几种常用农药助剂对意大利蜜蜂急性经口毒性及生理生化影响 64页

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目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IIIl引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．1蜜蜂概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．1意大利蜜蜂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～21．1．2世界蜜蜂现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一21．1．3影响蜜蜂健康的因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一31．1．4化学物质对蜜蜂急性经口毒性的测定方法及比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41．1．5蜜蜂对农药制剂抗性的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一61．2农药助剂概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．2．1农药助剂的毒性研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一71．2．2农药助剂对农药制剂毒性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一81．2．3农药助剂影响农药制剂对蜜蜂的毒性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一81．3选用农药助剂的基本性质及用途⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81．4研究的目的和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一122．1供试药剂、试剂和主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．1供试药剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．2生化测定主要化学试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．3主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2供试昆虫及饲养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．1供试蜜蜂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．2蜜蜂饲养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．3急性经口毒性测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．4生化测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．4．1羧酸酯酶活性的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．4．2乙酰胆碱酯酶(ACHE)活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．4．3谷胱甘肽一S一转移酶测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17 2．4．4酶源蛋白质含量测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．5数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯183结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一193．1常用农药助剂对意大利蜜蜂的急性经口毒力⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯193．2不同月份五种助剂对蜜蜂急性经口毒性的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．2．1不同月份农乳601撂对意大利蜜蜂急性经口毒性的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223．2．2不同月份乳化剂OP．10对意大利蜜蜂急性经口毒性的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯243．2．3不同月份农乳700撵对意大利蜜蜂急性经口毒性的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯263．2．3不同月份农乳1601撑对意大利蜜蜂急性经口毒性的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一283．2．5不同月份宁乳34#对意大利蜜蜂急性经口毒性的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一303．3农药助剂对意大利蜜蜂主要解毒酶、靶标酶的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．3．1农药助剂对意大利蜜蜂羧酸酯酶比活力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．3．2农药助剂对意大利蜜蜂谷胱甘肽一S一转移酶比活力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．3．3农药助剂对意大利蜜蜂乙酰胆碱酯酶比活力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯404讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一454．1农药助剂对意大利蜜蜂的急性毒性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯454．2农药助剂对意大利蜜蜂的致死中浓度随月份变化的规律⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯464．3农药助剂对意大利蜜蜂体内解毒酶的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯475结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一485．1明确了常用10农药助剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．485．2明确了5种毒性较高的农药助剂对意大利蜜蜂的毒力随季节变化的规律⋯⋯⋯⋯485．3明确了5种毒性较高的农药助剂对意大利蜜蜂主要解毒酶及靶标酶的影响⋯⋯⋯48本研究的创新之处⋯⋯⋯⋯⋯．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一50攻读硕士期间发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55II 山东农业大学硕士学位论文中文摘要本研究以意大利蜜蜂为试验材料，采用《化学农药安全评价试验准则》推荐的“小烧杯法”，测定10种易在水中分散的常用农药助剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性，并筛选出5种对蜜蜂毒性较高的农药助剂测定其在4—12月之间对意大利蜜蜂的致死中浓度，寻找致死中浓度随月份变化的规律，并对蜜蜂体内生物解毒酶的活性进行测定，寻找其致毒机理。明确了常用农药助剂对意大利蜜蜂的毒力情况、生物学参数影响，对毒性较高的农药助剂对蜜蜂的影响进行了评价。以期为农药制剂加工过程中选择对蜜蜂低毒的农药助剂提供参考依据。采用“小烧杯法”测定了10种常用农药助剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性，结果表明：农乳601撂在24h、48h对意大利蜜蜂的致死中浓度LC50分别为7117．66和2671．00mg／L；乳化剂OP一10在24h、48h对意大利蜜蜂的致死中浓度LCso分别为2625．19和1733．93mg／L；农乳7004在24h、48h对意大利蜜蜂的致死中浓度Lc50分别为16359．93和10019．75mg／L；农乳1601群在24h、48h对意大利蜜蜂的致死中浓度LC50分别为18378．44和10461．48mg／L；宁乳34#在24h、48h对意大利蜜蜂的致死中浓度LC50分别为11719．52和8524．98mg／L：AEO一3，DMF(二甲基甲酰胺)，吐温．80、EL一20和农乳2000#5种农药助剂在48h致死中浓度均大于20000mg／L。参照《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对蜜蜂急性经口毒性的分级标准，10种常用农药助剂均属于低毒。采用“小烧杯法”，由4月至12月在每月中旬测定5种较高毒性的农药助剂对蜜蜂的致死中浓度i寻找农药助剂对蜜蜂毒力随月份变化的规律。发现5种常用农药助剂对蜜蜂的毒力都有此规律：在4月，农药助剂对蜜蜂的LC50值较高，随后上升；于5月达到LC50最大值，随后开始降低；在6、7月持续降低，降低幅度不大；于8、9月LC50值有一个小的上升，但LC50值小于4月的LC50值；到10月之后，LC50值持续下降，于12月达到最低值。24h和48hLC50值均有此规律，相比而言，24h的LC50值变化量大于48h的LC50值变化量。研究了5种较高毒性的常用农药助剂不同浓度对意大利蜜蜂体内主要解毒酶及靶标酶的影响，测定结果表明：羧酸酯酶比活力在一定农药助剂浓度范围内，随着农药助剂浓度的增加，呈现上升趋势，当达到一定浓度后，羧酸酯酶比活力随浓度增大而减小，24h和48h都有此规律，且48h时羧酸酯酶比活力大于24h羧酸酯酶比活力，但各浓度之间差异性不明显；谷胱甘肽一S一转移酶比活力在一定浓度范围内，随着农药助剂浓度 几种常用农药助剂对意大利蜜蜂急性经口毒性及生理生化影响的增加，呈现上升趋势，24h和48h都有此规律，但24h与48h之间无规律，各浓度之间差异性不明显；乙酰胆碱酯酶比活力与农药助剂浓度之间无相关性。即此5种农药助剂对意大利蜜蜂体内主要解毒酶及靶标酶没有影响。关键词：农药助剂；意大利蜜蜂；急性经口毒性；解毒酶II 山东农业大学硕士学位论文AbstractInthisstudy,weusedthe和括melliferaasmaterial，andusedthe‘"smallbeakerlaw"’whichberecommendedinthe”SafetyEvaluationTestGuidelinesChemicalPesticides．”DeterminationtheacuteoraltoxicityonAp／smelliferfrom10kindsofcommonpesticideadjuvantswhichbeeasilyscatteredinthewater．Thenselect5kindsofpesticideadjuvantsthathavethehighertoxicityonAptsmelliferanddeterminethemedianlethalconcentrationfromApriltoDecember,tofmdthelawbetweenmedianlethalconcentrationchangesandthemonthesadvance．Anddeterminedtheactivityofdetoxifyingenzymestofindthemechanismofitstoxicity．Definedthattheinfluenceofthecommonpesticideadjuvantstothevirulencesituationandbiologicalparametersofthe卸ismellifer．EvaluatedtheinfluenceofthepesticideadjuvantsonAp／smelliferawhichhavethehighertoxicity．乃eresultsasfollows：Byuseing”smallbeakerLaw",weexaminedtheacuteoraltoxicityof10kindsofcommonlyusedpesticideadjuvantsonAp／smellifera，Resultsshowedthat：WhentheApismelliferabepassedbyuseddimethoateasthereferencematerial(LDso=0．130uga．i．Itg／bee)，TheLCsoofagriculturalemulsifier601撑onAp／smelliferain24h,48hwere6995．90and2644．73mg／L；TheLCsoofemulsifierOP一10onAp／smelliferain24h,48hwere2639．69and1733．92mg／L；TheLCs0ofagricultureemulsifier700#on卸ismelliferain24h，48hwere22，024．90and12333．88mg／L；TheLC50ofagricultureemulsifier1601并onAp捃melliferaat24h，48hwere18，378．44and10461．48mg／L；TheLC50ofning—emulsifier34#on卸括melliferain24k48hwere11，719．52and8524．98mg／L；AEO-3，DMF，Tween-80，EL一20andagricultureemulsifier2000#5kindsofpesticideadjuvantsinlethalconcentrationshigherthan20000mg／Lin48h；ReferringtotheStateEnvironmentalProtectionAgencyissueda”chemicalpesticidesafetyevaluationtestsGuidelinesenvironment”ofpesticidesonbeesacuteoraltoxicitygradingstandards，10kindsofcommonlyusedpesticideadjuvantsbelongtolowtoxicity．Byusing”smallbeakerLaw”，weexaminedtheLC50of5kindsofcommonlyusedpesticideadjuvantswhichhavethehighertoxicityonApismelliferaineachmonthofmiddlefromApriltoDecember，tolookforthelawbetweentheLCsoofpesticideadjuvantsonApiSIII 几种常用农药助剂对意大利蜜蜂急性经口毒性及生理生化影响melliferaandthemonthadvance．Foundoutthat5kindsofcommonlyusedpesticideadjuvantsonbeesallhavethisrule：InApril，pesticideadjuvantsonbeesLCsovalueishigher,thenrise；LCsoinMayreachedthemaximumvalue，andthenbegantodecrease；Julycontinuedtodecreasemarginallylower；thenLCsovaluesinAugustandSeptemberhaveasmallrise，butlessthantheLCsoinApril；untilafterOctober，LC50valuescontinuedtodecline，reachingthelowestvalueinDecember．And24hand48hLCsovaluesallhavethisrule，contrast，LCsovalueschangein24hisgreaterthanitin48h．Weexaminedtheeffectofdifferentconcentrationsof5kindsofcommonlypesticideadjuvantswhichhavehighlytoxiconApismelliferatomaindetoxificationenzymesandtargetenzymewhichinApismellifera，resultsshowedthat：thespecialactivityofCarEwithinacertainrangeofconcentrationsofpesticideadjuvants，alongwiththeincreasedconcentrationsofpesticideadjuvants，showinganupwardtrend，afterreachingacertainconcentration，thespecificactivityofCarEdecreaseswithincreasingconcentration，24hand48hallhavethisrule，andtheCarespecificactivitygreaterin48hthan24h，butnosignificantdifferencebetweentheconcentration；thespecificactivityofGSTsspecificactivitywithinacertainrangeofconcentrations，withincreasingconcentrationsofpesticideadjuvants，showinganupwardtrend，24hand48hallhavethislaw，butnolawbetween24hand48h，andnosignificantdifferencebetweentheconcentration；thespecificactivityofAChEactivityratiobetweentheconcentrationofadditivesandpesticidesnocorrelation．ThisfivekindsofpesticideadjuvantsthathavenoeffectonthemaindetoxificationenzymesandtargetenzymeinAp西mellifera．Keywords：pesticideadjuvants；ap／smellifera；acuteoraltoxicity；detoxificationenzymeIV 山东农业大学硕士学位论文1引言1．1蜜蜂概述蜜蜂是自然界中传粉昆虫种类最多、数量最大的类群。约73％的植物传粉由蜜蜂类昆虫完成，甚至对于大多数种子植物而言，蜜蜂是唯一的传粉昆虫类群(李捷，2007)，蜜蜂具有极大的经济价值和生态价值，对于农业生产和维护生态系统的生物多样性具有重要而深远的意义(罗术东，2009)。蜜蜂是节肢动物门、昆虫纲、膜翅目、细腰亚目、蜜蜂总科、蜜蜂科、蜜蜂亚科、蜜蜂属。蜜蜂属的特点是：后足胫节上没有距，巢脾是用自身的蜡腺分泌的蜂蜡建造，巢脾的方向垂直于地平面，并且巢脾两面都有六角形的巢房(AlixanderLJ．，1996)。蜜蜂营群体性生活，蜂群由一只蜂王，数百只雄峰和数千至数万只工蜂组成。蜂群内3种类型的蜂，分工合作，共同维持蜂群的群体生活。蜂王是由受精卵发育而来的雌性蜂，生殖器官发育完全，繁殖后代是它的惟一职能。工蜂也是由受精卵发育而来的雌性蜂，生殖器官发育不完全，它的职能有多项，例如照顾幼虫、清理巢房，给蜂王和雄蜂喂食，蜂蜜的酿制，分泌蜂蜡、修筑巢房，保卫蜂巢和采集花粉花蜜等活动。蜂王与工蜂是由于幼虫时食物不同，造成的发育不同。雄峰是蜂群中的雄性个体，是由未受精卵发育而来，职能就是与蜂王进行交尾，完成生殖行为。蜂群中身体最小的是工蜂，工蜂头部有一对具有触觉和嗅觉作用的膝状的触角；一对具有视觉作用的复眼；3个感光作用的单眼。工蜂的口器是咀嚼式口器，上鄂发达，可以咀嚼花粉；下鄂、舌和下唇都延长并合拢成管状，适用于吸吮花蜜。蜜蜂的胸部有2对翅和3对足，翅为膜翅，第三对足上有花粉刷和花粉筐，用于采集花粉。体表密被细毛，可以黏附植物的花粉，是蜜蜂与植物协同进化的结果。工蜂的腹部末端有蛰刺，蛰刺与毒囊连在一起，是蜜蜂防御的武器，受到惊扰时会用螫针刺敌并注入毒液，工蜂在此之后就死亡。蜜蜂的发育要经历卵、幼虫、蛹、成虫4个时期，是完全变态昆虫。工蜂的发育期为21d，雄蜂为24d，蜂王为16d(王承赋，2007)。工蜂卵期3天，幼虫期6天，蛹期12天。蜂王生命周期为2—5年；雄峰的生命周期为40--一50天；工蜂的生命周期为1～4个月，当在开花期时，工蜂工作量大，生命周期在一个月左右，在越冬期，工蜂的寿命最长可达N4个月。根据蜜蜂体型、颜色、筑巢方式以及分布的不同，蜜蜂被分为6个种，分别是大蜜蜂(如 几种常用农药助剂对意大利蜜蜂急性经口毒性及生理生化影响排蜂和岩蜂)、小蜜蜂、黑色大蜜蜂、黑色小蜜蜂、西方蜜蜂和东方蜜蜂(席芳贵，1995)。前四种蜜蜂为野生蜂种不适合进行家养，主要分布在热带地区，例如南非、东南亚和我国海南、广西和云南等省区，其中大蜜蜂和小蜜蜂的生活特点是最为原始的，它们生活在暴露的单一巢脾上，且染色体数目只有西方蜜蜂的一半(8对)。东方蜜蜂的体型、体色随分布区域有所变化。由南到北蜜蜂的个体逐渐增大，体色由黄变黑。东方蜜蜂又分为印度亚种、日本亚种、喜马拉雅亚种和中华蜜蜂亚种四个亚种。西方蜜蜂通常会分为欧洲蜜蜂、中东蜜蜂和非洲蜜蜂3个类群。在这些类群中又以意大利蜜蜂、卡尼鄂拉蜜蜂、欧洲黑蜂和高加索蜂三个蜂种为最具经济价值的蜂种。东方蜜蜂和西方蜜蜂是目前家养的主要蜂种。东方蜜蜂工蜂体长lO～13mm，体被褐色毛。雄蜂体长ll～13mm，体黑色，被褐色绒毛。蜂王最大，体长13～16mm，体色有两种：一种是腹部黑色带明显，黄色斑灰暗，全身呈黑色；另一种黄色斑明亮，黑色带窄，全身呈枣红色(匡邦郁，1988)。东方蜜蜂的特点为行动敏捷，嗅觉灵敏，善于利用零星蜜源，喜欢新脾。当蜂群受到天敌侵害或外界蜜源缺乏时，全群会离巢迁飞，在适合的地点重新筑巢，适于山区饲养(胥保华，2000)。其中中华蜜蜂是我国饲养的主要东方蜜蜂。西方蜜蜂中欧洲类型的蜜蜂有较多的优点，对温带、亚寒带的蜜源、气候等环境条件有较好的适应性，采集力、产卵力较强，一般能维持较大的群势，性情比较温顺，经济价值较高，意大利蜜蜂是我国饲养的主要西方蜜蜂。1．1．1意大利蜜蜂我国饲养的蜜蜂品种主要是意大利蜜蜂，该蜂种具有繁殖力强、能维持大群、产量高等优点，在我国大部分地区广泛饲养。意蜂一般比较温顺，在提脾翻转检查时，能保持安静，蜂群育虫力特强，从早春可直至深秋都能保持大面积子脾(地中海型的育虫周期)，分蜂性非常弱，特强的蜂群在仲夏仍能很好地工作，这样就能在主要季节，节省大量管理劳力。在开花盛期可以大量采集花粉花蜜，对较大面积花源的传花授粉效率非常高。由于意蜂吻较长，可以利用它为红三叶草授粉，它的造脾性能优越，蜜盖洁白，可以生产巢蜜。意蜂分泌王浆的能力特强，并善采贮大量花粉。在夏秋，往往采集较多树胶，清巢能力强，抗巢虫；但意蜂以强群越冬，食料消耗大，在较高纬度地区，越冬困难，早春育虫时，工蜂往往受冻损失，因而春季群势发展迟缓。若夏季流蜜不佳，由于消耗大，容易出现饲料短缺。1．1．2世界蜜蜂现状2 山东农业大学硕士学位论文f12006年冬以来，欧美相继出现蜂群大量减少的情况，科学家们称之为蜂群崩溃失调病(ColonyCollapseDisorder，简称CCD)，如在2006--2007年冬，估计在美国有65．1～87．5万蜂群消失，而这之前有240万蜂群。以下条件用以界定一个受CCD影响的蜂群：蜂巢内完全没有任何成熟的蜜蜂，蜂巢内只有少量或完全没有蜜蜂尸骸；蜂巢内有蜜蜂的幼虫；工蜂甚少遗下幼虫于巢内不顾；蜂巢内有蜂蜜及花粉积存，积存的食物并无受其他蜂类盗窃，亦没有因虫害而腐坏(HayesJ．etal，2007，OldroydB．P．PLoSBi01．，2007，StokstadE．Science，2007)。引致蜂巢最后崩溃的前因包括：没有足够的工蜂照顾蜜蜂幼虫；剩余的工蜂以刚成熟的工蜂为主；蜂后仍然存在于巢内；剩余巢内的蜜蜂停止制造蜂蜜、蛋白质补充物等饲料。引起蜂群衰退的因素有很多，其中农药的大量使用被认为是一个重要诱因(赵帅，2010)。鉴于蜜蜂具有重要的生态价值，欧美和欧盟一地中海植物保护组织在20世纪50年代就已经开展了农药对蜜蜂的生物毒性的测试方法以及安全性风险评价的技术的研究，并制定了蜜蜂急性毒性的测试技术导则，而且提出了比较完整的农药对蜜蜂生物安全性评价的体系(卜元卿，2009)。1998年国际经济合作与发展组织(OECD)制定了农药和其他化学品对蜜蜂经口急性毒性实验导则“Chemicals—Honeybeesacuteoraltoxicitytest"’。1989年我国前国家环保总局组织编写了《化学农药安全评价试验准则》，其中就包括对蜜蜂的急性经口毒性。1．1-3影响蜜蜂健康的因素蜜蜂的健康状况受温度的影响很大。由于我国大部分地区处于温带，我国饲养的蜜蜂都需要越过寒冷的冬季，并在次年春季发展起来进行采集工作。在这段期间，蜂王无法产卵，工蜂不能进行外出采集，蜂群只能通过消耗蜂巢内的食物来维持生存。蜜蜂是变温动物，低温是蜜蜂越冬的主要困难。在越冬阶段，蜂群的群势是影响蜂群越冬的重要因素。蜂群的群势越强，蜜蜂的数量越多，蜂团保持温度稳定的能力就越强；蜂群的群势越弱，温度散失就会加快，为了维持蜂团中蜜蜂生存的温度，蜜蜂只能通过消耗饲料、增加运动产热，这样不仅导致了饲料的消耗加速，而且也加快了工蜂的衰老速度(焦震，2012)。因此，强群是蜜蜂安全越冬的基础(李光德，l989)。3 几种常用农药助剂对意大利蜜蜂急性经口毒性及生理生化影响蜂群内的巢温是相对稳定，蜜蜂对巢房内温度变化较为敏感，当蜂群内温度偏离正常温度范围时，蜂群就会调动力量调节温度以达到合适的温度范围。蜂群具有调节巢内温度的能力，虽然外界气温时高时低，但是巢内始终保持一种相对稳定的温度。然而，蜂巢的温度不是恒定的，巢温的变化也与气温环境、季节、群势、蜂子发育状态、蜂种及人为管理因素有关。外界气温会影响蜂群内的巢温变化。当外界的温度有较大变化时，巢温也有较大变化，当外界温度在15．5～22．0"C之间变化时，子脾的温度保持在35．512左右，外界温度5～15．5。C和22．0"--"33．O℃时，子脾温度与外界温度明显相关，气温降至5。C时子脾温度下降N32．1℃，气温升至33℃时子脾温度会升至38．5℃。养蜂管理措施对蜂巢温度产生的影响也有很多，最常见的是箱盖的开启，如在缺蜜期开箱饲喂蔗糖水、蜂群群势不适合时进行调整、全面检查蜂群的状况等等。人为的干扰会对蜂群内温度产生很大的影响，从而会影响蜂群内正常生活及蜜蜂的发育。周冰峰曾做过研究，当外界温度低于蜂巢正常温度时，开启蜂箱盖，会导致蜂箱各个蜂路的温度会有不同程度的降低。蜜蜂的正常活动也受温度的影响及制约，例如蜜蜂的采集飞行行为必须在一定的温度范围内才能进行，蜜蜂个体的正常飞行的温度范围为10～38℃，当温度在38。C附近时，蜜蜂的外出采集行为主要是采水，当低于10。C时，蜜蜂会很快失去飞翔的能力。据调查，意蜂必须在气温高于12。C时才肯出巢飞行，当意蜂个体在13。C以下时，会逐渐呈现冻僵的状态；在1l℃时，翅肌会呈现僵硬；在7"C时，足肌会呈现僵硬，当气温在14。C以下时，意蜂就会逐渐停止飞翔(李月，2008)。温度也会影响蜜蜂成虫个体的代谢强度，甚至会影响其生存。蜜蜂个体代谢最低的温度范围是10～15℃，当温度低于lO℃时，会引起蜜蜂成虫个体的死亡，蜜蜂个体代谢最低的温度范围是10．．．．15oc，在15。C时，蜜蜂新陈代谢的强度最小，在15．-．．400c时，蜜蜂个体的代谢率会随着温度的升高而逐渐升高，在40．--．50。C时蜜蜂的新陈代谢就会失去平衡。当温度高于50℃时，蜜蜂成虫个体就会死亡(张翠平，2007)。1．1．4化学物质对蜜蜂急性经口毒性的测定方法及比较蜜蜂的广泛分布、周身被毛、易饲养、可移动性强、单一的采集特性等决定了它对环境十分敏感，因此蜜蜂常被称为环境污染生物指示器(CelliG，2003；吴黎明，2008)。因此，在化学物品毒性的检测中，其对蜜蜂的毒性是很重要的一项。对蜜蜂的急性毒性毒力测定方法主要包括：急性经口毒性测定和急性接触毒性测4 山东农业大学硕士学位论文定。急性经口毒性的测定方法包括“小烧杯法”和“饲喂管法”。1989年我国国家环保总局制订了《化学农药安全评价试验准则》，其中检测农药对蜜蜂的急性经口毒性的方法为“小烧杯法”，该方法已经被广泛的应用在我国农药制剂的登记试验中。然而“饲喂管法”被国际经济合作与发展组织(OECD)所推荐，许多的国家和国际组织则采用了此方法，而且“饲喂管法”的测定结果在国际流行的生态风险评价体系中常被作为农药风险评价的重要依据。然而在中国“饲喂管法”的检测结果以及应用很少公开报道。“小烧杯法”的具体做法是：将一定量的农药产品溶于糖水或蜂蜜中，配制成不同浓度的农药蜂蜜混合液(简称药蜜)，然后将药蜜按浓度分别用适量的脱脂棉浸渍，装在5mL的小烧杯内，烧杯口倒置在试验笼上方的纱网上，蜜蜂通过网眼摄取药蜜混合液，定时观察蜜蜂取食的情况，随时添加药蜜量，保证在试验期间蜜蜂可以持续取食。记录蜜蜂在24h内的死亡数，求出其相应的致死中量LD50或致死中浓度LC50。对难溶于水的农药，可加少量助溶剂(如丙酮等)帮助溶解，但应该添加助溶剂对照。“小烧杯法”测试农药对蜜蜂的急性经口毒性是在不涉及到该农药在大田使用中推荐的浓度的情况。此法的优点是农药对蜜蜂的毒力可以用LC50表示，并对农药之间的毒力进行比较，将大田推荐使用的农药浓度和室内采用“小烧杯法”求出的LCso相联系，可以预测农药在该浓度下对蜜蜂的影响。但此方法的缺点是：在测试过程中，蜜蜂在试验期间持续的摄入一定浓度的农药，没有反映出自然条件下农药对蜜蜂的危害，而是放大了农药对蜜蜂的影响，因此，该方法不利于新农药的推广，但对于发展可持续农业和保护生态环境却大有裨益。tt饲喂管法，，与c小烧杯法，，的不同之处在于：在试验之前，需要先使蜜蜂饥饿2～3h，然后向蜜蜂提供含有不同浓度农药的药蜜，药蜜的量应控制在蜜蜂刚好能消耗提供的药蜜在一定的取食时间内，以后再提供不含农药的糖水或蜂蜜，最后观测蜜蜂摄入一定浓度农药后24、48和72h后的死亡率，计算出相应的LC50或LD50值。所测得的LDso值通常用每只蜂所能承受的药剂量(ug)来表示，如果在测试前测得蜂的体重，也可以用所用药剂与蜂的质量比来表示。“饲喂管法，’考虑了化学农药对蜜蜂的作用并不是一个连续作用的过程，与“小烧杯法，，相比，测得的LC50值相对较高，有利于新农药的开发与推广。同时，该方法所测得的数据不但可以在不同药剂之间进行比较，而且可以对化学农药对蜜蜂的急性经口毒性进行量化评价。但是该方法忽略了化学农药的残留问题，其所测得的数据会低于田间数5 几种常用农药助剂对意大利蜜蜂急性经口毒性及生理生化影响据，因此，如果利用该方法得到的数据做为参考依据，一定会弱化农药残留对生物和环境的影响，对蜜蜂的保护有不利的地方(罗术东，2009)。c小烧杯法”对蜜蜂急性经口毒性参考陈锐等依据《化学农药环境安全评价试验准则》划分其对蜜蜂急性经口毒性划等级：低毒(LCso>200mg／L)，中毒(20mg／L1．0a．i．pg／蜂为低毒，2．0a．i．pg，!峰