蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究.pdf 144页

TheResearchonQualityAnalysisforHoneybyNearInfraredSpectroscopybyLIShuifangAdissertationsubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofDoctorofEngineeringinChemicalProcessingEngineeringofForestProducts1nCentralSouthUniversityofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoad，TianxinDistrictChangshaHunan410004，P．R．CHINASupervisorProfessorSHANYangMay,2012 懒Y23_李殇／／中南林业科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签乒D／矗年y月≥D日中南林业科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密曰。n(请您在以上相应方框打“√")作者签名／季砸谚导师签名：(≯节。≥孛o／文年!月)p日b幻ld年爹月7D日学位论文原创性声明与版权使用授权书示例(送审时用) 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究捅要蜂蜜是具有重要营养价值和医疗保健作用的天然食品。对蜂蜜质量的检测一般包括理化参数分析、品种鉴别、产地鉴别和真伪检测。高效、快速、低成本检测蜂蜜质量是有效监控蜂蜜质量的前提条件之一。近红外光谱技术具有高效、快速、低成本和绿色环保等常规分析方法无可比拟的优点。开展蜂蜜质量近红外光谱分析技术研究对保证蜂蜜质量、保护消费者权益和保障蜂蜜产业健康发展具有重要意义。本课题的主要研究内容及得到的结论如下：(1)研究了薄膜袋透反射、样品杯透反射和样本池透射三种不同方式下采集的蜂蜜近红外光谱的重复性，确定样品杯透反射光谱和样本池透射光谱重复性好。进一步比较这两种方式下采集的光谱所建模型的预Nil力后，确定样品杯透反射方式为蜂蜜近红外光谱采集的较合理方式。(2)通过考察扫描次数和分辨率对光谱响应特性和对模型预测能力的影响，确定采集蜂蜜近红外光谱时，扫描次数取32次、分辨率取8cm’1为宜。(3)用近红外光谱结合偏最d"-乘法(PLS)对蜂蜜的12个主要理化参数值进行了定量分析。这12个理化参数包括可溶性固形物含量(SSC)、水分、还原糖、pH值、总酸度、电导率、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖／葡萄糖和葡萄糖／水。PLS模型对蜂蜜中SSC、水分、还原糖和果糖／葡萄糖的定量分析结果好：验证集预测均方根误差(RMSEP)依次为O．1795、O．1696、1．5270和0．0344，真实值和模型预测值的相关系数(Rp)依次为0．9989、O．9989、0．9191和0．9749。对其它8个理化参数用蒙特卡罗交互检验法(MCCV)剔除奇异样本，再用竞争性自适应重加权采样(CARS)变量选择法结合PLS回归来优化模型，优化后的PLS模型的预IIIii力都有明显提高。优化后模型对蜂蜜pH值、总酸度、电导率、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖／水的RMSEP分别为O．1196、0．4674、2．6827、0．4955、0．5704、0．5711、0．2578和0．0394，Rp分别为0．9058、0．9083、0．9679、0．9845、0．9879、0．9386、0．9586和0．9809。(4)选择4200-5400CIIl。1的光谱范围，分别采用马氏距离判别分析法(MD．DA)、偏最小二乘判别分析法(PLSDA)和径向基函数神经网络法(I强FNN)对5个品种(苹果、油菜、枣花、枸杞和荆条)蜂蜜进行植物来源的判别分析。MD．DA模型和RBFNN模型对验证集的判别总正确率都达到了94．O％，而PLSDA模型只有78．O％。表明近红外光谱结合MD．DA法或RBFNN法具有快速识别蜂蜜品种的潜力。(5)光谱用小波变换(wT)进行变量压缩和滤噪。结合滤波前后的光谱信 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究息，分别用RBFNN和PLSDA建立了苹果蜜产地和油菜蜜产地的判别模型，并对验证集进行预测。对苹果蜜，PLSDA、WT-PLSDA、RBFNN和WT-RBFNN模型对验证集的判别总正确率都为96．2％；对油菜蜜，PLSDA、WT-PLSDA、RBFNN和WT-RBFNN模型对验证集的判别总正确率分别86．4％、90．9％、81．8％和86．4％。结果表明：不同品种蜂蜜的产地判别，同样的建模方法所得预测结果会存在较大差异；线性的WT-PLSDA模型比非线性的WT-RBFNN模型可能更适于蜂蜜产地判别；近红外光谱技术具有快速识别蜂蜜产地的潜力。(6)真蜂蜜样本中分别掺入高果玉米糖浆(HFCS)、甜菜糖浆(BS)、麦芽糖浆(MS)及这三种糖浆的混合物，采集掺假前后蜂蜜样本的近红外光谱。分别用距离匹配法(DM)、MD．DA和PLSDA法对真假蜜进行定性判别分析，结果表明PLSDA模型的判别结果最好：验证集的判别总正确率依次为82．4％、90．2％、90．2％和80．4％。当分别用这三种判别方法对掺假物类型进行判别分析时，只有DM模型和MD．DA模型能较好地识别MS掺假物，验证集的判别正确率都为82．4％。用PLS回归法对不同掺假物的掺假量进行定量分析的结果表明：同一蜂蜜样本掺假，掺假物的定量分析结果好，但这不具现实意义；同一品种或不同品种蜂蜜掺假，只有MS掺假物的定量分析结果较好。(7)真蜂蜜样本中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液，采集真蜂蜜与掺假蜜的近红外光谱。用wT对光谱进行变量压缩和去噪，选择径向基核函数(RBF)作为最小二乘支持向量机(LS-SVM)算法的内核函数，用网格搜索法寻优，得到回归误差的权重(∥和RBF核的核参数(一)分别为222．822和45．170。建立的LSSVM模型对验证集的判别总正确率为95．1％，高于支持向量机算法(SVM)、反向传播人工神经网络法(BPANN)、K一最临近距离法(KNN)和线性判别分析法(LDA)，表明LSSVM算法比SVM、BPANN、KNN和LDA算法具有更好的泛化能力。近红外光谱技术具有快速识别蜂蜜中掺入混合糖的能力。关键词：近红外光谱；蜂蜜；理化参数；品种；产地；掺假II 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究ABSTRACTHoneyisanaturalhealthproductwithhi曲nutritionalvalue．Qualityassessmentofhoneyincludesfollowingsections：quantitativeanalysisofphysicalandchemicalparameters，classificationofbotanicalandgeographicaloriginanddetectionofadulteration．ItisnecessarytolookingforfastandaccuratemethodstodetecttheseindexesSOastoassesshoneyqualitymoreeffectively．Asanewanalyticalmethod，nearinfraredspectroscopy(NIRS)haveadvantageslikehighlyefficient，fast，lowcostandgreenenvironmentalprotection，andSOon．Therefore，itissignificanttodevelopNIRSmethodstodetecthoneyquality,whichwillbenefithealthydevelopmentofhoneyindustryandprotectconsumers’rightsandinterests．Thedissertationmainlystudies：(1)Thedifferenteffectsofthreemeasurementswiththinfilmtransflectance，samplecuptransflectanceandcuveRetransmissionontherepeatabilityofspectraofhoneysamplewerestudied．Theresultsshowedthatbothsamplecuptransflectanceandcuvettetransmissionhadbetterrepeatabilitythanthinfilmtransflectance．Furtherstudiesresultsshowedthatthetransflectancesamplecupperformedbetterthancuvettetransmissioninmeasurement．(2)Thedifferenteffectsofscanningfrequencyandresolutiononnear-infraredspectraofhoneysamplesandthepredictionabilitiesofmodelswerestudied．Forhoneysample，theoptimizedparameterscombinationwas32timesofscanningfrequencyand8cm～ofresolution．(3)Thequantitativeanalyticmodelsof12differentphysicalandchemicalparameters，solublesolidscontent(ssc)，moisture，reducingsugar(RS)，pH—value，totalacidity(TA)，electricalconductivity(EC)，fructose，glucose，sucrose，maltose，fructose／glucoseratio(F／G)andglucose／moistureratio(G／M)inhoneyweredevelopedbypartialleastsquares(PLS)regression．SatisfyingpredictionaccuracieswereachievedforSSC，moisture，RSandF／G：Rootmeansquareerrorofprediction(RMSEP)foreachoftheparameterswasrespectivelyO．1795，0．1696，1．5270and0．0344；Coefficientofdeterminationinprediction(gp)setwasO．9989，0．9989，O．9191andO．9749．respectively．AlterrejectionoftheoutliersbyMonte-Carlocross-validation(MCCV)，competitiveadaptivereweightedsampling(CARS)III 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究combinedwithPLSregressionswereusedtochooseeffectivevariablesSOastooptimizePLSmodelsof8otherparameters．TheresultsshowedthatthepredictionabilitiesofPLSmodelswereobviouslyimproved．UsingtheoptimalPLSmodels，RMSEPofpH—value，TA，EC，fructose，glucose，sucrose，maltoseandG／MinhoneywereO．1196，0．4674，2．6827，0．4955，O．5704，O．5711，0．2578andO．0394，respectively,andRpwereO．9058、O．9083，0．9679，O．9845，O．9879O．9386，O．9586and0．9890，respectively．(4)ThreemodelsweredevelopedfordetectionoffivedifferentbotanicaloriginhoneysamplesbyMahalanobisdistance-discriminantanalysis(MD—DA)，partialleastsquares-discriminantanalysis(PLSDA)andradicalbasisfunctionneuralnetworks(RBFNN)intheNIRregionof4200-5400ClTI～．Thetotalpredictionaccuracy(PA)ofbothMD—DAmodelandRBFNNmodelCanreach94．0％．However,PAofPLSDAmodelwasonly78．O％．Therefore．NIRScombinedwithMD-DAorRBFNNhaveapotentialforquicklydetectingbotanicaloriginofhoney．(5)Thespectraldatawerecompressedandde—noisedusingwavelettransform(WT)．RBFNNandPLSDAwereappliedtodevelopclassificationmodelsofthegeographicaloriginofhoneysamplesusingeitherbeforeorafterthereconstructedsignals，respectively．Forapplehoneysamples，PLSDA，WT-PLSDA，RBFNNandWT-RBFNNproducedasametotalpredictionaccuracyof96．2％．Forrapehoneysamples，PLSDA，WT-PLSDA，RBFNNandWT-RBFNNproducedtotalpredictionaccuracyof86．4％，90．9％，81．8％and86．4％，respectively．Theresultsshowedthatpredictionaccuracyvariedwidelyinthedifferentgeographicaloriginhoneysampleswhenmodelingmethodwerethesame．LinearWT-PLSDAmodelmaybemoresuitableforgeographicalclassificationofhoneysamplesthanno-linearWT-RBFNNmodel．NIRShasapotentialforquicklydetectinggeographicaloriginofhoneysamples．(6)Authentichoneysampleswereadulteratedwithhi曲fructosecomsyrup(HFCS)，beetsyrup(BS)，maltosesyrup(MS)andablendofthesesyrups．Detectionofhoneyadulterationwasdevelopedbydistancematch(DM)，MD-DAandPLSDA．ThebestperformancesofclassificationofauthenticandadulteratedhoneyswereobtainedbyPLSDA：totalaccuracyforvalidationsetswere82．4％，90．2％，90．2％and80．4％．respectively．Theclassificationoftypesofadulterantswasalsodeveloped 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究usingtheabovemethods．andthehighestaccuracyof84．4％wasobtainedbybothDMandMD-DAforMSadulterant．ThequantitativeanalysisofadulterantsbyPLSregressiongavesatisfyingresultsifadulteratedhoneysamplesweregotfromthesameoneauthentichoneysample，otherwiseitgavedissatisfyingresultsfortheadulteratedsamplesfromdifferentbotanicalorigins，excepttheadulterationissoloMS．(7)Honeysampleswereadulteratedbyblendoffructoseandglucose．Nearinfraredspectrumofhoneyswerecollectedbeforeandafteradulteration．Thespectraldatawerecompressedandde-noisedbyWT．Theradialbasisfunction(RBF)wasusedaskernelfunctionofWT-LSSVMmodel．Bygridsearch，theselectedoptimalvalueofy(therelativeweightoftheregressione玎or)and一(thekernelparameteroftheRBFkernel)was222．822and45．170respectively．ThetotalaccuracyofWT-LSSVMmodelwas95．1％forthevalidationset，whichwasbetterthanthatofsupportvectormachines(SVM)，backpropagationartificialneuralnetworks(BPANN)，K-nearestneighbor(KNN)andlineardiscriminantanalysis(LDA)．ThisstudydemonstratedthatthesuperiorityofLSSVMinbuildingmodelswithbettergeneralizationabilitiesthanthoseobtainedfromSVM，BPANN，KNNandLDAfortheproblemsstudied．NIRShasthepotentialabilitytoquicklydetectmixedsugaradulterantsinhoneyKeywords：near-infraredspectroscopy；honey；physicalandchemicalmeasurands；botanicaloriginofhoney；geographicaloriginofhoney；adulterationV 蜂蜜质量的红外光谱分析技术研究目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯III1绪论1．1课题研究的背景和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)1．1．1我国蜂蜜的产业背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)1．1．2我国蜂蜜质量的现实背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)1．1．3课题研究的必要性和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(2)1．2近红外光谱技术(NearInfraredSpectroscopy，NIRS)⋯⋯⋯⋯⋯⋯(2)1．2．1NIRS的发展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(2)1．2．2近红外光谱产生的原理及特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(3)1．2．3近红外光谱的特征吸收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(4)1．2．4近红外光谱分析的基本流程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(5)1．2．5NIRS的特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(5)1．2．6近红外光谱分析中的化学计量学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(6)1．2．7近红外光谱分析中校正模型的评价参数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(10)1．2．8NIRS的应用研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(12)1．3蜂蜜主要理化参数、品种、产地和掺假检测方法研究进展⋯⋯⋯⋯(13)1．3．1蜂蜜主要理化参数定量分析方法研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(13)1．3．2蜂蜜品种鉴别研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(16)1．3．3NIRS在蜂蜜产地及品牌鉴别上的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(18)1．3．4蜂蜜掺假检测研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(19)1．4课题的主要研究内容及技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(21)1．4．1主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(21)1．4．2技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(22)2蜂蜜近红外光谱采集方式和附件及仪器匹配参数的研究2．1蜂蜜近红外光谱采集方式和附件的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(23)2．1．1采集方式和附件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(23)2．1．2不同采集方式的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(26)2．1．3样品杯透反射方式与透射方式的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(28)2．2仪器匹配参数的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(29)2．2．1扫描次数的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(29)2．2．2分辨率的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(31)2．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(33)3蜂蜜主要物理化学参数的近红外光谱定量分析模型3．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(36)3．1．1主要仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(36)3．1．2实验用试剂和蜂蜜样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(36)3．1．3实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(37)3．1．4主要化学计量学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(40) 蜂蜜质量的红外光谱分析技术研究3．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(43)3．2．1蜂蜜原始光谱及其特征吸收峰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(43)3．2．2蜂蜜样本物理化学参数值的统计结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(44)3．2．3蜂蜜物理化学参数PLS模型定量校正分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(45)3．2．4MCCV奇异样本剔除法和CARS变量选择法用于pH值、总酸度、电导率、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和葡／水的PLS模型优化⋯(50)3．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(58)4蜂蜜品种的近红外光谱定性判别方法4．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(59)4．1．1主要仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(59)4．1．2蜂蜜样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(59)4．1．3光谱采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(60)4．1．4样本集的划分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(60)4．1．5主要化学计量学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(60)4．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(63)4．2．1不同品种蜂蜜的近红外光谱⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(63)4．2．2蜂蜜品种的判别分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(64)4．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(71)5小波变换在近红外光谱技术判别蜂蜜产地中的应用5．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(73)5．1．1主要仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(73)5．1．2蜂蜜样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(73)5．1．3光谱采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(74)5．1．4样本集的划分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(74)5．1．5模型评价参数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(75)5．1．5主要化学计量学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(75)5．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(76)5．2．1光谱预处理方法的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(76)5．2．2小波变换(WT)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(77)5．2．3产地判别⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(80)5．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(83)6蜂蜜中掺入食用糖浆的近红外光谱检测方法6．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(85)6．1．1主要仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(85)6．1．2蜂蜜样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(86)6．1．3光谱采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(87)6．1．4判别方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(87)6．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(88)6．2．1真蜂蜜与掺假蜜的判别⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(88)6．2．2掺假物类型的判别⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(96)6．2．3掺假量定量分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(99) 蜂蜜质量的红外光谱分析技术研究6．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(103)7最小二乘支持向量机算法和近红外光谱法鉴别蜂蜜中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液7．1材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(105)7．1．1主要仪器和设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(105)7．1．2蜂蜜样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(105)7．1．3光谱采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(106)7．1．4样本集的划分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(106)7．1．5模型评价参数⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(106)7．1．6光谱预处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(106)7．1．7主要化学计量学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(106)7．2结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(107)7．2．1蜂蜜近红外光谱的变量压缩⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(107)7．2．2模型的建立与预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(110)7．3本章小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(113)8结论与展望8．1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(115)8．2创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(116)8．3展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(117)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(119)附录A(符号和缩略词表)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(131)附录B(攻读博士学位期间发表的论文)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．(133)致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(134) 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究1绪论1．1课题研究的背景和意义1．1．1我国蜂蜜的产业背景我国地域辽阔，气候条件差异大，具有丰富多样的蜂种资源和潜力巨大的蜜源宝库，为发展蜂蜜产业提供了良好的资源优势和潜力。目前，我国饲养蜜蜂约820万群，约占世界蜂群总数的1／10，现有蜂农约30万人，年产蜂蜜约30万吨，其中约50％用于出口，占世界蜂蜜贸易总量的40％左右，蜂蜜出口遍布全球60多个国家和地区，其中主要出IZI美国、欧盟和日本【l】。我国的养蜂数量、蜂蜜产量和蜂蜜出口量均居世界第一位【2。3】。随着经济的快速发展，我国从事蜂产品生产和流通的企业也在不断增多，据统计，目前国内从事蜂产品生产加工和流通的企业已达2000多个，其中年销售额过亿元的企业10余个，过5000万元的企业50余个【2】，全国蜂产品专卖店、连锁店和专柜已达到1万多个【2]，同时电子商务等现代营销方式也带动了蜂产品的消费，活跃了市场，促使蜂产品行业呈现快速发展的趋势。1．1．2我国蜂蜜质量的现实背景一般情况下，对蜂蜜的质量评价应包括以下4个方面：常规理化参数分析、真伪检测、品种鉴别和产地鉴别。而目前，我国蜂蜜质量在这四个方面都存在较严重的问题。主要表现为：(1)成分含量不真实：标签所标注的成分含量与实际含量不一致，最典型的就是标低水分含量、标高还原糖含量；(2)搀杂造假：蜂蜜中掺入糖或代糖类物质，更有甚者直接用食用糖浆或糖类物质、淀粉、硫酸一起熬制全假蜂蜜；(3)品种不真实：由于不同品种蜂蜜价格不同，所以低价品种蜂蜜常假冒高价品种蜂蜜；(4)产地不真实：不同地域的气候条件、土壤环境和空气质量不一样，即使是同一品种的蜂蜜，若来自不同产地，质量也会有所差异，因此，一些优良产地的蜂蜜常被其它产地的蜂蜜所假冒。随着人们生活水平的提高和健康意识的加强，蜂蜜的需求量正在逐年增大，一些不法蜂农、经销商和企业正是利用蜂蜜市场需求量加大的机会，大肆进行蜂蜜的搀杂使假，牟取暴益，甚至已形成规模化、市场化和专业化，不合格蜂蜜不但在农村和小商店销售，甚至一些大型超市和蜂产品专卖店也有销售。各地不断出现的蜂蜜质量问题引起了国家相关部门的重视，国家标准化管理委员会于 中南林业科技大学博士学位论文2005年10月26日发布了《蜂蜜》国家强制性标准(GB18796．2005)，并于2006年6月l号实施。与此同时，国家质检总局以国质检执函[20051854号文件的形式向全国各级质监部门发出通知，要求严查蜂蜜及蜂蜜制品生产企业执行标准的情况，严防搀杂使假行为的发生。通过这些措施，蜂蜜质量有所提高，2009年的一项抽检结果表明蜂蜜合格率由过去的31％提高到了77．9％【4】，然而蜂蜜质量仍存在严重问题：《商品与质量》2009年12月23日报道天津市对北京、天津、上海、⋯⋯等11个省市的26家企业生产的蜂蜜进行质量抽样检测，结果显示15个批次不合格，其中12个批次是掺假蜂蜜；《中国食品质量报》2010年7月27日报道安徽省近年蜂蜜掺假现象严重，曾一度占据市场50％的份额；2010年11月14日，中央电视台《每周质量报告》栏目报道了浙江省宁波市多家企业以次充好、生产销售假蜂蜜；《中国食品报》2011年4月11日报道广西蜂蜜合格率不到五成。1．1．3课题研究的必要性和意义蜂蜜质量不合格现象严重的主要原因，一是市场监管不力，二是目前蜂蜜质量检测技术滞后。(蜂蜜)国家标准(GB18796．2005)规定：蜂蜜中还原糖的检测方法是化学滴定法；果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的检测方法是液相色谱示差折光法；蜂蜜真伪的检测方法是碳．4植物糖含量的稳定碳同位素比率法。品种和产地的判别没有规定统一的标准方法，一般由有经验的专业人员用显微镜法观察花粉形态和数量来确定蜂蜜品种。这些检测方法的缺点是需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，费时，成本高，难以满足蜂蜜行业要求快速、低成本检测蜂蜜质量的要求。监管方面存在的问题可以通过制度的完善和加大监管力度得到解决，而检测方法上存在的缺陷必需通过新方法的建立才能解决。快速、低成本不仅是蜂蜜行业对质量检测提出的要求，也是整个农产品和食品领域的共同要求。要实现蜂蜜质量的有效监控，必须建立一种高效准确、成本低且易于操作的分析方法来评价蜂蜜质量，这直接关系到蜂蜜行业的健康快速发展及消费者权益的保护。近红外光谱技术是上世纪90年代后期迅速发展起来的分析检测技术，具有分析速度快，成本低，操作简便，重现性好，无损和绿色环保等优点，已广泛应用于制药、石化、农业和食品等领域，显示出了强大的生命力，是当今分析化学领域最重要的分析技术之一【5J。本课题利用近红外光谱技术对蜂蜜的主要理化参数、品种、产地和掺假进行检测研究，为快速准确评价蜂蜜质量探索新方法，为蜂蜜质量控制近红外光谱专用快速分析仪的开发提供方法参考和实验依据。2 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究1．2近红外光谱技术(NearInfraredSpectroscopy，NIRS)1．2．1NIRS的发展NIRS的发展可分为五个阶段【5。7】．(1)20世纪50年代以前，开始出现了近红外光谱的检测，但没有实际应用；(2)20世纪50年代，由于Norris等在近红外检测农产品方面所做的大量研究工作，近红外在测定农副产品(包括谷物、饲料、水果、肉、蛋、奶等)的品质(如水分、蛋白、油脂含量等)方面得到了广泛使用；(3)20世纪60．70年代，由于中红外光谱技术的发展及其在化合物结构表征中所起的巨大作用，人们淡漠了NIRS在分析测试中的应用，NIRS进入沉睡时期；(4)20世纪80年代，随着计算机技术的迅猛发展，带动了分析仪器的数字化和化学计量学学科的发展，人们开始重新认识NIRS，NIRS进入苏醒期；(5)20世纪90年代后期，NIRS得到迅速推广，已成为一门发展最快、最引人注目的独立分析技术，在诸多领域应用广泛，NIRS进入快速发展时期。1．2．2近红外光谱产生的原理及特征分子中存在四种不同形式的能量：平动能、转运能、振动能和电子能【6J。根据普朗克量子理论，分子中的能量是不连续的、量子化的。当一束光通过样品时，分子会吸收某些频率的光子，从一个能级跃迁到另一个能级，因此，只有具有一定频率的光子才能被吸收。振动和转动辐射要求光子的能量较低，通常在红外和微波区域。近红外光谱属于分子振动的倍频(振动状态在相隔一个或几个能级之间的跃迁)或合频(分子两种振动状态的能级同时发生跃迁)的吸收光谱。分子吸收光子后会改变自身的振动能态，通常分子基频振动产生的吸收谱带在中红外区(2500,、--25000nm)，而倍频和合频吸收谱带位于近红外区(780～2500nm)。图1．1列出了近红外光谱在电磁波谱中的位置。绝大多数有机化合物和许多无机化合物的化学健的振动在中红外的基频吸收，而在近红外区域产生的是倍频和合频吸收。近红外区域产生的倍频和合频吸收往往较中红外弱，且背景复杂、谱峰重叠严重，必须借助化学计量学方法才能提取有用的光谱信息。近红外光谱具有以下特征瞵】：(1)信息范围较窄：近红外区的吸收主要是波长在800"--2500am范围的吸收，包括C．H、N．H和O．H等含氢基团的倍频和合频吸收带；(2)信息量大：近红外光谱包括不同级别的倍频吸收和不同组合形式的合频吸收，组合形式多种多样，因此谱图复杂，信息丰富；(3)光谱信息弱： 中南林业科技大学博士学位论文分子中倍频或合频跃迁的几率比基频跃迁小得多，有机化合物在近红外区的摩尔吸光系数比中红外区小1．2个数量级，比紫外区小2．4个数量级；(4)谱峰重叠严重：倍频尤其是合频的组合形式多种多样，在同一谱区中不同分子或同一分子的不同基团都会产生吸收，加之近红外光谱区域范围较窄，因此，谱带重叠严重。近红外区图1．1近红外光谱在电磁波谱中的位置Fig．1．1Districtsofnearinfraredspectroscopyintheelectromagneticspectrum1．2．3近红外光谱的特征吸收近红外光谱主要是分子振动的倍频和合频吸收，因此谱带的产生和属性取决于分子的非谐性，非谐性最高的化学键是含氢原子的键。近红外光谱主要是含氢基团(C．H、0．H和N．H等)伸缩振动的各级倍频和伸缩振动与弯曲振动的合频吸收，几乎所有有机化合物中都含有含氢基团，不同的含氢基团和同一含氢基团在不同化学环境中的近红外吸收存在差异。当一束近红外光照射样品时，试样会选择性地吸收一定频率的近红外光，从而使得透过样品的光谱在某些波长处强度减弱，而在其它波长处较强，样品组成和性质发生变化，透过样品后的近红外光谱的强度和位置也相应地发生变化，因此透过样品后的近红外光谱就携带了有关样品组成和结构的信息，从而为近红外光谱检测样品的组成和结构提供了可能。表1．1不同含氢基团在近红外区域的特征吸收谱带【孓刿(rim)Table1．1ThecharacteristicabsorptionstripsofvariousNIRdistrictsofhydrogenbasegroup(am)注：空白表示没有或未检测到特征吸收带4 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究1．2．4近红外光谱分析的基本流程图1．2近红外光谱分析基本流程Fig．1．2Theflowofnearinfraredspectroscopyanalysis1．2．5NIRS的特点NIRS与其它仪器分析技术相比，有其独特优点【5’8’10】：(1)既可进行定量分析，也可用于定性判别，而且准确度高；(2)分析速度快，一般几秒钟内可完成光谱采集，几分钟内可完成一个样品的测定；(3)无前处理，不破坏样品，不用 中南林业科技大学博士学位论文试剂，成本低，绿色环保；(4)操作技术要求低，近红外光谱仪一般都带有较先进的数据处理软件，自动化程度高，对操作者的技术要求低；(5)可实现在线分析，通过使用光纤探头，可实现远距离监测，适于高温、高压和有毒环境的应用。NIRS存在的缺点【5’1lJ：(1)要实现近红外光谱的快速检测，必须预先建立数学模型，检测结果的准确度直接与所建模型的精度和可靠性有关；(2)建模时参考值的测定要依靠常规方法，故其测定结果的准确度一般不会超过常规方法；(3)物质一般在近红外区的吸收系数小，因此灵敏度较低，不适于痕量分析；(4)不同近红外仪器之间的模型传递还存在一些困难，而且随着仪器部件的老化、更换和维修，会使模型变得不可靠。1．2．6近红外光谱分析中的化学计量学方法化学计量学方法是近红外光谱分析中必不可少的组成部分，其在近红外光谱分析中的应用主要包括以下几个方面：光谱数据的预处理、奇异样本的剔除、样本集的划分、定量(或定性)分析模型的建立和模型的传递。1．2．6．1光谱数据预处理方法近红外光谱信号中不仅包含了反映样品组成和性质的信息，也携带了与这些信息无关的干扰信息，如噪声、背景吸收、光散射、杂散光和仪器响应等，干扰信息的存在导致光谱的漂移、不重复和复杂化，影响数学模型的准确性和稳定性。因此，有必要在建模前对原始光谱进行预处理以降低或消除这些干扰信息的影响。光谱预处理主要包括噪声和其它谱图不规则影响因素(如背景干扰、样本不均匀、杂散光、光散射及光程变化等对光谱产生的影响)的消除及光谱范围的优化【12·131。(1)噪声滤除滤除噪声的方法有很多，如平滑[141、小波变换滤噪【15。16】、傅立叶变换㈣、Kalman滤波㈣和其它一些方法[19-201。在这些方法中信号平滑算法和小波变换滤噪是消除噪声最常用而有效的方法。下面对这两种方法进行介绍。(i)平滑平滑可以提高分析信号的信噪比，其原理是将各数据点的值按一定的权重在自身和临近点重新分配得到较光滑的曲线。最简单的平滑方法是窗口移动平均平滑法，如Norris平滑法，但最常用的方法是窗口移动多项式最小二乘平滑，如Savitzky-Golay(S．G)平滑。窗口移动平均平滑法的基本思想是用窗口内的奇数个数据的平均值来代替这奇数个数据的中心点，通过窗口的移动得到平滑后的新数据。窗口大小(即平 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究滑点数)是一个重要参数，窗口太小，起不到有效滤除噪声的目的，窗口太大，可以增加信噪比，但会损失部分有用信息，造成分析信号的失真。窗口移动多项式最d"--乘平滑法的基本思想与窗口移动平均法类似，但不是采用简单的平均算法，而是采用加权平均的方式通过多项式对移动窗口内的数据进行最d"--乘拟合，在使用过程中需设置窗口宽度和多项式次数。(ii)小波变换(WaveletTransform，wT)WT应用于近红外光谱中，主要用于光谱滤噪、数据压缩和模型传递。wT可以将光谱信息分解为背景信息(低频)、组分信息(中频)和噪音(高频)。其用于光谱滤噪的基本步骤是：首先对含有噪音的原始光谱信号￡。isv进行wT得到小波系数序列∞；再通过阈值法去除(o中的高频部分；最后用经过处理的∞反变换得到去噪后的光谱信息。wT的消噪能力常优于其它方法，如平滑、傅立叶变换等【16．21‘221。(2)基线校正基线校正方法主要包括微分、多元散射校正和光谱归一化。(i)微分微分可以消除基线漂移、强化谱带特征、克服谱带重叠，是最常用的光谱预处理方法，一阶微分可去除与波长无关的漂移，二阶微分可去除同波长线性相关的漂移【5J。微分处理能提高光谱的分辨率和灵敏度，但同时也会引入噪声，降低信噪比¨2I。(ii)多元散射校正(MultiplicativeScatterCorrection，MSC)MSC是通过数学方法将光谱中的散射信号与化学吸收信息分离，并假设散射系数在所有波长处都相同。MSC法认为样品的每一条光谱都应与“理想”光谱呈线性关系，由于“理想”光谱无法得到，因此一般以样品平均光谱代替。MSC在消除样品粒径不均匀、样品的镜面反射和测样容器不一致对光谱产生的影响方面，效果较好，但对组分性质变化较大的样品，处理效果较差【5】。(iii)光谱归一化光归一化与MSC法不同，它对每一条光谱单独校正，因此，一般认为其校正能力较MSC法强。光谱归一化认为每一条光谱中，各波长点的吸光度应满足一定的分布(如正态分布)，通过这一假设对每一条光谱进行校正，无需“理想”光谱，是解决光程变化对光谱影响的较理想方法【5，8】。(3)光谱范围的优化近红外光谱通常由大量数据点构成，波长点数常常远远多于样本个数，光谱共线性非常严重，有效的变量选择不仅可以简化模型，更重要的是能剔除不相关或共线性变量，从而提高模型的预测能力和稳健性。近红外光谱分析中有效光谱范围的选择一直是研究的热点。早期KarlNorris等人利用其对被检测物质的了 中南林业科技大学博士学位论文解人为选定了一套近红外波长成功用于谷物蛋白质和水分含量分析，但近红外光谱谱带很宽且重叠严重，人为选择被检测物质吸收波长非常困难，因此需要化学计量学方法来解决问题。目前的变量选择方法有多种，如间隔偏最小二乘法(IntervalPLS，iPLS)、移动窗口偏最小二乘法(MovingWindowPLS，MW-PLS)、模拟退火算法(SimulatedAnnealing，SA)、遗传算法(GeneticAlgorithms，GA)、无信息变量消除法(UninformativeVariableElimination，UVE)、wT-UVE、蒙特卡洛．无信息变量消除法(MC．UVE)、连续投影算法(SuccessiveProjectionsAlgorithms，SPA)等【23．241及新近提出的竞争性自适应重加权采样(CompetitiveAdaptiveReweightedSampling，CARS)变量选择法【25】。1．2．6．2异常样本的剔除造成异常样本的原因很多，仪器误差、操作误差等都可能造成异常样本的出现。当校正集中存在异常样本时，模型可能出现较大偏差，因此建模前有必要对样本进行诊断，去掉奇异样本，以提高模型的预测能力和稳健性。奇异样本的识别一直是多元校正研究的热点之一。目前已有多种方法用于奇异样本的识别，大致分为两类：诊断法【26也71和稳健回归法【281。诊断法是指首先对奇异样本进行识别，然后利用去掉了奇异样本的训练集进行建模。常用的方法有马氏距离判别法、光谱残差的F检验法、杠杆值与学生t检验等[2引。稳健回归法无须去掉奇异样本，仅对不同的样本赋予不同的权重，如最小中位数平方、稳健主成分回归、稳健偏最小二乘法、利用投影追踪理论寻找奇异样本的方法及新近提出的基于蒙特卡洛交互验证(Monte．CarloCross．Validation，MCCV)的奇异样本筛选法【30】。1．2．6．3样本集的划分近红外光谱分析中，建模用样本是否具有代表性关系到所建模型的适应能力和预测性能。因此，如何从样本集中挑选有代表性的样本建模，在近红外光谱分析中相当重要。目前已有一些方法用于建模用样本的选择，如RS法(RandomSeclection)、KS法(Kennard—Stone)和SPXY法(SamplesetPartitioningbasedonjointx．Ydistances)。RS法是一种随机样本选择方法，方法简单，无需数据挑选。KS法和SPXY法都把所有样本看作训练集的候选样本，依次从中挑选部分样本进入训练集，是常用的有效挑选代表性样本的方法。1．2．6．4定量校正方法模型的建立是实现近红外光谱快速检测的关健一步，也是现代近红外光谱分析技术与经典红外光谱分析技术的本质区别之一。定量校正也称多元校正，即在样本的物化参数与光谱测量信号之间建立定量关联关系。最常用的定量校正方 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究法包括多元线性回归(MultiplicativeLinearRegression，MLR)、主成分回归(PrincipalComponentRegression，PLR)和PLS回归等线性校正方法及局部权重回归(LocallyWeightedRegressio，LWR)、人工神经网络(ArtificialNeuralNetworks，ANN)、非线性PLS、拓扑方法(Topology，TP)和支持向量机法(SupportVectorMachines，svM)等非线性方法，近年来一些新算法和模型建立策略相继出现，如基于核函数的非线性校正方法、集成(或共识)的建模策略、多维分辨与校正方法、基于局部样本的建模策略以及二维相关光谱等。PLS回归是最常用而有效的定量校正方法，已广泛应用于近红外光谱的定量分析。Svante等【3lJ综述了PLS回归用于校正模型建立算法的研究进展。褚小立等132J综述了近年来在近红外光谱分析方法中出现的一些新算法和模型建立策略，并给出了一些方法的具体算法。1．2．6．5模式识别方法近红外光谱模式识别的目的和作用，就在于分析近红外光谱量测数据对不同样本按某些共同的特征进行分类识别，从而发现被量测样本之间的内在联系，获得决策性的信息。模式识别方法依据计算机学习过程(或称训练过程)可分为有监督模式识别方法和无监督模式识别方法。有监督的模式识别方法指的是模式识别的学习过程是有监督的。一般是用一组已知类别的样本作为训练集，让计算机向这些样本学习，并由这个学习过程得到分类模型，从而对未知样本的类别进行预测。无监督的模式识别方法是一种事先对样本的类别未知，无需训练过程的分类识别方法。在化学模式识别方法中，常见的有监督的模式识别方法有距离匹配法(DistanceMatch，DM)、线性判别分析法(LinearDiscriminantAnalysis，LDA)、偏最小二乘判别分析法(PartialLeastSquaresDiscriminantAnalysis，PLSDA)、贝叶斯(Bayes)判别法、K．最邻近法(K．NearestNeighbor，KNN)、ANN和簇类的独立软模式法(SoftIndependentModelingofClassAnalogy，SIMCA)等‘331。常见的无监督模式识别方法有聚类分析法、无监督神经网络法【33】。PLSDA法是一种常用且有效的线性判别方法【341。ANN法由于具有突出的非线性映照能力，已发展成为NIRS重要的非线性定量和定性校正方法之一。SVM是近年出现的一种较新的模型识别方法，在涉及小样本数及非线性和高维数据空间的模式识别问题上，具有许多传统算法所不具有的优势。1．2．6．6模型的传递在某一仪器(称源机)上建立的校正模型无法在另一台与源机相同型号的 中南林业科技大学博士学位论文仪器上使用或者测定结果出现较大偏差。解决这类问题过程称为模型传递。目前解决模型传递问题主要有三种途径：一是建立稳健的校正模型，不用模型传递就可以适用于不同的仪器，这一途径主要通过变量的筛选、微分、wT、MSC、标准正态变换(SNV)、FT和正交信号校正(OSC)等预处理方法，以采用稳健回归方法建模来增强源机所建模型的适应性，使其能用于新仪器所测信号；二是修改现有模型以适应新的仪器，是基于预测结果的校正，如斜率／偏差算法；三是校正谱图的传递，常用的方法有直接校正算法、分段校正算法和Shenk’S算法【51。1．2．7近红外光谱分析中校正模型的评价参数1．2．7．1定量校正模型的评价参数(1)相关系数(CorrelationCoe街cient，R)R=(公式1．1)式中：q代表样本数，夕，代表第i个样本的模型测定值，Y，代表第f个样本的实际值，歹代表所有样本实际值的平均值。根据样本集的不同，R可分为校正集相关系数(＆。1)，交互验证相关系数(＆。)和预测集相关系数(RD)。(2)校正均方根误差(RootMeanSquareErrorofCalibration．RMSEC)I之MSEC=(公式1-2)式中：m代表校正集样本数，弘代表校正集第i个样本的实际值，歹，代表校正集第i个样本的模型预测值。(3)交互验证均方根误差(RootMeanSquareErrorofCross．Validation，RMSECV)RMSECV=式中：(公式1-3) 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究m代表样本数，y，代表第i个样本的实际值，多，代表第i个样本的模型交互检验的预测值。交互验证可采用留一交互验证或k折交互验证。首先将1个样本点随机分成大小基本相等的k个互不相交的子集：S-，Sz，．．．，&，即k折，然后进行k次训练和预测。若进行第i次训练和预测，则选择＆为预测集，其余Sl，．．．＆一I，&+I⋯，&为训练集，用训练集建立模型并对预测集进行预测，k次训练和预测完成后，取平均值作为该模型的评价标准，即为k折交互验证。若k等于样本数，则为留一交互验证；若k--10，则为10折交互验证。(4)预测均方根误差(RootMeanSquareErrorofPrediction，RMSEP)I洲SEP=(公式1-4)式中：n代表预测集样本数，yi代表预测集第i个样本的实际值，多，代表预测集第i个样本的模型预测值。(5)相对标准偏差(RelativeStandardDeviation，RSD)校正相对标准偏差：RSDc-—RM_SEC×100％(公式1-5)Y。预测相对标准偏差：RSDp=—RM-SEP×100％(公式1-6)yp式中：Yc代表校正集样本实际值的均值，歹。代表预测集样本实际值的均值。R反映实际值与预测值之间的相关关系；RMSEC作为校正集的评估标准，RMSECV和RMSEP反映模型对未知样本的预测效果；RSD反映模型对某一组分的总体测定效果，即测定精度。一般来说，R2越接近1，RMSEC、RMSECV、RMSEP和RSD越小，则模型的校正精度和预测精度越高，而小的RMSEC、RMSECV、RMSEP和RSD比大的R2更重要。1．2．7．2定性判别模型的评价参数定性判别模型的评价参数以全部样本的判别总正确率和各类样本的判别正确率为参数来评价。判别正确率越高，则模型的性能越好。判别正确率=一nr×100％(公式1-7)n式中，n，代表被正确判别的样本数，n代表样本总数。 中南林业科技大学博二匕学位论文1．2．8NIRS的应用研究进展NIRS是近十多年来发展最为迅速的高新技术之一，目前已有50多个国家和地区开展TNIRS的研究和应用工作，尤其是发达国家表现得更加突出【351。应用领域主要包括农业、食品、医药和石油化工等。1．2．8．1农业领域目前，NIRS在农业领域的分析对象涉及到谷物、经济作物、果蔬、饲料、肥料和土壤等，所用仪器的类型包括滤光片式、扫描式、傅立叶式和阵列式等，测定方式有漫反射、透反射和透射等，应用场合有传统的品质分析、育种、现场收购和加工业等。谷物分析方面，涉及对象有小麦【361、大麦【37】、玉米㈣、稻谷【39】等，测量参数有水分、蛋白质、氨基酸、脂肪、淀粉、灰分、总酚、黄酮、膳食纤维等【40,41-421和硬度、颗粒度、活力等物理参数以及品种鉴别【36"431。经济作物方面，分析对象涉及油料作物【44451、烟掣46】和茶叶【471等，分析参数有水分、蛋白质、脂肪、油分和糖类等，同时涉及真伪鉴别【4引。水果和蔬菜方面的应用包括鲜果(苹果、柑橘、梨、水蜜桃、杨梅等)[49-501及各类蔬菜(大白菜、辣椒、西红柿、洋葱和马铃薯等)[sq，分析参数包括糖分、维生素、胡萝卜素、酸度、糖度、蛋白质、脂肪、矿质元素、可溶性固形物含量、硬度、农残以及进行产地、品种鉴别掣49州】。饲料方面包括植物性饲料【81和动物性饲料[52]，分析参数有粗蛋白、灰分、水分、纤维素等。肥料方面包括复合肥、动物粪便等，分析参数有总氮、总磷、总钾、铵态氮等【531。在土壤方面的应用包括测定土壤中的有机质、水分、氮、磷、钾等【541。在水果病害识别方面也有研究报道【551。1．2．8．2食品领域NIRS在食品领域的应用非常广泛，测定对象有乳制品、肉类、果汁饮料、调味品、酒类和烘烤类食品等。乳制品包括各种浓缩乳、奶粉、鲜乳、乳酪【5昏571，测定参数有脂肪、蛋白质、矿质元素、水分、糖分(乳糖和蔗糖)等，乳制品的真假判别也有报道【5引。肉类包括猪肉、羊肉和蟹肉等，分析参数有脂肪酸、蛋白质和水分等以及真假、产地鉴别【5蛐11。在果汁饮料方面，检测对象涉及各种果汁、咖啡、可乐等【62躬】，检测项目包括灰分含量、脂质成分、糖分以及产地、真假和品种鉴别【62，64击61。在调味品方面分析对象主要为食醋，检测参数有总酸、挥发酸、还原糖、可溶性固形物含量、pH值、醋龄、氧化过程【67。68】以及掺假【69】和种类‘硎鉴别等。酒类方面的研究对象包括米酒【7l】、啤洲721、葡萄洱731和黄酒【74】等，检测项目为可溶性固形物含量、pH值、酒精度等m72t741以及品种鉴别【731。 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究烘烤类食品方面，XieF研究了面包贮藏期间淀粉和蛋白质的变化【75I。1．2．8．3医药领域NIRS在医药上的应用主要包括以下几个方面：化学成分的定量分析、药物分类识别、药物真伪和中药材产地鉴别、临床医学等。化学成分定量分析的研究对象包括各种中药材(如连翘、黄芩、三七、葛根等)[76-771、中成药[78-791和西药【80】，主要分析水分和各种功能性成分的含量。在药物分类识别方面包括品种鉴别㈣和中药材的分类识别【821等。药物真假鉴别涉及对象有阿胶㈣和中药材【84】(如大黄、当归、白芍、白术、葛根)等。中药材产地鉴别涉及的研究对象主要有白芷、丹参、黄柏、连翘、人参、黄芪等【85。8们。临床医学方面的研究主要集中在血糖、血氧测定和乳腺肿块的诊断，且大都处于探索、研究和评估阶段[87-88】。1．2．8．4石化领域NIRS在石油化工方面的应用开始于1989年，Callis等【89】在短波近红外区域采用PLS算法测定汽油的辛烷值，其后，石化产品各种性质的测定都有报道，如燃油中芳香化合物含量的测定【则、甲醇汽油中甲醇含量的测定洲、生物柴油调和比及理化指标的测定【921。并且结合光纤技术，可在线监控生产过程【931。1．2．8．5其它领域随着仪器制造水平的提高、化学计量学方法的发展和人们对NIRS的不断深入了解，NIRS正逐渐向诸多领域发展，如制浆造纸工业[941、环境科学[951、生命科学【961、木材工业【971等领域都有研究报道。NIRS的发展前景正变得越来越广阔。1．3蜂蜜主要理化参数、品种、产地和掺假检测方法研究进展蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜味物质【981。国际食品法典委员会【991、欧盟及其它国际蜂蜜标准[tOOl规定：蜂蜜的真实性包括蜂蜜品质、品种和产地来源，商品蜂蜜必须标明品种名称和产地来源；蜂蜜中不得添加任何成分，蜜蜂是蜂蜜的唯一生产者。蜂蜜具有补充营养、增强体质、消除疲劳、补肾脾、润肠、润肺、消炎、祛痰、止咳、美容养颜、抗氧化等多种功效‘101‘1021，因而深受广大消费者的喜爱。1．3．1蜂蜜主要理化参数定量分析方法研究进展蜂蜜的理化参数包括蜂蜜的各种化学成分及其含量以及蜂蜜的各种物理参数，如电导率、密度、粘度等。蜂蜜的理化参数因蜂种、蜜源、环境、采收时间等因素的不同存在差异。蜂蜜主要成分为葡萄糖和果糖，约占总干重的70％，此 中南林业科技大学博士学位论文外，还含有糊精、蛋白质、蜡质、氨基酸、矿物质、芳香化合物、有机酸、色素、酶类、挥发油、维生素、花粉、羟甲基糠醛、单宁类、树脂、乙酰胆碱、类黄酮物质和其它植物成分等100多种化合物[103-105]。蜂蜜的各种成分及其含量以及物理参数是评价蜂蜜质量优劣、鉴别蜂蜜品种和真伪的重要参数，也是最受蜂蜜生产企业和消费者所关注的，各国科学工作者在蜂蜜理化参数检测方面做了大量研究工作，下面仅就蜂蜜的主要成分——糖类的分析检测以及NIRS在蜂蜜理化参数检测上的应用研究进展进行综述。1．3．1．1蜂蜜中糖类物质的分析检测技术糖类是蜂蜜中含量最大的成分，其中以葡萄糖和果糖含量最高，约占总糖的85,～95％t106|。此外还含有蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、黑曲糖、茧蜜糖、松三糖、曲二糖、棉子糖、蜜二糖、麦芽三糖、⋯⋯等多种糖类成分【1071。AOAC标准‘1081中测定食品中的糖含量有三种方法：化学滴定法(斐林氏法和铁氰化钾法)、气相色谱法和液相色谱示差折光检测法。我国SN／T0852．2000进出121蜂蜜检验方法【109】规定蜂蜜中果糖、葡萄糖和蔗糖的测定方法为铜还原法，GB／T18932．22规定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量的测定方法【l∞]为液相色谱示差折光检测法。(1)化学滴定法化学滴定法是测定蜂蜜中糖含量的传统方法，测定时间长，过程复杂，水解条件和滴定条件不易掌握，测定结果往往误差较大。(2)色谱法色谱法是检测蜂蜜中糖类物质的最常用分析方法。蜂蜜中的糖类成分复杂，并且具有相似的特性，因此分离困难，气相色谱(GC)法具有高效分离能力，因而更有利于蜂蜜中糖类成分的分离【111】，Sanz等用毛细管GC法t1121N定了30个蜂蜜样品中的葡萄糖、果糖、松三糖和海藻糖含量，用气相色谱．质谱(GC．MS)法【113】定性和定量分析了蜂蜜中的16种--糖和9种三糖。Fuente等[114])羽GC法测定了蜂蜜中的15种二糖。Ouchemoukh等【115】用高效液相色谱(HPLC)脉冲安培电化学法测定了蜂蜜中的2种单糖和9种寡糖。崔鹤等【116】用离子色谱脉冲安培法测定了蜂蜜中葡萄糖、果糖和蔗糖含量。薄层色谱(TLC)法因操作简单，也被用于蜂蜜中糖类的测定，杨景芝等【117J用TLC法测定了蜂蜜中的还原糖和蔗糖含量，效果良好。(3)光谱法紫外光谱、拉曼光谱、红外光谱都被用于分析测定蜂蜜中的糖类成分。糖类成分在盐酸作用下，对紫外光有吸收。占达东[1MJ用紫外光谱法在291nlTl处直接测定了蜂蜜中的果糖含量，果糖浓度在0～"30mg／L范围内服从朗伯．比尔定律。杨菊文等⋯9】用紫外光谱法在286nrn处测定了蜂蜜中的总糖含量，总糖浓度在0"～30mg／L范围内服从朗伯．比尔定律。Batsoulis等【120J用拉曼光谱法同 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究时测定蜂蜜中的果糖和葡萄糖含量，测定结果与HPLC法的结果接近。Lichtenberg．Kraag：等[121】在930～4788cm‘1的中红外光谱范围内对蜂蜜中包括8种糖类成分在内的15个理化参数进行了定量分析，结果表明对含量大于2％的果糖、葡萄糖和蔗糖的预测结果满意。Tewari等【122】用傅立叶变换(FT)红外光谱仪在1000～1200cm’1的中红外光谱范围扫描光谱，对蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的定量分析，预测结果与HPLC法结果逼近。Ruof潜【123】用微衰减全反射傅立叶变换(FT)红外光谱仪在550～-4000cm。1中红外光谱范围扫描光谱，对蜂蜜中包括12种糖类成分在内的20个理化参数进行定量分析，偏最d,-乘法(PLS)模型对葡萄糖、果糖、蔗糖、松三糖和单糖的预测结果满意。WangJun等[124]用FT红外光谱仪在800"～1500ClTI。1中红外光谱区域内，用多元校正法对蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖进行定量分析，预测结果与HPLC法测定的结果接近。(4)其它方法林雁飞等【125】用0【．萘胺为衍生剂，高效毛细管电泳法测定了蜂蜜中7种糖含量，回收率为100"-"105％，相对标准偏差小于2％。顾大明等【I’26J用旋光法对蜂蜜中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量进行了测定，结果表明该法简单、误差小、重现性好。阎政礼【127】等用核磁共振波谱分析法(NMR)对蜂蜜中的葡萄糖、果糖和蔗糖进行定量分析，相对标准偏差依次为0．33％、0．17％_；f111．34％，回收率依次为96．08％、98．03％禾H95．56％。李雪梅等[128】将流动注射技术与电化学技术相结合，使溶液混合、反应、检测集中于一条管道中，实现了蜂蜜中还原糖的半自动化检测。1．3．1．2NIRS在蜂蜜理化参数定量分析上的应用研究进展1998年，ChoHJ[1291和HaJ【130】等首次报道TN用近红外光谱技术分析蜂蜜成分。随后，各国科学工作者陆续开展了这方面的研究。QiuPY等[1311在200-2500nm的波长范围内，对蜂蜜中的8种化学成分进行了研究，采用PLS法建模，所建模型能正确预测蜂蜜中水分、果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量，而对蜂蜜中的游离酸、内酯和羟甲基糠醛含量不能正确测定。Garcia．AlvarezM等[1321在400～2500nm波长范围内对三个不同年份收集的161个蜂蜜样品中的水分、果糖和葡萄糖进行近红外光谱研究，结果表明同一年份收集的样品所建模型能正确预测本年份的蜂蜜样品中的化学成分含量，而用某一年份的模型对另一年份的蜂蜜样品进行预测时，除水分外，果糖和葡萄糖都不能正确预测；当用三个年份收集的蜂蜜样品建立定量分析模型时，该模型对三个年份收集的蜂蜜样品中的水分、果糖和葡萄糖都能正确预测其含量。因此，作者建议建立校正模型时，校正集应包括不同年份收集的样品，才能提高模型的适应性。2002年，Garcia．AlvarezM 中南林业科技大学博二l：学位论文等人[1331又对这三个不同年份收集的蜂蜜样品的蔗糖含量进行近红外光谱分析，用改进的偏最d"-乘法(mPLS)建立的模型不能正确预测蔗糖含量，作者认为原因是校正集样品和验证集样品中蔗糖浓度范围太小，当增大样品集蔗糖浓度范围时，所建模型能准确预测蔗糖含量。2007年，RuoffK等人【134】在4000--．10000cm‘1的近红外光谱区域内，采用PLS建模，对蜂蜜24个理化参数值进行研究，结果表明模型对水分、葡萄糖、果糖、蔗糖、总单糖以及果糖／葡萄糖比、葡萄糖／水比有满意的预测结果，而对羟甲基糠醛、脯氨酸、pH值、电导率、游离酸、松二糖、黑糖、茧蜜糖、异麦芽糖、曲二糖、松三糖、蜜三糖、龙胆二糖、蜜二糖和麦芽三糖的预测结果不可靠。近年，国内科学工作者在NIRS检测蜂蜜理化参数上做了部分工作。陈兰珍等【135’1361利用近红外光谱结合PLS法建模，预测蜂蜜中果糖、葡萄糖和还原糖含量，预测值与化学测定值之间无显著差异。张欣等【1371对蜂蜜中还原糖进行NIRS检测，光谱经多元散射校正(MSC)后，PLS法建模，模型的交互验证决定系数和交互验证均方差分别为1．36和O．9627。屠振华等【1381采用近红外光谱结合PLS法建模，对蜂蜜的水分、葡萄糖和果糖含量进行预测，相关系数分别为O．9785、O．9311和O．8907，预测均方差分别为0．4108％、1．9144％矛12．5319％。屠振华等[1391的研究还发现：采用NIRS测定蜂蜜中葡萄糖含量时应尽量采集短波区、长光程的光谱，或者对全谱区、短光程的光谱进行特征波长的提取，避开水分的干扰，从而提高预测精度；对果糖含量的测定则应尽量采集全谱区、短光程的光谱；采用PLS法就能得到较好的预测结果，支持向量机(SVM)模型不能明显提高模型预测能力。1．3．2蜂蜜品种鉴别研究进展据不完全统计，我国能被蜜蜂利用的蜜源植物约5000种以上，能取到商品蜜的蜜源植物有100多种【1401。花期较长、生长集中、分泌花蜜较多的蜜源植物生产出的蜜主要有油菜蜜、荆条蜜、苹果蜜、椴树蜜、荔枝蜜、紫云英蜜、乌桕蜜、桂圆蜜、向日葵蜜、柑橘蜜、棉花蜜、枣花蜜、芝麻蜜和杂花蜜等，其中有些蜜种国外少有，有些蜜种为某些地区特有，如东北的椴树蜜，南方的龙眼蜜、荔枝蜜，北方的枸杞蜜。益母草、野菊花、党参、五味子和枸杞等特种蜜，因资源破坏严重，产量少。蜂蜜品种不同，色泽、口感和功能性成分会有所差异，因而价格也不同。蜂蜜品种的鉴别方法很多，主要有下列方法。1．3．2．1感观鉴别和花粉鉴别 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究感观鉴别由有经验的专家通过颜色、气味、状态、滋味等感观特性进行鉴别，但蜂蜜的这些特性在贮藏、加工和结晶过程中会发生变化，因此，感观鉴别存在很大的不确定性。天然蜂蜜中含有相应蜜源植物的花粉，对蜂蜜进行稀释、离心，在显微镜下观察花粉的形态和数量，可鉴别蜂蜜品种。花粉鉴别是国内外鉴别蜂蜜品种的较常用方法，具有良好的重复性。但由于蜜源植物繁多，气候、地域、环境等各有差异，从而造成花粉形态各异，且观察角度的不同也会影响花粉形态的确定，所以该法存在一定的不确定性。1．3．2．2理化参数鉴别单一的理化参数分析鉴别蜂蜜品种的准确度差，用化学计量学方法与常规理化分析相结合可用于分类不同品种的单花蜜。Devillers等【141l根据蜂蜜的pH值、电导率、游离酸度、果糖、葡萄糖和棉子糖含量结合逐步回归分析预测蜂蜜品种，结果较好。Saric等【1421通过测定蜂蜜的11种物化参数结合聚类分析和主成分分析法(PCA)对8种不同植物来源的蜂蜜进行了识别。Corbella等【1431用PCA和线性判别分析法(LDA)结合花粉分析来识别蜂蜜品种，对不同品种蜂蜜的识别正确率在66一-"100％之间。1．3．2．3色谱法国外许多研究报道，通过色谱技术分析蜂蜜中的多酚、有机酸、挥发性成分、氨基酸等，可鉴别蜂蜜的品种。迄今为止，在蜂蜜中已鉴定出约600种挥发性化合物。Aliferis等【144】用顶空萃取挥发性成分，再用气相色谱．质谱法(GC．MS)分离检测挥发性成分，结合多元统计判别分析，进行了蜂蜜品种的鉴别。Tomfis．Barberfin等【145】的研究证实，用HPLC法检测蜂蜜中的黄酮类化合物，如生松素醇、柯因、高良姜素、芹菜素、槲皮素和莰菲醇，可作为单花蜜的特征标记。1．3．2．4光谱法蜂蜜中所含的多酚和氨基酸有强烈的荧光团，可用于鉴别蜂蜜品种，如橙皮素为柑橘蜜的特征氨基酸，苯基丙氨酸和酪氨酸为熏衣草蜜的特征氨基酸，色氨酸和谷氨酸有助于区分花蜜和甘露蜜。Rebane等【146】用HPLC．紫外光谱(Uv)法分析蜂蜜中的游离氨基酸含量，同时结合PCA法鉴别蜂蜜品种，认为其中的12种氨基酸在鉴别蜂蜜植物来源上起着非常重要的作用。Karoui等[1471用荧光光谱结合判别分析法鉴别蜂蜜品种，校正集正确识别率为100％，验证集为90％。蜂蜜的中红外光谱能提供明显的特征吸收带，常用于蜂蜜品种鉴别。Ruoff等【148】采集蜂蜜的中红外光谱，同时结合PCA和LDA鉴别蜂蜜品种和地理来源，误判 中南林业科技大学博士学位论文率在O．1～8．3％之间。Bertell等【1491和Etzold等【1501都利用中红外漫反射光谱结合多元统计分析方法进行了蜂蜜品种鉴别，结果很好。1．3．2．5其它Schievano等【”l】用核磁共振技术结合化学计量学方法分析蜂蜜的氯仿提取物，对板栗蜜、油菜蜜、椴树蜜和多花蜜进行品种鉴别，判别正确率达到100％。Kropf等【152】通过蜂蜜中碳和氮同位素分析，对产自斯洛文尼亚的7个品种蜂蜜进行了植物来源鉴别。Latorre等1153】通过蜂蜜中的矿物质含量结合多元统计分析成功地鉴别了产自西班牙西北部的不同品种蜂蜜。1．3．2．6NIRS在蜂蜜品种鉴别上的应用研究进展Davies等【154】利用NIRS鉴别洋槐蜜、板栗蜜、石楠蜜、油菜蜜，得到了较好的分类效果，洋槐蜜和油菜蜜组成的样品集能很好地与板栗蜜与石楠蜜组成的样品集区分开来。Corbella等【155】报道了可见／近红外光谱用于分类乌拉圭蜂蜜品种，对来自桉树和牧草的50个蜂蜜样品进行分析，比较了PCA、偏最d"--乘判别分析法(PLSDA)和LDA法模型的分类结果，结果显示用PLSDA和LDA分类较准确，超过75％的牧草蜜和超过85％的桉树蜜能被正确分类。Ruoff等【156】利用NIRS对包括洋槐蜜、阿尔卑斯玫瑰蜜、冷杉甘露蜜、板栗蜜、蒲公英蜜、石楠蜜和油菜蜜以及多花蜜在内的蜂蜜进行了品种鉴别，应用PCA和LDA分别进行品种判别，结果表明NIRS能有效地从其它单花蜜和多花蜜中判别洋槐蜜、板栗蜜和冷杉甘露蜜，当把其它不能正确判别的5种蜂蜜归为一类时，LDA也能正确进行判别，实验结果还表明NIRS能正确判别花蜜和甘露蜜。国内杨燕等[157]报道了利用NIRS鉴别蜂蜜品种，用BP．ANN法建模，识别紫云英蜜、洋槐蜜、椴树蜜和野菊花蜜，预测正确率达100％。1．3．3NIRS在蜂蜜产地及品牌鉴别上的研究进展相对蜂蜜的品种和真伪来说，人们一般不太注重蜂蜜的产地和品牌，因此有关这方面的研究报道甚少。本文仅就NIRS在蜂蜜产地和品牌鉴别上的研究进展进行综述。Woodcock等【158】对分别来自爱尔兰、墨西哥和西班牙的未过滤蜂蜜和分别来自爱尔兰、阿根廷、捷克和匈牙利的过滤蜂蜜进行了研究。结果表明来自爱尔兰、墨西哥和西班牙的未过滤蜂蜜，簇类的独立分析法(SIMCA)模型对这三个产地的正确分类率分别为95．5％、94．4％和96％，而二阶微分结合PLSDA模型正确分类率都达到100％；对来自爱尔兰、阿根廷、捷克和匈牙利的过滤蜂蜜，SIMCA模型正确分类率分别为96％、91．7％、100％矛I]100％，而二阶微分 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究结合PLSDA模型正确分类率分别为100％、96％、100％矛1]100％。而Davies等【l”】在近红外光谱区域分别用PCA和典型变量分析法(CVA)却不能准确判别分别产自法国、德国和意大利的蜂蜜。邵咏妮等【1591利用可见／近红外光谱技术对蜂蜜品牌进行鉴别，结果表明独立组分人工神经网络(IC．ANN)分析方法优于主成分人工神经网络(PC．ANN)法，模型对三个品牌的鉴别正确率达到100％。1．3．4蜂蜜掺假检测研究进展1．3．4．1感观鉴别和花粉鉴别感观鉴别是根据蜂蜜的色、香、味、黏度、绵性等感观特性鉴别蜂蜜真伪。蜂蜜在贮藏、加工、结晶等过程中，感观特性会发生变化，而且随着各种食品色素、蜂蜜香精和增稠剂的使用，使得蜂蜜掺假、制假花样繁多、情况复杂、技术水平越来越高，因此仅凭感观分析已很难鉴别蜂蜜真伪。天然蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜酿造而成，含有相应植物的花粉颗粒，通过显微技术观察蜂蜜中的花粉形态、数量可对蜂蜜真伪进行鉴别【1601。但由于蜜蜂采蜜方式、蜜源植物、放蜂环境、季节、地域等多因素的影响，花粉鉴别存在较大的不确定性。1．3．4．2理化参数鉴别蜂蜜的理化参数包括水分、碳水化合物、淀粉酶值、羟甲基糠醛(HMF)、酸度、电导率、pH值、密度、粘度、流变性、色泽等。通过测定这些参数，可对蜂蜜进行品质控制或真伪的初步判断。蜂蜜中掺入了糖类物质后，其密度、粘度和流变性会发生一些变化，通过测定这些物理量，可对蜂蜜真伪进行初步判断[16H。蜂蜜的色泽从水白色、浅黄色、黄色、琥珀色到深色不等，不同品种的蜂蜜色泽不同，若蜂蜜存在掺假或造假，色泽会有所不同，但天然蜂蜜色泽会随贮藏时间的延长而变化，而且由于合成色素的使用，使得从色泽判断蜂蜜真伪变得不可靠。天然蜂蜜中含有许多微量元素，同时含有有机酸和其它可电离物质，因此具有一定的酸度和电导率，假蜂蜜中不含这些成分或者含量降低，因此，天然蜂蜜与假蜂蜜在酸度和电导率上存在差别。不同种类的蜂蜜都有相对稳定的旋光度，一般为左旋，当掺入不同糖类后，蜂蜜的旋光度会发生变化，甚至变为右旋，由此可判断蜂蜜中是否掺有糖类【1621。蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量及果糖／葡萄糖比在鉴别蜂蜜真伪上有一定应用，尤其是多糖的检测有利于对蜂蜜用转化糖掺假的鉴别‘163】。有研究【164。1651表明天然蜂蜜中的淀粉酶来源于蜜蜂，而不是花粉或花蜜，是一种动物淀粉酶，为蜂蜜中特19 中南林业科技大学博士学位论文有的成分，这种淀粉酶受热易分解，假蜂蜜中的淀粉酶为工业淀粉酶，具有耐高温、高活性、稳定等特点，通过测定蜂蜜中淀粉酶的稳定性和活性可鉴别蜂蜜真伪【1鲫。假蜂蜜中，一般都含有HMF，新鲜天然蜂蜜中不含HMF，Sanz等【167】通过测定HMF的存在及含量来鉴别蜂蜜真伪，但如果天然蜂蜜贮藏不当或贮藏时间长，也会存在HMF，且含量会随贮藏温度的升高和贮藏时间的延长而增大。天然蜂蜜中存在某些氨基酸，氨基酸组成和含量与蜜源植物有关。掺假蜂蜜中的氨基酸含量会降低，全假蜂蜜中不含氨基酸。Cotte等【168】通过对蜂蜜中氨基酸的种类和含量测定鉴定蜂蜜的品种和真假。1．3．4．3稳定同位素比率质谱法(IRMS)高等植物由于不同光合作用途径而在碳稳定性同位素固定上具有显著的生物歧视效应，其13C／12c比值在不同类别植物中不同。大多数蜜源植物属于碳．3植物，而碳．4植物基本上不是蜜源植物，而用于蜂蜜掺假的糖和糖浆一般都是通过玉米、甘蔗等碳．4植物淀粉转化而来，因此，通过测定蜂蜜中稳定碳同位素率就能鉴别蜂蜜是否掺入碳．4植物糖。Simsek等【169】利用元素分析仪．稳定同位素比率质谱仪(EA．IRMS)对蜂蜜掺假进行了鉴别。Cabanero等【l。70】利用液相色谱一同位素比率质谱法(LC．IRMS)对蜂蜜用甜菜糖、甘蔗糖、甘蔗糖浆、异葡萄糖糖浆和高果玉米糖浆掺假进行了鉴别。IRMS能鉴别蜂蜜掺假，尤其对低含量水平掺假有高的准确率，但是这种方法只对天然蜂蜜中掺入碳．4植物糖有效，如果蜂蜜中掺入利用水稻、小麦、大豆等碳．3植物淀粉制备的糖类成分则难以鉴别。1．3．4．4色谱法天然蜂蜜中含有来自植物和蜜蜂的某些特殊成分，如植物挥发性成分、植物次生代谢产物、蜜蜂的分泌物等，通过检测这些特殊成分的存在和含量，可鉴别蜂蜜真伪。Ruiz．matute等【l71】用GC法对蜂蜜中掺入高果糖浆进行了检测。Low等【172】利用二糖和三糖的气相色谱指纹图谱鉴别蜂蜜是否用转化糖掺假。Sanz等【l乃J利用GC．MS通过对蜂蜜中的16种二糖和9种三糖进行定性和定量检测鉴别蜂蜜是否用糖浆掺假。CotteJF等【168】利用HPLC技术对蜂蜜掺假进行鉴别，在油菜蜜和冷杉蜜中掺入糖浆，通过对其中氨基酸含量的分析可进行蜂蜜中掺入HFCS的鉴别。CordeliaC等【174】利用高效阴离子交换色谱．脉冲电流检测法(HPAEC．PAD)对蜂蜜利用糖浆掺假进行了初步研究，利用LDA鉴别蜂蜜真伪，利用PLS进行掺假量测定，获得了好的结果。MoralesV等【175】利用HPAEC．PAD法对蜂蜜用玉米糖浆和HFCS掺假进行了研究，结果表明通过对天然蜂蜜与掺假蜜中寡糖的分析，可对蜂蜜真伪进行鉴别。20 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究1．3．4．5光谱法Paradkar等【176J利用FT拉曼光谱对蜂蜜用甘蔗转化糖浆和甜菜转化糖浆掺假进行了研究，对同一样本掺假的定性判别结果和掺假量的定量分析结果都较好。Sivakesava等‘177’1791和Kelly等‘180m11利用中红外光谱技术对蜂蜜用葡萄糖溶液、果糖溶液、蔗糖溶液、转化甜菜糖浆、HFCS、部分转化甘蔗糖浆、葡萄糖糖浆掺假进行了研究，得到了较好的结果。此外，荧光光谱也可用于蜂蜜掺假的检测，尹春玲等[182]用荧光光谱结合主成分分析鉴别真蜂蜜与掺假蜜，结果满意。1．3．4．6其它方法Bertelli等[183]用高分辩率的NMR光谱结合多元统计判别分析法对蜂蜜用7种糖浆掺假进行了研究，判别正确率可达95．2％。Cordelia掣184】利用差热扫描量热法(DifferentialScaningCalorimetry，DSC)对蜂蜜用糖浆掺假进行了研究，利用天然蜂蜜与糖浆在热参数上的差异，可检测天然蜂蜜中是否掺入了糖浆。1．3．4．7NIRS在蜂蜜掺假鉴别上的研究进展NIRS在蜂蜜真伪鉴别上的研究甚少，国外Downey和Kelly在这方面做了某些工作。Downey等[J85]用NIRS对蜂蜜用果糖和葡萄糖溶液掺假进行了研究。分别配制葡萄糖与果糖质量比为0．7：1、1．2：1和2．3：1的掺假溶液，每一种掺假溶液分别按质量百分比为7％、14％和21％掺入真实蜂蜜中，得到掺假蜂蜜，分别用PLSDA、K．最临近距离法(K．NN)和SIMCA进行真假蜜判别，结果表明PLSDA为最优方法，真蜂蜜判别正确率为84％，假蜂蜜判别正确率为99．6％。Kelly等¨86J利用NIRS对蜂蜜用甜菜转化糖浆和HFCS掺假进行研究，采用SIMCA定性判别，PLS对掺假量进行定量预测，定性判别结果较好，定量预测结果不理想。MishraS等[187]用NIRS对蜂蜜中掺入椰子糖糖浆进行了研究，结果表明该技术能实现对蜂蜜中掺入椰子糖糖浆的无损快速检测。国内，仅陈兰珍等【188】对蜂蜜真伪进行了近红外光谱研究，PLSDA模型对蜂蜜中掺入HFCS的判别结果较好。1．4课题的主要研究内容及技术路线1．4．1主要研究内容(1)蜂蜜近红外光谱采集方式和附件及仪器匹配参数的研究从光谱的重复性、操作的简易性和所建模型的预测能力等方面比较样品杯透反射光谱、薄膜袋透反射光谱和样本池透射光谱的差异，结合仪器状态参数(扫描次数和分辩率)，确定蜂蜜的较佳采谱方式、附件和仪器匹配参数，为蜂蜜质量的NIRS检测 中南林业科技大学博士学位论文打下基础。(2)蜂蜜主要物理化学参数的近红外光谱定量分析模型对反映蜂蜜质量的12个主要的物理化学参数：水分、可溶性固形物含量、总酸度、pH值、电导率、还原糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖／葡萄糖比(果／葡)和葡萄糖／水比(葡／水)进行NIRS定量分析研究。(3)蜂蜜品种的近红外光谱定性判别方法取5个较常见品种蜂蜜，利用NIRS对蜂蜜品种进行定性判别研究。(4)小波变换在近红外光谱技术判别蜂蜜产地中的应用分别取同一品种不同产地的蜂蜜，采用小波变换进行光谱数据的压缩和去噪，利用非线性和线性建模方法分别对蜂蜜产地进行判别分析。(5)蜂蜜中掺入食用糖浆的近红外光谱检测方法分别用常见的三种食用糖浆(高果玉米糖浆、甜菜糖浆、麦芽糖浆)掺入真蜂蜜样本中，对蜂蜜真伪及掺假物类型进行近红外光谱定性判别研究，并对掺假量进行定量分析研究。(6)最／,bz乘支持向量机算法和近红外光谱法鉴别蜂蜜中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液将果糖和葡萄糖的混合溶液掺入真蜂蜜样本中，用最／j,-乘支持向量机算法对蜂蜜真伪进行鉴别研究。1．4．2技术路线模型的建立与评价按图1．2的检测流程进行。近红外光谱定量分析中，各理化参数值的常规测定方法分别为：(1)水分：按SN／T0852．2000中3．4的方法(40℃恒温)测定；(2)可溶性固形物含量：阿贝折光仪测定；(3)pH值：pH计测定；(4)酸度：用0．05mol／L的NaOH溶液按SN／T0852．2000中3．5的方法测定；(5)电导率：电导率仪测定；(6)还原糖：按SN／T0852—2000中3．8．2的方法(铁氰化钾法)测定；(7)葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖：按GB／T18932．22．2003的方法(液相色谱示差折光检测法)测定。 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究2蜂蜜近红外光谱采集方式和附件及仪器匹配参数的研究获取稳定可靠的样本近红外光谱是NIRS成功应用的先决条件。近红外光谱仪采集光谱的方式一般有三种：透射方式、漫反射方式和透反射方式。均匀透明的液体样本，受光照射时，只对光产生吸收，不产生反射和散射，可采用透射方式采集光谱，检测器检测的是承载了样本组成和结构信息的透射光或与样本内部分子相互作用后的光。固体或粉未样本，受光照射时，极易对光产生反射和散射，～般采用漫反射方式采集光谱，检测器检测的是入射光与样本表面或内部作用后以各种方式反射回来的光，同样承载了样本信息。黏稠、半透明、流动性差的样本，样本中各种成分往往形成复杂的分散体系，其中包括真溶液、高分子溶液、胶体悬浮液、乳浊液及其过渡状态的分散体系，当受一束平行光照射时，除对光产生吸收外，还产生散射，一般考虑采用漫反射或透反射方式采集光谱，也可用透射方式。蜂蜜是一种黏稠而高度复杂的糖类混合物，呈透明或半透明状态，目前透反射方式和透射方式采集蜂蜜近红外光谱均有报道f134,135,157,185】。采用透反射方式时，检测器检测的是光线透过样本后经另一侧的金箔反射板反射回来的光，光线两次通过样本，光程是样本厚度的两倍，包含了更加丰富的样本信息，而透射方式采集的光谱信号往往包含的样本信息较弱。扫描次数和分辨率是进行近红外光谱采集时必须设定的两个重要参数。扫描次数是指一个样本一次光谱采集过程中光谱仪采样的次数。扫描次数增大，可提高分析信号的信噪比，从而改善近红外分析结果，但会延长扫描时问，增加仪器的系统误差；扫描次数少，可节省扫描时间，得到的光谱曲线光滑。分辨率表明单色器对两条相邻谱线的分辨能力。分辨率越大，采集的数据点越多，光谱的信息越丰富，完成一次光谱采集的时间也越长，噪声也增加，同时还会增大谱图所占空间，增大数据量和计算量。因此，在保证光谱质量的前提下，应尽量减少扫描次数和选择较低的分辨率。2．1蜂蜜近红外光谱采集方式和附件的确定2．1．1采集方式和附件使用AntarisII型傅里叶变换近红外光谱仪(美国TherrnoNicolet公司)及仪器配备的TQ软件采集和保存光谱。样品杯和金箔反射板为丹麦FOSS公司的近23 中南林业科技大学博士学位论文红外光谱仪配件，薄膜袋和样本池(直径为O．5cm的玻璃比色皿)为AntarisII型近红外光谱仪白配。图2．1为傅里叶变换近红外光谱仪及使用的采样附件。分别用三种方式采集同一蜂蜜样本的近红外光谱：样品杯透反射方式、薄膜袋透反射方式和样本池透射方式。光谱采集条件均为：扫描范围10000,～,4000cm～，分辨率8cln‘1，增益2，扫描次数32，以空气为背景，每隔1小时扫描一次背景。AntarisII型傅里叶变换近红外光谱仪◆◆一FOSS样品杯及金箔及射极附什架薄膜袋图2．1AntarisII傅里叶变换近红外光谱仪及采谱附件Fig．2．1AntarisIIFT-NIRandcollectionaccessory2．1．1．1样品杯透反射方式AntarisII型傅里叶变换近红外光谱仪自带的样品杯仅适合于固体或粉未样品的光谱采集。因此，我们选用丹麦FOSS公司提供的近红外光谱仪配件：样品杯(部件号：10013857)和金箔反射板(部件号：10013156，可控制样品厚度为0．1mm)。图2．2为样品杯透反射方式采集样本光谱的示意图。具体操作如下：将约lOg溶解晶体后的蜂蜜倒入样品杯内，合上金箔反射板，将样品杯置于仪器样品窗口，采用积分球透反射方式采集光谱，通过适当移动样品杯在窗口的位置进行5次重复采集。 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究金箔反射板样品窗口图2．2样品杯透反射方式测量示意图Fig．2．2Adiagramoftransflectancemodeusingsamplecup2．1．1．2薄膜袋透反射方式AntarisII型傅里叶变换近红外光谱仪可用薄膜袋采集液态或黏稠样本的透反射光谱。图2．3为薄膜袋透反射方式采集样本光谱的示意图。具体操作如下：将约109溶解晶体后的蜂蜜装入薄膜封I=1袋内，将薄膜袋置于样品窗口上方的附件架上，用附件架上的金箔反射板(可控制样本厚度为0．1mm)压紧，采用积分球透反射方式采集光谱，通过适当移动薄膜袋在窗口的位置进行5次重复采集。附件架积金箔反射板样品窗口图2．3薄膜袋透反射方式测量示意图Fig．2．3Adiagramoftransflectancemodeusingthinfilmsamplebag25 中南林业科技大学博士学位论文2．1．1．3透射方式用胶头滴管将少量溶解晶体后的蜂蜜加入样本池中，将样本池放入透射附件架内，采用透射方式采集样本光谱，每采集完1次光谱，重新装样，进行5次重复采集。图2．4为透射方式采集样本光谱的示意图。o一口光源干涉仪一口一口样本池检测器图2．4透射方式示意图Fig．2．4Adiagramoftransmissionmode2．1．2不同采集方式的比较2．1．2．1操作的简易性(1)样品杯透反射方式：装样快速，不易产生气泡，但每采集完一个样本，样品杯和金箔都需用自来水洗净，再用蒸馏水润洗，然后冷风吹干，才能进行下一个样本的光谱采集，对于蜂蜜这种黏稠难于清洗的样本，会比较耗时。连续采集多个样本的光谱时，包括样品杯的清洗时间在内约6min完成一个样本的光谱采集。样品杯和金箔反射板价格昂贵。(2)薄膜袋透反射方式：装样快速，每采集完一个样本都更换新的薄膜袋，无需清洗，速度较快，约3min完成一个样本的光谱采集。但金箔挤压样本的过程中极易产生气泡，引起光散射和影响光程的稳定性，从而影响光谱质量。薄膜袋为一次性使用，消耗量会较大。(3)透射方式：由于蜂蜜粘度大，往样本池(直径为O．5cm的玻璃比色皿)内加样不易操作，样本池的清洗和干燥也不方便，所以，透射光谱的采集过程比前面两种透反射方式更加耗时。样本池价格便宜，且可重复使用。2．1．2．2光谱的重复性图2．5(A)、(B)和(C)分别为样品杯透反射方式、薄膜袋透反射方式和透射方式下5次重复采集的近红外光谱。图2．6为3种不同采集方式下5次重复采集的相对标准偏差光谱。 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究《o字■《o∞o一《o警■Wavenumbers(cm．1)Wavenumbers(cml)图2．5蜂蜜样本5次重复测量光谱：(A)样品杯透反射方式；(B)薄膜袋透反射方式；(C)透射方式Fig．2．5Spectraofhoneysampleforfive-timesrepeated：(a)transflectancemodewithsamplecup；(b)transflectancemodewiththinfilmsamplebag；(c)transmissionmode27 中南林业科技大学博士学位论文／、鬟V剂莲翅嚣靛黑Wavenumbers(cm-。)图2．6不同采集方式下的相对标准偏差光谱Fig．2．6Therelativestandarddeviationofspectrausingdifferentcollectingmethods从图2．6可以看出，三种采集方式，以薄膜袋透反射方式的相对标准偏差最大，其值在1．0727-4．4906％之间，其中4100～7500cm。1波数范围内，相对标准偏差明显高于其它波数处；其次为样品杯透反射方式，其值在O．3760～1．4048％之间，其中7100～10000cm。波数范围内，相对标准偏差略高于其它波数处；透射方式的相对标准偏差最小，其值在0．0245～0．3532％之间。因此，透射方式光谱重复性最好，薄膜袋透反射方式光谱重复性最差。从图2．5直观观察也证实了这一点：样品杯透反射方式和透射方式，重复5次采集的光谱几乎完全重合，光谱稳定，重现性好，而用薄膜袋透反射方式采集的光谱，重复5次采集的光谱相差悬殊，光谱极不稳定，重现性差，因此，不宜采用薄膜袋透反射方式采集蜂蜜光谱。究其原因，样本品透反射方式采用样品杯装样和用金箔反射板控制样品光程，可保证样品内没有气泡和光程稳定：透射方式采用0．5cm的比色皿装样，光程固定，且不易产生气泡；而薄膜袋透反射方式，采用薄膜袋装样和局部挤压的方式控制光程，在挤压过程中，往往会产生较多气泡，极易造成局部不均匀现象，从而影响光谱的重现性和稳定性。因此，从光谱的重复性和稳定性分析，只宜用样品杯透反射方式或透射方式采集蜂蜜近红外光谱，而不宜用薄膜袋透反射方式采集。2．1．3样品杯透反射方式与透射方式的比较样品杯透反射方式和透射方式所采集的光谱都稳定，重复性好，为了比较这两种测量方式，我们取两组样本，每组样本分别用这两种方式采集光谱。第一组样本由132个蜂蜜样本组成，用于建立水分和还原糖含量PLS定量分析模型； 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究第二组样本由49个真蜂蜜样本和49个HFCS掺假蜜样本(掺假量为20％)组成，用于建立真蜂蜜与掺假蜜的PLSDA判别模型。表2．1列出了两种测量方式下，PLS定量校正模型留一交互检验的结果(光谱范围：4000～10000cm～；光谱预处理方法：Norris平滑+一阶微分+MSC)。表2．1PLS定量校正模型留一交互检验结果Table2．1Resultsofleave-one-outcross-validationbyPLS表2．2为两种测量方式下，PLSDA判别模型留一交互检验的结果(光谱范围：4000～10000cm～；光谱预处理方法：一阶微分)。表2．2PLSDA判别模型留一交互检验的结果Table2．2Resultsofleave··one·-outcross—·validationbyPLSDA测量方式交互检验总正确率／％透反射透射69．451．0从表2．1和2．2可以看出，无论是定量校正模型还是定性判别模型，模型交互检验的结果都是透反射方式比透射方式好。说明蜂蜜的透反射光谱比透射光谱包含了更强的样本特征信息。因此，样品杯透反射方式为采集蜂蜜近红外光谱的较合理方式。2．2仪器匹配参数的选择2．2．1扫描次数的选择2．2．1．1不同扫描次数对蜂蜜近红外光谱响应特性的影响选择分辨率为8cm～，在4000～10000cm‘1范围内，对同一蜂蜜样本，采用样品杯透反射方式分别选择扫描次数为16、32和64次采集近红外光谱，每个扫描次数下都平行5次采集，取平均光谱。图2．7为3个不同扫描次数下的平均光谱。图2．8为平均光谱的相对标准偏差光谱。直观观察图2．7，3条光谱几乎完全重合，同一波长处的吸光度值没有明显 中南林业科技大学博士学位论文差异；从图2．8也可观察到不同扫描次数之间吸光度值的相对标准偏差很小，在0．2217～0．7059％之间。因此，扫描次数对蜂蜜近红外光谱响应特性没有明显影响。Wavenumbers(cra"1)图2．7不同扫描次数下的蜂蜜光谱Fig．2．7Spectraofhoneysamplewithdifferentscanningfrequency／、享＼-，制堡拱蜂靛口Wavenumber(clIfl)图2．8不同扫描次数下的相对标准偏差光谱Fig．2．8Therelativestandarddeviationofspectrawithdifferentscanningfrequency2．2．1．2不同扫描次数对模型预测精度的影响取两组样本：第一组含50个真蜂蜜样本，用于建立水分定量分析模型；另一组含49个真蜂蜜样本和49个HFCS掺假蜜样本(20％掺假量)，用于建立真蜂蜜与掺假蜜定性判别模型。采用样品杯透反射方式分别选择扫描次数为16、32和64次采集近红外光谱，每个扫描次数下平行3次光谱采集，取平均光谱为样本光谱，考察不同扫描次数对模型预测精度的影响。用第一组样本建立水分PLS定量校正模型(光谱范围：4000～10000cm～；光谱预处理方法：Norris平滑+一阶微分+MSC)；用第二组样本建立真假蜂蜜的PLSDA定性判别模型(光谱范围：4000～10000cm～；光谱预处理方法：一阶微分)。采用留一交互验证法检30 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究验模型的预测精度。结果见表2．3。从表2．3可以看出：水分定量校正模型留一交互检验的结果以扫描次数为32次略好，而真假蜂蜜定性判别模型留一交互检验的结果以64次略好；除16次扫描结果略差外，32次和64次扫描的结果接近。因此，扫描次数对这两个模型的预测结果影响都不大。综合考虑，选择32次为后续实验的扫描次数。表2．3不同扫描次数下模型留一交互检验结果Table2．3Resultsofleave·-one-·outcross-·validationwithdifferentscanningfrequency2．2．2分辨率的选择2．2．2．1不同分辨率对蜂蜜近红外光谱响应特性的影响扫描次数为32次，在4000～10000cm。范围内，对同一蜂蜜样本，采用样品杯透反射方式分别选择分辨率为4cm一、8cm。1和16cm‘1采集近红外光谱，平行3次采集，取平均光谱。图2．9显示了不同分辨率下的平均光谱。由于分辨率不同，组成光谱的数据点不同(分辨率4cm～、8cm。1和16cmJ下的数据点分别为3112、1557和778)，因此，我们将4000～10000cm。1范围分成6个波段，计算各波段吸光度平均值，然后求不同分辨率下各波段吸光度平均值的相对标准偏差，结果见表2．4。Wavenumbers(era"1)图2．9不同分辨率下的蜂蜜光谱Fig．2．9Spectraofhoneysamplewithdifferentresolutions3l 中南林业科技大学博二L学位论文表2．4不同分辨率下的相对标准偏差Table2．4Relativestandarddeviationofspectrawithdifferentresolutions从图2．9直观观察，不同分辨率下扫描得到的光谱几乎完全重合，说明同一波长处的吸光度值没有明显差异；表2．4的结果也表明，3个分辨下6个不同波段范围的相对标准偏差都很小，在0．2470～0．8404％之间。因此，分辨率大小对蜂蜜近红外光谱的响应特性影响不明显。2．2．2．2不同分辨率对模型预测精度的影响用2．2．1．2中相同的蜂蜜样本，选择扫描次数为32次，采用样品杯透反射方式，选择分辨率分别为4cm～、8cm～、16cm一采集光谱。用第一组样本建立水分PLS定量校正模型(光谱范围：4000～10000cm～；光谱预处理方法：Norris平滑+一阶微分+MSC)；用第二组样本建立真假蜂蜜的PLSDA定性判别模型(光谱范围：4000～10000cm一；光谱预处理方法：一阶微分)。采用留一交互验证法检验模型的预测精度。结果见表2．5。表2．5不同分辨率下模型留一交互检验的结果Table2．5Resultsofleave．one．outcross．validationwithdifferentresolutions表2．5的结果表明：当分辨率取8cm。1时，水分定量校正模型的预测结果略好，而分辨率取8cmJ和16cm一，真假蜂蜜交互验证总正确率相同，都为69．4％；三个分辨率下，蜂蜜定量校正模型和定性判别模型的交互检验结果没有明显差 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究异。综合考虑，选择分辨为8cm。为后续实验的仪器分辨率。2．3本章小结研究了薄膜袋透反射方式、样品杯透反射方式和样本池透射方式下，所采集的蜂蜜近红外光谱的重复性，通过对光谱的相对标准偏差的分析，表明薄膜袋透反射方式采集的光谱重复性差，而样品杯透反射方式和样本池透射方式采集的光谱重复性好。进一步比较后两种采集方式下采集的光谱所建模型的预测性能，表明样品杯透反射方式采集的光谱比样本池透射方式采集的光谱包含了更丰富的样本特征信息，所建模型预测性能更好。因此，确定样品杯透反射方式为蜂蜜近红外光谱采集的较合理方式。研究了扫描次数和仪器分辨率对蜂蜜近红外光谱响应特性的影响，结果表明扫描次数为16、32或64次，或者分辨率为4cm～、8cm。1和16cm以下采集的蜂蜜近红外光谱没有明显差异；分别用这3个扫描次数或3个分辨率下采集的光谱建立定量分析和定性判别模型，除扫描次数为16次或者分辨率为4cm‘1下采集的光谱，所建模型预测性能略差外，其它两个扫描次数或者分辨率下采集的光谱，所建模型的预测性能都无明显不同。综合考虑采谱时间、光谱质量和模型的预测能力，最终确定扫描次数选择32次，仪器分辨率选择8cm～。 中南林业科技大学博士学位论文34 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究3蜂蜜主要物理化学参数的近红外光谱定量分析模型蜂蜜是一种成分复杂的天然保健食品，主要成分是葡萄糖和果糖，约占蜂蜜质量的70％，其它成分还包括水分、蔗糖，麦芽糖及其它各种低含量的糖类物质(如异麦芽糖、麦芽三糖、蜜二糖、曲二糖、龙胆二糖、海藻糖和棉子糖等)，蛋白质、氨基酸、矿物质和类黄酮在蜂蜜中的含量也很低。以上这些物质是蜂蜜具有重要营养价值和特殊保健作用的主要组成成分。蜂蜜中的可溶性固形物含量(SolubleSolidsContent，SSC)主要是还原糖含量，而还原糖主要包括葡萄糖和果糖，约占总糖的85～95％。(蜂蜜)国家标准(GB18796．2005)对蜂蜜中的葡萄糖和果糖含量有强制性要求：葡萄糖和果糖含量不得低于60％。水分是蜂蜜中除果糖和葡萄糖之外的第三大成分。水分含量高低不仅是评价蜂蜜品质和等级的主要参数，而且标志着蜂蜜的成熟度，也直接影响蜂蜜的保质期。水分含量高的蜂蜜容易因发酵而变质。(蜂蜜)国家标准(GB18796．2005)对蜂蜜中水分含量也有强制性要求：一级品蜂蜜不得超过20％，二级品蜂蜜不得超过24％。蜂蜜中的果糖与葡萄糖之比(果／葡)及葡萄糖与水之比(葡／水)对鉴别蜂蜜植物来源具有参考价值‘1341。蜂蜜贮藏期间是否易于结晶除与温度、是否存在晶种及贮藏条件等因素有关外，还与果／葡和葡／水有关：果／葡大于1．3的蜂蜜结晶缓慢或不结晶；葡／水小于1．7的蜂蜜不结晶，在1．7～2．0之间的蜂蜜结晶缓慢，大于2．1的蜂蜜易于结晶【1341。pH值是描述氢离子活度的参数，与蜂蜜中已离解的酸的浓度有关。蜂蜜的pH值可作为区分花蜜和甘露蜜【107,1121以及判断单花蜜是否真型1891的一个重要参数。总酸度是指中和100g蜂蜜试样所需lmol／L氢氧化钠溶液的毫升数。蜂蜜总酸度反映了蜂蜜中酸性物质含量的高低，是衡量蜂蜜是否发酵的重要参数【981，也是区分花蜜和甘露蜜的一个重要参数‘1121。蜂蜜中的酸性物质包括有机酸和无机酸，有机酸有葡萄糖酸、乳酸、醋酸、丁酸、甲酸和苯甲酸等，无机酸有磷酸和盐酸等，这些物质形成蜂蜜特殊的口味、酸度、抗菌和抗氧化能力【190】。我国(蜂蜜)国家标准(GB18796．2005)规定蜂蜜总酸度不得大于40(1mol／L氢氧化钠)mL／kg[981。 中南林业科技大学博士学位论文电导率是体现溶液传导电流能力的物理量。蜂蜜的电导率一定程度上反映了蜂蜜中矿物质含量的高低‘10刀。矿物质主要来源于花蜜，与蜜源植物及其生长地的环境气候和土壤特性等因素有关，可作为区分花蜜和甘露蜜【107,191]及区分蜂蜜植物来源和产地【1921的参数。本章利用NIRS对蜂蜜的12个主要物理化学参数进行定量分析研究。这12个物理化学参数包括水分、SSC、pH值、总酸度、电导率、还原糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果／葡和葡／水。3．1材料和方法3．1．1主要仪器及设备AntarisII傅里叶变换近红外光谱仪及TQ软件美国ThermoNicolet公司样品杯(部件号：10013857)及金箔反射板(部件号：10013156)丹麦FOSS公司色谱柱(LichrospherNH2柱，10nm×5Irtm，4．6×250mm)江苏汉邦LC．20AT高效液相色谱仪日本岛津RID．10A示差折光检测器日本岛津2WA．J阿贝折光仪上海光学仪器五厂AL2004电子分析天平梅特勒一托利多(上海)有限公司501型超级恒温水浴锅金坛市岸头国瑞实验仪器厂PHS．320pH计(附pH复合电极)成都世纪方舟科技有限公司DDS一11C电导率仪(附电导电极)上海雷磁新泾仪器有限公司3．1．2实验用试剂和蜂蜜样本3．1．2．1试剂氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、盐酸、酚酞、次甲基蓝等都为市售分析纯；蔗糖、D．果糖、葡萄糖、麦芽糖都为美国Sigma公司标准品(纯度芝99％)；乙腈为美国Tedia公司色谱纯；HFCS由湖南润涛生物科技有限公司提供，果糖和葡萄糖含量≥92％；甜菜糖浆由杭州紫香糖业有限公司提供，果糖和葡萄糖含量兰92％；麦芽糖浆由湖南润涛生物科技有限公司提供，麦芽糖含量≥50％；蒸馏水。3．1．2．2蜂蜜样本 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究实验所用蜂蜜样本包括不同年份收集的不同品种和不同产地的真蜂蜜。此外，由于市售蜂蜜存在假蜂蜜，为使样本集具有更好的代表性，样本集中还包含了部分掺假蜜。用于水分、SSC、还原糖、pH值、总酸度和电导率测定的样本集包括122个真蜂蜜样本(其中包括112个未经浓缩处理的原料蜜和10个经浓缩处理后的商品蜜)和12个掺假蜜样本，共134个。真蜂蜜样本包括2008和2009年收集的15个品种(油菜、柑桔、荔枝、洋槐、荆条、枸杞、益母草、野菊花、九龙藤、黄芪、桂圆、枣花、山桂花、老瓜头和苹果)，来自全国10个省区(湖南、湖北、广西、四川、宁夏、贵州、山西、陕西、河南和云南)。掺假蜜分别用麦芽糖浆和HFCS按不同质量比掺假，每种掺假物得到6个掺假样本，共12个。用于果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果／葡和葡／水测定的样本集包括111个真蜂蜜样本(其中包括34个经浓缩处理后的商品蜜和77个未经浓缩处理的原料蜜)、10个蜜蜂喂食蔗糖后酿造的蜂蜜样本和30个掺假蜜样本，共151个。真蜂蜜样本包括2008、2009和2010年收集的16个品种(荆条、柑橘、桂圆、洋槐、荔枝、益母草、枸杞、九龙藤、黄芪、枣花、野菊花、山桂花、油菜、老瓜头、苹果和多花蜜)，来自全国10个省区(湖南、湖北、广西、广东、四川、宁夏、贵州、山西、陕西和云南)。掺假蜜分别用麦芽糖浆、甜菜糖浆和HFCS按不同质量比掺假，每种掺假物得到10个掺假样本，共30个。本实验蜂蜜样本来源广、品种多、包含了不同年份收集的蜂蜜，既有真蜂蜜又有掺假蜜，因此，样本代表性强，所建模型具有更好的适应范围。蜂蜜收集后，贮藏在6-8。C冰箱中。采集光谱时，先将蜂蜜从冰箱内取出，放置至室温，再在55。C水浴下溶解晶体后待光谱采集。3．1．3实验方法3．1．3．1光谱采集在约250C室温下，采用样品杯透反射方式采集近红外光谱，扫描范围4000,、,10000cm一，分辨率8cm’1。，增益2，扫描次数32次，空气为背景，每隔1小时扫描一次背景。每个样本平行采集3次，取平均光谱为样本光谱。每采集完一个样本光谱，样品杯和金箔反射板用自来水洗净后，再用蒸馏水润洗，然后冷风吹干。光谱采集完后，即进行参数值测定。同一批样本，光谱采集和参数值的测定在同一天进行。37 中南林业科技大学博士学位论文3．1．3．2水分和SSC的测定水分：按SN／0852．2000中3．4的方法(40℃恒温)测定；SSC：阿贝折光仪测定。阿贝折光仪校正后，将恒温水浴锅与仪器相连，用玻璃棒蘸取蜂蜜样本两滴于下棱镜上，迅速闭合上下棱镜，等待约半分钟后，从目镜观察，同时调整仪器转动手轮，使视野分成清晰可见的两个明暗部分，其分界线正好穿过十字交叉点，记录读数。水分含量按公式3—1计算，SSC含量从折光仪上直接读取。平行测定两次，取平均值。水分含量计算公式：X=100一[78+390．7∞一1．4768)](公式3．1)式中：X-一样本中的水分含量，％；n——样本在40℃时的折光率3．1．3．3pit值的测定pH计测定。平行测定三次，取平均值。3．1．3．4总酸度的测定颜色较深的蜂蜜，采用SN／T0852．2000中3．5中的方法测定时，终点不易确定，导致误差较大，故将方法作如下修改：准确称取10g左右蜂蜜溶于100mL蒸馏水中，用约0．05mol／LNaOH溶液滴定到pH值为8．3，记录消耗的NaOH体积(毫升)。按公式3．2计算样本总酸度。平行三次测定，取平均值。总酸度计算公式：x：兰兰三×100(公式3-2)m式中：X_一样本的总酸度，％；V_～滴定所消耗NaOH标准溶液的体积，mL；c-—NaOH标准溶液的浓度，mol／L；m——蜂蜜样本的质量，g。3．1．3．5电导率的测定电导率仪测定。平行测定三次，取平均值。3．1．3．6还原糖的测定采用SN／T0852．2000中3．8．2的铁氰化钾滴定法测定。按公式3—3计算还原糖含量。 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究还原糖含量计算公式：x：三兰兰QQQ×100(公式3-3)V×m式中：X_一试样中还原糖含量(以转化糖计)，％；T_滴定度，每10mL1％铁氰化钾溶液相当于转化糖的质量，g；V-一滴定10mL1％铁氰化钾溶液所消耗样液的体积，mL；m——蜂蜜试样质量，g。3．1．3．7果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量的测定采用GB／T18932．22的方法——高效液相色谱示差折光检测法测定。(A)图3．1色谱图：(A)标准品中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖；(B)蜂蜜样品中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖Fig．3．1Chromatograms：(A)fructose，glucose，sucroseandmaltoseinstandards；(B)fructose，glucose，sucroseandmaltoseinhoneysample 中南林业科技大学博士学位论文液相色谱条件：色谱柱：LichrospherNH2柱(10nmx5gin，4．6×250mm，江苏汉邦)；检测器：RID．10A示差折光检测器；流动相：乙腈+水(77+23)；流速：1．0mL／min；柱温：30。C；检测器温度：35。C；进样量：15灶。配制5个不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的系列混合标准工作溶液，按上述液相色谱条件测定含量。准确称取一定质量蜂蜜样本用一级水溶解，用乙腈定容成100mL，用0．45¨m滤膜过滤后按与标准品同样的条件测定。标准品和蜂蜜样品的色谱图见图3．1。按公式3．4计算样品中各种糖的含量。平行测定两次，取平均值。糖含量的计算公式：x：三∑!(公式3-4)m式中：卜样品中被测组分含量，g／100g；c-从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，g／100mL；卜样品溶液定容体积，mL；川——蜂蜜试样质量，g。3．1．4主要化学计量学方法3．1．4．1偏最小二乘算法(PareialLeastSquares，PLS)PLS同时对光谱矩阵X和数值矩阵Y进行分解[1931。具体算法如下：(1)对光谱矩阵x和数值矩阵Y进行分解，其模型为：X=TP士EY=∞+，式中，T和U分别为X和Y的得分矩阵；P和Q分别为X和Y的载荷矩阵；E和F分别为X和Y的PLS拟合残差矩阵。(2)对T和U做线性回归：U=TBB=p7’丁)-1丁7’】，在预测时，首先根据P求出未知样本光谱矩阵X未知的得分T未知，之后由下式得到未知样本的数值预测值：Y未知=T未知BQPLS克服了多元线性回归(MLR)不满秩求逆和光谱信息不能充分利用的弱点‘1941，也与主成分分析法只对光谱矩阵x进行分解不同，它同时还考虑了 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究数值矩阵Y对光谱矩阵X的影响。PLS法的优点在于：对光谱数据可随意选取，既可是全谱，也可是部分谱段或部分变量；消除了变量之间线性相关的问题；考虑到了光谱矩阵与数值矩阵之间的内在联系，建立的模型更为稳健；适合于复杂体系的分析。PLS算法由中南大学中药现代化研究中心提供，在Matlab7．0中实现。3．1．4．2KS(Kennard．Stone)法代表性样本的选择不仅可以减少建模工作量，还可提高模型的可靠性和稳定性。KS法根据欧氏距离挑选样本集，它把所有样本都看作候选样本，并从中依次挑选部分样本进入校正集‘1951。KS法首先选择欧氏距离最远的两个向量对进入校正集：定义以为从第i到j个样本向量的欧氏距离，假设已有k(k应小于样本总数n)个样本向量被选进校正集，针对第v个待选样本向量，定义最小距离：Db=min(dl，，d2，，⋯，d．h")所有待选样本向量的Dh最大值：D。h=max(D如)，拥有最大最小距离D胁的那个待选样本进入校正集。依此类推，直到达到需要的样本数。该法的特点是能保证被选择的样本按照空间距离分布均匀，是一种典型而有效的从样本集中挑选代表性样本的方法【195棚61。KS算法由网络提供的共享工具包下载【19引。在Matlab7．0中实现。3．1．4．3蒙特卡洛交互检验(Monte．CarloCross．Validation，MCCV)奇异样本筛选法MCCV奇异样本筛选法的具体算法如下：(1)通过PLS确定最佳主成分数。(2)用蒙特卡洛随机取样法(MonteCarloSampling，MCS)每次从样品集中随机抽取一定比例(如80％)的样品作为校正集，建立PLS回归模型，剩余的20％用于预测，从数据的统计性质和计算时间考虑，一般选择建立1000～2000个模型。(3)若样本集中的第k个样本被预测了n次，计算出该样本的预测残差的均值(MEANk)和标准偏差(STDk)。计算公式为：∑(或厂乓)2MEAN女=立L——一nSIDk=4l 中南林业科技大学博士学位论文式中或．，和五分别代表第k个样本第i次预测的预测值和该样本的实际值。(4)作MEANk．STDk图，得到全部样本的MEAN．STD分布图，MEANk或STDk高的样本为奇异样本，应剔除。MCCV算法由中南大学中药现代化研究中心提供，在Matlab7．0中实现。3．1．4．4竞争性自适应重加权采样(CompetitiveAdaptiveReweightedSampling，CARS)变量选择法CARS变量选择法的每一次迭代中都模仿达尔文进化理论中“适者生存”的原则，相继采用两种策略进行变量消除：(a)首先利用预定义的指数衰减函数强制去掉一部分竞争力相对较弱(指PLS模型回归系数的绝对值相对较小)的变量；(b)然后通过自适应重加权采样(AdaptiveReweightedSampling，ARS)技术继续对剩余的变量进行带有一定随机性的筛选，按概率继续去掉一部分不重要的变量。迭代完成后，利用交互检验选出模型交互检验均方差(RMSECV)值最低的变量子集。具体算法如下：(i)用MCS法每次从样品集中随机抽取80％的样品作为校正集，分别建立PLS回归模型。(ii)用X(mxp)代表含有m个样本和P个变量的校正集的光谱矩阵，Y(mxl)代表校正集的性质向量，T代表X的得分矩阵，W代表联系x和T的系数矩阵，C代表用Y和T建立起来的PLS校正模型的回归系数向量，e代表预测残差。则有下列关系式成立：T=XWY=Tc+e=XWc+e=Xb+e这里b=Wc=[bl,b2⋯．bp]1，是一个P维的系数向量。b中第i个元素的绝对值川(1O时，判定样本属于1这一类；YDl，则采用判别函数方法确定未知样本的最终类别。对两类样本的判别，判别函数为：ks=∑(S／口)i=1式中，S为校正集k个样本中第f个样本的取值，若属第1类，取“+1”，若属第2类，取“．1”；Di为未知样本与第f个样本之间的距离，可理解为权重，即距离较小的校正集样本给予较大权重，反之则给予较小权重。当两类的样本数相同时，口越大，其对S的贡献就越小。在距离相同时，若第1类样本多，则s为正，未知样本属于第1类，反之则属于第2类。KNN法(k=1)对验证集的判别结果为20个真蜂蜜中有1个被误判，而21个掺假蜜中有5个被误判，判别总正确率为85．4％，ROC曲线下的面积为0．856。LDA法是通过线性判别函数来定义一个超平面，从而将一个n维空间划分成两个区域来进行分类的一种方法。LDA模型对验证集的判别结果为20个真蜂蜜中有5个被误判，21个掺假蜜中有2个被误判，因此，判别总正确率为82．9％，而ROC曲线下的面积则为0．827。五种判别模型，以LSSVM的N,N结果最好。究其原因，可能主要与蜂蜜的主要成分有关：蜂蜜的主要成分是果糖和葡萄糖，占蜂蜜质量的70％左右，果糖和葡萄糖的混合物作为掺假物掺入蜂蜜中后，近红外光谱的变量与蜂蜜的真实性之间并不是完全的线性相关关系，而LSSVM算法具有很好的非线性识别能力和泛化能力，而且比SVM具有更少的支持向量，因此能得到更好的预测结果。7．3本章小结真蜂蜜中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液，分别用PCA和wT对真蜂蜜和掺假蜜的近红外光谱进行变量压缩，用压缩后的变量作为输入建立LSSVM模型，然后对验证集进行预测，并与使用全部1557个变量的LSSVM模型对验证集的预测结果进行比较。PCA、wT和全部变量下，LSSVM模型对验证集的判别总正确率分别为90．2％、95．1％和75．6％，ROC曲线下的面积则分别为0．902、O．952和0．780，表明使用WT进行变量压缩后，LSSVM模型的预测结果最好。wT具有对蜂蜜近红外光谱这类复杂的高维数据进行变量压缩的较好能力。用WT进行变量压缩后，分别用LSSVM、SVM、BPANN、KNN和LDA法 中南林业科技大学博士学位论文建立真蜂蜜与掺假蜜的判别模型，并对验证集进行预测，这五个模型对验证集的判别总正确率分别为95．1％、85．4％、90．2％、85．4％31：182．9％，ROC曲线下的面积分别为0．952、O．854、0．902、O．856和O．827，结果表明LSSVM模型的预测结果最优，LSSVM分类算法和近红外光谱相结合是一种判别蜂蜜中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液的较好方法。NIRS具有快速鉴别蜂蜜中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液的能力。114 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究8结论与展望8．1结论本文研究了近红外光谱采集方式、采样附件和仪器匹配参数对蜂蜜近红外光谱响应特性和模型预测精度的影响，应用近红外光谱结合化学计量学方法对蜂蜜质量检测进行了一系列探索性研究。这些研究包括影响蜂蜜质量的12个主要理化参数的定量分析、蜂蜜品种和产地的定性判别分析、真蜂蜜与掺假蜜的定性判别分析、掺假蜜中掺假物类型的定性判别分析和掺假量的定量分析。由研究结果可得如下结论：(1)采用样品杯透反射或样本池透射方式都能获得稳定、重复性好的蜂蜜近红外光谱，而薄膜袋透反射方式采集的光谱不稳定、重复性差。用样品杯透反射方式采集的光谱建立的模型比用样本池透射方式采集的光谱建立的模型精度更高，说明透反射光谱包含了更强的样本特征信息。样品杯透反射方式为蜂蜜近红外光谱采集的较理想方式。(2)用样品杯透反射方式采集蜂蜜近红外光谱时，扫描次数和分辨率对光谱特征及模型精度影响不大。确定采集蜂蜜近红外光谱的扫描次数取32次、分辨率取8cm_较合理。(3)在4000-10000cm‘1的光谱范围内，光谱经适当的预处理后，建立的PLS模型能实现蜂蜜水分和SSC的准确预测，还原糖和果／葡也有较好的预测结果。用MCCV奇异样本筛选法剔除异常样本后，再用CARS变量选择法结合PLS回归筛选变量来优化蜂蜜中pH值、总酸度、电导率、果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和葡／水的PLS模型，优化后的PLS模型对pn值、果糖、葡萄糖和葡／水的预测结果也令人满意，而总酸度、电导率、蔗糖和麦芽糖的预测结果也有明显提古间o(4)分别用MD．DA、RBFNN和PLSDA三种方法判别5个品种(油菜、苹果、枣花、柑橘、荆条)蜂蜜的植物来源，MD．DA模型和RBFNN模型的判别总正确率都为94．0％，而PLSDA模型的判别总正确率为78．O％。光谱预处理方法、建模方法及模型参数对蜂蜜品种的判别具有较大影响。同一模型下，不同品种蜂蜜的判别结果会存在较大差异。NIRS具有快速判别蜂蜜品种的潜力。(5)蜂蜜产地的差异主要来自环境因素，同一品种不同产地蜂蜜之间的差异小。WT具有对蜂蜜近红外光谱这类复杂的高维数据进行变量压缩的能力。用 中南林业科技大学博：I：学位论文wT压缩蜂蜜近红外光谱时，小波基和分解尺度对模型的预测结果有较大影响，建模前应进行优化。光谱用wT进行变量压缩和去噪后，WT-PLSDA模型和WT-RBFNN模型对苹果蜜产地的预测总正确率都达到了96．2％，对油菜蜜产地的预测总正确率则分别为90．9％和86．4％。结果表明：相同的判别方法下，不同品种蜂蜜的产地判别结果会有较大差异，因此，判别蜂蜜产地时最好不同品种分别建模；线性的WT-PLSDA模型比非线性的WT-RBFNN模型可能具有更好的判别蜂蜜产地的能力；NIRS具有快速识别蜂蜜产地的潜力。(6)真蜂蜜样本中分别掺入四种掺假物，即HFCS、BS、MS和这三者的混合物，然后将真蜂蜜分别与这四种掺假物的掺假蜜组成样本集，分别用DM法、MD．DA法和PLSDA法对真假蜂蜜进行判别分析。三种判别方法以PLSDA模型的预测能力最好，预测集的判别总正确率分别达到了82．4％、90．2％、90．2％和80．4％。三种方法对真蜂蜜与MS掺假蜜组成的样本集都有较好的预测结果，预测集的判别总正确率分别达到了90．2％、84．3％和82．4％。因此，NIRS是一种潜在的快速识别蜂蜜中掺入HFCS、BS或MS的方法。(7)采用PLS法对真蜂蜜中分别掺入HFCS、BS和MS后的掺假样本进行掺假量定量分析。用同一真蜂蜜样本掺假，三种掺假物的定量分析预测结果都很好，但这一结果不具现实意义；同一植物来源蜂蜜和不同植物来源蜂蜜掺假的定量分析，除MS的预测结果满意外，HFCS和BS的预测结果都较差。产生这个结果的主要原因是HFCS和BS的主要成分与蜂蜜主要成分一致，都为果糖和葡萄糖，而MS的主要成分是麦芽糖，与蜂蜜主要成分存在较大差异，因此，当掺假物的主要成分与蜂蜜主要成分差异较大时，NIRS能实现对掺假量的定量分析，反之，则不能。(8)真蜂蜜样本中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液，用WT压缩变量后，分别用LSSVM、SVM、BP．ANN、KNN和LDA法建立真假蜂蜜的判别模型，模型对预测集都有较好的判别结果，判别总正确率分别为95．1％、85．4％、90．2％、85．4％和82．9％，以WT-LSSVM法的预测结果最好。因此，LSSVM分类算法和近红外光谱相结合是判别蜂蜜中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液的较好方法，NIRS具有快速识别蜂蜜中掺入果糖和葡萄糖的混合溶液的能力。8．2创新点(1)通过对蜂蜜近红外光谱采集方式和采样附件的优化，确定样品杯透反射方式为采集蜂蜜近红外光谱的较合理方式。这一研究对类似蜂蜜的黏稠样本的 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究近红外光谱采集具有借鉴意义。(2)蜂蜜是一种成分高度复杂的样本，运用较新研发的MCCV奇异样本筛选法剔除异常样本后，用CARS变量选择法结合PLS回归筛选变量来优化模型，显著提高了蜂蜜pH值、果糖、葡萄糖、葡／水、总酸度、蔗糖、麦芽糖和电导率的PLS模型精度。研究内容为成分复杂的样本的物理化学参数定量分析模型的优化提供了可借鉴的方法。(3)将WT用于蜂蜜近红外光谱的变量压缩和去噪，表明WT具有对蜂蜜近红外光谱这类复杂的高维数据进行变量压缩的能力。这一研究为其它复杂样本的高维光谱数据的变量压缩提供了方法借鉴。(4)真蜂蜜样本中分别掺入HFCS、BS、MS及这三种糖浆的混合物后，利用NIRS对真假蜂蜜的判别、掺假物类型的判别和掺假量的定量分析进行了系列研究。研究内容为开发蜂蜜真伪近红外光谱快速检测仪提供了理论依据和方法参考。8．3展望本文运用近红外光谱结合化学计量学方法对蜂蜜主要理化参数、品种、产地和掺假进行了一系列探索性研究，研究结果为蜂蜜质量的快速评价提供了新的方法参考，为蜂蜜质量控制近红外光谱专用快速分析仪的开发提供了理论依据。但由于样本采样方面存在困难及受研究时间的限制，本文的研究还不十分全面，今后应在以下这些方面开展进一步的工作：(1)虽然PLS法是目前普遍认为较好的定量校正方法，但该方法对蜂蜜总酸度、蔗糖、麦芽糖和电导率的定量分析结果还不满意，估计主要原因在于两方面：一是大部分分析样本这些参数的数据较小，它们的近红外光谱特征信息弱；二是对蔗糖和麦芽糖来说，它们的分子结构与果糖和葡萄糖相似，光谱特征峰易被掩盖。这两方面的原因都会使特征信息提取困难，从而导致所建模型的稳定性和预测精度降低。因此，在今后的研究中有必要增加样本数，使样本数据分布更加合理，此外，在光谱特征信息提取方面也有必要开展深入研究。(2)本文仅对5个品种蜂蜜进行了植物来源的判别分析，得到的结果对NIRS快速识别蜂蜜品种具有参考意义。而实际情况是蜂蜜品种多种多样，仅市场上销售的就达20种左右，今后应扩大品种来源，建立更多品种的判别模型。对某一品种蜂蜜的判别结果，是否受与它相组合构成样本集的其它品种的影响；受自然因素影响，任何品种蜂蜜都不可能是完全单一花粉蜜，若要建立标准化的 中南林业科技大学博士学位论文蜂蜜近红外光谱品种识别方法，品种的纯度应达到什么要求，从而采取合理措施隔离和控制放蜂环境，保证样本的要求。以上这些都是今后有待研究的方面。(3)本文仅对苹果蜜和油菜蜜的两个产地进行了判别分析，而实际中蜂蜜品种多种多样，且一些品种产地较多。因此，有必要采集更多品种单花蜜或多花蜜进行多产地的判别分析，以进一步检验NIRS在蜂蜜产地判别上的应用能力。(4)当蜂蜜中掺入与其成分类似的掺假物(如HFC、BS)时，真假蜂蜜的判别总正确率和掺假物类型的判别总正确率还有待提高，如何通过更加有效的化学计量学方法来提取光谱的特征信息从而提高判别正确率，能否使用NIRS与其它分析技术相结合的方法来提高判别正确率还有待深入研究。(5)本文仅对天然蜂蜜中掺入较普遍使用的几种蜂蜜掺假物(即HFCS、BS、MS和它们的混合物以及果糖和葡萄糖的混合物)进行了NIRS检测的部分研究，而实际中，蜂蜜掺假物多种多样，掺假或造假的方法和技术也在不断更新，甚至有的掺假蜜或假蜂蜜可以达到现行国家标准的技术要求，或现行国家标准也难检测出其真伪，因此，关于NIRS检测蜂蜜真伪有大量工作可做，今后应对蜂蜜中掺入其它掺假物、不同方法和技术的掺假或造假展开近红外光谱检测的研究。掺假检测时，掺假量达到多少即能实现NIRS的检测(即检测限)也是今后有待研究的方面。(6)近红外光谱技术中，奇异样本的筛选和特征变量的选择对模型精度影响较大，今后应在这两个方面开展广泛深入的研究。(7)近红外光谱分析中，模型的转移直接关系到这项技术在实际中的应用和推广，因此，实现模型在其它近红外光谱仪上的转移也是今后研究工作的一个重要方面。(8)本文利用NIRS对蜂蜜质量进行了一系列探索性研究，蜂蜜的生物活性和保健功能与蜂蜜组成及各成分含量密切相关，NIRS能否直接实现蜂蜜功能性指标的快速评价，有必要开展系列研究。总之，无论是蜂蜜理化参数的定量分析，还是品种、产地的鉴别以及掺假检测，若要开发蜂蜜质量控制近红外光谱专用快速分析仪，就必须建立合理的样本数据库和化学计量学模型才能实现。 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中南林业科技大学博士学位论文130 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究附录ABPANNBSCARS1D2DDMMD—DAHFCSKNNKSLDALS．SVMMCCVMCSMSMSCNIRSPCAPLSPLSDARBFNNRc。2Rp2K2ItMSECVI洲SEPIUvISECRSDS．G符号和缩略词表BackPropagationArtificialNeuralNetworks反向传播人工神经网络BeetSyrup甜菜糖浆CompetitiveAdaptiveReweightedSampling竞争性自适应重加权采样FirstDerivative一阶微分SecondDerivative二阶微分DistanceMatch距离匹配法MahalanobisDistance-DiscriminantAnalysis马氏距离一判别分析法Hi曲FructoseCornSyrup高果玉米糖浆K-NearestNeighborK最临近法Kennard．StoneKS标样选取方法LinearDiscriminantAnalysis线性判别分析法LeastSquaresSupportVectorMachines最d,-乘支持向量机算法Monte．CarloCross．Validation蒙特卡罗交互验证Monte-CarloSampling蒙特卡罗随机取样法MaltoseSyrup麦芽糖浆MultiplicativeScatterCorrection多元散射校『FNearInfraredSpectroscopy近红外光谱技术PrincipleComponentAnalysis主成分分析ParcialLeastSquares偏最小二乘算法PartialLeastSquaresDiscriminantAnalysis偏最d,-乘判别分析法RadicalBasisFunctionNeuralNetworks径向基函数神经网络CoefficientofDeterminationofCrossValidation交互验证决定系数CoefficientofDeterminationofPredictionSet预测集决定系数CoefficientofDeterminationofCalibrationSet校正集决定系数RootMeanSquareErrorofCrossValidation交互验证均方根误差RootMeanSquareErrorofPrediction预测均方根误差RootMeanSquareErrorofCalibration校正均方根误差RelativeStandardDeviation相对标准偏差Savitzky-GolayS．G数据平滑法131 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究SNVSSCSVMWTStandardNormalVariate标准正交变量变换SolubleSolidsContent可溶性固形物含量SupportVectorMachines支持向量机算法WaveletTransform小波变换132 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究附录B攻读博士学位期间发表的论文1．李水芳，单杨宰，尹永，周孜．基于连续投影算法的油菜蜜近红外光谱真伪鉴别研究．食品工业科技，2012，04，33(4)：89—91，962．李水芳，单杨半，朱向荣，李忠海．近红外光谱结合化学计量学方法检测蜂蜜产地．农业工程学报，2011．08，27(8)：350．354．(E1收录)3．李水芳，单杨+，张欣，朱向荣，李高阳．蜂蜜用葡萄糖溶液掺假的近红外光谱检测．食品研究与开发，2011．05，32(5)：114．118．4．李水芳，单杨=．c，范伟，尹永，周孜，李高阳．基于MCCV奇异样本筛选和CARS变量选择法对蜂蜜pH值和酸度的近红外光谱检测．食品科学，2011．04，32(8)：182．185．5．李水芳，单杨木，朱向荣，李高阳．近红外透反射光谱用于检测蜂蜜用麦芽糖浆掺假．食品科技，2010．12，35(12)：299．303．6．李水芳，张欣，单杨术，李忠海．近红外光谱检测蜂蜜中可溶性固形物含量和水分的应用研究．光谱学与光谱分析，2010，09．30(9)-2377．2380．(SCI收录)7．李水芳，朱向荣，单杨，李忠海．中／近红外光谱技术结合化学计量学在蜂蜜快速检测中的应用研究进展．食品与机械，2009，09．25(5)：121—124，177．8．李水芳，朱向荣，单扬．蜂蜜掺假鉴别技术研究进展．食品工业科技，2009，11．30(11)：353-356，359．9．XiangrongZhu，ShuifangLi，YangShan’，ZhuoyongZhang，GuoweiLing，DonglinSu，FengLiu．Detectionofadulterantssuchassweetenersmaterialsinhoneyusingnearinfraredspectroscopyandchemometrics．JournalofFoodEngineer,2010，101：92．97．(SCI刊源)．10．张欣，单杨，李水芳，基于多元散射校正和偏最小二乘(MSC／PLS)的傅里叶变换近红外光谱检测蜂蜜中还原糖．食品与机械，2009，11．25(6)：109．112．11．李水芳，单杨，尹永，周孜，凌国巍．拉曼光谱法快速鉴别蜂蜜中掺入甜菜糖浆的可行性研究冲国食品学报，拟2012，6．12．ShuifangLi，XiangyongZhu，JuhuaZhang，GouyangLi，DonglinSu，YangShan．Authenticationofpurecamelliaoilbyusingnearinfraredspectroscopyandpatternrecognitiontechniques[J]．JournalofFoodScince，2012，77(4)：374—380．(SCI刊源)13．ShuifangLi，YangShan，XiangrongZhu，XinZhang，GuoweiLing．DetectionofHoneyAdulterationbyHighFructoseCornSyrupandMaltoseSyrupUsingRamanSpectroscopy．JoumalofFoodCompositionandAnalysis．Underreview．(SCI刊源)．133 蜂蜜质量的近红外光谱分析技术研究致谢本学位论文是在导师单杨研究员和李忠海教授的精心指导下完成的。无论是论文的选题，还是实验方案的设计、研究工作的开展、实验结果的分析以及论文的撰写，导师都给予了悉心的指导，倾注了大量心血。两位导师渊博的知识、严谨的治学态度、活跃的学术思维和无私的奉献精神堪为表率，将使我受益终身，也时刻激励我在学术道路上克服困难，发奋图强。在此，谨对两位恩师的教诲、指导和关心表达我最真诚的感谢和崇高的敬意，祝福恩师身体健康，生活幸福。感谢湖南省著名企业——湖南明园蜂业有限公司无偿提供了全部的真蜂蜜样本。公司总经理尹永、质检部主任周孜在保证蜂蜜的真实性方面付出了辛勤的劳动。本论文的完成还得到了诸多方面的帮助。湖南省农产品加工研究所的朱向荣博士从光谱数据的采集、实验结果的分析和论文的撰写，自始至终都参与其中；中南大学中药现代化研究中心梁逸曾教授为实验方案的设计和数据的处理提出了许多宝贵意见，范伟博士、李洪东博士在实验数据的处理方面给予了大量指导和帮助；本学位论文的实验部分在湖南省农产品加工研究所完成，李高阳所长、何建新书记、付复华副所长、张菊华主任、苏东林主任及中心全体人员给予了诸多关心、帮助和支持；理学院应用化学研究所胡云楚教授为论文的撰写提出了诸多宝贵意见；实验过程也得到了湖南省农产品加工研究所硕士研究生张欣、刘星和博士研究生袁红燕等的帮助；在我攻读博士学位期间，化学教研室的老师，特别是化学实验中心的老师为我分担了大量工作。在此，向他们表达我衷心的感谢。也要感谢我所在学院——理学院领导的关心和支持。特别要感谢我的父母，在我攻读博士学位期间，父母无怨无悔地承担着我们全家的家务，鼓励和支持我的学习和研究工作，父母的教诲和吃苦耐劳的精神，激励我发奋努力，积极进取；也要感谢我的丈夫喻勋林教授和儿子喻寰，他们的理解、关心和支持使我能够全身心投入到学习和研究中，顺利完成学业。经过五年的学习和研究，博士论文终于定稿，限于本人学识水平，论文中还存在许多问题，研究工作也还不够全面、深入，恳请各位专家、学者多多指导，提出宝贵意见，在今后的学习和研究中，我将不断改进，进一步完善，取得更多更好的成绩。李水芳2012．5．】2