黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探 59页

ByYoumeiWangMastersupervisor：Dr．Prof．FanglinLiuADissertationSubmittedtoTheUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofMasterofEcologyXishuangbannaTropicalBotanicalGarden，TheUniversityofChineseAcademyofSciencesMay，2013 独创性声明IIIIIIIIIIIIIIIIIlY2430918本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人或集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到并承担本声明的法律结果。学位论文作者签名：互看羡日期：Ⅵ?乡．j．乡D关于论文使用授权的说明本人完全了解中国科学院西双版纳热带植物园有关保留与使用学位论文的规定，即：中国科学院西双版纳热带植物园有权保留送交论文及复印件，允许论文被查阅或借阅；可以公布论文的全部或部分内容，可以采用复制或其它手段保存论文。(保密的论文在解密后应遵守此规定)作者鼢磁灸新签名：易懈嗍Ⅵ膨"。 致谢三年的硕士生涯，愿意与否，即将随着毕业论文答辩而收尾。回顾一下，在学业上经历了挫折和困难，但都坚持下来了。欣喜之余，内心更多地充满了感激，想起那么多给过我帮助的人，心里满满的都是暖暖的谢意。首先，向导师刘方邻研究员致以最衷心的感谢!从选题、研读文献、开题、实验、数据处理到毕业论文的撰写，每一步对我来说都较艰难，沮丧过、迷茫过。刘老师给我鼓励和帮助。刘老师不仅对学生的培养要求严格，同时也注重培养学生的独立思考和独立科研能力。刘老师严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作和学习中的榜样，他循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我启迪÷同时，在生活上也给予我关怀。在此，谨向恩师表达学生由衷的感激之情和崇高的敬意!我还要十分感谢刘爱忠老师，他为本研究提供了实验平台，本研究主要实验是在刘老师实验室完成的。另外，在实验方法和数据处理方面，刘老师给了我许多指导和建议，让我少走弯路，非常感谢刘爱忠老师。感谢师兄徐伟对我不断督促以及数据处理方面的悉心指导与帮助。感谢昆明植物所的贺水莲师姐对我数据处理方面无私地帮助。师姐弥宪洁在实验过程中给与了很大帮助，让我学到了实验操作的技巧，在此感谢她。感谢分子遗传与育种实验室的全体老师和师兄弟师妹在我的学习、实验和生活中给予的诸多帮助!对于图书馆、人事处、后勤处的各位老师在我的学习、生活中所提供的帮助在此也一并表示感谢!最后，感谢我的家人!本研究得到国家基金项目(30870445)的支持。 摘要黄色大蜜蜂Apisdorsata是南亚和东南亚热带雨林生态系统重要的传粉者。与Apis属其它种相比，黄色大蜜蜂有一个显著的特点就是进行季节性迁飞，在旱季，黄色大蜜蜂的蜂群常常聚集在低海拔地区的高大乔木上，到雨季来临时，通常迁飞到别的地方。但人们对黄色大蜜蜂季节性迁飞的生态学意义知之甚少。本研究采用标记．重捕法跟踪了版纳植物园(xrBG)、勐养(MY)和打洛(DL)三个地点黄色大蜜蜂的迁飞地点，并通过分析回迁蜂群遗传结构，初步探讨了黄色大蜜蜂迁飞的繁殖意义。本研究得到如下主要结果：1．旱季聚集在XTBG一颗木棉树上的黄色大蜜蜂的蜂群在雨季来临时(7．8月)离开大树，一般朝西北方向做长距离迁飞，通常在距离XTBG约80公里的江边寨及其对面过门山野生动物保护站(GWPS)停留一段时间(1．10天)，随后继续向北迁飞。另外，来自MY的黄色大蜜蜂在GWPS中途停留，但DL的黄色大蜜蜂没有发现迁飞到GWPS。因此，不同地理聚群的黄色大蜜蜂蜂群可能有不同的迁飞线路，但一些距离较远的聚群在雨季分布区有重叠。2．黄色大蜜蜂在雨季结束后(9．10月)在一些比较低矮的小树上筑巢，采集并贮存食物。大约在12月份，蜂群离开这些蜂巢回迁。检查留下的巢脾，发现这些蜂群在回迁之前繁殖后代。因工蜂的寿命一般比较短(2．3个月)，回迁的黄色大蜜蜂的工蜂应该是在雨季结束后繁育的。3．回迁的蜂群并不立即在树上筑巢。对刚刚返回但未在原来栖息的大树上的黄色大蜜蜂的工蜂进行微卫星遗传分析，结果表明雨季分布区重叠的XTBG和MY聚群之间的基因交流最大，群体分化最小(风T：0．044，P>0．05)。其次是III 在MY和DL聚群之间(FsT=0．068，P>0．05)，基因交流最小的是XTBG和DL聚群之问(FsT=0．081，P>0．05)。本研究认为旱季栖息的低海拔地区是黄色大蜜蜂的主要繁殖地，但雨季迁飞到森林里可能有利于距离较远的聚群间基因交流，加强黄色大蜜蜂迁飞途中停歇点以及雨季栖息地的管理对保护黄色大蜜蜂遗传多样性具有重要意义。关键词：黄色大蜜蜂；栖息地重叠；微卫星DNA；迁飞IV AbstractThegianthoneybee，Ap／sdorsata，isindispensablepollinatorsofwildplantsinthetropicalforestecosystemsthatrangethroughsouthandSoutheastAsia．OneofthedistinctfeaturesfromotherAp／sspeciesisthatcoloniesofA．dorsatausuallyundergoseasonalmigration．Theyoftenaggregateinsingletreesinlowlandhabitatsinthedryseasonandmigratetoalternativesitesattheonsetoftherainyseason．However,theadaptivebenefitsoftheseseasonalmigrationsbyA．dorsataarepoorlyunderstood．Inthestudy，weusedmark-recapturemethodtotrackthemigratoryd器tinationsbytheswarmsnestinginthebigtreesoftheXishuangballnaTropicalBotanicalGarden(XTBG)，Mengyang(MY)，Daho【DL)，southwesternChina，andpreliminarilyprobethesignificanceoftheirmigrationbyanalysisofmicrosatelliteDNA．Themainresultsareasfollowing：1．Attheonsetofrainyseason(July-Augest)，outboundSWarlqflSfromthefocaltreeinXTBGundertake80一kms订aightflightstotheirmigrationstopoversintheforestsaroundJianbianvillageorGuomenshanWildProtectionStation(GWPS)atthesidesofLancangRiver．themigratorycoloniesfromafocaltreeinMengyang(MY)alsopassthroughtheforestsandtakearestatthestopovers．ButthemigratoryswarmsfromalargetreeinDaluo(DL)arenotfoundintheseforests．AfterstoppingOVerforsomedays(1—10days)，bothXTBGandMYcoloniesmovenorthwardtoreachtheirmigrationdestinations．Socoloniesfromwidelyseparatedaggregationsmayemigrateindifferentways，butsomeoverlapatalternativesitesintherainyseason．2．Bytheendoftherainyseason(September-October)，coloniesstopmovementandbuildnestswithcombsonsomesmalltrees．TheworkerbeesofthesecoloniescollectV andstorefood．BytheendofDecember，theyreturntotheiroriginallowlandnestingsites．Thecombsleftbyreturningcoloniesareexaminedtobeusedforbreeding．Duetotheshortlife-spanofworkerbees，returningbeestooriginaltreesshouldbebornatalternativesites．3．Returningcoloniesdonotimmediatelynestontheiroriginaltrees．GeneticanalysiswithworkerbeesjustreturningtotheirlowlandhabitatsrevealsalargeramountofgeneflowbetweenXTBGMYcolonyaggregationsthatsharethesamealternativesites(XTBGVSMY?FsT=O．044，P>0．05)thanbetweenthosewithdivergentmigrationdestinations(MYVSDL，FsT=O．068，．P>0．05；XTBGvsDL咫孓O．081，P>O．05)．OurstudysuggeststhatseasonalmigrationtoalternativebreedingsitesbyA．dorsatacoloniesmayprovideallavenueforgeneflow，particularlybetweenwidelyseparatedaggregations．WeshouldpaymuchattentiontoprotectthestopoverforestsautumnbreedingsitesformigratorycoloniesofApisdorsataresource．Keywords：却括dorsata，colonyoverlap，microsatelliteDNA，migrationVI 目录致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．川Abstract．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯．Vi．前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．1选题的背景和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2国内外本学科领域的发展现状与进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．1黄色大蜜蜂的生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．2黄色大蜜蜂的迁飞研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．2．3迁飞可能影响黄色大蜜蜂蜂群基因交流⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61-3本研究拟解决的科学问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．研究内容和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．92．1大蜜蜂迁飞路线与迁飞地点的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．2基于微卫星标记的大蜜蜂遗传结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．112．2．1实验材料和仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112．2．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2．3数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯183。研究结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253，1三个黄色大蜜蜂聚群雨季的栖息地⋯⋯⋯⋯⋯．3．2基于微卫星数据的大蜜蜂不同聚群的遗传结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．273．2．1DNA提取结果和PCR扩增产物检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273．2．2PCR电泳检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．2．3聚群内的遗传变异⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯293．2．4哈迪一温伯格平衡和连锁不平衡⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。293．2．5聚群间的遗传分化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．2．6群体间的Nei遗传距离和基因流⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．2．7聚群间的FsT值⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．32VII 4．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．334．1黄色大蜜蜂雨季迁飞与繁殖⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。334．2黄色大蜜蜂雨季迁飞与聚群遗传分化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．354．3保护大蜜蜂栖息地和迁飞走廊⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．365．结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41作者简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47论文发表情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49 1．前言1．1选题的背景和意义昆虫迁飞(Migration)是指某些有翅昆虫在一定的季节里，或在其生长发育的某个特定阶段，成群或分散地、有规律的从一个发生地飞到另一个地区的适应性现象(江幸福等．2008)。迁飞是昆虫中较为普遍的一种生物学特性，是在长期进化过程中形成的对环境的一种适应性，有利于减少竞争、躲避周围的不良环境或逃避天敌等而离开原来的生境，侵该虫种得以繁衍(江幸福等．2008)。大马利筋长蝽Oncopeltusfasciatus自然种群中约有一半是迁飞型，是一种长距离迁飞的昆虫。它每年随季风迁飞，春季由南往北迁飞，秋季又随风南返(Dingle1984)。斑蝶Danausplcxippus是世界上有名的迁飞性昆虫，每年春天由南向北扩迁，夏季分布在美国大部分地区和加拿大南部，到秋季向南方回迁到墨西哥湾和加利福尼亚南部近海的树上越冬(Steveneta1．2010)。蝽象Neacoryphusbicrucis既能迁飞到新的栖息地作单程的迁出，又能迁飞到新栖息地在那里渡过成虫滞育阶段后又回迁到原来的发生地(SolbreckandPehrson1979)。在英格兰南部的密林深处，一些破茧而出的蛾子“银色Y”(silverY)每年要穿越非洲的南北两端(Chapmaneta1．2012)。常见的农业害虫多具有迁飞习性，有关农田害虫迁飞行为的发生与调控机制一直是昆虫迁飞研究领域中的热点。如我国粘虫Myth加naseparata是典型的迁飞昆虫，在春季由南往北作接力棒式迁飞为害，秋季从北方向南回迁。有的粘虫蛾迁飞距离达1000公里，远的在1400公里以J2(JiangandLuo2005)。褐飞虱 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探Nilaparvatalugens在每年春、夏季由南往北覆瓦式迁飞，秋季又往南回迁。但粘虫、褐飞虱回迁的个体是不同世代的成虫(Cai1988)。东亚飞蝗Locustamigratoriamanilensis成虫就成群飞到几百公里以外的地方为害OrangandZhang2009)，它们在新的栖息地产卵、繁殖，在当地死亡，都是单程迁出，并不回迁。广泛分布在华北地区、江苏、安徽等地的棉蚜(AphisgossypiiGlover)进行有规律的迁飞活动，每年4．5月从越冬寄主植物上迁飞到棉田，在同年的9．10月再迁飞到越冬寄主上tWuandGuo2003)。稻纵卷叶螟(Cna刀halocrocismedinalis)表现出短飞行居留型、长飞行迁飞型和中间型(Zhang1980)。研究这些昆虫迁飞对掌握其灾变规律，提高害虫防控的能力有重大实践意义。蜜蜂总科(Apidea)在身体大小、形态、口器结构及行为习性等方面适合为植物传粉(Shrestha2009)，是陆地生态系统最重要的传粉者(钦俊德等．2001)，对维持生态系统健康和人类食物安全方面发挥着极为重要的作用(VanMeleandCuc2000)。例如在物种多样性的热带森林中(Whitmore1984)，同种植物个体之间常常被其它植物个体隔离开来，需要依靠一些动物，特别是蜜蜂为这些植物传播花粉(Ashtoneta1．1988)，因为社会性的蜂类比独居的节肢动物能远距离传播花粉(Degrandi-HoffmanandMartin1995)，促进了广泛分散的同种植物间的异型杂交。在东南亚，森林中有三分之一的植物都依赖社会性蜂类授粉(Roubiketa1．1996)。为吸引蜜蜂授粉，这些森林以每年3．10次无规律的大规模开花来招揽蜜蜂(Sakaieta1．1999)。例如，黄色大蜜蜂(AdorsataFabricius，1793)具有很强的飞翔能力和较大的自然群体是东南亚低地龙脑香林等森林冠层树木的主要传粉者(Momoseeta1．1998，Itiokaeta1．2001)，也是一些林下植物如砂仁的传粉者。因此野生蜂类极大地影响着热带森林生态系统的传粉和植物遗传多样性(DyerandSeeley1991)。 1．前言蜜蜂属(Apis)的一些种，如黄色大蜜蜂，黑色大蜜蜂(彳．1aboriosaSmith，1871)，黄色小蜜蜂(爿．floraeFabricius，1787)，黑色小蜜蜂(彳．andreniformisSmith，1858)，都集中分布在亚洲，尤其是东南亚诸国(胥保华2000)。他们对环境变化及其敏感，表现出明显的季节性迁飞习性(DyerandSeeley1994)，(Woykeeta1．2001)。它们的季节性迁飞将影响种群间基因交流，改变群落中物种之间作用，从而影响整个森林生态系统的结构和功能。因此，研究蜜蜂的迁飞对于保护物种遗传多样性，维护自然生态系统结构与功能具有重要意义。但由于在茂密的森林里跟踪和调查这些昆虫迁飞比较困难，有关它们季节性迁飞的适应性和生态学意义了解比较少。1．2国内外本学科领域的发展现状与进展1．2．1黄色大蜜蜂的生物学特性黄色大蜜蜂(4．dorsataFabricius，1793)分布于东亚和东南亚热带和亚热带地区(Ruttner1988)，在中国主要分布在云南省的东南、西南、南部等低海拔地区及海南省、广西壮族自治区的南部，西藏自治区的南部和东南部。蜂巢营单一纵向裸露巢脾，多栖息于悬岩或高大的乔木上或建筑的屋檐(OldroydandWongsiri2006)。黄色大蜜蜂在行为和生态学上不同于蜜蜂属的其他种(OldroydandWongsiri2006)。例如，黄色大蜜蜂的蜂群在树上或岩石下面建单一的巢脾，且通常是许多蜂群密集地聚合在一起。据报道，有200多个蜂群栖息在同一棵大树上或岩石下面(Oldroydeta1．2000)，并且蜂群之间只有几厘米的距离(Paareta1．2004)。还有蜂群偏爱旧的筑巢地点，野外调查表明有些蜂群几十年来一直在原来的地点筑 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探巢(Oldroydeta1．2000，OldroydandWongsiri2006)。因此，蜂群对筑巢地点显示出高度的忠实性(Neumanneta1．2000，Paareta1．2000)。另外一个显著的特点是蜂群经常进行季节性迁飞(P船reta1．2000)。通常是雨季来临前迁飞到深山里，在那里生活大约为3-4个fl(Paareta1．2004)，之后，蜂群迁回到原来的栖息地。1．2．2黄色大蜜蜂的迁飞研究Woyke等发现在尼泊尔的奇旺地区(Chitwanregion)，当有新的蜜源植物出现时，黄色大蜜蜂就迁飞到新的地点，并且伴随有蜜蜂分群现象(Woykeeta1．2001)。Oldroyd等研究表明，在迁飞并遗弃巢址后，黄色大蜜蜂还会返回到原来的地点筑巢(Oldroydeta1．2000，OldroydandWongsiri2006)。所以，蜂群偏爱原来的筑巢地点(Neumanneta1．2000，Paareta1．2000)。但是，蜂群在离开数月后是如何找到原来的筑巢地点仍然是一个迷(Liueta1．2007)。根据一年中不同时期在不同地点的蜂巢出现的地点，可以推断出蜂群迁飞的距离。据报道，蜂群可以成群横渡苏门答腊岛和马来西亚之间50公里宽的马六甲海峡(Mardan1989)。在斯里兰卡，在大约一个月内，蜂群在每个方向上的迁飞距离最大可达200公里，并在沿途的树上休，息(KoenigerandKoeniger1980)。在中途停留点的蜂群形成集群或露营群，通常临时栖息在树下。但此时的蜂群没有构筑巢脾，只有迁飞群抵达目的地后，才开始建巢脾积累食物储备(Deodikareta1．1977，KoenigerandKoeniger1980，DyerandSeeley1994，Hepburn2011)。黄色大蜜蜂的宿营行为没有受到系统的研究。凑巧的宿营地发现使研究人员能够描述侦察蜂的舞蹈和遍及斯里兰卡各处的蜂群后续飞行，认为这是蜂群迁飞的尾声并在寻找附近的巢址(KoenigerandKoeniger1980)。4 1．前言Robinson揭示了连续两个季风季节被发现聚集在泰国北部芒果林河畔的52个宿营的大蜜蜂蜂群的到达和离开的时间和物候学(Koenigereta1．2011，Robinson2012)。露营蜂群聚集的中途站点是沿着派河(PaiRiver)的一个小芒果林。由于同一地点连续多年被占领以及大量黄色大蜜蜂群体每年聚集在那里，Robinson把其称为一个“露营聚集中途站(Bcss)”。露营蜂群在芒果树及紧邻的其他树上停留，并不建巢脾。之后，蜂群的离开的大致方向是依据蜜蜂舞蹈的。Robinson认为，正如由于本能和环境信息发现雄蜂聚集区一样，蜜蜂出于本能可以很容易地发现有标志的地理位置。因此，在整个南亚地区，BCSS的发生作为迁飞路径的标志是可能的(Koenigereta1．201j)，这可能可以作为大蜜蜂迁{5I有一定的遗传基础的证据(KoenigerandKoeniger1980)。在BCSS，派河(PaiRiver)是一个明显的导航地标并为飞行的蜜蜂提供水源。开花原生柚木和什锦林下草本植物以及大量的非本土的由加利树提供花蜜。在全球授粉下降，东南亚的森林遭到迅速砍伐，大蜜蜂的数量减少以及其他昆虫的脆弱性生态瓶颈的情况下，Robinson强调保护大蜜蜂的BCSS的重要性。蜂群可能会在处于不同花期的地区间进行迁飞(KoenigerandKoeniger1980，Underwood1990，Craneeta1．1993，DyerandSeeley1994，SheikhandChetry2000，Itiokaeta1．2001，Liueta1．2007)，因此食物短缺可能是诱导黄色大蜜蜂迁飞的因素。另外，在迁飞途中，蜂群一般不建巢脾(Underwood1990)，这可能有助于减少蜂群被寄生螨Tropilaelaps感染，因为这种寄生螨需要利用蜂群的巢脾育雏繁殖(Rinderereta1．1994，Kavinseksaneta1．2003)。所以，有人认为黄色大蜜蜂迁飞是为了避免敌害。但是，有关黄色大蜜蜂迁飞的生态意义和适应性尚不十分清楚。 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探1．2．3迁飞可能影响黄色大蜜蜂蜂群基因交流对黄色大蜜蜂遗传结构的研究，国内外都有报道。CAO等利用微卫星位点分析了云南、广西和海南黄色大蜜蜂的遗传关系，发现来自不同地理区域的大蜜蜂群体问存在较大差异。但海南的黄色大蜜蜂聚群内部的遗传多样性水平较低，这可能是遗传漂变的结果(CAOeta1．2012)。杨洁等利用14对微卫星引物对采自云南省的35个野生的黄色大蜜蜂蜂群进行了群体遗传变异检测和遗传多样性分析，结果表明云南大蜜蜂群体遗传多样性相对贫乏，分化程度较低(杨洁等．2012)。但是对于这种遗传分化低的原冈不清楚。聚群之间存在母女群吗?Oldroyd等利用A14、A88、A107、B124四对微卫星标记研究马来西亚半岛北部靠近亚罗士岛的柏都湖热带雨林中高密度聚集在一棵大树上120多个黄色大蜜蜂蜂群的遗传关系，发现它们并不是母女蜂群，黄色大蜜蜂的聚群并不是通过蜂群分蜂的方式形成I!I勺(Oldroydeta1．2000)。随后，Insuan等使用mtDNA的PCR．RFLP和微卫星标记大范围调查了泰国的黄色大蜜蜂的遗传分化，结果表明，在整个泰国范围内黄色大蜜蜂种群的遗传分化程度非常有限(Insuaneta1．2007)。Rattanawannee对泰国北部的大蜜蜂的遗传结构分析表明，来自三个聚群的54个大蜜蜂蜂群间不存在母女蜂群。尽管在泰国北部森林的严重斑块化，聚群之间有较高的连通性(Rattanawanneeeta1．2013)。所以，无论是在较大范围进行比较还是在较小范围进行比较，聚群之间的遗传分化都比较低。Paar等利用8对微卫星标记研究了印度东北部黄色大蜜蜂聚群的遗传结构。与随机分散的蜂群相比，聚群内的蜂群有更高的关联度，但是不同地理区域间以 1．前言及聚群间蜂群的遗传分化减小。认为迁飞的蜂群在返回原来的聚群时，可能有部分蜂群离开了原来的聚群而来到新的聚群，导致聚群间遗传差异减d,(Paarcta1．2004)。大规模开花时期蜂群的快速增长不是该地区蜂群的繁殖，而是由于迁飞蜂群的到来。1．3本研究拟解决的科学问题尽管昆虫迁飞可能改变种群之间的基因交流，从而影响种群之间的遗传分化程度，但对于黄色大蜜蜂迁飞路线的研究较少。对于多数迁飞性的昆虫而言，低海拔的栖息地被认为是其最为主要的繁殖地．所以在低海拔地区，回迁的蜂群从另外的聚群迁入一个新的聚群可能减少黄色大蜜蜂聚群之间的遗传分化(aaareta1．2004)。但是，最近有关丫纹夜蛾Autographacalifornica迁飞适应意义的研究发现，丫纹夜蛾在春季迁飞到英国，并且夏季繁殖使得成虫的丰度增长到原来的4倍，其中部分将在秋季向南返回。另外，80％的丫纹夜蛾到达地中海盆地适于冬季产卵的地区。由此推断，昆虫向高纬度进行季节性的、长距离迁飞可能给昆虫带来较高的生殖收益(Chapmaneta1．2012)。长距离迁飞对于蜂王和蜂群都存在一个极大的风险，因为蜂王可能在飞行过程中死亡。如果在雨季迁飞到别的栖息地的途中处女蜂王死了，培育新王是必须的，否则整个蜂群最终会灭亡。所以，黄色大蜜蜂可能迁飞到别的地点后也进行繁殖。另外，有遗传证据表明，在所有的蜜蜂属中，黄色大蜜蜂蜂王被发现进行多次交配(Taneta1．1999)，是动物王国中一妻多夫程度最高的(Moritzeta1．1995)，可与超过100的雄蜂交配(Wattanachaiyingcharoeneta1．2003)。因此，雨季迁飞到别的地方后，蜂王可能与来自其它聚群的雄蜂交配，促进聚群之间基因交流，导致黄色大蜜蜂聚群之问的遗传分化程度低。 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探为此，本研究采用标记．重捕方法，跟踪西双版纳地区黄色大蜜蜂的迁飞地点和可能的迁飞路线，确定黄色大蜜蜂在雨季迁飞到别的地方后是否筑巢进行秋繁，并用分子标记的方法比较距离相当、迁飞地相同或不同的三个黄色大蜜蜂聚群的遗传结构和遗传分化程度，初步探讨雨季迁飞是否会促进大蜜蜂蜂群的基因交流，为西双版纳地区大蜜蜂遗传资源的保护和有效利用提供重要的理论依据。 2．研究内容和方法2．1大蜜蜂迁飞路线与迁飞地点的确定在版纳植物园内(XTBG，21055’N，101。15’E)，有一棵高达40米的木棉树，其上连续几年栖息Y20多群黄色大蜜蜂(图2．1)。野外观察表明，该聚群的黄色大蜜蜂一般在每年雨季来临前(7．8月份)离开，前往别的地方，等到第二年的2月份又返回到树上筑巢。为了跟踪蜂群的迁飞，在2005年6月，在距地面25米以上的两棵大树上都放了一个CCD摄像机，分别位于蜂群筑巢的的大树的东面和西面，与大树的距离都为30米。我们用一个数字视频记录系统(kdec电子有限公司)，用电脑控制直接记录黄色大蜜蜂的蜂群离开这课木棉树的飞行方向。当离开它们筑巢的树时，蜂群首先垂直向上飞，在树顶上徘徊很短一段时间(约30秒)后并水平飞行，离开该树。在雨季来临前，认真观察蜂群的迁飞情况。在同一个聚群的蜂群不是同时离开这个大树，一般每天只有1．2群蜜蜂离开，最多每天有4．5群蜜蜂离开。国蠕tiorsatacoloniesBombaxsp．图2．1版纳植物园木棉树上的黄色大蜜蜂聚群Figure2．1AnaggregationofApisdorsatacoloniesinaBombaxtreeatXishuangbannatropicalBotanicalGarden 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探通过观察起初离开的蜂群飞行，初步判断随后蜂群的迁飞方向，并沿该方向，在森林空隙地带安排移动的地面观察人员，跟踪并寻找迁飞蜂群的落脚点，根据观察当天的情况，我们雇用了十几个观察员。两个观察员间的最远距离为lO公里。随后地面人员每从09：00至lJl7：00(因为蜂群迁飞的主要时段为上午10：00．下午14：00)，观察经过头顶的迁飞蜂群，直到大树上的蜂群全部离开，并记录蜂群大致的迁飞方向和不连续的飞行路径。接着，地面人员继续在森林里寻找迁飞蜂群的落脚点，搜寻时间持续到10月，直到发现有蜂群在树上筑巢为止。为进一步确定迁飞途中的蜂群是否来自XTBG聚群，在2007年6月份，在黄色大蜜蜂将要迁飞之前，在聚集有20多群黄色大蜜蜂的木棉树西面距离800米的空旷地上，用浸渍有糖浆的旧巢脾来吸引黄色大蜜蜂的采集蜂。也许因为在雨季前可利用的蜜源较少，蜜蜂很容易就被旧巢脾吸引，并吸食糖浆(图2．2)。≯謦图2．2(A)黄色大蜜蜂吸食旧巢脾内的混有UPT的糖浆；(B)激光笔检测黄色大蜜蜂肠道含UPT标记物；(C)迁飞途中黄色大蜜蜂肠道内被检测含有UPT标记物Figure2．2：(A)和括dorsataforagersdrinkingasugarsolutionwithUPTpowerinapieceofoldcomb．(B)TheUPTpowerinthegutofaworkerbeeofA．dorsatacouldbedetectedbyalaser．(C)UPTpowerwasdetectedinthegutofaworkerbeeofA．dorsataonitsmigratoryway．10 2．研究内容和方法在每100mL糖浆qj3nXo．59UPT粉末(200nm，上海科韵光电科技有限公司提供)。从7月10日．8月5日期间的晴天，每天下午给蜜蜂饲喂600mL含UPT糖浆，直到多数蜂群离开。预实验表明，用UPT公司提供的激光笔很容易检测到吸食蜜蜂肠道含UPT(图2．1，B)，作为一个定性的研究方法，UPT在黄色大蜜蜂体内停留时间为10—15天。由于本研究中版纳植物园内给蜂群饲喂UPT和在大蜜蜂迁飞落脚点抓大蜜蜂工蜂进行UPT激光探测是同时进行，具有时效性因此可由此来标记蜜蜂。对于迁飞途中露营的蜂群，从每个易接近的蜂群中采样500．1000只工蜂，检查它们肠道内是否含有UPT标记物。利用同样的方法确定迁飞途中蜂群有无来自勐养(MY)和打洛(DL)两个地点的聚群。2．2基于微卫星标记的大蜜蜂遗传结构分析2．2．1实验材料和仪器2．2．1．1蜜蜂采样采集时问为2012年2月。此时迁出蜂群已返回低海拔栖息地，但回迁蜜蜂并未立即上树筑巢，而是隐藏在森林里，所以不能直接从蜂群采样。去年雨季迁出蜂群在别处生活了大约3—4个(Paareta1．2004)，因工蜂寿命一般只有2-3个月，回迁工蜂应是在雨季栖息地出生的。为比较它们遗传分化，我们分别从XTBG、MY和DL大蜜蜂树周围花上取样(表2．1)，样本保存于95％的乙醇。 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探表2．1采样地点与黄色大蜜蜂样品数Table2．1SamplinglocationsandthenumbersofApisdorsataworkersamples聚群采集地采集量地理经纬度海拔XTBG版纳植物园60101014’9767E546M21055’8739NMY勐养60100052’2607E798M22011’0717NDL打洛60100010’3947E695M21043’9557N2．2．1．2试剂配制1MTris缓冲液(pH8。O)：Tris(碱)121．14g，ddH20800ml，加盐酸调pH值至8．0，去离子水定容至1000ml，高压灭菌。0．5MEDTA(pH8．O)：EDTA186．19，ddHzO800ml，搅拌溶化后，用NaOH(约209)调节pH值至8．0后，加ddH20定容至1000ml，高压灭菌。TE缓冲液(pH8．0)：10mMTris-HCl(pH8．O)，1mMEDTA(pH8．O)，高压灭菌，4"C保存。20％SDS：SDS200g，ddH20900ml，68℃水浴溶化，用盐酸调pH值至7．2，加ddH20定容至1000ml。20mev"ml蛋白酶K：蛋白酶K100mg，灭菌ddH205ml，．20℃保存。RNaseA贮存液：RNaseA1mg，10mMTris(8．O)1ml，100℃煮沸10min，．20℃保存。细胞裂解液(100mM"Iris—C1，20mMEDTA，500mMNaCl，1．5％SDS)：20mg詹ng蛋白酶K；无水乙醇；10mg／mLRNn酶；3MNaAc(pH5．2)；70％乙醇；TE缓冲液(10mlVlTris—HClpH8．0；1mMEDTApH8．O)。1％琼脂糖凝胶：0．29琼脂糖，20mllxTAE，1．2ulG．v核酸染料。12 2．研究内容和方法上样缓冲液1xTAE：取50xTAE储备溶液20mL用ddH20定容至1000ml。5xTBE：Tris54g，硼酸27．59，EDTA·2H203．729，加ddH20定容至10％过硫酸胺：过硫酸胺lg，加ddH20定容至10ml，4"C保存，现用现配。8％聚丙烯酰胺凝胶：5ml40％丙烯酰胺，5ml5×TBE，180uL10％APS，16uLTEMED，15mLddH20。20％AgN03：AgN0320g，加去离子水定容至100m1．10VoNa2S203：Na2S2031．5g，加去离子水定容至15ml。70％乙醇：取70nd无水乙醇，加ddH20定容至100ml。15％NaOH：NaOHl509，加去离子水溶解，定容至1000ml。2．2．1．3主要仪器PCR仪(LifeExpress生命快车基因扩增仪，杭州博日科技有限公司)、DYCP．31DN型电泳槽、QIAxcel毛细管电泳仪、美国EastmanKodak公司EDAS20型Kodak凝胶成像系统、UV755B紫外可见分光光度计、Centrifuge5418型离心机(eppendorf)、LX．100手掌型离心机、LDZX一50KBS立式压力蒸汽灭菌器、DHG一9053A电热恒温鼓风干燥箱、GL．3250A磁力搅拌器、DYCZ．30B型电泳槽、DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)、WD．9406型胶片观察灯、WD．9405B型水平摇床、QL．861旋涡混合器、Mili—Q50超纯水制备系统、Galanz．P70D20TJ．D3微波炉、TP．402电子天平，眼科剪刀。13 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探2．2．2实验方法2．2．2．1蜜蜂基因组DNA的提取本试验中大蜜蜂基因组DNA的提取参照和志娇等的蜜蜂基因组DNA提取方法的改良(和志娇等．2008)。具体步骤如下：(1)样品处理：用镊子将大蜜蜂取出用双蒸水冲洗，再用灭菌水冲洗干净，吸水纸吸干水分，取头部和胸部放置于2mL离心管，液氮研磨。(2)力I／X．700ul细胞裂解液(56℃预热，至少30min)混匀，2ul10mg／mL1LNA酶和10u1蛋白酶K剧烈振荡摇匀，56。C水浴60min，每隔15min摇匀，然后放置于4。C冰箱2min冷却。(3)加入等体积Tris饱和酚：氯仿(1：1)和1／25体积的异戊醇，轻轻混匀，在摇床上抽提30min。(4)40C12000r／rain离-I二,10min，取上清液，重复(3)、(4)步，使蛋白质除尽。(5)力H2倍体积的无水乙醇(-200C预冷)和1／10体积3MNaAc(pH5．2)混匀，-20。C保持20min，使核酸沉淀，12000rknin离，I二,10min，弃上清。(6)沉淀经70％乙醇洗涤(重复1次)，晾干。(7)沉淀溶解7：100ul灭菌双蒸水中或100ulTE缓冲液qh(10mMTris—HClpH8．O；lmMEDTApH8．O)。(8)取5ulDNA经0．8％琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计检测提取的DNA浓度和纯度，根据检测的DNA浓度将提取的DNA稀释至lJl0ng／gl，并于4℃保存。2．2．2．2PCR反应PCR反应为20此体系，包含1UEasyTaqDNA聚合酶(北京全式金生物技术14 2．研究内容和方法变性：94。C30S、退火：引物退火温度30s}I35cycle。延伸：72。C45Sj2⋯223聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染1)PAGE凝胶的制作a．将厚度为1．5mm的两块干净玻璃板配对组装到1．5mm的制胶条中，在胶条两侧各用一个夹子夹住，在台面平整后，用2％琼脂糖溶液对玻璃板进行热封；b．待底部琼脂糖密封条凝固后，将配置好PAGE制胶液(见表2．2)缓慢地倒入两块玻璃板中间，并避免产生气泡，插入梳齿，仔细观察玻璃板是否有侧漏，及时用制胶液补充，以免凝胶聚合产生气泡或胶浓度不均一影响后续实验；C．待凝胶聚合完毕后，可观察到梳孔完全成型，松开夹子，将制好的的凝胶泡入lxTBE溶液中，使凝胶继续老化，便于凝胶完全聚合，待用。 黄色大蜜蜂和如dorsata季节性迁飞路线及意义初探表2．2配置8％PAGE凝胶成分Table2．2Thecomponentsof8％PAGEelectrophosisbuffer2)PAGE凝胶电泳及银染将制好的PAGE凝胶按要求装入电泳槽中，加入适量的1×TBE电泳缓冲液，拔出梳齿，观察加样孔是否有气泡，必要时用lmL的移液枪将气泡吹打出来。a．厍J20bpDNAlader点到不同板上不同加样孔内，以标识上样次序及分子量，将适量的PCR产物分别加到各加样孔中，根据PCR产物大小选择适宜的电泳条件，本研究PCR产物约Y了loo-300bp，选电压180V，电流200mA电泳120分钟。b．电泳完毕后，按顺序拆卸胶板，小心撬开两块玻璃板，除去琼脂糖封条，将凝胶置入固定液(40mL无水乙醇和2mL乙酸，加去离子水补足400mL，混匀)，于水平摇床振荡固定20分钟；c．倒去固定液，并用去离子水洗两次，加入银染液(4mL200／0的AgN03，加去离子水补足400mL，混匀)，于水平摇床振荡银染20分钟；d．倒银染液，并用去离子水洗两次，加入脱色液(80uL10％的Na2S203，加去离子水补足400mL，混匀)，脱色45秒，倒去脱色液，用去离子水洗三次；e．加入显影液(40mL15％的NaOH和2mL甲醛，加去离子水补足400mL， 2．研究内容和方法混匀)，于水平摇床振荡显影至清晰条带出现为止，倒去显影液，加去离子水终止反应，在胶片观察灯上照相并保存。2．2．2．4多态引物筛选及基因型判定由意蜂(Amellifera)发展的对异种特异性微卫星引物在黄色大蜜蜂上进行了筛选(Estoupeta1．1995)，多态位点A14，A88，A24常用于黄色大蜜蜂群体遗传学研究(Estoupeta1．1995)。Paar等利用8对微卫星引物研究黄色大蜜蜂的遗传分化(Paareta1．2004)。本研究所使用的微卫星引物参照他们的研究。来自1个地理聚群的20只黄色大蜜蜂个体作为材料进行筛选检测。在供试的23对引物中，只有8对引物有较高多态性(表2．3)。筛选出多态引物并对所有样本进行扩增，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，对照Marker挑出具有多态性的扩增产物送到昆明植物所进行QIAxcel毛细管电泳，最后依据聚丙烯酰胺电泳结果及QIAxcel毛细管电泳结果确定基因型。17 黄色大蜜蜂却妇dorsata季节性迁飞路线及意义翅探表2．3大蜜蜂8对微卫星引物的特征星信息Figure2．3CharacteristicsoftheeightmicrosatellitelociforApisdorsataLocus(GenBanknO．)PrimerSequence(5’．3’)RepeatmotifTa(*C)A14(AJ509286)F：GTCGATTACCGCTCGTGACG(CT)13(GGT)958A76(AJ509357)A88(AJ509489)B124(AJ509292)Ap049(AJ509334)Ap085(AJ509359)At003(AJ509505)Ap243(AJ509466)R：GTGTCGCAATCGACGTAACCF：GCCAATACTCTCGAACAATCGR：GTCCAArl℃AC&r"GTCGACATCF：GCGAATTAACCGArl：1TGTCGR：GATCGCAATTATTGAAGGAGF：GCAACAGGTCGGGTrAGAGR：CAGGATAGG(订’AGGT从GCAGF：CCAATAGEGGCGAGTGTGR：GGGCTrCGTACGTCCACCF：GATCAAACACACAAACGAAAGCR：ACCGGAAGCCTAATCAAGGF：GATCA，rrFCT丌CA订CTTCTCTCTCR：ATGCTCGACTA下rCCGCGF：AATGTCCGEGAGCATCTGR：TGTrTACGAGAA’rTCGACGGG(CT)32，CATT(CT)2CA(CT)360(CT)toTC(CCTT)2(CTTI")3⋯(OOA)755(CT)8．．．(CT)14CCTC(GC)3。(∞)855(AGG)7(GA)6(GA)n(CT)6TT(CW)14(TCC)9585253标注：GenBank号；F--弓I物的正向，IP反向；Repeatmotif=-重复单元；Ta=最佳退火温度2．2．3数据分析先利用软件GenALEx6．4(PeakallandSmouse2006)1塾]建数据模板，按照等位基因数进行数据读取，将无SSR位点的个体结果作为缺失处理，标记为“0”，并保存为Excel文档。利用该软件可以将该数据文件转换为其他分析软件所需的分析格式，便于后续分析研究。2．2．3．1哈迪．温伯格平衡及连锁不平衡检测哈迪．温伯格平衡是由英国数学家Hardy和德国生理学家Weinberg分别独立提出的群体遗传学模型。它是指在一个无限大的、随机交配的理想居群中，如果不存在突变、迁移、自然选择和遗传漂变，那么其等位基因频率和基因型频率在18 2．研究内容和方法世代间保持不变(Templeton2006，HartlandClark2007)。本研究采用GENEPOP4．10(http：／／genepop．curtin．edu．au／)软件(Rousset2008)在线版本中的“Fishers’exacttests”对微卫星位点水平、聚群水平以及全局水平进行了哈迪．温伯格平衡检测。连锁不平衡是指在某一群体内，不同位点上某两个等位基因出现在同一条单元型上的频率与预期的随机频率之问存在明显差异的现象(Hedrick2011)。不同基因位点上的某些等位基因经常在一起连锁遗传，而连锁的基因并非完全随机地组成单元型，有些基因较多出现在一起，致使某些单元型在群体中出现的频率较高，引起连锁不平衡。本研究采用GENEPOP4．1(http：／／genepop．curtin．edu．all／)软件在线版本中的‘"Fishers’method"’检测各个聚群以及各个位点间的连锁不平衡水平。2．2．3．2遗传结构分析为了对黄色大蜜蜂的遗传结构进行评估，本研究选用GenALEx6．4(PeakallandSmouse2006)对不同参数进行计算。1)等位基因数及频率本研究基于以下原理和方法计算总的等位基因数目、平均等位基因数目和有效等位基因数目。在进行多个位点分析时，每个居群或位点等位基因的总数是衡量物种遗传多样性丰度最基本的参数。平均等位基因数目平均等位基因数目即群体中测得的所有等位基因种类的平均值，每个位点上等位基因的平均数目及等位基因的频率，反映了每个等位基因在遗传结构中的重19 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探要性。其数值越接近所检测到的等位基因的绝对值，表明等位基因在各群体中分布越均匀。本研究用GenALEx6．4(PeakallandSmouse2006)对这个参数进行计算。其数学表达式为：M：吉缸眨。，以，为第i个位点上的等位基因数，，z为所测定位点的总数。有效等位基因数目有效等位基因数目是指与现实群体中观察到的纯合体频率相等的、具有相同等位基因频率的假定群体中等位基因数目。它反映了等位基因间的相互作用，比用杂合体频率和纯合体频率能更好地度量群体遗传变异的增加，可用于比较等位基因频率分歧分布。本研究用GenALEx6．4(PeakallandSmouse2006)对这个参数进行计算。其数学表达式为：M：吉善‘蔷p∥2．。(2．2)其中，ai为第f个位点上的等位基因数，以为检测的位点总数，p{『我第f个位点上第，等位基因频率。2)杂合度最简单度量群体遗传多样性的参数就是杂合度，比较常用的参数有观察杂合度、期望杂合度和校正后的无偏杂合度。观察杂合度指实际观察到的杂合体数目占群体中全部个体数目的比例。一个位点的观察杂合度可用如下数学表达式计算：办。=,-Ep。(2．3) 2．研究内容和方法pF为第f个位点等位基因纯合基因型的频率，，．为实测等位基因种类。如果有多个位点时，就需要首先对所有位点的杂合度进行求和，然后再计算其平均值。可用如下数学表达式计算：H。：去季办巧=!n窆i=l(·一喜p驴]。2q办oj为第f个位点上的观察杂合度，行为测定的位点总数，P驴为第f个位点上第歹个等位基因纯合基因型的频率，，．为第f个位点上的测定到的等位基因数目。期望杂合度：Nei(NdandKumar2000)提出采用期望杂合度来度量群体遗传多样性。假定随机交配群体中，期望杂合度可用以下的数学公式进行计算。惦．戮r2(2．5)qi为第f个等位基因的频率，，．为实测等位基因总数。如果检测群体中多个基因位点，则采用平均期望杂合度。平均期望杂合度(日。)是指每个基因位点上期望杂合度的平均值，用于描述单个基因位点上平均期望杂合程度。其计算公式如下：凰：吉釉=褂毒2。]㈦6，办。为第f个位点上的期望杂合度，玎为所分析位点总数，go为第f个位点匕第／个糍NNN"g，，．为第i个位点匕等位基因的总数。2．2．3．3遗传分化分析 黄色大蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探1)F-统计量检测F．统计量是一个十分有用的遗传分化参数，不仅可用来检测群体间遗传变异占总遗传变异的比例，提供群体间遗传分化程度大小，而且还可以衡量群体中基因型频率在不同层次水平上偏离群体理想期望值比例的程度(杂合体比例是否缺乏)及其可能的原因。各层次现实群体中基因型频率期望值偏差一般用FI”FlT和Fs-r三个参数来度量，这些参数统称为F统计量。Fs"r常用来测量各个地方群体间的遗传分化程度，其理论取值范围为(0，1)(HartlandClark2007)。FST最小值为0时，说明不同地方群体遗传结构完全一致群体问没有分化；其最大值为1，意味着等位基因在各个地方群体中完全固定。1978年，Wright对FsT与遗传分化关系给出向导性的解释(Wright1978)：实际研究中，FST为0-0．05时，群体间遗传分化很小，可不考虑群体问遗传分化；FsT为0．05．0．15时，群体间存在中等程度遗传分化；FsT为0．15．0．25时，群体问遗传分化较大；FsT值在0．25以上，表明群体间有很大遗传分化。这三种统计量的关系为：肛紫㈦7，F11r和FIs分别表示个体相对于群体和它所在的亚群体)的固定指数(F11r和FIs，也可以解释为两个配子间的相互关系)，FIT表示总群体中基因型的实际频率和理论预期频率的离差，FIs表示亚群体中基因型的实际频率和理论预期频率的离差。FsT则表示随机抽取每个亚群体两个配子间的相互关系，它用来测量亚群体间的遗传分化程度。本研究用POPGENE对以上三个参数进行了计算。 2．研究内容和方法2)遗传距离遗传距离能反映不同群体间在进化上的关系，计算方法有多种，由微卫星DNA多态性研究群体遗传变异时多采用Nei氏距离(Nei1972)和Reynolds遗传距离，Nei氏距离计算公式如下：月七EEP。，P。：i=l／=l上)j：一。n(，)1J]瓤nks2。2．8，式中pif，为群体1第f个位点的第，个基因频率，PFz为群体2第f个位点的第J个基因频率。，m，～——Do=l-手莩压佤眨9，X{，和y{『分别为x和】，群体的第歹个位点的第f个等位基因频率，m，是第，个位点上的等位基因数，，是检测的基因位点数。3)基因流动基因流动是指由于迁移和杂交等原因导致一个中种群的基因进入到另一个种群(同种或不同种)的基因库，使接受者的基因频率发生改变。其他种群基因的流入可以直接改变种群原有的基因频率，影响遗传结构，并使基因交流频繁的种群间存在遗传上趋于一致。基因流动值(N。)由Fsr获得： 黄色大蜜蜂和妇dorsata季节性迁飞路线及意义初探FST=再矾+1)(2．10)4)分子遗传方差分析利用ArlequinV．3．1l(Excoffierandlischer2010)对所有聚群进行了分子遗传方差分析(AMOVA分析)。24 3．研究结果3．1三个黄色大蜜蜂聚群雨季的栖息地从2005年7月13．29号，通常是从上午10点到下午13点，相机共记录至1J23个蜂群的离开XTBG，因此蜂群不是同时离开。这些蜂群多半向西北方迁飞，到达距XTBG大约80公里的地方停歇(图3．1，红色箭头所示)。图3．1来自版纳植物园的黄色大蜜蜂蜂群向西北迁飞Figure3．1ThecoloniesofApisdorsatamigratingfromXTBGtonorthwestsites沿着迁飞方向，地面观察jL员至lJl8个蜂群经过头顶。但蜂群没有中途停留，在距离XTBG大约80公里的过门山自然保护区森林(GWPS，22。14’N，100。36·E)发现了18个蜂群，它们通常栖息小树干上(图3．2)。经过检查，只有两个蜂群含有UPT标记。从7月N8Jq，在过门山斜对面的江边寨附近的森下找 黄色大蜜蜂和括dorsata季节性迁飞路线及意义初探至lJ31个宿营蜂群。其中有11个蜂群被确定来自XTBG。这些蜂群在一个地点停留一段时间后(一般为1．10天时间)，继续向北飞行。到了9月末、10月初，蜂群停止迁飞，并在一些比较低矮的树上(低于5米)筑巢(图3．3)，一般一个蜂群单独占领一棵树。检查发现，蜂群筑巢不只是为了贮存蜂蜜，还繁殖后代。onyofdorsataSlanalna"一ground1一图3．2迁飞途中一个黄色大蜜蜂蜂群栖息在一颗小树上Figure3．2AcolonyofApisdorsatarestinginasmalltreeonitsmigratorywayAcolonyofApisdorsata图3．3一个黄色大蜜蜂蜂群在小树筑巢繁殖Figure3．3AcolonyofApisdorsatanestinginasmalltrccforbreeding 3．研究结果在2009年至2010年，我们跟踪了来自勐养一棵大树的蜂群，发现它们也迁飞到江边村附近的树丛中。因此，尽管MY和XTBG两个黄色大蜜蜂的聚群相距很远，但是蜂群在雨季的栖息地有重叠，而且来自MY和XTBG的蜂群很少飞越澜沧江到达过门山。然而，没有发现来自DL的蜂群飞到江边村或者过门山(之前的跟踪调查显示，另一地理区域即大勐龙，是一个更为复杂的大蜜蜂迁飞聚集地，打洛地区的黄色大蜜蜂在雨季飞往该地)。因此，来自DL的蜂群与来自MY和XTBG蜂群在雨季的分布区不同。3．2基于微卫星数据的大蜜蜂不同聚群的遗传结构分析3．2．1DNA提取结果和PCR扩增产物检测用UV755B型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)检测提取的DNA浓度和纯度，根据检测的DNA浓度将提取的DNA稀释N10ng／p1，用于微卫星引物的PCR扩增。大蜜蜂基因组DNA提取产物检测结果见图3．4。图3．4大蜜蜂基因组DNA提取产物检测Figure3．4TheresultofportionofDNAextractionproducts23130bp 黄色大蜜蜂和括dorsata季：市性迁飞路线及意义初探3．2．2PCR电泳检测结果试验用8对微卫星引物对样本进行PCR扩增，特异的扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染法显影、定影。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，对照Marker挑出具有多态性的扩增产物送到昆明植物所进行QIAxcel毛细管电泳，最后依据聚丙烯酰胺电泳结果及QIAxeel毛细管电泳结果进行基因型判定。部分微卫星弓物PCR产物银染后的结果见图3．5、3．6。图3．5A88位点部分PCR扩增产物Figure3．5TheresultofaportionofPCRproductsofA88图3．6A14位点部分PCR扩增产物Figure3．6TheresultofaportionofPCRproductsofAl4160bp140bp120bp麓舶p笠魄P∞褥p 3．研究结果3．2．3聚群内的遗传变异本研究从23对引物中筛选出8对条带清晰、大小合适、多态性和重复性都较好的SSR引物用于大蜜蜂的遗传分析，其详细信息见表3．1。从位点水平看，在8个筛选得到的微卫星位点中，等位基因数(Na)从4到15不等，等位基因数目较多，其中以At003和A88的等位基因数目最丰富，而Ap243位点的等位基因最少。平均有效等位基因数最大为At003，为8．268。At003和A88位点具有较高的Na和Ne。观测杂合度(／40)介于0．256．0．822之间，其中A14和A76的值较高。期望杂合度(％)介于0．422．0．877之间，最高值0．877出现在At003位点上。固定系数F变异范围为．0．019．0．617之间，最大值为0．617出现在Ap243位点上，表明在所有聚群中Ap243位点所拥有的等位基因已经固定。三个地理聚群的等位基因数(Na)分别为8．65、8．25和8．25。平均有效等位基因数和期望杂合度都是DL群体最高，分别为为5．023和0．764。XTBG群体比打DL群体低，勐养(MY)群体最低为0．660，所有聚群的期望杂合度为0．718。XTBG和MY群体的遗传多样性差异不大。3．2．4哈迪．温伯格平衡和连锁不平衡Fis值以及I型错误的可能性被用来作为精确评价偏离Hardy—Weinberg平衡的指标。Hardy-Weinberg平衡检测(Fis，W＆C)的结果见表3．1。结果显示，除了版纳植物园群体在Ap049位点符合哈迪．温伯格平衡，其余聚群均偏离哈迪-温伯格平衡(p0．05)。 黄色人蜜蜂Apisdorsata季节性迁飞路线及意义初探表3．18个微卫星位点的遗传多样性和Wright’SF检验Table3．1GeneticdiversityandF-statisticoverallpopulationsforeachmicrosatellitelOCUSNS=nonsignificant，★=P0．05)，XTBG和勐养聚群的风T值为O．044，XTBG和打洛聚群的凡T值为O．081，勐养和打洛聚群的咫T值为0．068。表3．5黄色大蜜蜂三个聚群问的FST值Hble3．5FSTvalueinthe3ApisdorsatapopulationsPopulationXTBGMYDL■■■■■■■■■■●■■一1■■■■■■■■■■■■■■■■■■●■■l■■●■■■■●I■_■■■■■■__●●_■■●●■●■■■■■■■■■■■■■■■●■●●■■_■■■■■■■■●■■■■■■■■■■■■■■■■■■■●●■■■_■●■■●■■■■■●■■■■■■■■■■■■■■■一XTBGMYDL0．0440．0810．068 4．讨论4．1黄色大蜜蜂雨季迁飞与繁殖对泰国北部黄色大蜜蜂的迁飞研究表明，蜂群不是直接飞到新的栖息地，而是在迁飞途中要稍作停留，通常露营在树下，这时的蜂群不建巢脾，然后继续飞行，直到新的栖息地点(Robinson2012)。本研究对西双版纳地区黄色大蜜蜂的迁飞跟踪，发现蜂群首先进行一个很长距离的直线飞行，大约有80公里，然后中途停留1．10天时间，栖息在小树上或田边。对此时的蜂群进行糖浆饲喂实验，发现蜜蜂并不取食糖浆，我们推测蜂群的中途停留不是为了补充营养，而是为了调整迁飞方向。随后蜂群做短距离飞行，一般的飞行距离不超过5公里，直到9月末、10月初。然后，蜜蜂停止飞行，在小树上筑巢。在多年跟踪迁飞蜂群发现，迁飞的蜂群每年都会在江边寨和GWPS停留。这些观察结果与Robinson的研究是一致的，这也许可以说明黄色大蜜蜂的迁飞是遗传决定的。对西双版纳地区不同聚群的黄色大蜜蜂迁飞跟踪表明，尽管三个较大蜜蜂的聚群之间的距离相隔较远，至少在80公里以上，但来自MY和XTBG聚群的蜂群在GWPS和江边寨中途停留点相汇聚，而且最终都集中在GWPS以北地方筑巢。虽然这些蜂群不是聚集在同一棵树上，但各个蜂群之间的距离比较近，有的相距不到100米。因此，雨季迁飞的蜂群的分布区存在重叠现象。在热带茂密的森林里迁飞，像澜沧江和派河等很容易被迁飞的蜂群看到，无疑可以成为一个迁飞路径的标示(Robinson2012)。研究人员发现蜂群在中途停留后准备继续飞行的时候，能够观察到蜜蜂舞蹈，而且后续飞行是依据这个舞蹈指 黄色大蜜蜂却括dorsata季节性迁飞路线及意义初探示的方向，因此迁飞的路线是迁飞之前就确定的。对于在低海拔地区哺育的工蜂而言，没有到过将要迁往的地点，不可能知道迁飞的路线。因为蜂王可以存活3．5年，可以记住之前的迁飞的路线，所以黄色大蜜蜂的迁飞可能是依据蜂王的记忆往返不同季节的栖息地。有关丫纹夜蛾Autographacalifornica迁飞适应意义的研究发现，丫纹夜蛾在春季迁飞到英国，并且夏季繁殖使得成虫的丰度增长到原来的4倍，其中部分将在秋季向南返回。另外，80％的丫纹夜蛾到达地中海盆地适于冬季产卵的地区。由此推断，昆虫向高纬度进行季节性的、长距离迁飞可能给昆虫带来较高的生殖收益(Chapmaneta1．2012)。Pokhrel认为奇旺地区的大蜜蜂长距离迁飞是由气候因素(降雨量减少)和食物供给(是否有可利用的蜜源植物)决定的(Pokhrel20LO)。Thapa在泰国也发现了大蜜蜂迁飞与天敌、寄生虫、温度、雨量、风速和物理干扰呈正相关(Thapa1998)。Wongsiri等发现，在泰国，大蜜蜂季节性和周期性迁飞为了开拓新的资源(Wongsirieta1．1996)。Oldroyd等人认为大蜜蜂季节性和周期性迁飞是为了通过增加蜜源、提高育种率和降低育雏寄生虫压力来提高蜂群的适应度，以便蜂群更好地繁殖后代(Oldroydeta1．1996)。意大利蜜蜂(apismellifera)和中华蜜蜂(Apiscerana)很少迁飞的蜜蜂种类，它们的蜂群都有两个繁殖高峰期，即春繁和秋繁(WinstonandLEE1987)。与黄色大蜜蜂类似的、具有迁飞习性的黑色大蜜蜂(Apislaboriosa)在入冬前也进行繁殖(Woykeeta1．2001)。但是，没有研究报道黄色大蜜蜂繁殖越冬蜂，确保蜂群安全越冬。事实上，江边寨位于澜沧江畔，水源丰富，植被覆盖率高，是大蜜蜂蜂群理想越冬栖息地，有利于大蜜蜂蜂群的繁殖。本研究结果表明黄色大蜜蜂在雨季结束后便开始了秋繁。因此，黄色大蜜蜂的迁飞可能是为了寻找一个新的34 4．讨论繁殖地点。中华蜜蜂和意大利蜜蜂的蜂群一般在秋季时培育新的蜂王，这样有利于蜂群在第二年春暖花开的时候，迅速形成一个繁殖高峰，培育更强的蜂群。因此，黄色大蜜蜂也有可能在雨季刚结束进行秋季繁殖，并更换新的蜂王。4．2黄色大蜜蜂雨季迁飞与聚群遗传分化等位基因数目容易受到样本量的影响(Maudetreta1．2002)。本研究的8个微卫星位点，在所有样本中的等位基因数为7至19，每个聚群的平均等位基因数大于8，这说明本研究的样本量较为充分，另一方面也说明这8对微卫星引物在这3个聚群中所提供的多态信息含量较为丰富且基因频率分布较为均匀，用其分析遗传多样性具有较高的有效性和可靠性。各聚群的有效等位基因数分别为XTBG=4．584、MY=4．463和DL=5．203。泽格·欧特将多态位点定义为杂合度至少为0．10的位点(ott2001)，平均期望杂合度大小近似的反映出遗传结构变异程度的高低。本研究所分析的8个微卫星标记中，各位点均具有较高的多态性。各聚群平均期望杂合度分别为XTBG=0．719、MY=0．734和DL=0．764。虽然每个位点均有或多或少的群体显著的偏离Hardy-Weinberg平衡，但8对微卫星位点均符合连锁平衡(P>0．05)，表明黄色大蜜蜂的蜂群是自由交配群体。Rattanawannee(Rattanawanneeeta1．2013)对泰国北部距离为5km至U18km的三个地理区域的大蜜蜂聚群的遗传结构分析表明，聚群间无显著的遗传分化，认为蜂群之间可能有交配行为，即某个聚群内蜂王可能与另一聚群的雄蜂进行交配，由于某个聚群的蜂群并不是全部回迁到原来的栖息地(Paareta1．2004，Wattanachaiyingcharoeneta1．2008)，他们认为一个聚群内的蜂群可能来自不同地 黄色火蜜蜂Apudorsata季节性迁飞路线及意义初探方，有利于蜂群的基因交流。事实上，大蜜蜂的迁飞有效避免了蜂群间近交，Darvill等就曾提出近交会造成品种基因多样性降低，被隔离的群体显示较低的遗传多样性。而遗传多样性不高可能会导致蜜蜂性等位基因纯合，产生二倍体雄蜂，影响蜂群群势发展、工蜂个体采集力降低，影响蜂群生存能力(Darvilleta1．2006)，Paar(Paareta1．2004)等对印度东北部大蜜蜂聚群的遗传结构研究表明，由于蜂群的长距离迁飞，使得不同地理区域间以及聚群间蜂群的遗传分化减小。本研究中，聚群问的遗传分化达到10％(P<0．01)，所有位点都极显著地贡献于这一结果(P