基于COⅡ序列的云南东方蜜蜂遗传分化研究.pdf 5页

南方农业学报JournalofSouthemAgriculture2015，46(8)：1500一1504ISSN2095—1191；CODENNNXAABhttp：／／www．r血y】‘b．cornDOI：1023969／j：issn．2095-1191．2015．08．1500基于COH序列的云南东方蜜蜂遗传分化研究殷玲1，吉挺2，李冠华1，牛德芳1(1江苏农牧科技职业技术学院，江苏泰州225300；2扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009)摘要：【目的】研究云南东方蜜蜂群体的遗传多样性及其遗传分化，为其种质资源保护和有效利用提供参考依据。【方法】对云南不同地理东方蜜蜂群体线粒体的a)Ⅱ部分序列(1—259bp)进行测序，并分析其遗传分化情况。【结果】在6个云南东方蜜蜂群体的线粒体c0Ⅱ部分序列中发现有5个变异位点，并确定存在7种单倍型，其单倍型多样度为O加．644，核苷酸多样度为㈣．00420，群体间的遗传分化系数(Fst)为0．00966,-0．69753。从基于mONACOnq皇倍型的东方蜜蜂NJ系统发生树可以看出，云南东方蜜蜂群体mtDNAC0叮序列的7种单倍型与我国境内其他地区及邻国日本的单倍型聚为一类，而与其他国家或地区的单倍型分开。【结论】云南东方蜜蜂群体遗传多样性丰富，不同地理群体间遗传分化明显，尤其是武定东方蜜蜂群体的整齐度较差、遗传结构较复杂。关键词：东方蜜蜂；c0Ⅱ序列；遗传多样性；遗传分化；云南中图分类号：$893．2文献标志码：A文章编号：2095—1191(2015)08—1500-05GeneticdifferentiationofApisceranafromYunnan，ChinabasedonmtDNACOIlsequencesYINLin91，JITin92，LIGuan-hual，NIUDe-fan91(1JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege，Taizhou，Jiangsu225300，China；2CoUegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou，Jiangsu225009，China)Abstract：【Objective]ThepresentexperimentwasconductedtoinvestigategeneticdiversityandgeneticdifferentiationofApisceI"an8fromYunnan，China，inordertoprovidetheoreticalbasisforprotectingandusingeffectivelygeneticre-sourcesofA．cer8／18．【MethodlThepartsequence(1-259bp)ofmtDNACoⅡfromdifferentgeographicpopulationsofA．ceranawassequenced．Andthegeneticdifferentiationofpopulationswasanalyzed．【Result]Theresultsshowedthatthereexisted5variablesitesintheCOIlsequenceand7haplotypesinA．ceranapopulationsofYunnan，t}Iediversityofhaplo-typesinpopulationsWas0—0．644，thenucleotidediversityWas0—0．00420，andthegeneticdifferentiationcoefficient(Fst)amongpopulationswas0．00966—0．69753．Furthermore．theneighbor-joiningtreeWasconstructedsuccessfullybasedonhaplotypesofmtDNACOIlsequence．whichshowedthatthe7haplotypesofmtDNACOⅡsequenceinA．ceranapopula‘tionsfromYunnanwereclusteredintoonebmnchwithtllehaplotypesofmtDNACOIIsequenceinA．ceranapopulationsfromotherregionsofChinaandneighboringJapan，andthereweresomedifferencesbetween7haplotypesinpopulationsfromYunnanandhaplotypesinpopulationsfromothercountriesorregions．【Conclusion】SixA．cerenapopulationsareabundantingeneticdiversity．andthereexistgeneticdifferentiationamongdifferentgeographicpopulations，especial·ly，A．ceranapopulationfromWudingregionwhichshowsworseuniformityandmorecomplicatedgeneticstructure．Keywords：A．cerena；COIlsequence；geneticdiversity；geneticdifferentiation；YunnanprovinveO引罱【研究意义】我国云南省蜂业资源丰富，蜜蜂种类繁多，包括小蜜蜂、黑小蜜蜂、大蜜蜂、黑大蜜蜂、西方蜜蜂、东方蜜蜂等。其中，东方蜜蜂是云南土著蜂种，也是云南省的主要饲养蜂种，广泛分布于全省海拔3000m以下地区。云南省境内气候水平分布复杂、垂直分布明显，以及特殊的地理位置和地形地貌，致使其蜜蜂群体具有丰富的遗传多样性与复杂的遗传结构(匡邦郁和李有泉，1990；谭垦等，2003)。因此，掌握云南蜜蜂群体内的遗传分化特征，对优化云收稿日期：2015一Ol—11基金项目：江苏农牧科技职业技术学院重点科研项目(NSFRCl401)作者简介：殷玲(1983一)，博士，主要从事蜜蜂分子生物学研究工作，E-mail：lingyin_txx@163．com 8期殷玲等：基于CO肼列的云南东方蜜蜂遗传分化研究·1501·南蜂业结构调整及促进其产业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】至今，关于云南东方蜜蜂遗传分化特征的研究已有较多报道。匡邦郁和李有泉(1990)最早以形态标记的方法将云南东方蜜蜂分为3个亚种：印度亚种ApisCCEa．BaindicaFabricius、西藏亚种ApisCCl3．BaskorikoviMaa、指名亚种A施ceEaBaceranaFabricius。谭垦等(2003)通过分析云南东方蜜蜂的形态特征数值，认为云南东方蜜蜂总体上可分为南方和北方两大类群，而云南是亚洲东方蜜蜂从南到北分布的中间过渡带区域。Tan等(2003，2008)根据蜜蜂的形态特征及其线粒体DNA多态性，以北纬25。及海拔1600m为界可将云南东方蜜蜂划分为两大类型。殷玲等(20iI)利用微卫星标记分析了云南东方蜜蜂群体的遗传多样性及遗传分化特征，发现来自腾冲、无量山、迪庆、武定、泸水、西双版纳6个云南东方蜜蜂群体间的遗传分化与其地理距离不存在显著相关。陈伟文等(2013)通过比较分析广东、广西和云南东方蜜蜂的形态特征，发现这3个地区的东方蜜蜂分成两大地理类群，云南东方蜜蜂为一个地表1样本采集情况Tab．1Informationofcollectingsamples理类群，广东和广西的东方蜜蜂为另一个地理类群。【本研究切入点】mtDNA遗传是严格的母系遗传方式，即单个个体的IntDNA类型就能代表整个母系连锁群。蜜蜂具有特殊的生殖机制，在一个蜂群中所有工蜂都拥有与蜂王相同的mtDNA，一只工蜂的mtD．NA类型就可代表整个蜂群，因此mtDNA是研究蜜蜂遗传资源最方便、有效的工具。【拟解决的关键问题】通过测序方法对云南省6个东方蜜蜂群体的mtDNAC0堪因区域进行多态性检测，研究云南东方蜜蜂群体的遗传多样性及其遗传分化，为其种质资源保护和有效利用提供参考依据。1材料与方法1．1试验材料本研究采集了云南省呈野生或半野生状态的64"东方蜜蜂群体，每个采集地随机采集10群样本，每群样本随机选取1只工蜂作为试验材料。样本采集后用无水乙醇杀死并浸泡于2mL离心管中，各蜜蜂群体采样数及采样地点见表l。1．2试验方法采用E2(5’．GGCAAGAATAAGTGCATTG．3’)与H2(5’．cAATATcArrGAT(}Acc．3’)引物对线粒体tRNAhL∞Ⅱ基因区域进行扩增，PCR扩增体系50．0斗L，包括基因组DNA200ng，10×Buffer5．0斗L，200i山moULdNTPs2．0斗L，10pmoFL正、反向引物各1．0I-tL，TaqDNA聚合酶5U，ddH20补足至50．0体L。扩增程序：96℃预变性3min；94℃60S，55℃60S，72℃60s，进行35个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶回收后送至北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司测序。1．3统计分析利用LI．CORAlignIR软件对原始序列进行多重比对，再以DnaSP4．0软件提取变异位点序列(Rozaseta1．，2003)，合并单倍型并分析序列的单倍型多态性与核苷酸多样性。同时1)AArlequin3．0软件计算蜜蜂群体间的分化水平(Fst)(Excoffiereta1．，2005)、MEGA3．1软件构建基于C()Ⅱ序列的Neighbor-joining(NJ)系统发生树(Kumareta1．，2004o2结果与分析2．1CaI工翻基因片段测序分析结果PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，发现云南东方蜜蜂tRNAh-c()Ⅱ基因区域大小约480bp(图1)。截取C0皿基因片段1-259bp进行序列多态性分析。 ·1502·750bp500bp250bp南方农业学报46卷图1PCR扩增产物电泳检测结果Fig．1Electrophoresisdetectionofamplifiedproducts工2．2云南东方蜜蜂群体C()!磅B分序列的遗传多态性在6个云南东方蜜蜂群体60个个体的线粒体COB部分序列中，发现有5个变异位点，以H1单倍型作对照，共确定了7种单倍型(图2)。由表2可以看出，7种单倍型中H1、H2为共享单倍型，且以H1单倍型包含的个体数最多，共出现34次，分布于除武定群体外的其他5个云南东方蜜蜂群体中，约占个体样本的56．7％；其次是H2单倍型，共出现14次，分布于除腾冲群体外的其他5个云南东方蜜蜂群体中，约占个体样本的23．3％。其他单倍型表现如下：H3单倍型出现1次，为无量山群体特有；H4单倍型出现6次；H5单倍型出现1次；H6单倍型出现2次，是武定群体特有的单倍型；H7单倍型出现2次，为泸水群体所特有312231537971HaD1TTCnTHap2⋯C．Hap3．．T．．HapJ．．C．G．HaDS⋯C．Hap6C．．G．HaD7⋯．C图26个云南东方蜜蜂群体C叩序列单倍型类型及其变异位点Fig2HaplotypesofCOIIsequenceandvariablesitesof6A．cerenapopulationsfromYunnanprovince表2mtDNA∞Ⅱ单倍型在6个云南东方蜜蜂群体中的分布情况Tab．2DistributionofmtDNAC01Ihaplotypesin6A．ceranapopulations舶mYunnanprovince群体单倍型HaplotypePopulationTCWLSDQWDLSXSBNHl1045—78H2—51l2H3一l一H4—-—-—-6—-—-H5一l一H6一2一H7一2—2．3云南东方蜜蜂群体mtDNAa)踯分序列的遗传分化情况由表3可以看出，6个云南东方蜜蜂群体的单倍型多样度为O加．644，单倍型变异度总体为0．622±0．055。从总体上看，云南东方蜜蜂群体单倍型多样度丰富，但不同群体间存在差异，其中腾冲群体单倍型多样度最低，而无量山群体和武定群体单倍型多样度最丰富，均为0．644。表36个云南东方蜜蜂群体内mtDNAC()Ⅱ单倍型多样度Tab．3HaplotypediversityofmtDNAc0Ⅱin6A．ce_ranapopulationsfromYunnanprovince群体样本数单倍型数单倍型多样度PopulationSampleNumberofHaplotypenumberhaplotypediversitvTClO10．000±0．000WLS1030．6“±o．10lDQ1020．556士0．075WD1040．644±0．152LS103O．5ll±O．164XSBN1020．356±0．159合计Total6070．622±0．055641云南东方蜜蜂群体中mtDNAC()Ⅱ序列的核苷酸总变异位点数以武定群体最多(3个)，无量山群体和泸水群体有2个，迪庆群体和西双版纳群体为1个，腾冲群体则缺失变异位点(表4)。表46个云南东方蜜蜂群体内mtDNAc0Ⅱ核苷酸多态性Tab．4NucleotidepolymorphismofmtDNAC01Iin6A．cer-anapopulationsfromYunnanprovince对C()Ⅱ序列的变异进行分子方差分析，结果发现641云南东方蜜蜂群体内的方差组分占总变异的60．32％，而mtDNAC()Ⅱ序列群体间的方差组分占总变异的39．68％。由表5可知，64"东方蜜蜂群体间的遗传分化系数(Fsf)为0．009664)．69753，平均为0．39688。显著性检验结果显示，仅有武定群体与其他群体间的Fs馐异均达极显著水平(火O．01)。2．4mtDNACI如单倍型的NJ系统发生树利用MEGA3．1软件构建6个云南东方蜜蜂群体mtDNAc(Ⅺ序列7种单倍型与GenBank中已发表其他东方蜜蜂单倍型的NJ系统发生树(枝上的数字为自展分析自展值，1000次重复)。由图3可以看出，H1单倍型在北京、广东、江西、吉林、陕西、云南保山、日本及韩国均有分布，而其余6种单倍型只在云南地区分布。 8期殷玲等：基于c0Ⅱ序列的云南东方蜜蜂遗传分化研究-1503·图3基于mtDNAc()Ⅱ单倍型的东方蜜蜂NJ系统发生树Fig．3Neighbor-joiningphylogenetietreeofA．ceranabasedonhaplotypeofmtDNACOII表56个云南东方蜜蜂群体间的遗传分化情况Tab．5Geneticdifferentiationof6A．COl"aliapopulationsfromYurmanprovince左下角为云南东方蜜蜂群体间的遗传分化系数(Fst)，右上角为显著性检验结果(P)Thedatainlower-leftcorneroftablewereg∞eficdifferentiationcootS．一cients(Fst)of6A．ccranapopulationsfromYmprovince，thedatainupper-fightCOmeroftableweretheresultsofsignificaneetest(P)云南东方蜜蜂群体mtDNAc0Ⅱ序列的7种单倍型与我国境内其他地区及邻国日本的单倍型聚为一类，而与其他国家或地区的单倍型分开。3讨论本研究在6个云南东方蜜蜂群体的线粒体c()Ⅱ部分序列中共发现5个变异位点，并确定存在7种单倍型，与姜玉锁等(2007)曾对我国12个地点47只蜜蜂tRNAh-C()Ⅱ进行PCR扩增发现6个变异位点相比，说明云南东方蜜蜂遗传多样性较丰富，与田嵩浩等(2014)的研究结果相符。在云南东方蜜蜂的7种单倍型中有两种为共享单倍型，其中以Hl单倍型包含的个体数最多，共出现34次，分布于除武定群体外的其他5个云南东方蜜蜂群体中，即该基因区域的共享单倍型较丰富，也说明6个东方蜜蜂群体间存在一定的基因交流。在6个云南东方蜜蜂群体中，武定群体的单倍型类型最多(4种)，同时含有共享(1种)及特有单倍型(3种)，反映了武定群体来源复杂，可能是云南武定与周边地区交通便利，其东方蜜蜂群体曾与其他群体间发生过基因交流，因此武定东方蜜蜂群体的整齐度较差、遗传结构较复杂。本研究中6个云南东方蜜蜂群体间mtDNACOII序列的Fst为O．39688，基于C0Ⅱ基因区域序列进行差异分析，得知武定群体与其他群体间的Fs磋异均达极显著水平(P<0．01)，综合群体分化分析结果推测武定群体可能已分化为独立种群。云南无量山、泸水及腾冲3个地理群体间的Fs湘对较小，从单倍型类型来看，3个群体均含有群体共享的主体单倍型(H1)，说明这3个群体与其他群体间的基因交流较频繁，是云南东方蜜蜂分布的“交混区”和“分化区”，也是云南南方蜜蜂类群与北方类群的中间过渡类型。李华等(2012)通过对云南东方蜜蜂的形态特征进行分析，也认为云南中 ·1504·南方农业学报46卷西部地区是云南境内两大东方蜜蜂的过渡地带。可见，云南东方蜜蜂遗传多样性丰富，不同地理类型群体间既发生了一定程度的遗传分化，又存在较高程度的基因交流(董霞等，2001o本研究构建了基于mtDNAC0Ⅱ序列单倍型的东方蜜蜂NJ系统发生树，结果显示，6个云南东方蜜蜂群体mtDNACoⅡ序列的7种单倍型与我国境内其他地区及邻国日本的单倍型聚为一类，而与其他国家及地区的单倍型分开。因此推断，本研究中的6个云南东方蜜蜂群体与日本东方蜜蜂的亲缘关系很近，在历史上可能存在遗传交流。此外，本研究的NJ系统发生树将印度亚种的单倍型聚集到云南群体单倍型类群之外，说明云南东方蜜蜂群体内可能不存在印度亚种，进一步佐证了姜玉锁等(2007)的研究结论。4结论云南东方蜜蜂群体遗传多样性丰富，不同地理群体间遗传分化明显，尤其是武定东方蜜蜂群体的整齐度较差、遗传结构较复杂。参考文献：陈伟文，王钰冲，董诗浩，刘晰文，谭垦．2013．广东、广西与云南东方蜜蜂形态特征比较研究[J]．蜜蜂杂志，(4)：7—9．ChenWW，WangYC，DangSH，LiuXW，TanK．2013．Mor-phometricstudyandcomparisononApisceranaofGuang—dong，GuangxiandYunnan[J]．JournalofBee，(4)：7-9．董霞，史宪伟，张炫，禹--)JI，吴世芳，陈永久，张亚平．2001．云南东方蜜蜂随机扩增多态DNA研究[J]．蜜蜂杂志，(8)：3-5．DongX，ShiXW，ZhangX，YuYC，WuSF，ChenYJ，ZhangYP．2001．GeneticdiversitydetectedbyRAPDinYunnanApiscerana[J]．JounalofBee，(8)：3-5．姜玉锁，赵慧婷，姜俊兵，曹果清，张桂贤，朱文进，郭传甲．2007．中国境内不同地理型线粒体DNAtRNAh～CO1I基因多态性研究[J]．中国农业科学，40(7)：1535—1542．JiangYs，ZhaoHT，JiangJB，CaoGQ，ZhangGX，ZhuWJ，GuoCJ．2007．StudiesonmtDNAtRNAh--COhrgenepoly—morphismsofApisceranadistributedindifferentgeograph—icaleR8inChina[J]．ScientiaAgricultureSinica，40(7)：1535—1542．匡邦郁，李有泉．1990．云南东方蜜蜂ApisceraJIaFabricius的研究[J]．云南农业大学学报，5(4)：224—229．KuangBY，LiYQ．1990．StudyonsubspeciesofApiseeranaFabrieiusinYunnan[J]．JournalofYunnanAgriculturalU—niversity，5(4)：224—229,李华，胡宗文，汪正威，庄迪，杨爽，谭垦，和绍禹．2012．云南省中西部地区东方蜜蜂形态特征研究[J]．云南农业大学学报，27(4)：611-615．hH，HuZW，WangZW，ZhuangD，YangS，TanK，H百7S’Y．2012．MorphologicstudyonApisceranainmiddleandnorthwestofYunnanprovince[J]．JournalofYunnanAgri—culturalUniversity，27(4)：611-615．谭垦，张炫，和绍禹，周丹银．2003．云南东方蜜蜂的形态特征数值分类研究[J]．中国养蜂，54(3)：4-6．TanK，ZhangX，HeSY，ZhouDY．2003．MorphometricandbiogeographyofYunnanA．cerana[J]．ApicultureofChina，54(3)：4—6．田嵩浩，赵照林，赵慧婷，马卫华，杨珊珊，孟娇，姜玉锁．2014．基于线粒体基因的东方蜜蜂群体亚分化研究[J]．应用昆虫学报，5l(2)：448--459．TianSH，ZhaoZL，ZhaoHT，MaWH，YangSS，MengJ，JiangYS．2014．StudyofthepopulationstructureofApisceranabasedonmitochondrialgenevariationlJJ．ChineseJoumalofAppliedEntomology，51(2)：448—459．殷玲，吉挺，陈国宏．2011．利用微卫星标记分析云南省6个东方蜜蜂(apiscerena)群体遗传多样性及遗传分化[J]．西南农业学报，24(2)：772—778．YinL，JiT，ChenGH．2011．Studyongeneticdiversityandge-neticdifferentiationofsixgeographicpopulationsofApiscerana(Hymenoptera：Apidae)inYunnanbymicmsatellitemakers[J]．SouthwestChinaJournalofAgriculturalSci-ences，24(2)：772—778．ExcoffierL，LavalG，SchneiderS．2005．Arlequin(version3．0)：anintegratedsoftwarepackageforpopulationgeneticsdataanalysis[J1．EvolutionaryBioinformaticsOnline，1：47-50．KumarS，TamuraK，NeiM．2004．MEGA3：Integratedsoftwareformolecularevolutionarygeneticsanalysisandsequencealignment[J]．BriefingsinBioinformatics，5(2)：150-163．RozR8J，Sdnehez—DelBarrioJC，MesseguerX，RozR8R．2003．DnaSP，DNApolymorphismanalysesbythecoalescentandothermethods[J]．Bioinformatics，19(18)：2496-2497．TanK，FuchsS，KoenigerN，ZanRG．2003．MorphologicalcharacterizationofApisceranaintheYunnanprovinceofChina[J]．Apidologie，34：553-561．TanK，HepburnHR，RadloffSE，FuchsS，FanX，ZhangLJ，YangMX．2008．MultivariatemorphometricanalysisoftheApisceranaofChina[J]．Apidologie，39(3)：343-353．(责任编辑兰宗宝)