‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析 10页

园艺学报，2016，43(4)：643–652.ActaHorticulturaeSinicadoi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0707；http：//www.ahs.ac.cn643‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析*闫朝辉，李桂荣，穆金燕，娄航通，朱自果（河南科技学院园艺园林学院，河南新乡453003）摘要：以欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’为材料，利用同源克隆法获得1个NAC转录因子，命名为VvDRL1（GenBank：XP-002281816）。该基因全长840bp，编码280个氨基酸，与‘黑比诺’葡萄中该基因的同源性为100%，但是基因组DNA序列中存在6处单核苷酸突变。瞬时转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析，VvDRL1基因主要在细胞核内表达，属于核蛋白；通过农杆菌介导的叶盘法获得稳定整合的转基因烟草，T2代转基因植株生长迟缓，株高、叶面积和叶片细胞面积约为野生型烟草的60%、34%和31%，转基因植株叶片出现向内卷曲现象，利用石蜡切片进行显微结构观察，转基因植株主叶脉上表皮下缺失2~3层厚壁细胞，且海绵组织内的空隙明显多于野生型植株。研究结果表明，VvDRL1在调控植株的形态发育方面起着重要作用。关键词：葡萄；NAC转录因子；矮化；卷叶中图分类号：S661.1文献标志码：A文章编号：0513-353X（2016）04-0643-10SubcellularLocalizationandFunctionalAnalysisofaNACGeneVvDRL1fromVitisvinifera‘YatomiRosa’*YANChao-hui，LIGui-rong，MUJin-yan，LOUHang-tong，andZHUZi-guo（CollegeofHorticultureandLandscapeArchitecture，HenanInstituteofScienceandTechnology，Xinxiang，Henan453003，China）Abstract：Inthisstudy，aNACgene，VvDRL1，wasisolatedfromVitisvinifera‘YatomiRosa’.ThelengthoffullVvDRL1was840bp，encoding280aminoacids，whichshareda100%similarityincRNAand6singlenucleotidemutationinDNAwith‘PinotNoir’.SubcellularlocalizationshowedthatVvDRL1isanuclearprotein.TransgenictobaccowithVvDRL1wasobtainedbyAgrobacterium-mediatedmethod.Comparedwiththewildtype，thegrowthofT2-generationtransgenictobaccopresenteddelayedwiththeplantheight，leafareaandmesophyllcellsareaofabout60%，34%and31%incomparisonwithwildtobaccoplants.Inaddition，thetransgenictobaccoshowedcurlyleaves.Throughparaffinsectionsobservation，itisfoundthattheupperepidermisinmainleafveinsoftransgenictobaccolacked2–3layerssclerenchymacellsandhadsignificantlymorespaceinthespongytissuecomparedwiththewildtype.Basedontheabovestudy，itisinferredthatVvDRL1geneplayanimportantroleintheregulationof收稿日期：2015–12–08；修回日期：2016–04–08基金项目：国家自然科学基金项目（U1404321；31340015）；河南省科技计划项目（152300410094）*通信作者Authorforcorrespondence（E-mail：shanhong98@163.com） YanChao-hui，LiGui-rong，MuJin-yan，LouHang-tong，ZhuZi-guo.SubcellularlocalizationandfunctionalanalysisofaNACgeneVvDRL1fromVitisvinifera‘YatomiRosa’.644ActaHorticulturaeSinica，2016，43(4)：643–652.plantmorphologicaldevelopment.Keywords：Vitisvinifera；NACtranscriptionfactor；dwarf；curlyleafNAC转录因子是植物特有的转录因子。Souer等（1996）从矮牵牛中克隆得到的第1个NAC转录因子。随着各物种基因组测序的完成，在拟南芥、杨树、大豆和水稻基因组中已鉴定出117、120、152和151个NAC家族成员（Ookaetal.，2003；Huetal.，2010；Nuruzzamanetal.，2010；王洋和柏锡，2014）。研究表明，NAC转录因子在植物的开花诱导，胚胎发育，次生壁加厚，细胞分裂等方面发挥着重要作用。水稻NAC转录因子成员NTL8通过抑制FLOWERINGLOCUST（FT）基因的表达，大大延迟植株的开花进程（Kimetal.，2007）；拟南芥NARS1和NARS2调节胚珠外皮的发育，影响植株胚胎形成，产生非正常形状的种子（Kuniedaetal.，2008）；拟南芥SND2基因正向调控次级细胞壁的发育，可以增强有关纤维素、木聚糖、甘露聚糖和木质素聚合相关基因的表达，从而导致纤维次级细胞壁的加厚（Husseyetal.，2011）；FEZ和SOMBRERO（SMB）在细胞分裂过程中起着重要作用，FEZ在根冠中表达，促进细胞平周分裂，SMB则抑制根冠细胞的分裂（Willemsenetal.，2008）。此外，NAC转录因子也参与植物的生物胁迫和非生物胁迫过程（邵帅等，2014；郭文芳等，2015）。水稻NAC基因ONAC045提高了水稻对干旱和高盐的抗性（Zhengetal.，2009）；在大豆中，GmNAC11可以增强拟南芥对高盐和冷冻的抗性（Haoetal.，2011）；拟南芥NAC基因ATAF2降低对病原真菌Fusariumoxysporum的抗性，ATAF1提高了对Botrytiscinerea的敏感性（Delessertetal.，2005；Wuetal.，2009）。目前关于NAC基因的研究主要集中在水稻和大豆等少数农作物上，关于葡萄NAC基因的报道很少，仅见欧洲葡萄VvNAC1参与对干旱、高盐和病原菌的抗性，以及在VvNAC1转基因拟南芥的发育后期可显著增加植物的生物量，而且可提早开花4~8d（LeHenanffetal.，2013）；中国野生华东葡萄VpNAC1基因增强了烟草对白粉病和疫霉病的抗性（Zhuetal.，2012）；Tello等（2015）利用生物信息学研究VvNAC26的功能，发现其与果实大小的变异有关。作者前期对欧洲葡萄NAC基因家族启动子进行生物信息学分析，发现VvNAC94基因启动子中除了含有ABA（ABRE）和干旱响应元件（MBS）外，还包含一个与发育相关的Leafy顺式作用元件，推测此基因可能调控葡萄的生长发育，故在欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’品种中克隆此基因，并在烟草中进行功能分析，并将其命名为VvDRL1（VitisviniferaDroughtandRolledLeafgene1），这将有助于了解葡萄生长发育的机理。1材料与方法1.1植物材料试验于2012年进行，欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’的嫩叶采自河南科技学院葡萄种质资源圃，转基因所用本氏烟草为本实验室保存。1.2半定量PCR反应及基因表达分析采用改良SDS/酚法进行‘粉红亚都蜜’葡萄叶片RNA的提取（张今今等，2003），采用TaKaRa公司的PrimeScript反转录试剂盒进行第1链cDNA的合成；采用改良的CTAB法提取葡萄DNA（Michelmoreetal.，1991）。分别以叶片cDNA和DNA为模板进行全长cDNA和DNA基因的克®隆，采用TaKaRa公司的PrimeSTARHSDNAPolymerase高保真酶进行扩增，程序为94℃3min， 闫朝辉，李桂荣，穆金燕，娄航通，朱自果.‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析.园艺学报，2016，43(4)：643–652.64530个循环（98℃10s，68℃3min），72℃10min。半定量PCR在Thermol梯度PCR仪上进行。反应体系：2×TaqPCRMasterMix10µL，cDNA模板1µL，上下游引物各1µL，最终用ddH2O补齐到20µL。参照天根生化科技有限公司TaqPCRMasterMix说明书，程序为94℃3min，28个循环（94℃30s，60℃30s，72℃30s），72℃10min。试验中所用引物及序列见表1。表1试验中所用的引物及序列Table1Sequenceoftheprimersintheexperiment基因名称基因ID引物序列（Primersequence5′–3′）GenenameGeneID正向Forward反向ReverseVvDRL1（cDNA）XP-002281816CACAGGACAACACCAGTAAGCAGGTTATTCATACCAAGCCAGGGATVvDRL1（gDNA）KU213972ATGGAGGACATGACAGCAGAGCTTAGAAATTCAGAATGTTGGTGTAAGTVvDRL1（Semi-PCR）XP-002281816TTTTGGGAAGAGGCAGAGGTTTGATTGATGACATTGGAGATGAAGGNtActin（Semi-PCR）AB158612AGCACCAAACCACTCCCACGAGGATGCAGCCACCACTTCA1.3生物信息学分析在GenoscopeGenomeBrowser的BLATserver进行染色体定位预测，利用在线软件PredictProtein（http：//www.predictprotein.org/）进行核定位信号分析，利用SMART软件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）进行保守性结构域分析，利用NCBI数据库中BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源蛋白基因的寻查。1.4亚细胞定位将去除终止子的VvDRL1基因编码序列插入到载体PBI221-GFP的绿色荧光蛋白的C端，构建融合表达载体pBI221-GFP-VvDRL1。构建好的载体质粒利用PSD-1000/He基因枪在1100psi压力下轰击洋葱表皮细胞，28℃培养16h，在激光共聚焦荧光显微镜（LSM510，USA）下进行观察。基因枪转化操作步骤参照PSD-1000说明书。1.5烟草转基因构建过量表达载体pWR306-VvDRL1（徐伟荣，2005），参照Horsch等（1985）的农杆菌介导的叶盘共培养法转化本氏烟草，25℃，16h光照/8h黑暗环境下培养T2代转基因烟草用于功能分析。1.6切片制作及显微观察切取烟草叶片，在4%FAA液中固定72h，用30%、50%、85%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水，每级30~60min，二甲苯透明，浸蜡，倒入纸盒内进行包埋。用切片机切8μm厚度的切片，依次经过二甲苯、无水乙醇、50%乙醇、蒸馏水，脱蜡至复水。依次用1%番红水溶液和0.5%固绿酒精溶液染色，染色后的切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片。在光学显微镜（NikonC-SHG1，Japan）下进行观察。2结果与分析2.1VvDRL1的结构分析以欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’叶片cDNA为模板，根据欧洲葡萄基因组数据库中VvNAC94开放阅读框两侧的序列设计全长引物，利用同源基因克隆法，获得1个包含NAC保守性结构域的NAC成员VvDRL1，开放阅读框全长840bp，编码280个氨基酸，蛋白分子量为30.9kD，同源性比对分 YanChao-hui，LiGui-rong，MuJin-yan，LouHang-tong，ZhuZi-guo.SubcellularlocalizationandfunctionalanalysisofaNACgeneVvDRL1fromVitisvinifera‘YatomiRosa’.646ActaHorticulturaeSinica，2016，43(4)：643–652.析发现该基因与VvNAC94相似性为100%，GenBank登录号：XP-002281816（图1）。而后利用同源克隆法克隆获得长度为1044bp的VvDRL1基因的DNA序列，该序列与‘黑比诺’葡萄基因组序列同源性为99%，仅存在6处单核苷酸的突变（图2），GenBank登录号：KU213972。该基因组DNA序列包含两个内含子（103、101bp），3个外显子（405、269、166bp），在‘黑比诺’基因组上进行染色体定位，VvDRL1位于第3条染色体的2447338~2448391bp处（图1，图2）。图1VvDRL1的染色体定位Fig.1ChromosomallocationofVvDRL1图2葡萄VvDRL1的DNA序列分析Fig.2HomologyanalysisofVvDRL1genomeDNAsequenceinV.vinifera‘YatomiRosa’with‘PinotNoir’蛋白结构分析表明，VvDRL1在N端包含一个147个氨基酸的NAC保守型区域，一个PKKK核定位信号肽，位于第70~76个氨基酸处，在C端存在一个与激活功能有关的[W/N]xWEQx[n/t]W结构域，位于第254~266个氨基酸处（图3）。图3葡萄VvDRL1的蛋白结构Fig.3SchematicproteinstructuredomainsofVvDRL1 闫朝辉，李桂荣，穆金燕，娄航通，朱自果.‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析.园艺学报，2016，43(4)：643–652.6472.2亚细胞定位利用基因枪法在洋葱表皮细胞内进行VvDRL1亚细胞定位分析，如图4，VvDRL1融合蛋白主要在细胞核内分布，其次在细胞壁有少量分布，而对照GFP蛋白则分布于整个细胞壁、细胞膜和细胞核，表明VvDRL1属于核蛋白。图4VvDRL1的亚细胞定位Fig.4SubcellularlocalizationofVvDRL1protein2.3VvDRL1转基因烟草的获得利用土壤农杆菌介导的叶盘法进行转基因烟草研究，对获得的抗性植株提取RNA进行半定量分析，表明已获得转VvDRL1烟草植株（图5）。在后续的研究中选取转基因株系OE1、OE5和OE9进行表观及显微观察试验。图5VvDRL1在转基因烟草不同株系中的表达烟草Actin基因作为内参。WT：野生型；OE1、OE5、OE9：转基因烟草。下同。Fig.5ExpressionlevelanalysisofVvDRL1intransgenictobaccosTobaccoActingenewasusedasaninternalcontrol.WT：Wildtypetobacco；OE1，OE5，OE9：Transgenictobaccos.Thesamebelow.2.4VvDRL1转基因烟草表型分析2.4.1植株矮化T2代转基因植株生长迟缓，生长21~70d的幼苗在体形上明显小于野生型植株（图6）。生长70d的成苗转基因株系OE1、OE5、OE9平均株高为野生型的60.7%，60.8%和60.2%，但是叶片数相差不大。茎粗、植株鲜质量和叶片面积都明显小于野生型，分别是野生型的51.3%、54.1%、 YanChao-hui，LiGui-rong，MuJin-yan，LouHang-tong，ZhuZi-guo.SubcellularlocalizationandfunctionalanalysisofaNACgeneVvDRL1fromVitisvinifera‘YatomiRosa’.648ActaHorticulturaeSinica，2016，43(4)：643–652.54.1%；36.5%、36.1%、35.7%和34.2%、35.3%、34.4%（表2）。此外，通过甲苯胺蓝染色进行叶片细胞观察，转基因植株叶片细胞也明显小于野生型（图7），分别为为野生型的31.4%、30.6%和31.0%（表2）。图6VvDRL1转基因烟草表型分析Fig.6PhenotypeanalysisofVvDRL1transgenictobacco表2VvDRL1转基因烟草幼苗形态指标Table2Morphologicalindexesoftransgenictobaccoplants22类型株高/cm茎粗/cm叶片数鲜样质量/g叶片面积/mm细胞面积/μmTypeHeightStemdiameterLeafnumberFreshweightLeafareaCellarea*****OE15.25±1.340.19±0.0113.63±1.920.84±0.0844.25±3.253370.35±615.68*****OE55.26±0.990.20±0.0412.57±1.980.83±0.0845.75±2.583286.30±354.21*****OE95.21±1.080.20±0.0313.13±1.550.82±0.0744.60±1.513328.33±475.60WT8.65±1.340.37±0.0314.50±1.432.30±0.08129.50±4.2010729.07±1311.53注：﹡P<0.05（t检测），n=10。Note：SignificantdifferencewasconfirmedbyTukey’sttest（P<0.05），n=10.图7转基因烟草叶片细胞观察Fig.7Leafcellobservationoftransgenictobacco 闫朝辉，李桂荣，穆金燕，娄航通，朱自果.‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析.园艺学报，2016，43(4)：643–652.6492.4.2叶片卷曲如图8，A所示，不论是幼苗期还是成苗期VvDRL1转基因烟草植株，除了表现矮化方面外，所有的叶片均出现向内卷曲现象。为了明确卷叶的原因，取10周大的烟草自下往上第10片叶子制作石蜡切片进行显微观察，在叶脉中，野生型烟草上表皮细胞下部木质部外面存在3、4层厚壁细胞，上表皮细胞向外凸出（图8，B），而转基因植株上表皮细胞下部仅存在1、2层厚壁细胞，上表皮细胞不外凸（图8，C）。此外，相比野生型烟草，转基因烟草海绵组织中出现更多的细胞间隙（图8，D、E）。这些差异可能是导致转基因株系叶片出现卷叶现象的原因。图8VvDRL1转基因烟草叶片表型及显微组织分析A：野生型和转基因烟草的叶片表型；B~E：转基因烟草（B、C：叶脉的显微观察，D、E：叶肉的显微观察）。WT：野生型；OE9：转基因烟草。Fig.8LeafphenotypeandmicrohistologicalanalysisofVvDRL1transgenictobaccoA：LeavesphenotypeofVvDRL1transgenictobacco.B–E：Transgenictobaccos（B，C：Observationofleafvein.D，E：Observationofleafmesophyll）.WT：Wildtypetobacco；OE9：Transgenictobaccos.3讨论2007年葡萄作为第1种果树和第4种开花植物，其基因组测序完成。李绍华课题组研究发现，葡萄2000多个转录因子中预测包含74个NAC基因（Wangetal.，2013）。NAC转录因子N端含有1个高度保守的DNA结合域，C端含有1个高度变异的激活域（Quattrocchioetal.，1999；Riechmannetal.，2000）。葡萄NAC家族基因分布在除第5和9条外的17条染色体上，且在第15和19条染色体上的NAC成员最多。本研究中从欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’中克隆到1个NAC家族成员，VvDRL1， YanChao-hui，LiGui-rong，MuJin-yan，LouHang-tong，ZhuZi-guo.SubcellularlocalizationandfunctionalanalysisofaNACgeneVvDRL1fromVitisvinifera‘YatomiRosa’.650ActaHorticulturaeSinica，2016，43(4)：643–652.该基因定位于第3条染色体上，其N端包含1个147个氨基酸的NAC保守型区域，还有一个PKKK核定位信号肽。NAC转录因子以往研究主要集中在植物开花诱导，胚胎发育，次生壁加厚、细胞分裂等方面的作用（Kimetal.，2007；Kuniedaetal.，2008；Willemsenetal.，2008；Husseyetal.，2011），对于植株形态，诸如植株的矮化和叶片形态方面研究较少，本研究中VvDRL1的功能将对葡萄在形态发育方面的研究有重要意义。内在的基因调控、各种激素作用和外界环境的影响，可使得植株节间不能正常伸长生长从而导致植株矮化。本研究中，葡萄VvDRL1基因可以导致转基因的植株矮化，其植株的高度、茎粗度、叶面积明显小于野生型植株。这与拟南芥NAC转录因子中的NTL8、ANAC036、XND1基因的功能一致，其都可使植株的生长减缓（Kimetal.，2007）。还有葡萄VvDRL1和拟南芥ANAC036均可引起转基因植株细胞面积缩小，这可能是导致植株株形矮化的直接原因。另外，拟南芥NAC转录因子NTL8基因可介导GA信号转导途径。GA是植物生长发育过程中一类重要的调节激素，对诱导植物种子的萌发、节间和叶片的伸长、茎的伸长和植株增高、花器官形成等都有明显的促进作用，阻断GA的生物合成或信号转导途径均可引起植株矮化。葡萄中GA受体蛋白基因VvGID1a和VvGID1b的缺失可导致转基因拟南芥株形严重矮化，表明GA在调控葡萄株形发育期起关键作用（Acheampongetal.，2015）。在其他物种中也有类似的现象，YABBY类转录因子中的OsYAB1在水稻的快速分化和伸长的组织中超量表达能抑制osGA3ox2的表达，使水稻植株矮化（Jangetal.，2004）。bZIP类转录因子中的RSG基因在超表达的烟草中会抑制GA20ox的表达从而引起烟草植株矮化（Yamaguchi，2008）。至于本研究中VvDRL1导致烟草植株矮化是否介导了GA信号转导途径，还需要进一步的研究。叶片卷曲是一个复杂的生物学过程，也是环境因子诱导下的形态学反应，造成叶片卷曲的原因有很多。基因是控制叶片形态发育的基础，基因的表达和调控是植物接受外界信号和调控叶片形态等发育活动的关键（Ito，1957；李平霞，2013）。拟南芥ARF转录因子ARF3和ARF4（Irenaetal.，2005），HD和ZIPⅢ转录因子中的PHB和PHV（Janeetal.，2001），水稻Roc5基因、SLL1基因（Zhangetal.，2009；Zouetal.，2011）等均可调控叶片的形态发育。在葡萄中，中国野生华东葡萄VpYABBY1也引起转基因拟南芥植株叶片的外卷现象（Xiangetal.，2013）。本研究中葡萄VvDRL1转基因烟草出现了叶片向内卷曲的现象，这与水稻基因SLL1突变体表型一致。通过石蜡切片观察，发现转基因植株叶片叶脉处的厚壁细胞相比野生型植株较少了1~2层，这不利于叶片的展开，这与水稻基因Roc5的机制相同，水稻SLL1基因突变体正是通过叶脉离轴面厚壁细胞的不正常发育造成叶片的内卷（Zhangetal.，2009）。相反，水稻Roc5基因突变体则通过增加泡状的数量及体积导致叶片出现外卷现象（Zouetal.，2011）。此外，VvDRL1转基因烟草叶片海绵组织中出现较多的细胞间隙，这有利于叶片的内卷。以上这两点的差异可能是VvDRL1导致叶片内卷的原因。ReferencesAcheampongAK，HuJ，RotmanA，ZhengC，HalalyT，TakebayashiY，JikumaruY，KamiyaY，LichterA，SunTP，OrE.2015.FunctionalcharacterizationanddevelopmentalexpressionprofilingofgibberellinsignallingcomponentsinVitisvinifera.JournalofExperimentalBotany，66(5)：1463–1476.DelessertC，KazanK，WilsonIW，vanDerStraetenD，MannersJ，DennisES，DolferusR.2005.ThetranscriptionfactorATAF2repressestheexpressionofpathogenesis-relatedgenesinArabidopsis.PlantJournal，43：745–757.GuoWen-fang，LiuDe-chun，YangLi，ZhuangXia，ZhangJuan-juan，WangShu-sheng，LiuYong.2015.Cloningandexpressionanalysisofnewstress-resistantNAC83genefromCitrus.ActaHorticulturaeSinica，42(3)：445–454.(inChinese) 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