DB35∕T 1854-2019 蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术(福建省) 16页

ICS11.220B41DB35福建省地方标准DB35/T1854—2019蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术DiagnostictechniquesforIsraeliacuteparalysisvirusofhoneybees2019-09-11发布2019-12-11实施福建省市场监督管理局发布 DB35/T1854—2019目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13缩略语............................................................................14疾病概述..........................................................................15临床诊断..........................................................................26实验室诊断........................................................................27结果判定..........................................................................5附录A（规范性附录）溶液的配制......................................................7附录B（资料性附录）参考序列........................................................8附录C（资料性附录）核酸扩增电泳图..................................................9I DB35/T1854—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由福州海关提出并归口。本标准起草单位：福州海关、海口海关、福建农林大学、长春海关、厦门瑞德利校准检测技术有限公司、东莞市中鼎检测技术有限公司、福建省国鼎检测技术有限公司。本标准主要起草人：张体银、郑腾、李丹丹、王武军、张志灯、黄少康、宋战昀、廖善胜、白泉阳、林杰、于师宇、曹维强、李厚标。II DB35/T1854—2019蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术1范围本标准规定了蜜蜂以色列急性麻痹病毒病的疫病概述、临床诊断、实验室诊断和结果判定。本标准适用于蜜蜂以色列急性麻痹病毒病的诊断和蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染的监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。Ct值：循环阈值（CycleThreshold）DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethyPyrocarbonate）dNTP：三磷酸脱氧核苷酸（DeoxynucleosideTriphosphate）EB：溴化乙锭（EthidiumBromide）IAPV：以色列急性麻痹病毒（IsraeliAcuteParalysisVirus）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction）TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（TrihydroxymethylAminomethane-BoricAcid-ethyleneDiamineTetraaceticAcid）4疾病概述以色列急性麻痹病毒病是由IAPV引起的一种常见的蜜蜂病毒病，可侵染各个发育时期的蜜蜂个体（卵、幼虫、蛹、成蜂）和蜂群各级型蜜蜂（工蜂、雄蜂和蜂王），给蜂群造成重大损失，对蜜蜂养殖业危害大，目前该病在全球大部分地区分布。IAPV属于小核糖核酸病毒总科（Picornaviridae），病毒基因组是由9487个核糖核苷酸组成，它的两个开放读码框被一个由184个核苷酸组成的基因间区域分开。靠5′端的开放读码框编码翻译与RNA复制和蛋白质加工相关的、由1900个氨基酸构成的非结构性多聚蛋白质，靠3′端的开放读码框编码翻译用于加工不同衣壳蛋白的、由944个氨基酸组成的结构性多聚蛋白。IAPV有两个内核糖体进入位点，一个位于5′端非翻译区，另一个位于两个开放阅读框之间的基因间区域，在衣壳蛋白的起始翻译合成时起介导作用。内核糖体进入位点介导的翻译起始机制降低了病毒对寄主的依赖性，这种机制被认为是病毒破坏宿主蛋白质翻译合成过程的方式之一。1 DB35/T1854—20195临床诊断5.1临床表现5.1.1临床健康的蜂群短时间内大量成年工蜂突然消失。5.1.2在巢脾上只剩下蜂王、幼虫和一些未成年工蜂以及花粉等残留食物，且在蜂箱内并无死亡蜜蜂的残存尸体，也没有其他寄生害虫的存在。5.1.3蜜蜂个体感染早期腹部、胸部逐渐变黑，翅膀颤抖，在蜂箱外的空地上转圈，既不采食也不能飞行。5.1.4蜜蜂感染后期胸部绒毛脱落，最后麻痹抽搐而死。5.2初步诊断当蜂群出现5.1中部分或全部临床表现时，可做出初步诊断，确认需要进行实验室诊断。6实验室诊断6.1设备、材料和试剂6.1.1设备6.1.1.1普通PCR扩增仪。6.1.1.2荧光PCR仪。6.1.1.3台式冷冻高速离心机（12000r/min）。6.1.1.4微量移液器（0.5µL～10µL、2µL～20µL、20µL～200µL、100µL～1000µL）。6.1.1.5水平电泳仪。6.1.1.6凝胶成像系统。6.1.1.7电子天平（感量0.01g）。6.1.1.8冰箱（2℃～8℃和–80℃）。6.1.2材料和试剂6.1.2.1试验用水应符合GB/T6682—2008中一级水的规定。6.1.2.2焦炭酸二乙酯处理水（DEPC水）。6.1.2.3Trizol试剂。6.1.2.4三氯甲烷。6.1.2.5异丙醇。6.1.2.6无水乙醇。6.1.2.710×OneStepRNAPCRBuffer。6.1.2.8MgCl2。6.1.2.9dNTPs（含dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。6.1.2.10逆转录酶。6.1.2.11TaqDNA聚合酶。6.1.2.12琼脂糖。6.1.2.13分子量标准（100bp～1000bp）。6.1.2.14TBE电泳缓冲液，配制方法按附录A中A.1的规定。2 DB35/T1854—20196.1.2.15EB（10mg/mL），配制方法按附录A中A.2的规定。6.1.2.16上样缓冲液，配制方法按附录A中A.3的规定。6.1.2.17DNA纯化回收试剂盒。6.2引物、探针序列和对照样品6.2.1引物和探针序列6.2.1.1普通RT-PCR引物序列IAPV-F15′-AAGGCTCAGCTAGGATGACAC-3′。IAPV-R15′-TCAGGATTTAAAGCCTCACG-3′。扩增片段约270bp，用双蒸水溶解至10μmol/L后，保存于-20℃备用。6.2.1.2荧光RT-PCR引物和探针序列上游引物IAPV-F25′-ACTAGTGGACGAAGCGAGTT-3′。下游引物IAPV-R25′-TGTACTGGGCAGTTACAGCA-3′。探针IAPV-P序列为5′-FAM–CGGAACGCCGCATGTGTTACCA–BHQ1-3′。扩增片段约127bp，用双蒸水溶解至10μmol/L后，保存于-20℃备用。6.2.2对照样品6.2.2.1阳性对照为灭活的IAPV或单一感染IAPV的蜜蜂组织或含目的片段的RNA。6.2.2.2阴性对照为灭活的其他蜜蜂病毒或未感染IAPV的蜜蜂组织或不含目的片段的RNA。6.2.2.3空白对照用无菌水代替样品。6.3样品采集和保存选择疑似感染的蜂群，挑取带有临床表现的蜜蜂或新鲜死亡蜜蜂10～20只；也可挑取单个病、死虫或蛹2～3只装入无菌的小试管内；发现患病蜂王也可采取单个蜂王个体。若样品24h内能送达实验室，应2℃～8℃保存；若样品24h内不能送达实验室，则应-20℃或更低温度保存。对于无临床表现的蜂群也可采用上述采样和保存方法。6.4IAPV的RT-PCR检测6.4.1RNA提取选取不超过200mg～300mg待鉴定幼虫虫体或成蜂蜂体，置于DEPC水处理过的研钵中，加入液氮进行研磨，将研磨得到的粉末，快速转移至无RNA酶并经过液氮冷却的1.5mL离心管中，加入1mLTrizol试剂，用移液器充分吹打10～20次，室温放置5min；加入200μL三氯甲烷，旋涡振荡30s混匀，室温放置15min；4℃，12000r/min离心15min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20℃放置20min；4℃，12000r/min离心15min；弃上清液，沉淀用1mL75%乙醇清洗；4℃，10000r/min离心10min，弃上清液，沉淀室温干燥5min；加20μLDEPC水溶解RNA沉淀。-80℃冰箱保存备用，RNA溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。RNA提取也可采用其他等效的提取方法或等效的商品化RNA提取试剂盒。3 DB35/T1854—20196.4.2RT-PCR反应取PCR反应管，按表1的规定配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。表1IAPVRT-PCR反应体系(25μL)加样量组分终浓度μL10×OneStepRNAPCRBuffer2.51×MgCl2（25mmol/L）2.52.5mmol/LdNTPs（10mmol/Leach）0.50.2mmol/LRNaseInhibitor（40U/μL）0.50.8U/μL逆转录酶（5U/μL）0.50.1U/μLTaqDNA聚合酶（5U/μL）0.50.1U/μL引物IAPV-F1（10μmol/L）1.00.4μmol/L引物IAPV-R1（10μmol/L）1.00.4μmol/LDEPC水13/模板/对照3/将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪，扩增反应条件设定为：60℃反转录30min；95℃预变性2min；之后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，运行35个循环；72℃补充延伸10min，4℃保温。以水作为空白对照，同时设阳性对照和阴性对照。6.4.3琼脂糖凝胶电泳用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶平板，其中含有1μg/mLEB（或与EB等效的商品化核酸染料）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6μLPCR产物和2μL上样缓冲液混匀后加入样品孔中进行电泳。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止。6.4.4测序使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约270bp的DNA片段，应对其切胶回收后进行测序，也可直接送PCR产物进行测序，参考序列参见附录B，同源性达到95%以上方可判为核酸阳性。6.4.5判定依据经核酸扩增电泳后阳性对照出现一条大小约270bp的DNA条带，阴性对照和空白对照无该目的条带，才可判定试验成立，参见附录C中的图C.1。待检样品经核酸扩增电泳后，在大小约270bpDNA位置上有条带并经测序验证者为核酸阳性，无条带或条带的大小不是约270bp的为核酸阴性。4 DB35/T1854—20196.5IAPV的实时荧光RT-PCR检测6.5.1实时荧光RT-PCR反应取PCR反应管，按表2的规定配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。表2IAPV实时荧光RT-PCR反应体系(25μL)加样量组分终浓度μL10×OneStepRNAPCRBuffer2.51×MgCl2（25mmol/L）2.52.5mmol/LdNTPs（10mmol/Leach）0.50.2mmol/LRNaseInhibitor（40U/μL）0.50.8U/μL逆转录酶（5U/μL）0.50.1U/μLTaqDNA聚合酶（5U/μL）0.50.1U/μL引物IAPV-F2（10μmol/L）0.50.2μmol/L引物IAPV-R2（10μmol/L）0.50.2μmol/L探针IAPV-P（10μmol/L）0.50.2μmol/LDEPC水14/模板/对照2.5/将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪，扩增反应条件设定为：60℃反转录30min；95℃预变性2min；之后95℃变性15s，60℃退火30s，收集荧光，共40个循环。同时设阳性、阴性对照和空白对照。6.5.2判断依据综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值≤30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且Ct值＞40或未检出，二者均成立才可判定试验成立。检验样本Ct值≤35时，报告IAPV核酸阳性。检验样本35＜Ct值≤40时，重复一次，如果Ct值仍然≤40，并且曲线有明显的对数增长期，报告IAPV核酸阳性，否则报告IAPV核酸阴性。检验样本Ct值为零或Ct值＞40时，报告IAPV核酸阴性。7结果判定7.1若有临床表现，经RT-PCR和/或实时荧光RT-PCR检测为核酸阳性，判定为蜜蜂以色列急性麻痹病毒病。7.2若有临床表现，经RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测为核酸阴性，判定为未感染蜜蜂以色列急性麻痹病毒，需进一步做其他病检查。5 DB35/T1854—20197.3若无临床表现，经RT-PCR和/或实时荧光RT-PCR检测为核酸阳性，判定为蜜蜂以色列急性麻痹病毒隐性感染。7.4若无临床表现，经RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测为核酸阴性，判定为未感染蜜蜂以色列急性麻痹病毒。6 DB35/T1854—2019AA附录A（规范性附录）溶液的配制A.1TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)三羟甲基氨基甲烷（Tris）54.0g硼酸27.5g乙二胺四乙酸（EDTA）2.9g蒸馏水定容至1000mL用5mol/L的盐酸(HCl)调pH至8.0。A.2EB(核酸染色剂)EB100mg蒸馏水10mL用蒸馏水配制成10mg/mL的浓缩液。用时每100mL染色液中加10μL的浓缩液。A.3上样缓冲液溴酚蓝0.25g蔗糖40g蒸馏水100mL溶解混匀后121℃高压灭菌15min。7 DB35/T1854—2019BB附录B（资料性附录）参考序列B.1RT-PCR扩增的IAPV基因序列（共270bp）aaggctcagctaggatgacacgcctgtacactgtcgacattagttaagttacaattacacgtcttttgccgaagaaaccattttagtcaactgattatgatttttgtataacgacaaacagtgatgaactgtataactcatcaataacaaaatggattacgaacctatttgtaactatcttgatcgaagtctagtagatccccaatatagccctgaaaagcttgagggacgagatagctctataaatagacgtgaggctttaaatcctgaB.2实时荧光RT-PCR扩增的IAPV基因序列（共127bp）actagtggacgaagcgagttccgtattgtgtacgttgggagtattgctttcttgttgtgaatcaccaggcatgatatttcggaacgccgcatgtgttaccatacgactgctgtaactgcccagtaca8 DB35/T1854—2019CC附录C（资料性附录）核酸扩增电泳图核酸扩增电泳图参见图C.1。500bp300bp100bpNPM123说明：N——阴性对照；P——阳性对照；M——100bpDNALadder；1——IAPV阳性样品；2——IAPV阴性样品；3——空白对照（无菌水）。图C.1核酸扩增电泳图_________________________________9 DB35/T1854－2019福建省地方标准蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术DB35/T1854—2019*2019年9月第一版2019年9月第一次印刷