中华蜜蜂小分子热激蛋白基因hsp27.6的克隆、鉴定与功能分析 56页

山东农业大学硕士学位论文中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27.6的克隆、鉴定与功能分析姓名：刘昭华申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：胥保华20120614 山东农业大学硕士学位论文中文摘要小分子热激蛋白(sHSPs)基因的功能是分子生物学领域的研究热点之一。sHSPs在生物体应对一系列内部应激和外部应激的细胞防御中起重要作用，而在昆虫的免疫系统中的作用也逐渐被发现。中华蜜蜂是我国的特色蜂种，它耐寒抗病，善于搜集零星蜜源，对于维护与其有关的植物共生生态系统的平衡具有重要的经济价值和社会效益。本研究以中华蜜蜂(彳p括cer(1rlaceratl(i)为材料，首次克隆得到小分子热激蛋白基因Hsp27．6；利用半定量PCR的方法分析了AccHsp27．6在不同部位，不同发育阶段以及在各种外界应激条件下的转录水平表达模式：并获得了有活性的体外融合蛋白。为进一步研究该基因的功能及作用机理奠定了基础。本研究的主要结果如下：1．通过RT-PCR和RACE．PCR的方法从中华蜜蜂中克隆得到Hsp27．6基因，命名为AccHsp27．6，其GenBank登陆号为GQ254650，eDNA全长1,014bp，包含76bp的5’UTR，223bp的3’UTR和708bp的ORF，编码一条含有236个氨基酸残基，．分子量约为27．6kDa的多肽链，等电点约为7．53。序列分析发现，AccHsp27．6具有热激蛋白家族的保守结构域a晶状体结构域，氨基酸序列比对显示AccHsp27．6与McsHSp●(GenBank登陆号EU624206)andNvHsp21．7(GenBank登陆号XP001604512)的同源性分别达到43．88％和44．07％。基因组DNA克隆显示，AccHsp27．6没有内含子，并且在5’端空白区域发现了若干个假定的转录因子结合位点，比如有7个热激元件(HeatShockElement，HSE)租3个NF．r,B结合位点，它们的存在提示AccHsp27．6可能会具有某种．免疫功能。·2．半定量PCR分析显示，AccHsp226在所有测试的部位和发育阶段都有表达。将中华蜜蜂的成年蜂或幼虫暴露于各种应激条件中并检测AccHsp27．6转录水平的表达模式。这些应激条件包括高温，H202，6种化学试剂(C02，S02，甲醛，乙醇，丙酮，氯仿)，4种农药(辛硫磷，啶虫脒，蚊蝇醚，菊酯)以及4种微生物侵染(Staphylococcusaureus，Micrococcusluteus，Bacillussubtilis，Pseudomonasaeruginosa)。其中除C02，。蚊蝇醚，菊酯，枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌可以抑制AccHsp27．6的转录表达水平外，其余应激条件均可诱导AccHsp27．6的转录表达。3．分别以pMDI8-Tsimple和pET-30a(+)为克隆载体和表达载体构建了AccHsp27．6基因编码区的原核融合表达载体AeeHsp27．6．pET-30a(+)，转化EscherichiacoliBL21(DE3)并对其表达条件进行优化，在IPTG诱导下表达出大小约为36kDa的融合蛋白并 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析进行纯化。将纯化蛋白进行体外活性检测，抑制MDH热聚沉实验显示重组AccHsp27．6蛋白具有显著的体外分子伴侣活性，纸盘稀释法抑菌实验显示重组AccHsp27．6蛋白具有显著的体外抑菌活性。’本研究结果表明，AccHsp27．6在应对生物性和非生物性刺激的反应中起到重要作用，在中华蜜蜂免疫防御机制中具有潜在的功能。关键词：中华蜜蜂：小分子热激蛋白(sHSP)；基因克隆：功能分析¨ 山东农业大学硕士学位论文Cloning，characteriza“onandfunctionalanalysisofHsp27．6from,4p／sceranaAbstractThefunctionofsmallheatshockproteins(sHSPs)isoneofthehottopicsinthefieldofmolecularbiology．sHSPsplayanimportantroleinthecellulardefenseofprokaryoticandeukaryoticorganismsagainstavarietyofinternalandexternalstressors．AndtheimmunefunctionofsHSPhasbeenfoundgradually．TheChinesehoneybee，apesceranacerana，isallimportantindigenousspecies．Itiscoldanddiseaseresistanceandgoodatcollectingscatterednectar，andhaveimportanteconomicvalueandsocialbenefitsforthemaintenanceoftheecologicalbalanceasthepollinatoroffloweringplants．Inthisresearch,weselectedtheChinesehoneybeeastheexperimentmaterial，andaseriesofresearchhavebeenmanagedontheisolation,sequenceandexpressionprofileanalysis，andfunctionalidentificationofAccHsp27．6，whichCangreatlyhelptostudythefunctionandmechanismofsHSEThemainresulIsareasfollows：1．TheHsp27．6genewasclonedfrom卸tSceranabyRT-PCRandRACE-PCR,andnamedasAccHsp27．6(GenBankaccessionnumberGQ254650)．Thefull—lengthAccHsp27．6eDNAWas1,014bp，witha76-bp5’untranslatedregionCOTR)，a223一bp3’UTRanda708-bpORFencodingaproteinof236aminoacids、^，itllacalculatedmolecularweightof27．6kDaandallisoelectricpointof7．53．ThesequenceanalysisrevealedAccHsp27．6hastheGt··crystallindomain(ACD)ofmetazoana-crystallin·typesHSPsandthepredictedaminoacidsequenceofAccHsp27．6exhibited43．88％and44．07％similaritytothesHSPfromMacrocentruscingulum(GenBankaccessionnumberEU624206)andHsp21．7fromNasoniavitripennis(GenBankaccessionnumberXP001604512)，respectively．ThecloneofgenomicDNAindicatedthattherewasnointroninthisgeneand7HSEsand3NF-r,Bbindingsiteswerepresentinthe5"-flankingregion，suggestingapossiblefunctioninimmunity．。’2．Asemi·quantitativeRr．PCRanalysisindicatedthatAccHsp27．6wasexpressedinalltestedtissuesandatdifferentdevelopmentalstages．Furthermore，expressionoftheAccHsp27．6¨I● transcriptwasinducedbyexposuretoheatshock，H202，anumberofdifferentchemicals(includingS02，formaldehyde，alcohol，acetone，chloroform，andthepesticidesphoximeandacetamiprid)，andthemicrobesStaphylococcusaureusandMicrococcusluteus．Incontrast，themRNAexpressioncouldberepressedbyC02，thepesticidespyriproxyfenandcyhalothrin，andthemicrobesBacillussubtilisandPseudomonasaeruginosa．3．AccHsp27．6一pET-30a(+)WasconstructedusingpMD18一TsimpleandpET-30a(+)ascloningvectorandexpressionvector,respectively．AndthenitwasinducedbyIPTGtoexpressinEcolistrainBL21(DE3)．Thefusionproteinwiththeapproximatelymolecularweightat36kDaWasthenpurified．Notably,therecombinantAccHsp27．6proteinexhibitedsignificant／nvitromolecularchaperoneactivityandantimicrobialactivity．Takentogether,theseresultssuggestthatAccHsp27．6mightplayanimportantroleintheresponsetoabioticandbioticstressesandinimmunereactions．Keywords：却豇ceranacerana，smallheatshockprotein(sHSP)，genecloning,functionalanalysis．IV 符号说明Amp；Ampieillin，氨苄青霉素Acr：Acrylamide，丙烯酰胺Bis：N，N’-Methylenebisacrylarnide，亚甲基丙烯酰胺Bp：Basepair，碱基对BSA：Bovineserumalbumin。牛血清白蛋白eDNA：ComplementaryDNA，互牢卜DNADEPC：Diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯DNA-De似y曲onudeicacid，脱氧核糖核酸dNTP：Deocyribonueleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸EB：Ethidiumbromide，溴化乙锭EDTA：Ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸I-PCR：Inversepolyrnerasechainreaction，反向PCRIPTG：Isopropyl-B-D-thiogalactoside，异丙基⋯13D硫代半乳糖苷KarlLB"Luria-bertanimedium，LB培养基mRNA：MessengerRNA，信使R．NA’NaAC：Sodiumacetate，醋酸钠PBS：Phosphatebuffer，磷酸缓冲液．PCR．Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应RNaseA：RibonucleaseA，核糖核酸酶ART-PCR．ReversetranscriptativePCR，反转录PCRSDS：Sodiumdodeeylsulfate，十二烷基硫酸钠SDS-PAGE：SDSPoly-acrylamidegelelectrophoresis，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳TE：Tris．HC!，EDTAbuffer，Tris—HCl，EDTA缓冲液Tris：Tris(Hydmxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷X—gal：5-Bromo-4一ehloro-3·indolyl-13-D—galaetoside，5-’溴4-氯-3一吲哚⋯13O半乳糖苷 山东农业人学硕士学位论文1日IJ吾昆虫没有完善的免疫系统，但在长期进化过程形成了独特的防御机制，来抵御病原物的入侵和适应各种逆境条件如气候变化环境污染等。昆虫的抗逆能力是决定其种群能否在特定的生态环境中得以生存并延续的必要条件。热激反应(heatshockresponse，HSR)．是昆虫自我保护的重要机制之一，最初的热激反应现象是1962年Rittossa在研究Drosophilamelanogaster唾液腺时发现的，短暂的热激能诱导Dmelanogaster唾液腺的多线染色体发生膨突，与该区基因发生转录有关，后证实在受热激的Dmelanogaster组织中产生了一类新的蛋白，热激蛋白(heatshockproteins，HSPs)。以后又陆续从细菌，鸟类和哺乳动物的组织或细胞中发现了类似的反应，1982年Adems等证实了一切生物细胞受高温诱导时均可合成HSPs，它们是一类具有相似生物学活性和生理功能的蛋白质。1982年美国冷泉港召开了第一届HSPs国际会议后，世界上对HSPs的研究蓬勃发展起来(王海鸿和雷仲仁，2005)。热激蛋白家族在进化中高度保守，其成员在微生物、植物和动物等各种生物体内广泛存在。HSPs进化上的高度保守性和分布的广泛性表明其在细胞功能中的重要性和作用机理的复杂性(张永强等，2004)。HSPs作为蛋白陪伴分子具有重要作用(HendrickandHartl，l993)并与一系列生理过程有关，包括胚胎发育、昆虫滞育以及形态发生等。现在已经证明，HSPs不仅可以被高温所诱导，而且可被多种其他类型的刺激条件所诱导。因此HSPs又称为应激蛋白(stressproteins)。HSPs可以帮助细胞耐受外界逆境压力，特别是热应激，‘．具有细胞保护功能。近几年研究还发现热激蛋白具有抗肿瘤和抑制人类疾病的功能。。·1．1热激蛋白的分类与生物学特性目前对HSPs的分类还没有明确的标准，常用以下两种方式。根据作用和调控方式，可以把Hsps分为两大类：一类是诱导型热激蛋白(inducedheatshockproteins)，另一类是组成型热激蛋白(constitutiveheatshockproteins)。●根据Hsps的分子量大小可以将其分为四个家族：HSP90，HSP70，HSP60和sHSPs(MizrahiP，a1．，2010)。1．1．1HSP90家族的生物学特性HSP90的分子特征是氨基端具有抗肿瘤抑制剂格尔德霉素和根赤霉素位点以及一个靶蛋白的结合部位(Prodromoueta1．，1997a：Prodromoueta1．，1997b：Stebbinseta1．r 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析1997)，羧基端具有钙调蛋白结合位点和多种蛋白的结合位点，如：类固醇受体、肌动蛋白细丝等(Peteretal．，1998)，羧基端最末端4个氨基酸是EEVD(Glu．Glu．Val—Asp)，是所有真核细胞HSP90的共同特性。通常HSP90蛋白在羧基末端区域发生二聚化，以二聚体形式存在。HSP90在正常或刺激条件下的各种类型细胞质中都存在，作为蛋白伴侣与变性蛋白结合，维持它们的折叠状态(Yoneharaeta1．，1996)。激素受体等信号传导蛋白相互作用并形成复合体(RutherfordandZuker，1994)，使其具有生物活性。即使是在无刺激条件下，HSP90也是真核生物必不可少的(Borkovicheta1．，1989)。nmelanogaster体内只有一种HSP90家族蛋白即Hsp83，在正常发育条件下也有一定量的表达(BlackmanandMeselson，1986)，Dmelanogaster的Hsp83是细胞正常生长存活、形成正常精子和中心体正常发挥功能所必需的。在真核细胞内质网上大量存在的HSP90蛋白是Grp94，也称为糖蛋白96(gp96)，它与胞质内HSP90的序列有50％同源。内质网上的Grp94分子量较胞质中的HSP90大，在SDS．PAGE显示的分子量分别为94．108kDa和87．92kDa。Orp94的氨基端有一段信号肽，羧基端最末端4个氨基酸为KDEL(Uys．Asp．Glu-Leu)，是内质网蛋白滞留信号。先前报道Cap94可以氨基端，羧基端两个末端或仅羧基端末端截去的方式存在，从内质网中“逃离"出来。Grp94参与了内质网分泌蛋白的成熟和亚基的组装过程。1．1．2HSP70家族的生物学特性HSP70在原核生物和真核生物体内都存在，并存在于所有的细胞区室和细胞器中。哺乳动物细胞液中HSP70有2种，一种为基础合成型(HSC70又称Hsp73)，另一种为高度诱导型(HSP70又称为Hsp72)。内质网上HSP70的代表性成员是78kDa的蛋白称为免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP蛋白)或Grp78(Welch，1992)。线粒体内HSP70家族成员是gp75。Grp78(Bip)、gp75、HSC70(Hsp73)在正常发育的细胞中表达，而HSP70(Hsp72)由应激诱导产生。Ecoli和Saccharomycescerevisiae中HSP70家族成员具有不同的名称。Ecoli胞液中的HSP70称为Dnak(SegalandRon，1998)。&cerevisiae胞液中有两种HSP70，Ssa和Ssb；内质网中的称为驱动蛋白(Kar2)(Roseeta1．，1989)，线粒体中的称为Sse。Dmelanogaster的HSP70家族有2个诱导型成员，Hsp68和Hsp70，和5个组成型表达的成员，Hse70．1、．2、．3、4、．5，其中Hse70·3和Hse70．5分别定位于内质网和线粒体，其余的定位于胞质内。Hsp70家族成员均含有两个主要的结构域，氨基端高度保守的44kDaATPase功能2 山东农业大学硕士学位论文域(ATP．bindingdomain)和一个25kDa的羧基端区域组成。由于氨基端有ATPase功能域，因此可以结合ATP。羧基端又可以分成保守的15kDa的多肽结合功能域(polypeptidebindingdomain)和不保守的靠近羧基端最末端的10kDa可变区和羧基端最末端的基序(motif)，不同类型的HSP70成员的基序是特异性的，定位于胞质中的HSP70的基序序列为EEVD，内质网中的为HDEL，线粒体中的为PEAEYEEAKK(GuyandLi，1998)。不同物种间位于同一细胞区室的HSP70蛋白之间，比来自同一生物不同器官的HSP70之间更相似，说明不同成员功能的特化。1．1．3HSP60家族的生物学特性真核细胞线粒体内的HSP60是核基因的产物，后被运输到线粒体内。在线粒体的基质内，7个HSP60亚基构成一个环状寡聚结构，这样2个环状结构叠加在一起形成桶状结构(HutchisonetaL，1989)。线粒体HSP60不仅参与核基因编码的蛋白进入线粒体后的折叠和组装，而且参与线粒体基因编码蛋白的折叠和组装。在蚜虫血淋巴中称为菌胞的特化细胞中，原细菌内共生体中大量存在一种63kDa的共生蛋白称为symbionin(Syml)，它与大肠杆菌中HSP60家族成员陪伴蛋白Cn"oEL高度同源(88．7％相似)，在蚜虫体内称为Syml(StanleyandFenton，2000)。Syml在蚜虫传播植物病毒过程中起着一定的作用(Ishikawa，1984；FulotsuandIshikawa，1992)。Syml能与马铃薯卷叶病毒(PLRV)(Hogenhoutela1．，1998：Vandereta1．，1994)和大麦黄矮病毒(BYDV)结合(Filichkineta1．，1997)，使其避免酶促降解(Hogenhouteta／．，1998)．．1．1．4sHSP家族的生物学特性．sHSP’是一个非常多样的群体，广泛分布于分枝菌和所有真核生物体内。依据它们的DNA序列、免疫交叉反应活性及细胞内定位的不同，可以将其分成至少5个不同的类型(Vierling，1991；Waterset口，．，1996)：其中classI和classH两个类型位于细胞质中，其它3个类型位于细胞器中，分别称为叶绿体sHSP、内质网sHSP和线粒体sHSP．1．2sHSPs的结构和功能sHSPs的分子量大小大约在15到43kDa，与其他类型的HSPs相比，sHSPs在序列，大小和功能上具有最大的变异(deJongeta1．，1998)。然而，几乎所有的sHSPs都含有一个80到100个氨基酸残基组成的保守结构域，称为a晶状体结构域(a-crystallindomain，简称ACD)，它的氨基端和羧基端都具有可变延伸(SunandMacRae，2005)(见图1．1)。 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析bH—termi弛lrt％i帅ot_3iIz；|j；|===；==jIn，阳∞_—·一—————-1卜———+嘲印l‘．’糕l雄辩驸印卵楸坤瘁卵辨·础：铱^t∞∞曩霹媳n脏删群E孵礴蕞垮"毫^5，JllmlPl‘．s--睨剐静鼬u茂硪鲴H置再礓铆托。吣9熨|∞1口，90墩溯P!曩T工叠蜀，碑l肼c^s-’．‘l：；’●：●．‘i：一’I●————_．．．——-◆———◆鼻l阳O"o+c-rFmv．a11lnda-ltln廿j口●—5乒‘I"—啼————-◆—————◆————-．’。’_◆啊啊●pl‘．●nL陀YEEE瞎罕￡VRVl卫口葛VkVV嚣：鞠叮勰蝈∞蜩隧D鬈哟VP曩墨B￡：暑·FV叠丘聃王i|西WVllt塌叩l‘．S懈小渊髓∞j：U“¨叠口z：豆I剐蝴警骥l口菡置鱼工工譬疆，守砌强豇硼l锪霸捃们懈1I’●’。●：‘‘=；：：．-：．●：．：^：=．：："．．：：●：r●●+-————’——————◆———-■’——-——●i口】盯p5囊6即．．IC·tE玎Ij∞1目ctt阻it■t参●卢’睁lo———◆——————啼———"WR明p16．，鲫嚣“韭皇诤∞盘若饲Ⅳ纠蚺誓锄“毒扛V基^l口王日口1量1—粗雪“；。S瞰聃刽堪纠哟舒，工落H渖蒜^置岩一一盘王妇日l并lE-1●’●-●I-●●●-●●t’^●-，’●o_————◆——————’●●·_—◆ⅡlO●一以●1●C图卜IMethanococcusjannaschiiHspl6．5和TriticumaestivumHspl6．9的结构对比(引自SunandMacRae，2005)．(a)M．jannaschiiHspl6．5和7=aestivumHspl6．9的氨基酸序列用CLUSTALW(1．82)软件比对。7=aest／vumHspl6．9的二级结构标注在序列上方，M．jannaschiiHspl6．5的二级结构标注在序列下方．序列上方用粗线标注的为a-crystallmdomain。(b)M．jannaschiiHspl6．5的四级结构。(c)7=aestivumHspl6．9的四级结构。Fig．1·IStructuralcomparisonofM．jannaschiiHspl6．5and7=aestivumHspl6．9．(a)Theaminoacidsequencesofg．jannaschiiHspl6．5and7=aestivumHspl6．9wcrcalignedbyCLUSTALW(I．82)．ThesecondarystructureofT．aestivumHspI6．9isdepictedabovethealignmentandthesecondarystructureofM．jannaschiiHspl6．5isbelowthealignment．(b)QuaternarystructureofM．jannaschiiHspl6．5．(C)QuaternarystructureofT．aestivumHspl6．9．在高级结构中，a晶状体结构域形成一个保守的由两个反向平行的p折叠片构成的13折叠三明治结构(Pdrcz—Moraleseta1．，2009)，这个保守的结构促使sHSPs组装成大4 山东农业大学硕：f=学位论文约800kDa大小的低聚物复合体，正是这些低聚物复合体决定了sHSPs的最主要的功能，即作为分子伴侣去结合那些局部变性的蛋白质来防止它们在极端温度，氧化，紫外线照射，重金属中毒，化学试剂中毒等变性条件下发生不可逆的热聚沉(Reineke，2005)(图1．2)。sHSPs的分子伴侣功能并不局限在应激条件下，在正常的发育过程中sHSPs也参与了多种生理过程，包括细胞生长，分化，凋亡(Arrigo，1998)，膜结构的流动性(Tsvetkovaeta1．，2002)，昆虫的滞育过程(Gkouvitsaseta1．，2008)，还有昆虫的寿命(Morrowela1．，2004a)等。tX蟾__-圈!-2sHSP募聚化与分子伴侣功能(引目SunandMacRac·2005)．’：Fig．I-!sHSPoligomcrizationandcha弘玳min辱1．3sHSPs的研究进展关于细菌，藻类：植物，两栖动物，鸟类和哺乳动物的sHSPs已经有相当多的研究。‘Dmelanogaster的四种主要的sHSPs．Hsp22，Hsp23，Hsp26和Hsp27都已经有了详细的研究。它们之间具有显著的序列相似性，而且在应激条件下具有协调的表达模式，但是它们的发育表达模式以及细胞定位存在差异(Michaudeta1．，2002)。近几年来，多种物种的热激蛋白家族成员被克隆发现，包括Plutellaxylostella，在此研究中，hsp90，hsc70，和hsplg．5三个HSP基因被克隆鉴定出来，结果显示除热激反应外，HSP基因在小菜蛾的发育过程中还参与其他生理功能(SonodaelaI．，2006)：关于Mamestrabrassicae的HSP的研究中，却9D，却加，hsc70，hsp20．7和hspJ9．7五个HSP基因从培养的细胞中被克隆鉴定，此研究结果表明hspZ0可能对于评估镉诱导的细胞应激或损伤具有重要作用(Sonodaela1．，2007)：关于Ceratitiscapitata的HSP的研究中，Hsp27被克隆鉴定并在结构特性和发育表达等方面与Dmelanogaster的Hsp27基因做了比较，5 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析结果表明总体上两个基因的发育表达模式相似，但在特定发育阶段具有重要差异，提示这两种直翅目昆虫的Hsp27基因具有不同的调控模式(Kokolakiseta1．，2008)；Gkouvitsasetal．(2008)的研究中克隆鉴定了Sesamianonagrioides的两个sHSP基因并探讨了在滞育过程中两者的不同发育表达，结果显示这两个sHSP基因在滞育调节中发挥独特的作用；Liriomyzasativa的五个HSP基因被克隆鉴定并研究了它们在低温刺激中的表达以及发育表达，结果表明HSP基因除热激反应外在L．sativa的发育过程中也起重要作用，另外不同的sHSP成员负责不同强度的低温刺激(Huangeta1．，2009)；以及Macrocentruscingulum的四个HSP基因：Hsp90，Hsc70，Hsp70和Hsp23．8也被克隆鉴定出来，该研究结果表明Hsp90，Hsp70和Hsp23．8可能在热激与正常发育状况下具有双重功能，而Hsp70和Hsp23．8在热激状况下能提供更重要的保护功能(Xueta1．，2010)。1．4本研究的目的和意义中华蜜蜂(Apisceranacerana)为东方蜜蜂7．O)室温静置lmin，12，000rpm离心lmin，洗脱DNA。12．为得到更多的DNA，进行第二次洗脱，在柱的中央加入200此预热EB(600C)，或去离子水(pH>7．0)室温静置lmin，12，000rpm离心lmin，洗脱DNA。洗脱出的DNA于．200C保存。2．2．3．2总DNA提取产物的纯化1．加2mL1MNH40Ac，使沉淀溶解。2．加l／3体积的lOMNHAOAc，加2倍体积异丙醇，室温放置lh或过夜。16 山东农业大学硕上学位论文3．10，000rpm离心5min，弃上清，可以看见透明物质(粘稠状)于管底。4．用70％的乙醇漂洗两次，370C干燥。5．加入50此TE缓冲液回溶，并转入1．5mL小离心管中，加入2gLR．Nase于370C处理1．2h，或储存在40C。6．取少量DNA跑电泳，看是否除尽RNA。如果已除尽，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，颠倒混匀，室温，8,000．10，000rpm，离，心5min。7．取上清，转入新的1．5mL小离，心管，力口入等体积的酚：氯仿：异戊醇，混匀，8,000一10，000rpm，离心5min。8．取上清，加入1／25体积的5MNaCl和2倍体积的无水乙醇，．200C放置2h，或过夜储存。9．12，000rpm，离心5min，倒掉上层，用70％的乙醇漂洗2次，370C烘干。lO．50mLddH20回溶。2．2．4AccHsp27．6基因组DNA的克隆根据测序所得目的基因的全长cDNA，设计引物GPl和GP2以中华蜜蜂总基因组DNA为模板进行PCR扩增全长基因组序列，并与cDNA比对分析内含子序列。反应体系如下：10xPCRbuffc目r25mMM矿+．dNTPmixture(10mM)GPi(toopM)GP2(io山Ⅵ)总基因组DNATaqEddHzO2．5止2此l止l此0．25pLUpt025HL反应程序见表2．2。2．2．5,4ccHsp27．65’空白区域的克隆1．中华蜜蜂基因组DNA于37。C用限制性内切酶SspI酶切24h。2．酶切反应结束后，先用等体积的氯仿／异戊醇(24：1)抽提，然后加入1／10NaAC和2×无水乙醇沉淀DNA，溶解于30pLddH20中，浓度调整到5pg／mLz17 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析3．取以上调制好的DNA溶液5pL，在T4连接酶的作用下自连，条件为16。C，12h：4．以连接产物作为模板，PSI和PXI为引物进行第一次PCR：5．取一次PCR反应产物lIJLL稀释50倍，加入稀释产物l此，以其为模板，用PS2和PX2为引物进行二次PCR扩增。反应体系及程序如下：反应程序见表2．2。6．所得片段，回收，连接克隆载体pMDI8．T，转化Ecoil，挑选阳性克隆并送测序。7．测序结果与原有序列进行序列比对和拼接，序列正确，并用引物QSl和QS2进行验证。2．2．65生白区域转录因子结合位点预测．使用转录因子结合位点分析软件TFBIND(http：／／ffbind．ims．u-tokyo．ac．jp)对5’空白区域进行序列分析(TsunodaTandTakagiT，1999)。2．2．7生物信息学分析和系统进化分析1．利用NCBI生物信息学工具(http：／／blast．ncbi．nlm．nih．gov／Blast．egi)检测AccHsp27．6的保守区。2．利用DNAman软件预测AccHsp27．6的开放阅读框以及蛋白质二级结构。3．利用在线3D结构预测工具(http：／／swissmodel．expasy．org／)预测蛋白质三级结构。4．利用ClustalX程序在默认参数下进行多重序列比对(Kokolakiseta1．，2008)。5．利用MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis(MEGAversion4．1)软件的neighbor-joining方法进行系统发育和分子进化分析。18 山东农业大学硕士学位论文2．2．8半定量RT-PCR进行转录水平表达分析设计一对特异性引物来扩增AccHsp226基因的一个片段。内参基因p-actin(GenBank登陆号：XM640276)用来估计各个样品中RNA的量是否相当，内参基因的扩增用的是引物RPI和RP2，反应程序与AccHsp226片段相同。所有样品按照2．1．2中叙述的方法处理，处理结束后立臣l】用液氮冻存，集中提取总RNA，反转录成’eDNA，以eDNA为模板进行PCR，方法参照Wang(2008)。所有PCR反应均重复三次，利用Quantity．OneTM[]像分析软件将AccHsp27．6电泳结果针对内参电泳结果进行标准化，电泳成像系统为VersaD0c4000(Bio—Rad，Hercules，CA，USA)。2．2．9中华蜜蜂室内人工饲养实验与微生物侵染幼虫实验2．2．9．1中华蜜蜂室内人工饲养参照王倩(2009)饲养方法，将1日龄幼虫移到24孔培养板中(预温并在孔内铺有一薄层鲜王浆)，置于相对湿度95％的干燥器中，并将干燥器置于温度340C避光培养箱中进行培养，并饲喂人ZIZ日粮，全程观察蜜蜂生长过程。表2．3中蜂幼虫日粮组分Table2-3ThccompositionofdietwithApis仪；啪ac锄alarva组成新鲜蜂王浆D．葡萄糖D-果糖酵母提取物无菌水累计比例(％)506l37100注l衰中数据为质量百分比；151根殒4"C保存·现用现配．2．2．9．2微生物侵染中蜂幼虫实验在四组(每组10只，分另IJ置于四个培养板上培养)3日龄幼虫的体表分别接种四种细菌(Saureus，Mluteus，及subtilis和户aeruginosa)并饲养至6日龄，用液氮冷冻并于．800C保存。2．2．10表达质粒构建，重组蛋白表达与纯化2．2．10．1实验试剂配制19 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析1．Aer-Bis(29．2：O．8)30％(w～)：29．2gAcr，O．8gBis，加重蒸水定容到100mL，过滤，40c避光保存；2．2x上样缓冲液：O．25mol／LTris—HCI(pH一6．8)，4％SDS(w／v)，20％甘油(v／v)，痕量溴酚兰；3．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：800mL重蒸水力口热溶解2gSDS，加入30．2g"Iris碱，144g甘氨酸，溶解后定容至1000mL；4．考马斯亮兰R250染液：225mL重蒸水溶解1．25g考马斯亮兰R250，225mL甲醇，50mL冰醋酸；5．脱色液：10％冰醋酸；6．1．0MTris—HCl(pH=8．8)：12．1gTris溶于ddH20中，浓HCI调pn值至8．8，定容至l00mL：7．1．0MTris—HCI(pH=6．8)：12．1gTris溶于ddH20中，浓HCI调pH值至6．8，定容至100mL；8．10％APS-lg过硫酸氨溶于10mLddH20中：9．10％SDS：10gSDS溶于100mLddH20中，力口热溶解。2．2．1O．2原核表达载体的构建1．用分别带有XpnI和HindIII酶切位点的引物EPl和EP2扩增．4ccHsp27．6编码区全长，并凝胶电泳分离和回收目的片段：2．用KpnI和Hind111分别双酶切回收的目的片段和pET30a(+)，这样两者就带有相同的限制性内切酶粘性末端，凝胶电泳分离回收目的片段和载体片段，连接，转化EColiDH5a，酶切鉴定并筛选阳性克隆pET-30aa．)一AccHsp27．6。2．2．10．3E．coliBL21原核表达的诱导1．将pET-30a(+)一AceHsp27．6重组质粒转化原核表达菌株BL21(DE3)：2．挑取单菌落，接种到5mL含卡那霉素的LB培养基中，于370C振荡培养过夜：3．取lmL菌液接入10mL含卡那霉素的LB培养基中，于370C振荡培养至OD600=0．2-0．5：4．加入IPTG至终浓度0．5mM，于370C继续振荡培养3h：5．取lmL菌液，12，000rpm离心30sec，弃F-清，加入100此2×上样缓冲液，振荡悬浮，沸水中加热5min，12，000rpm离-心30seC后准备上样。2．2．10．4聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)20 山东农业人学硕士学位论文1．安装好电泳槽；2．按以下体系制备分离胶：30％Acr-BisI．0MTris-HCl(pH=8．8)10％SDSlO％APSTEMEDddH20Tlo协I7．5mL5．6mL0．3mL0．2mL20pL1．85mL15mL加入TEMED并混匀后，立即将分离胶倒入两块玻璃板之间，并马上在胶面上覆盖一层ddH20，保持胶面水平，静置30min至胶完全凝固：3．倒去顶部ddH20，用吸水纸吸干，按下表制备浓缩胶：30％Act-Bis1．0MTris-HCI(pH=6．3)·10*4SDS10％APSTEMEDddH201’o协l加入TEMED并混匀后，立即将浓缩胶倒入两块玻璃板之间，插上样品梳，于室温静冒40min至胶完全凝固：4．取l5“L样品上样：5．加100V电压至溴酚兰刚好跑出浓缩胶；换150v电压至溴酚兰刚好跑出分离胶：6．卸下胶板，将凝胶置于50mL染色液中，于室温染色lh；7．将凝胶取出放入lO％冰醋酸脱色液中脱色，每2．3h更换一次脱色液，至完全脱吡儿L吡也75目日=L3盯矗2J0D0lO0l7l 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析净；-．8．观察是否有差异条带。2．2．10．5目的蛋白的纯化1．收集50mL诱导的培养的Ecoli，将其悬浮8mL在含有10mM咪唑的Nativebindingbuffer溶液中；2．加入80ttL10mg／mL溶菌酶，冰上放置30min；‘3．超声波处理lmin：4．3,000g离心15min，将上清转移到新的离心管中；5．将8mL的上清转移到纯化柱中；6．加入1．5mL预处理的树脂，结合0．5h：7．800g离心2min，弃上清；8．用8mLNativewashingbuffer洗树脂，800g离心2min，弃上清，重复3次；9．用2mL的NativeElutionbuffer洗脱目的蛋白；10．SDS．PAGE检测。2．2．1l重组蛋白的体外分子伴侣活性和抗菌活性检测2．2．11．1体外分子伴侣活性检测本研究通过检测重组蛋白抑制猪心苹果酸脱氢酶(MDH，mitochondrialmalatedehydrogenase)(EC1．1．1．37；mnresco)热聚沉的能力，检验AccHsp27．6是否具有体外分子伴侣活性。3组样品分别置于430C进行孵育(A组为MDH：B组为MDH+AecHsp27．6；C组为MDH+BSA)，牛血清白蛋白(BSA，bovineserumalbumin)用来消除非特异蛋白分子伴侣活性的影响。每隔10min测一次360nnl处的吸光度值，连续测1h(Pdrcz-Moraleseta1．，2009)。2．2．11．2体外抗菌活性检测利用纸盘稀释法检测重组蛋白体外抑菌活性。消毒的纸盘浸透重组蛋白AceHsp27．6溶液后于300C烘干，在LB液体培养基中接种过夜培养的4种细菌Mluteus，&a14reu$，丑subtHis和Paeruginosa，使初始细菌浓度达到106cells／mL，然后均匀涂抹在琼脂糖固体平板上。然后将AceHsp27．6浸透的纸盘贴放在平板上，于370C培养24h。3结果与分析3．1中华蜜蜂AccHsp27．6基因的克隆 山东农业人学坝，1．学位论义3．1．1总RNA提取用TRIZOL试剂盒法提取总RNA，完毕后取1“LRNA上样进行电泳，电泳检测证实提取的中华蜜蜂总RNA较完整(图3—1)。图3-I中华蜜蜂总RNA琼脂糖矬股电泳Fig．3-IAgaroscelectrophorcsisofextractionoftotalRNAinApiscermmcerana3．1．2AccHsp27．6基因中间片段的克隆根据Genbank中已公布的Ap／smellifera，Nasoniavitripennis，和Macrocentruscingulum的sHSPs的保守DNA序列，设计一对特异性引物HPl和HP2(图3．2)来扩展一段大约785bp的片段。以中华蜜蜂总RNA的反转录产物为模板，进行RT-PCR扩增，所得片段大小与预期一致(图3．3)。 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析GCATTTGCATGTAAATAGATGTAATCAATAAGATTAGATTTAATGATAACATTAATGATTTATTGCAACAAATTATGTTTCA——-——————————-——--------·-———---+QSlAGJ^A从TATTGTACTTTATTTTATCTTTCTCTATTATTAAATATATTGGAATTAAATCAAATAATTATATCAAATAAATAATATTAC^TTGTTTTATTTTT从TATGTTATTTTT^ATTATTA^从TTGTTTTGTAGATATCAACAATTTTTTCAAAATAATGTAATGTACGAAATTAATAAAATTTAATTATTTTGTTAATTTCAAGAATAAATATAAAATTTTTAATTTTATAT·····-⋯⋯GTTAGTGAAGCATTTAAATTAATT^=TATTCGGAAAGTGGGG从ACATT啵T^Ac从CAT从^CT^C^GTTTG№c衄；毒瑟。≯可匠亘互二‘QS2AATTGGTATTGAA从TACTTGC^C^黼CATTAATACCAATGMGTTTTCCGACTGGTGGGAAGATCTAGACCGACCTCATCGTCTTTGGGATCAGCATTTTGGCACAGCAATAGATCTAGMGATTTTAAC．GATCTAGATTCACTTGGTTCAGAAGTTCTGCTATATCGACCACATAAACGCGGc从从G^CATCATCGTcAT从TCATCATCcATTTTTG从GGCTTTc^^C从从GGCATGGTCGTGGTACATCAACTGTTCAAGCTGATAAAGAOAAATTTC^^GTGAC^TTGG^TG"汀C^C从TTTGCAccGG^GG～认TTACTGTTAAAGTAATAGATCAGAAAGTCGTCATCGAAGCTAAACACGAAGAAAAAAGGGAT附CATGGTT∞GT^TOcA卧CAATTTATCAGA^^ATATATTAT^CCGTC^CAATGTG^TATC从TC从GTAGAATCAC^TTTGTCTTCCG^OGGT^TCTT^TCAMTACGGCACCAAGAAAAGAACCTTTACAATCTAGATC从^T矾G加从cAGTG从G垒TAcATTATAcG∞T卧ACc^∞TTTG^CT从TTTTG^TGATTGTTC^从TG^∞TTTcT趴ATC^G从从能从CAAC从ATT∞^c^^cG觚从c^^TCAc^ATCACAACAGCAAAATCAGCAATTACAAAATCAC-CAACATCAACAACATCAGCGTTG!从M丛GGc^GT丛些垒!垒!苎塑坠!_______-·__-_____--_I______o-_o●o-l______-o-__l__-_ooooooooor’PSIPS2HP2EP2GP23P2G幅讯1G讯弋讯1lH、ⅥⅪ11弋c讯饥1¨、1Ⅺ1^心1Ⅵ入讯11n1C髓∞隅黼硪蝎蜗入Ⅺ弋、心黼吣1Ⅺh●～～嗡峨弋讯瓯¨硪趴1【瞄峨鼠峨讯、悯弋、阮峨镐献黼喁惝”、¨抽抵Ⅺ粥^Ⅺh氏心心、舒m入●●————-——-———-——。。。’’。。。。。。一oP2ATTATTTCTTTAATAAAGTAATAAAGAAACTTTATTTGATTTAAA溅’图3-2中华蜜蜂dccHsp27．6基因的核酸序列与引物示意图。cDNA序列下方表明了引物名称和方向·Fig．3-2NucleotidesequenceofAccHsp27．6andprimers．TheeDNAsequenceisindicatedonthetopline，andthenamcsofthepfimcrsandtheircorrespondingorientationsarcshownOnthesecondline．2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3-3中华蜜蜂AceHsp27．6中间片段的PCR扩增电泳图Fig．3—3IsolationofmiddlefragmentofAccHsp27．624 山东农业人学硕’Ij学位论文3．1．3AccHsp27．6基因3。片段的克隆根据已经获得的中间片段的序列，设计特异引物3PI，与公共引物B26组合进行PCR，然后以该PCR产物为模板，以引物3P2和B25进行巢式PCR，扩增得到一条约244bp的片段(图3—4)。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3-4中华蜜蜂AccHsp27．63。片段的PCR扩增电泳图Fig．3-4Isolationof3’fragmentofAccHsp27．63．1．4AccHsp27．65’片段的克隆根据已经获得的中间片段的序列，设计特异引物5P1和5P2，以纯化加尾的cDNA为模板，分别用5P1和AAP，5P2和AUAP为引物进行巢式PCR，进行5’RACE，扩增得到一条约16lbp的片段，与预测片段大小相符(图3—5)。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3-5中华蜜蜂AccHsR27．65’片段的PCR扩增电泳图Fig．3-5Isolationof5’fragmentofAccHsp27．63．1．5AccHsp27．6全长cDNA的克隆根据已经获得的中间片段序列，3’片段序列和5’片段序列以及重复序列，拼接得到 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析了AccHsp27．6的全长eDNA序列。根据拼接序列，设计一对特异性引物QPl和QP2，扩增得到了1014bp的全长cDNA序列(图3．6)。2000bp1000bp7：50bp500bp250bp100bp图3-6中华蛋蜂AccHsp226eDNA全长片段的PCR扩增电泳图Fig．3-6IsolationoffullIcngIlIeDNAofAccHsp27．63．1．6AccHsp27．6基因基因组DNA的克隆根据已经获得的eDNA序列，设计引物GPI和GP2(图3．2)进行基因组全长的扩增，获得AccHsp27．6基因基因组DNA序列，分析发现AccHsp27．6基因不含内含子。3．2AccHsp27．6基因序列分析3．2．1AccHsp27．6eDNA全长序列分析利用DNAman软件对AccHsp27．6的全长eDNA序列进行分析，结果显示AccHsp27．6的：：DNA全长为1014bp，包括708bp的开放阅读框，76bp的5’非编码区(5’UTR)和223bp的3’非编码区(3’UTR)(图3-2)。该基因编码一个236个氨基酸残基的多肽，预测分子量为27．6kDa，等电点为7．53。3．2．2氨基酸序列分析及蛋白质结构分析3．2．2．1同源结构域搜索NCBI保守区搜索显示，在AccHsp27．6的氨基酸序列中含有后生动物a晶状体型sHSPs的Q晶状体结构域(a-crystallindomain，ACD)，它的存在提示了AccHsp27．6基因属于sHSPs家族。3．2．2．2二级结构分析二级结构分析显示，在AccHsp27．6的氨基酸序列中，a螺旋结构的含量为10．55％，这正是sHSPs结构特性(Augusteyn，2004)；在AccHsp27．6的二级结构中B折叠的出 tlI东农业人学坝Ij学位论文现非常频繁，这与先前研究报道t}J提到的sHSPs：：二级结构中富含B折叠是相一致的(de．10ngela1．，1998)：除此之外，在整个AccHsp27．6的氨基酸序列中只含有2个半胱氨酸，这与FuP，a1．(2003)的报道是相一致的，其中提到在分子伴侣蛋白的氨基酸序列中半胱氨酸残基的数量显著少于其他蛋白家族成员。3．2．2．3三级结构分析本研究还分析了AccHsp27．6的三级结构，在PDB数据库中humanalphaBcrystallin(PDBcode：2WJ7)模型是AccHsp27．6蛋白同源模型建立的最佳模板(图3—7)。此模型包含大约94(67残基到157残基)个氨基酸的一条多肽链。在3D结构中，包含188个残基的保守0t晶状体结构域富含p折叠条(13一strands)，它们组织构成“13折叠三明治结构”(13-sheetsandwich)。这些13折叠是sHSPs基本的结构单位(SunandMacRae，2005)并且有助于二聚体结构的形成和随后的sHSPs的低聚反应。Front图3．7a晶状体结构域67残基．157残基的三级结构SideFig．3-7Thetertiarystructureofct-crystallindomainresidues67·157．3．2．2．4氨基酸多重序列比对预测的AccHsp27．6氨基酸序列与McsHSP(34．cingulum，GenBank登陆号EU624206)和NvHsp21．7(Ⅳvitripennis，GenBank登陆号XP001604512)分别显示出43．88％和44．07％的相似性。蛋白序列比较(图3—8)显示AccHsp27．6含有两个显著的保守区(图3．8)。除包含ACD的保守区外，氨基端部分最开始的27个氨基酸残基具有相对较高的同源性，并且这个区域是高度疏水的，可能与调节低聚反应，亚单位动力27 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析学，底物结合有关。某些sHSPs的f氐聚反应和结合过程受氨基端影响，但不是全部(SunandMacRae，2005)。通常，氨基端的延伸在长度和序列上是可变的。然而，根据Kokolakisetal．，(2008)的报道，Drosophila，medfly和Sarcophagacrassipalpis的HSP27比对中，最开始的氨基端只有14个氨基酸疏水性较高并显示出57％氨基酸序列同源性。类似的疏水结构域在Dmelanogaster的Hsp23和Hsp26中也非常保守，但在Hsp22中却不保守(Southgateela1．，l983)。AccHsp27．6在氨基端相对较高的同源性提示了sHSP在结构和功能上的保守性。-垡-，．-JL—AccHsp27．6MSLIPMMFSDWWEDLDRPIIRLWDQHFOTAIDLDDFNDLDSLGSEVLLYRPHKRGKRIIIIRHMcsHspMSLVPLLFSDWWADLDRPIIRIFDQDFGLGLRPEQLL^PEML一一ERYLVPLERP—RRSALNNvHsp21．7MSLVPLLFSDWWEDLDRPHHLLDQDFGLGIHPEQLLTPQRL一一EQYLIQPQR一一KRYPLN．且．．e。．．旦。。．g⋯e⋯⋯．e⋯．．AccHsp27．6NHHPFLKAFNKRHGRGTSTVQADKDKFQVTLDVSOFAPEEITVKVIDOKWIEAKHEEK磺McsHspYYRPWAQLAQRGDTG-TSTVNAGKDKFQVILDVQQFKPEEIDVKWDKFvVVEAKHEEKPNvHsp21．7YIRPWAELLRSADKGGVSTVEADKDKFQVTLDVQQFKPEEIDVKWGKHVVVNAKHEEKR：木：：．．木掌事：木．主兰圭圭圭主兰圭圭。兰圭主主主圭主主主：．：主圭：：圭烹圭兰主兰．．⋯P．．．．．．g⋯E．．．．．莹．．．⋯量．．．AccHsp27．6移EHG吖SRQFIRKYIIP夸OCDINQVESHL"SS}莎．GILs工TAP燃EFe笱gl国NERTVl(vHY’嚷McsHspDEHGFISRQFIRKYMIPEQCNIDEVQSSLSSDGVLTITAPRKETPKVE—NERVVKIEHTGNvHsp21．7DEHGWISREFTRKYLIPEQCDIDQVSSKLSSDGVLTILAPRKDIQPKLE．：NEKVIKIEHTG兰兰圭兰：：兰耋：主兰主兰：主主．兰兰：主：：兰．兰兰主兰兰主：主：耋圭兰主木：：．宰掌：．：誊：．：掌宰AccHsp27．6McsllspNvHsp21．7重p^LTNFDDssNDvsEsQi}譬石QIPQREQsQsoQQNQQLQNQQ再蚕葫丕jicKKGsKGvKPAIR⋯一⋯一一ENCEKECKKVECKKDAKKDEKSAGKK⋯一KPALK一：宰宰：一AKEEVE一：宰：KKDKK---Id∞tityI∞’‘43．8渤●．．07％图3-8和豇cera舢lcProl幽i,Macrocerdr埘cingulum和Nasoniavitripennis的sHSP同源染色体之间的氨基酸序列比对·星号，双点和单点分别表示完全保守残基，保守程度较高的残基和保守程度较低的残基。保守区域以灰色显示．ACD以下划线表示．序列末端显示了相对于AccHsp27．6的相似度．序列上方标注了AceHsp27．6二级结构的分配．Fig．3-8AminoacidsequencecomparisonofsHSPhomologsfromApiscerarmcerana，Macrocentruscingulum，andNasoniavitripennia．Theasterisks,doubledots,andsingledoLsdcnotcfully,strongly,andwoaldy∞nscrvcdresidues,respectively．Theconservedregionsarcshowningray．Thea-crystMlindomainisunderlined．ThcdegrecofidentityrelativetoAccHsp27．6isshownattheendofeachsequence．Thesecondary$tFuIctBr@assignmentoftheAccHsp27．6isshownabove3．2．3AccHsp27．6基因5’空白区域的克隆与转录因子结合位点的预测为了研究AccHsp27．6的表达调控，我们利用反向PCR的方法克隆了它的5’空白区域，获得转录起始位点前1376bp的DNA片段(GenBank登陆号：JF317273)。利用TFBIND软件搜索转录因子结合位点，结果检测到7的HSE和3个NF．r,B结合位点。 山东农业大学硕士学位论文此外，。个位于转录起始位点之前代表核心启动子元件的TATA．BOX也被检测到(图3．9)。ATTGTTTTGTAGATATCAACAATTTTTTCAAAATAATGTAATGTACGAAATTAATAAAATTTA-1314ATTATTTTGTTAATTTCAAGAATAAATATAA从T丁TTT^AT丁丌ATATTT丌TCTTCACATTT^T^AATGT-1243AAATGATGTTCCATATAATTTAAAATA^^TTTG^^^^CT^TTT^TTTATACTAT^ACACATTTTCACATA-1173ATCCTCTATTATAlTT^AAATlTT下TA^TTTTTTTT^1TG下TT^CCATACGAATT6．工Q166工IL匹王ⅡTTT-1101NF．姬HSE^圃rTG哐巫巫圃AATATATGTTAATTATTACAATTATATATAATAACAGAAAAAAA-1032AATATACAGTTTATTTTCCAA^TATTTATACATTC^ACATTT^TTTT^A^TTCTATTCT^^TTTCTATG^A．961ATAT^T^^ATATCAAAATAATTT^TT^^GTTCAAAAl1"TAATAACCTTTAAGTGAAAA^TTTT^AGAAA-892HSETc区夏亘巫三囵cAAT^cGcTTTTAT^^^^TGTT^TT^^TTTTTATTT^TTAA^TTT^TTATT^^GTGTTA·821TAl．AATT^AAGAATTATAGAA"ITCTATTAAT^^^^A^TA^^TAG^ATT^^^TTTTTT^TCTTTTTTCTTA-75lTC^TTTTG^^G^TG^TTT^TTGAT^1．TT^^^G^T^TG^TT^TTT^TCTGA^^^TT^^AA^C^T^TT^TT^-68ICTTrr^^GTTT^TG^T^A^GC^T^TT^^^C^T^TT^C^TTC^TG^TTCATGACAAA^T^T1．GTGC^^T^T·6IlT^TT^T^TTATGCGTATATTATATAC^^TCATATCATATCAAAAGATTTTATAAAATATT^TAATTT^TT-54ITCT^TCHSE^TTTG^C^TCT^^^G^C^TTCTT^^GCGGTTT^CGTTAAAGAACTTGTTCTT^T．47lATTAGAATAGATATACATAGTAACACAGTTTTC^T^GACAGTGGCGTAAAACATAAAACGTACATGCT-403^TGGTT^^GTT^CGTT^T^TTGCGCAAGTTGCT^T^C^^^^CTGATCT^^G^TACG^^^^CG^CGATTG-334TGTTC^^GGGC^^CTCGAC^TTtTCHSENF．kBTCCCCACCATTTT-264CCTT^GTGCGC^ACAA^T^TGTAT^AAAGAOTACT^CCT^GTTOCCG^C^GTTG^TGTCGACGT^TG^^·l够CGATATAACAGTACGACGATTAATCAGCTGCAAATAAATCAGTAATTTATACGCGTTTCATAAAATTAA．176TT^C^^^GGTA^^GCTATA．BOX+lTTTGTT^GTG^^Gc^TTT^^^TTA苎!!垒：垒二!gGGAAAGTGGC拍·57AAACATTCCTAACAACATAAACTACAGTTTGAATTGGTATTGAAAATAC"ITGCACA△工g图3-9AccHsp2L6基因5’空白区域的核酸序列和假定的转录因子结合位点．图中转录起始位点和翻译起始位点分别以箭头标注．下划线部分表示假定的NF．KB结合位点．方框部分表示假定的HSEs．TATA-box以淡灰色突出显示．Fig．3-9ThenucleotidesequenceandputativetranscriptionfactorbindingsitesoftheY．flankingregionofAccHsp226．Thetranscriptionandtranslationstartsitesfireindicatedwith鲫arrowhead．TheunderlinedsectionsindicatetheputativeNF·t：Bbindingsites,andtheboxesindicatetheputativeHSEs．TheTATA-boxishighlightedinlightgray．3．3系统进化分析为了研究不同昆虫sHSPs之间的进化关系，我们利用MEGA(version4．1)软件构建了一个系统进化树，所有用到的氨基酸序列都来自GenBank。如图3-10所示，同一 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析目的昆虫sHSPs比其他目中的昆虫同源sHSPs在系统进化关系上更亲密，然而在此系统进化树中有一个包含若干种不同目间的昆虫sHSPs同源簇存在，提示了这些sHSPs在物种分化前已经进化了(Kokolakiseta1．，2008)。卜卜—。。’’一1n2图3．tO不同昆虫物种(双翅目，膜翅目和鳞翅目)的sHSP氨基酸序列的系统进化分析．其中所有基因的物种全名和登陆号见附录Fig．3-i0PhylogcncticanalysisofsHSPaminoacidsequencesfromdifferentinsectspecies(Diptera,Hymcnoptcra,and1．．cpidoptera)．3．4,4ccHsp226基因的发育表达模式和组织特异性表达模式为了研究AccHsp27．6基因的发育表达模式和组织特异性表达模式，我们利用半定量RT-PCR检测了不同发育阶段和不同组织的mRNA堆积量。如图3．1lA所示，从2日龄至5日龄幼虫期AccHsp27．6的表达水平显示出逐渐减少的趋势，接着在6日龄有一个显著的提高。相同的表达模式在蛹期也非常明显，白眼蛹到粉眼蛹有一个快速的衰减期，随后在黑眼蛹期又有一个显著的提升。在新出房的成蜂中，AccHsp27．6的表达量较低，而在10日龄的成蜂则达到表达量最高峰。,4ccHsp226的空间表达模式分析显示 山东农业人学硕二I二学位论文它的转录量在胸部和腹部较丰富，而在头部较缺乏(图3—11B)。AAccttsp27．6p—actin3兰2．5暑2整1．5嚣l‘昙O．5L0Differentdevelopmentalstages2d4d5d6dpwPPpdal0Diffcrenttissuesheadthoraxabdomen舭脚"s■—■基墨曼置headthoraxabdomen图3-lldccHsp27．6不同发育阶段和不同组织的表达模式。A：,4ccHsp27．6不同发育阶段的表达模式。分别从幼虫(2d．2口龄；4d·4口龄：5d·5日龄：6d-6日龄)，蛹(pw．白眼蛹；pp．粉眼蛹；pd．黑眼蛹)和成蜂(a1．i日龄出房成蜂；alO·lOEI龄出房成蜂)提取总RNA。AccHsp27．6的整个发育过程的转录水平都被检测。B：AceHsp27．6不同组织的表达模式。分别从12kl龄成蜂的头部，胸部和腹部提取总RNA。半定量RT-PCR用来检测不同条件下的转录水平，fl-actin基因用作内参基因，柱状图表示相对表达水平，y轴的值表示相对于fl-actin基因的表达水平，x轴的值分别代表不同的泳道。Fig．3-llExpressionpatternsofl4ccHsp27．6atdifferentdevelopmentalstagesandinvarioustissues．A：ExpressionpatternsofAccHsp27．6atdifferentdevelopmentalstages．TotalRNAwasisolatedfromlarvae(2d-secondinstars,4d-fourthinstars,5d-fifthinstars，and6d-sixthinstars)，pupae(pw-white-eyedpupae，PP-pink-eyedpupae，andpa·dark-eyedpupae)。andadults(al·onedaypost-emergenceadultsanda10-tendaypost-emergenceadults)．ThetranscriptsofAecHsp27．6wcl"edetectedthroughouttheentiredevelopmentproce鹞．B：ExpressionpatternsofAccHsp226invarioustissues．Tota．1RNAwasextractedfromthebrain，thoraxandabdomenoftheadultbees(12d)attheindicatedtimes。andsemi-quantitativeRT-PCRwasusedtoexaminedthetranscriptlevelofl4ccHsp27．6underdifferenttreatments．Thefl-actingeneWasusedas811internalcontr01．Thehistogramsindicatetherelativeexpressionlevels．ValuesOnthey-axisarethenormalizationunitsrelativetofl-actinlevels．Inaddition，thevaluesonthex-axisrepresentthelanes．3．5AccHsp27．6基因在非生物条件刺激下的表达模式sHSPs是热刺激和其它刺激反应的产物。先前的研究已经报道sHSPs在高温，氧化刺激，紫外线照射和化学试剂中毒状况下具有保护功能(Reineke．2005)。在这些结论6S432●00O0O一。》。一c。一坼∞。-(I一。u一，一一再一舢-I 中华蜜蜂小分了热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析提示下，我们检测了AccHsp27．6对不同环境刺激的反应。本研究中，12日龄成蜂经受热刺激，氧化刺激(紫外线照射和H202刺激)和以一系列化学试剂刺激(农药，C02，SO，，甲醛，乙醇，丙酮和氯仿)。如图3．12所示，热刺激下AccHsp27．6转录水平在2h快速达到最高水平在4h下降。紫外线照射处理只能诱导AccHsp226转录水平在4h产生微弱的提高。H202刺激下AccHsp27．6转录水平在2h达到最高。转录水平针对4种农药刺激发生了不同的反应引起了我们注意。在蚊蝇醚和菊酯处理使水平下调，然而辛硫磷和叮虫脒却使其显著上调，并分别在3h和1h处达到最大表达量。其它的化学试剂包括S02，甲醛，乙醇，丙酮和氯仿均能诱导AccHsp27．6转录达到不同的水平，相反C02刺激抑制其转录几乎达到零表达。(KI245h4cc脚276C=‘=】==Z=，C=a,tcnnC=—=，=jE=■jD!。I，i．iCK2535h、叫¨刀一==E=墨=Z=■=昌p—m‘=‘=誓=，=—巴jCKJ245hActlfsp276E置■雹■墨墨【=，曩■[jactin==●=，C=，=j■=，ECK123hAceHsp226C=，C=】匕=】口口一actin‘=，C=，C=jE=j㈨萋毒㈨CK253h^。。H，，276I：：：：：IlllllllIIIlIIlIlIllp⋯a===Z=C：Z：jFCKl】．523hAcctlsp276=—ijE|；】==胁mE，皇—Ej—昌—詈‰㈠k熊㈨(’Kf)5123hp。iii王二王=盈。i二====‘=‘=口；．II·CKCO：SO：lAalcace[chl—m，2Ⅵ置—■■=】=】===：口口Jct：n‘=Ej=j二j=====，：一．1lc．．|l_．32b弛啪B5n2．KmC2曲m，岫KIC 山东农业大学硕士学位论文幽3·12AccHsp27．6基迭I在非生物条件刺激下的表达模式．分别从经过不同时间不同条件处理的12日龄成蜂提取总RNA(A·热刺激；B，紫外线照射；C·HzO=刺激；D·蚊蝇醚：E，菊酯；F，辛硫磷：G，叮虫脒：H，有害化学试剂)·利用半定量RT-PCR检测AccHsp27．6在不同条件处理下的转录水平．FA．甲醛；alc．乙醇；acet．丙酮；chl．氮仿·B-actin雉因用作内参姥因。CK表示空白对照，柱状图表示相对表达水平，y轴的值表示相对于p-actin基因的表达水平，x轴的值分别代表不同的泳道．·Fig．3-12ExpressionprofilesofAccHsp27．6underabioticstress．TotalRNAwasextractedfromadultbees02d)treatedattheindicatedtimeswithheat(A)，UVin"adiation(B)，(C)’pesticides(D，Pyriproxyfen；E。Cyhalothrin；F’Phoxime；GAcetamiprid)，andhazardouschemicals(H)．Semi-quantitativeRT-PCRWaSusedtoexaminethetranscriptlevelsofAccHsp27．6underdifferenttreatments．FA,formaldehyde；ale，面cohol；acct,acetone；chl，chloroform．The卢-actingenewasused丛锄internalcontr01．ThelineCKindicatesthecontr01．Thehistogramsshowtherelativeexpressionlevels．Thevaluesonthey-axisal"ethenormalizationunitsrelativeto卢actinlevels．inaddition,thevaluesonthex-axisrepresentthelanes．3．6中华蜜蜂室内人工培养与微生物侵染幼虫实验．本实验室已成功实现对中蜂幼虫的人工培养，1日龄幼虫至出房成蜂的成活率达到50％以上(图3．13)。细菌性幼虫病严重影响蜂群的发育，蜂产品的质量以及养蜂业的收益。&aureus，只aeruginosa和膨luteus是自然界环境中广泛存在的条件致病菌，而Asubtilis能刺激动物免疫器官的发育。为了研究Hsp27．6是否与免疫系统有关，在本研究中我们利用这4种自然界中普遍存在的细菌侵染人工饲养环境下的3日龄幼虫，并培养至6日龄后利用半定量RT-PCR检测其AccHsp27．6基因的转录表达水平。如图3．14所示，&aureus和Mluteus口-ff[以诱导AccHsp226基因的转录表达，相反最subtilis和只aeruginosa可以抑$1IAccHsp27．6基因的转录表达，这些结果预示在蜜蜂抵抗微生物入侵时AccHsp27．6起重要作用。33 中华蜜蜂小分予热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析一Al门司乙153．13中华蜜蜂幼虫室内人工饲养。A，2日龄幼虫；B，4B龄幼虫；C，5日龄幼虫-Fig．3-13RearingofApiscerarlDcerar船larvaeinvitro．人2-day-oldlarvae；B，4-day·oldlarvae；C，5-day-oldlarvae·Microbeinfe；ctionCKSAM[LBSPAAceHsp27．6E—巴，=卫冒l墨[}-actin21．81．61．41．21O．8O．60．40．20CKSAMLBSPA图3．14爿cc胁棚7．6基因在微生物侵染条件下的表达模式。SA·．S_oureu$；ML·／14．1uteus；BS·B．subtile；PA—P口Prugin∞口。24孔板中培养的3日龄幼虫体表接种菌株并继续培养至6日龄。分别提取总l喇A-利用半定量RT-PCR检34 山东农业人学颂．}：学位论文删爿cc，，印27．6的转录水3卜·∥’口c，加基因用作内参捧凼，CK表示空白对照，柱状图表示相对表达水sF-，y轴的值表示相对十声一口c，m幕因的表达水、|，．x轴的值分别代表不同的泳道。Fig．3-14ExpressionprofilesofAccHsp27．6inresponsetomicrobeinfection．SA，S．aureus；ML．Mjluteus；BS。B．subtilis；PA．尸aeruginosa，The3-day’oldlarvaefedinthe24一wellplateswereinoculatedwithmicrobesandmaintaineduntiltheywere6daysold．TotalRNAwasextractedattheindicatedtimes，andsemi．quantitativeRT-PCRwasusedtoexaminethetranscriptlevelsofAccHsp27．6．The伊actingenewasusedasaninternalcontr01．ThelineCKindicatesthecontr01．Thehistogramsshowtherelativeexpressionlevels．Thevaluesonthey-axisarethenormalizationunitsrelativetofl-actinlevelsInaddition，thevaluesonthex·axisrepresentthelanes．3．7重组蛋I兰lAccHsp27．6的表达与活性检测3．7．1重组蛋白AccHsp27．6的表达AccHsp27．6基因作为6XHis—tagged融合蛋白在EcoliBL21菌株中表达。37。CIPTG诱导以后，SDS-PAGE分析检测到符合HSP27．6．6XHis融合蛋白的条带(图3．15，lane3)。在未经诱导的空白对照中，没有明显的条带(图3．15，lane2)。这表明爿cc月印27．6基因成功表达，同时经试剂盒法纯化获得纯化Hsp27．6．6XHis融合蛋白(图3．15，lane1)。23M(kDa)糊——97．2-——66．444．3—-"—吵’_．一噌≯-----36kDa_岁——29．Okit3-15SDS·PAGE分析AccHsp27．6重组蛋白在Eco“中的表达与纯化．Lane1．纯化的AccHsp27．6重组蛋白lLane2，35攀撼：蓑 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析来诱导西株；Lane3，诱导菌株；LaneM，蛋白质Marker．Fig．3-15ExpressioninEcoliandpurificationoftheAccHsp27．6recombinantproteinaSanalyzedbySDS·PAGE．Lanel，purifiedAccHsp27．6recombinantprotein；Lane2，non·induced；Lane3，induced；LaneM，molecularmassstandard．3．7．2重组蛋白AccHsp27．6体外分子伴侣活性的检测利用MDH热聚沉分析法分析重组蛋I兰tAccHsp27．6的体外分子伴侣活性。如图3．1|6所示，在43。C进行孵育时，MDH在360am处的吸光度不断升高，发生明显的热聚沉反应(Pdrez-Moraleseta1．，2009)。另外，当MDH与无分子伴侣活性的蛋白BSA混合时热聚沉的速度更快。然而，当添加等量的重组蛋AccHsp27．6时，几乎可以完全抑制MDH的热聚沉。因此，重组蛋白AccHsp27．6具有显著的体外分子伴侣活性。010ZO3040如60Time(min)图3．16MDH热聚沉法检测AccHsp27．6的分子伴侣活性．MDH(◆)，MDH+A∞Hsp27．6以摩尔比率lll混合(●)和MDH+SBA以摩尔比率l：I混合(●)于430C孵育，每10min检测一次360am处的吸光度，连续测Ih．Fig．3·16Molecularc呐oncactivityofAccHsp27．6shownbythemalamdchydrogenasethermalaggregationassay．MDHw髂heatedat430C(◆)；mixedwithAccHsp27．6inamolarratioI：1(■)：甜mixedwithBSA(I：I)(●)．,adDsorbanccw舔monitoredat360nmatrggularintervals(iomin)forIh．3．7．3重组蛋白AccHsp27．6体外抗菌活性我们利用纸盘稀释法研究了具有生物活性的重组蛋I兰IAccHsp27．6的体外抗菌活性。如图3．17所示，重组蛋白对＆aureus，Mluteus，且subtilis和Paeruginosa显示出显著的抗菌活性。另外，与重组蛋l兰tAccHsp27．6采用相同的纯化方法的蛋[刍AecCPR26作为阴性对照消除6XHIS标签的影响以及在纯化过程中的毒性累积，如图3-18所示，AecCPR26并无显著抗菌活性。 山东农业人学硕一I：学位论文图3-17纸盘稀释法检测AccHsp27．6的体外抗菌活性．A，S口l艘时；B，Miute埘：C，且subtili#：D，Paeruginosa。I，2倍稀释的AccHsp27．6蛋白溶液：2，5倍稀释的AeeHsp27．6蛋白溶液；3，10倍稀的AccHsp27．6蛋白溶液；4。阳性对照((卡那霉素，250mg／mL)：5，阴性对照(BL21(DE3)Ecolt总菌体蛋白溶液)：6，PBS：7，原始浓度的纯化AccHsp27．6溶液(0．5mg／mL)．Fig．3-I7AntimicrobialactivityofAccHsp27．6shownbythediskdiffusionmethod．A"&aureus；B，Mluteus；C。最subtili#；,D，Paeruginosa．I。2-folddilutionoftheAccHsp27．6proteinsolution；2，5-folddilutionoftheAccHsp27．6proteinsolution；3．10-folddilutionoftheAccHsp27．6proteinsolution；4。positivecontrol(kanamycin，250mg／mL)；5，negativecontrol(thetotalproteinfromBL21(DE3)Ecoti,0．5mg／mL)；6。PBS；7，theoriginalconcentratedsolutionofpurifiedAccHsp27．6protein(0．5mg／mL)37 中华蜜蜂小分予热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析图3-18AccHsp27．6抗菌活性的补充实验·A，&口鹏埘；B·膨luteuasC·且subtilis：D，Paeruginoaa·K·卡那霉索(250mg／mL)A，氨苄西林(250mg／mL)：1＆2，纯化的AccHsp27．6蛋白溶液(0．5mg／mL)：3，纯化的．AccCPR26蛋白溶液(O．5mg／mL)。FIg．3—18Theadditionalcxpcrin帖mtofantimicrobialactivityofAccHsp27．6．^Saureus；B，Mluteus；C：且subtilis；D，尸aeruginosa．K，kanamycin(250mg／mL)；A,ampicillin(250m咖I·)；I&2，purifiedAccHsp27．6protein(O．5mg／mL)；3，purifiedAccCPR26protein(O．5mg／mL)．4讨论虽然昆虫中sHSPs的分子生物化学特性被广泛的研究，但大多数研究集中于模式昆虫物种，比如D．melanogaster。然而在中华蜜蜂(Apisceranacerana)中sHSPs还没有被报道过。本研究初次证明中华蜜蜂中sHSPs的存在及其与各种环境刺激(非生物性和生物性)的相关性。我们的实验结果(包括中华蜜蜂sHSP基因的克隆，鉴定以及表达模式研究)提示sHSP在抵御各种逆境条件刺激的反应中起重要作用。4．1AccHsp27．6是sHSP家族成员在克隆得到基因序列后，我们通过保守结构域检索，氨基酸序列同源比对，二级结3R 山东农业大学硕士学位论文构分析，三级结构分析等方法鉴定该基因属于sHSP家族，并根据常用的命名方法将其命名为AccHsp27．6。4．1．1AecHsp27．6序列中包含sHSP家族保守结构域利用NCBI保守结构域搜索工具检测到AccHsp27．6序列中包含sHSP家族保守结构域(It晶状体结构域。4．1．2AccHsp27．6氨基酸序列与已鉴定的sHSP基因具有较高同源性预测的AccHsp27．6氨基酸序列与McsHSP和NvHsp21．7分别显示出43．88％和44．07％的序列相似性。除Q晶状体结构域所在的显著的同源区域外，在氨基端还具有一个比较显著的27个氨基酸残基的同源区域，并且与先前报道相符合，该区域具有高疏水性。4．1．3AccHsp27．6具有典型的sHSP家族的二级结构和三级结构二级结构分析显示，a螺旋结构的含量较少，然而p折叠的出现非常频繁，同时氨基酸序列中仅含2个半胱氨酸，这些特征都与先前报道想符合。：三级结构数据库(PDB)中可以检索到三级结构模型humanalphaBcrystallin(PDBcode：·2WJ7)，模型中具有伴侣蛋白典型的“B折叠三明治"结构。4．2A"ecHsp27．6在中华蜜蜂响应环境刺激的反应中起保护作用4．2．1AccHsp226基因存在HSEsHSEs是可以被热激因子(heatshockfactor，HSF)识别的DNA序列，HSFs是负责HSPs压力条件表达调控的转录因子。HSEs是HSP基因转录最关键的元件。在AccHsp27．‘6基因的5’空白区域，我们检测到7个假定的HSEs。先前有关DrosophilaHsp22基因启动子的研究表明，3个功能性的HSEs对于Hsp22基因压力条件的适当表达是必需的(Morrowela1．，2004b)。HSE是否负责AccHsp27．6基因的热诱导还未确定。4．2．2AccHsp27．6基因在转录水平上响应各种环境刺激sHSPs可以作为分子伴侣保护蛋白，防止其在高温压力下发生变性，而且在其他的压力条件下比如低温，干旱，氧化，高渗透压，重金属甚至高群体密度等也具有保护功能(Lieta1．，2009)。在本研究中我们利用半定量RT-PCR分析了．4ccHsp27．6基因在非生物刺激下的表达模式。结果显示AccHsp27．6基因可以被热激和H202处理显著诱导，农药辛硫磷和叮虫脒，化学试剂S02，甲醛，乙醇，丙酮，氯仿的处理也有类似的结果；然而C02和农药蚊蝇醚和菊酯却可以抑制基因的表达量。 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析4．2．3AccHsp27．6重组蛋白具有显著的体外分子伴侣活性‘‘先前的报道中指出，Gt晶状体结构域的存在并不能确定该蛋白一定具有分子伴侣活性，实际上有的sHSP氨基酸序列中含有a晶状体结构域却并不具有分子伴侣活性(Kokkeeta1．，l998)。因此本研究利用抑制猪心苹果酸脱氢酶热聚沉的分析方法检测了AccHsp27．6重组蛋白的体外分子伴侣活性，结果显示AccHsp27．6重组蛋白可以显著抑制猪心苹果酸脱氢酶的热聚沉反应。4．3AccHsp27．6在中华蜜蜂免疫防御机制中具有潜在的功能昆虫缺乏完善的免疫系统，昆虫的防御机制主要依靠先天的免疫反应。过去lO间大量的研究表明HSP可能是潜在的先天免疫系统激活剂(Wueta1．，2011)。然而，sHSPs与免疫相关的潜在功能的信息相对缺乏，近年来成为研究热点。虾(Shrimp)中的一个sHSP基因，lisp21，在与宿主细胞凋亡相关白斑综合征病毒(whitespotsyndromeviral)的侵染过程中显著下降(Huangeta1．，2008)。在家蚕核多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus)感染的家蚕细胞的基因组范围的宿主基因表达分析中，感染后2h家蚕Hsp20．1的表达量下降到大约50％，这说明在感染早期家蚕Hsp20．1与抗Bml岬V免疫有关(Sagisakaela／．，2010)。最近，据报道蚶(Tegillarcagranosa)的一个sHSP基因与应对副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和脂多糖类(1ipopolysaceharides)的免疫反应有关(Baoetal．，2011)。感染胞浆多角体病毒(cytoplasmicpolyhedrosisvirus)的家蚕中肠的基因表达模式的微点阵分析显示一系列的HSP基因(包括sHsp23．7)被上调，这个试验结果提示这些HSPs可能与抗BmCPV免疫有关(Wueta1．，2011)。然而，先前的研究都主要集中在转录水平的表达分析上。在本研究中，多条证据显示AccHsp27．6可能与免疫反应相关。4．3．1AccHsp27．6基因存在核细胞因子．心结合位点在基因的5’空白区域检测到3个核细胞因子．r,B(NF．1出)结合位点。NF．r,B是一个普遍存在的转录因子，它在通过调节众多炎症和免疫相关基因的表达而起作用的宿主防御和慢性炎症疾病中起关键作用(Barnes，1997)。4．3．2AccHsp226基因在转录水平上响应微生物侵染值得注意的是，AccHsp27．6基因在应对不同微生物侵染时具有不同的表达模式。&aureus和Mluteus可以上调基因表达量，而及subtilis和户aeruginosa却可以下调基因表达量。这些结果表明该基因与免疫系统有关。 山东农业大学硕士学位论文4．3．3AccHsp27．6重组蛋白具有显著体外抗菌活性直接证据来自AccHsp27．6重组蛋白的活性分析，该实验结果显示获得的AccHsp27．6重组蛋白具有显著的体外分子伴侣活性和体外抗菌活性。因此，我们有理由推测AccHsp27．6可能与蜜蜂的免疫反应有关。在本研究中，我们只检测中蜂幼虫的微生物侵染反应，因为蜜蜂细菌性幼虫病严重影响蜜蜂的生长发育，蜂产品的质量和养蜂业的收益。并且幼虫具有较不完善的免疫系统，因此更需要HSP的保护，对微生物的刺激具有更强烈的反应。所以研究特异性感染蜜蜂的微生物的效应具有重要意义，比如美洲蜜蜂幼虫腐臭病(AmericanFoulbrood)的致病菌Paenebacil括larvae。通过更深入的研究来揭露AeeHsp27．6在免疫系统的功能和作用机制是非常重要的。5结论1．从中华蜜蜂中克隆得到了Hsp27．6基因，命名为AccHsp27．6，Genbank登陆号为GQ254650。序列分析发现AccHsp27．6含有sHSP典型的保守结构域a晶状体结构域，并具有分子伴侣蛋白典型的二级结构(富含13-sheets)和三级结构([I-sheetsandwich结构)以及疏水性高的氨基端保守区。2．5’空白区域序列分析发现7个HSEs和3个NF．r,B结合位点。这些功能元件表明，AceHsp27．6可能在中华蜜蜂的免疫反应过程中发挥了一定的作用。3．AccHsp27．6基因在中华蜜蜂的幼虫、蛹和成虫等各个阶段都有表达且具有与其它昆虫相类似的发育趋势，可以推测出昆虫中该基因表达的调控机制具有一致性。4．环境刺激条件下的表达模式以及重组蛋白的体外分子伴侣活性研究结果表明，AccHsp27．6作为分子伴侣在机体蛋白遭受刺激变性失活的反应过程中起保护作用。5．微生物侵染室内人工饲养的中华蜜蜂幼虫的实验以及重组蛋白的体外抑菌活性检测实验研究结果表明，AecHsp27．6可能参与蜜蜂的免疫防御体系，在非特异性免疫反应中起作用。4l 中华蜜蜂小分子热激蛋白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析参考文献王海鸿，雷仲仁．昆虫热休克蛋白的研究进展．中国农业科学．2005，38(10)：2023．2034王倩．室内人工培育中华蜜蜂幼虫技术研究．山东农业科学．2009，(11)：113．116张永强，王进军，丁伟和赵志模．昆虫热休克蛋白的研究概况．昆虫知识．2004．40(1)：16—19ArrigoA．P．．Smallstressproteins：chaperonsthatactasregulatorsofintracellularredoxstateandprogrammedcelldeath．BiolChem，1998，(379)：19—26AugusteynR．C—a—crystallin：areviewofitsstructureandfunction．C／／nExpOptom，2004，(87)：356—366BaoY．，WangQ．，LiuH．andLinZ．．AsmallHSPgeneofbloodyclam(Tegillarcagranosa)involvedintheimmuneresponseagainstVibrioparahaemolyticusandlipopolysaecharide．FishShellfishImmunol,2011，(30)：729-733BamesP．J．．MoleculesinfocusNuclearFactor-r．B．／ntJBiochemCellBiol,1997，(29)：867．870BitondiM．M．，NascimentoA．M．，CunhaA．D．，GuidugliK．IL，NunesF．M．andSimfesZ．L。Characterizationandexpressionofthehex10geneencodingaglutamine·richhexamerininthehoneybee，却括mellifera．ArchInsectBiochemPhysiol,2006，(63)：57．72BlackmanR．K．andMeselsonM．．InterspecificnucleotidesequencecomparisonsusedtoidentifyregulatoryandstructuralfeaturesoftheDrosophilahsp82gene．Journalo／MolecularBiology,1986，188(4)：499-515BorkovichK．A．，FarrellyF．W．，FinkelsteinD．B．，TaulienJ．andLindquistS．．hsp82isanessentialproteinthatisrequiredinhigherconcentrationsforgrowthofceilsathighertemperatures．MolecularandCellularBiology,1989，9(9)：3919·3930DeJongW．W．，CaspersG．J．andLeunissenJ．A．．Genealogyofthealpha-erystallin．smallheat·shockproteinsuperfamily．IntJBiolMacromol,1998，(22)：151·162FilichkinS．A．，BrumfieldS．，FilichkinT．P．andYoungM．J．．InvitrointeractionsoftheaphidendosymbioticSymlchaperonin、Ⅳitllbarleyyellowdwarfvirus．Journalof 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山东农业火学硕：t学位论文’附录1．1LB液体培养基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，加水950mL溶解，用5NNaOH调pH值至7．0，定容至1L，高压灭菌后保存。1．250xTAE缓冲液Tris242g，冰醋酸57．1mL，O．5MEDTA(pH8．O)100mL，用水定容至1000mL，用时稀释50倍。1．3质粒的提取溶液I：50mmol／L葡萄糖，25mmol／L"Iris—HCI(pH8．O)，10mmol／LEDTA。溶液II：0．2mol／LNaOH，IxSDS。溶液III．5mmol／LKAC60mL，冰醋酸11．5mL，H2028．5mL。TE缓冲液：10mM秭s．HCI(PH8．O)lmMEDTA(PH8．O)灭菌保存。1．4图3—10中引用基因的物种全名和GenBank登陆号为：DmHsp26(Drosophilamelanogaster，NM079273)，DmHsp27(Drosophilamelanogaster，NM079276)，DmCG14207(Drosophilamelanogaster,NM134482)，LhHsp20(Liriomyzahuidobrensis，DQ452370)，LsHsp21．7(Liriomyzasativae，DQ452372)，MesHsp(Macrocentruscingulum，EU624206)，NvHsp21．7(Nasoniavitripennis，XP001604512)，NvHsp20．6(Nasoniavitripennis，XM001607625)，AeeHsp27．6(Apisceranacerana，GQ254650)，BmHsp20．1(Bombyxmori,AB195971)，BmHsp23．7(Bombyxmori，AB195973)，BmHsp20．4(Bombyxmori，AF315318)，BmHsp22．6(Bombyxmori，FJ602788)，BmHsp2i．4(Bombyxmori,AB195972)，AgHsp20．9即nophelesgambiae，XM560153)，TcHsp21．8(Triboliumcaslaneum，XM968592)，AmHsp25．6(Apismellifera，XM392405)，LmHsp20．6(Locusmmiratoria，DQ355964)。47 中华蜜蜂小分子热激蚩白基因Hsp27．6的克隆、鉴定与功能分析致谢本研究是在导师胥保华教授和郭兴启教授的悉心指导下完成的，论文的每个字每句话都渗透着两位导师的心血和智慧，体现了两位导师对作者的关怀，鼓励和指导。两位导师都具有深厚的学术素养和独特的人格魅力，又都秉承“要做事，先做人”的理念，每次语重心长的教诲都使人印象深刻。胥老师的大气和郭老师的严谨在每个学生身上都留下深深的烙印，胥老师教育我们做事“要务实’’，郭老师教育我们做事“要用心"，正是两位导师的言传身教使我在三年的硕士研究生学习阶段不仅养成了良好的科学实验素养，积累了足够的专业知识，掌握了一定的科学研究方法，科学分析方法和科学创新能力，更学会了为人处事、待人接物的基本道理，为我们踏入社会融入新的工作环境奠定了基础。值此论文完成之际，谨向两位导师致以最崇高的敬意和由衷的感谢!感谢所有给予我帮助的老师，特别是王中华教授、林海教授、李福昌教授、杨在宾教授、杨维仁教授、王桂芝教授、宋志刚教授、康明江副教授、刘锋和高峥老师!本论文的完成还要感谢山东农业大学生命科学学院作物生物学国家重点实验室4514和动物科技学院蜜蜂团队的全体研究生，特别是孙汝江博士，艾涛波、刘利、巩志宏和张良四位师兄，王冕、郭若玉两位师姐，孙静师妹，姚朋波师弟，还有孟飞、于小丽、于菲菲、骆璐、卢文静、李玉真、闫慧茹、刘秀芳、郑本乐、焦震、王改英、李迎军、王颖÷马兰婷、吴在富等同学。在此特向三年来所有帮助、支持、关心和鼓励我的老师和同学表示最真诚的谢意!祝愿大家身体健康，工作顺利，前程似锦!毕业之际，非常怀念这三年硕士研究生的生活。能有机会在山东农大这个大家庭里学习和生活，我感到无比的快乐和幸福。祝愿所有的兄弟姐妹无论在学习上还是在生活中都能互相帮助，共同进步，快乐生活，并通过不断的拼搏进取，实现自己的人生梦想1最后，需要特别感谢的是我的家人。父母的养育之恩无以为报，他们是我十多年求学路上的坚强后盾，在我面l临人生选择的迷茫之际，为我排忧解难，他们对我无私的爱与照顾是我不断前进的动力。 山东农业大学硕．上学位论文攻读学位期间发表论文情况1．MolecularcloningandcharacterizationofHsp27．6：thefirstreportedsmallheatshockproteinfromApiscerana作者：刘昭华，郗冬梅，康明江，郭兴启，胥保华刊物名：cellstressandchaperonesDOI：10．1007／s12192．012．0330．X2．Twosmallheatshockprotem‘genesintheAp／sceranacerana：structuralcharacterization，heatshockregulationanddevelopmentalexpression作者：刘昭华，康明江，郭兴启，胥保华刊物名：ComparativeBiochemistryandahysiology状念：正在投稿3．意大利工蜂不同发育时期抗氧化酶基因mRNA表达量的变化。作者：肖培新，吴在富，刘昭华，胥保华刊物名：昆虫学报2010年，53(11)：1202．1206奖励情况1．2011年3月于山东农业大学动物科技学院获得硕士中期考核一等奖2。2012年3月于山东农业大学获得2012届校级优秀毕业生3．2012年3月于山东农业大学获得2012届省级优秀毕业生49 基金资助本研究由国家自然科学基金‘‘中华蜜蜂谷胱甘肽一S．转移酶(GSTs)基因的表达调控及抗氧化功能分析(31172275)"和国家蜂产业技术体系建设专项资金(CARS-45)资助。．