中国主要东方蜜蜂种群的遗传多样性分析 9页

中国主要东方蜜蜂种群的遗传多样性分析任勤1，曹联飞2，赵红霞3,，王瑞生1，程尚1，罗文华1,曹兰1，姬聪慧*1（1.重庆市畜牧科学院，重庆402460；2.浙江省农业科学院，浙江杭州310021；3.广东省生物资源应用研究所，广东广州510260）摘要：对中国具代表性的东方蜜蜂遗传资源中7个种群的线粒体DNAtRNAleu～COⅡ基因进行扩增和测序,并进行遗传多样性比较及亲缘关系分析。结果表明，共发现43个单倍型，其中10个单倍型在GenBank数据库对比确认属于新发现单倍型；7个群体中，阿坝中蜂、滇南中蜂和海南中蜂遗传多样性水平较高，长白山中蜂遗传多样性水平较低，其他群体遗传多样性居中；不同种群间遗传距离变化较大，其中海南中蜂与滇南中蜂、阿坝中蜂间的遗传距离最大，长白山中蜂与云贵中蜂、北方中蜂、华南中蜂间的遗传距离最小；聚类分析显示7个种群可聚为4个类群。关键词：东方蜜蜂；遗传多样性；线粒体DNA中图分类号：文献标志码：AAnalysisofgeneticdiversityofApisceranapopulationsinChinaRENQin1,CAOLianfei2,ZHAOHongxia3,WANGRuisheng1,CHENGShang1,LUOWenhua1,CAOLan1,JIConghui*1（1.ChongQingAcademyofAnimalScience，Chongqing402460，China；2.ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Zhejiang310021，China;3.GuangdongInstituteofAppliedBiologicalResources,Guangdong510260,China）Abstract:ThemitochondrialDNAtRNAleu～COIIgenesin7populationsofApisceranaFabriciusinChinawereamplifiedandsequenced,andtheirgeneticdiversityandphylogeneticrelationshipswereanalyzed.Theresultsshowedthatatotalof43haplotypeswereidentified,ofwhich10haplotypeswereidentifiednewhaplotypesintheGenBankdatabase,Among7populations,Ababee,HainanbeeandYunnanbeehavehigherlevelofgeneticdiversity,ChangbaiMountainbeehaslowerlevelofgeneticdiversity,otherpopulationswereintermediate;Thegeneticdistancesbetweendifferentpopulationsvariedgreatly,ofwhichHainanbeeandhavemaximumgeneticdistancewithYunnanbeeandAbabee,ThegeneticdistancesbetweenChangbaimountainbeeandYunnanbee,MiddleChinabee,NorthernbeeandSouthernbeeweresmall.;Clusteranalysisshowedthatthe7populationscouldbeclusteredinto4taxa.Keywords:ApisceranaFabricius;geneticdiversity;mitochondrialDNA收稿日期：基金项目:国家蜂产业技术体系基金项目（CARS-45SYZ15）;重庆市畜牧科学院基金项目(16421).作者简介：任勤(1979-),男,宁夏固原人，助理研究员,硕士研究生，主要从事蜜蜂方面的研究。通信作者：姬聪慧(1980-)，女，河南平顶山人，助理研究员，硕士研究生。 中国东方蜜蜂资源丰富，分布于除新疆和内蒙古北部以外的广大地区[1]。中国的东方蜜蜂资源可分为5个亚种,分别为中华亚种、西藏亚种、印度亚种、阿坝亚种和海南亚种[2-3]。由于地理隔离等因素影响，中国东方蜜蜂在形态及遗传上存在差异，形成了不同的生态型和丰富的遗传资源，有北方中蜂、华南中蜂、华中中蜂、云贵高原中蜂、长白山中蜂、海南中蜂、滇南中蜂、阿坝中蜂和西藏中蜂[4]。近年来，国内多位学者采用mtDNA、微卫星等分子标记对中国华东地区、江苏省、四川省、海南岛、贵州省、重庆市等地东方蜜蜂进行了遗传多样性分析，发现不同地区的中蜂存在较明显的分化[5-12]。因此，分析更大范围的东方蜜蜂样本，对于了解其遗传分化水平具有重要意义[14]。本研究使用线粒体DNAtRNAleu～COⅡ基因,对中国具有代表性的遗传资源北方中蜂、华南中蜂、海南中蜂等7个种群进行遗传多样性对比及群体间亲缘关系分析，为中国东方蜜蜂资源的遗传分化提供信息，从而促进中国东方蜜蜂资源的保护与利用。1材料与方法1.1材料1.1.1样品采集在中国主要东方蜜蜂分布区的12个采样地点采集东方蜜蜂样本300个（见表1），尽可能采集当地较原始饲养蜂群。每群采集工蜂100只左右，用无水乙醇浸泡，置于冰箱中冷冻保存备用。表1蜜蜂样本分布情况及数量Table1Distributionandquantityofhoneybeesamples采样地点samplingposition地理型topomorph样本数samplenumber宁夏固原Guyuan,Ningxia北方中蜂Beifang20陕西延安Yanan,Shanxi北方中蜂Beifang20山西太原Taiyuan,Shanxi北方中蜂Beifang20广东从化Conghua,Guangdong华南中蜂Huanan20广西南宁Nanning,Guangxi华南中蜂Huanan20福建福州Fuzhou,Fujian华南中蜂Huanan20云南西双版纳Xishuangbanna,Yunnan滇南中蜂Diannan30海南海口Haikou,Hainan海南中蜂Hainan30贵州贵阳Guiyang,Guizhou云贵高原中蜂Yungui30辽宁绥中Suizhong,Liaoning长白山中蜂Changbaishan30吉林长白山Changbaishan,Jilin长白山中蜂Changbaishan30四川马尔康Maerkang,Sichuan阿坝中蜂Aba301.1.2主要仪器全称、型号及生产厂紫外可见分光光度计（KU-T6/KU-T6PC，南京肯凡电子科技有限公司）、常规PCR仪（Eppendorf Mastercycler nexus，艾本德中国有限公司）、迷你型水平电泳系统（GCMGU-102T，上海苑胜仪器设备有限公司）、台式高速冷冻离心机（TG16-WS，长沙湘锐离心机有限公司）、全自动免染凝胶成像分析系统（GelDocEZ，济南舜腾生物技术有限公司）、基因测序仪（NextSeq550AR，安诺优达基因科技）。 1.1.3主要试剂细胞/组织基因组DNA提取试剂盒和蛋白酶K（北京百泰克生物技术有限公司）、dNTP、10×Buffer、TaqDNA聚合酶和Marker（大连宝生物公司）、DNA凝胶回收试剂盒（爱思进生物技术有限公司）、引物（E25’-GGCAGAATAAGTGCATTG-3’，H25’-CAATATCATTGATGACC-3’）（上海生工生物工程有限公司合成）。1.2方法1.2.1基因组DNA的提取每个蜜蜂样本取1只工蜂进行试验。取出被无水乙醇浸泡过的蜜蜂个体，在灭菌水中清洗3次，取蜜蜂胸部置于1.5mL的离心管中,用小剪刀剪碎,按照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书提取基因组DNA。基因组DNA用TE溶解后于-20℃保存，备用。1.2.2PCR扩增与测序1.2.2.1反应体系(50μL)模板DNA2μL，10×Buffer(含Mg2+)5μL，2.5mmol·L-1的dNTPs4μL，10pmol·L-1的引物各2μL，5UTaq酶0.5μL，灭菌双蒸水34.5μL。1.2.2.2反应条件95℃预变性4min；94℃变性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环；72℃再延伸10min。PCR产物纯化后使用测序仪（型号为ABIPRISM3730×l）进行测序。1.2.3序列分析利用SeqMan程序对测定获得的序列进行校对，用MegAlign软件比对所有序列。通过DnaSP5.0软件输出单倍型序列，同时计算各样点的单倍型多样度（Hd）、平均核苷酸差异数（K）、核苷酸多样度（Pi）。用MEGA3.1软件构建系统进化树。2结果与分析2.1PCR扩增及测序结果所有样本均成功进行了扩增和测序，扩增的片段大小约为450bp,与目的片段大小一致，测序获得序列长度约为400bp，扩增结果如图1。1为空白对照，2-21为部分样品的扩增结果，M为250bpPlusDNAMarker1:blankcontrol;2-21:Amplificationresultofsomesamples;M:250bpPlusDNAMarker图1PCR产物电泳结果Fig.1ElectrophoresisresultsofPCRproducts2.2序列特征分析所有序列比对后,获得一致序列为415bp,包括tRNAleu基因部分序列(1～18bp) 、非编码区完全序列(19～108bp)和COⅡ部分序列(109～415bp)。所有序列中A+T含量均在80%以上，所有序列分析表明，多态性位点有31个，其中单变异位点22个，简约信息位点9个，测序结果如图2。 图2测序结果Fig.2sequencingresult2.3单倍型分析共检测到单倍型43个。H2单倍型是主要单倍型，占总样本数的46.52%。其余单倍型比例均小于10%，其中有16个单倍型的比例大于1%。43个单倍型中，10个单倍型在GenBank数据库中比对确认属于新发现的单倍型，提交的序列号为MG197799-197808。2.4群体间遗传多样性比较依据样本分布地，将样品分为海南中蜂（Hainan）、滇南中蜂（Diannan）、阿坝中蜂(Aba)、长白山中蜂(Changbaishan)、云贵中蜂(Yungui)、北方中蜂(Beifang)和华南中蜂(Huanan)等7个群体。各个群体的单倍型多样度（Hd）、平均核苷酸差异数（K）和核苷酸多样度（Pi）见表2。表2群体间遗传多样性比较Table2Geneticdiversitycomparison amongpopulations长白山Changbaishan海南Hainan云贵Yungui滇南Diannan北方Beifang华南Huanan阿坝Aba单倍型多样度Hd0.50830.84760.67620.88570.76400.68280.9048平均核苷酸差异数K0.5581.8100.9331.9051.1520.9761.848核苷酸多样度Pi0.001360.004400.002250.004600.002800.002370.00448从表1可以看出，7个群体中，阿坝、滇南和海南3个群体的遗传多样性水平较高，长白山中蜂群体遗传多样性水平较低，其他群体遗传多样性水平居中。2.5群体间差异比较群体间遗传距离(P-距离法)如表3所示。7个群体间，海南中蜂与滇南中蜂、阿坝中蜂间的遗传距离最大，长白山中蜂与云贵中蜂、北方中蜂、华南中蜂间的遗传距离最小。表3群体间遗传距离比较Table2Geneticdistance amongpopulations长白山Changbaishan海南Hainan云贵Yungui滇南Diannan北方Beifang华南Huanan海南Hainan0.004云贵Yungui0.0020.005滇南Diannan0.0030.0060.004 北方Beifang0.0020.0040.0030.004华南Huanan0.0020.0040.0030.0040.003阿坝Aba0.0040.0060.0040.0050.0040.0042.6系统发育树分析所有单倍型NJ法构建的系统发育树如图3所示。 图3邻接法对单倍型进行聚类分析注：H1-H43代表2.3中所检测到的43个单倍型Fig.3NJmethodforclusteranalysesofhaplotypesNote:H1-H43representsthe43haplotypesdetectedin2.3  图3显示：存在4大分支。H24、H25、H28形成一个分支，属于滇南中蜂；H33、H42形成一个分支，属于华南中蜂；H15、H16、H17、H19、H20、H21形成一个分支，属于海南中蜂和华南中蜂；其余单倍型形成一个分支。3讨论3.1线粒体DNA遗传标记可靠性分析线粒体DNA是真核细胞中核外唯一的遗传物质，绝大多数呈母性遗传[15]，且其许多片段呈多态性，在种间及种内具有丰富的遗传多样性[16]。蜜蜂属于典型的社会性昆虫，其不同亚种间普遍存在线粒体DNA多态性。同一蜂群中，所有工蜂具有相同的母系,作为母系遗传的线粒体DNA在所有工蜂中都是相同的，任何个体都能代表蜂群的线粒体DNA遗传方式。使用线粒体DNA对蜜蜂遗传多样性及亲缘关系进行研究具有简单且不存在群体间变异所产生的差异。3.2各群体间遗传多样性比较分析对所有样本进行检测，结果显示共检测到单倍型43个。H2单倍型是主要单倍型，属于我国东方蜜蜂各群体间普遍存在的单倍型，占总样本数的46.52%。43个单倍型中，10个单倍型在GenBank数据库中比对确认属于新发现的单倍型，分别为H4、H10、H15、H22、H24、H27、H28、H34、H37、H38，说明我国东方蜜蜂遗传资源丰富，不同的群体都具有特殊的遗传背景。群体间单倍型多样度、平均核苷酸差异数和核苷酸多样度分析表明，阿坝、滇南和海南3个群体的遗传多样性水平较高，单倍型多样度指数最高为0.9048，平均核苷酸差异数指数最高为1.905，群体核苷酸多样度指数最高为0.00448。长白山中蜂群体遗传多样性水平较低，单倍型多样度指数为0.5083，平均核苷酸差异数指数为0.558，群体核苷酸多样度指数为0.00136。其他群体遗传多样性居中。根据以上各指数可以得出，由于地理环境的差异，不同生态、地理种群间遗传差异及多样性程度分化明显。3.3各群体间亲缘关系分析7个种群的东方蜜蜂可分为4大类群。其中。滇南中蜂聚为一类，华南中蜂聚为一类，海南中蜂和华南中蜂部分群体聚为一类，其他群体聚为一类。群体间遗传距离指数显示长白山中蜂与云贵中蜂、北方中蜂、华南中蜂亲缘关系较近。海南中蜂与滇南中蜂、阿坝中蜂间的亲缘关系较远，这可能与长期的地理隔离和特殊的自然环境有关。参考文献：[1]杨冠煌.中华蜜蜂资源调查[J].中国养蜂,1984（3）:4-7.[2]杨冠煌,许少玉,匡邦郁,等.东方蜜蜂在我国的分布及其亚种分化[J].云南农业大学学报,1986,1(1):89-92.[3]龚一飞,张其康.蜜蜂分类与进化[M].福州:福建科学技术出版社,2000.[4]国家畜禽遗传资源委员会.中国畜禽遗传资源志蜜蜂志[M].北京:中国农业出版社,2011.[5]姜玉锁,赵慧婷,姜俊兵,等.中国境内不同地理型东方蜜蜂线粒体DNAtRNAleu～COⅡ基因多态性研究[J].中国农业科学,2007,40(7):1535-1542.[6]高鹏飞,赵慧婷,张春香,等.基于线粒体Cytb基因部分序列的中国东方蜜蜂不同地理种群的系统发育[J].动物学报,2008,54(6):1005-1013.[7]吉挺,殷玲,刘敏,等.华东地区中华蜜蜂六地理种群的遗传多样性及遗传分化.昆虫学报[J],2009,52(4):413-419.[8]吉挺,陈晶,殷灵,等.江苏省野生及家养中华蜜蜂微卫星DNA遗传多样性分析[J].中国畜牧兽医,2007,34(12):39-41.[9]曹联飞,姬聪慧,任勤,等.重庆金佛山地区东方蜜蜂遗传多样性研究[J]. 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