意蜂群中不同日龄工蜂的东方蜜蜂微孢子虫感染差异比较 4页

36中国蜂业APICULTUREOFCHINA2014年4～6月下第65卷意蜂群中不同日龄工蜂的东方蜜蜂微孢子虫感染差异比较游信毅　叶坤婷　苏欣　应碧华　陈沉思　梁勤　黄少康（福建农林大学蜂学学院，福州350002）摘　要：东方蜜蜂微孢子虫是蜜蜂中肠上皮细胞内专性寄生单细胞真菌，对蜜蜂健康有较大影响。2011年4-5月，对4群意大利蜂群中0日龄至30日龄工蜂中肠的微孢子虫感染情况进行了调查和比较，结果表明，5日龄以下工蜂中未检出，10日龄后，工蜂的感染率为13.8%，之后逐渐增加；20日龄后感染率极显著增加（P<0.01），平均感染率约70%，并持续维持在高感染水平。20及25日龄的感染蜂中，严重感染的工蜂比例极显著高于轻度感染的比例（P<0.01）。关键词：东方蜜蜂微孢子虫；意大利蜜蜂；工蜂；感染中图分类号：S895文献标识码：AComparisonofInfectionRateofHoneybeeWorker(Apismellieferaligustica)ofDifferentAgesfromColoniesbyNosemaceranaeYouXinyi,YeKunting,SuXin,YingBihua,ChenChensi,LiangQin,HuangShaokang（CollegeofBeeScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002）Abstract:Nosemaceranaeisanobligateparasiticfungusintheintestinalepithelialcellsofhoneybee,hasseverelyimpairhoneybeehealth.FromApriltoMay,2011,theinfectionrateofhoneybeeworkers(Apismelliferaligustica)ofdifferentagesbyN.ceranaewereinvestigatedandcompared.Theresultedshowedthat,workersunder5-day-oldwerenon-infected,however,13.8%of10-day-oldworkerswerefoundinfected,thentheinfectionrateincreasedgraduallyastheworkersgrewolder.Infectionratereachedabout70%in20-day-oldworkers(P<0.01),andmaintainedatthehighlevelafterwards.Thepercentagesofseverelyinfectedworkersin20-and25-dayoldworkersweresignificantlyhigherthanthoseoflightlyinfectedworkeratthesameage(P<0.01)。Keywords:Nosemaceranae;Apismelliferaligastica;Honeybeeworker;Infection东方蜜蜂微孢子虫（Nosemaceranae）是一种常与其他病原共同危害蜂群，使蜂群面临更为严重的[9-14]寄生于蜜蜂中肠的专性细胞内寄生单细胞真菌。病害威胁，它可能是造成蜂群衰竭（colonycollapse[10,15-17]1994年，在中华蜜蜂（Apisceranacerana）中首次disorder,CCD）的重要原因之一。[1]发现并于1996年命名；2005年，首次在台湾的西在我国，东方蜜蜂微孢子虫在意大利蜜蜂（简[2]方蜜蜂（A.mellifera）工蜂中被发现。大量研究称意蜂）和中华蜜蜂（简称中蜂）中均有广泛感染[18-20][18]表明，在世界大部分养蜂地区，东方蜜蜂微孢子虫。黄少康等对意蜂外勤蜂中微孢子虫感染情已逐渐替代了西方蜜蜂微孢子虫（N.apis）成为侵况的调查表明，4月份，在51.9%的意蜂群中，外勤[3-8]染蜜蜂的主要微孢子虫种类。蜂的微孢子虫感染率可达40%～60%，可能是造成[21]蜜蜂微孢子虫的侵染不仅造成蜜蜂消化、能量代采蜜生产后蜂群快速下降的原因之一。Traver等谢异常、免疫抑制，寿命缩短，生产力下降，它还常对美国弗吉尼亚一蜂群的微孢子虫感染状况调查显基金项目：国家自然科学基金(项目编号：30771635)，现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-45-KXJ7)。通讯作者简介：黄少康（1969-），博士，教授，研究方向：蜜蜂生理病理。Email:460963445@qq.com 2014年4～6月下第65卷中国蜂业APICULTUREOFCHINA37示，在1a中以4-6月感染率高，秋冬季低，未发现孢子虫感染情况镜检，结果表明（图1），初感染与否与群势强弱和分布地域有关。目前，对于出房和5日龄工蜂均未检出，此后，随着工蜂我国意蜂群中不同日龄工蜂东方蜜蜂微孢子虫的感日龄的增加，感染率逐渐升高。10日龄和15日染情况尚未见报道，结果报道如下。龄工蜂平均感染率分别为13.8%和23.8%；而1材料与方法20日龄平均感染率高达80%，极显著高于10、1.1意蜂工蜂标记与不同日龄工蜂的采集15日龄（P=0.001，P=0.004），25日龄的感2011年4-5月，从意蜂群中提取即将出房的老染率仍保持高水平，但与20日龄无显著差异熟工蜂子脾，放入35℃，70%±10%RH恒温恒湿箱（P=0.737）。到30日龄时，仅有1群蜂还能取到中人工羽化，出房24h内的工蜂定为0日龄，取20只20只蜂样，工蜂平均感染率达75%。冷冻保存。对其它出房工蜂进行标记，标记后分别放入蜂势相近的4群意蜂群中，于5、10、15、20、25、30日龄时每群取回标记蜂样20只，样品立即存放入冰箱中冷冻保存。1.2东方蜜蜂微孢子虫感染情况检查取冷冻保存的工蜂样本，逐一拉取中肠，放入1.5mL离心管，标记管号，单只研磨，再于冷冻离心机中，以10000r/min离心15min。沉淀加入100μL蒸馏水，振荡混匀，吸取5μL制片，图1意蜂群中不同日龄工蜂中微孢子虫的感染率于400倍显微镜下检查微孢子虫感染情况。无感染注：No.1至No.4为4群蜂的感染率变化；Average为4群蜂平均感时记录为“-”。由于感染蜂中感染程度有差异，染率变化。有的只是轻度感染,在视野下只能见到少量孢子，2.2蜂群中严重感染微孢子虫的工蜂比例随日龄增有的则为严重感染，整个视野下满是孢子。为了加显著升高方便比较，将感染程度定为4个级别：每个视野内可见孢子数在少于10个时记录为Ⅰ级，>10～30个记录为Ⅱ级；>30～200个为Ⅲ级；200个以上记为Ⅳ级。1.3数据处理根据每只工蜂中肠的微孢子虫镜检情况进行感染程度分级记录，统计各日龄工蜂的微孢子虫感染百分率，以及感染严重程度的百分率。百分率数据经平方根反正弦转换后，用SPSS的方差分析（ANOVA）的LSD法进行差异显著性分析。2结果与分析图2不同日龄意蜂工蜂中微孢子虫感染程度差异比较2.1意蜂蜂群中工蜂的微孢子虫感染率随日龄注：微孢子虫的感染级数以400倍显微镜下，每个视野内孢子数增加而增加少于10个时记为Ⅰ级，10～30个记录为Ⅱ级；>30～200个为Ⅲ对4蜂群中不同日龄意蜂工蜂中肠中的微 38中国蜂业APICULTUREOFCHINA2014年4～6月下第65卷级；>200个以上记为Ⅳ级。何采取安全有效的措施来抑制和降低东方微孢子虫由于感染率只能表示是否有微孢子虫感染，并对蜜蜂的危害，保障蜜蜂的健康和生产，是提高养不表达感染程度的差异，而同为感染的蜂，有感染蜂生产效益和农业授粉效益亟待解决的重要问题。程度的差异。因此，进一步对10至25日龄不同感染程度的工蜂百分率进行比较，结果可知（图2），参考文献10和15日时，无感染蜂的比例极显著高于感染蜂FriesI.,FengF.,SilvaA.D.,SlenmendaS.B.,PieniazekN.J.Nosema的比例（P=0.001），到20至25日龄时，严重感染ceranae(Microspora,Nosematide)Morphologicalandmolecular（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级）蜂的百分率上升，20日龄时characterizationofamicrosporidianparasiteoftheAsianhoneybeeⅣ级感染蜂的比例显著高于Ⅱ级感染蜂的百分率Apiscerana(Hymenoptera,Apidae).Eur[J].Protistol.,1996,32:356-（P=0.008），25日龄的严重感染（Ⅳ级）蜂百分365.比显著低于低感染蜂（感染Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级）的比例HuangW.F.,JiangJ.H.,WangC.H.ANosemaceranaeisolatefromthe（P=0.009，P=0.003，P=0.009）。honeybeeApismellifera[J].Apidologie,2007,38:30-37.综合上述，在意蜂群中，随工蜂日龄的增加，FriesI.,MartinR.,MeanaA.,García-PalenciaP.,HigesM.Natural不仅蜂群中的感染率增加，感染严重程度也显著增infectionsofNosemaceranaeinEuropeanhoneybees[J].Apic.Res.,加，特别是20日龄以上的工蜂。2006,45:230–233.3讨论KleeJ.,BesanaA.M.,GenerschE,etal.Widespreaddispersalofthe试验结果显示，意蜂群中，东方蜜蜂微孢子microsporidianNosemaceranae,anemergentpathogenofthewestern虫对工蜂的感染率及严重感染的百分率，是随日龄honeybee,Apismellifera[J].Invertebr.Pathol.,2007,96(1):1-10.的增加而增加的，特别是在20日龄后，感染尤为严ChenY.P.,EvansJ.D.,ZhouL.,BoncristianiH.,KimuraK.,XiaoT.,重。同时，试验过程中发现，在4群的取样蜂中，LitkowskiA.M.,PettisJ.S.AsymmetricalcoexistenceofNosema有3群的感染率升高较快，而另1群的感染率升高较ceranaeandNosemaapisinhoneybees[J].Invertebr.Pathol,2009,慢。25日龄时取样时，2群感染较重的蜂群（No.1101:204–209.和No.2）中已无蜂样可取，仅感染较重的（No.3）HigesM.,Martín-HernandezR.,BotiasC.,MeanaA.Thepresenceof和较轻的1群(No.4)仍有蜂可取，这是导致图1中25Nosemaceranae(Microsporidia)inNorthAfricanhoneybees(Apis日龄的平均感染率低于20日龄平均感染率的主要原melliferaintermissa)[J].ApicRes.2009,48:217–219.因，尽管二者在统计上是无显著差异的。至30日龄ForsgrenE,FriesI.ComparativevirulenceofNosemaceranaeandNosema时，仅能取到1群（No.4）的蜂样本。这说明，显apisinindividualEuropeanhoneybees.VetParasitol,2010,170(3):示随着日龄的增加，感染率的升高，工蜂的寿命缩212-217.短，死亡率增加。而且，蜂群中大多数工蜂平均寿FriesI.NosemaceranaeinEuropeanhoneybees(Apismellifera)[J].命还不到30日龄，主要原因之一是东方蜜蜂微孢子Invertebr.Pathol,2010,103:S73-S79.虫的感染。同时，试验期间为4-5月，正处荔枝、龙黄少康,胡庆银,路贺然.意蜂来源的微孢子虫感染对中蜂工蜂血眼开花流蜜期，工蜂外出采集积极极高，高强度的淋巴蛋白的影响[J].福建农林大学学报（自然科学版）,2008,野外采集活动，又增加了受感染个体死亡的机率。37(6):646-649.因此，生产上常见采蜜期后，群势快速下降。实际HigesM.,Martín-HernándezR.,BotaisC.,BailonE.G.,Gonzales-Porto上，这与微孢子虫的感染有密切关系。所以，在微A.V.,RarriosL.,delNozalM.J.,BernalJ.L.,JimenezJ.J.,Palencia孢子虫广泛感染我国乃至全世界蜜蜂的情况下，如P.G.,&MeanaA.HownaturalinfectionbyNosemaceranaecauses 2014年4～6月下第65卷中国蜂业APICULTUREOFCHINA39honeybeecolonycollapse[J].Environ.Microbiol,2008,10:2659-Disorder”inhoneybees(Apismellifera)[J].J.Apic.Res.,2010,49:2669.80-84.Antúnez,Karina,etal.Immunesuppressioninthehoneybee(Apis丁桂铃,石巍.东方蜜蜂微孢子虫的研究进展[J].中国蜂业,2009,mellifera)followinginfectionbyNosemaceranae(Microsporidia)60(6):51.[J].Environ.Microbial,2009,11(9):2284-2290.刘楠楠,郝京玉,王志.蜜蜂微孢子虫对蜜蜂行为及生理机能的影响黄少康,吴丽丽,荆战星,等.不同饲料对接种东方蜜蜂微孢子虫意蜂[J].中国蜂业,2012,12:42.工蜂的影响[J].中国蜂业,2010,11:7-11黄少康,董捷,张招荣,等.中、意外勤蜂微孢子虫的自然感染率调查ChaimaneeV,ChantawannakulP,ChenY,etal.Differentialexpressionof[J].蜜蜂杂志,2006,8:3-4.immunegenesofadulthoneybee(Apismellifera)afterinoculatedby刘锋,王强,代平礼,等.蜜蜂微孢子虫在中国的自然种系构成初探[J].Nosemaceranae.J[J].Insect.Physiol.,2012,58(8):1090-1095.昆虫知识,2008,45(6):963-966.HoltH.L.,AronsteinK.A.,GrozingerC.M..Chronicparasitizationby董捷.中蜂微孢子虫对两种蜜蜂的侵染性及经意蜂持续传代后的变Nosemamicrosporidiacausesglobalexpressionchangesincore异[D].福建农林大学硕士学位论文,2009.nutritional,metabolicandbehavioralpathwaysinhoneybeeworkersTraverB.E.,WilliamsM.R.,FellR.D.Comparisonofwithinhivesampling(Apismellifera)[J].BMCgenomics,2013,14(1):799.andseasonalactivityofNosemaceranaeinhoneybeecolonies[J].PaxtonR.J.DoesinfectionbyNosemaceranaecause“ColonyCollapseInvertebr.Pathol,2012,109(2):187-193.