瞄准疾病的利器——英美科学家因基因靶向技术获2007年诺贝尔生理学或医学奖 5页

万方数据2007年第28卷12月第6期首都医科大学学报JournalofCapitalMedicalUniversityDee．2007V01．28No．6·诺贝尔奖专栏·瞄准疾病的利器——英美科学家因基因靶向技术获2007年诺贝尔生理学或医学奖任振华关云谦张愚’(首都医科大学宣武医院细胞治疗中心)【摘要】瑞典卡罗林斯卡医学院2007年lO月8日宣布，将2007年诺贝尔生理学或医学奖授予美国人马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯和英国人马丁·埃文斯，以表彰他们在改造活体内特定基因的基因靶向技术等方面做出的奠基性贡献。本文从3位获奖科学家的简介、主要贡献和基因靶向技术的意义等方面进行综述。【关键词】基因靶向技术；诺贝尔生理学或医学奖SharpWeaponAimingatDiseases。_。-_____·。___。——TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicinefor2007JointlytoAmericanandBritishScientistsforGeneTargetingRenZhenhua，GuanYunqian，ZhangYu+(CellTheraFyCenter，Xuanwu舶驴删，CapitalMedw越Unwersity)【ABSTRACT】8thOctober2007TheNobelAssemblyatKarolinskaInstitutehasdecidedtOawardTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicinefor2007jointlytoMarioR．Capeechi，MartinJ．EvansandOliverSmithiesfortheirdiscoveriesof”principlesforintroducingspecificgenemodificationsinmicebytheuseofembryonicstemcells”．Inthispaper，weintroducecontributionsofthethreewinners，andthesignificanceofthediscoveryofgenetargeting．【KEYWORDS】genetargeting；NobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007年10月813，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将授，美国国家科学院院士。2007年诺贝尔生理学或医学奖授予美国人MarioR．Capeeehi、0liverSmithies和英国人MartinJ．Evans，以表彰他们在改造活体内特定基因的基因靶向技术等方面做出的奠基性贡献。所谓基因靶向技术是指利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)可与外源性DNA同源序列发生同源重组的特性，定向改造生物体内某一基因的技术。借助这一从20世纪80年代发展起来的技术，人们得以按照预先设计的方式对生物遗传信息进行精细改造。从长远来看，基因靶向技术对人类在理解基因功能方面将带来持续而深远的影响⋯。1获奖科学家简介1．1MarioR．CapecchiCapecchi于1937年出生在意大利，后获得美国国籍，1967年获美国哈佛大学生物物理学博士学位。Capeechi一直担任犹他大学霍华德·休斯医学研究所研究员，同时是犹他大学人类遗传学和生物学教·Correspondingauthor，E-mail：Yaz@bjs印．orgCapecchi的主要研究集中在同源重组和胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)基因修饰等方面。个体生命发育及功能信息由DNA携带，DNA被组装在染色体上，染色体是成对出现的，一条来自于父本，另一条来自于母本，成对染色体之间的交换增加基因的变化，这一过程称之为同源重组。Capeechi发现哺乳动物细胞拥有同源重组的酶系统，能诱导外源性DNA分子和受体细胞同源的DNA序列之间同源重组。他运用逆转录病毒重组ES细胞基因，通过阳性一阴性选择方法(positive．negativeselection)筛选得到重组的ES细胞，再将其植入囊胚，发现重组基因能传递给子代的嵌合子小鼠。1．2MartinJ．EvansEvans于1941年在英国出生，1963年从剑桥大学毕业后，进入伦敦大学学习，获解剖学和胚胎学博士学位，1978年返回剑桥大学工作。Evans现在是英国加的夫大学哺乳动物遗传学教授，兼任生命科学学院院长。Evans的主要研究集中于干细胞培养和胚胎移植 万方数据676首都医科大学学报第28卷技术。1981年，他和同事第一次从小鼠囊胚中成功分离出未分化的胚胎干细胞。3年后，他和他的团队建立了囊胚注射技术。Evans将病毒转染的Es细胞注射进入囊胚，发育成嵌合子小鼠，检测嵌合子小鼠发现其携带有外源基因。1．3OliverSmithiesSmithies于1925年出生在英国，后获得美国国籍。1951年获牛津大学生物化学博士学位，现在是美国北卡罗来纳大学病理学教授。Smithies和Capecchi几乎同时对基因靶向技术做出了奠基性贡献。Smithies通过质粒携带缺失的启动子和起始位置的2个外显子，利用同源重组修复突变ES细胞的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthinephosphoribosyltransferase，HPRT)基因，基于自己的研究他得出可通过选择性的修饰多潜能的ES细胞基因来改造哺乳动物基因组的结论。1989年HPRT基因突变小鼠在Smithies实验室诞生。2主要贡献2．1胚胎干细胞随着细胞培养技术的发展，Evans等几位科学家在20世纪70年代早期建立了鼠源睾丸畸胎癌的胚胎癌性细胞(embryonalcarcinoma，EC)。Evans发现EC细胞具有创造嵌合子小鼠的潜能。Evans与Rich-ardGardner合作，将EC细胞注入囊泡，再植入代孕小鼠，发育成了嵌合子小鼠[2】。然而由于核型异常，这种嵌合子小鼠没有繁殖能力。随后，Evans【31发现了具有与EC细胞相似表型的正常细胞一Es细胞，通过囊胚注射技术，注射Es细胞进入小鼠囊胚，Es细胞作为载体携带突变的等位基因转入小鼠的基因组，成功发育成嵌合子小鼠。此外，Ev一8n8通过注射逆转录病毒进入ES细胞，在产生的嵌合子小鼠及其子代中检测到了逆转录病毒DNA，这些工作都表明外源性的DNA能被导入小鼠基因组。之后，Evans选择了x连锁单基因遗传病一莱一萘综合征(Lesch—Nyhansyndrome，LNS)，一种由于HPRT基因突变引起的嘌呤代谢缺陷疾病HJ，来验证通过ES细胞的基因靶向技术。Evans将携带突变的HPRT基因的逆转录病毒注入Es细胞，ES细胞再被注射进入囊胚发育成嵌合子小鼠，结果发现雄性子代小鼠丧失了HPRT基因活性。这是第一次通过改造ES细胞基因而制作的人类疾病模型，也证实了通过ES细胞进行基因靶向技术是成功的。2．2同源重组同源基因之间的重组被发现已有半个世纪。1982年Capecchi证实哺乳动物细胞具有同源重组的酶系统，利用这种酶系统能诱导外源性DNA分子和受体细胞的DNA序列之间进行同源重组。20世纪60年代早期Smithies通过同源重组建立了结合珠蛋白等位基因变异体"】，并于1985年通过同源重组成功地将携带重组基因的质粒整合进入人的红白血病细胞的常染色体B珠蛋白基因中。Smithies和Capecchi的研究都选择了HPRT基因。Smithies利用同源重组在培养的ES细胞上纠正了突变的HRPT基因。Capecchi为了选择性富集含有靶向断裂基因的ES细胞，精心设计了阳性．阴性选择策略，他诱导新霉素抗性基因(neor)进入HPRT基因外显子，HPRT基因的尾端包含筛选基因一胸腺嘧啶核苷激酶(HSV—tk)基因，同源重组结果是表达neor但丧失tk基因。运用这种方法Capecchi成功的筛选出包含靶向断裂基因的ES细胞怕J，目前这种筛选方法一直被广泛使用。2．3转基因小鼠的诞生1986年各个方面准备工作都已经就绪，这些工作包括：ES细胞培养，通过逆转录病毒转移基因进入ES细胞，Es细胞的基因修饰传递给子代小鼠，发现哺乳动物基因组同源重组发生频率很高，证明在培养的小鼠ES细胞上通过同源重组能够靶向定位基因，阳性．阴性选择法成功筛选出了携带靶向断裂基因的Es细胞‘61等。终于，在1989年基因敲除小鼠几乎同时诞生在Smithies实验室和其他的几个实验室【_7I。随着这项技术的发展，现已实现在特定时间和特定组织的基因靶向技术。3基因靶向技术的意义目前，在高等动物中基因靶向技术的应用还仅局限于建立转基因小鼠，但转基因小鼠的研究已经改变了生理学和医学的实验研究模式。通过基因靶向技术建立各种疾病转基因动物模型，帮助我们理解成千上万个基因在发育、免疫、生理和代谢等各个方面所起的作用，并能应用于药物临床前的实验研究。3．1单基因病动物模型哺乳动物基因靶向技术出现后，实验遗传学家首 万方数据第6期任振华等：瞄准疾病的利器——英美科学家因基因靶向技术获2007年诺贝尔生理学或医学奖677先关注的领域就是单基因病。Evans和Smithies实验室最早研究的单基因病是Lesch-Nyhan综合征，即敲除HPRT基因，并给予腺嘌呤磷酸核糖转移酶抑制剂，培育的HPRT√一小鼠表现出持久的自我行为损害，与人类疾病临床特征相似旧J。另一个很好的例子是囊性纤维病——一种西方人中最常见的单基因遗传病。Smithies和他的同事敲除了小鼠的囊性纤维病膜转导受体(cysticfibrosistransmembranceregulator，C丌R)基因，CFRT√一小鼠表现出呼吸道肠道上皮氯化物转运体功能缺陷、发育停止、胎粪梗阻、胃肠道消化腺病理改变等许多与人类疾病类似的特征。3．2复杂性疾病动物模型复杂性疾病有多个致病基因，由于基因与基因之间、基因与环境之间的相互作用，很难分解单个基因在疾病中的作用。基因靶向技术可以进行多基因多因素疾病的实验研究。1)心血管疾病动物模型：OliverSmithies在这一研究方面已经成为领跑者，他专注于两个重要的复杂性疾病一高血压和动脉粥样硬化。Smithies发现多个拷贝的血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)转基因小鼠的AGT基因产物和血压随拷贝数增加而增加一o；但另一个重要的基因一血管紧张素转换酶(angioten·sin．convertionenzyme，ACE)，却没有这样的线性关系。这表明在制作复杂性疾病的动物模型时，必须要综合考虑基因数量、基因表达和基因产物的清除及代谢等各种因素。1992年Smithies实验室的NobuyoMaeda培育了Apoe√一动脉粥样硬化小鼠模型，出现自发的动脉粥样硬化症状，与人类的动脉粥样硬化非常相似。Ishibashi等敲除小鼠低密度脂蛋白(10w-densitylipoprotein，LDL)受体基因(Ldlr)后，高胆固醇食物能引起Ldlr转基因小鼠发生动脉粥样硬化¨引。这2种基因敲除小鼠模型已经被广泛应用于动脉粥样硬化研究。3．3癌症基因靶向技术在癌症研究领域应用前景广阔，组织特异性敲除众多原癌基因、肿瘤抑制基因或血管生成因子基因等，有利于我们理解肿瘤发生、浸润和转移等的分子机制。具有代表性的例子是结合后来发展起来的Cre．10x技术，组织特异性敲除结肠腺瘤性息肉(adenomatouspolyposiscoli，APC)基因，制作APC基因敲除小鼠，诱导小鼠结肠直肠肿瘤，现已成为研究固体肿瘤有用的动物模型⋯】。3．4其他疾病目前基因靶向技术研究已经深入到了大部分人类疾病，包括内分泌疾病、代谢性疾病、神经疾病、炎症和其他疾病，都有了基因敲除模型。事实上，转基因小鼠已经成为医学各研究领域所必需的基本研究手段与技术。4总结基因靶向技术改变了传统的生理学和医学实验研究方法与手段，标志着人类掌握了更深入地了解基因功能的钥匙，为治疗人类疾病带来了真正的希望。通过基因靶向技术建立各种疾病转基因动物模型，帮助我们理解成千上万基因在发育、免疫、生理和代谢等方面所起的作用，最终方法的发展纠正治疗人类基因缺陷。这项技术将对人类疾病研究产生深远的影响。5参考文献[1]TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007，press肛lease．[2]PapaioannouVE，McBumeyM，GardnerRL，eta1．Thefateofteratoearcinomacellsinjectedintoearlymouseem·bryos[J]．Nature，1975，258：70-73．[3]StinnakreMG，EvansMJ，WillisonKR，eta1．Expres—sionofForssmanantigeninthepost·implantationmou8eem·boo[J]．JEmbryolExpMorphol，1981，61：117—131．[4]KuehnMR，BradleyA，RobertsonEJ，eta1．ApotentialanimalmodelforLesch··Nyhansyndromethroughintrodue·-tionofHPRTmutationsintomice[J]．Nature，1987，326：295‘剪8．[5]SmithiesO，ConnellGE，DixonGH．Chromosomalroar-rangementsandtheevolutionofhaptoglobingenes[J]．Na—ture，1962，196：232-236．[6]MansourSL，ThomasKR，CapecchiMR．Disruptionoftheproto··oncogeneint-2inmouseembryo—-derivedstemcells：ageneralstrategyfortargetingmutationstonon-$e-lectablegenes[J]．Nature，1988，336：348-352．[7]KollerBH，HagemannLJ，DoetschmanT，eta1．Germ—linetransmissionofaplannedalterationmadeinahypoxan-thinephosphoribosyltransferasegenebyhomologousi"ecom-binationinembryonicstemcells[J]．PracNailAcadSciUSA，1989，86：8927—8931．[8]WuCL，MeltonDW．ProductionofamodelforLesch-Ny—hansyndromeinhypoxanthinephosphoribesyltransferase-de— 万方数据678首都医科大学学报第28卷ficientmice[J]．NatGenet，1993，3：235-240．[9]Smithies0，KimHS．Targetedgeneduplicationanddis—rupfionforanalyzingquantitativegenetictraitsinmice[J]．ProcNatlAcadSci(USA)，1994，91：3612—3615．[10]IshibashiS，BrownMS，GoldsteinJL，eta1．Hypercholes-terolemiainlowdensitylipoproteinreceptorknockoutmiceanditsl-eVe／"B日Llbyadenovirus．mediatedgenedelivery[J]．JClinInvest，1993，92：883-893．[11]ShibataH，ToyamaK，ShioyaH，eta1．RapidcolorectaladenomaformationinitiatedbyconditionaltargetingoftheApcgene[J]．Science，1997．278：120—123．(收稿日期：2007—1卜16)2007年9月(ten)刊登了以韩国高等科学技术院化学家李知昊(音译)为首的研究小组的论文。李知昊等已绘制出能导致血中毒的TLRl和，I"LR22种受体的基因图。此外还公布了他们绘制出小鼠TLR4(TLR4．MD一2)受体的结构图，TLR4·MD-2受体是另一种诱发败血症的蛋白质。败血症的病死率为20％至40％。当人体自然免疫系统对细菌和病毒感染“反应过度”时就会导致败血症，并有可能诱发致命性肺功能衰竭、心力衰竭、肝衰竭、肾衰竭以及败血症休克。2007年9月(Science)刊登了“美国艾滋病疫苗临床试验失败”的消息。2007年9月18日，艾滋病疫苗研究遭受了灾难性打击，一个最有希望的艾滋病疫苗的临床试验宣布失败。据2007年9月28日出版的美国(Science)杂志报道，对该疫苗大规模，临床试验的结果显示，该疫苗既无法保护志愿者免遭致命病毒的侵害，也不能减少人体免疫缺损病毒(HIV)感染者体内的病毒数量。参加此试验的741位受试者只接受了1个单位的疫苗剂量，其中有24人被感染。而在接受安慰剂试验的762人中，只有21人被感染，且2组受试者体内的病毒数量没有差别。哈佛新英格兰灵长类动物研究中心的负责人罗纳德·德鲁西认为，这项试验的失败为这种疫苗的临床试验亮起了红灯。2007年10月9日(PNAS)在线刊登了题为“全新的听觉机制”的研究论文。美国科学家近日发现了1种全新的听觉机制，从根本上改变了目前对内耳功能的认识。在最新的研究中，美国麻省理工学院研究人员DennisM．Freeman，RoozbehGhaffari和AlexanderJ．Aranyosi对耳蜗覆膜进行了研究，发现耳蜗覆膜比之前预想的要重要得多。它能选择性地接收和传输声波能量至耳蜗的不同部位，传输方式是一种不同于普通上下起伏波的纵向传输。Aranyosi认为这一发现将有助于更深入地研究某些遗传性听觉丧失，对于助听器和耳蜗移植技术的发展也将产生影响。 瞄准疾病的利器——英美科学家因基因靶向技术获2007年诺贝尔生理学或医学奖作者：任振华，关云谦，张愚，RenZhenhua，GuanYunqian，ZhangYu作者单位：首都医科大学宣武医院细胞治疗中心刊名：首都医科大学学报英文刊名：JOURNALOFCAPITALMEDICALUNIVERSITY年，卷(期)：2007,28(6)参考文献(11条)1.SmithiesO;KimHSTargetedgeneduplicationanddisruptionforanalyzingquantitativegenetictraitsinmice19942.WuCL;MeltonDWProductionofamodelforLesch-Nyhansyndromeinhypoxanthinephosphoribosyltransferase-deficientmice[外文期刊]19933.KollerBH;HagemannLJ;DoetschmanTGerm-linetransmissionofaplannedalterationmadeinahypoxanthinephosphoribosyltransferasegenebyhomologousrecombinationinembryonicstemcells19894.MansourSL;ThomasKR;CapecchiMRDisruptionoftheproto-oncogeneint-2inmouseembryo-derivedstemcells:ageneralstrategyfortargetingmutationstonon-selectablegenes[外文期刊]19885.SmithiesO;ConnellGE;DixonGHChromosomalrearrangementsandtheevolutionofhaptoglobingenes[外文期刊]19626.KuehnMR;BradleyA;RobertsonEJApotentialanimalmodelforLesch-NyhansyndromethroughintroductionofHPRTmutationsintomice[外文期刊]19877.StinnakreMG;EvansMJ;WillisonKRExpressionofForssmanantigeninthepost-implantationmouseembryo19818.PapaioannouVE;McBurneyM;GardnerRLThefateofteratocarcinomacellsinjectedintoearlymouseembryos[外文期刊]19759.ShibataH;ToyamaK;ShioyaHRapidcolorectaladenomaformationinitiatedbyconditionaltargetingoftheApcgene[外文期刊]1997(5335)10.IshibashiS;BrownMS;GoldsteinJLHypercholesterolemiainlowdensitylipoproteinreceptorknockoutmiceanditsreversalbyadenovirus-mediatedgenedelivery[外文期刊]199311.TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2007,pressrelease本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_sdykdxxb200706002.aspx