基于snp重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选 72页

分类号：一$89密级：尘亚单位代码：!Q圣三三学号：2lll2盟§洳≥：j～嗜硕士学位论文中文题目：英文题目：苎￡鼗曼壁垫g鲤壁垒塾丛坠丝g呈壁垒逝丛垒￡鲢￡量．Usin2SNPRe-sequencingTechnology申请人姓名：晏励匿一指导教师：堡垂揠熬援蒸揸盟盟究旦专业名称：挂盘经进边堑鱼差研究方向：生趁拉盎生金壬生堑堂所在学院：边堑叠堂堂暄 瓮fl}{；!Y哟25删5删8㈣7磐8删1艘⑧一论文作者签名：墨笙型指导教师签名：堑堑童i!坠论文评阅人1：盟适握熬援评阅人2：黄尘鏖熬握评阅人3：筮渔圣副数援答辩委员会主席：委员1委员2委员3委员4答辩日期：二零一四年三月八日 Author’ssignature：⑧y肌乒泗川supervisor"ssignature：—上!厶兰!—22弓坠Extemalreviewers：里!Q鱼墨sQ!一苎鱼L．L丝嘤星塾￡￡Q鱼曼墨Q!H坠垒垒g墨地K垦望g鱼遏曼Q匹亟丝￡煦鱼墨墨Q!塾!H亟i鱼垫g．．ExaminingCommitteeChairperson：ExaminingCommitteeMembers：Dateoforaldefence：2014．3．8 浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得迸姿盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：蜴彩鼬签字日期：扣J垆年乡月矿日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝姿盘鲎有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权迸姿盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：吕降们导师签名：耷眨签字日期：矽叶年弓月z歹日签字日期：砌l中年多月≯r日 本研究得到现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-45-KXJ3)资助。特此致谢! 目录致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯I摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IIAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯III第1章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1白垩病的病原体生物学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．1白垩病的病因和传播机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1．2白垩病的发病原理、症状和鉴定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．2白垩病的流行病学⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．3蜜蜂抗白垩病的机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3．1行为机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．3．2生理机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．41．3．3分子机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．4SNP技术及其在蜜蜂领域的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．4．ISNP技术在蜜蜂进化方面的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯71．4．2SNP技术在蜜蜂疾病方面的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．5研究意义和创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．81．5．1研究意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．5．2研究创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9第2章意蜂蜂群和幼虫个体抗白垩瘸能力的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．102．1研究材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．1主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．1．2主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．102．1．3研究样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l2．2研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ll2．2．1组织实验蜂群⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l2．2．2意蜂抗白垩病能力的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．112．2．3意蜂清理能力的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ll2．2．4蜜蜂幼虫抗白垩病能力的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12 2．3研究结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．3．1意蜂的抗白垩病能力测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。152。3．2意蜂清理能力的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．3．3蜜蜂球囊菌的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．3．4意蜂幼虫抗白垩病能力的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．4．1蜂群实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．282．4．2蜜蜂球囊茵的鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．4．3蜜蜂幼虫抗白垩病能力测定的结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29第3章蜜蜂抗白垩病分子遗传标记的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．1研究材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．303．1．1主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．1．2主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．1．3研究样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．2研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．2．1抗白垩病和易感白垩病蜜蜂幼虫个体的收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．303．2．2蜜蜂幼虫个体DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．313．2．3DNA文库的构建和高通量测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l3．2．4干净序列的获取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一323．2．5干净序列在蜜蜂参考基因组上的比对和分布统计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．333．2．612个蜜蜂个体的SNP的检测和注释⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．333．2，7与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的ShIP分子标记的筛选⋯⋯⋯⋯．．333．3研究结果和分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．3．1蜜蜂样本的筛选及处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．3．2蜜蜂个体DNA的提取及质量检验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．3．3原始数据和干净数据的产量统计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．343．3．4干净序列在蜜蜂参考基因组上的比对和分布统计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。373．3．512个蜜蜂个体的SNP的检测和注释⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一383．3．6与蜜蜂幼虫抗自垩病性状相关的SNP分子标记的筛选⋯⋯⋯⋯40 3．4讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。473．4．1SNP重测序样本分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。473．4．2与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的SNP分子标记的筛选⋯⋯⋯⋯．．473．4．3与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的分子标记的功能分析⋯⋯⋯⋯．．48第4章主要结论和后续研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．504．1主要结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．504．2后续研究展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．50考》：考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58硬士期间发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59国际交流及会议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．60 致谢青春如同白驹过隙，匆忙间走过，却仍然忍不住驻足眺望．在浙江大学的两年半时光是我难以忘怀的日子，从第一次见到美丽的紫金港校区的欣喜，到现在被浙江大学的完善的配套设施、优美的人文环境所深深吸引，更值得庆幸的是我在浙江大学认识、结交了很多优秀的老师和知心的朋友．首先，我要对苏松坤老师表达我最诚挚的谢意及最崇高的敬意，感谢他在学>--j、生活和科研上对我的无私帮助与精心指导，从实验开题的设计、研究过程的跟进到毕业论文的撰写，无不渗透着苏老师的大量心血．此外，科研工作方面，苏老师严谨求实的治学态度、无私忘我的科研精神、高超的学术水平以及勤恳的工作作风；学习生活方面，苏老师渊远博大的学识、谦虚好学的学风、积极乐观的生活态度均将使我受益终生．感谢我的另一位导师缪云根教授，他深厚扎实的学术造诣是我的榜样，在实验中得到他很多的指导和帮助．记得在我对未来的选择方向感到迷茫时，缪老师耐心地跟我交谈，并分享他的经验，给我建议和鼓励，谢谢缪老师!感谢浙江大学动物科学学院领导、特动系领导、以及陈盛禄教授、胡福良教授、相关工作人员在我研究生学>-j期间给予的大力支持和帮助!感谢实验室的刘芳师姐、胡云娟师姐，李文峰、李志国师兄，感谢同级的卢媛媛．王凯，福建农林大学的刘元珍师弟、刘小彦师妹对我在生活和实验方面的帮助，感谢平舜在科研、生活、就业各方面的支持和鼓励，感谢胡老师实验室的师兄师姐、师弟师妹们，感谢你们帮助我克服各种困难与疑惑，让我有勇气并能够顺利完成实验．特别要感谢我的亲人，感谢他们的培育之恩，感谢他们一直以来对我学业的支持与付出，他们给我的关怀与鼓励是我完成学业、不懈努力的精神支柱!感谢我生活学习了两年半的浙江大学，感谢母校给我提供了如此之好的学>--j资源与发展平台，让我能够不断充实自我，提高自我：感谢母校给我提供了优美舒适的生活和学习环境，让我度过了两年半的美好时光．最后，感谢参加论文评审和答辩的所有专家和老师，谢谢你们! 摘要蜜蜂白垩病(ehalkbrooddisease)是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraap／s)引起的蜜蜂幼虫死亡的真菌性疾病，该病已蔓延至世界各地．长期以来，人们对蜜蜂抗白垩病的机制进行了深入研究，取得了诸多进展，但大多研究集中在行为水平和生理水平，而对培育抗自垩病蜂种最为重要的分子机制方面的研究甚少，对蜜蜂抗白垩病相关的关键基因未见报道，因此，开展蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记的研究，具有重要的科学意义和应用前景．本研究采用20个患白垩病蜜蜂黑色干尸混合509花粉粉碎，用蜂蜜混和制成条状花粉饼对患白垩病和健康意蜂蜂群进行人工接种感染，发现它们在接种前后患病个数差异显著(2012年P=O．0227，2013年P--0．0005)；不同组的蜂群之间在接种感染前后患病个数差异均显著(P=0．0238和P--0．0211，2012年)，证实了不同蜂群抗白垩病能力确实存在显著差异．采用封盖子脾冷冻法检测了5群意蜂蜂群的清理能力，发现蜂群内幼虫的患病个数与清理率呈显著负相关(P=O．0187)，说明蜂群清理能力越强，患白垩病的幼虫个数越少．采用蜜蜂球囊菌孢子接种3日龄幼虫的方法来检测蜜蜂幼虫抗白垩病能力，结果表明不同群的蜜蜂幼虫抗白垩病能力差异显著(2012年P=0．0006，2013年P=0．0005)，且幼虫抗病能力和蜂群整体抗病能力呈正相关性．收集强抗病幼虫个体(6只)和易感病幼虫个体(6只)，作为SNP重测序的样本．提取DNA并建立DNA文库之后，获取了高质量的测序数据，将干净序列与蜜蜂参考基因组进行比对和SNP注释．最终，我们获取位于mRNA的与蜜蜂抗白垩病相关的SNP位点696个，与蜜蜂易感白垩病相关的ShIP位点102个．通过进一步的基因过滤筛选，我们一共筛选出71个与蜜蜂幼虫抗白垩病性状密切相关的SNP位点，并对编码边缘糖基转移酶，白介素．1，多抗药性蛋白，王浆主蛋白一5等物质的SNP位点进行了分析讨论，这些研究结果为蜜蜂抗白垩病分子辅助选育提供了宝贵的分子标记．关键词：蜜蜂；白垩病；蜜蜂球囊菌；SNP；分子标记Ⅱ AbstractChalkbroodisfungaldiseaseofhoneybeelarvaecausedbyAscosphaeraapis，thisdiseasehadbeenspreadingthroughtheworldwide．Manystudieshavebeenmadeonchalkbroodtolerancemechanismsinhoneybeesandprogresshasbeenachievedinmanyaspects．However,mostresearcheswereconcentratedonbehavioralandphysiologicallevel．TherewerefewreportsrelatedtomolecularmechanismsofchalkbroodtolerancewhichWasimportanttocultivatefmebreedsoftoleranthoneybees．Uptonow，thereWasnoreportOnkeygenesrelatedtochalkbroodresistance．Therefore，itWasimportantandurgenttomakeresearchonconfirmingthemolecularmakersrelatedtochalkbroodresistancetraitsinhoneybees．Inthisstudy,wecarriedouttheexperimentsoftheartificialinfectionwiththemixtureoftwentysporulatedmummies,50grampollen，andhoneyTheresultsshowedthatthechalkbroodnumberin卸ismelliferaligusticacoloniesincreasedsignificantly(P=O．0227in2012，P=0．0005in2013)afterinfection．Therewerealsosignificantdifferencebetweenhealthyandchalkbroodgroupsundernaturalconditionandartificialinfectionaswell(beforemfecfion，P=0．0238in2012；afterit，P=0．0211in2012)，whichindicatesthereexistsignificantdifferenceofchalkbroodresistanceamongcoloniesofApismelliferaligustica．Wealsousedthemethodoffrozensealedbroodtodetectthecleaningcapacityinfivecolonies(apismelliferaligustica)withsamecolonypopulationandfoundthereWasasignificantnegativecorrelationbetweenchalkbroodnumberandcleaningratio(P--O．0187)，whichindicatesthecolonywiths订ongercleaningcapacityhasfewerlarvaeinfectedwithchalkbrood．WcusedsporesofAscosphaeraapistoinfectlarvae(thirdday)，theresultsweresignificantbetweendifferentcolonies@：0．0006in2012，P=0．0005in2013)，andthelarvaefromthecolonyofstrongerresistantabilitytochalkbroodshowedlowermortalityrateaftersporesinfection．Wecollectedlarvaewithstrongresistantabilitytochalkbrood(N26)andlarvaewithsusceptibletraittochalkbroodfN=6)，assamplesforSNPre·sequencing．AfterDNAisolationandconstructionofDNAlibrary,weIlI obtainedhighqualitysequences,subsequently,wemappedthecleanreadsontotheApismelliferareferencegenomeandmadetheSNPannotation．Finally,Weacquired696SNPmarkersrelatedtochalkbroodresistanceand102SNPmarkersrelatedtochalkbroodsusceptibleness(alltheseSNPmarkersarelocatedinmRNA)．Afterfilteringandselecting，71SNPmarkerswerescreenedasclosedrelatedmarkerstochalkbroodresistance，andwealsoanalysedtheSNPsequenceswhichcodefringeglycosyl仃ansferase，Interleukin一1，multidrugresistanceassociatedprotein,majorroyaljellyprotein一5．Thisstudyprovidesgeneticmarkersforfurtherstudiesonmolecularassistantselectionbreedingonchalkbroodresistanceinhoneybee．Keywords：honeybees；chalkbrood；AscosphaeraapLP；SNP(singlenucleotidepolymorphism)；molecularmarkersIV 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状榴关纳分子标记筛选第l章文献综述蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)是一种侵染蜜蜂幼虫，引发蜜蜂白垩病的真菌性病原微生物．蜜蜂幼虫主要通过摄食真菌孢子患病，孢子侵染幼虫后，于封盖期在幼虫体内末端开始生长，菌丝迅速膨胀，穿过上皮层，3d后就能穿透虫体，继续在空气中生长。大部分幼虫在封盖期死亡，感染白垩病死亡的幼虫逐渐萎缩干枯至僵硬状，死亡幼虫最后变成白色、灰色或黑色的石灰样硬块【11．白垩病早在20世纪初就已经被发现【21，随后逐渐传播至整个世界范围，当前蜜蜂白垩病已经成为对我国西方蜜蜂健康危害十分严重的蜜蜂疾病，有迹象表明白垩病发生率可能正在升高[31．值得关注的是，蜜蜂球囊菌已经成为第一个全基因被测序的昆虫真菌性病原体【41，分子检测技术在白垩病的诊断等方面也起到日益重要的作用．纵观国内外白垩病的研究进展，单纯依靠药物治疗措施，达不到令人满意的效果，反而增加了防治成本，引发蜂产品中药物残留超标问题．如果不采取有效措施，该病仍会广泛流行[51．因此，培育抗白垩病蜂种将成为根治白垩病的理想途径，培育抗白垩病蜂种的首要前提是了解蜜蜂的抗白垩病机制．有些蜂群在感染白垩病后仍能存活。表现出良好的抗病性状，在对这些具有抗病性状的蜂群进行深入研究后，发现其存在一种或多种的行为或生理特征并决定其抗病性【4】．本文综述了白垩病的病原体生物学．流行病学和控制方法等研究进展，并将蜜蜂的抗白垩病机制归纳为行为机制、生理机制及分子机制，以期从基因研究方面更好地理解蜜蜂球囊菌繁殖和发病机理的控制机制，为蜜蜂抗白垩病育种提供科学依据．1．1白垩病的病原体生物学1．1．1白垩病的病因和传播机制蜜蜂球囊菌经过有性生殖产生孢子侵染蜜蜂幼虫是蜂群感染白垩病的根本原引6】．尽管成年蜂不受这种病原菌感染，但成年蜜蜂之间能够通过食物传播这种疾病：真菌的孢子通过觅食的蜜蜂携带，当工蜂用被污染的食物饲喂健康幼虫时孢子就会被传递给幼虫，幼虫在摄入含蜜蜂球囊菌孢子的食物后很可能感染上白垩病．蜂群之间主要是通过迷巢工蜂、雄蜂、蜂机具以及被污染的花粉、蜂蜜 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选等传播白垩病．Flores等【7，81研究发现，巢脾中被蜜蜂球囊菌污染的蜂蜡很可能是自垩病的重要传染源，因为孢子可能从蜂蜡转移到蜂箱的其他部位以及箱内的蜂产品中，其存活年限可以长达15年，任何一种蜂房中的材料被真菌孢子污染以后都会成为长期污染源．另外，转地放蜂和蜜蜂商业授粉也是蜜蜂球囊菌大规模传播的重要途径．1．1．2白垩病的发病原理、症状和鉴定方法孢子被蜜蜂幼虫摄食以后，很可能是被二氧化碳激活并最先在内脏中开始繁殖【9】．随后菌丝逐渐膨胀，直到穿透蜜蜂幼虫身体末端的角质层，一般来说，3—4日龄的幼虫最容易被感染，被感染的幼虫很快就会减少食物消耗，之后全部停止摄食。Theantana和Chantawannalml[10】鉴定了蜜蜂球囊菌产生的几种酶，其中一些酶的作用就是帮助病原菌渗透蜜蜂幼虫的中肠膜，渗透肠壁以后，真菌的菌丝就会在动物体腔中生长，最后穿透幼虫尾部．在机械作用和酶的损伤下，血淋巴不能循环，蜜蜂球囊茵从蜜蜂幼虫尾端生长到头部，最后整个蜜蜂幼虫都覆盖了厚厚的白色菌丝．病至末期，虫体逐渐萎缩干枯且僵硬，最后变成白色、灰褐色或黑色的石灰样扁平硬块。蜜蜂白垩病的传统鉴定方法是以病原的形态学、生物学及培养条件等方面的特征为基础。粱勤和陈大福⋯1研究发现，白垩病的病原在含有酵母膏的马铃薯葡萄糖琼脂和麦芽糖琼脂培养基上生长良好，可以作为病原鉴定和疾病诊断的培养特性．但是这些特征差异并不明显，甚至会出现形态和大小上的重叠，几乎难以区分‘121．如果要对患白垩病蜜蜂进行准确地鉴定，还要从分子水平上入手．赵柏林【131使用荧光定量PCR方法对蜜蜂白垩病作出快速准确的诊断，较传统鉴定方法而言，准确率得到大幅度提高．1．2白垩病的流行病学低温潮湿的环境会加快蜜蜂球囊菌在蜂巢中的生长繁殖，这也是白垩病在春季最为流行的原因之一．除环境条件以外，真菌菌株和蜜蜂遗传背景的差异性等生物因子的交互作用也可能影响疾病的发生率和严重性．Vojvodie等‘1钔通过用不同进化支的蜜蜂球囊菌孢子饲喂蜜蜂幼虫，发现其毒力水平表现出近6倍的差异．此外，真菌孢子在蜂群中的高浓度集中增长了蜜蜂幼虫被孢子感染的几率，所以疾病的发生率还有可能依赖于真菌的囊孢子产量、孢子的发芽率和传播效率。’ 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选当蜂群发生了白垩病以后，较多使用药物来进行治疗。使用化学药物治疗白垩病可能会对蜂产品污染很大，严重影响了蜂产品的品质．随着科学技术的发展，人们开始尝试使用新型药物或方法来治疗自垩病【15】，如多功能生物制剂、中草药、天然植物提取液和从蜂蜜中分离的一些芽孢杆菌等．但研制价格便宜、能够治疗该病的特效药物仍需努力．目前，从蜜蜂抗病育种的途径解决蜜蜂的白垩病问题已成为新的发展方向．如果能够从分子水平掌握蜜蜂的抗白垩病机制，发现与抗病性状相关的分子遗传标记，并结合分子遗传标记辅助选育技术，不但能保证选择的准确性，还可以加快选育速度，大大提高选育抗白垩病蜂种的成功率，安全、有效地解决蜜蜂白垩病困扰．1。3蜜蜂抗白垩病的机制1．3．1行为机制1．3．1．1卫生行为蜜蜂的卫生行为是指蜜蜂能够检查、咬开封盖巢房并清除巢房内已被病害感染的蜜蜂幼虫的一种行为．一般情况下，若要检查蜂群是否具有卫生行为可通过分别检测蜂群在24h和48h后对冷冻致死的封盖仔的清除能力‘161。美国学者在培育抗病和抗螨的蜜蜂品系时，发现清巢能力强的蜜蜂品系很少患美洲幼虫腐臭病．白垩病及被蜂螨寄生．蜜蜂个体从患病幼虫中察觉到化学刺激之后就迅速从巢房中移走患病幼虫，从而减少病原菌的传播，这是蜜蜂的一种群体免疫机制的具体表现．Swanson等‘1刀通过研究发现，蜜蜂的卫生行为除了与先天的遗传基因有关以外，还与蜜蜂对气味识别的敏感度密切相关．从患白垩病的蜜蜂幼虫中检测到三种挥发性混合物，这些挥发性混合物很容易被成年工蜂监测到．两种生化手段均证实，挥发物中的一种醋酸盐成分与蜜蜂球囊菌孢子感染的蜜蜂幼虫联系密切，从而引发了蜜蜂的卫生行为，所以具有敏感识别气味能力的蜜蜂具有较强的清理能力．神经生物学相关研究证实，患病蜂群查探到病原菌时间的长短对于其抗病能力而言至关重要，蜜蜂必须在病原菌的感染力达到一定程度之前侦察到并移走患病蜜蜂个体【18，191，否则当病原菌达到传播水平，移走患病蜜蜂的过程可能会加剧病原菌的传播。Invemizzi等‘11研究发现具有较强卫生行为的蜂群其优势在于能够在早期发现感染幼虫的死亡并在它们变成干尸之前将其迅速清出巢房．1．3．1．2温度调节行为1 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选蜜蜂通过加热、冷却、改变空气流通速度来调节蜂巢内部温度【2们．在蜂巢中，蜜蜂群体将温度维持在32．34"C左右并且设法抑制巢房内湿度出现波动．这种调节温度的能力是蜜蜂抵御生物入侵的一种方法．关于蜜蜂产热来应对病原菌威胁的研究已有报道，Starks等【211发现微小的但是有显著意义的巢础升温，这种升温出现在白垩病的病原菌一蜜蜂球囊菌入侵的时候。蜜蜂球囊茵在30"(2v1刚-最容易对蜜蜂幼虫发起进攻，所以作者推测在病原菌入侵时巢础中o．56"C的平均升温可能抑制了病原菌的增殖。巢房内温度的降低会增加白垩病的流行，将蜜蜂幼虫于34"C进行体外培养，同时用蜂球囊菌孢子饲喂蜜蜂幼虫，实验期间将培养温度降低至27℃，持续进行24h，发现期问实验幼虫由于患白垩病而死亡的概率明显升高【221，表明温度对白垩病发展程度影响显著．1．3．1．3其他行为蜜蜂通过梳理行为来清除外来物质，抗病能力较强的蜜蜂用中足进行梳理以防止病原微生物传播到同伴身上。蜜蜂还通过与同伴相互梳理来移除外来物质和同伴身上的病原微生物．Boecking和Spivak[23】提出，蜜蜂的同伴梳理行为可能是由一种梳理舞蹈行为引起的，目前蜜蜂通过梳理行为来损伤或杀死蜂螨的报道研究较多．大部分被病原茵感染的蜜蜂很可能死亡在蜂巢外，蜜蜂能够及时将死亡的成年蜂从巢房中清除，这些行为降低了潜在的病原菌感染蜂群的几率，有利于蜜蜂群体健康[23,24]．Simone．Finstrom和Spivakl251发现当蜂群受到蜜蜂球囊茵感染时，蜂群会增加采集蜂胶的蜜蜂数目来抵抗病原菌侵袭，蜜蜂并不摄食蜂胶而是将蜂胶放在蜂箱中来抑制真菌孢子的繁殖．在实验中，增加蜂胶采集的蜂群明显降低了被蜜蜂球囊菌感染的几率，有力地证实蜂胶抗白垩病的效用．1．3．2生理机制1．3．2．1物理防御蜜蜂球囊菌通过攻破蜜蜂主要的物理防御屏障一一角质层和上皮层来感染蜜蜂口61。角质层和上皮层的化学组成成分，如蜡和不饱和脂肪酸，具有很强的抗真菌活性，从而阻止病原菌黏附或是进入蜜蜂体内．Crailsheim和Riessberger-Gall6[273发现成年蜜蜂的中肠具有一种或多种非诱导性的，对温度稳定的物质，这些物质可能抑制了孢子的萌发，从而降低甚至消除了孢子对蜜蜂的侵染能力．成年蜜蜂中肠提取物的抗菌能力明显强于蜜蜂幼虫的中肠提取物，这种差异很可能就是由于这种物质含量存在差异造成的，这也导致了不同幼虫个体4 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选对病原菌的敏感性不同和抗病能力差异．但关于这种物质是蜜蜂合成的还是存在于蜂产品中尚未得出结论[271．另外，蜜蜂还可以通过改变中肠的pH值或其他化学条件来抑制微生物的入侵．1．3．2．2免疫防御当外在的物理屏障被攻破之后，蜜蜂会通过激活由细胞免疫和体液免疫组成的生理性免疫防御系统抵御真菌的侵染‘281．蜜蜂体内的血淋巴一旦检测到入侵病原，细胞免疫应答反应随即开始，同时两种抗菌肽一蛾血素和溶解酵素在被侵染的数小时之后特征性地出现在血淋巴中‘291，有力地抵抗病原菌的侵袭．吞噬作用和封闭作用在蜜蜂抵御致病性真菌的过程中是最常见的防御机制【2引．与免疫相关的血细胞可以直接杀死真菌孢子，并且通过噬茵作用机制毁灭其他外来小分子t30]。体液免疫的活化作用诱导AMPs和溶菌酶的合成，并且激活了酚氧化酶合成系统．这些协同作用能够钝化或杀死入侵微生物[291，在一定程度上保护蜜蜂不被病原菌侵染．1．3．2．3激活信号通路除了物理防御和免疫防御，蜜蜂还通过加剧免疫应答对病原菌的侵入做出反应．蜜蜂具有4种主要的并相互关联的反应通路：Toll、Imd．Jak／STAT和Jnk通斛311．这些通路由识别病原菌侵入信号的蛋白质、调节和放大这些信号的蛋白以及直接参与病原菌抑制作用的效应蛋白和代谢物组成[321．识别蛋白与不同病原茵的结合存在一定的差异，从而特异性地识别不同的病原菌．例如，p葡聚糖存在于真茵病原茵的表面，识别蛋白特异性地识别这种物质，将入侵信号传递出去．发现入侵物以后，识别蛋白与蛋白酶、其他细胞因子以及一些信号物质发生作用，最终影响跨膜蛋白，Toll信号通路和J划sTAT信号通路就是这样起作用的．但是也有例外，Imd信号通路中本身就存在跨膜蛋白，可以直接与其他蛋白发挥作用。最终转录因子编码抗菌性的多肽或是其他效应因子，免疫途径释放，从而发挥防御病原菌的作用‘331。1．3．3分子机制蜜蜂基因组测序工作的完成为从分子水平进一步研究蜜蜂的抗白垩病机制提供了重要基础．如果能够从分子水平掌握蜜蜂的抗白垩病机制，筛选出与蜜蜂抗白垩病性状密切相关的分子标记，我们就可以为培育抗白垩病蜂种提供理论及技术支持．HoSpital【蚓认为，相对与确定抗病性显性基因的大难度、高成本，筛S 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗自垩病性状相关的分子标记筛选选分子遗传标记无疑为一种有效的育种手段．蜜蜂的卫生行为等一些行为性状几乎都是最理想的抗白垩病性状，但是很难对它们进行准确的定性及定量检测，而分子遗传标记可以直接通过确定与目标基因紧密连锁的基因位点而加快选择速度和提高选择准确度．筛选抗病性状相关基因的方法主要有两种．一种方法是利用微阵列技术对抗白垩病蜜蜂和白垩病易感蜜蜂进行研究和比较，找出差异表达的基因，再作进一步分析和验证．傲阵列技术的优点是可以从行为和生理水平描述基因表达模式，从而获得与抗白垩病性状相关的目的基因，缺点是蜜蜂样本的遗传背景差异会影响基因表达，从而降低实验结果的准确度。另一种方法是用数量性状基因座定位(quantitativetraitlocus，QTL)技术在染色体区域寻找影响抗白垩病性状的相关基因，因为QTL技术适用于所有的遗传性状，通过研究影响性状表达的数量性状基因的数量及它们的相关效应，估算该基因在染色体上的位置【351，从而有效地筛选出目的基因。Amnstein等f3司使用cDNA-AFLP和qRT-PCR分析。发现了蜜蜂发挥抗真菌感染作用所需的主要转录物，这些转录物还参与转录调节、细胞凋亡、营养代谢及RNA转录加工等重要事件，更值得关注的是转录基因与抗白垩病相关的SNP位点具有很高的相似性．这些研究无疑为我们改良蜜蜂遗传信息、培育抗病蜂种提供了宝贵的信息。1．4SNP技术及其在蜜蜂领域的应用单核苷酸多态·陛(singlenucleotidepolymorphism，SHIP)被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，这种差异包括单个碱基的缺失或插入【371．更常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基(A与G)和嘧啶碱基(c与T)之间．SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记．目前，已有2000多；个标记定位于人类染色体上，在拟南芥上也已发展出236个SNP标记．在这些SNP标记中大约有30％包含限制性位点的多态性．最新报道的微芯片电泳(microchipelectrophoresis)，可以高速度地检测临床样品SNP，它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高lo和50倍D8]．目前华大科技等基因公司通过提取基因组DNA并随机打断、加上接头、上机测序、生物信息学分析等步骤可以准确获得基因组SNP信息，筛选出与特异 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选性状相关的SNP分子标记．1．4．1SNP技术在蜜蜂进化方面的应用意大利蜜蜂起源于非洲，之后扩张到欧洲地区．1956年，非洲起源的蜜蜂被引入南美，它们的后代与之前引入欧洲的蜜蜂结合，大大地增加了“非洲化”蜜蜂一一种强进攻性和无经济价值的蜜蜂的数量[39‘40]。Zayed等t411为了探究蜜蜂“非洲化”的扩张与基因组标记的联系，对蜜蜂基因组编码SNPs和非编码区SNPs进行了对比基因差异估值分析(FST)．在自然情况下的群体中，蛋白质编码区SNPs的FST值会显著高于非编码区，提示基因组适应性的进化是由积极选择来驱动的．这个选择信号与蜜蜂从非洲侵入欧洲的行为相关联，在一定程度上反映了蜜蜂对于环境的适应能力。研究还发现FST值与GC含量呈负相关，提示AT*富基因在蜜蜂的选择进化中起到非常重要的作用．通过分析蜜蜂中1500个单核苷酸多态性，Whitfield和他的同事[39】证实了蜜蜂亚种存在四个分支：两个在欧洲，一个在亚洲，一个在非洲．这些SNP数据显示了这些亚种是怎样完成迁移的．实际上蜜蜂完成迁移是通过两种方式：一种是通过登录西班牙然后进入中欧和俄国，另一种是蜜蜂聚集在东欧然后进入亚洲．结果，尽管两个欧洲蜜蜂亚种在地理上十分接近，却是地球上差异最大的两种蜜蜂142]。1．4．2SNP技术在蜜蜂疾病方面的应用蜜蜂白垩病是由蜜蜂球囊菌引起的蜜蜂幼虫死亡的真菌性疾病，该病已蔓延至世界各地并且发生率仍在上升，由此给蜂农带来巨大的损失，给养蜂行业带来不可估量的灾害．Holloway等[43】使用白垩病的孢子悬浮液喷洒在含有小于4日龄蜜蜂幼虫的巢脾上，将巢脾在低温下孵化促使幼虫感染白垩病，于封盖期收集患病幼虫(蛹)和抗病幼虫(蛹)，提取了患病幼虫(蛹)和抗病幼虫(蛹)的DNA，对其单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)位点与抗病性状之间的关系进行了研究。通过单标记绘图发现，只有第二条和第十一条染色体的似然比值(109arithmofthelikelihoodratio)大于2．5，从而证明这两条染色体与蜜蜂抗白垩病性状密切相关，同时，筛选出155个与蜜蜂抗白垩病性状相关的SNP位点，这些潜在的候选分子标记为培育抗白垩病蜂种提供了良好的思路．狄斯瓦螨(Varroadestructor)是蜜蜂的一种体外寄生螨．目前，狄斯瓦螨已成为西方蜜蜂的主要病虫害之一．狄斯瓦螨靠吸食蜜蜂的血淋巴生存，受螨危害的 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选幼虫濒于死亡，羽化的幼蜂体质衰弱、畸形、寿命缩短，整个蜂群失去生产能力．此外，狄斯瓦螨还可作为病原携带者，传播细菌病和病毒病等，它能够激活蜜蜂体内的病毒增殖、抑制蜜蜂自身的免疫系统，使蜂群内一些原本无害的病毒对蜂群也造成极大杀伤力，加快蜂群的灭亡㈣．通过对与蜜蜂工蜂相关的卫生行为的基因进行分析，spo仕cr等【451设计了特异性的44KsNP的芯片，起初他们从蜜蜂基因组中选择了70000个与蜜蜂开盖有关的ShiPs，这当中经过验证的36000个SNPs和8000个未经验证的SNPs被选择出了建立一个ShIP阵列．这个阵列不仅适用于筛选抗螨基因，同样也适用于筛选其他与卫生行为有关的抗病性状．作为新一代生物技术，虽然SNP技术具有极高的实用价值、在蜜蜂的某些领域的应用已相对成熟，且取得了一定进展，但是该技术在蜜蜂抗白垩病分子标记相关方面的研究仍然较少．因此，本研究采用SNP技术对蜜蜂抗白垩病分子标记进行筛选，以期发现与蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记，探索蜜蜂抗自垩病的分子机制，准确高效地选择抗白垩病蜜蜂进行育种，甚至为通过基因手段培育更加优质的抗病蜂种奠定良好基础。1．5研究意义和创新点1．5．1研究意义蜜蜂白垩病(becchalkbrooddisease)是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera印妇)引起的一种真菌病蜜蜂幼虫疾病，专一地影响蜂群．这种病害给整个蜜蜂产业带来了极大地危害，由白垩病导致的蜜蜂死亡、蜂产品产量大幅度减少，不仅对广大蜂农造成了巨大的经济损失，也危害到整个蜜蜂养殖业．值得关注的是，到目前为止，没有一种有效的治疗白垩病的方法，对蜜蜂抗白垩病性状的基因水平研究的相关报道更是屈指可数．长期以来，大量研究证实，蜂群的抗病能力与其清理能力密切相关，本研究在测定蜂群清理率的同时，还测定了不同蜂群幼虫的抗白垩病能力，首次证实了蜜蜂幼虫也发挥了重要的抗白垩病作用．强抗病蜂群的发现，为我们通过遗传学手段进行抗病育种提供了宝贵材料．同时，我们通过蜜蜂球囊菌孢子接种蜜蜂幼虫观察其是否感染白垩病，能够有效正确的收集强抗病和易患病蜜蜂样本，为筛选出正确的抗白垩病分子标记提供了宝贵材料．我国是养蜂大国，应用SNP测序技术筛选强抗病、弱抗病蜜蜂中差异表达的基因，为培育优质的抗白垩病蜂种 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选打下了坚固的基础，对推动我国蜂业由世界大国向世界强国发展具有重要意义。sNP测序技术在大多数领域的应用仅仅深入到筛选出ShIP分子标记，很少对筛选出的SNP基因进行进一步验证与功能分析，尤其是蜜蜂领域的类似研究更少。本研究采用的是对12个蜜蜂个体(6个强抗病个体，6个易感病个体)进行SNP重测序，每个样品测序深度达到5×的覆盖率，从而保证所得实验数据的全面性及准确性．这是首次运用成熟的生物技术从基因水平研究蜜蜂抗白垩病性状，更是首次将sNP测序技术应用到蜜蜂抗白垩病分子标记相关方面的研究．本研究在SNP重测序结果的基础上，制定了严格有效的荧光定量PCR验证方案以及较为新颖的数据统计方法，并应用了较为全面的基因功能分析工具，极大地发挥了不同生物技术的联用效应，从而更加科学准确的获得抗白垩病性状相关的分子遗传标记，更深入地探究抗白垩病的分子机理，并能够将这一研究成果应用于抗白垩病优良蜂种培育工程上．1．5．2研究创新点(1)在测定蜂群清理率的同时，还测定了不同蜂群幼虫的抗白垩病能力，首次证实了蜜蜂幼虫抗病力强弱与蜂群的抗白垩病能力密切相关。(2)首次通过蜜蜂球囊菌孢子实验室接种蜜蜂幼虫观察其是否感染白垩病，有效准确收集强抗病和易患病蜜蜂样本，为筛选出正确的抗白垩病分子标记提供了宝贵材料．(3)采用SNP测序技术检测了强抗病蜜蜂个体和易感病蜜蜂个体的SNP位点，准确查找出位于基因上的与抗白垩病性状相关的SNP位点，筛选出与抗白垩病能力相关的分子标记和关键基因． 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选第2章意蜂蜂群和幼虫个体抗白垩病能力的检测本研究采用20个患白垩病蜜蜂黑色干尸混合509花粉粉碎，用蜂蜜混和制成条状花粉饼对意蜂蜂群进行人工接种感染，发现意蜂蜂群在接种前后患病个数差异显著(2012年P=0．0227，2013年P=0．0005)；不同组的蜂群之间在接种感染前后患病个数差异均显著(P=0．0238和P=0．0211，2012年)，证实了不同蜂群抗白垩病能力确实存在显著差异．我们还采用封盖子脾冷冻法检测了5群意蜂蜂群的清理能力，发现蜂群内幼虫的患病个数与清理率呈显著负相关(P=0．0187)，说明蜂群清理能力越强，患白垩病的个数越少．蜜蜂幼虫抗白垩病能力的研究采用蜜蜂球囊菌孢子接种3日龄幼虫的方法，结果表明不同群的蜜蜂幼虫抗自垩病能力差异显著(2012年P=0．0006，2013年P=0．0005)，且幼虫抗病能力和蜂群成年蜂抗病能力结果一致，提示抗白垩能力强的蜂群其幼虫抗自垩病能力也强；抗白垩能力弱的蜂群其幼虫抗白垩病能力弱．2．1研究材料2．1．1主要试剂液氮，花粉，洋槐蜂蜜，次氯酸钠，麦芽糖，蛋白胨．琼脂。葡萄糖，果糖，酵母提取物，新鲜王浆，氯化钠，乳白蛋白水解物，2．吗啉代乙磺酸，DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程上海有限公司)，PCR扩增试剂盒(生工生物工程上海有限公司)，琼脂糖，goldenview(上海赛百胜基因技术有限公司)2．1．2主要仪器CFl6RXII型微量高速离心机：日本HITACHI公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海一恒科技有限公司；NanoDropND一1000，2000UV-VISSpectrophotometer：Gene有限公司；JS．6800型全自动凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司；DYY-6D型电泳仪：北京市六一仪器厂；DW-HL88型超低温冷藏籍：中科美菱低温科技有限责任公司；VXQ．LS．50SII型数昱立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；调温干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；超净工作台：上海博迅实业有限公司；二氧化碳培养箱：上海博迅实业有限公司； 浙江大学硕士学位论文基于sNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选HWJ-350恒温恒湿培养箱：宁波海曙赛福实验仪器厂；96WellThe彻a1Cycler：AppliedBios脚sCompany；奥林巴斯CH型双目相差显微镜。2．1．3研究样本抗白垩病蜜蜂(意大利蜜蜂，4砷meH如ra)、患白垩病蜜蜂(意大利蜜蜂，和妇mel蜘ra)，饲养于金华，福州蜂场．2．2研究方法2．2．1组织实验蜂群2012年3月，分别在浙江省金华市长山乡石门村蜂场、浙江金华市汤溪镇九峰山蜂场、浙江金华市莘畈乡莘畈水库蜂场各取两群群势基本一致的意蜂蜂群(每群四脾)，其中一群为健康蜂群，一群为患白垩病的蜂群．编号为1-6号．另从千岛湖蜂场取5群蜂群(意蜂)作为清理行为的实验蜂群，千岛湖蜂群编号为7．11号．2013年3月，在福建省福州市福清坊里村蜂场取八群群势基本一致的意蜂蜂群(每群四脾)，其中一群为健康蜂群，一群为患白垩病的蜂群．编号为12—19号。2．2．2意蜂抗白垩病能力的检测2012年3月25日至4月11日期间，每隔六天统计六个意蜂蜂群的患白垩病蜂仔个数．4月11日，我们对蜂群进行蜜蜂球囊茵人工接种感染：取20个白垩病尸体(黑色)，配509花粉，用九阳料理机粉碎后，用蜂蜜和成条状，取相同重量(60克)的花粉条放在试验蜂群的巢脾的上梁上，成年蜜蜂在采集含蜜蜂球囊菌的花粉时传播病原，对蜂群中蜜蜂幼虫进行人工接种感染．4月12日至4月29日期问，每隔六天统计六个意蜂蜂群的患白垩病蜂仔个数．将健康蜂群的患病蜂仔总个数和患病蜂群的患病蜂仔个数进行DPS软件的t检验嗍来统计分析其在接种前后的差异显著性．对于每一蜂群，也采用DPS软件配对t检验【4q来分析其接种前后的差异显著性．2013年3月12日至4月11日，用同样的方法对福建省福州市福清坊里村蜂场的八群蜜蜂蜂群进行了抗白垩病能力检测．2．2．3意蜂清理能力的测定统计五群群势相似的意蜂蜂群的患白垩病个数和清理率：每群用特制的巢脾 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选切块机切出四块6．5*3．5cm的小封盖子脾，在经一20"C冰冻24h处理后，按原位放回原群，每隔24h观察记录一次封盖子的剩余数目。连续观察三次，测得清理率后，用DPS软件的相关分析和回归分析140q检测患白垩病个数和清理率之间的关系。2．2．4蜜蜂幼虫抗白垩病能力的测定2．2．4．1蜜蜂球囊菌的培养收集患白垩病蜜蜂黑色干尸，用10％的次氯酸钠消毒10分钟，之后用灭菌蒸馏水水洗2分钟．将漂洗过的虫尸放在沙氏葡萄糖琼脂培养基上(麦芽糖409，蛋白胨109，，琼脂209，蒸馏水1L．加热溶解后，调pH至6．0，118"C灭菌后备用)，在恒温恒湿培养箱中于34"C培养。几天之后，可以观察到蜜蜂球囊菌菌丝在培养基上生长，用灭菌过的接种环挑取菌丝尖端，接种在新的培养基上．2．2．4．2提取蜜蜂球囊菌的DNA①取100mg蜜蜂球囊菌的菌丝用液氮研磨成粉末，加入到1．5ml离心管中．加入400ul裂解液和4ulfb巯基乙醇，震荡混匀．65"C水浴l小时至细胞完全裂解②加入200ulbufferPF,充分颠倒混匀，．20"C冰箱放置5分钟。③室温10，000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的1．5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀，室温放置2．3分钟．室温10，000rpm离心5分钟，弃上清．⑤加入Iml75％乙醇，颠倒漂洗1．3分钟，10，000rpm离心2分钟，弃上清．④重复步骤④一次。⑦开盖室温倒置5．10分钟至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的DNA用50．100ulTEBuffer溶解．⑨使用NanoDropND．1000对DNA进行定量和质量检测．2．2．4．3蜜蜂球囊菌的鉴定①查找文献，确定蜜蜂球囊菌的特异性序列SCA300，SCAl635和EF．1a。②在NCBI上搜所这3个片段的原始序列，并利用Primerpremier6设计扩增引物，筛选符合要求、条件较统一的引物序列，并且由上海生工生物工程有限公司完成引物合成．③使用PCR试剂盒进行PCR反应，将DNA模板稀释至10ug／ml，引物稀释至 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选10umol／L，在无菌洁净的PCR管中依次加入以下溶液：灭菌超纯水20ul2xPCRmaster25ulDNA模板lul上游引物2ul下游引物2ul终体积50ul充分混匀后短暂离心④设置合适的PCR反应条件：95℃3mia35个循环：95℃40s，53℃40s，72"Clmin72℃10rain⑤制备琼脂糖凝胶，进行电泳．1．5％琼脂胶的配制：17mlTAE缓冲液，琼脂糖0．2559，goldenview1．275ul，溶解之后，凝胶30rain,上样之后，在120伏电压下运行30rain左右．⑥在凝胶成像分析仪观察电泳结果。⑦将PCR产物送至生工生物(上海)有限公司，进行测序，与原始蜜蜂球囊菌的DNA序列进行比对．2．2．4．4蜜蜂球囊菌孢子活力的测定①待沙氏葡萄糖琼脂培养基上的蜜蜂球囊菌菌丝转变为黑色，肉眼观察到菌丝尖端出现黑色孢子，即可用灭菌的接种环轻轻挑取孢子放入玻璃研磨杵中，加入20ul灭菌超纯水，充分研磨之后，再加入lOOul灭菌超纯水冲洗研磨杵上的残留孢子至玻璃管中．②静置20分钟，观察到玻璃管下端出现明显黑色沉淀，用移液枪小心吸取50ul上清液至新的200ul离心管中。③将取出的孢子悬浮液震荡混匀，用移液枪取出10ul打在血球计数板上．④将血球计数板放置于相差显微镜下，计算孢子数目，推算出孢子悬浮液浓度，将孢子悬浮液浓度稀释至2x107个／m1．⑤取150ul孢子悬浮液，加入150ulGLEN液体培养基(49葡萄糖，7．689氯化钠， 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选6．59乳白蛋白水解物，59酵母提取物，1．952，92．吗啉代乙磺酸，将pH调整至7．o，定容至1L，118"(2灭菌后备用)，混合均匀。⑥将灭菌过的载玻片放置于灭菌过的培养皿中，用移液枪吸取10ul混匀液打在载玻片上，准备三个样本．载玻片周围放置湿润的滤纸，培养皿放置在10％浓度的二氧化碳培养箱中于34"C孵化36小时．036小时后，将载玻片盖上盖玻片，于相差显微镜下观察其萌发情况，记录孢子发芽率(发芽的孢子体积膨大数倍，有的还会长出萌发管)．2．2．4．5幼虫的体外培养与孢子接种实验④将实验蜂群同时进行限王产卵，12小时以后，取出限王的巢脾，检查产卵情况；用王笼扣住蜂王，将卵于原群孵化3天．②将孵化出的1日龄幼虫在室温下(->--2012)用消毒过的移虫针移到灭菌过的48孔细胞培养板中，每群设置3组实验组，l组对照组．根据日龄不同，细胞培养板中添加的幼虫食物量和孢子量不同，具体量表2．1．1．表2．1不同日龄蜜蜂幼虫的食物量Table2．1Thefoodamountforhoneybeelarvaewithdifferentage幼虫食物配方：质量分数50％的中国新鲜王浆，质量分数6％的果糖，质量分数6％的葡萄糖，质量分数1％的酵母提取物，质量分数37％的灭菌超纯水．注：取2．5x106个／ml浓度的孢子与幼虫食物按1：4的比例混匀，在第三天幼虫摄取食物6小时后饲喂10ul孢子感染食物③化蛹前(1-6日龄)，幼虫于34"(3，90％湿度环境下的恒温恒湿箱中培养，从第7日龄开始，停止喂食，将幼虫转移至铺垫有消毒滤纸的新48孔培养板中，化蛹的幼虫于34℃，70％湿度环境下的恒温恒湿箱中培养．注：90％的湿度用饱和硫酸钾溶液控制：lllg硫酸钾加入到10009蒸馏水中制成饱和硫酸钾溶液；70％gTj!g度用饱和氯化钠溶液控制：3609氯化钠加入到10009蒸馏水中制成饱和氯化钠溶液④每天早晨和晚上检查幼虫死亡情况和患白垩病情况，做好详细记录．⑤用DPS软件进行相关分析和回归分析，检测不同蜂群的幼虫患白垩病个数差14 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选异的显著性．2．3研究结果与分析2．3．1意蜂的抗白垩病能力测定2012年3月25日至4月11日期间，我们根据蜂群在自然情况下患白垩病数目将1、3、5号蜂群分为健康组，将2、4、6号蜂群分为患病组．用t检验进行统计分析，发现不同实验组的蜂群在自然情况下的患病个体数目差异显著(p=O．0238)．2012年4月11日统计数据之后，对蜂群进行病原茵接种，4月12日至4月29日期间，我们根据蜂群患白垩病数目将蜂群分为3组，1，3号蜂群分为强抗病群，4、5号蜂群分为中抗病群，2、6号蜂群分为弱抗病力群，不同组的蜂群在接种之后的患病个体数目差异显著(p=O．0211)，证实了不同蜂群在抗白垩病能力上确实存在差异．图2．12012年6群意蜂蜂群在接种前后18天的患病个数统计Fig2．1Statisticsofinfectedlarvaefrom6coloniesbeforeandafterinfection(18days)，2012 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选表2．2健康蜂群和患病蜂群的患白垩病情况分析Table2．2Statisticsofinfectedlarvaefromhealthycolonyandinfectedcolony处理样本数均值标准差标准误95％置信区间处理l34．33335．85953．383-10．222418．8891处理23300．6667144．382683．3593-57．9996659．3329方差分析表变异来源平方和自由度均方F值P值处理间131720．2l131720．212．6160．0238处理内41761．33410440．33总变异173481．55Tukey法多重比较(下三角为均值差，上三角为显著k-Y-)Tukey05=Tukey01=3231．624384．0469No．均值2l2300．66670．023814．3333296．3333字母标记表示结果5％显著水l％极显处理均值平著水平处理2300．6667&A处理14．3333bA16 浙江大学硕士学位论文基于sNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选表2．3强抗病蜂群、中抗病蜂群和弱抗病蜂群的抗白垩病情况分析Table2．3Statisticsofinf＆湖lanrae丘咖colomeswimdiffercntresiSt孤tabili哆处理1处理2处理3变异来源处理间处理内27980．610257．645．253721190336．5828238．1834．076722352．82842209．5876方差分析表平方和自由度均方F值p值1447121．3332723560．66718．120．0211119794339931．33331566915．33总变异35Tul(ey法多重比较(下三角为均值差，上三角为显著水平)Tul【ey05=834．801做ey01=14938．5014No．均值23l211900．035l0．023232359550．73881791111156字母标记表示结果1％极显著处理均值5％显著水平水平处理21190aA处理3235bA处理179bA17 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选另外，我们对于同一蜂群在接种前后的蜜蜂患病个数进行了分析，由于2号和6号蜂群在接种之前患病就比较严重，人工接种后其患病个数增加了一倍以上，考虑到严重患病群在接种之前群内即存在大量白垩病病原，所以，我们对患病较轻的1、3、4、5号四群的接种之前6天的患病个数与接种之后6天的患病个数进行生统配对T检验，发现接种前后其白垩病发病个数差异显著(p=0．0227)，说明接种效果明显．图2．22012年四群意蜂蜂群在接种前后6天的患病个数统计Fig2．2Statisticsofinfe圮tedlarvaefrom4coloniesbeforeandafterinfection(6days)，2012表2．4蜂群接种白垩病孢子的发病情况分析Table2．4Statisticsofinfectedlarvaeafterinoculatedwithspores(Ascosphaeraapis) 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选2013年3月12日至4月11日期间，对福建省福州市福清坊里村蜂场的八群蜂群中自垩病情况进行了统计，结果如下：图2．32013年8群意蜂蜂群在接种前后18天的患病个数统计Fig2．3Statisticsofinfectedlarvaefrom8coloniesbeforeandafterinfection(18days)，2013考虑到后续幼虫实验的需要，以及2012年实验的经验，我们进行了DPS软件的相关分析和回归分析，将14号、13号、16号蜂群确定为强抗病群、中抗病群和弱抗病群，并进行了统计分析，P值=o．0005，差异极显著． 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩瘸性状相关的分子标记筛选表2．514号、13号、16号蜂群在接种前后18天的抗病能力分析Table2．5Statisticsofresistantabilityincolonies14，13，16beforeandafterinfection(18days)变异来源平方和自由度均方F值P值处理间处理内总变异23544l193．1667236．0580．00051869Tukey法多重比较(下三角为均值差及统计量，上三角为P值)Tukey05=180．6054Tukey01=324．1939No．均值3l2处理3852．50．00070．0006处理151801．500(26．22)0．8568处理227．5825，000(26．99)23．500(0．77)字母标记表示结果1％极显著水处理均值5％显著水平平处理3852。5aA处理151bB处理227．5bB2．3．2意蜂清理能力的测定由于蜂群的清理能力受多因素影响，我们选择了群势和蜂脾密集程度一致的5个蜂群进行清理率与患病个数之间的相关分析，测定了5群患白垩病蜜蜂的清理率和患病个数之间的相关性，发现意蜂蜂群清理率与患病个数之间存在显著的相关性(P=0．0187)，结果显示，蜜蜂抗白垩病能力与蜂群的清理率呈正相关，清理行为越强的蜜蜂抗白垩病能力越强．表2．6不同蜂群的意蜂清理率与患病个数统计Table2．6Statisticsofcleaningcapacityandinfectedlarvaenumberindifferentcolonies373O3眠％蛆39278 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选表2．7意蜂蜂群清理率与患病个数的相关性分析Table2．7Correlationanalysisbetweencleaningcapacityandinfectedlarvaenumberindifferentcolonies2．3．3蜜蜂球囊菌的鉴定根据方法2．2．4．2所描述的步骤，提取培养的蜜蜂球囊茵的总DNA，对纯化后的DNA进行定量和质量检测，主要为检测DNA液的紫外分光值(c=1929ng／u1．A260／280=2．04)．结果说明DNA的提取效果较好，其中A260／280的值在1．9．2．2范围内，DNA浓度比较高，非常有利于后续实验的操作．电泳实验结果发现所培养的蜜蜂球囊菌DNA具有SCA300，SCAl635，EF．0【三个特征性位点的亮带，测序结果与DNA原始序列通过mi驴x软件进行了比对。SCA300，SCAl635，EF．旺的比对结果分别为86．3％，88．1％，83．9％，可以证明实验所用的菌株即为蜜蜂球囊菌．表2．8蜜蜂球囊菌鉴定的引物碱基序列Table2．8TheprimersequencesusedforconfirmationofAscoaphaeraapis名称引物碱基序列SCA300一FORSCA300．ReVSCAl635一F1ClRSCAl635．REVEFla-FOREFl廿REVAGGAACCGCGTITGTrGT：ATCTTCAAAGCCAGCTCCAGTCCGACAAGGCTGTCrrCJ钮℃AAGCA(1℃TCGGT(—℃G1_ITCTCACAATGGGGl-ATGTTGCGGGAAGAGACCrCCTTGACGA 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选纽。1000。700,一500一400—300一200．J100—markerSCA300SCAl635EF一“图2．4蜜蜂球囊菌鉴定的电泳结果图Fig2．4TheelectrophoresispictureofAscosphaera印括confirmation注：SCA300，SCAl635和EF．a是蜜蜂球囊菌的三个特征性片段表2．9蜜蜂球囊菌鉴定的PCR产物测序结果Table2．9SequencingresultforPCRproductsinAscosphaeraapbzconfirmation名称测序碱基序列SCA300．FORGGAAACGAGG(1’AGCATGcGTGTGAGAGTrGAACGGATTCAA：rrITCAACCGAIXrCTCGTTGGTGAGTA订GGT戌I=A：兀ACCGCTGCGACCAGGGGGGCGTCGACCAG‘珂AACG—(ITGAGGGTGCrAGTGCTA：I．ATCACCAACCGGAAAAGA：rI：]r】XKⅪETCTAAAGAAGACTI’GATCGCAAGAAAGACCAACCTGGAGC^A：丌GAAGCAGCAGCACGGAATCGAGTAAACGTGCCAATGACACAA：ITCCATGTGCCGTCIⅪCAGCCCCGATGACATCGCCTGAGCArrIWGCCACGl：ACGATAGCGACGGACACACGCAACAGGCCCAGAGAAATCGmGrnrCAACCAGCA：丌：舡ATATCCr触阿TC联rCAGC√盯GACGAGCGACG√虹GCG(玎℃AAAGTCCAAI：f虹℃GAG戌rITGGGCGGAACTCTAL姐ATGGAATTCGAGGAAACCAGCGGCGTGAGAGll"AAGl’GGGTGAAGCAGArll一ACAGGTAGAAGGoGCGAGAGAGGCATCCTC．IAGCCAGCCA^TACGATACATGGA：I’^：rCAGTCTTGOCGGTCAAACTTCTCACCATCGTCCAGGGAGGAGTGGTAGGCAAAGGCrrTGCTGCATGGArrCTCAGTCGTCCTrrGTCA：rrrrCGCAGACACGCACGCTGACACAGGCCCA1=ACTCACAGATCGCCTAGCACCCATCr兀1CAAT戌兀AACCGGA订GAACrrGACrGGAGTGGCT兀AGAAGSCA300．RBVGAA11TGGTAAAGArGTGCG．I’AGCrAGGCGATCTGTGAGTⅪGGGCCTGTGTCAGCGTGCGTGTCI’GCGAAA^TGACAAAGGACGACrGAGAJ虹℃CArI笼AGC从AGCCTrrGCCTACCACTCCTCCCTGGACGATGGTGAGAAGTr丌GACCGGCAAGACTGAIATCCATGTA：rCGTA=nr(×X玎GGCTAGAGGA眦(叮CTCTCGoGCCTTCTACCTGl=AAATCTGCrrCACCCACll．AACTCTCACGCCGCTGGTllTCCTCGA戌11℃C文L蜩jATAGAGTrrCCGCCCAArl了rCGAI：fU’rGGACmGAGCGCATCGTCGCTCGTCATGCTGATAGAA^：I!AGGA=D嗍AATGCTGGTTGAAACAAACG戌rrrI卫℃TGGGCCTGT 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选TGC(汀(汀GTCCGTCGcTATCGl’ACGT(玲CGCAATGCTCAGGCGArGTCArCGGGGCTGAIAGACGGCACA：瑚A．^：ITGTGTCA订GGCACGTI’IACTCGAl-rCCGTGCT(KTGCrrCAA]盯GCTCCAGGr啪TCrnKTH瑚ATCAAGrCrr(1TIAGA6℃GCAAGA]rCrr】-I℃CGGTIGGTGACAlAGCACTAGCACCCTCAA：rCGrI’AGCTGGTCGACGCCCCCCTGGTCGCAGCGGTAA：I=^ITACCAATACTCACC从CGAGAlⅪCGGTTTTGAAAmGA^：rCcGTTCAA(】1GTCACACGCCTG(m：AGCGTCGTr】?GTer(】-rCA=!队TACAACAACGCCGAGTCTCTAASCAl635一FORCGr(jC叽AA1丁GACGrrGOCATGCA彻rAAGCGGAACAGAGCTGCACCAACA：rrL粥ACTrrI：ACTAGGGGTGAAAAGGAGAArGA&啪AGTGGTGCrA^LTCCACAI℃AAI耵GACCGAGA√叮GTCAAGCTA玎G(】TGAGATGACATATCCTGCACA：rGCTCACACACGA玎GAGGGTTCCAIIcGCTTCACGGCAGAGrrGGKr‘]_IAr(习n℃T11TCCAGAAG(、1IACCAOCrnrGGAGAAGTTA(了GCAGAAA触rCGACACA玎GAAAGGCGATCCCGCL姐1CAGGACGCCGTGAACIlATCTCAAGGAGOGGGAGAAGAGTGCCAGCl℃GAATGCA：rrGCCl"AACCTOCAACTrI卫呵℃GCGACTrrGTrGAGAAACACCTAGAGGCTGTTOCAGTCAGCTOCAGArrI"GCAATCGC’rG文D虹℃A：rCCGTTGCATGTTCGCCGA：r‘X：CAAAGTGAGCGGGrrCTll、GCTGAAGAAGCGGACCAIAAAACCGTCArCACACTGCTrr℃ACAAGCAGATA烈I-ATCCCAGAHGCCC订ACGCH卫IACGACTCGTTCTAACTCAACrGGo(汀GCAACCTGrr(了CCTCACCCGTCTACCCTGA：I：AAGA1仃TCATCGTCGCcT(订TTrGAAAGAGACJ叮GCATCAAGCl"AGCGACCrIa广I℃GJ蜩临TI’GGACTCGCAr(抛CAll：ACGAAoCoCAGCTGTn℃ACTGA：rATACAACllⅪGCATCC眦AACCm文I、GCTCGGCTrGACGAGCGGoCAGAAAAGCmCAGAGArA(狐ACAGGTGGAACTCGCGGCGTcGCTCAI：f婚AGTC^幻-rGGAAACGAGACGCGAAGTCTA：I．ATSCAl635．REVGC卫U’兀AAC(斑～GCCCGCGAACTTCAo叩GT]K1舢K?rC叮GAGAGCTTTr(玎GGTCGCTCGTCAAGCCGAoC筒nArI孙^1-rGTAGGArGCCAAGTTGTAlrATCAGTGA舢～CAGCTGCG‘孙_rCGTAATGlAGCA赋GA(、1℃CAACATcGJ认GAGGTCGCn峪CTTGATGCATGTCrCI]广I℃AAACAGGCGAC(¨汀GAAA=rl舅n眦AGGGTAGACGGGTGAGGAGAACAGGTTGCACGCCAG订GAGllAGAACGAGTCGTAGAGC(n’AAGGGCAA：I℃TGGGATATTA：r℃TGCrrGTGAAAGCAGTGTGATGACGGTrrIAI’GGTOCGCrI℃TI℃AGCA八AGAACCCGCTCACTI]roGCATCGGCGAACAr‘ⅪAACGGArGAL蛆℃AGCGA玎GCAAATCI。GGAGCTGACI℃GAACAGCCTCIAGGTGTTT(了CAACAAAGTCGCGAAGAAGrrGGAGGrrAG(祀AA眦A：11℃GAGCTGGCACTCrrl了rCCCGCTCCllGAGATAGl．rCACGGCGTC(可GAATAGCGGGATCGCCn-rCAA：r<打GrcG^=】nTr{习bCAGl：^ACrrcTcCAAAGGTGGTAOCrTCTGGAAAAGAACATAAGAmCAACrc疆GCCGTGAAGCGA：啪AACCCTCAATCGTGTGTGAGCA：rGTGCAGG^：n蛆1GTC√U’CTCAAGCAATAGCTTGAC蓖r】’CTCGGTCAA玎GATGTGGAnrA(配～oCACrCCA兀CA：丌(1℃Cr]阿TCACOCCrAGl=AAAGTCAl广AAATGTrGGTGTAGCTcTGATCCC触rA订GCAr(ⅪCA^TGCD虹A^GCCCGAGAAACGTCAACrITGA：IBAAGACGCGCTGTGCTGAGAGTAA 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选EFIa-FORCGCA(汀AGGTCTACATCCTGAGCGAGA：啪ATGTCGl"AAAGGACGl℃TCTI℃CAGAAAACTGCAAArCTATGCAGl[AAGGAGGGCAAGTCTCACGrrAACGTCGTCGTrATCGGCCACGTCGArrCCGGCAAGTCTACCACCACTGATCACTTG—LTCTACAAGrGCGG．啪．IⅪCGACTCrCGTACCATCGAGAAGTI℃GAGAAGGAGGCTGAGGA(X=TCGGCAAGAAGTC(1TCAAGTACGCTrGGGJrrC兀GACAAC℃TCAAGG(了GAGCGTGAoCGTGGl：fU℃ACCATCGATAlTGCTCr《]℃GAAG，rrCGAGACTCCCAAG影虹℃AGGTTAC=CGTCArTGKyIⅪ(门陀GAAAA：11’rCTGTTCCGAAAACAAAGlTCAAATCCGGCAGAAAAATCArrI’GCTf～ACGTGTCATCA：rmAGAI’GCCCCTGGTCACCGTGAllTC』虹℃AAGAACATG^：rCACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCCA：I]rCTCAI℃越兀℃CTGCCGGTACTGGT(认GTrCGAGGCTGGT蛆℃TCCAAGGATG(订℃AGACCCGTGAGCACGCTCrI习-rGTCGTTCACCCTCoGT(、1℃C(订℃AGCrCKrCGTCGCC盯CAACAAGArGGAIACCACCAAGTGGrll"GAGACOCGrn℃AACGAAATCGTCAAGGAGTrCTCTrrCC^：L姐CAGGEFIa-REVACAAACoGA舶胁GATCCrl习ⅪC田GGTAToCATCn"AGrrGATGTGTGAGATGAGCTGACGGACACCGAGGGTGAACGACAAGAGAGCGTG(1℃ACGoGTCTGACCATCCrDGGAG^=IACCAGCCTCGAACTCACCAGTACCGGCAGCA—汀GATGAGA肖LTGGCGCAGTCAGCCrI瑚AGGl：ACCAGTGATC式兀弼n℃TTGATGAAA：rCACGGTGACCAGGGGCATCTAAAATGArGACACGn．AGCAAATG蓖nTI]厂I’rCTGCCGGA：]rI’rGAACrrrGrn广rCGGAACAGAAA!rrITCGACJ蛆ACCA^TGACGGTAACCTCA：IIACrrGGGAGTCTCGAA(1TCCAGAGAGCAAImGAI’GGTGJ钮’ACCACG(1℃ACGCTCAGCCTTGAGCnr(订℃AAGAAoCCAAGCGTAC兀GAAoGACnm(托．CGAGCTOCTCAGCCTCCI]^CTCGAACrHX℃GATGGTACGAGAGTOC讽：rACCACCGCACrrGTAG^=rCAAGTGACCAGT删AGACrrGCCGGAA：rCGACGTGGCCG—dAACGACGACGTTAACGTGAGACr眦CCTC(=TTAcTGCATAGATT(、TCAGrn-rCTGH盯T(、AACGGA：I]nTr(卫’GTr(Ⅺ℃GAAATCGJ虹℃GGAGTC旧GAAGAAGAOGGAGGAGATCGCAACA=rACCCACA订GTGGAAA2．3．4意蜂幼虫抗白垩病能力的测定表2．10蜜蜂球囊菌孢子萌发率的测定(三次)Table2．10DetectionofgerminationratioofAscosphaera印如spores孢子萌发率平均值均大于80％，说明孢子活力强，通过混合食物接种蜜蜂幼 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选虫，可以蜜蜂幼虫患白垩病．2012年9月．10月，对1号和4号蜂群的幼虫进行实验室培养，接种白垩病孢子，实验数据和统计分析结果如下：表2．112012年不同蜂群蜜蜂幼虫感染白垩病的死亡率Table2．11Mortalityrateoflarvaeinfectedwithchalkbroodindifferentcolonies(2012)日期：2012．9．141号为抗病力强群，4号为抗病力弱群．每群实验组对照组各48只，孢子量10ul卜实验4一实验日期：卜实验4一实验日期：卜实验4一实验自然死亡白垩病死对照)自然死亡白垩病死对照)2012．9．28(自然死亡(白垩病死(对照)(自然死亡(白垩病死(对照)2012．10．11第一第二第三第四第五天)00343亡)0020O2lO)0510亡)003012l21号为抗病力强群，4号为抗病力弱群．第一第二第三第四第五天)02l21亡)00101l2O)O2760亡)0010Ol2Ol号为抗病力强群，4号为抗病力弱群．第一第二第三第四第五天自然死亡)白垩病死亡对照)自然死亡)自垩病死亡对照)第六第七第八第九合天计死亡率2l932502861837．50％1Ol1612．50％Ol071llO223777．08％Ol31020．83％每群实验组对照组各48只．孢子量10ul第六第七第八第九合天计死亡率25722203561531．25％O1O612．50％lO0l83510193879．17％3Ol918．75％每群实验组对照组各48只．孢子量10ul第六第七第八第九合天计死亡率52842425l31122．92％01l048．33％38O011471l133572．92％30l1918．75％4O1O0O21O1O10Ol1O1O0O0O 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选表2．122012年强抗病蜂群幼虫和弱抗病蜂群幼虫抗白垩病差异分析Table2．12Statisticsofresistantabilityoflarvaefromdifferentcolonies(2012)处理样本数均值标准差标准误95％置信区间处理13O．3056O．0731处理230．76390．0318方差分析表变异来源处理间处理内总变异平方和自由度均方O．31510．01270．327810．315140．003250．04220．12390．4873O．01840．68490．8429F值P值99．0470．0006Tukey法多重比较(下三角为均值差及统计量，上三角为P值)Tukey05=0．1279No．处理2处理1均值20．76390．30560．458(14．07)字母标记表示结果处理处理2处理15％显著均值水平0．7639a0。3056bl0．0006l％极显著水平AB2012年7月，对13号、14号和16号蜂群的幼虫进行实验室培养，接种白垩病孢子，实验数据和统计分析结果如下： 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选表2．132013年不同蜂群蜜蜂幼虫感染白垩病的死亡率Table2．13Mortalityrateoflarvaeinfectedwithchalkbroodindifferentcolonies(2013) 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选表2．142013年强抗病蜂群幼虫和弱抗病蜂群幼虫抗白垩病差异分析Table2．14Statisticsofresistantabilityoflarvaefromdifferentcolonies(2013)2．4讨论2．4．1蜂群实验结果2012年和2013年的蜂群实验对健康组蜂群和患病组蜂群在接种前后进行了统计分析，发现不同组蜂群在抗白垩病能力上确实差异显著(2012年P=0．0227，2013年P=0．0005)，证实了不同蜂群确实存在不同的抗病能力．同一蜂群在接种前后其患病个数也存在显著差异(P=0．0238和P=0．0211)，表明病原菌一花粉接种法是一种有效的测定蜜蜂抗白垩病能力的方法．统计结果表明，意蜂抗白垩病能力与蜂群的清理率呈正相关，再次证明了清理能力与蜜蜂抗病能力密切相关，为我们抗病育种提供了新的思路．2冀 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选2．4．2蜜蜂球囊茵的鉴定结果提取的DNA浓度比较高，其中A260／280的值在1．9．2．2范围内，结果说明DNA的提取效果较好。PCR和电泳实验结果中出现了3条单一且亮度高的目的条带，即蜜蜂球囊菌的3条特异性条带，说明成功培养分离了蜜蜂球囊菌．PCR产物的测序结果-9DNA原始序列通过Align>：软件进行了比对，3条特异性序列的同源性均在80％以上，进一步证明实验所用的菌株即为蜜蜂球囊菌．2．4．3蜜蜂幼虫抗白垩病能力测定的结果结合文献和自己的预实验，我们确定了不同日龄蜜蜂幼虫培养的食物量，确保了刚好足够幼虫存活的食物量，这样可以保证第三日龄接种的蜜蜂球囊菌孢子最大限度的被蜜蜂幼虫摄取，同时，第三日龄蜜蜂幼虫的孢子接种时间是在蜜蜂幼虫摄取食物6小时以后接种的，保证了幼虫食物消化的时间，增加了实验结果的科学性．对照组没有接种蜜蜂球囊菌孢子，且幼虫存活率均在80％以上(只有2012年的4号幼虫对照组存活率为79．16％)，2013年的幼虫存活率已达到90％及以上．说明实验操作过程中由于人工操作引起的幼虫死亡少，实验人员培养幼虫技能较强。幼虫感染白垩病实验中所用的蜜蜂球囊茵孢子活力强(孢子萌发率均在80％以上)，能够有效的使蜜蜂幼虫感染白垩病．实验过程中所有的器材设备均经过严格的灭菌消毒处理，在幼虫期和化蛹期严格控制幼虫培养皿的湿度，保证幼虫较高的存活率。幼虫人工培养实验过程中，连续三次测定每群幼虫的患白垩病个数，然后根据每群幼虫患白垩病的数量进行统计和t检验，证明2012年的1号群和4号群幼虫抗白垩病能力差异极显著(P值=o。0006)，且趋势与蜂群实验结果一致；2013年的3号群和5号群幼虫抗白垩病能力差异极显著(P值=o．0005)，且趋势与蜂群实验结果一致．实验过程中每天早晨和晚上固定时间检查蜜蜂幼虫的患白垩情况，并进行详细记录。确保了患白垩病幼虫统计结果的准确性和可靠性．蜂群抗病能力主要是由于成年蜜蜂具有清理能力，而本实验通过连续2年的研究揭示了蜂群中蜜蜂幼虫也具有一定的抗白垩病能力，且成年蜂抗病能力和幼虫抗病能力具有正相关性，即抗白垩病能力较强的蜂群，其幼虫整体上也具有较强的抗白垩病能力． 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选第3章蜜蜂抗白垩病分子遗传标记的筛选本研究使用蜜蜂球囊菌孢子在实验室环境下感染蜜蜂幼虫个体，收集强抗病幼虫个体(6只)和易感病幼虫个体(6只)，作为SNP重测序的样本．提取DNA并建立DNA文库之后，我们获取了高质量的测序数据，将干净序列与蜜蜂参考基因组进行比对和SNP注释．最终，我们获取了位于mRNA的与蜜蜂抗白垩病相关的SNP位点696个，与蜜蜂易感白垩病相关的SNP位点102个．通过进一步的基因过滤筛选，我们一共筛选出71个与蜜蜂幼虫抗白垩病性状密切相关的SNP位点，并对其并进行了基因功能注释，从基因分子水平预测蜜蜂抗白垩病性状相关的可能分子机制．3．1研究材料3．I．1主要试剂液氮，DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程上海有限公司)，PCR扩增试剂盒(生工生物工程上海有限公司)，琼脂糖，go!denview(上海赛百胜基因技术有限公司)3．1．2主要仪器CFl6RXII型微量高速离心机：日本HITACHI公司；DK．8D型电热恒温水槽：上海一恒科技有限公司；NanoDropND．i000，2000UV-VISSpectrophotometer：Gene有限公司；JS．6800型全自动凝胶成像分析仪：上海培清科技有限公司；DYY-6D型电泳仪：北京市六一仪器厂；DW-HL88型超低温冷藏箱：中科美菱低温科技有限责任公司；YXQ—LS．50SII型数昱立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司；华大机器：Illumina-HiSeq2000测序仪；超净工作台：上海博迅实业有限公司；96WellThermalCyclerAppliedBiosystemsCompany3．1．3研究样本抗白垩病和易感白垩病蜜蜂幼虫个体各6只3．2研究方法3．2．1抗白垩病和易感白垩病蜜蜂幼虫个体的收集结合2013年3月的蜂群实验结果和2013年7月的幼虫实验结果，确定3 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩瘸性状相关的分子标记筛选号群蜜蜂抗白垩病能力强，5号群蜜蜂抗白垩病能力弱，收集3号群和5号群中第九日龄仍然没有感染白垩病的蜜蜂幼虫作为抗病幼虫个体，收集3号群和5号群中在接种蜜蜂球囊菌孢子的早期即感染白垩病的蜜蜂幼虫作为易感病幼虫个体。易感病蜜蜂幼虫个体采集过程中，当观察到蜜蜂幼虫身体末端出现白色茵丝，则立即将蜜蜂幼虫固定在消毒过的蜡盘上，小心地用消毒过的解剖刀和解剖针去除幼虫的内脏(主要是中肠)，操作尽可能迅速，以保证样本的新鲜度．抗病样品和易感病样品用灭菌过的离心管收集，做好标记，于．80"12低温冰箱保存注：抗白垩病个体和易感白垩病个体的SNP重测序工作委托华大基因公司完成．3．2．2蜜蜂幼虫个体DNA的提取①将每只蜜蜂幼虫个体单独用液氮研磨成粉末，分别加入到1．5ml离心管中。加入400ul裂解液和4ulp一巯基乙醇，震荡混匀。65V水浴l小时至细胞完全裂解．②加入200ulbufferPF"充分颠倒混匀，．20"C冰箱放置5分钟．⑦室温10，000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的1．5ml离心管中。④加入等体积的异丙醇，颠倒5．8次使之充分混匀，室温放置2．3分钟。室温10，000rpm离心5分钟，弃上清。⑤加入lml75％乙醇，颠倒漂洗1．3分钟，10，000rpm离心2分钟，弃上清．④重复步骤⑤一次．⑦开盖室温倒置5．10分钟至残留的乙醇完全挥发。⑧得到的DNA用50-100ulTEBuffer溶解．⑨最后得到总DNA，用NanoDropND．1000对DNA进行定量和质量检测。A260／A280：1．9．2．1，符合标准．本实验中采用符合标准的总DNA。3。2．3DNA文库的构建和高通量测序将提取的每个蜜蜂幼虫个体的DNA随机打断成约100．200个碱基的小片段，电泳回收所需长度的DNA片段，在片段的两个末端加上接头，将DNA片段变成单链后通过接头与芯片表面的引物碱基互补而使一端被固定在芯片上．另一端随机和附近的另一个引物互补，也被固定住，形成桥状结构．通过30轮扩增反应，每个单分子被扩增约1000倍，成为单克隆的DNA簇，随后将DNA簇线性化．在下一步合成反应中，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选dNTP。在DNA合成时，每一个核苷酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐，激发生物发光蛋白发出荧光。在激光反应扫描板表面，在读取每条模板序列每一轮反应所聚合上去的核苷酸种类后，将这些荧光集团化学切割，恢复3·端粘性，随后添加第2个核苷酸。如此重复，直到每条模板序列都完全被聚合为双链．统计每轮收集到的荧光信号结果，就测得DNA片段序列。具体测序流程见图3．1。Amplification[图3．1SNP重测序的原理和步骤Fig3．1Principleandpmc跚eofSNPre-sequencing3．2．4干净序列的获取测序得到的原始图像数据经basecalling转化为序列数据，被我们称为rawdata或rawreads，原始序列带有一段3’接头序列，并且含有少量低序列以及各种杂质成分。通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得到干净序列。数据处理的步骤①去除低质量DNA(如果一条序列的低质量碱基数占整条序列的一半及以上，则该DNA序列将被去除)。②去除3’接头序列。③去除5’接头污染．一般地，低质量Tags在原始数据总量的2％以内，各种杂质和拷贝数为l的 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选Tags总体占据原始数据总量的15％以内为正常范围，说明样品制备和实验完成良好。3．2．5干净序列在蜜蜂参考基因组上的比对和分布统计运用Soap2(ShortOligonucleotideAlignmentProgram)软件【47l(http：／／soap．genomics．org．cn／soapalingcr．html)将测序得到的序列与参考基因组序列进行比对．根据统计结果，计算出相对于参考基因组的测序深度和覆盖度。选取蜜蜂参考基因组中最长的两条染色体(或者scaffold)，做出序列在基因组上的分布图，从而反映出序列在基因组各个位置大致的分布情况和基因组的覆盖度情况。3．2．612个蜜蜂个体的SNP的检测和注释将比对蜜蜂基因组后所获得的样本的SNP信息，与参考序列之间存在多态性的位点进行过滤，以得到高可信度的SNP的数据集．对每个蜜蜂幼虫个体的同型突变、异型突变、同义突变、非同义突变、外显子、基因组、mRNA、ncRNA．rRNA、transcript、tRNA等不同的SNP位点进行染色体名称、位点、SNP类型、突变前后的密码子和氨基酸、起始位置、终止位置以及基因功能的注释。如果SNP不改变所编码的氨基酸序列，称为同义SNP(synonymousmutations)，如果SNP导致了所编码的氨基酸序列的改变，称为非同义SNP(non-synonymousmutations)．我们对于每个蜜蜂幼虫个体的同义和非同义SNPs进行了统计。3．2．7与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的SNP分子标记的筛选对于6个抗白垩病的蜜蜂幼虫个体，我们挑选出这6个个体共有的SNP位点，并统计出其染色体编号，坐标点、参考序列对应位置碱基和测序个体的基因型。由于6个抗病个体共有的SNP位点比较多，我们通过基因过滤筛选，选取了位于mRNA区域的SNP位点，并对其补充了symbol号(用于在NCBI中查找基因功能注释的编号)，进行了基因功能注释。对于6个易感病的蜜蜂幼虫个体，我们也采用同样的方法筛选出与蜜蜂感染白垩病相关的SNP位点．同时，我们还统计出12个蜜蜂幼虫个体(6个抗病蜜蜂幼虫个体，6个易感病蜜蜂幼虫个体)共有的SNP数量，并进行了坐标点、参考序列对应位置碱基和测序个体的基因型注释。 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选3．3研究结果和分析3．3．1蜜蜂样本的筛选及处理为了获得更科学、更准确的抗白垩病蜜蜂幼虫个体和易感白垩病蜜蜂幼虫个体作为实验素材，按照方法2．2．4所述，对实验蜂群的蜜蜂幼虫进行了蜜蜂球囊菌的孢子接种，每天早晨和晚上固定时间检查幼虫的患病情况，及时发现患病幼虫，并对患病幼虫在无菌环境下进行解剖，去除肠道，以减少微生物(尤其是蜜蜂球囊菌基因组对实验结果的干扰)。因此，本研究所采用的样本是非常可靠的．3．3．2蜜蜂个体DNA的提取及质量检验根据方法3．3．2所描述的步骤，分别提取12只蜜蜂幼虫(6只抗病蜜蜂幼虫个体和6只易感病蜜蜂幼虫个体)的总DNA，经检验幼虫DNA均为轻微降解，非常有利于后续实验的操作．此外，图3．I的电泳图显示12个电泳条带亮度高且单一整齐，说明12个样本组织DNA提取液的纯度都很高，即本研究中DNA的质量很高，可以保证后续实验结果的准确性。图3．212个蜜蜂幼虫样本DNA的电泳图Fig3．2TheelectrophoresispictureofDNAfrom12larvaes注：3-res代表3号群的抗病个体，5．res代表5号群的抗病个体，3-SUS代表3号群的感病个体，5．$US代表5号群的感病个体．3．3．3原始数据和干净数据的产量统计测序得到的原始图像数据经basecalling转化为序列数据，被我们称为rawdata或rawreads，原始序列带有一段3’接头序列，并且含有少量低质量序列以及各种杂质成分．经过一系列数据处理，得到cleandata或cleanreads。得到的原始数据经过一系列处理，如去除杂质，去除低质量标签等，最后得到的cleandata的质量值有所提高(见表3．I，表3．2)，如3-resl号蜜蜂幼虫个体的rawdata中34 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选的质量值大于20的比例只有92．13％，其对应的cleandata中的质量值大于20的比例达到了94．09％．在12个蜜蜂幼虫个体的原始数据中，质量值大于20的比例在92．13％及以上，在处理后的干净数据中，质量值大于20的比例在94．09％及以上，整体数据质量值比较高．一共构建了12个DNA文库(每个蜜蜂幼虫个体构建一个DNA文库)，并得到了15．1G的原始序列，数据经过处理后，得到了14．4G的干净序列。 ∞no”．．【甙寸．9"【∞∞．9岔．【∞式n口气_全．9_【昏∞．9岔-【∞“n价乜"【寸NK"I蟛6．寸小喀N“n卜寸．一西寸．．【一价．_【吼寸．_【N￡．∞_【一■心小卜卜．寸n”n．9．1no‘吼NN．寸nN∞．9_”■℃文呐N“n卜n．9_【∞卜∞吼卜n．峪n一冀。寸气寸口o．卜A△n“n卜n．ocI．寸卜t崞昏on．9nno．一n∞．I一心■心乱幛一．崞nn卜ooc．∞乱■吗吼卜卜．蚺n”c．H∞甙奇一甙o．寸昏^o一∞u∞一∞一掣邑∞口母壶一摹一oN八蚤焉j口寸卜．寸n^摹-Q_-拦oocSlls．nN∞fls_n_|晴Tl∞．ncs2晶N∞2A_r∞u．I．nn∞j的。nN的j∞．n一曲t1∞．nn∞n’J．nN∞¨IJ．n_r∞pI-1Q—葛时IIQ—A—II爵力一时苗勺c薅Q—ov∞u一>．I一一N一-o∞一呐h一爵c时_jcIurI口g∞勺Q—I工N．nQ—D_叠一高苗屯lI堡。一葵太_菩址船搽窖甚七《黎斯懈七N．【N．￡碟。肇七龌谁窖枯妒”啭芒sn千”．世七惧豫譬旗巾n垛芒sn∞．c．适七螺嬉留旗咖”烬芒∞竿呐．避七惧零留旗伞n磲车墅-￡一媸卜n．In寸卜一岔。试吼”o．￡nN价．"【∞∞．∞一N_【．价岔Ho．9nN心．I∞西一_【_【N“小心寸价n寸价．_【昏。心一N∞．寸岔∞A寻nn唧一nN．卜一崞c．n小_【寸．寸n∞”．一∞”．卜一N西寻@峪寸nn岣价．一nt，．ooc．卜_No“A卜卜．∞no寸．o一∞．寸_【寸．寸一母。寸吼甙心“n母吼．￡昏_【∞．9n心寸NH∞∞．n岔卜寸．均no∞．o卜∞．8崞昏“小卜o．9n卜岭“一￡I一岔n吼．寸n^o)sQ∞订盛^_e∞口时0H一零voN八j—lB，d一摹|)譬罡Uon∞11嚼．n 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选3．3．4干净序列在蜜蜂参考基因组上的比对和分布统计测序深度是指测序得到的总碱基数与参考基因组大小的比值，有效测序深度是指与参考基因组比对上的总碱基数与参考基因组大小的比值．覆盖度是指测序获得的序列占整个基因组的比例．由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，测序深度和覆盖度是衡量样品质量的重要指标之一．对获得的干净序列进行基因组序列定位分析显示，样品的最低有效测序深度达到4．46x(样品3-sus3)，最高有效测序深度达到7．10X(样品3-res3)．我们的样品分为抗病组和易感病组，抗病组样品总测序深度达到40．85×，有效测序总深度达到34．39×；易感病组样品总测序深度达到39．14X，有效测序总深度达到30．02×．样品基因组覆盖度整体较高，最低为83．26％(样品3-susl)，最高为88．95％(样品5-sus3)。 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选表3．312个蜜蜂幼虫个体的数据比对蜜蜂基因组的统计(cleandata)Table3．3Statisticsofcleandatafrom12larvaesmappinghoneybeegenome3．3．512个蜜蜂个体的SNP的检测和注释将比对蜜蜂基因组后所获得的样本的SNP信息，与参考序列之间存在多态性的位点进行过滤，以得到高可信度的SNP的数据集．对每个蜜蜂幼虫个体的同型突变、异型突变、同义突变、非同义突变、外显子、基因组、mRNA、neRNA、rRNA、transcript、tKNA等不同的SNP位点进行染色体名称、位点、SNP类型、突变前后的密码子和氨基酸、起始位置、终止位置以及基因功能的注释；对于每个蜜蜂幼虫个体的同义和非同义SNPs进行了统计。 ot"q一_一_一—⋯HdH⋯⋯—小n口卜卜∞崞心口崎卜口∞n呐NHo—nNNo一△nn一一乱oo卜onn￡-∞o∞蚤N西岔口一．【n乱n"Eon西寸口卜No小。寸峪”口寸NN一口∞卜H蓦HNn昏No一心。卜cI_【岭甙一”口价匹心一卜N=苌∞卜。崎∞一∞n寸吼cIt，NAa寸卜寸∞”△n066∞N寸。蚺峪A卜∞o一一一nn乱。一寸NN一登卜∞∞西口on寸∞卜oonoo_【寸寸n卜卜一n寸”∞=∞non峨譬卜NH竹nn蚤口”o∞西寸n!卜nn!nN∞SIA母∞∞2∞A口n口cIn∞oN一罱H6Io代西∞心。口一心nn一寸NN一协∞一NuN—NnN寸N—nn一∞02oH＆∞o寸n20n”∞o一￡，盘∞n∞寸心t，n寸昏nn凸。卜oN口峪卜_I盘卜nAN寸∞N∞寸_【∞o卜崞卜口。一∞”寸乱昏”Nnnn一口。一四寸no∞nn心∞卜∞寸n卜一一n心心全一n乱。卜N一心∞卜o∞卜￡-寸。卜卜A卜一∞nN昏∞卜一n_【no竺NIt7n口岔N寸寸竹一on∞nIo一”n心No∞心oN””岭N卜AN卜昏乱∞∞n寸一_【卜竹no—n∞AnocI一△N卜n吼n寸∞nN一心口n∞一卜寸∞∞一_【寸”卜n一一一卜nn∞一n∞一n∞一卜心oooN”∞寸卜一一16n卜N．【No小寸谚_【寸口昏一ANN寸。寸寸一卜”o负∞n∞；s．nNnIls．”一詈∞矗￡s2．SN∞uJ．n_【∞aJ认嚼j千nNmt、m-clsjs-nn∞QJ_nN器J-n一∞2．c《趸苞仨u的—哥墨《弓宅《Z篮口II《ZggQIJ＆∞口o_【_时-j—#∞口。一_对_11—IIg|"09}co口》力．IIo卜JsnolII^口。岛^力砷110比奇p矗_廿=竹110眦k_zo—IIo=厶Z∞o_H≈lIu—A口鲁∞∞等AJjN_【Jollo号。葚∞1p山7铙Jo∞o鼍焉荡冀no—D舀#螺霉墼悟太山Z∞蛊妊七墨黎靳谭七釜寸．c啭蝌辍瞎颦巾太露水婴葵赳一馔削皿嚣靳龌窨苌辎世一聪恻山z∞巾诮K皋攀扑书匿弓鲁长蠼凑 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选图3．312个蜜蜂幼虫个体同义和非同义SNP统计图Fig3．3Statisticsofsynonymousandnon—synonymousSNPin12larvaes3．3．6与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的SNP分子标记的筛选对于6个抗自垩病的蜜蜂幼虫个体和6个易感自垩病的蜜蜂幼虫个体共有SNP标记分析显示，12个文库共有总序列数为197个。另外，我们还挑选出6个抗自垩病的蜜蜂幼虫个体共有的SNP位点，总数量为1816个，6个易感白垩病的蜜蜂幼虫个体共有的SNP位点为629个．除去两组蜜蜂幼虫共有的SNP位点，我们得出6个抗白垩病的蜜蜂幼虫个体特有SNP位点1620个，6个易感白垩病的蜜蜂幼虫个体特有的SNP位点为433个．对于以上提到的SNP位点，我们对其染色体编号，坐标点、参考序列对应位置碱基和测序个体的基因型进行了注释．由于6个抗病个体共有的SNP位点比较多，我们通过基因过滤筛选，选取了位于mRNA区域的SNP位点，并对其补充了symbol号(用于在NCBI中查找基因功能注释的编号)，并进行了基因功能注释．对于6个易感病的蜜蜂幼虫个体，我们也采用同样的方法筛选出与蜜蜂感染白垩病相关的SNP位点．最终，我们获得位于mRNA的与蜜蜂抗白垩病相关的SNP位点696个，与蜜蜂易感白垩病相关的SNP位点102个．Hclloway等(43】的研究证实蜜蜂第2条和第ll条染色体的LOD阈值大于2．5，提示这两条染色体与蜜蜂抗白垩病性状密切相关。6个抗病幼虫个体位于mRNA上的共有SNP位点为680个(除去16个没有比对上任何一条染色体的SNP位点)，其中位于第2条和第1l条染色体上的SNP位点为118个，位于第2条染 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选色体上的SNP位点有52个，位于第1l条染色体上的SNP位点有66个，共占总SNP位点的17．4％．我们过滤掉和易感病共有的SNP位点以及假设基因，筛选出与蜜蜂幼虫抗白垩病密切相关的SNP位点(共71个)，整理成表3．4． 《净b出o匠一Nt"qI"qNt"qNt"qt"q—o_1l。峪Qo酲Moll譬鼍凸Iq—II∞爵曲；H三II—Q-2a龇II一勺lI—o．—，『趸一盘一I．6l，告一oIIIoIIo再2口ou善皇∞3J警Jp誊11E一旦一I．一对一．1它皇oIIuo=—葛A∞口一卫oJA一矗—葛。昕口DlJ∞∞N一《^l一_基qn∞石旨高口u1lo一葛u_『曼甚QloQ吕苞80=lID—sII罡_o量oods南_13口oIIQ唇h乌_：卫lI-峪口。幺缸。一。吕olI—II是∞；苫II一30基趾II—pulq．《乏譬一旦一I_uIsoII譬一一显II-A寸眦01090lS粤2AQo意苗一∞o．I眦IupI=罩g一∞卫II．《一．口置oIIa时—簋o∞一卫寻IIlso二譬一‘uIJ口I_二II一旦lI-嚣IsQLI譬一一Il_1．Io_LIllIN寸寻崞N∞卜”oo—uorl一心II”nUo，IN∞"【寸N卜uo一一《山《卜∞}{一寸心N∞卜”oo_【¨vnvJ一¨一卜∞o寸Uo—心心lln”UorI一∞n卜寸n卜00一‘8∞∞o一寸UoJ—g_【‘一”一卜∞o寸Uo一一暑_■nnnon∞一N卜一∞o口N趴卜卜∞昏∞o卜峪一西卜一∞H甙o∞No寸H∞o口N∞o口oo价一N卜心_【卜吼呐也一N卜寸。寸∞∞一nnN饥。卜．LH．H西筑卜卜nnoo．，簪Z卜H．nN一∞卜nnoo≥Z《一"1昏岔卜卜nnoo≥Z《一．一西龠卜卜nnoo≥Zo一．吗卜岔卜卜nnoo≥Zo_【．c一_∞卜nnook多Z一．8N是卜nnoo≥Zo一．H乱怠卜卜nnoo|／乒ZU一．一∞o∞卜nnoo≥ZU一．∞卜岔卜卜nnoo≥Zo一．N∞o∞卜nnoo≥Z碘燃殴摊巾10Dg套肇刽《迥糊罐硝罐世七谅迩惧蟮糖舔挺妒骠世书联N迁即禚【l一口II时NQ暑o∞ogo主u-∞。嗯>高=II墨∞惕2∞-o、，Z笛g口一∞；oo一厶Z∽llo暑goQuIl—n．n∞lq曩_一=娶N世脚糕一蜓迥山z∽诞球署q<蚕uI=}迥世七《黎螓蟮七崞n．￡垛蝌壕骝肇巾太右球娶葵掣诞州与i蠕蜜蠲留长璐世露蝴山z∞■确以皋牮舯书警朴K照舞 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浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选3．4讨论3．4．1SNP重测序样本分析抗白垩病和易感白垩病蜜蜂幼虫标本的采集工作均在同一地点(福建农林大学)进行，由同一人操作，幼虫培养箱的温度和湿度均严格控制，模拟出比较适合幼虫生存的生活环境．在幼虫化蛹当天，观察到幼虫开始排便时，即将幼虫转移到铺垫有消毒滤纸的新的培养板中，保证化蛹时的干燥环境．实验过程中对照组幼虫存活率非常高，2013年7月取幼虫样本进行测序时，对照组存活率最高达到97．9％(5号群)，最低也达到89．6％(3号群)。因此，可以看出幼虫培养过程中实验人员操作技术过关，由实验技术操作引起误差的可能性比较小。我们将第3日龄接种白垩病孢子后最早表现出发病症状的幼虫即刻在无菌条件下进行解剖，去除内脏(主要是去除蜜蜂球囊菌生长密集的中肠)，之后放在．809C环境下储存，尽最大可能防止DNA的降解．对于第15日龄尚未感染白垩病的蜜蜂，我们选取外表健康的个体作为抗病样本．整体来说，6个抗病蜜蜂个体和6个易感病蜜蜂个体的选择科学准确，可信度高．3．4．2与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的SNP分子标记的筛选12个蜜蜂幼虫样本的DNA提取物质量较高，样本等级lo个为A类，2个为B类，均为轻微降解，电泳图也显示12个电泳条带亮度高且单一，非常有利于之后的建库分析．12个蜜蜂个体的初级数据(rawdata)质量值大于20的数据量在92．13％及以上，干净数据(cleandata)质量值大于20的数据量在94．09％及以上，说明我们的数据质量比较高。另外，12个蜜蜂幼虫样本的基因组覆盖度和有效测序深度均较好，基因组覆盖度均在83．26％及以上，表明我们的样本(尤其是患白垩病蜜蜂幼虫样本)没有被杂菌(尤其是蜜蜂球囊菌)污染。对6个抗白垩病幼虫个体和6个易感白垩病幼虫个体的同义SNP和非同义SNP进行统计，发现在12个蜜蜂幼虫个体中，同义SNP的数量均大于非同义SNP的数量，表明大部分SNP标记不会引起所编码的氨基酸的改变，即不会导致幼虫抗病能力的差异。在我们筛选出的71个蜜蜂抗白垩病性状密切相关的SNP标记中，只有LOC410269(probablemultidrugresistance—associatedproteinlethal(Z)03659．1ike)为非同义SNP位点。对于初步获取的6个抗白垩病蜜蜂幼虫个体共有的SNP位点，我们进行了筛选和过滤，除去了抗病组和易感病幼虫组共有的SNP位点和假设基因，获取47 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选与蜜蜂幼虫抗白垩病性状密切相关的位于mRNA上的71个SNP位点．3．4．3与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的分子标记的功能分析我们得到的71个与蜜蜂幼虫抗白垩病性状相关的分子标记(表3．4)涉及RNA加工过程和转录调节，组织发育以及抗性蛋白和营养蛋白的合成等各个方面。与Helloway等得到的155个分子标记进行了比对分析，发现了7个相同symbol号的基因，分别是fng(fringeglyeosyltransferase)，SyxlA(syntaxinIA)，LOCl00576279(prolow—densitylipoproteinreceptor—relatedprotein1-like)，LOC413091(serrateRNAeffectormoleculehomolog)，li93(DNAligaseIII)，LOCl00578939(singleIgIL一1·relatedreceptor-like)，LOC410269(probablemultidrugresistance—associatedproteinlethal(2)03659一like)。Fng蛋白通过Notch受体调节信号通路．Notch受体是跨膜蛋白，它的激活是通过DSL配体在Notch细胞外领域结合到表皮生长因子上(481．Notch信号通路在机体大部分的组织发育过程中起到非常重要的作用，而且研究表明人类基因疾病与Notch信号通路中的基因突变相关联1491。尽管血g是一些不同组织正常发育的必要因素，但是翅膀对翘活性降低的敏感度最高‘5们．目前，她是果蝇中研究最透彻的糖基转移酶【51，翊．Correia等通过研究证实不同的flag等位基因的表达，会导致果蝇形成不同的翅膀表型521．本实验中6个抗白垩病蜜蜂幼虫个体均具有fngSNP位点，很可能与幼虫组织发育相关，良好健全的组织发育提高了幼虫的机体抗病能力。白介素．1(Interleukin,IL．1)是到目前为止研究最多的细胞因子之一，因为它在炎症应答和免疫的过程中的有着重要作用：Ⅱ，1的激活会增加大量与抗炎症相关的基因的表达，这些基因大多编码直接参与免疫反应和抗炎症反应相关的蛋白，从而影响机体对损伤和感染的反应佟3彤】．已有报道证实果蝇的发育、酵母基因调节和植物疾病抗性均与IL-1受体相关【531．但是目前蜜蜂当中关于白介素．1(Interleukin,IL．1)的报道非常少，本研究中发现的6个抗白垩病蜜蜂幼虫个体共有的LOCl00578939(singleIgIL一1-relatedreceptor-like)SNP位点提示抗白垩病蜜蜂个体在蜜蜂球囊菌侵入后可能由IL-l的激活引发相关的免疫反应，这为该细胞因子在蜜蜂中更深入的研究提供了宝贵的信息．LOC410269(probablemultidrugresistance—associatedproteinlethal(2)03659．1ike)，该SNP位点是筛选出的71个抗白垩病相关的分子标记中唯一一个 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选非同义SNP，也就是说该位点的单核苷酸突变会导致所编码的蛋白质的改变。在癌症的治疗过程中，癌细胞会产生多耐药抗性蛋白(multidrugresistanceassociatedprotein，MDR)来阻碍药物治疗，这些蛋白可以通过调节肝脏和肠的排泄物来限制细胞的适应性，从而对药物产生抗性【鲴．虽然近来多种P一糖蛋白抑制剂(化疗增敏剂)被广泛研究去抑制MDR(multidrugresistanceassociatedprotein)，但其抗癌症效果并不明显．Jaganathan通过大量的文献调研，发现黄酮类在抑制MDR方面具有两种功能．黄酮类可以抑制ATP酶的活性，并且作为P．糖蛋白转运蛋白的配体，从而与其他配体结合引起竞争抑制．这个黄酮类与P．糖蛋白转运蛋白的双模式作用提高了治疗作用【57-63]，从而推测蜂蜜中黄酮类的多酚提取液是一种可行的抑制P一糖蛋白的物质酬．本研究中6个抗病蜜蜂幼虫个体均存在LOC410269(probablemultidrugresistance·associatedproteinlethal(2)03659-like)位点非同义SNP突变，推测可能造成多耐药抗性蛋白(multidrugresistanceassociatedprotein，MDR)的缺失，有利于机体发挥免疫功能，增加机体对环境的适应性。此外，我们还在与蜜蜂幼虫抗白垩病相关的SNP标记中发现了mrjpS(majorroyaljellyprotein5)基因．蜂王浆是专门用于饲喂蜂王及3Et龄以内小幼虫的分泌物，也是决定蜜蜂级型的根本因素．Fontana等人在蜂王浆中发现了4种抗菌肽，它们对酵母、革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌均具有特异性抗茵作用[651．有研究者发现，蜂王浆可以通过刺激抗体和免疫活性细胞增殖而达到免疫调节的效果，并证实了可能是蜂王浆中的MRJP3在这一过程发挥重要作用‘66，671．Kamakura等人还通过大鼠研究发现，蜂王浆中的MRJPl可以保护大鼠的肝脏，同时还能增加白蛋白的合成，并发挥细胞分裂素的作用从而有效促进细胞增殖[68】。另外，蜂王浆还具有抗肿瘤的作用，如Majtan等证明Apal(IVlRJPl)能刺激巨噬细胞释放肿瘤细胞破坏因子(TNF．a)，同时重组的Apal经胰蛋白酶消化后，其免疫刺激功能也会显著增强t691．本研究中6个抗白垩病蜜蜂幼虫个体的编码mrjp5(majorroyaljellyprotein5)的SNP位点可能机体的免疫细胞增殖和抗菌作用相关联，从而导致蜜蜂幼虫具有较强的抗真菌(蜜蜂球囊菌)能力． 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选第4章主要结论和后续研究展望4．1主要结论(1)本研究采用20个患白垩病蜜蜂黑色干尸混合509花粉粉碎，用蜂蜜混和制成条状花粉饼对意蜂蜂群进行人工接种感染，发现意蜂蜂群在接种前后患病个数差异显著(2012年P=O．0227，2013年P=O．0005)；不同组的蜂群之间在接种感染前后患病个数差异均显著(P=0。0238和P=O．0211，2012年)，证实了不同蜂群抗白垩病能力确实存在显著差异．我们还采用封盖子脾冷冻法检测了5群意蜂蜂群的清理能力，发现蜂群内幼虫的患病个数与清理率呈显著负相关(P--O．0187)，说明蜂群清理能力越强，患白垩病的个数越少。(2)蜜蜂幼虫抗白垩病能力的研究采用蜜蜂球囊茵孢子接种3日龄幼虫的方法，结果表明不同群的蜜蜂幼虫抗白垩病能力差异显著(2012年P--O．0006，2013年P=0．0005)，首次通过实验研究证实幼虫抗病能力和蜂群成年蜂抗病能力存在正相关性，即抗白垩能力强的蜂群其幼虫抗自垩病能力也强；抗白垩能力弱的蜂群其幼虫抗白垩病能力弱．(3)本研究使用蜜蜂球囊茵孢子在实验室环境下感染蜜蜂幼虫个体，收集强抗病幼虫个体(6只)和易感病幼虫个体(6只)，进行SNP重测序。最终，我们获得位于mRNA的与蜜蜂抗白垩病相关的SNP位点696个，与蜜蜂易感白垩病相关的SNP位点102个．通过进一步的基因过滤筛选，我们一共筛选出71个与蜜蜂幼虫抗白垩病性状密切相关的SNP位点，对其进行了基因功能注释，并对编码nag，IL广1，multidrugresistance,associatedprotein,majorroyaljellyprotein5等的SNP位点进行了分析讨论，从基因分子水平预测蜜蜂抗白垩病性状相关的可能分子标记．4．2后续研究展望(1)从上述筛选所得的71个SNP位点中选取与幼虫抗白垩病性状密切相关的SNP位点(如nag，IL一1等)进行验证，进一步证实它们可以作为蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记．(2)通过基因敲除技术等方法对本研究中得到的与蜜蜂抗白垩病性状相关的关键基因进行功能研究，进一步掌握蜜蜂抗白垩病性状相关的分子机制．Sn 浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选[1】[2】[3】【4】【5】[6】[7】[8】[9】【10】[11]【12]【13]【14】【15】参考文献Invemizzi，C．，ERivas，andL．Bettucci，Resistancetochalkbrooddiseasein却妇melliferaL．(I-Iymenoptera：Apidae)colonieswithdifferenthygienicbehaviour[J]．NeotropicalEntomology,2011．40(1)：P．28—34．Maassen,A．，WeitereMitteiltmgenuberderseucherdaaflenBmtkrankheitenderBienen【Furthercommunicationontheepidemicbrooddiseaseofbees]【J]．MitteilungenausderKais耐ichenBiologischenAmtaltfurLand-undForstwirtscshaft,1913．14：P．48-58．Kluscr,S．andP．Peduzzi，Globalpollinatordecline：aliteraturereview[J]．Unep／Grid-Eumpe，2007．10P．1—12．Qin，x．，Evans，J．D．，Aronstein，K．A．，eta1．，GenomesequencesofthehoneybeepathogensPaenibacilluslarvaeandAscosphaeraapis[y]．InsectMolecularBiology,2006．15(5)：P．715-718．Taber,S．，Studiesonchalkbrooddisease[J]．Americanbeejournal，1992．132．Aronstein,K．andK．Murray,Chalkbrooddiseaseinhoneybees[J]．Journalofinvertebratepathology,2010．103：P．$20-$29．Flores，J．，M．Spivak,andI．Gutidrrez，SporesofAscosphaera印括containedinwaxfoundationCaninfecthoneybeebrood[J]．VeterinaryMicrobiology,2005．108(1)：P．141·144．Flores,J。，I．Gutidrrez，andR．Espcjo，TheroleofpolleninchalkbrooddiseaseinAptsmellifera：transmissionandpredisposingconditions[J]．Mycologia,2005．97(6)：P．1171一1176．Bailey,L．，Honeybeepathologyl981：AcademicPressIne．(London)Ltd．Theantana,T．andP．Chantawannakul，Proteaseandp．N—aceWlglucosaminidaseofhoneybeechalkbroodpathogenAscosphaeraapis[J]．JournalofApiculturalResearch,2008．47(1)：P．68—76．粱勤，陈大福．蜜蜂保护学(第二版)【M】．北京：中国农业出版社，2009，83—85．熊翠玲，蜜蜂白垩病分子诊断技术的研究【D】．硕士学位论文集，2010．赵柏林，蜜蜂白垩病PCR及荧光实时定量PCR诊断方法的建立【D】．硕士学位论文集，2007．Vojvodic，S．，Jensen，A．B．，Markussen,B．，eta1．，Geneticvariationinvirulenceamongchalkbroodstrainsinfectinghoneybees[J]．PIoSone，2011．6(9)：P．e25035．James，R．，ImpactofdisinfectingnestingboardsOnchalkbroodcontrolinthealfalfaleafcuttingbee[J]．Journalofeconomicentomology,2005．98(4)：P．51 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浙江大学硕士学位论文基于SNP重测序技术的蜜蜂抗白垩病性状相关的分子标记筛选国际交流及会议’rheXXXXIIIAPIMONDIAINTERNATIONALCONGRESS时间：2013年9月29日至10月4日主办单位：国际养蜂大会组委会地点：乌克兰基辅本人论文：DifferentialmicroRNAsexpressionsinheadofforagerbetweenApismelliferaandApiscerana形式：口头报告60