存在两个极端(表4～3)，绝大部分菌株间的rDNA-ITS相似性在97％以上，大部分菌株间的rDNA—ITS相似性甚至在99％以上。35个菌株间rDNA-ITS相似性为100％的菌株有DFI和DJ4、DF2币IDF4、DF2和DJl、DF2和DJ5、DF2$1LS3、DF4币IDJl、DF4和DJ5、DF4年ILS3、DJl年HDJS、DJl和LS3、DJ5和LS3、KY5和SYl、LS2和SY5、SB4和SY2。除此以外，少部分菌株与其它菌株的相似性只有约92％，它们分别是DFl、D34、ItZ4、KY4、KY5、SYI。rDNA—ITS的差异性在区分绝大多数实验菌株时不太明显：但对于特异性菌株，rDNA—ITS去P能显著性地区分开。4．3．2rDNA-IGs的测序结果与两两比较测定的rDNA—IGS序列经拼接加工后，已提交GenBank，序列登陆号见表4—4。35株蜜环菌的rDNA—IGS长度在841—925bp之间，GC含量在42．33％一44．73％之间(表4—4)。rDNA-IGS序列长度为907-910bp的有22个菌株之多，其中5个菌株的rDNA—IGS的长度为909bp，15个菌株为910bp。rDNA—IGS序列长度相同菌株的Gc含量有些差异，基本在44％左右，但也有完全相同的菌株。在实验菌株的rDNA-IGS序列两两比较中，序列相似性也存在两个极端(表4—5)，情况与rDNA—ITS的有些类似。绝大部分菌株间的rDNA—IGS相似性在97％以上，大部分菌株间的rDNA—IGS相似性甚至在99％以上。35个菌株间rDNA—IGS相似性为100％的菌株有DFl和DJ4、DF4和DJ5、DJI平IHZ3、DJl和KY2、DJl和SY4、DJl和SY5、DJl和T54、HZ3和KY2、HZ3和SY4、HZ3和SY5、HZ3和TJ4、KY2和SY4、KY2和SY5、KY2和TJ4、KY4和KY5、KY4和SYI、KY4币ISY2、KY5和SYl、KY5和SY2、LSl和TJ2、SB4并ITJl、SYl和SY2、SY4幂ISY5、SY4币ITJ4、SY5和TJ4。除此以外，少部分菌株与其它菌株的相似性较低，其中84％的占多数，它们分别是DFl、DJ4、HZ4、KY4、KY5、SYl、SY2。rDNA—IGS的差异性在区分绝大多数实验菌株时不太明显；但对于特异性菌株，rDNA-IGS却【=LrDNA-ITS更具区分度。22 蜜环菌遗传多样性研究表4-2rDNA-ITS的测序结果Tab．4-2ThesequencingresultsofrDNA-ITS菌株L警’篙H‰景菌株k掣∞三警翥毒DJ385544．33KJ643337TJ486944．07I(J64335lLSl85644．39K丁643342TJ586944．07KJ643352SY585743．99KJ643345DF486944．19KF032533HZl85845．22KJ643338DJl86944．19KF032522TJ286543．82KJ643349DJ586944．19KF032526HZ586643．88KJ643340LS386944．19KF03252lDF286744．29KJ643335SY786944．30KJ643347LS586844．0lKF03253lHZ287043．56KF032527SY4’86844．01KJ643344SY387043．68KJ643343TJ386844．01KJ643350DF387044．25KJ643336KY286943．84KF032524HZ387143．86KF032529LS286943．84KF032528DJ488642．44KF032534KYl86943．96KJ643341KY588642．78KF032535SB386943．96KF032525SYl88642．78KF032532TJl86943．96KJ643348HZ488643．23KJ643339SB486944．07KF032520DFl88742．39KF032530SY286944．07KF032523KY490942．13I一勺勺口对一Q一“口时一扫QTl一∞Q召一h辱lI—LI一∞m．￡Q卜卜．寸．D幅一^般⋯Fv恻昧制冥一娅⋯叫u掣警罂幕世m-1％．L盆唇蜷坦姆卜七懈仪袋迥扑书匿扑长证目 蜜环菌遗传多样性研究4．3．4参试蜜环菌的生物种分子鉴定与系统发育分析将得到rDNA—ITS序列提交到GeneBank进行生物种分子鉴定时，参试的13株蜜环菌与Armillariagallica的相似率大于97％，DJ3和LSl与爿册jJ，』a，妇gallica的相似率为96％，Hzl则接近94％；6株蜜环菌与爿埘j』』a，妇mellea的相似率在93％一95％之间；12株蜜环菌与血仞j』』a，如cepistipes的相似率大于97％，SY5与血撕』』盯扬cepistipOS的相似率则为96％(表4—8)。由此可知参试蜜环菌株基本为加研j』』ar妇gallica、Armillariamellea、彳肋j』』a，妇cepistipOS。其中基本确定为彳肋j』』ar』agallica的有13株；可能为爿埘j』|，ar妇cepistipOS的有12株；DFl等6株蜜环菌与爿删j』』盯幽mellea相近，可能为其近缘种或亚种。利用软件MEGA5．1对实验的35株蜜环菌和GeneBank中相似菌株的rDNA—ITS序列进行系统发育分析，参考序列的选择遵循种属明确、序列准确可信且己发表文章的原则。数据经软件MEGA5．1分析，采用Kimura2-parameter参数模型、MaximumLikelihood(最大似然法)构建系统发育树(图4—1)。DFl等6株蜜环菌与Armillariamellea聚为一类，支持率高达87％，这一类又可细分为34,类，支持率分别为65％、99％、76％。KY2等29菌株聚为一大类，但支持率仅有40％。其中DJ5等5株蜜环菌与Armillariagallica聚成一类，支持率较高为77％，但他们与国内的蜜环菌栽培种(FJ501582)却以98％的支持率聚为一类。LS5等24株蜜环菌的聚类效果不明显，支持率较低，且里面包含了Armillariagallica、月彻j』_，a—acepistipes。由此可知rDNA—ITS不能很好地区分开Armillariagallica和彳朋j-J『盯妇copistipes，但能将它们与Armillariamellea明显分开。同时也说明了LS5等24株蜜环菌在rDNA—ITS序列上差异较多，遗传多样性丰富。实验的35株蜜环菌年lGeneBank中相似菌株的rDNA—IGS序列经软件MEGA5．1分析，采用Hasegawa—Kishino—Yano参数模型、MaximumLikelihood(最大似然法)构建系统发育树(图4—2)。参考序列的选择遵循种属明确、序列准确可信且己发表文章的原则。基于蜜环菌rDNA-IGS序列构建的系统发育树与rDNA—ITS的情况有些类似；但是基于遗传标尺和聚类情况分析，rDNA—IGS在菌株间的差异性要大于rDNAITS。蜜环菌rDNA—IGS系统发育树的遗传标尺默认为0．02，而rDNA—ITS的则为o．01。在蜜环菌rDNA—IGS系统发育树中，DFl等7株蜜环菌任与月埘j』』a，幽melloa聚为一大类，支持率高达100％，其中DFI矛IDJ4以92％的支持率聚为一小类。其它28个菌株的聚类情况比较复杂，且里面也包含了Armillariagallice、ArmillariacedistipOS；它们能划为几小类，例女DDF3、DJ3和DF2、LS3分别以86％和72％的支持率聚为一小类。对LLrDNA—ITS，可知rDNA—IGS也不能很好地区分开Armillariagallica年HArmillariacepistipPs，但区分效果要EtrDNA—ITS的好。同时rDNA—IGS能更好地将Armillariamellea与Armillariagallica、ArmillariacepistipPs2q 西南大学硕士学位论文区分开。由此可知，蜜环菌在rDNA—IGS序列上的差异更多，遗传多样性更丰富a表4-8蜜环菌种属的分子鉴定Tab．4-8ThemolecularidentificationoftheArmillariastrains菌株GenBank编号分子鉴定相似序列序列比对覆盖比率(％)序列相似率(％)StrainGenBankaccessionNO．molecularidentificationsimilarsequenceQuerycoverageSequenceidentityDF2KJ643335ArmillariagallicaAJ25005410099DF4KF032533ArmillariagallicaAJ25005410099DJlKF032522ArmillariagallicaAJ25005410099DJ5KF032526ArmillariagallicaAJ25005410099KYIKJ643341ArmillariagallicaAJ25005410098LS3KF032521ArmillariagallicaAJ25005410099TJ3KJ643350ArmillariagallicaAJ25005410099SY7KJ643347ArmillariagallieaAYl9024899DF3KJ643336ArmillariagallicaFR68654810098DJ3KJ643337ArmillariagallicaFR68654810096HZIKJ643338ArmillariagallicaFR68654897LSlKJ643342ArmillariagallicaFR6865489799SY4KJ643344ArmillariagallicaFR68654810099TJ2KJ643349ArmillariagallicaFR68654810099TJ4KJ643351ArmillariagallicaFR68654810099TJ5KJ643352ArmillariagallicaFR68654810099DF1KF032530ArmillariamelleaAB5108529699DJ4KF032534ArmillariamelleaAB5108579699KY4KF032536ArmillariamelleaAB5108809697KY5KF032535ArmillariamelleaAB5108809699SYlKF032532ArmillariamelleaAB5108809699HZ4KJ643339ArmillariamelleaAY5543339698SY3KJ643343ArmillariacepistipesAJ25005310099SY5KJ643345ArmillariacepistipesAJ2500539799SY6KJ643346ArmillariacepistipesAJ25005310099TJIKJ643348ArmillariacepistipesAJ250053100ggHZ2KF032527ArmillariacepistipesJN65744999HZ3KF032529ArmillariacepistipesJN65744999HZ5KJ643340ArmillanacepistipesJN65744999KY2KF032524ArmillariacepistipesJN65744999LS2KF032528ArmillariacepistipesJN65744999LS5KF032531ArmillariacepistipesJN65744999SB3KF032525ArmillariacepistipesJN65744999SB4KF032520ArmillariacepistipesJN65744999SY2KF032523ArmillariacepistipesJN65744910099 蜜环菌遗传多样性研究p—————————叫a们图4-1基于35个实验菌株及来自GeneBank相似蜜环菌的ITs序列构建的系统发育树Fig．4一lphylogenetictreebasedonITSsequenceof35ArmillariastriansandalongwithknownArmillariafromtheGenBankwithhighsequencesimilarity． 西南大学硕士学位论文}———————————叫嘎瞳图4-2基于35个实验菌株及来自GeneBank相似蜜环菌的IGs序列构建的系统发育树Fig．4—2phylogenetictreebasedonIGSsequenceof35ArmillariastriansandalongwithknownArmillariafromtheGenBankwithhighsequencesimilarity．利用软件MEGA5．1对实验的35株蜜环菌和GeneBank中不同蜜环菌生物种的Tell-a序列进行聚类分析。参考序列的选择遵循种属明确、序列准确可信的原则。因实验Tefl—a序列的5’和3’端是不完整的，且序列间差异显著，构建聚类图时选择的比对是非编码基因模式，数据经分析后采用Kimura2-parameter参数模型、MaximumLikelihood(最大似然法)构建优化的无根系统发育树(图4—3)。但同样看出蜜环菌在Tefl—a的差异性相当大，除了KYl、TJ3、TJ4；KY4、KY5；SY2、32 蜜环菌遗传多样性研究SY4、SY7以99％的支持率聚在一起外，其余菌株聚在一起的支持率基本低于90％。部分实验菌株甚至是单独聚为一类的，女IDF3、HZ3等。由此可知，Tefl-a在蜜环菌中差异显著，遗传多样性极丰富。Tefl—a不仅能区分爿册j』』ar扬mellea、月脚jJ』丑nagallica、月脚j』』a订acepistipes，甚至能区分种属一样的蜜环菌。图4—3基于35个实验菌株及来I刍GeneBank相似蜜环菌的Tefl—a序列构建的聚类图Fig．4-3dendrogrambasedonTefl-asequenceof35ArmillariastfiansandalongwimknownArmillariafromtheGenBankwithhighsequencesimilarity．由上述生物种分子鉴定与系统发育分析可知，试验菌株的rDNA—ITS系统树与生物种鉴定较为一致。与Armillariamellea关系较近的DFl等6个菌株确实以较高33 西南大学硕士学位论文的支持率(87％)被聚至UArmillaria助P』』∞一类，DJ5等5个菌株则与四川I省农科院提交的蜜环菌栽培种(FJ501582)以98％的支持率聚为一类，其余菌株则与Aminariagallica、Arminariacepistipe喻得不是根清楚q试验菌株DFl、DJ4币IJKY4、KY5在rDNA—ITS、rDNA—IGS、Tefl—a的系统发育分析中均以较高的支持率聚为一类，且在rDNA—ITS、rDNA—IGS的系统树中不存在遗传距离差异。这与DFl、DJ4和KY4、KY5在rDNA-ITS、rDNA—IGS、Tefl—a间的两两比较一致，同时也说明了它们可能为同一菌株，也有可能是这3个基因片段不能区分DFl、DJ4和KY4、KY5。这需要通过互交不育性实验或其它分子标记来确定。34 促进天麻生长的优良蜜环菌筛选第五章促进天麻生长的优良蜜环菌筛选5．1材料与方法5．1．1供试菌株实验蜜环菌由贵州省现代中药材研究所提供(表5-1)，蜜环菌cK、萌发菌是购于贵州乌蒙腾菌业有限公司的三级固体种。表5-1蜜环菌参试菌株T曲．5．1Theinformationof7Armillariastriarts5．1．2天麻蒴果用于实验的天麻蒴果由贵州省现代中药材研究所提供，有红天麻(岔elataBI．f．eIata)、乌天麻(岔eIataBI．f．giaucaS．Chow)、绿天麻(岔eJaraBI．f．vYridisMak．)三类天麻。天麻蒴果选择时应注意无病虫害，大小均匀、饱满度和成熟度一致的蒴果。5．1．3蜜环菌三级固体种的制备于2012年12月制备实验蜜环菌的液体菌种，具体实验方法见第二章。2013年1月将蜜环菌液体种接入三级种培养基培养。三级种培养基为袋装的固体培养基，制备时将阔叶树锯木屑4份、玉米粉1份、麦麸1份、白糖1份混合均匀后，加水9份拌匀后装袋高压灭菌24,时(袋为17cmx33cm的聚丙烯菌包袋)。蜜环菌三级固体种培养时，第一周在18"C恒温下避免杂菌感染，以后应控温25。C，约30d一60d即能长满袋。3与 西南大学硕士学位论文5．174蜜环菌、萌发菌与天麻蒴果的有性栽培(1)选地本实验选择在贵州省现代中药材研究所的种植基地，该地海拔约为1000m，年平均气温15．4℃左右，最高气温在每年的7月，最低气温在每年的1月。年平均降雨量1157．6毫米，年平均相对湿度81％。全年无霜期280天，日照时数为1400tJx时。试验在针叶林间空地，东西走向的5、10。缓坡种植。(2)培植固定菌床2013年3月清理场地上过密的杂树、杂草后，直接挖坑培植固定菌床，坑深20cm，长边顺坡0．8m，宽0．7m。先在坑底放一薄层湿润的木屑河沙混合物(比例1：1)，木屑河沙混合物上顺坑长放约18斤青杠树大材(长20cm，直径7一lOcm)，大材之间顺坑宽摆放约7斤青杠树小材(长lOcm，直径2—4cm)，然后将1包约1．5斤的蜜环菌三级固体种掰成核桃大小，菌块放置于大小菌材的接口处(图5—1)，做完后覆湿润的木屑河沙混合物回填至菌材似露非露。再依同样方法摆放一层菌材和菌种，然后用湿润的木屑河沙混合物填实固定菌床。最后盖上一层编织袋，覆lOcm厚的湿润砂土，做成龟背形并盖上枯枝落叶或杂草。(3)萌发菌与天麻种子拌菌2013年6月，以每坑固定菌床为一个单位取2包萌发菌掰成蚕豆大小，将16个天麻蒴果种子均匀洒在菌块上并拌匀，然后装入塑料袋(注意透气)，20"C恒温放至菌块转白，即可播种’嘲。(4)播种与日间管理揭开固定菌床的编织袋，取出上层菌材，露出下层菌材。按间隔5cⅢ贴近蜜环菌摆放转白拌种萌发菌块一个，均匀摆完后放一薄层树叶，回填2"--3cm厚的木屑河沙混合物；同样方法栽第二层，再将原编织袋回位即可。夏天要覆盖物或搭阴棚，将土层温度控制在26"C以下，不超过28"C。秋季控水抑菌，土壤含水量50％左右，手握稍成团，再轻捏能散。冬季控制土壤含水量30％左右，干爽松散。6个月后收获，统计产量，产量以白麻的重量表示，数据采用软件spss20．0进行统计分析。对于红、乌、绿三种天麻，每个供试菌株各作为1个处理，一个处理5个重复，完全随机区组设计。 促进天麻生长的优良蜜环菌筛选大材l固定菌床示意图r1--．．．．．．---—-—---------．．．．．．_—--------------—-—----—J图5-1固定菌床摆放示意图·Fig．5-1thesketchmapofplanting5．2结果与分析5．2．1不同菌株间红天麻产量统计与分析6个月后揭开固定菌床覆盖的编织袋收获各天麻的白麻，每个固定菌床记为一个重复，视有效种植面积1m2。不同菌株问各天麻的产量有明显差异(表5—2)。在红天麻的收获中，以菌株DJl拌栽的红天麻产量最高，显著性地大于其它菌株的产量，为1473．39／mz；菌株HZ2最低，为51．79／m2；其余依次是CK>菌株LS3>菌株SB4>菌株KY5>菌株SYI>菌株KY4。其中cK和菌株LS3的红天麻产量产量之间没有显著性差异：菌株SB4、菌株KY5、菌株SYl、菌株KY4、菌株HZ2之间也无显著性差异。菌株DJl、LS3对红天麻的促进作用明显，尤其是菌株DJl。 西南大学硕士学位论文表5-2天麻产量统计Tab．5—2Theyieldstatisticsofgastrodiaelata注：字母表示0．05水平的显著性Note：DifferentlettersmeansignificantdifferenceatO．05level5．2．2不同菌株间乌天麻产量统计与分析同一菌株拌栽天麻时，乌天麻产量要明显低于红天麻和绿天麻(表5—2)，这可能与乌天麻本身增殖系数低有关。不同菌株拌栽乌天麻时，菌株DJl拌栽天麻产量最高，为484．79／m2；菌株KY4最低，为28．79／m2；其余依次是菌株SB4>CK>菌株KYS>菌株HZ2)菌株LS3>菌株SYl。其中菌株D51、SB4、CK的乌天麻产量产量之间没有显著性差异；菌株KY5、菌株HZ2、菌株LS3、菌株SYl、菌株KY4之间也无显著性差异。菌株DJl、SB4对红天麻的促进作用明显，菌株DJl仍是最优良菌株。5．2．3不同菌株间绿天麻产量统计与分析各菌株关于绿天麻的拌栽情况与在红天麻类似(表5-2)。菌株DJl拌栽绿天麻产量最高，显著性地大于其它菌株的产量，为1706．79／m2；菌株KY4最低，为27．19／m2；其余依次是CK>菌株LS3>菌株SB4>菌株KY5>菌株SYI>菌株HZ2。其中CK和菌株LS3的红天麻产量产量之间没有显著性差异；菌株SB4、菌株KY5、菌株SYI、菌株HZ2、菌株KY4之间也无显著性差异。菌株DJl、LS3对绿天麻的促进作用较明显，菌株DJl的绿天麻产量将接近是对照菌株的2倍。 促进天麻生长的优良蜜环菌筛选：’_■r『7⋯一．、吖．弋‘!’：：≯．、毋_，t-．●r．．■■■1o冬、．、)FtFI、’．。图5—25个月后拌栽菌株DJl的天麻生长情况A、B、c分别是红天麻、乌天麻、绿天麻Fig．5—2thegrowthsituationofgastrodiaelatawhichgrowwimstainDJIforfivemonths．A．BandCarerespectivelyG．elataBI．fielata，G．elataBI．f．glaucaS．Chow，G．elataBI．f．viridisMazk．5．2．3不同蜜环菌生物种对天麻生长的影响从实验菌株的生物种分子鉴定来看，HZ2_；}HSB4为Armillariacepistipes，DJl和LS3是Armillariagallica，KY4、KY5、SYl与Armiliariamellea的亲缘关系较近。但在各天麻的拌栽实验中，属于Armillariagallica的DJl对三种天麻均有较强的促进作用，LS3也能明显地促进红天麻和绿天麻的生长；属于Armillariacepistipes的菌株只有SB4能勉强促进乌麻的生长；而与Armillariamellea亲缘关系较近的3株菌株基本不能促进天麻生长。总的说来Armillariagallica与天麻共生关系最好的，ArmillariacepistipPs次之，Armillariamellea最差；这也与日本学者的研究结果一致。但是不同的Armillariagallica菌株对于不同天麻的生长促进作用也有差异，筛选栽培天麻的优良蜜环应把方向框定在Armillariagallica中，但也不能忽略特异的Armillariacepistipes菌株。 西南大学硕士学位论文 优良蜜环菌发酵液胞外酶研究第六章优良蜜环菌发酵液胞外酶研究6．1材料与仪器6．1．1材料主要试剂与仪器：木聚糖(Aladdin)；丁香醛连氮(Sigma—A]drich)；羧甲基纤维素钠(科龙化工)；木糖(北京鼎国)；DNS试剂；培养箱(天津泰斯特)；无菌匀质器(SCIENTZ)；恒温摇床(ThermoFisherMax484P)；恒温水浴锅XMTD一204(上海梅香仪器有限公司)；离心机(ThermoFisherFresc021)；紫外分光光度计(尤尼科4802)。6．1．2培养基固体培养基成分为蛋白胨29，硫酸镁0．59，葡萄糖209，琼ns79，KH。PO。0．469，K2HPO。lg，水1000mL，ptt自然；液体培养基成分为葡萄糖469，无水乙醇249，酵母膏59，蛋白胨139，硫酸镁29，磷酸二氢钾ig，VBIO．Olg，VB20．039，水1000mL，pH自然。其中维生素是在培养基灭菌后(121℃、30min)冷却至40—50。C时加入。6．1．3供试菌株供试菌株为贵州省现代中药材研究所重点实验室分离保存的蜜环菌，详细信息见表6—1。表6—1蜜环菌参试菌株亿出．6．1Theinformationof7Arrnillariastrians 西南大学硕士学位论文6．2方法6．2．1标准曲线的制备按董国强、张捷的方法以不同浓度的木糖溶液、葡萄糖溶液与DNS试剂反应，在530nm处测0D值、制作木糖、葡萄糖标准曲线∞6J67|。6．2．2液体菌种的制备将各蜜环菌母种接入含固体培养基的平皿中，22℃暗培养15天后，切取0．5cm长的菌索尖端3段转接入含有150mL液体培养基的容积为250mL的三角瓶。然后180r／min、22。C暗培养至菌丝球长满三角瓶(约15天)即为一级液体菌种。取一级液体菌种一瓶于无菌匀质器中，每秒9次拍击，匀浆8分钟后吸取3mL转接入含有150mL液体培养基的容积为250mL的三角瓶。然后180r／min、22。C暗培养至菌丝球长满三角瓶(约7天)即为二级液体菌种。6．2．3粗酶液的制备在二级液体菌种摇瓶培养过程中，每天定时吸取2mL发酵液作为粗酶液。6．2．4木聚糖酶酶活性测定往具塞刻度试管中加入1％的木聚糖溶液(用pH4．8，0．05M柠檬酸盐缓冲液配制)1．5mL，加稀释5倍的粗酶液lmL混匀，50。C水浴准确保温30min，取出后立即加入DNS试剂1．5mL，具塞摇匀立即煮沸lOmin，取出，冷却后加入蒸馏水补足25mL，轻轻上下摇匀，用4802型分光光度计测530nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复鼻引。6．2．5CMC酶活性测定往具塞刻度试管中加入0．5％的羧甲基纤维素钠溶液(用pH4．6，0．1M醋酸盐缓冲液配制)1．5mL，加稀释5倍的粗酶液0．5mL混匀，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入DNS试剂1．5mL，具塞摇匀立即煮沸lOmin，取出，冷却后加入蒸馏水补足20mL，轻轻上下摇匀，用4802型分光光度计澳lJ530nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复∞9’70|。6．2．6漆酶酶活性测定取0．5mmol／L丁香醛连氮100uL放入2mL离心管，加入酶液50uL和1．5mLpH6．0的0．1M磷酸盐缓冲液混匀，25％恒温水浴5min后立即冰浴终止反应，用4802型分光光度计狈JJ525nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。4⋯。6．2．7酶活力计算在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或是转化底物中1微摩尔相关基团所需的酶量，称为一个国际单位(u)。酶活性以燎示，单位为酶活性单位每升(U／L)。木聚糖酶、CMC酶活性按式(1)计算，漆酶活性按式(2)计算n“：42 优良蜜环菌发酵液胞外酶研究晦南×n(式1)碍×话XTOD(式2)式(1)、式(2)中：m是根据标准曲线方程计算测得0D值对应的葡糖糖或木糖的质量，单位为微克；M是葡萄糖或木糖的摩尔质量；V酶是反应添加的酶液体积，单位是升：V总为反应总体积，单位是升；t是酶反应时间，单位为分钟；n为酶液稀释倍数：￡是丁香醛连氮的摩尔消光系数，65000L·(mol·cm)-1；OO为漆酶吸光度。6．3结果与分析6．3．1标准曲线DNS法测定的葡萄糖标准曲线为y=O．0047x+0．0093R2=0．9997(葡萄糖浓度ug／mL)。DNS法测定的木糖标准曲线为y=O．0012x+0．0034R2=o．9996(木糖浓度ug／mL)。图6-1各菌株的发酵终点A、D、E、F、G是菌株HZ2、LS3、KY4、KY5、SYl第7天的发酵情况；B是菌株SB4第8天的发酵情况；C、H是菌株DJl第6天、第4天的发酵情况。Fig．6-1TheendpointoffermentationaboutArmillarilla．A，D，E，F，G：strainHZ2，LS3，KY4，KY5，SYlontheseventhdayoffermentation．B：strainSB4ontheei【ghthdayoffermentation．C，H：strainDJ1onthesixthdayandthefourthdayoffermentation．6．3．2木聚糖酶活性依据各菌株的发酵情况确定的发酵终点中(图6—1)，除菌株SB4、DJl在第8天、第6天结束发酵，其余均为第七天。发酵过程中，各菌株的木聚糖酶活性均是先升高再下降，且发酵终点的酶活性远大于发酵第一天的酶活(图6-2)。各菌株的木聚糖酶活性除菌株SB4是在第5天达到最大值外，其余菌株均是第4天。各菌株的木聚糖酶活性最大值满足正态分布，可进行菌株间两两比较。其中菌株SYl的木聚糖酶活性最高，其次HZ2，二者 西南大学硕士学位论文间没有显著性差异。紧随其后的依次是菌株LS3、KY4、SB4、KY5、DJl，其中LS3与KY4、SB4与KY5没有显著性差异，其余菌株间均有显著性差异。、．1．1‘]一’一3h’’h鼍彝时■，d图6-2各菌株发酵过程中木聚糖酶活性均值变化曲线Fig．6-2IntheprocessofAxmillarillafermentation．Thecurverepresentthechangeruleofthemeanofxylanaseactivity．注：字母表示0．05水平的显著性Note：Differentlettersmeansignificantdifferenceat0．05level．6。3．3cMc酶活性发酵中，各菌株的CMC酶活性均是先升后降，发酵终点的酶活性除菌株DJl、sYl；,l-，其余均远低于发酵第一天的酶活性(图6-3)。各菌株中SB4、DJl、HZ2的木聚糖酶活性是在第3天达到最大值外，其余菌株均是第4天。各菌株的CMC酶活性最大值满足正态分布，可进行菌株间两两比较。其中菌株LS3的CMC酶活性最高，其次是SB4，二者间没有显著性差异。紧随其后的依次是菌株DJl、SYl、KY5、HZ2、KY4，其中DJl、SYl、KY5、HZ2两两之间没有显著性差异，其余菌株间均有显著性差异。 优良蜜环菌发酵液胞外酶研究．：：：：：：一o：!一～’一＼．．1．一一．_一二j二培彝时■，d图6—3各菌株发酵过程中CMC酶活性均值变化曲线Fig．6-3IntheprocessofArmillarillafermentation．Thecurverepresentthechangeruleofthemeanofcarboxymethylcelluloseenzymeactivity．注：字母表示0．05水平的显著性Nore：Differentlettersmeansignificantdifferenceat0．05level．6．3．4漆酶活性发酵时，各菌株的漆酶活性也是先升高再下降，且发酵终点的酶活性大于发酵第一天的酶活(图6—4)。各菌株中DJl的漆酶活性在3天达到最大，LS3是第5天，其余均是第4天。各菌株的漆酶活性最大值满足正态分布，可进行菌株间两两比较。其中菌株KY4的漆酶活性最高。紧随其后的依次是菌株SYl、KY5、DJl、LS3、SB4、HZ2，其中SYl、KY5、DJl；KY5、DJl、LS3；LS3、SB4、HZ2两两之间没有显著性差异，其余菌株间均有显著性差异。6．3．53种胞外酶之间酶活比较与分析液体摇瓶过程中，不同蜜环菌的木聚糖酶、CMC酶、漆酶的酶活最大值基本出现在第4天，但最大酶活值与蜜环菌的生长速度基本没有相关性。菌株DJl生长速度最快，4天就能结束发酵。但在不同蜜环菌的木聚糖酶活最大值中，菌株DJl的最低；CMC酶活最大值中，菌株DJl排第三，并与SYl、KY5、HZ2均没有显著差异。菌株SB4生长速度最慢，需要8天多才能结束发酵，但是其各酶活的最大值在不同45 西南大学硕士学位论文菌株中并不是最低的，有的甚至和最高菌株没有显著差异。蜜环菌的生长速度与最大酶活的持续时间相关，持续时间长的菌株生长快，如菌株DJl。其次，蜜环菌的生长速度可能与其自身细胞膜通透性、主动运输能量供应相关。口1■●■，I一口"∞a，■■簟■时■，．图6-4各菌株发酵过程中漆酶活性均值变化曲线Fig．6-4IntheprocessofAxmillarillafermentation．Thecurverepresentthechangeruleofthemeanoflaccaseactivity．注：字母表示0．05水平的显著性Note：Differentlettersmeansignificantdifferenceat0．05level．从三种酶的变化规律来看，蜜环菌液体发酵时最早分泌的是CMC酶、漆酶，然后是木聚糖酶，但是木聚糖酶后来居上能短时超过前面两种酶。这估计与蜜环菌的自身属性有关，作为一种木腐菌，它的第一营养物质可能是木质素或是纤维素，其次是半纤维素。液体发酵中，蜜环菌首先分泌的是与木质素、纤维素相关的胞外酶，当发酵环境中不存在木质素、纤维素时，它再分泌降解半纤维素的相关酶，并迅速适应环境提高酶分泌量。 优良蜜环菌的栽培种培养基筛选第七章优良蜜环菌的栽培种培养基筛选7．1材料与仪器7．1．1供试菌株实验蜜环菌DJl为贵州省现代中药材研究所提供。7．1．2主要试剂与仪器木聚糖(Aladdin)；丁香醛连氮(Sigma—Aldrich)；羧甲基纤维素钠(科龙化工)；木糖(北京鼎国)；DNS试剂；培养箱(天津泰斯特)；无菌匀质器(SCIENTZ)；恒温摇床(ThermoFisherMax484P)；恒温水浴锅xMTD一204(上海梅香仪器有限公司)；离心机(ThermoFisherFresc021)；紫外分光光度计(尤尼科4802)。7．1．3培养基固体培养基成分为蛋白胨29，硫酸镁0．59，葡萄糖209，琼脂79，KH：PO。0．469，KzHPO。lg，水1000mL，pH自然；液体培养基成分为葡萄糖469，无水乙醇249，酵母膏59，蛋白胨139，硫酸镁29，磷酸二氢钾lg，VBl0．Olg，VB20．039，水1000mL，pH自然。其中维生素是在培养基灭菌后(121℃、30min)冷却至40—50。C时加入。本实验采用了8种不同的栽培种培养基，培养基见表7-1。表7—18种栽培种培养基T，出．7．1The8kindsofculturemedium47舯吣一_≈_o≈_≈_肼。一oo黼㈨唧一。。一一一m加加加加㈣一一""¨"玎"羞M一∞砌一粮‰重J。加加∞们册∞阳黼∞一一伯∞∞∞∞加∞。褪抽一。。。。。，。垮m一 西南大学硕士学位论文7．2方法7．2．1栽培种培养基制备按培养基配方将每种培养基的固形物称好混匀，再按对应比例加水混匀后装入规格为30mm×200m的玻璃试管中。装管时注意填实，装满时培养基与橡胶塞问距lcm，此时培养基重约709。培养基经121摄氏度灭菌1h即可使用。7．2．2菌种制备将DJl的母种接入含固体培养基的平皿中，22。。C暗培养15天后，切取0．5am长的菌索尖端3段转接入含有150mL液体培养基的容积为250mL三角瓶。然后180r／min、22℃暗培养至菌丝球长满三角瓶(约10天)即为一级液体菌种。取一级液体菌种一瓶至于无菌匀质器中，每秒9次拍击匀浆8分钟后吸取3mL转接入含有150mL液体培养基的容积为250mL三角瓶。然后180r／min、22。C暗培养至菌丝球长满三角瓶(约4天)即为二级液体菌种。将3mL二级液体种接到各种栽培种培养基中，22。C恒温培养即可(注意开始一周竖直摆放)。7．2．3生长速度的测定培养20天和40天时，测定DJl在各培养基中菌丝或菌素的生长速度，每种培养基为一个处理，一个处理3个重复，数据采用软件spss20．0进行统计分析。7．2．4粗酶液的制备在栽培种中，从菌丝或菌索生长底端向上取lOg蜜环菌一培养基混合物后加水至50mL，25摄氏度浸提4h，10000r／min离心5min，吸取上层清液即可=72。。7．2．5标准曲线制备按董国强、张捷的方法以不同浓度的木糖溶液、葡萄糖溶液与DNS试剂反应，在530nm处测OD值、制作木糖、葡萄糖标准曲线。7．2．6木聚糖酶酶活性测定往具塞刻度试管中加入1％的木聚糖溶液(用pH4．8，0．05M柠檬酸盐缓冲液配制)1．5mL，加粗酶液imL混匀，50。C水浴准确保温30min，取出后立即加入DNS试剂1．5mL，具塞摇匀立即煮沸lOmin，取出，冷却后加入蒸馏水补足25mL，轻轻上下摇匀，用4802型分光光度计测530nm处的oD值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。7．2．7GMG酶活性测定4R 优良蜜环菌的栽培种培养基筛选往具塞刻度试管中加入0．5％的羧甲基纤维素钠溶液(用pH4．6，0．1M醋酸盐缓冲液配制)1．5mL，加粗酶液0．5mL混匀，50℃水浴准确保温30min，取出后立即加入DNS试剂1．5mL，具塞摇匀立即煮沸lOmin，取出，冷却后加入蒸馏水补足20mL，轻轻上下摇匀，用4802型分光光度计测530nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。7．2．8漆酶酶活性测定取0．5mmol／L丁香醛连氮100uL放入2EL离心管，加入粗酶液200uL和1．5raLpH6．ongo．1M磷酸盐缓冲液混匀，25。C恒温水浴5min后立即冰浴终止反应，用4802型分光光度计澳lJ525nm处的0D值。以煮沸灭活的酶液为对照，每组3个重复。7．2．9酶活力的计算在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或是转化底物中l微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个酶活单位(u)。酶活性以。辕示，单位为酶活性单位每升(U／L)。木聚糖酶、CMC酶活性按式(1)计算，漆酶活性按式(2)计算：彳靠誊×n(式1)群×瓷X下OD(式2)式(1)、式(2)中：m是根据标准曲线方程计算测得0D值对应的葡糖糖或木糖的质量，单位为微克：M是葡萄糖或木糖的摩尔质量；Vi是反应添加的酶液体积，单位是升；V总为反应总体积，单位是升：t是酶反应时间，单位为分钟；n9酶液稀释倍数；e是丁香醛连氮的摩尔消光系数，65000L·(mol·cm)一1；OD为漆酶吸光度。7．3结果与分析7．3．1标准曲线DNS法测定的葡萄糖标准曲线为y=O．0046x+0．0085R2；0．9995(葡萄糖浓度ug／mL)。DNS法测定的木糖标准曲线为y=O．0013x+O．0029R2=0．9996(木糖浓度ug／mL)。7．3．2不同培养基对DJl生长速度的影响蜜环菌DJl在8种培养基中均能生长(图7—1)，但是生长速度不同，且存在显著性差异(表7—2)。第20天时，菌株DJl在各培养基中的生长速度依次是培养基一>培养基六>培养基三>培养基二>培养基四>培养基八>培养基七>培养基五；菌株DJl在培养基一中的生长速度最快，但是与培养基六之间没显著性差异；培 西南大学硕士学位论文养基四、五、七、八最差，且之间没有显著型差异。第40天时，菌株DJl在培养基一中生长速度依旧最大，且与其他培养基有显著性差异；培养基五仍是最小，并明显著性小于其它培养基。表7-2DJl的生长速度Tab．7-2TherateofgrowthaboutstrainDJ1培养基生长速度。。吖茅2。天d2鼍著性差异。。％，培养基生长速度(cⅢ／d)第4。天显d著40性差异(5％)mediumrateofgrowthsignificantdifferencerateofgrowthsignificantdifference10．33A10．42A2O．29BC20．41B3O．30BC30．4lB40．27CD40．39C50．24D50．36D6O．31AB60．41B70．26CD70．40B80．27CD80．40BC注：字母表示0．05水平的显著性Note：Differentlett豇smeansignificantdifferenceatO．05level．图7-1第40天时DJl在不同培养基的生长情况Fig．7-1ThegrowthsituationofstrainDJ1，onthe40thday． 优良蜜环菌的栽培种培养基筛选7．3．3不同培养基中蜜环菌DJl的CMC酶活性利用8种栽培种培养基培养蜜环菌，分别隔20天测一次其胞外酶活性，表7—3记录了不同培养基中蜜环菌DJl分泌的3种胞外酶活性。不同培养基中，蜜环菌DJl的CMC酶活性在前后两次测定时呈下降趋势，第一次测定时各培养基之间无显著差异。第二次时存在显著差异，培养基三的CMC酶活性最大为530．29(tJ／L)，但与培养基八、培养基一、培养基六、培养基四之间没有显著性差异；培养基二、培养基七、培养基五最小且之间也无显著性差异。CMC酶活性大小依次是培养基三>培养基八>培养基一>培养基六>培养基四>培养基二>培养基七>培养基五。7．3．4不同培养基中蜜环菌OJl的木聚糖酶活性前后测定蜜环菌DJ的木聚糖酶活时，除培养基三、培养基四和培养基五的木聚糖酶活性上升外，其它培养基的酶活性呈下降趋势，且两次测定中不同培养基间存在显著差异，均是最大值极显著，其余值无显著差异(表7—3)。第一次酶活性大小依次是培养基一>培养基六>培养基八>培养基五>培养基四>培养基七>培养基二>培养基三，培养基一远大与其它培养基，活性为7438．92(U／L)；培养基三酶活性最小，为155．88(U／L)。第二次酶活性大小依次是培养基五>培养基三>培养基四>培养基八>培养基六>培养基一>培养基二>培养基七；培养基五酶活性最大，为3900．01(U／L)；培养基七最小，为371．13(U／L)。7．3．5不同培养基中蜜环菌D01的漆酶活性漆酶在木质素降解中起重要作用，但是不同培养基中蜜环菌DJ的漆酶活性无显著性差异，且前后两次测定时呈上升趋势(表7—3)。第一次测定时，培养基五的漆酶活性最高，为22．67(U／L)；其它培养基的漆酶活性大小依次为培养基二>培养基一>培养基六>培养基八>培养基七>培养基四>培养基三。第二次测定时，培养基三最大，为35．62(U／L)，其它培养基的漆酶活性大小依次是培养基四>培养基二>培养基八>培养基一>培养基六>培养基五>培养基七，最小的是培养基七，为22．15(U／L)。 西南大学硕士学位论文表7—3不同培养基中蜜环菌DJl的胞外酶活性Tab．7—3TheextracellularenzymeactivityofstrainDJI注：字母表列i0．05水平的显著性Note：Differentlettersmeansignificantdifferenceat0．05level．7．3．6不同培养基对蜜环菌DJl的胞外酶和生长的影响蜜环菌DJl在8种培养基上均能生长，但是菌株生长势却存在差异。由图7—1可以看出，随着棉籽壳含量的增加，菌株越易在试管口形成红棕色的成熟菌索，尤其是培养基七和培养基八，而不含棉籽壳的培养基一则基本没有红棕色的菌索。由实验数据可知，培养基成分确定菌株胞外酶活性，胞外酶决定菌株的生长速度。培养基成分不同，DJl分泌的胞外酶活性也不一样。如在第20天时，CMC酶活性基本与培养基中纤维素含量相关，纤维素含量多的CMC酶活性也大；漆酶活性与培养基中木质素含量有关，木质素含量较多的漆酶活性往往较大。蜜环菌的生长速度与胞外酶活性有紧密的联系，第20天时，DJl在培养基一中的生长速度最大，其分泌的木聚糖酶、漆酶的活性也较大，尤其是木聚糖酶活性，而CMC酶偏小；这样DJl对于木屑的利用率就大，生长速度也大。同一培养基中各酶活性有较明显差异，木聚糖酶活性单位是千位级、CMC酶是百位级、漆酶是十位级。蜜环菌DJl的生长可能由胞外酶共同决定的，各酶在分解吸收营养物质是相互协同的。 讨论第八章讨论8．1野生蜜环菌的分离材料一般为菌索、子实体、含菌索的天麻块茎，但是后两者一般较难获得。通过菌索分离蜜环菌是一种简单、易行的分离方法。本实验中采用75％酒精、青霉素、庆大霉素对菌索进行表面消毒分离，实验操作简单、杂菌少、分离成功率较高、不限菌索幼嫩程度，但是消毒时间是关键，不易掌握。张玉方(1995)从新鲜幼嫩菌索着手提出了蜜环菌的简便分离方法。该法操作简单、免表面消毒、成功率高，但是野外往往不易采集到新鲜幼嫩菌索。王传华等(2005)年优化了菌索的分离方法，他们通过培养含有生长良好蜜环菌的木本植物死亡组织(尚未完全腐烂)来获得新生菌索，再利用优化的玉米粉培养基进行免消毒分离。这种方法大大提高了分离的成功率，但步骤繁琐、周期长。8．2蜜环菌幼嫩菌丝、菌索容易老化形成浅褐色的菌丝或红棕色菌索，在做平皿形态观察时，对于菌丝、菌索的颜色判断应该限定在一定的时间内。同时菌索形态在平皿中多变，在设计实验时，应尽量采用营养不丰富的标准微生物培养基，平皿直径、培养基厚度等都应确定。另外接种培养时应保持菌龄、培养条件一致。在形态分类时，一些质量性状如菌丝稠密度、荧光强度等应该慎用。虽然可以对它们赋值做聚类分析，但是客观因素过多。尤其是蜜环菌的荧光强度与环境的关系十分密切。8．3蜜环菌在rDNA—ITS、rDNA-IGS、Tefl-a序列上的多样性依次递增可能与这三种序列自身特性有关。rDNA—ITS作为内部转录间隔区是中高度保守序列，多应用在鉴定真菌种属中，其多样性必然不会高。rDNA—IGS虽然是非转录的基因间隔区，但其参与转录前的调控，其保守度应低于rDNA—ITS。Tefl—a作为管家基因，需要翻译蛋白且受环境选择压力较大，相比之下多样性最高。但在加留j，』a，妇gallica、ArmillariacepistipeS菌株间两两比较及系统发育分析时，rDNA—ITS、rDNA—IGS均无明显区分效果。这可能与Armillariagallica、ArmillariacepistipOS不论在子实体、菌索形态、生境都极为相似有关。同时本实验蜜环菌Tefl—a的差异大，是在基因没有翻译的情况下比对并构建进化树的。下一步探索蜜环菌问Tefl—a的多样性时，应对Tefl—a进行全基因扩增，分别进行Tefl—a基因和Tefl—a翻译产物比对后再做系统发育分析。至于部分实验菌株在rDNA—ITS、rDNA—IGS、Tefl—a序列间两两比较、系统发育分析的差异性则可通过三者联合的多基因分析进行下一步更深入的研究。8．4本实验虽然在实际生产中比较了各菌株对不同天麻的促进作用，实际价53 西南大学硕士学位论文值较高。但是不同生境的适应性、菌材利用率、菌株退化等都是优良蜜环菌应该考虑的。下一步可考虑让优良菌株DJl在不同地方进行天麻有性栽培的区域试验，探索菌株DJl的菌材利用率，诱导菌株DJl的子实体来解决菌种退化问题。8．5本研究的发酵过程中，不同蜜环菌的木聚糖酶、CMC酶、漆酶的酶活大小在同一时期存在明显差异，木聚糖酶是万位级、CMC酶是千位级、漆酶是十位级。漆酶活性小可能与发酵液的成分有关，发酵液中基本不含木质素，只有葡萄糖和蛋白类物质，不能有效的促进漆酶的分泌。其次漆酶活性小也可能与自身特性有关，作为一种氧化酶，测定酶活终止时间尤为重要。本实验中检测漆酶活性的中间产物是醌类物质，它们容易在短时间内氧化还原为其他物质，这将导致实验数据偏小。测定漆酶时可以考虑稳定的反应底物如ABTS，并优化反应终止时间。另外，蜜环菌分泌的酶远不止这三种，要弄清不同酶之间以及酶活与蜜环菌生长速度的关系应该增加淀粉酶类、蛋白酶类、氧化酶类等的测定。8．6优良蜜环菌DJl的栽培种培养基筛选时，增添了胞外酶活的测定，这能很好地解释生长速度的差异。但是测定的酶类偏少，不能完全说明问题，可以考虑增加其它酶类。同时测定酶活的时间间隔应该细化，因为蜜环菌生长到后期会老化，形成了对环境适应能力强的红褐色菌索，这会影响酶活性测定。 结论第九章结论9．1蜜环菌菌索的有效分离培养基为蛋白胨2g，硫酸镁0．5g，葡萄糖20g，琼脂7g，磷酸二氢钾0．46g，磷酸氢二钾lg，青霉素10万单位，庆大霉素20万单位，水1000mL，pH自然。其中抗生素是在培养基灭菌后(12l℃、30min)冷却至40一50℃时加入。75％酒精中浸泡消毒时，幼嫩菌索1min、老化菌索约2min为佳。9．2贵州天麻主产区的蜜环菌在PDA培养基上形态多样，依据形态特征和生长势大致可划分为9个形态群。同时shannon多样性指数表明贵州天麻主产区的蜜环菌形态多样、菌群分布均匀，其中形态群Ⅵ占绝对优势，其次是形态群Ⅷ。9．3生物种分子鉴定时，贵州天麻主产区的蜜环菌基本为爿瑚j，Ja，而gallica、Armillariamellea、ArmiHariacopistipOS，其中Armillariagallica居多，且多分布在海拔1500m左右的地区。蜜环菌在rDNA-ITS、rDNA—IGS、Tefl—a序列上的多样性依次递增，不论是序列间的两两比较还是系统发育分析，rDNA—ITS都不能很好地区分开爿删j_，_，a，而gallicac和ArmiljariacepistipeS，但能将它们与Armillariamellea明显分开。rDNA—IGS的情况与rDNA—ITS类似，但rDNA—IGS在Armillariagallica、彳埘j』_，打妇cepistipes菌株间的差异性要大于rDNA-ITS。Tefl—a在蜜环菌中差异显著，遗传多样性极丰富。它不仅能区分Armillariamellea、／4埘j-』a，jagallica、ArmillariacepistipPs，甚至能区分同种属的菌株。9．4筛选促进天麻生长的优良蜜环菌时，属于Armillariagallica的菌株DJl对三种天麻都有很好的促进作用，而与彳彻j_，』a订amellea关系较近的菌株基本不能促进天麻生长。菌株DJ与三种天麻有性栽培半年后，红天麻产量为1473．39／m2、乌麻产量为484．79／m2、绿天麻产量为1706．79／m2，均显著性地大于对照和其它菌株。9．5液体发酵时，各菌株胞外酶活性变化趋势均是先升后降；各酶在不同菌株间达到最大酶活的时间、最大酶活持续时间、最大酶活性值存在明显差异；优良菌株DJl生长最快，4天就能结束发酵，达到最大酶活时间最短、持续时间也长。9．6优良蜜环菌DJl在栽培种培养基一的生长速度最快为0．42cm／d，显著性地大于其它培养基中的生长速度。此外，栽培种培养基含木屑越多，菌株DJl活力就越好，越不易形成老化的红褐色菌索。蜜环菌的生长速度与胞外酶活性有紧密的联系，培养基成分确定菌株胞外酶活性，胞外酶决定菌株的生长速度。 西南大学硕士学位论文 参考文献[1】CoetzeeMPA，W咄fieldBD，BloomerP，eta1．BiogeographyandpossibleoriginofArmillariaspecies[C]．BookofAbstractsofthe17mInternationalMycologicalCongressrIMC7)．Oslo11-17tb,August2002．pl12．[2]SchwarzeFWMR，BaumS，FinkS．ResistanceoffibreregionsinwoodofAcerpseudoplatanusdegradedbyArmillariamellea[J]．MycologicalResearch．2000，104(09)：1126．1132．[3】WargoPM，ShawCI．Armillariarootrot：thepuzzleisbeingsolved[J]．PlantDisease．1985．69(10)：826—832．[4]郭顺星，徐锦堂．蜜环菌的化学成分及应用研究[J】．微生物学通报．1996，23(4)：239—240．【5】郭顺星，徐锦堂．蜜环菌侵染猪苓菌核的细胞学研究【J】．JournalofIntegrativePlantBiology．1993(011：44—50．【6】兰进，李京淑．蜜环菌和天麻共生营养关系的放射性自显影研究【J】．真菌学报．1994，13(3)：219．222．17]孙立夫，张艳华，杨国亭，等．黑龙江省蜜环菌生物种的地理分布概况【J】．菌物学报．2007(01)：59．67．【8】邓艳芹．湖北西部天麻共生蜜环菌遗传多样性及协同进化[D】．中国科学院研究生院，2007：12—16．【9】吴兴亮，连宾，邹方伦．贵州蜜环菌资源及生态研究[J]贵州科学．2003，2l(3)：56．60．【10】VolkTJ，BurdsallJrHH．thestateoftaxonomyofthegenusArmillaria[J]．1993，11(1)：4-11，【1l】AndersonJB，UlllrichRC．BiologicalspeciesofArmillariamelleainNorthAmeriea[J]．Mycologia．1979(71)：402-414．【12】孙立夫，张艳华，杨国亭，等．蜜环菌生物种和地理分布概况综述【J】．菌物学报．2007(02)：306—315．【13】王岚，杨祝良．中国西南的蜜环菌属真菌[J】．中国食用菌．2003(05)：4-6．【14】赵俊，戴玉成，秦国夫，等．新的蜜环菌生物种[J】．菌物学报．2008(02)：156．170．【15】秦国夫．中国蜜环菌的遗传学与系统学研究[D】．中国林业科学研究院，2002：78．83．【16】AndersonJB，StasovsldE．MolecularPhylogenyofnorthernhemispherespeciesofArmillaria[J]．Mycologia．1992，84(4)：505-516．【17]ChillaliM，WipfD，GuillaurnmJJ，eta1．DelineationoftheEuroPeanArmillariaspeciesbasedonthesequencesoftheinternal仃anscribedspacer(ITS)ofribosomalDNA[J]．NewPhytologist．1998，138(1)：553．561．[18]CoetzeeMPA，WingfieldBD，HarringtonTC，eta1．GeographicaldiversityofArmillariamelleas．S．basedonphylogeneticanalysis[J]．Mycologia．2000，92(1)：105．113．[19]王汉臣．中国蜜环菌属系统学研究[D】．中国科学院沈阳应用生态研究所，2007：1．6．120]孙立夫，裴克全，张艳华，等．法国蜜环菌爿rmillariagallica菌株遗传多样性的ISSR分析[J】．菌物学报．201l(05)：686．694．[21]AntoninV，TomsovskyM，SedlakP，eta1．MorphologicalandmolecularcharacterizationoftheArmillariacepistipes—A．gallicacomplexintheCzechRepublicandslovakia[J]．MycologicalProgress．2009，8(3)：259·271．[22]MatsushitaN，FukudaK，NagasawaE，eta1．ArmillariaSpeciesinJapanIdentifiedbyIsozymePatternswithspecialReferencetotheBiologicalspeciesoftheNorthernHemisphere[J]．JournalofForestResearch．1996，3(1)：155．160． 西南大学硕士学位论文[23】MwenjeE，RideJ．MorphologicalandbiochemicalcharacterizationofArmillariaisolatesfromZimbabwe[J]．Plantpathology．1996(45)：1036-1051．[24】MwenjeE，RideJ．TheuseofpecticenzymesinthecharacterizationofArmillariaisolatesfromAfriea[J]．Plantpathology．1997(46)：341—354．[25】RobeneS，Lung·EscarmantB．LaccaseisoenzymepaaemsofEuropeanArmillariaspeciesfromculturefiltratesandinfectedwoodyplanttissues[J]．EuropeanJournalofForestPathology．1997，2(27)：105一114．[26】MillerJ，Jihnson0，BurdsallJ，eta1．spceiesdelimitationinNorthAmericanspceiesofArmillariaasmeasuredbyDNAreassociation[J]．MycologiealReseareh．1994，98(9)：1005-1011．[27】KorhonenK．ArmillariasinceEliasFries．Acta．Univ．Ups[J]．Symb．Bot．Ups．1995，3(30)：153—161．[28】周元．天麻生物学特性研究[D】．西北农林科技大学，2005：1-8．[29】周铉，陈心启．国产天麻属植物的整理[J]．云南植物研究．1983(04)：361—368．[30】袁崇文．中国天麻【M]．贵阳：贵州科技出版社，2002：1-254．[31】徐锦堂．天麻栽培学[M]．北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993：1-294．[32】王贺，王震宇，张福锁，等．天麻吸收蜜环菌营养机制的细胞学研究[J】ActaBotanicaSinica．1997(06)：500—504．[33】刘炳仁，于瑞兰，刘坤．天麻栽培与加工新技术[M】．北京：科学技术文献出版社，2003：1-156．[34】杨增明，胡忠．天麻球茎几丁质酶和13-l，3-葡聚糖酶的初步研究[J]_云南植物研究．1990(04)：421-426．[35】胡忠，黄清藻，刘小烛，等．天麻抗真菌蛋I刍GAFP-I的一级结构和cDNA克隆【J]．云南植物研究．1999(02)：3-10．[36】MalletK，ColoteloN．RhizomorphexudatesofArmillariamellea[J]．CanadianJournalofMicrobilogy．1984(30)：1247·1252．[37]RobeneS，Lung-EscarmantB．LaeeaseisoenzymepaRemsofEuropeanArmillariaspeciesfromculturefiltrates&infectedWOOdyplanttissues[J]．EuropeanJournalofForestPathology．1997，27(2)：105．114．[38】RehmanAU，ThurstonCF．PurificationoflaccaseIfromArmillriamellea[J]．JournalofGeneralMicrobiology．1992(138)：1251-1257．[39】CurirP，ThurstonCF．CharacterizationofalaccasesecretedbyArmillariamelleapathogenicforGenista[J]．PlantPhysiologyAndBiochemistry(Paris)．1997，35(2)：147-153．[40】吴涓，肖亚中，王怡平，等．蜜环菌胞外漆酶酶活力的分光光度法测定【J]厦门大学学报(自然科学版)．2001(04)：893．898．[41】李福后，王伟霞．5株蜜环菌产几种胞外酶活性比较[J]．淮海工学院学报(自然科学版)．2006(03)：58．61．[42】焦迎春，余梅，唐达．黄绿蜜环菌液体培养几种胞外酶的测定[J】_食用菌．2010(03)：6-7．[43]ChaY，IgarashiT．Armilladaspeciesassociated谢thGastrodiaelatainJapan[J]．EuropeanJournalofForestPathology．1995，6-7(25)：319—326．[44]KimH．SelectionofsuperiorstrainsofarmillariaspeciesforthecultivationofGastrodiaelata[J]．FRIJour"nalofForestScience．1997(56)：44—51．[45]戴玉成，秦国夫，徐梅卿．中国东北地区的立木腐朽菌[J]．林业科学研究．2000(01)：18—25．[46]SingerR．KeysfortheidentificationofthespeciesofAgaricalesI[J]．Sydowia．1978(30)：192—279．[47]王秋颖，郭顺星，关风斌．不同来源蜜环菌对天麻产量影响的研究[J]．中草药．2001(09)：74．76．[48]陈明义，李福后，边银丙．蜜环菌不同菌株对天麻产量的影响[J]．食用菌学报．2004(01)：46．48．58 [50]薛梅．一株“食麻”蜜环菌的生理生化研究[D】．中国协和医科大学，2004：1．6．[51]王晓玲，王晓多，刘安发，等．天麻共生密环菌生长情况的实验研究[J】．贵阳医学院学报．2005(04)：340—341．[52]孙士青，陈贯虹，邱维忠，等．乙型蜜环菌对不同品种天麻产量及天麻素含量的影响【J]山东科学．2004(02)：37—39．[531彭述敏，陈玉惠，雷然，等．蜜环菌培养条件的响应面分析优化【J】．西南大学学报(自然科学版)．2011，33(8)：68．73．[54】王传华，王义敏，暴朝霞，等．一种优化的蜜环菌分离与纯化方法[J】．武汉植物学研究．2005(05)478—481．【55]肖波，胡开治，刘杰，等．蜜环菌菌种分离新方法一天麻组织分离法+【J】．微生物学通报．2006，33(3)：118一121．[561刘景圣，郑明珠，蔡丹，等．长白山地区蜜环菌菌种的分离与筛选[J】．食品科学．2005，26(7)：82-85．f57]刘景圣．蜜环菌催眠功能优良菌株筛选和发酵工艺优化研究[D】．吉林农业大学，2005：19—30．158]黄宏文，王传华，李作洲，等．琼脂固体培养基培养蜜环菌菌素总DNA的提取[J]．武汉植物学研究．2007，25(4)：371—376．[59】陈昆松，李方，徐昌杰，等．改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取[J】．遗传．2004(04)：529．531．[60】冯健，范俊岗，金若忠，等．基于IGs序列的两株蜜环菌分子鉴定【J】’北方园艺．2012(03)：116．118．[61】ZhouMY，Gomez-SanchezCE．UniversalTAcloning．【J】．CurrIssuesMolBi01．2000，2(1)：1-7．[621ZhouMY，ClarkSE，Gomez—SanchezCE．UniversalcloningmethodbyTAstrategy．【J]-Bioteclmiques．1995，19(1)：34-35．[63】NishimuraN，TakaokaN，BabaY，eta1．DirectPCRdetectionoffood-bomebacteriafrommixedhumanfeces．[J1．KansenshogakuZasshi．2012，86(6)：741．748．[64】HallBG．BuildingPhylogeneticTreesfromMolecularDatawithMEGA．[J1．MolBiolEv01．2013．30(5)：1229-1235．[65】段金玉，梁汉兴．天麻种子的萌发率与种子成熟度的关系[J]．云南植物研究．1982(03)：303．306．[66】张捷，黄荣花，张书华．标准曲线法测定茯神中多糖的含量[J】．中国药业．2013(16)：15．16．[67】董国强，张孟白，林开江．半纤维素酶的DNS液显色法测定【J]．浙江农业科学．1989(02)：88—89．[68】回晶，赵文静，邹志远，等．金耳液体培养过程中几种胞外酶活性的变化规律[J】．食用菌学报．2007(03)：29—32．[69】段学辉，颜淑芳，高鹤．几株纤维素酶产生菌的分离鉴定及其产酶能力[J]．南昌大学学报(工科版)．2010(02)：134-139．[701余志坚，陈传红，赵晋宇．DNs法检测食用菌多糖含量条件优化研究[J】．江苏农业科学．2012(01)：259—260．[711林俊芳，刘志明，陈晓阳，等．真菌漆酶的酶活测定方法评价【J]．生物加工过程．2009(04)：1-8．[72】宋宏．榆耳新品种选育及营养生理特性研究[D】．吉林农业大学，2008：15．17． 西南大学硕士学位论文60 致谢本论文是在业师刘朝贵副教授、朱国胜研究员的悉心指导下完成的。导师给我最大的印象便是治学严谨、知识渊博、和蔼可亲。三年的研究生生涯，从论文选题、试验设计以及论文的撰写，直至最终付梓印刷，无不倾注了导师大量的心血和汗水。此外，导师在专业实践方面的谆谆教诲更使我受益匪浅。三年来，感谢导师在学习、生活以及找工作过程中给予的关心和帮助。在此即将毕业之际，谨向导师致以最衷心的感谢和最崇高的敬意!同时在研究生三年的学习生活中，我还要感谢桂阳副研究员、刘素君老师等。有了他们的指导和帮助，我才能顺利完成试验、完成论文。在此，向他们致以诚挚的谢意!在此还要衷心感谢答辩委员会的各位老师，感谢您们百忙之中抽出时间来审阅我的论文，为我指点迷津!感谢已走上工作岗位的陈仁玉、方琼、韦小庆、王延杰、沈知君、蓝家旺、朱允吴、陈韵等师兄师姐在我试验过程中给予的大力帮助和指导。感谢同窗好友赵金凤、连凯、王迎鑫、刘海、冉孝琴、李清风在实验和学习上给与的帮助。还要感谢杨梅、杨静、龚光禄、罗鸣、李秋月、尚光美、蔡霞、涂韦波等师弟妹们的帮助和关心。祝福大家生活幸福，工作顺利!最后，感谢我的家人和亲友!在将近二十年的求学生涯中，是他们的无私关爱给了我敢于拼搏的勇气。他们也是我强大的精神后盾，衷心地向他们表示感谢!谨以此文献给所有这些关心我、帮助我的老师、同学、朋友和亲人161 西南大学硕士学位论文 发表论文及参加课题一览表发表论文：1．黄万兵，桂阳，刘朝贵．贵州天麻主产区蜜环菌的分离及rDNA—ITS序列分析，西南师范大学学报(2014年6月见刊)．参加课题z贵州省农业科学院研究生创新基金项目：贵州天麻蜜环菌资源收集及天麻亲和性研究，黔农科合(创新基金)2011016号。贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目：贵州大方天麻适宜性蜜环菌分离提纯与应用，黔科合中药字[2011]5035号。贵州省农业科学院专项项目：贵州天麻伴生菌优良菌株选育，黔农科院专项[2012]020号。