GB-T 18932.8-2002 蜂蜜中红霉素残留量的测定方法 杯碟法 8页

ICS67.180.10X31中华人民共和国国家标准GB/T18932.8-2002蜂蜜中红霉素残留量的测定方法杯碟法Methodforthedeterminationoferythromycinresiduesinhoney-Cylinderplatemethod2002一12一30发布2003一06一01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 GB/T18932.8-2002前言GB/T18932-2002分为12个部分，本部分为第8部分。GB/T18932的本部分遵循GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分:化学分析方法》的编写规则。本部分的附录A是规范性附录，附录B和附录C是资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分由中华全国供销合作总社归口。本部分起草单位:中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局。本部分主要起草人:庞国芳、付宝莲、林忠。本部分系首次发布的国家标准。 GI3/T18932.8-2002蜂蜜中红霉素残留量的测定方法杯碟法范围GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中红霉素残留量的杯碟测定方法。本部分适用于各种蜂蜜中红霉素残留量的测定。本部分红霉素的方法检出限为。.05mg/kg,2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T6379-1986测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(negISO5725:1981)GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(neqISO3696:1987)原理试样中残留的红霉素经甲醇溶解后，在碱性条件下用三氯甲烷提取，提取液经浓缩并溶解后，利用杯碟法进行检测，并用红霉素标准曲线进行定量。试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682-1992中规定的三级水。4.1试荆4.1.1甲醇。4.1.2正己烷。4.1.3三氯甲烷。4.2试验菌种枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)。菌种号(ChinaMicrobialCultureCollection)CMCC(B)63501.4.3标准物质红霉素。923IU/mg或相当者。4.4工作溶液的配制4.4.1氢氧化钠溶液;1mol/L。称取40.Og氢氧化钠，溶解于水中并定容至1000mL.4.4.2磷酸氢二钠溶液:10g/L。称取10.0g磷酸氢二钠，溶解于水中并定容至1000mLo4.4.3磷酸盐缓冲溶液:pH8.0。称取16.73g无水磷酸氢二钾，0.53g无水磷酸二氢钾，溶解于水中并定容至1000mL1 GI3/T18932.8-20024.4.4生理盐水:8.5g/l.,称取8.5g氯化钠，溶解于1000ml一水中，121"C高压灭菌20min,4.5标准溶液的配制4.5.1红霉素标准储备溶液:准确称取(精确至。.1mg)适量的红霉素标准物质(4.3)，用甲醇(4.1.1)溶解并定容浓度为1OOOpg/mL(按效价换算)的标准储备溶液。4℃保存，贮存期限一周。4.5.2红霉素标准工作溶液:取标准储备溶液(4.5.1)用磷酸盐缓冲溶液(4.4.3)稀释，配制成浓度为0.05A10,0.20,0.40和0.80Ixg/ml的标准工作溶液。当天配制，当天使用。4.6培养基4.6.1培养基1:见第A.1章。4.6.2培养基2:见第A.2章4.6.3培养基3:见第A.3章。4.6.3培养基3:见附录A中A.3,4.7菌悬液的配制将试验菌种(4.2)接种于培养基1内(4.6.1)，经(35士1)℃培养18h^24h后，再转种于培养墓2(4.6.2)的斜面上，置(35士1)℃培养7d。镜检芽抱在85%以上后，用10ml.生理盐水(4.4.4)洗下菌苔，于65℃水浴30min后，离心(3000r/min)20min，弃去上清液。再加10mL生理盐水，重复离心步骤两次。最终用10mL生理盐水制成芽抱菌悬液。4℃保存，贮存期限一个月5仪器5.1均质器:转速不低于5000r/min,5.2离心机:转速不低于4000r/min,5.3旋转蒸发器。5.4恒温水浴锅。5.5生化培养箱:(35士1)0C,5.6高压灭菌器。5.7培养皿:内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。5.8牛津杯:不锈钢小管，外径(8.0士0.1)mm，内径(6.0士0.1)mm，高度(10.0士0.1)mm,5.9游标卡尺:测量范围。mm-200MM，精度士。.02mm,6试样的制备与保存6.1试样的制备将样品搅拌均匀。分出。.5kg作为试样，制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识。6.2试样的保存将样品于常温下保存。7测定步骤7.1提取称取10g试样，精确到。.01g，置于50mL离心管中，用2X20mL甲醇(4.1.1)均质1min(4000r/min)后离心20min(4000r/min)合并两次离心的上清液于200mL分液漏斗中。7.2净化7.2.1甲醇萃取在上述上清液(7.1)中加人20mL正己烷(4.1.2)充分振荡1min，静置分层，将下层的甲醇相移人另一200mL的分液漏斗中。7.22三点甲烷萃取 G13/T18932.8-2002在上述甲醇相(7.2.1)中加人2ml-氢氧化钠溶液(4,4.1)和30m[三氯甲烷(4.1.1)充分振荡1min，再加人30mI磷酸氢二钠溶液(4.4.2)，振荡1min，静置15min--20min。将三氯甲烷相移人50mL的容量瓶中，并用三氯甲烷定容至刻度，混匀。量取其中25m工于150ml.鸡心瓶中，在40℃水浴的旋转蒸发器上蒸发至干。加人5mI磷酸盐缓冲溶液(4.4.3)溶解残渣。此溶液含试样量为1.0g/mL。7.3测定7.3.1菌悬液用量的测定在实际测定前，将不同浓度的菌悬液(4.7)加人定量的培养基3(4.6.3)中培养，能使。.05pg/mL浓度的红霉素标准工作溶液(4.5.2)产生直径大于10mm、清晰、完整的抑菌圈为最适菌悬液用量7.3.2检定用平板的制备将从7.3.1测试所得的最适菌悬液用量加人已溶化并冷至55℃左右的培养基3(4.6.3)中，充分混匀并立即倾注在灭菌培养皿中，每平皿加人量为9.0mL。置水平台上凝固后，在每个检定用平板中放置六个牛津杯，使每个牛津杯在半径为2.8cm的圆面成60。角间距。所用平板应当天制备。7.3.3标准曲线的制备红霉素标准工作溶液(4.5.2)0.80,0.40,0.20,0.10和。.05pg/mI五个浓度中，0.20pg/mL标准工作溶液为参考浓度。每个红霉素标准工作溶液浓度除参考浓度(0.20pg/mL)外，各取三个检定用平板为一组，四组共12个检定用平板。每个检定用平板中的三个牛津杯内注满参考浓度(0.20pg/mL)标准工作溶液，另三个牛津杯中则分别注满其他浓度的标准工作溶液。这样参考浓度(0.20pg/mL)标准工作溶液将得出36个抑菌圈直径读数的数据，其他浓度标准工作溶液将各得九个抑菌圈直径读数的数据。盖好陶瓦盖，置(35士1)℃培养18h士lh后取出，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量各抑菌圈直径(精确到。.1mm)，求出各组平板中标准工作溶液浓度及参考浓度(0.20pg/mL)抑菌圈直径读数的平均值以及参考浓度(0.20pg/mL)36个抑菌圈直径读数的总平均值。用参考浓度(0.20pg/mL)的总平均值减去各组参考浓度(0.20pg/mL)的平均值之差为校正值，以此值校正其他各浓度标准工作溶液以及被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值。将各组校正值代人式(1)和式(2)中，求出L和H值后，在半对数坐标上，以抑菌圈直径(mm)为纵坐标(算术级)，以标准工作溶液浓度(p,g/mL)为横坐标(对数级)，标出L和H点，连一直线，即为标准曲线L二(3a+2b+c一e)/5··························，····⋯⋯(1)H二(3e+2d+c一a)/5.......................................(2)式中:1.—标准曲线上最低浓度(0,05fag/mL)的抑菌圈直径，单位为毫米(mm);H—标准曲线上最高浓度(0.80pg/mL)的抑菌圈直径，单位为毫米(mm);c—参考浓度(0,20jcg/mL)抑菌圈直径的总平均值，单位为毫米(mm);a,b,d,e—分别表示标准曲线中其他各浓度标准工作溶液(0.05,0.10,0.40,。80pg/mL)抑菌圈直径数据的校正值，单位为毫米(mm),7.3.4样品溶液的测定每份样品溶液各用三个检定平板。按7.3.3标准曲线制备的要求放置牛津杯，各平板中的三个牛津杯中注满参考浓度(0.20pg/mL)标准工作溶液，另三个牛津杯中则注满被测样品溶液。将陶瓦盖盖好，(35士1)℃培养18h士lh后，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量抑菌圈直径(精确到0.1mm)，分别求出被测样品溶液及参考浓度抑菌圈直径读数的平均值。 GI3/T18932.8-20027.4确证试验如被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值)10mm时，应用薄层色谱法做确证试验，以证明抑菌物确系红霉素。本方法流程图参见附录B,本方法的添加回收率数据参见附录C.结果计算如被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值<10mm，即报告为“未检出”。如被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值)10mm，按7.3.3要求校正后，从标准曲线上查出相应的红霉素含量(pg/mL)，即得出以Kg/ml计的红霉素含量，根据确证试验(7.4)报告结果。如果样品中红霉素的含量单位用mg/kg表示时，可将pg/mL按式(3)进行换算。C，。、曰、=—‘，户二，.⋯‘.，奄奋，.‘.’二，二“.、j少刀;式中:X—样品溶液中红霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);C—从标准曲线上查出的样品溶液中相应的红霉素含量，单位为微克每毫升(pg/mL);m—最终样品溶液中所代表的样品量，单位为克每毫升(g/ml,).9精密度GB/T18932的本部分精密度数据是按照GB/T6379-1986的规定，通过九个实验室对四个添加水平的试样所做的试验中确定的。获得重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。9.1重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(t)，本部分方法的重复性限按方程式(4)计算:蜂蜜中红霉素的含量在。.050mg/kg--0.800mg/kg范围:馆r二1.09931馆m一0.5784······························⋯⋯(4)式中:m—两次测定值的平均值，单位为毫克每千克(mg/kg)a如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.2再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，本部分方法再现性限按方程式(5)计算:蜂蜜中红霉素的含量在。.050mg/kg-0.80Omg/kg范围:R二0.4243in一0.0117··································。·⋯(5)式中:rn—两次测定值的平均值，单位为毫克每千克(mg/k妇。 G13/T18932.8-2002附录A(规范性附录)培养基A.1培养基蛋白脉10.0g牛肉膏3.09氯化钠5.09蒸馏水1000mLpH7.0士0.1制作:分装试管，每管约5.0mL,1200C高压灭菌15min,A.2培养基2胰蛋白陈5.09牛肉膏3.0g磷酸氢二钾3.0g琼脂粉5g-20g蒸馏水1000mLpH7.8-8.0制作:1210C高压灭菌20min,A.3培养基3培养基的成分同A.2，但pH6.5士。.1,制作:分装试管，于1210C高压灭菌20min. GB/T18932.8-2002附录C(资料性附录)回收率本方法中红霉素添加浓度及回收率的试验数据:在添加量为。.05Omg/kg时，平均回收率为101.40a;在添加量为0,20Omg/kg时，平均回收率为80.7环;在添加量为。40Omg/kg时，平均回收率为87.7%;在添加量为。.80Omg/kg时，平均回收率为90.0%e