高效液相色谱串联质谱测定蜂蜜蜂王浆中氯霉素残留 4页

第33卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第12期2005年12月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1767～1770高效液相色谱串联质谱测定蜂蜜、蜂王浆中氯霉素残留3谢文丁慧瑛章晓氡郑自强奚君阳俞春燕(浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心,杭州310012)摘要前处理方法包括添加同位素内标氯霉素2d5和采用10%偏磷酸沉淀蜂王浆产品中的蛋白质,上清液经乙酸乙酯提取,自制硅胶柱和Oasis小柱净化。净化后的提取溶液用高效液相色谱2电喷雾电离质谱检测,多反应监测3对离子(321.0/256.9、321.0/194.0、321.0/175.8)。该方法对不同基质样品的加标回收率为91%～107%;相对标准偏差小于10%;蜂蜜和蜂王浆的方法检出限分别为0.1μg/kg和0.2μg/kg。关键词高效液相色谱串联二级质谱,蜂蜜,蜂王浆,氯霉素残留,同位素内标氯霉素2d51引言氯霉素(chloramphenicol,CAP)是一种高效广谱的抗生素,对各种好氧和厌氧微生物都有活性。它曾被用于家畜和家禽疾病的预防和治疗,它在动物性食品中残留的潜在危害就是对人骨髓造血功能造[1～3]成严重损害,从而引起人的粒细胞缺乏病,再生障碍性贫血和溶血性贫血,严重者可致死。FAO/WAO规定食品中氯霉素的残留量不得检出,欧盟(EEC)96/23指令中把CAP列入禁用药,并规定氯霉素MRPL(minimumrequiredperformancelimits)值为0.3μg/kg。随着科学技术的进步,欧盟对进口动物源产品中的氯霉素的检出限量不断降低,甚至禁止中国的某些动物源产品的进口,同时蜂产品中氯霉素残留的检测又是动物源产品检测中的难点,因此蜂产品中氯霉素的检测变得尤为重要。文献报道用气相色谱(GC)、气相色谱质谱(GC2MS)测定动物源产品中CAP,这些方法应用于蜂产品中氯霉素的检测,存在检出限难以达到要求、背景干扰或样品净化不完全以及衍生化难等问题。ELISA作为筛选方法,在蜂产品中氯霉素残留的最低检出限达到0.1μg/kg,但是对于阳性样品需要与之相对应的确证方法。文献[4、8]报道关于蜂蜜中氯霉素残留量的检测方法,分别采用高效液相色谱(HPLC)和GC2MS,尚未有蜂王浆中氯霉素残留量检测方法的报道。随着LC2MS/MS技术发展的日趋成熟,该方法被越来越多的应用于测定和确证动物源产品中氯霉素的残留量。本实验提出了添加同位素内标氯霉素2d5和采用10%偏磷酸沉淀蜂王浆产品中的蛋白质,上清液经乙酸乙酯提取,用LC2MS/MS测定蜂产品中氯霉素残留量的方法。2实验部分2.1仪器与试剂API4000液相色谱2串联质谱仪,配电喷雾离子源和大气压化学源(美国AB公司);OasisHLBSPE柱(500mg,6cc,Waters公司)。实验用水为二次蒸馏水;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、正己烷为色谱纯,氯化钠、无水硫酸钠为分析纯。硅胶:105℃灼烧2h,在干燥器内冷却至室温,加1.5%的水脱活,备用。氯霉素标准物质(纯度≥99%,SIMA公司);氯霉素2d5同位素内标:纯度≥99%(德国BGVV研究所)。储备液用甲醇配制,贮存在4℃冰箱中。根据需要用甲醇稀释至适当浓度的标准工作液。2.2液相色谱与质谱条件色谱柱:ZORBAXEclipseXDB2C8,5μm,4.6mm×150mm;流动相:乙腈∶5mmol/L醋酸胺梯度洗脱(见表1);流速:0.4mL/min;进样量:20μL。扫描方式:负离子扫描;检测方式:多反映监测;电喷雾电压:-3500V;雾化气压力:0.266MPa;气帘气压力:0.189MPa;辅助气流速:45L/min;离子源温度:525℃;去簇电压(DP)-65V。2005201221收稿;2005204207接受本文系国家质量监督检验检疫总局2002年出国人员科技活动资助项目。 1768分析化学第33卷2.3样品处理表1流动相梯度洗脱Table1Gradientelutionofmobilephase2.3.1蜂蜜称取5.00g样品,置于50mL离心管中,加入乙腈(%)5mmol/L醋酸胺0.1mL氯霉素2d5(10μg/L),15mL水,8gNaCl,20mL乙酸t/minAcetonitrileNH4AC(%)乙酯,混匀,4000r/min,离心5min,上层乙酸乙酯过无水硫0208027030酸钠柱至浓缩瓶中,样品溶液再加入20mL乙酸乙酯,重复上67030述操作,合并乙酸乙酯提取液,50℃以下水浴减压浓缩至干。6.18020残渣用10mL乙腈∶甲苯(1∶9)溶液转移入硅胶净化柱6.58020(150mm×5mmi.d.玻璃柱,底部垫约5mm厚脱脂棉,1cm6.62080102080无水硫酸钠,1g硅胶,顶端加1cm无水硫酸钠),弃去流出液,用6mL乙腈∶甲苯(6∶4,V/V)洗脱,在50℃以下水浴中平缓氮气吹干,加入0.5mL乙腈2H2O(1∶1,V/V),混匀,如有沉淀,溶液过0.45μm滤膜,供LC2MS/MS测定。2.3.2蜂王浆称取2.00g蜂王浆样品,置于50mL离心管中,加入0.1mL氯霉素2d5(10μg/L),20mL10%偏磷酸溶液,混匀,以4000r/min离心10min。将上层清液转移至另一50mL离心管中,加20mL乙酸乙酯,8gNaCl,同蜂蜜的提取及用硅胶柱的净化方法。加入5mL水溶解残渣,倒入OasisHLB的小柱(已依次用8mL甲醇和15mL水预处理),再用5mL水和5mL乙腈2水(1∶7,V/V)洗柱。在65kPa的负压下,减压抽干,最后用7mL乙酸乙酯洗脱,洗脱液在50℃以下水浴平缓N2吹干,准确加入0.5mL乙腈2水(1∶1,V/V),混匀,如有沉淀,将溶液通过0.45μm滤膜,供LC2MS/MS测定。3结果与讨论3.1氯霉素的液相色谱质谱图[10]氯霉素分子式为C11H12O5N2Cl2,分子量为322.0123。同位素内标氯霉素-d5(氯霉素在5个不同位置上的氢被氘取代)的分子量较氯霉素的分子量多5,两者的理化性质相同,在样品净化过程中可以矫正由于样品净化对氯霉素造成的损失,提高测定方法的回收率。图1a为氯霉素的LC2MS/MS,出现了主要的碎片有m/z256.9(丢失了Cl和OH),m/z194.0(丢失了CCl2和OH),m/z175.8(从m/z194.0的碎片上丢失H2O),256.9、194.0和175.8的离子碎片峰相对其它离子碎片强,同时可以看到氯霉素母离子的分子离子峰为321.0。图1b为氯霉素2d5的多级串联质谱图,出现了一个主要的碎片m/z157.1,因此监一对离子326.0/157.1。图1氯霉素(a)和氯霉素2d5(b)的多级串联质谱Fig.1Multi2stagetandemmassspectraofchloramphenicol(CAP)(a)andCAP2d5(b)3.2色谱条件的优化氯霉素属于弱极性物质,易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂。本实验以乙腈25mmol/L醋酸胺为流动相进行了色谱条件的优化。实验表明,乙腈在流动相中所占比例,决定氯霉素的保留时间、峰形和测定的灵敏度。在测定蜂产品时,由于氯霉素与干扰杂质一起流出,对氯霉素的离子化产生严重抑制作用和色谱峰背景干扰,因此本实验采用梯度洗脱的方法,使氯霉素与杂质基本达到完全分离。3.3样品提取溶剂的选择[4～9]氯霉素易溶于乙酸乙酯,而不溶于正己烷。大量文献报道选用乙酸乙酯作为提取溶剂。实验表明,乙酸乙酯提取杂质多,提取颜色较深,但乙酸乙酯提取效率高,因此本实验选用乙酸乙酯提取样品 第12期谢文等:高效液相色谱串联两级质谱测定蜂蜜、蜂王浆中氯霉素残留1769中的氯霉素,用无水硫酸钠脱去乙酸乙酯中的水分,可减少水溶性杂质。3.4蜂王浆中蛋白质沉淀方法的选择蜂王浆样品含有大量蛋白质的均匀胶体。要从蜂王浆中提取氯霉素,必须破坏其胶体状态。文献[11]选2%三氯乙酸和2%柠檬酸沉淀蛋白,经实验,沉淀蛋白质时间短,效果理想,但是沉淀后的上清液经乙酸乙酯提取后,由于有酸性溶液存在,乙酸乙酯溶液难浓缩干。本实验采用文献[12]的方法,选用10%偏磷酸溶液沉淀蛋白质。3.5硅胶柱净化用自制的1g硅胶柱净化样品提取液,方法简便快捷,成本低,实验结果表明,用硅胶柱净化蜂蜜,效果好,色谱图中的背景杂质干扰少。但是控制好硅胶1.5%脱水后的活性是关键之一。先进行标样的淋洗后,再净化样品溶液,另外,样品溶液过柱的流速不要过快。以1滴/s净化、洗脱效果较好。3.6方法的线性关系将氯霉素和氯霉素2d5混合标准溶液直接进样,在LC2MS/MS的响应不理想,同时考虑到有些实验室缺少同位素内标,在样品前处理过程中回收率偏低,因此本实验5点不同浓度工作曲线全部采用空白样品添加氯霉素和氯霉素2d5,取5g蜂蜜空白样分别添加0.05、0.1、0.2、0.3和0.4mL氯霉素(10μg/L)和0.1mL氯霉素2d5(10μg/L)或取2g蜂王浆空白样分别添加0.04、0.08、0.12、0.16mL氯霉素(10μg/L)和0.1mL氯霉素2d5(10μg/L),按照2.3操作方法制备样品溶液,在本法所确定的实验条件下进样,测定其峰面积,以质量浓度X(μg/kg)为横坐标,峰面积的比值Y(氯霉素峰面积/氯霉素2d5面积)为纵坐标,绘制标准曲线。结果见表2。表2线性方程、相关系数Table2Thelinearequation线性方程相关系数线性范围样品离子对名称LinearCorrelationLinearrangeSampleTransitionsequationcoefficient(μg/kg)蜂蜜Honey321.0/256.9Y=2.21X+0.04450.99920.1～0.8蜂王浆Royaljelly321.0/256.9Y=1.52X+0.06180.99850.2～0.8图2蜂蜜氯霉素阳性样品氯霉素23.7回收率及精密度实验d5(0.2μg/kg)的选择在5g蜂蜜空白样品中分别添加0.05、0.2、0.4mL氯霉素(10Fig.2Selectionchromatogramsofμg/L)和0.1mL氯霉素2d5(10μg/L)。2g蜂王浆空白样品中分别positivesamplespikeCAP2d5(0.2添加0.04、0.08、0.16mL氯霉素(10μg/L)和0.1mL氯霉素2d5μg/kg)inhoneysample(10μg/L),按照2.3制备样品溶液。回收率及精密度见表3,阳性样品氯霉素2d5)见图2和图3。表3方法的回收率及精密度实验Table3Therecoveryandprecisionofthemethod加入量测定量平均回收率样品离子对RSDAddedFoundRecoverySampleTransitions(%)(μg/kg)(μg/kg)(%)0.10.091914.4蜂蜜321.0/256.90.40.431072.7Honey0.80.821022.10.20.2011002.8图3蜂王浆氯霉素阳性样品添加蜂王浆Royaljelly321.0/256.90.40.39977.1氯霉素2d5(0.5μg/kg)总离子流图0.80.79992.3Fig.3Selectionchromatogramsof应用本方法检测出口蜂王浆166批,结果氯霉素含量大于0.3positivesamplespikeCAP2d5(0.5μg/kg)inroyaljellysampleμg/kg为42%;20批蜂蜜,结果均小于0.1μg/kg。该方法具有很高的灵敏度和选择性。通过1对离子碎片对氯霉素定量,其余2对离子碎片对检测结果进行确证。由于添加了同位素内标氯霉素2d5,方法的回收率和精密度在0.1μg/kg的痕量残留仍然符合实验要求。采用10%偏磷酸测定蜂王浆中的蛋白质,方法简便、容易操作, 1770分析化学第33卷适用于日常检验。References1SeminYA.Hematol.,1973:10:225～2342DingQuanfu(丁全福).Pharmacology(药理学).Beijing(北京):PeoplePress(人民出版社),2001:249～2503LiLansheng(李兰生),WangYongqiang(王勇强).JouralofChinaOceanUniversity(青岛海洋大学学报),1995,25(3):400～4064HuDaxi(胡大晰),LiQingcai(李庆才).YantaiTeachersUniversityJournal(NaturalScience)(烟台师范学院学报自然科学版),1994,10(2):121～1245TakinoM,DaishimaS,NakaharaT.J.Chromatogr.A,2003,1011:67～756GantvergA,ShishaniI,HoffmanM.AnalyticaChimicaActa,2003,483:125～1357MottierP,ParisodV,GremaudE,GuyPA,StadlerRH.J.Chromatogr.A,2003,994:75～848LiuYizi(刘宜孜),XieMengxia(谢孟峡),HanJie(韩杰),LiuYuan(刘媛),QiuYueming(邱月明),DingYayun(丁雅韵),ZhangLei(张雷).JournalofBeijingNormalUniversity(北京师范大学学报自然科学版),2004,40(2):232～2369GikasE,KormaliP,TsipiD,TsarbopoulosA.J.Agric.FoodChem.,2004,52:1025～103010LiJunsuo(李俊锁),QiuYueming(邱月明),WangChao(王超).AnalysisVeterinaryDrugResidue(兽药残留分析).Shanghai(上海):ShanghaiScienceTechnologyPress(上海科学技术出版社),2002:393～39511SN/0205293ProfessionalStandardofthePeople′sRepublicofChinaforImportandExportCommodityInspection(中华人民共和国进出口商品检验行业标准).Beijing(北京):StandardPress(中国标准出版社)12SN/T054921996ProfessionalStandardofthePeople′sRepublicofChinaforImportandExportCommodityInspection(中华人民共和国进出口商品检验行业标准).Beijing(北京):StandardPress(中国标准出版社)DeterminationofChloramphenicolResidueinHoneyandRoyalJellybyHighPerformanceLiquidChromatography/MassSpectrometry/MassSpectrometry3XieWen,DingHuiying,ZhangXiaodong,ZhengZiqiang,XiJunyang,YuChunyan(ZhejiangEntry2exitInspectionandQuarantineBureau,Hangzhou310012)AbstractAmethodforthedeterminationofchloramphenicolresidueinhoneyandroyaljellysampleshasbeenintroduced.Inordertoenhancetheaccuracyofthemethodandprecipitatetheproteininsamples,theisotopeinternalstandard(CAP2d5)and10%metaphosphoricacidsolutionwereaddedintothesamplesolutions,theupperlayersolutionwasextractedwithethylacetate,thenitwascleanedupwithsillicaandOasiscolumns.Theabovesolutionwasanalysedbyusinghighperformanceliquidchromatographycombinedwithelectrosprayionizationmassspectrometry.Theprecursor/productiontransitions(321.0/256.9,321.0/194.0,321.0/175.8)weremonitored.Therecoverieswerebetween91%and107%indifferentmatrix.TheRelativestandarddeviationswerebelow10%.Thelimitofdetectionsofthemethodfortheanalysisofhoneyandroyaljellysampleswere0.1μg/kgand0.2μg/kgrespectively.KeywordsHighperformanceliquidchromatograpytandemmassspectrometry,honey,royaljelly,chloram2phenicolresidue,isotopicinternalstandardchloramphenicol2d5(Received21January2005;accepted7April2005)