高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定蜂蜜中5种头孢菌素.pdf 5页

第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第5期2010年5月ChineseJournalofAnalytic~Chemistry735～739DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．O0735高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定蜂蜜中5种头孢菌素李学民曹彦忠张进杰范春林刘晓茂钱小清(秦皇岛出入境检验检疫局，秦皇岛0660O4)摘要建立了用高效液相色谱一电喷雾串联质谱(LC—MS—MS)测定蜂蜜中5种头孢菌素残留量的方法。蜂蜜样品用磷酸盐缓冲溶液溶解，经OasisHLB固相萃取柱净化。5种头孢菌素在c柱上以乙腈一水为流动相梯度洗脱条件下完成分离，电喷雾电离串联质谱在正离子多反应监测模式下进行测定。添加浓度在2～100g／kg范围时，回收率为84．2％～103．6％；相对标准偏差为3．89％～9．08％。本方法头孢唑啉的定量限为10，头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟的定量限为2．0g／kg。关键词高效液相色谱一电喷雾串联质谱；头孢菌素；蜂蜜1引言头孢菌素是分子中含有头孢烯和头霉烯两类一内酰胺类的半合成抗生素，具有广谱强杀菌、能耐酸、耐青霉素酶及过敏反应发生率比青霉素低的特点，主要对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌具有杀菌作用¨J。随着头孢菌素化学研究的不断深入，在动物养殖及疾病治疗中广泛应用，导致在动物机体组织中产生头孢菌素残留，对人体健康造成危害。因此，世界各国对部分动物源性产品中头孢菌素残留量均提出了限量要求，如美国FDA规定牛奶中头孢匹林最高残留限量(MRL)为20，牛肉未蒸煮可食组织中头孢匹林最高残留限量为100g／kg；欧盟规定牛奶中头孢菌素最高残留限量为20～100g／kg；日本肯定列表规定牛肉中头孢菌素最高残留限量为10～1000ixg／kg，蜂蜜中头孢菌素最高残留限量还未见报道。牛奶、动物组织中头孢菌素残留量的检测方法有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法、凝胶电泳法J、高效液相色谱法～和液相色谱电喷雾串联质谱法J。本方法参考了文献[8]，研究了蜂蜜中5种头孢菌素的提取和净化效果。以磷酸盐缓冲溶液为提取液，采用固相萃取柱净化，液相色谱．电喷雾串联质谱仪测定。本方法比文献[8]方法操作简单，样品不用乙腈提取和浓缩，回收率高，是一种既能定性又能定量的检测方法，完全适用于蜂蜜中5种头孢菌素残留量的检测。2实验部分2．1仪器与试剂API3000液相色谱。串联四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司)，配有电喷雾离子源；1100高效液相色谱仪(Angilent公司)；液体混匀器；玻璃固相萃取装置；真空泵；pH900型pH计(瑞士Precisa公司，测量精度±0．02)。OasisHLBC固相萃取柱(500mg，6mL)：使用前分别用5mL甲醇、10mL水和5mL磷酸盐缓冲溶液预处理，保持柱体湿润。头孢唑啉(CAS：25953—19—9)、头孢匹林(CAS：24356-60·3)、头孢氨苄(CAS：16549-56—7)、头孢洛宁(CAS：5575—21—3)、头孢喹肟(CAS：118443—89．3)标准物质由Sigma公司提供；甲醇、乙腈为色谱纯；乙酸、NaOH、NaH：PO为优级纯；磷酸盐缓冲溶液(0．15mol／L，pH=8．5)。其它试剂为分析纯。2．2液相色谱与质谱条件液相色谱条件：流动相A为水，含0．1％()甲酸；B为乙腈。梯度洗脱：0～2rain，95％A：2～8min，40％A；8～15min，95％A。流速：200I~L／min。色谱柱：ZORBAXSB—C18(150mm×2．1mm，3．5m)；进样量：20L。2009-06-05收稿；2010-01-05接受E—mml：ciqlixm@163．com 736分析化学第38卷质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压(IS)：5500V；雾化气(NEB)：0．055MPa，气帘气(CUR)：0．079MPa，辅助气(AUIX)：6L／rain；离子源温度40O℃。其它MRM条件见表1。表15种头孢菌素的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞气能量Table1Someparametersofmultiplereactionmonitoringdetectionfor5cephalothins2．3标准工作溶液的配制准确称取每种头孢菌素标准物质，分别用水配制成浓度为1．0g／L的标准储备溶液。取适量头孢菌素标准储备溶液，用空白样品提取液配制成适当浓度的基质混合标准工作溶液。2．4样品处理称取5g蜂蜜样品于150mL三角瓶中，加入25mL磷酸盐缓冲溶液溶解样品，混匀，用5moL／LNaOH溶液调节至pH=8．5。把样品溶液移至下接OasisHLB固相萃取柱的贮液器中，以3mL／min的流速通过固相萃取柱，先用5mL磷酸盐缓冲溶液洗涤三角瓶并过柱，再用2mL水洗柱，弃去全部流出液。用2mL乙腈洗脱，收集洗脱液于刻度样品管中，在40cc用氮气吹干，用2mL水溶解残渣，摇匀后，过0．2m滤膜，供液相色谱一电喷雾串联质谱仪测定。3结果与讨论3．1提取溶液的选择根据蜂蜜样品的特点和被测物的性质，确定磷酸盐缓冲溶液作为提取液。通过回收率实验，比较了提取液中磷酸盐缓冲溶液浓度和pH值对5种头孢菌素回收率的影响。从图1a和b可见，当提取液中磷酸盐缓冲溶液浓度为0．15mol／L，pH=8．5时，5种头孢菌素回收率最佳。因此，本方法使用pH=8．5，0．15mol／L磷酸盐缓冲溶液作为提取液。a～／兰吾，?ll】lIl0．0500．0830．1O0O15O0．17O0．200Concentrationofbufersolution(mol／L)pH图1缓冲溶液浓度(a)和pH值(b)对回收率的影响Fig．1Effectsofconcentration(a)andpH(b)ofbuffersolutiononrecoveries3．2固相萃取柱洗脱条件的选择本方法比较了用1，2和3mL乙腈作为洗脱剂，对5种头孢菌素回收率的影响，结果见表2。实验表 第5期李学民等：高效液相色谱一电喷雾串联质谱法测定蜂蜜中5种头孢菌素737明，当洗脱剂用量为2mL时，5种头孢菌素的回收率为94．5％～98．7％；当洗脱剂用量为3mL时，5种头孢菌素回收率没有明显改善。因此，本方法选用2mL乙腈作为洗脱剂。表2固相萃取柱洗脱剂用量对回收率的影响Table2EluantdosageofsolidphaseextractioncolulTlnonrecoveries回收率Recoveries(％)m回收率Recoveries(％)^Compound1mL洗脱剂2mL洗脱剂3mL洗脱剂Compound1mL洗脱剂2mL洗脱剂3mL洗脱剂1mLElum~t2mLEluant3mLElum~t1mLEluant2mLEluant3mLEluant头孢唑啉Cefazolin92．798．797．6头孢洛宁Cefalonium96．798．196．3头孢匹林Cephapirin89．295．296．3头孢喹肟Cefquinome95．896．995．4头孢氨苄Cephalexin86．794．595．93．3液相色谱柱的选择分别使用IxBondapakC18(300mm×4．0mm，10Ixm)色谱柱和ZORBAXSB—C】8(150mm×2．1mm，3．5m)色谱柱对5种头孢菌素的色谱行为进行了比较。实验发现，这两种色谱柱的灵敏度均能满足要求。但IxBondapakC色谱柱流速为1．0mL／min时，5种头孢菌素的峰形较宽；当流速达到1．5mL／min时，5种头孢菌素的峰形较好，但进行质谱分析前需分流，对5种头孢菌素结果的测定产生一定误差；而使用ZORBAXSB—C色谱柱不需分流，定量准确度优于IxBondapakC。柱。因此，本实验选用ZORBAXSB—Cl8色谱柱。3．4质谱条件的确定采用注射泵直接进样方式，以5IxL／min流速分别将头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁和头孢喹肟标准溶液注入离子源，用正离子检测方式对5种头孢菌素进行一级质谱分析(Q1扫描)，得到质子化分子离子峰分别为m／z456，424，348，459和529，再对分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息。然后对去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)、电喷雾电压、雾化气和气帘气压力进行优化，使分子离子与特征碎片离子对强度达到最佳。然后将质谱仪与液相色谱联机，再对离子源温度、辅助气流速进行优化，确定样液中5种头孢菌素离子化效率最佳条件，见表1。3．5线性范围和方法检出限配制一系列含头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟和头孢唑啉的样品基质混合标准溶液，浓度范围为2．5～1000Ixg／L之间。在选定的条件下进行测定，进样量为20L，用峰面积对各被测组分的浓度作图，头孢唑啉、头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢喹肟的绝对量在0．05～20ng范围内均呈线性关系，符合定量分析要求，其线性方程和相关系数见表3。在此操作条件下，5种头孢菌素在添加浓度在2～100g／kg范围时，其浓度在线性范围之内。样品中头孢唑啉的添加浓度为10kg，头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁和头孢喹肟的添加浓度为2．0g／kg时，所测谱图的信噪比大于10。因此，确定本方法头孢唑啉的定量限为l0g／kg；头孢匹林、头孢氨苄、头孢洛宁和头孢喹肟的定量限为2．0g／kg。表35种头孢菌素回归方程和相关系数Table3Linearsranges，regressionequationandcorrelationcoeficientof5cephalothins3．6方法的回收率和精密度用不含5种头孢菌素的蜂蜜样品进行添加回收率和精密度实验，在2～100Ixg／kg范围内添加3个不同浓度的5种头孢菌素标准溶液后，摇匀，放置2h，然后按本方法进行提取和净化，用高效液相色谱一电喷雾串联质谱仪测定，其回收率和相对标准偏差结果见表4。由表4可见，本方法回收率在84．2％～103．6％之问；相对标准偏差在3．89％～9．08％之间。 738分析化学第38卷表45种头孢菌素添加回收率及精密度cRecoverle％RSDR。乙omp。“nd(Reerie，)(％)L％，’=u。J头孢唑啉Cefazolin10雾；蒌C头ep孢ha氨lex苄in三薹头孢洛宁Cefalonium曩璺．嚣C头ef孢qui喹no肟me曼蚕囊头孢匹林Chapirinep曼蒌i3．7方法的适用性采用本方法对4种蜂蜜(油菜蜜、椴树蜜、荆条蜜、洋槐蜜)中的5种头孢菌素进行检测，以3个添加水平添加浓度(2～100kg)进行回收率实验，其分析结果见表5。从表5可以看出，4种蜂蜜的回收率在81．6％～106．8％之间；相对标准偏差在4．01％～10．26％之间，说明本方法的适用性良好。表54种蜂蜜中5种头孢菌素的回收率Table5Resultsofrecoveryfor5cephalothinsindifferentmatrixsamplrsReferences1WANGRu—Long(王汝龙)，YUANZheng—Ping(原正平)．ChemicalProductsHandbook(化工产品手册)，Drugs(药物)．Beijing(北京)：ChemicalIndustryPublishers(化学工业出版社)，2005：16～l72AnalyticalProceduresForDrugResiduesinFoodofAnimalOrigin(动物源性食品中药物残留分析方法)．Tianjing(天津)：TianjingScientificandTechnicalTranslationPublishers(天津科技翻译出版公司)，1999：367～3683LIJun—Suo(李俊锁)，QIUYue—Ming(邱月明)，WANGChao(王超)．AnalysisofVeterinaryDrug~sidue(兽药残留分析)．Shanghai(上海)：ShanghaiScientificandTechnicalPublishers(上海科学技术出版社)，2002：331～3364PANGGuo—Fang(庞国芳)．ModernAnalyticalTechniquesofPesticideResiduesandVeterinaryDrugs(农药兽药残留现代分析技术)．Beijing(北京)：ScientificandTechnicalPublishers(科学技术出版社)，2O07：3385TyczkowskaKT，VoyksnerRD，StraubRF，AronsonAL．~urnalofAOACInternational，1994，77(5)：1122～11316StraubRF，LinderM，VoyksnerRD．Ana1．Chem．，1994，66(21)：3651～36587CanNO，AhiokkaG，Aboul—EneinHY．Ana1．Chim．Acta，2006，576(2)：246～2528BeckerM，ZittlauE，PetzM．Ana1．Chim．Acta，2OO4，520(1-2)：19～329BmnoF，CuriniR，CorciaAD，NazzariM，SamperiR．Agric．FoodChem．，2001，49：3463～3470 第5期李学民等：高效液相色谱一电喷雾串联质谱法测定蜂蜜中5种头孢菌素739Determinationof5CephalothinsinHoneybyHighPerformanceLiquidChromatographyCoupledwithElectrosprayTandemMassSpectrometryLIXue—Min，CAOYan—Zhong，ZhANGJin—Jie，FANChun—Lin，LIUXiao—Mao，QIANXiao—Qing(QinhuangdaoEntry—ExitInspectionandQuarantineBureau，Qinhuangdao066002)AbstractAsensitivemethodwasdevelopedforthedeterminationofresidueof5cephalothinsinhoneybyhighperformanceliquidchromatographycoupledwitheleetrospraytandemmassspectrometry(HPLC—MS／MS)．Honeysamplewasdissolvedinsodiumdihydrogenphosphatebuffersolution，thensamplesolutionwascleanedupwithOasisHLBSPEcartridge．Identificationwasachievedbyelectrosprayionization(ESI)inpositivemode．ThetargetcompoundswereseparatedonaC18columnbygradientelutionwithaeetonitrileand0．1％formicacidsolutionasmobilephaseandresidueswerequantifiedinmultiplereactionmonitoringmode．Recoveriesof5cephalothinswerebetween84．2％and102．5％(n=10)atspikedlevelsof2．0—100．0Ixg／kg．Therelativestandarddeviations(RSD)ofthemethodwerebetween3．89％and9．08％．Thelimitofquantitation(LOQ)ofthemethodforcefazolinwas10．0Ixg／kg，andtheLOQofthemethodforcephapirin，cephalexin，eefaloniumandeefquinomewas2．0g／kg．KeywordHighperformanceliquidchromatographycoupledwithelectrospraytandemmassspectrometry；Cephalothins；Honey(Received5June2009；accepted5January2010)第十五届冶金及材料分析测试学术报告会征稿通知作为国内外冶金及材料分析测试技术、冶金制造流程优化与产品优化的过程检测及质量控制等技术交流的盛会，第十五届冶金及材料分析测试学术报告会及展览会将于2010年9月12—15日在北京举行。会议由中国金属学会(CSM)与中国机械工程学会(CMES)主办，国际钢铁工业分析委员会(ICASI)支持。热忱欢迎冶金、材料、矿山、化工、机械、地质、环保、外贸、国防、商检等单位、部门或院校从事冶金及材料分析、无损检测、物理检测和力学性能测试等工作的技术人员及管理者踊跃投稿，积极参加。时间／地点：2010年9月12～15日，北京·九华山庄征稿范围：征稿范围包括：试样前处理及湿法分析、等离子光谱、等离子质谱、原子吸收光谱、原子荧光光谱、火花光谱、激光光谱、辉光光谱／辉光质谱、x一荧光光谱、材料气体分析、状态分析、原位统计分布分析、材料表面／界面分析、冶金过程在线及环境分析、微束分析、材料微观解析、失效分析及动态断裂、力学试验、物性分析、无损检测、实验室管理与质量控制等。论文截止日期：2010年6月30日。论文格式参考《冶金分析》投稿须知。请提供作者简介、工作单位(全称)、详细通讯、邮编、电话、E—mail。论文提交请登陆：http：／／journa1．yejinfenxi．cn。注意标明稿件类型为“2010年会论文”联系方式：中国金属学会分析测试分会秘书处地址：北京海淀区学院南路76号14信箱，邮编：100081电话：010—62182398；010—62188330传真：010—62181163E-mail：csm@analysis．org．CB；yejinfenxi@163．con