反义ACC氧化酶基因表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化 34页

内蒙古农业大学硕士学位论文反义ACC氧化酶基因表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化姓名：王翠艳申请学位级别：硕士专业：蔬菜学指导教师：云兴福2003.5.1 摘要本实验以河套蜜瓜果肉基因组DNA为模板，用甜瓜ACC氧化酶基因特异寡核苷酸链为引物进行PCR扩增，得到128bp的扩增产物。将得到的扩增产物克隆到质粒载体pMD—18一T上，筛选反向克隆，然后将其反向构建到植物表达载体pBINYXW的CaMV35S启动子和TMV增强子“Q”的下游，构建成反义表达载体pBINYA。并在对河套蜜瓜授粉受精生物学研究的基础上，通过花粉管通道法转化河套蜜瓜，共获76颗瓜，并进行了硬度和含糖量的分析。关键词：ACC氧化酶基因；反义表达载体：嗄霍≥河套蜜瓜；媛彀，‘了，’＼本实验由盘古集团科技创新基金和内蒙古教育厅基金项目(河套蜜瓜徽卫星DNA的分离及其遗传图谱的构建)资助完成。 ConstructionofAntisenceACCOxidaseGeneExpressionVectorandTransformationofCucumismeloL．CVHetaoAbStractDegenerate01igonucleotidestohighlyconservedregionsofCucumismelo1．aminocyclopfopane-1-carboxylicacid(ACC)oxidasegenewereusedtoprimetheamplificationoffragmentof128bpbyploymerasechainreaction(PCR)insamplesofgenomicDNAfromfruitofCucumismeloL．cvHetaoflesh，whichwasclonedintoplasmidvectorpMD一18-T．Theclonofantisenseorientationwereselected，anditwasinserteddownstreamofCaMV35Spromoterandenhancer“Q”ofTMVintotheplantexpressionvectorpBINYXW．antisenceexpressionvectorpBINYAwasconstructed．AtthebasethatpollinationandfertilizationofCucumismeloL．cvHetaowasstudied，usingpollentubepathwaytransformateCucumismeloL．cvHetao，76fruithadbeenobtained，moreover，hardnessandcontentofsugarwereanalysed．Keywords：ACOxidase，AntisenceExpressionVector，ConstructionCucumismeloLcvHetao；TransformationDjrectedby：ProfYUNXingfuApp}icantforMasterdegree：WANGCuiyan(Olericulture)(AgriculturalInstitute，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Huhhot010018，China) bpBSAODTriSKanAmpIPTGX～galdNTPPCRSDSNPTIIACC英文缩写baSepairsBoyiheSerumAlbumenOpticaldensity(hydroxy—methl)一aninomethaneKanamycinAmpiCillinIsopropylthiogalactoside5-bromo——4——chloro——3——indolyl一0一D-galactOSidedeoxynuckotideTriphosphatesPolymeraseChainReaetionSodiumDodecylSulphateneomycinpbosphotransferaseII1一aminocycIopropane一1一carboxylate碱基对牛血清白蛋白光密度三羟甲基氨基甲烷卡那霉素氨苄青霉素异丙基一B～D-硫代半乳糖苷5一澳一4一氯一3一吲哚一B—D-半乳糖苷脱氧核苷三磷酸聚合酶链式反应十二烷基磺酸钠新霉素磷酸转移酶IIl一氨基环丙烷一卜羧酸 内蒙古农业大学硕士学位论文·1引言河套蜜瓜(Cucumisme]oL．CVHetao)俗称华莱士瓜，属葫芦科(Cucurbitaceae)葫芦亚科，香瓜属，甜瓜种，属内蒙古巴盟特产。由于该地区独特的土壤和气候条件，使其瓜香浓郁，风味独特。但河套蜜瓜成熟后，软化速度快，仅能存放一周左右，难以贮运外销，对经济效益的增长是一个严重的桎梏，也影响广大瓜农的种植积极性。基于上述种种原因，人们在延长河套蜜瓜贮存期方面做了大量的工作，包括常规育种及植物生物技术等多种方式。其中，随着植物生物技术的迅速发展和对瓜果成熟分子生物学的深入研究，为延长河套蜜瓜的贮存期开辟了一条崭新的途径。1．1国内外保鲜技术概况目前国内外果蔬保鲜的技术很多，从因地置宜的简易贮藏保鲜到高度自动化的贮藏保鲜，都有着广泛的应用。其中，产地贮藏是我国的传统方法，如四川南充地区的地窖贮藏柑桔u-，新疆地区的吊挂贮藏和搁板贮藏贮存哈密瓜⋯等。近年来j又在此基础上发展出土窑洞加机械制冷等节能贮藏体系，并己在苹果、梨等水果中应用⋯。在温控贮藏保鲜“J中，简易贮藏保鲜包括埋藏、堆藏、窖藏、通风库贮藏等，在很多蔬菜水果上都可应用；冷藏保鲜是现代化果蔬贮藏的主要形式之一，防止冷害和冻害是应用这项技术需注意的问题。目前，冷藏库的自动化是发展的主要趋势m；控制冰点贮藏保鲜是在冰点温度下对食品进行保鲜的新方法，目前应用不多。在应用众多的保鲜技术中，气调贮藏保鲜目前已经成为工业发达国家果蔬保鲜的重要手段”1，包括CA气调贮藏保鲜、MA气调贮藏保鲜(塑料薄膜袋自控保鲜)、塑料薄膜帐气调贮藏保鲜及MAP保鲜法，目前，我国主要应用的有cA气调贮藏保鲜和塑料薄膜帐气调贮藏保鲜。近年来，还兴起了几项新的保鲜技术，例如：减压贮藏保鲜和高压保鲜“”，由于这两项技术在应用中投资较大，而且在设备制造上存在一定的困难，所以大规模应用还处于试验阶段，但小规模的减压贮藏是可行的，在甜瓜上也有应用；电子保鲜、磁场保鲜和电离辐射保鲜，这三种方法，都是发展很快的保鲜技术，特别是电子保鲜，从八十年代起，美国、日本等发达国家在食品保鲜方面普遍应用此项技术“1，康锡兰等(1989)利用静电保鲜棚在常温下贮藏甜瓜也取得了较好的效果”1。在应用保鲜剂保鲜中，根据保鲜剂不同可分多种类型，包括吸附型和防护型保鲜剂、植物生长调节剂和中草药保鲜剂保鲜等m。还有就是生物技术保鲜，这是果蔬贮藏保鲜上新发展起来的贮藏保鲜技术，包括生物防治保鲜和基因工程保鲜。这两种方法在甜瓜上均有不少成功的应用n⋯。这里所说的基因工程保鲜就是控制与成熟有关的基因的表达，从而达到延长贮藏期的目的。美国的CalgeneInc公司的FlavrsavrTM的番茄和华中农业大学培育出的“华番l号”番茄的商品化生产m，，标志着利用基因工程方法控制果实成熟已进入产业化阶段，同时也是显示出植物分 2ACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化子生物学应用潜力的很好例证““。1．2果实成熟的分子生物学利用遗传工程技术控制果实成熟的研究，依赖于对果实成熟生理学和分子生物学的理锯。果实成熟是指果实生长发育停止后发生的一系列生理生化变化的综合过程，其结果是果实形成典型的外观和食用品质，如成分、色泽、质地或其它感观属性发生变化m，。根据果实成熟期有无呼吸高峰区，可以分为跃变型和非跃变型两类。跃变型果实经过一个明显的高峰即进入成熟，这时体内发生一系列急速的成分变化，包括贮藏的多糖水解，细胞壁构成物质的水解，硬度下降等。这种果实的典型代表有番茄、香蕉、苹果等，甜瓜也属此种类型。而非跃变型果实由于没有呼吸高峰，所以成熟较缓慢，比如葡萄、草莓等。早在上个世纪人们就开始研究乙烯的生理作用，直到1934年Gane证实乙烯是植物组织代谢的天然产物，是一种成熟激素““。呼吸跃变与果实内乙烯的释放有密切关系，果实跃变的基础是乙烯的诱导，而呼吸现象及其它相继出现的，如RNA和蛋白质的合成增多、细胞壁透性变化等都是次生的。Yangetal确定了植物体内乙烯的生物合成途径，提出乙烯的生成是以甲硫氨酸为底物，经s一腺菅甲硫氨酸(SAM)合成酶、ACC合成酶，催化生成ACC，再经过ACC氧化酶的作用生成乙烯n⋯。其中，ACC氧化酶和ACC合成酶是乙烯合成的途径中的关键酶。很多通过基因工程手段抑制果实成熟都是通过控制这两个酶的活性或表达来实现的。骆蒙等(1996)发现ACC氧化酶先于ACC合成酶基因表达的“倒序现象”n“。研究表明，ACC氧化酶基因属多基因家族，它在不同品种的不同组织器官、成熟果实和受伤组织中表达水平有所不同。”，和甜瓜成熟有关的基因是CM—ACOI。”。ACC氧化酶基因最早是从番茄文库中克隆出来的””，随后又在苹果⋯“1、桃m“等植物中克隆到ACC氧化酶基因，Pech也于1995年克隆到甜瓜的ACC氧化酶基因m。法国的Ayub利用反义技术将ACC氧化酶基因导入甜瓜，使其乙烯释放量只有对照的1％，首次获得转基因耐贮存甜瓜w。在控制乙烯生成从而延长果实贮藏期的过程中，还可以通过其它途径实现对乙烯的控制，比如生成ACC后可以通过ACC脱氨酶的催化生成a一酮基丁酸，在植株体内导入正义的ACC脱氨酶，就可使ACC转向n一酮基丁酸，从而达到保鲜的目的m，。在果实成熟过程中，发生的最显著的变化就是果实的软化，它与果胶物质的降解有关，而多聚半乳糖醛酸酶(PG)被认为参与果胶的降解。研究人员试图通过导入PG酶基因从而使果实推迟软化，但后来发现，果实软化的因素很复杂，PG基因的导入并不能推迟软化，但转基因果实的加工性能有所改善，且能抵抗继发性真菌的感染⋯。PG酶的作用机制还在进～步探索之中。另外一个和细胞壁降解有关的酶是果胶酯酶(PE)，它可从细胞壁的果胶中去除甲基基团，从丽加速细胞壁的降解。PE ．塑塞查窒些查兰堡主兰堡笙皇!是个多基因家族，导入单一反义PE基因并不能使果实中所有PE的mRNA水平降低，但也可改善果实的加工性能⋯1。1．3基因工程技术在控制果实成熟中的应用控制果实成熟的基因工程主要原理是基因干涉。基因干涉主要包括干涉靶基因DNA和干涉靶基因mRNA两种方法。目前干涉靶基因DNA的策略主要有三种：(1)基因敲除，细胞分裂时，靶载体与目的基因通过同源重组发生连锁交换，从而破坏目的基因m1。(2)用合成寡核苷酸与双链DNA杂交，形成三链DNA，可能通过DNA解链或抑制转录因子与基因结合，防止靶基因转录m1。(3)采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子与靶基因结合，抑制靶基因转录⋯1。干涉靶基因mRNA的方式主要分以下几个方面：(1)设计寡核苷酸来破坏与mRNA结合的蛋白质，使mRNA不稳定m。(2)RNA干涉技术，即外源双链RNA引发的体内基因的同源序列降解，从而表现出的基因转录后的沉默现象。RNA干涉技术有很多特点，其抑制基因表达的时间可以控制在目标生物发育的任意时期，并且其介导的干涉表现为惊人的细胞穿透力，可以传递给其它的组织，对特定基因的抑制作用甚至可延续到Fl代n⋯，。(3)利用反义技术阻遏翻译过程，破坏内源性的mRNA。这里所说的反义技术是根据碱基互补原理，利用人工或生物合成特异互补的DNA或RNA片段抑制或封闭基因表达的技术。自从首次证实人工构建的反义寡核苷酸在真核生物中具有生物学效应以来，反义技术受到人们的普遍关注。尤其是反义RNA技术，因其安全性好、操作简便、调节效率高等优点发展迅速，己成为反义技术研究的主流。”。反义RNA最初发现在细菌中，它们是一些较短的、散布的转录物⋯1，本身缺乏编码能力，但可以通过碱基配对的方式与靶的特定区域互补，从而抑制基因的正常表达。因此，反义RNA是高度特异的基因表达抑制因子”“，它已渗透到包括农艺品质改良等研究在内的很多领域，如在控制果实成熟的研究过程中反义RNA技术就起到举足轻重的作用。Hamiltonetal应用反义RNA技术抑制转基因果实中ACC氧化酶的活性，实现对乙烯活性和果实成熟的控制，是世界上首次获得减少乙烯生成的转基因植株m1。投入商业化生产的转基因番茄标志着应用反义RNA技术控制果实成熟已迈向一个新的阶段。在甜瓜耐贮运转基因方面，目前除有法国的Ayub外，内蒙古大学的哈斯阿古拉、尹俊也用此项技术获得了转基因耐贮河套蜜瓜⋯⋯。可以说，利用反义RNA技术，以ACC氧化酶基因作为目的基因在耐贮运基因工程方面有广阔的前景。1．4目的基因对植物的遗传转化现在应用的遗传转化方式主要有农杆菌介导法、外源DNA直接导入法和种质转化法。三种转化方式各有优缺点，以农杆菌转化法和种质转化法最为常用。而种质 4ACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化转化法中的花粉管通道法同其它转基因技术相比，这项技术具有简单方便、育种时间短、任何基因来源都可用来基因转化，并可直接运用到常规育种中等优点，被广泛的应用到多种作物中m，。所谓的花粉管通道就是植物授粉后，花粉在柱头上萌发形成花粉管，穿过花柱进入子房，沿子房的内壁或胎座继续生长直到胚珠。胚珠在授粉之前，珠心是一个封闭的体系，在花粉管到达之前，从珠心到胚囊的一些珠心细胞退化形成一条便于花粉管生长的通道m。随着现代分子生物学的进展和基因工程的出现，外源DNA通过花粉管通道进入胚囊这一事实，被许多学者证实。龚蓁蓁等(1988年)用3H-DNA注入到棉花子房，从3H-DNA放射自显影中清楚的看到：外源DNA只能经过珠孔进入开放的珠心到达胚囊，而在花粉管中没有找到3H—DNA，说明DNA不是进入花粉管后再进入胚囊，花粉管通道是外源BNA进入胚囊的唯一通道m，。1988年，Luo等人用花粉管通道法将含报告基因的质粒DNA转入水稻，得到了转基因植株n“。1993年，曾君祉等和Chong等用该法获得转基因小麦“⋯“。Dewet则用该法转化玉米叶斑病抗性基因，也获得转基因玉米植株一”。哈斯阿古拉(2000)首次在河套蜜瓜上应用该法转化ACC合成酶基因获得成功w。至此，花粉管通道法转基因已经在多种作物中获得了成功，前景广阔。1．5研究内容及意义利用遗传转化导入抑制乙烯合成的基因对于延长河套蜜瓜的贮藏期是一种快速有效的解决办法。为此，我们对河套蜜瓜的授粉受精生物学进行了研究，得到了不同时期花粉管的生长情况，为利用花粉管通道法转化基因打下了基础。另外，从河套蜜瓜果肉部分提取了总DNA，利用报道的甜瓜ACC氧化酶基因5、端序列合成两条引物，用PCR法扩增出ACC氧化酶基因cDNA片段，并将此基因反向克隆到植物表达载体pBINYXW中，控制在组成型表达启动子CalVIV35S下游，利用它通过花粉管通道法转化河套蜜瓜。期望通过反义ACC氧化酶基因在河套蜜瓜中的表达起到保鲜的作用。2材料与方法2．1实验材料：2．1．1材料甜瓜栽培品种河套蜜瓜(CuCumisme]oL．cvHetao)种子，系巴盟农业科学研究所提供。212试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、TakaRaTaq酶购自大连宝生物工程公司；PCR试 宣夔宣窒些查兰塑主兰垡堡塞!剂、pUCMarker，BNA回收试剂盒购自上海生物工程公司·2．1．3质粒：质粒性状来源2．1．4菌株：名称E．coliDH5a性状SupE44Alacul69(V801aczAM15)HsdRl7recAlendAlgyra96ThilrelAl来源本室保存2．1．5有关试剂及溶液配置2．1．5．1主要培养基LB培养基：蛋白胨109，酵母提取物59，NaCIlOg，溶于1000ml水中，PH7．0固体培养基每L加159琼脂粉，高压灭菌。2．1．5．2主要溶液STE溶液：lmoi／1Nacl，lOmmol／iTric—ci(PH8．0)，l跚ol／lEDTA溶液I：50mmol／l葡萄糖，10硼01／1EDTA，25mmol／1Tric-cl(PIt8．0)，分装后高压灭菌，4"C冰箱贮存备用，使用前加溶菌酶lOmg／ml。溶液II：I％SDS，0．2mol／INaOH。溶液IⅡ：5M乙酸钾60ml，冰乙酸11．5ml，水28．5ml，高压灭菌。RNaseA(10mg／m1)：lOn】IIlol／iTris—Hcl(PH7．5)，15mmol／iNaCl溶液配置，100。C煮沸lOmin，冰浴冷却，-20℃保存备用。TE缓冲液(PH8．0)：lOmmol／1Tric—C1(PH8．0)，Immol／IEDTA(PH8．0)氨苄青霉素储液(100mg／m1)：无菌水配置，一20"C保存备用。卡那霉素储液(100mg／m1)：无菌水配置，一20。C保存备用。水溶性苯胺兰：3．429K。HPO；，0．0059苯胺兰，PH值在9—10之间，至lOOml，4V贮存备用。I*SSC：在800ml水中溶解8．7659NaCl和4．419柠檬酸钠，调PH值至7．0，加 AcC氧化酶萋因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化水定容到lL，分装后高压灭菌。CTAB：2．429Tris加入到150ml水中，加3M的HCI约3．2ml，调PH至8．0，然后加入NaCl约15．369，4m1500mmol／lEDTA，CTAB29，定容至200ml，灭菌常温保存。5*TBE：54酊ris，27．59硼酸，20m10．5mol／IEDTA(PH8．0)，定容至1000ml。50*TAE：2429Tris，57．Iml冰乙酸，IOOmlO．5mol／1EDTA(PH8．0)，定容至1000ml。2．1．6实验仪器：冷冻离心机，PCR仪，硬度计，甜度计，分光光度计2．2实验方法2．2．1Acc氧化酶基因的PCR扩增、克隆及鉴定2．2．1．1引物设计与合成参照ACC氧化酶基因序列m3合成2条脱氧寡核苷酸链，在引物2的5’末端设计有BamHI位点，引物序列如下：P1：j’ccAAAACAAAACC丌GATACcAAAGAGTTC37P2：5’∞医幽TCATTGATGTTTTCCMGTT3’⋯f2．21．2河套蜜瓜总DNA的提取植物总DNA提取方法参考文献⋯并加以改进：(1)取大约lg新鲜河套蜜瓜果肉，于液氮中研成粉。(2)将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入iml65。C预热的2倍CTAB提取缓冲液中，充分混匀，65℃保温90分钟，其间不时摇动。(3)加入等体积氯仿／异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r／min离心10分钟。(4)将上清液转入另一离心管中，加入1／10体积的IO％CTAB，混匀，加入等体积氯仿／异戊醇，颠倒离心管混匀，室温下，12000r／min离心10分钟。(5)取上相，重复(4)操作1次。(6)将上相转入新离心管，加入l倍体积的l倍CTAB沉淀缓冲液，混匀，室温放置30分钟，4000r／min离心10分钟，去上清，TE回溶。(7)加入3MNaAc，使终浓度为0．3mol／L，2倍体积无水乙醇，～20。C放置l小时以上。(8)离心10分钟，沉淀吹干，50uLTE回溶。 内蒙古农业大学硕士学位论文72．2．13ACC氧化酶基因的PCR扩增反应以上面提取的植物总DNA为模板，以Pl、P2为引物，在25uL体系中进行PCR扩增，反应体系如下表：表1ACC氧化酶基因的PCR扩增反应体系反应物反应量总DNAluL94"Cj顶变性5min，94。C变性30sec，55℃退火30sec，72。C延{030sec，共30个循环，72。C延伸5min。2．2．1．4扩增产物检测扩增产物用1．5％琼脂糖凝胶(TBE)检测。2．2．1．5连接将PCR产物和pMD一18一T质粒载体进行连接，反应体系如表2表2PCR产物和pMD-18一T质粒载体连接体系■==：：—————————————————————————————————一一反应物反应量。————————————————————————————————————————～一PCRfraglOng0‘一pMD18一T(2．7Kb)水s01utionlOOng3uL5“L100ng4uL5uL总体积10uL10uL————————————————————————————————一_16"C连接过夜。2-2．1．6感受态细胞的制备：参照金冬雁⋯1中方法从E·c。liDH5Q的37℃过夜培养的平板上挑取同一单菌落，分别在LB—Amp 8ACc氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化—————————，————————————————_————————————-————————，_—-—————————，_—-—————————_—-—————————●_——————————一一LB—Kan及LB一无抗生素固体平板上划线，37。C过夜培养。选用在前=平板均无菌落出现，只在LB无抗生素固体平板出现的单菌落，取一接种于LB液体培养基中振荡培养过夜。从中取出0．5mL接种于50mLLB液体培养基中，37。C震荡培养2—3小时，待E．C01iDH5Q长到对数生长期即0D。。o=O．5时，立即置于冰中lOmin后，4000rpm离心5min，弃上清，用冰冷的0．1MCaCl。重悬，重复一次(第一次用原体积的l／5CaCl：，第二次用原体积的1125CaCl。)。将制各好的感受态细胞每100uL分装于Eppendorf管中，加30％甘油混匀，放于-70℃冰箱中备用。2．2．1．7E．COIiDH5Q的转化取两管感受态细胞，分别加入2．2．1．5中的连接液及对照，轻弹管壁混匀，冰浴30min，42℃热激90S，立即冰浴3min，每管加200uLLB液体培养基，37℃震荡培养1小时，每～管取100uL涂于含x—gal、IPTG的氨苄青霉素平板上，37。C倒置培养过夜。2．2．18筛选重组子(1)碱裂解法”孙量提取质粒挑LB平板上的单菌落接种于20ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37。C振荡培养过夜，将菌液倒入1．5mlEppendorf管中，10000rpm离心imin。弃上清，加入溶液IlOOu]，振荡混匀，冰浴lOmin；加入新配置的溶液II200ul，轻摇混匀，冰浴5min；加入预冷的溶液Ⅲ150ul，微摇混匀冰浴10min。12000rpm、4℃离心10min，吸取上清液400ul，加入两倍体积的无水乙醇，室温放置2min。12000rpm、4℃离心5min，弃上清，倒扣离心管用纸巾吸干。1ml70％乙醇洗涤DNA沉淀后，12000rpm、4℃离心5min。去上清，真空干燥1—2分钟。lOOulTE回溶，一20℃保存。(2)从2．2．1．7转化子平板中挑取白色单菌落，碱裂解法小量提取质粒，并作电泳分析，初步鉴定为重组子的定名为pMD一18一T—ACC，并用新合成的引物：p3：5、AAACAAAACCTTGATACC3、p4：j、ATGTTTTCCAAGTTGATG3’进行PCR扩增并鉴定方向，反应体系如下表：94。C预变性4min，94oC变性imin，50。C退火imin，72。C延伸lmin，共30个循环，72。C延伸5min。1．O％琼脂糖凝胶电泳，加分子量Marker和阴性对照，留反向质粒备用，并把鉴定为阳性克隆的重组质粒进行序列分析。 内蒙古农业大学硕士学位论文922．2Acc氧化酶基因植物表达载体的构建和鉴定2．2．2．1质粒提取：参照碱裂解法2．2．2．2pBINYXW载体的构建(1)限制性DNA内切酶消化：EcoRI和HindIII双酶切pUCl8和pBINYX，反应体系如下表表4酶切pucl8和pBINYX反应体系反应物反应量～—————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————～pBINYX(500ng)putl8(500ng)EcoRIHindllIlOxBufferBSAdH。0总体积20uL20uL37℃反应3小时。(2)回收DNA片段分别在1．O％琼脂糖凝胶上电泳pUCl8／。。和pBINYX／。消化产物，用回收试剂盒回收pUCl8／w大片段2．7Kb和pBINYX／。小片段一1．4Kb。 10ACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化(3)连接将回收的pUCl8／。。大片段一2．7kb与pBINYX／Ⅲ小片段1．4kb连接，反应体系见下表：表5putl8／”与pBINYX／。连接反应体系反应物反应量pBINYX(150ng／uL)pUCl8(100ng／uL)10*Bufferr。ONA连接酶ddH。0(灭菌)总体积16℃反应过夜。(4)感受态细胞的制备与2．2．1．6中相同。(5)E．coliDH5d的转化取两管感受态细胞，前一管将连接产物全部加入，第二管加入感受态细胞作为对照，混匀冰浴30min，42"C热激90S，立即冰浴3min，每管加200uLLB液体培养基，37℃震荡培养1小时，每一管取100uL涂LB-Amp(30mg／1)平板，37。CN置培养过夜。(6)筛选重组子挑取单菌落摇菌，用碱法提取质粒，1％琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定，取鉴定为阳性克隆的重组子，命名为pBINYXW，备用。2．2．2．3ACC氧化酶基因表达载体的构建(1)酶切回收用BaIIlHI和SalI对pBINYXW和pMDl8一T-ACC进行双酶切，酶切体系如下表：酶切体系30ul，反应3小时后，用1．5％琼脂糖凝胶(TAE)电泳，30u1全部上样。电泳结束后，切pMDl8一T—ACC留取小片段一O．12Kb和pBINYXW留取大片段一3-9Kb，回收试剂盒回收。1．O％琼脂糖凝胶(TAE)电泳检测回收产物浓度，为连接反应做准备。 内蒙古农业大学硕士学位论文I(2)连接将回收的BamHl与Sail双酶切后的消化产物pMDl8一T—ACC小片段～0．12Kb和pBINYXW大片段一3．9Kb进行连接，反应体系如下表：表7pMDl8一T—ACC和pBINYXW连接反应体系反应物反应量PBINYXW1ulpMDl8一T—Ace1ulT4DNALigaseIu1lO*Buffer2u1无菌水5ul总体积10u1连接体系lOul，16℃反应过夜。(3)转化及鉴定转化方法同上，从转化后的平板上挑取单菌落摇菌提质粒，然后将提取的质粒上样电泳及PCR检测，PCR体系如下表：反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性lmin，52"c退"Almin，72℃延伸lmin，共30个循环，72℃延伸5min。PCR结束后，用1．5％琼脂糖凝胶(TBE)电泳。将初步鉴定为重组予的pBINYXW—ACC进行序列分析：用正向引物P3对重组质粒pBINYXW—ACC中的插入片段进行核苷酸序列测序，并将测序得到的重组子pBINYXW—ACC命名为pBINYW。儿以“毗oo一¨血“们oo一圳吲一一黜。一 12ACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化表8PCR检测pBINYXW—ACC反应体系反应物反应量M矿10*BufferdNTPTaq酶P3P4pBlNYXW—ACC超纯水2ul2．5ul025ul02ul2．5u1luli4．05u】总体积25u12．2．3河套蜜瓜授粉受精生物学的研究2．2．3．1为观察花期受粉受精过程，2002年6月13日将当天开的完全花去雄套袋7时开始分批授以当天开放的雄花花粉，试验设计见表9。表9授粉设计方案授粉授粉花数固定时间(小时)时间(朵)13日13目13日14日9：05lj：052l：053：057：059：35～——————————————————————————————————————————————————————————————一一13目7：05252h8h14h20h24h1．5h26h20皿inlh7h13h19h23h30min25h6h5h12hllh18h22h】7h2lh1l：05154hlOh16h12：05153h9h15h注：每次采样5朵固定2·2·3．2固定液用FAA(甲醛：醋酸：无水酒精=1：1：8)，在固定液中可长期保存。按实验设计采集带花柱的子房，放入围定液中。观察时将带花柱的子房用切片∞0拍加∞加踮拍∞踮∞|=n乳&吼‰ 内蒙古农业大学硕士学位论文纵切，软化(无水酒精：浓HCI=I：1)5min，取出后用蒸馏水冲洗3遍，再用蒸馏水浸泡lh，水溶性苯胺兰m，染色3h以上，压片，Olypus荧光显微镜观察并照相。2．2．4河套蜜瓜的遗传转化2．2．4．1质粒的大量提取⋯1将鉴定后的ACC氧化酶基因反义表达载体转化，转化方法同上。挑单菌落接种于20miLB液体培养基中(加Amp)，37。C振荡培养过夜。将得到的菌液取lOml加入含相应抗生素的500mlLB培养基中扩培。至OD。>O．5时，8000rpm离心5min，收集菌体，用STE反复洗涤沉淀2次，离心，收集菌体，用lOml溶液I悬浮沉淀，室温放置5min；然后加入20ml新配制的溶液II，缓慢倒置离心管混匀内容物，冰浴lOmin；再加入预冷的15ml溶液III，轻轻混匀，冰浴lOmin：10000rpm、4"C离心15min：取上清液，加2／3体积的异丙醇，充分混匀，一20℃放置lh；12000rpm、4"C离心15min；弃上清，干燥沉淀，加ImlTE溶解沉淀，溶入RNaseA至终浓度40mg／L，于37℃消化30minRNA，再加入等体积的酚／氯仿／异戊醇，氯仿／异戊醇各抽提1次，12000rpm、4℃下离心5min，取上清液，加入0．1倍体积的NaAC(3M)和2倍体积冰冷的无水乙醇，一20℃放置lh；12000rpm、4℃离心lOmin，沉淀用70％乙醇洗一次，真空抽干沉淀，溶于lmlI*SSC中，测光密度值，OD。。／OD。。>1．8、浓度在0．img／ml左右，一20℃贮存备用。22．4．2河套蜜瓜的遗传转化(1)2002年6月26日将次日将开的完全花去雄套袋，备用。(2)柱头涂抹法I：2002年6月27日早7时，选取部分已去雄套袋的花，滴加lOul外源DNA(2．2．4．1中所提质粒，下同)于柱头上，隔5min后，再授以本株雄花花粉，并将子房竖直固定、套袋。(3)柱头涂抹法II：选取部分花在授粉20—30min后，再涂抹lOul外源DNA于柱头上，并将子房竖直固定套袋。(4)柱头切割法：选取部分花在授粉2．5h之后，用手术刀仔细切去部分柱头，然后滴加lOul外源DNA于花柱上，将甜瓜子房竖直固定套袋。(5)子房注射法：选取部分花在授粉后12—24h后，用微量注射器吸lOul外源DNA，轻轻沿着花柱注射到子房里，注射部位在子房靠上部的i／3处，然后套袋，并固定好子房。(6)以上几个处理分别都设有对照，为I*SSC溶液对照及只授粉而不滴加任何外源物质的空白对照，具体处理方法见表10。 14ACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化2．2．5采收2002年8月4日及8月8日分两批采收处理过的河套蜜瓜，并进行硬度和甜度的分析。2．2．51硬度分析去掉河套蜜瓜外约2—3m厚，lcm2见方的表皮，用硬度计垂直插向果肉，用力要均匀，记录所测硬度，每颗瓜选3个部位，取平均值。2．2．5．2甜度分析切开河套蜜瓜，选取中果皮及果肉各1cm3见方，挤出汁液放在甜度计上测出外糖、内糖含量，重复三次，取平均值。3结果分析3．1AcC氧化酶基因的克隆及PCR鉴定3．1．．；根据甜瓜ACC氧化酶基因5、端序列合成2条引物，扩增河套蜜瓜果肉总DNA，产物用1．5％琼脂糖凝胶上样电泳，电泳结果如图(1)：M：^DNAEcoRI／HindllIMarker1：阴性对照2—4：扩增产物图1PCR扩增河套蜜瓜总DNA结果3·1·2经扩增后产物因其两端都带A，连到pMD一18一W载体上，然后用M13正向测序 内蒙古农业大学硕士学位论文15引物和ACC氧化酶基因的正向引物P3为引物，以pMD一18一T—ACC为模板进行扩增，只有反向构建到pMD一18一T上的基因才能被扩增出来。扩增产物用1．5％琼脂糖凝胶上样电泳，电泳结果如图(2)：M：^DNAEcoRI／HindllIMarker1：阳性对照2：阴性对照3：扩增产物图2PCR鉴定pMDl8-T-ACC结果3．1．3重组质粒的序列分析对经PCR鉴定为阳性克隆的pMD—18一T—ACC质粒进行测序分析，测序结果与ACC氧化酶基因比较，与AcC氧化酶基因5’端序列完全相同，序列分析结果(附图1)3．2ACC氧化酶基因植物表达载体的构建与鉴定32．1pBlNYXW载体的构建将连接好的oBINYXW转化并提取质粒，上样电泳(1％琼脂糖凝胶)，经与分子量marker比较之后t证明pBINYXW就是所需要的质粒载体，电泳结果如图(3)：M：LambdaDNAEcoRI／HindlIIMarkerI：阴性对照2—5：所提质粒图3质粒电泳结果3．2．2ACC氧化酶基因表达载体的构建与鉴定 6ACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化如构建图谱所／下．将pMD一18卜A(’L经BamHl及salI双酶切后定向插入到经同样酶切的pBjⅥxw载体卜，从转化后得到的克隆提取‘菌落经PCR鉴定，确认ACC氧化酶基因L反向插入到pBINYXW中，得到pBINYW，对其进行PCR后电泳(i．5％琼脂糖凝胶j．结果如图【4)：M：^DNAEcoRl／HindllIMarker1—2：阳性对照3：pBINYW的PCR产物图4PCR鉴定pBlNⅧ结果从电泳结果可以看出：l号样品是两个引物Pl、P2，PCR扩增总DNA后得到的128bp的片段c2号为pMD一18一T—ACC用p3、p4为引物，经PCR反应后得到的108bp的片段。3号为pBINYW用p3、p4为引物经PCR反应后得到的108bp的小片段。将得到的重组克隆pBIXYXW—ACC测序，测序得到的序列与甜瓜ACC氧化酶基因的j、端对比完全相同，符合设计目的，从而证实了该质粒即为含有ACC氧化酶基因的重组表达载体，命名为pBINYWa由构建图谱可以看出表达载体的结构：ACC氧化酶基因处于CaMV35S启动子“Q”序列和NOS终止子之间，且含有T-DNA的左边界，它可随T—DNA整合到植物基因组中，加“Q”序列的作用是加强翻译。另外构建载体时去掉了NPTII基因，提高了实际生产中的生物安全性。(附测序图2)33河套蜜瓜授粉受精生物学的研究33．1河套蜜瓜子房平均长度约为16．5mm，花柱长约为4mm一5mm，从花柱顶端到子房入口的胚珠约为5mm一6mm。32花粉萌发：甜瓜的成熟花粉的形状为近圆三角形，略显浅黄色，一般有三个萌发孔授粉后·可以看出每个萌发孔都有小突起出现(附图3)，但只有一条花粉管能伸长附图_{r授粉后约20min，花粉管开始萌发，30min左右花粉管开始进入柱头、附图j已萌发的花粉管．由于生长速度不尽相同。大约4h以后内容物全部转 内蒙古农业大学硕士学位论文移到伸长的花粉管中，所以花粉粒变得透明(附图6)。33花粉管的伸长(1)花粉管进入柱头后顺花柱向下伸长，进入子房后，大部分沿胎座中心空隙向子房下部生长(附图7)。在授粉后约13h，花粉管已有部分到达子房底部，并有少量花粉管开始横向生长，伸向胚囊(附图8)。(2)在授粉后约2h，花粉管到达子房顶部，进入子房后花粉管的生长速度开始减慢，约8h花粉管尖端开始膨大，即开始释放内容物。释放完内容物的花粉管会逐渐消失。据观察，在授粉后约23h，大部分花粉管都己消失。25—26h左右，即完成全部受精过程(附图9)。(3)花粉管生长过程中，在显微镜下可观察到花粉管中隔一定距离即有一亮点出现，即为栓塞(附图10)。它的成分是胼胝体，作用是保持花粉管内形成一定的渗透压，促进花粉管的不断延伸，但栓塞之间的距离不定，有的间隔距离大些，有的{、司隔贝0很小。34河套蜜瓜的遗传转化3．4．1利用花粉管通道法将ACC氧化酶反义基因转化到河套蜜瓜中，三种方式共处理603朵花，收获果实76颗，结实率为12．27％。34．2利用柱头切割法进行滴注共做了411朵花，收到瓜17颗，结实率4．14％：对照用I*SSC溶液进行滴注，处理了20朵花，收获瓜1颗，结实率为5％。收获的17颥瓜中，硬度在4．3kg／cm2以上的有7颗，占到总收获的瓜数的41．18％，这7颗瓜中甜度(外糖、内糖)在14和12以上的有2颗，占到了总收获数的11．76％；I*SSC溶液处理后硬度在4．3kg／cm2以上，糖(内糖、外糖)含量超过12和14的为零。表”柱头切割法处理效果的显著性分析34．3利用子房注射法共做了93朵花，收获果实14颗，结实率为15．05％，对照i*SSC溶液进行注射，共处理了20朵花，收获瓜3颗，结实率为15％；收获的14颗瓜中，硬度在4．3kg／cm二以上有6颗，占这部分处理的42．86％，在这6颗硬度在4．3kg／cm2 !!垒!曼堑垡堕墨里垦兰壅姿墼堡塑塑壅墨塑塑壅璧巫塑壁些一以上的瓜中，含糖量(外糖、内糖)在14和12以上有4颗，占同种处理所收获瓜的28．58％；1．$SC溶液处理后收获的3颗瓜中，有1颗的硬度在4．3kg／c一以上、含糖量(内糖、外糖)含量超过12和14，占同种处理所收获瓜数的33．3％。襄12子房注射法处理效果的显著性分析3．4．4利用柱头涂抹法共处理了99朵花，收获45颗瓜，结实率为45．45％，对照用I*SSC溶液进行涂抹，共处理了20果花，收获7颗，结实率是35％；收获的45颗瓜中，硬度在4．3kg／cm2以上、含糖量(内糖、外糖)含量在12和14以上的有8颗，占到17．78％，而对照I*SSC溶液用同法处理得到的7颗瓜中，硬度在4．3kg／cm2以上，外糖、内糖含量在14和12以上的有I颗，占同种处理的14．29％。表13柱头涂抹法处理效果的显著性分析3．4．5对于100朵只授粉而没作任何处理的空白对照，收获果实59颗，结实率是59％，硬度在4．3kg／c一以上的有20颗瓜，占到了收获果实数的35％，在这20颗瓜中，外糖、内糖含水量量在14和12以上的有3颗，占总收获果实的5％。表14三种处理方法与空白对照处理效果的显著性分析 内蒙古农业大学硕士学位论文194讨论4．1AcC氧化酶基因的克隆由于本实验的目的是用反义RNA来抑制ACC氧化酶基因的表达，有实验表明”“，40个碱基的反义RNA即可结合于mRNA上，抑制mRNA的翻译，从而阻断基因的表达。本实验扩增了ACC氧化酶基因的5、端序列，使之反向克隆于载体上，在导入植物体后，能于mRNA的5、端互补结合，达到阻止其翻译的目的。4．2表达载体的构建以往的实验中用花粉管通道法转化植物时，所用载体均为Ti质粒载体”⋯，因其较大，构建上有一定难度。本实验中，我们用EcoRI和HindIII将具有完整表达框，并且具有T区左边界的小片段从pBINYX(13．6kb)上切下来，装到pUCl8质粒载体上，构建适合做花粉管导入的表达载体。此表达载体约有4kb，构建相对容易，又因带有T区左边界及完整表达框，可以在导入植物后与植物基因组进行整合并表达。而且在构建表达载体时最重要的是去除了NPTII基因，这也是本实验的一个特色。去除了这个选择标记，提高了这项转基因实验的安全性。43甜瓜授粉受精生物学的研究由于使用花粉管导入法必须了解河套蜜瓜授粉受精的生物学，为此我们使用了两种方法对此进行了研究。实验表明：研究方法的选用与固定时间的长短有直接关系。(1)在采集的子房固定的48小时之内，可以选用番红一苯胺兰染色，用普通显微镜观察即可，但这种方法对于固定时间长的子房不适用。(2)苯胺兰染色法对子房被固定的时间长短没有要求，但对于河套蜜瓜来说，对于配制苯胺兰的缓冲液有所要求。文献中””所报道的KH2P04所配的苯胺兰溶液染色效果不理想，不易观察到花粉管的生长。应用l(H。P04所配的溶液效果很好，但应低温保存，且存放时间以4—5天以内为宜。在苯胺兰染色过程中，用蒸馏水冲洗和苯胺兰染色这两步处理的时间由1h和2h分别延长卜2个小时，效果会更好。4．4河套蜜瓜的遗传转化通过3．4的显著性分析可以看出：4．4，1对于三种转化方式来说，对结实率都有～定的影响，但柱头涂抹法对结实率影响较小：因柱头切割法是切去部分柱头，对结实率影响最大。4．4．2用三种转化方法处理后的果实硬度和含糖量都与SSC对照及空白对照有显著 2oACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化差异。予房注射处理后的果实在硬度和含糖量上的变化最大，但即使变化最小的柱头切割法也高于空白对照及SSC对照。我们已选择出硬度和含糖量有别于对照的30颗瓜的种子播种于巴盟农科所，以进一步进行转基因表达及对贮存特性的影响的研究。4．4．3综合结实率及硬度和含糖量三方面的因素，柱头涂抹法是较理想的花粉管通道法转化方式，而在子房注射法的应用过程中，如能克服对结实率的影响，则不失为一种理想的转化方式44花粉管通道法不需要进行组织培养，实验成本低，而且可直接获得种子，操作简便易行，又适合花器大，多胚珠的甜瓜类作物，所以对河套蜜瓜转基因来说是首选的转基因方法。5结论51通过河套蜜瓜授粉受精生物学的研究得到了河套蜜瓜授粉后不同时间内(从授粉后开始到授粉后的26小时之内)花粉管的生长及受精情况，这对基因导入等生物工程都可起到一定的指导作用。5．2用PCR扩增出河套蜜瓜ACC氧化酶基因的5、端部分序列包括5、非翻译区和编码序列的一部分，得到了阳性克隆pMD—18一T—ACC。5．3将克隆的ACC氧化酶基因片段进行全序列分析，证明序列正确符合预期设计。5．4构建了CaMV35S启动子驱动的反义植物表达载体。55通过对反义植物表达载体的序列分析，证明序列正确符合预期设计。5．6通过对河套蜜瓜授粉受精生物学的研究，可知：授粉后约20min，花粉管开始萌发；30min左右花粉管开始进入柱头；授粉后约2h，花粉管通过花柱到达子房顶部：授粉后约8h开始受精：授粉后25—26h可完成全部受精过程。5．7通过对河套蜜瓜授粉受精生物学的研究的基础上，利用花粉管通道法将外源的反义ACC氧化酶基因导入河套蜜瓜，得到了硬度和含糖量上区别于对照的果实，将这些果实的种子采收，为进一步研究ACC氧化酶基因的表达及其表达对保鲜所起的作用打下了坚实的基础。 内蒙古农业大学硕士学位论文21致谢本论文是在云兴福教授和尹俊讲师的悉。指导下完成的，从论文题目的确定，试验设计至整个实施过程中，都给予了精。安排和指导。他们严谨的治学态度和工作作风永远是我学习的榜样。在三年的学习生活中，始终得到他们的谆谆教诲和亲切关怀，我所取得的每一点进步，无不凝聚着恩师的m血，论文的完成是他们辛勤指导的结晶。感谢农学院和生物工程学院的老师对我的帮助与指导，特别是赵清岩老师在实验设计上提供的宝贵意见；感谢李淑芬、邢燕平、郝丽珍、马力国、刘杰才、杨文秀、陈桂华老师在各方面对我的照顾；何勇、姜亚峰、齐秀丽等同学协助进行了材料的准备；张智、杜傻卿同学在论文的修改及整理过程中提供了帮助，谢谢你们。我的论文是所有关a和爱护我的人们的共同。血和汗水的结果，特此一并致谢! 塑薹直壅些盔兰堡主堂堡笙塞：!参考文献1胡新宇等水果贮藏保鲜技术的进展．沈阳农业大学学报，2000，32(6)2彭国勋等．果蔬保鲜工艺与技术．包装与食品机械，1996(1)：23—303陈雷，秦智伟．甜瓜采后生理和贮藏保鲜研究进展．北方园艺，1999(6)4．林河通．现代果品贮藏保鲜技术的进展食品与机械，1994(6)：5—75．潘永贵等．我国果品贮运保鲜的现状和发展趋势．食品科学，1996(4)6徐文迭．食品气调包装技术食品与机械，1994(4)：7—97．汪禄祥．果蔬贮藏保鲜中所采用的物理技术方法食品工业科技，19968．毛琼等．中草药提取物保鲜水果的效果研充食品科学，1999，20(5)9．王东昌板栗烂果病的生物防治研究中国果树，2001(3)：10—1259旷一59424—2766—69(4)：77—7954—5610．蒋侬辉．果树保鲜技术及保鲜设施新动态．韶关学院学报，2002(2)：14一1611叶志彪，李汉霞等．转基因技术育成耐贮藏番茄一华番1号．中国蔬菜，1999(1)：6～12．宋刚，林顺权反义RNA技术控制果实成熟的研究进展福建农业大学学报，2000，29(4)：421—42813刘愚果实成熟及其调节．余叙文，汤章城植物生理与分子生物学北京科学出版社，1998．61(卜61914徐昌杰，陈昆松等．乙烯生物合成及其控制研究发展．植物学通报，1998，15(增刊)：54—6115．YangSF,HoffmanNE．Ethylenebiosynthesisanditsregulationishigherplants．AnnRerP1physiol，1984，35：155．16．骆蒙，方天祺河套蜜瓜软化的生理生化研究．内蒙古大学学报，，1998，29(3)：402--40617VereridisPJohanP．Completerecovery,inintmofethyleneformingenzymeactivity．Phytochemistry1991，30：725．18-Lasserre．DifferentialactivationoftwoACCoxidasegenepromotersfrommeloduringplantdevelopmentandinfesponsetopathogenattackMolecularandGeneralGenetics，1997，(3)，211—222：19．HoldsworthMJ．Structureandexpressionofanethylene—relatedmRNAfromtomato．NuclAcidsRes，1987，15：73120·Dong．JG·SequenceofacDNAcodingfora1-aminocyclopropane一1一carboxylateoxidasehomologfromapplefruit．PlantPhysiol，1992，98：153021·RossGS，‰i曲toilMLAnethylene—relatedcDNAfromfipemngapples．PlantMolBiol，1992，19：213--23822·CaUahanAM，MorgensPH．Comparisonofpch313RNAaccumulationduringfruitsofteningand 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26Acc氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化附录弘>l二≥睦￡一’i一=；)，‘≥=。匿：}；争c三≥=_==三=一三；一，：≥：≥c=；：三一s：j篓。』≥圣～．．i姜jj≮。．5≥o：=三二)姜i旁n三；?二==二j一鎏。≥至’，爹sii：==一拿i}；董三≥：毫；亏P．：岁gi≥§j≥。j≥§；喜。j，二=：_=一。4拿；烈摩；一萎：；，、兰兰+i爹≤萎～i摹2|裂=三三一。j≥。§：主兰～：三一=三≥：善；；；。；奏麓瑟：≥i萋羹j≥三?一：≥?§§i之；j蚤j；一；：薰≥i专§?主二j霎ii}j霎《至!!萎錾圣；≥。i；8；≥：≥；至～ii；暑；至l≥：墨。!耋；r厂。，{巨；ii；；’!引≥i；；≥：妻；l萝；：≥≤≥。j己?。’o毒8；附图1pMD-18·T-ACC质粒测序分析结果 ，●u⋯⋯，"⋯⋯-～●⋯．{{{iij。ili．ii{ii附图2pBINYW测序结果：：薯xr／一叁一’_，一二二)蔓立一F≥=====；-》三；)≥一)：《。n<．：》乏==)：芏；．§≥>》，3-_《N04^v-_- 28ACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化附图3几个萌发孔同时出现突起(X40)附图4最终1条花粉管仲长(×40)附图5花粉管开始进入柱头(×10)附图6透明的花粉粒(×40)附图1在胎座中向下生长的花粉管(x40)附图9完成全部受精后的胚囊(×40) 内蒙古农业大学硕士学位论文29附图8横向生长的花粉管(×40)附图10栓塞(×40) 30ACC氧化酶基因反义表达载体的构建及对河套蜜瓜的转化附图11pBinYW构建路线示意图0二№n 内蒙古农业大学硕士学位论文作者简介王翠艳，女，汉族，1978年9月27日出生于内蒙古通辽市。1993--1996年就读于内蒙古通辽市扎鲁特旗第一中学1996--2000年就读于内蒙古农业大学农学院园艺专业，获农学学士学位2000—2003年就读于内蒙古农业大学农学院蔬菜学专业攻读硕士学位，+师从云兴福教授