蜜柚黑斑病症状及病原鉴定-论文.pdf 6页

福建农林大学学报(自然科学版)第43卷第3期JoamalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition)2014年5月蜜柚黑斑病症状及病原鉴定张晓彬，王宏毅，卢友民。，黄智辉，严进‘，张绍升(1．福建农林大学植物保护学院，福建福州350002；2．厦门出入境检验检疫局，福建厦门361012；3．平和县农业局植保站，福建漳州363700；4．中国检验检疫科学院动植检所，北京100029)摘要：症状观察结果确认平和县瑁溪蜜柚黑斑病出现2种症状类型：黑星型和黑斑型．通过病原菌分离培养、形态特征观察和ITS序列分析，果实黑斑病的病原鉴定为亚洲柑橘叶点霉，叶片黑斑有亚洲柑橘叶点霉和中华柑橘叶点霉．采用科赫氏法则证实亚洲柑橘叶点霉是瑁溪蜜柚黑斑病的病原茵，中华柑橘叶点霉未能对瑁溪蜜柚果实致病．关键词：亚洲柑橘叶点霉；中华柑橘叶点霉；蜜柚黑斑病；症状；病原鉴定中图分类号：$436．661．1文献标识码：A文章编号：1671-5470(2014)03-0245．-06PathogenidentificationandsymptomsofhoneypomeloblackspotZHANGXiao—bin，WANGHong-yi，LUY0u．rain，HUANGZhi．hui，YANJin‘，ZHANGShao．sheng(1．CollegeofPlantProtection，F~ianAgricultureandForestryUniversity，Fuzhou，F~ian350002，China；2．XiamenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Xiaraen，Fujian361012，China；3．PlantProtectiveStation，AgriculturalBureauofPingheCounty，Zh肌gzh0u，Fujian363700，China；4．InstituteofAnimalandPlantQuarantine，ChineseAcademyofInspectionandQuarantine，Beijing100029，china)Abstract：TwodiferentsymptomsofGuanxihoneypomeloblackspot。hardspotandfrecklespothavebeenob8ervedinPingheCounty，FujianProvince．Accordingtothecultureandisohte，morphologicalcharacteristicsandITSsequencesofthepathogenicfungus，thepathogensonfruitswereidentifieda8PhyUostictacitriasiana。andthepathogensonleaveswereP．citriasianaandP．cit-richinaensis．P．c／tr／as／anaWaSdetermined髓thepathogenofhoneypomeloblackspotbyinoculationtest。butP．citrichinaensisdidnotinfectthefruitsofGuanxihoneypomelo．Keywords：PhyUostictacitria~mna；PhyUostictac^瑚：honeypomelobhckspot；symptom；pathogenicidentification瑁溪蜜柚[C／trusgrand／s(L．)OsbeckCV．guanximiyou]是福建省平和县的特色水果，也是当地的经济支柱产业．近几年，瑁溪蜜柚黑斑病危害严重，影响了柚果出口创汇，造成重大经济损失．瑁溪蜜柚黑斑病症状与柑橘黑斑病(citrusblackspot)相似．柑橘黑斑病于1895年首次发现于澳大利亚的一个柑橘园，1899年其病原菌被鉴定为橘果茎点霉菌(尸7lD，加citricarpaMcAlpine)J，1948年报道该病病原菌的有性阶段橘果球座茵(GuignardiacitricarpaKiely)，1973年该病菌的无性态分类地位被更名为橘果叶点霉菌[Phyllostictacitricarpa(McAIpine)VanderAa]．Wulandarietal将中国、泰国及越南出口柚果黑斑病病原菌命名为亚洲柑橘叶点霉(P．citriasiana)．罗金水等将福建蜜柚果实黑斑上分离的病原菌鉴定为亚洲柑橘叶点霉(P．citriasiana)；Wangetal[53将橙果和柚叶黑斑上分离的病原菌命名为中华柑橘叶点霉(citrichinaensis)．上述研究结果表明，柑橘类黑斑病的病原菌种类具有多样性．有关瑁溪蜜柚黑斑病的症状学和病原学尚缺乏深入研究．为此，本研究对瑁溪蜜柚黑斑病的症状类型进行系统观察和描述；通过传统形态学鉴定和现代分子生物技术相结合，确定其病原菌的分类地位，以期为蜜柚黑斑病的诊断和检疫提供依据．1材料与方法1．1材料1．1．1菌株来源2012年在瑁溪蜜柚成熟期至采收期从福建省平和县试验果园采集具有典型症状的病果和病叶，在实验室进行病原菌的分离和纯化培养．1．1．2供试植物组织柚果品种：瑁溪蜜柚，当年生果实；柚叶品种：瑁溪蜜柚，当年春梢叶片．收稿日期：2013—10—14修回日期：2014—01一l0基金项目：公益性行业(质检)科研专项资金(201110022)．作者简介：张晓彬(1989一)，男，硕士研究生．研究方向：植物病理学．通讯作者张绍升(1951一)，男，教授．研究方向：植物病理学．Emall：slut-∞州mg@126．corn． ·246·福建农林大学学报(自然科学版)第43卷1．2菌株回接与症状观察将分离、纯化培养的菌株在PDA平板上培养2周后，刮取培养基上的菌落置于三角烧瓶的无菌水中，充分振荡并配制成浓度为1×10个·mL孢子悬浮液．采用伤口针刺注射法将2种病原菌的孢子悬浮液接种于当年生的成熟瑁溪蜜柚果实表皮，以接种无菌水为对照，观察记录发病情况．1周后从病斑上再分离、纯化菌株；通过肉眼观察发病果实和叶片症状，对具有明显病征的病组织进行切片和病原菌鉴定，根据观察结果描述症状．1．3病原菌的鉴定1．3．1病组织上的病原菌形态学鉴定采用徒手切片法，选择有典型病征的病组织切片，通过显微镜观察形态和进行显微计测，病原种类鉴定参照文献[3，5]．1．3．2病原茵分离培养和形态学鉴定将采集的病组织样本用PDA平板进行病原菌分离、培养和纯化，观察培养性状，在光学显微镜下观察病原菌形态特征和摄影．1．3．3分子鉴定分子鉴定方法参照文献[4]，采用石英砂研磨和SDS法提取DNA．PCR扩增区为真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)，用通用引物1TS1(5．TccGTAGGTGAACcTGCGG-3)和引物1TS4(5一TC-CTCCGC1-IlA1TrGATATGC-3)扩增．PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火458，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min．反应结束后，取5扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，利用凝胶成像仪观察、拍照．将PCR产物ITS区测序结果输入GenBank核酸数据库进行Blast比对．1．4病原菌ITS序列进化树的构建从GeneBank中收集不同来源的病原菌相似种，采用ClustX1．83、PAUP4．0、Treeview等相关软件，使用最大简约法(maximumparsimony)构建系统进化树，Bootstrapvalue依据10000次重复计算．2结果与分析2．1病原菌鉴定从平和县瑁溪蜜柚果实黑斑上分离的菌株为HP201209．1，从平和县瑁溪蜜柚叶片黑斑上分离的菌株为HP201209-4．根据柯赫氏法则，HP201209．1菌株接种柚果7d后初现病斑，21d后接种果上产生黑斑(图1A、D)；从接种后产生的黑斑上重新分离获得与接种菌HP201209．1一致的病原菌．无菌水对照接种的柚果没有病斑(图1C、F)．HP201209-4菌株接种柚果未发现明显病斑(图lB、E)．HP201209—1和HP201209-4菌株接种柚叶的结果表明：2种菌株均对柚叶产生致病性，从接种产生的病斑上分离的病原菌与对应的接种菌形态一致．致病性接种试验证实了亚洲柑橘叶点霉HP201209-1菌株是引起瑁溪蜜柚黑斑病的病原菌，同时证实了中华柑橘叶点霉HP201209-4菌株的分生孢子对成熟的柚果无致病性．这是未在病果发现中华柑橘叶点霉的原因．2．2症状描述蜜柚黑斑病主要发生于果实上，也可为害叶片．在福建省平和县瑁溪蜜柚果园中，7月上旬至中旬柚果上出现病斑．瑁溪蜜柚黑斑病症状有2种病斑类型：黑星型和黑斑型．黑星型：病斑发生在果实绿色转黄色时期(7—8月)，且多在朝阳面出现J，病斑散生，圆形至椭圆形，不愈合成大病斑(图2A—B)．病斑形成初期为黑褐色小点，有黄色晕圈，随后产生流胶，扩大并凹陷，凹陷处呈灰白色至棕色，上生小黑粒，病健交界处有一条明显的较粗赤棕色界线，黄色晕圈消失(图2c)．病斑经多次流胶渐趋成熟，形成木栓化并开裂隆起(图2D)．病斑可侵入果皮内深层海绵组织，但不侵入果肉．这种病斑在国外称为硬斑型(hardspot)[71．黑斑型：病斑发生在果实成熟期至贮藏期(7月之后)，初现红褐色或黑褐色小点，偶伴有黄色晕圈(图2E)．国外称黑斑型为雀斑型(frecklespot)或早期毒性型(earlyvirulentspot)】．病斑形态受阳光照射影响产生成熟病斑和雀点病斑．成熟病斑多产生在朝阳面，病斑近圆形或不规则形，中央灰色至棕色凹陷，外缘呈赤褐色边界，数个病斑可相互愈合成为大病斑，呈泪痕形或不规则形斑块，病斑上产生数个黑色小粒点(图2F)．病斑形成和扩展期间会不断产生流胶(图2G)．病斑可以侵入果皮内深层海绵组织，但不侵入果肉．雀点病斑多产生在树荫处的果实上，病斑基本无流胶，中央凹陷，红棕色，病斑扩大呈近圆形、圆形或不规则形，病部与健部无明显边界线，病斑上不产生小黑点，病斑相互愈合形成不规则的斑块(图2n)．病斑仅侵入表层海绵组织． ·250·福建农林大学学报(自然科学版)第43卷spot)】．而国内将柑橘黑斑病的症状分为黑斑型和黑星型H引．以上的症状分类均是针对柑橘黑斑病，并未对柚黑斑病的症状进行区分和描述，有关柚子黑斑病的报道也很少．本研究对璃溪蜜柚黑斑病病果和病叶上的病斑进行病原分离培养，鉴定出亚洲柑橘叶点霉和中华柑橘叶点霉，并通过分子鉴定得到进一步确认．病果上分离的病原菌为亚洲柑橘叶点霉，而病叶上分离得到亚洲柑橘叶点霉和中华柑橘叶点霉．经致病性测定亚洲柑橘叶点霉能侵染瑁溪蜜柚果实，可以确定亚洲柑橘叶点霉是瑁溪蜜柚黑斑病的病原菌．本鉴定结果与Wulandarietal和罗金水等[4报道的柚黑斑病的病原一致．从柚叶片黑斑病上分离的中华柑橘叶点霉经致病性测定未能侵染唁溪蜜柚果实，中华柑橘叶点霉在福建属首次记录．该菌与蜜柚果实黑斑病的关系有待做进一步研究．本研究表明，柚黑斑病的病原与柑橘黑斑病的病原属于不同种，柑橘黑斑病的病原菌为柑橘叶点霉．系统进化树的分析也表明，亚洲柑橘叶点霉与柑橘叶点霉之间的遗传距离有差别．参考文献[1]王兴红，陈国庆，王卫芳，等．柑橘黑斑病(CitrusBlackSpot)发生危害现状和研究进展[J]．果树学报，2011，28(4)：674—679．[2]VANDERAAHA．StudiesinPhyilosticta[J]．StudiesinMycology，1973，5：1—110．[3]WULANDARINF，TO—ANUNC，HYDEKD，et81．PhyUostictacitriasiana8p．nov．，thecaugeofCitrustanspotofC／tmsmax／mainAsia[J]．FungalDiversity，2009，34：23—39．[4]罗金水，张汉荣，卢松茂，等．珀溪蜜柚黑斑病菌分离鉴定及其致病性测定[J]．福建热作科技，2011。6(4)：1—5．[5]WANGXH，CHENGQ，HUANGF，eta1．PhyUostictaspeciesassociatedwithcitrusdiseasesinChina[J]．FungalDiversi-ty，2012，52：209—224．[6]KOTZ~JM．EpidemiologyandcontrolofcitrusblackspotinSouthAfrlca[J]．PlantDisease，1981，65(12)：945—950．[7IKIELYTB．Gu／gnard／ac／tr／carpan．8p．anditsrelationshiptOtheblackspotdiseaseofcitrusincoastalorehan!~ofNewSouthWales[J]．JournaloftheAustralianInstituteofAgriculturalScience，1948，14：81—83．[8]GOMEZH．ScreeningAidforCitrusBlackSpot(CB$)DiseaseSymptoms[R]．Florida：CAPSResourceandCollaborationSite，USDAAPHISPPQ，2011．[9]DEWDNEYMM，SCHUBERTTS，ESTESMR，eta1．FloridaCitrusPestManagementGuide：CitrusBlackSpot[R]．Gainesville：DepartmentofPlantPathology，FloridaCooperativeExtensionService，IFAS，UniversityofFlorida，2012．[1O]张汉荣，罗金水，李美桂．国内外柑桔黑斑病研究进展[J]．中国农学通报，2011，27(6)：4o一44．(责任编辑：杨郁霞)