固相萃取_气相色谱_质谱联机分析蜂蜜中的氯霉素残留量 5页

2004年4月北京师范大学学报(自然科学版)Apr.2004第40卷第2期JournalofBeijingNormalUniversity(NaturalScience)Vol.40No.2固相萃取-气相色谱-质谱联机3分析蜂蜜中的氯霉素残留量•刘宜孜谢孟峡韩杰刘媛邱月明丁雅韵张雷(北京师范大学分析测试中心,100875,北京∥第一作者23岁,女,硕士生)摘要利用固相萃取气相色谱质谱联机分析蜂蜜中的氯霉素残留量.对氯霉素在固相萃取柱上的保留行为进行了研究,优化固相萃取条件,发现不同浓度的氯霉素在硅胶柱和C18柱上的回收率均在90%以上,蜂蜜加标的回收率为80%～95%,相对标准偏差为7.2%～18.2%,最低检出-1限为0.1μg·kg.对氯霉素的三甲基硅烷化衍生物采用选择离子的模式进行检测(m/Z=466,-1468,470),衍生物的峰面积与样品质量浓度在0.55～220μg·L范围内呈良好的线性关系,线性回归系数为0.9998.关键词氯霉素;气相色谱质谱联机;固相萃取;蜂蜜+分类号O657.63;O658.2;R978.73氯霉素(chloramphenicol)又名左旋霉素,是一类广谱抗生素,作为药物常用于家禽疾病治疗和预防.氯霉素对人的造血系统、消化系统具有严重的毒性反应,有可能引发人的再生障碍[1]性贫血,因此欧盟等国家规定蜂蜜及其他动物源食品中氯霉素的最高残留量不得超过0.1-1μg·kg.动物组织、体液、牛奶、鸡蛋等基体中氯霉素的检测方法已有一些报道,应用较多的有[124]气相色谱法、气相色谱质谱联机、液相色谱法和液相色谱质谱联机等.但多数检测方法的-1最低检出限都达不到0.1μg·kg,以蜂蜜为基体的氯霉素检测方法的相关报道更少.近年来[526]固相萃取方法在对复杂基体样品预处理方面得到了广泛应用.本文对蜂蜜样品的净化和富集方法进行了较为系统的研究,考察了氯霉素在硅胶和C18固相萃取柱上的保留行为,测定了不同浓度的氯霉素在固相萃取柱上的回收率,建立了固相萃取气相色谱质谱联机分析蜂蜜-1中氯霉素的方法,其最低检出限为0.1μg·kg,相对标准偏差符合痕量残留物检测的要求.1实验部分1.1仪器和试剂气相色谱质谱联用仪(TraceGC2MS,美国Thermo2Quest,Finningan公司),色谱柱:DB25MS石英毛细管色谱柱,30m×0.25mm,膜厚0.25μm(J&WScientific,Folsom,-1CA,USA).色谱条件:载气为高纯He,流量1mL·min;不分流进样,进样量1.0μL;进样口温-1度250℃;温度梯度:100℃(1min)→30℃·min→280℃(3min).质谱条件:负CI化学电离源(反应气为甲烷),源温150℃;传输线温度250℃;检测电压500V;选择离子收集模式(收集m/Z为466,468,470的3种碎片离子).所用溶剂和试剂均为分析纯或色谱纯,氯霉素标准品(美国sigma公司),双三甲基硅基三3国家科技攻关计划资助项目(2001BA804A18)•联系人收稿日期:2003210223 第2期刘宜孜等:固相萃取-气相色谱-质谱联机分析蜂蜜中的氯霉素残留量233氟乙酰氨(BSTFA,含φ=1%三甲基氯硅烷,美国SupelcoPark公司).固相萃取柱:C18小柱,LC218500mg,容积6mL(美国SupelcoPark公司),硅胶柱,SI21500mg,容积6mL(美国Phenomenex公司).1.2样品处理-11.2.1样品中氯霉素的提取称取5g蜂蜜于50mL离心管中,加入10mL50mmol·L磷酸缓冲液(pH=6.88)、3g无水硫酸钠,旋涡混合.用30mL乙酸乙酯分3次提取.收集提取液,在55℃水浴下旋蒸掉大部分溶剂,剩余的溶剂用氮气吹干,待上样.1.2.2固相萃取净化样品6mL硅胶小柱依次用5mL乙腈、5mLV(二氯甲烷)∶V(正己烷)=1∶1混合液活化;500μL二氯甲烷溶解1.2.1节中的残留物后上样;5mLV(二氯甲烷)∶V(正己烷)=1∶1的混合液淋洗,弃去淋洗液;用5mLφ=20%的乙腈水溶液洗脱,洗脱液用3mL乙酸乙酯分3次提取,合并提取液并吹干,用5mLφ=5%的乙腈水溶液溶解残留物,待C18柱进一步净化.6mLC18小柱依次用5mL乙腈、5mL水活化,上样,5mL水淋洗,弃去淋洗液,5mL乙腈洗脱,吹干洗脱液,待衍生化.1.2.3萃取物的衍生化在上述处理好的残渣中加入100μL衍生试剂,密封后70℃水浴衍生1h;衍生完毕,氮气吹干多余的衍生试剂,用正己烷定容至0.5mL,待GC2MS分析.1.3标准溶液的配置及标准曲线的测定氯霉素标准溶液的配制:准确称取100mg左右氯霉素,用甲醇定容至100mL,取该溶液100μL稀释至10mL作为工作溶液.配置一系列不同质-1量浓度的标准溶液(0.55,5.5,11.0,55.0,110.0,220.0μg·L),衍生化,进样分析,以标准溶液进样前的质量浓度和组分色谱峰面积作标准曲线.线性回归方程为y=18955x-4097.6,回归系数r=0.9998.2结果与讨论2.1气相色谱质谱定性、定量检测氯霉素氯霉素硅烷化衍生物的结构式和用负化学电离源检测的质谱图如图1所示.从图1可看出,在分子离子峰附近有一簇强峰外,其他峰都较弱.由于氯霉素衍生物分子中有2个同位素丰度较大的氯图1氯霉素衍生物的质谱图原子,其同位素峰比较有特征.m/Z=466的峰为分子离子峰,m/Z=468的峰为M+2峰,m/Z=470的峰为M+[7]4峰,三者的相对丰度比约为100∶75∶15,可用于氯霉素定性、定量检测的选择离子. 234北京师范大学学报(自然科学版)第40卷2.2预处理方法的建立-12.2.1提取的平均回收率R…分别在缓冲体系中加入10.5,105,1050μg·L的标准溶液100μL,按1.2.1节中的提取方法进行提取并衍生.每个质量浓度做3次重复实验,每个样品进样3次.GC2MS测定该提取方法的R…>95%,相对标准偏差sr<5%.2.2.2硅胶柱的净化及不同量氯霉素的R…活化条件的选择:固相萃取柱的活化有2个目的,一是激活固定相表面的活性基团的活性,创造出一个和样品溶剂相匹配的环境;二是洗脱柱子中残留的杂质,使其对样品的分析不产生干扰.活化通常采用2个步骤,先用洗脱能力较强的溶剂(初溶剂)洗脱去柱中残存的干扰物,激活固定相;再用一种洗脱能力较弱的溶剂(终溶剂)淋洗柱子以使其与上样溶剂匹配.本实验选用5mL乙腈为初溶剂、5mLV(二氯甲烷)∶V(正己烷)=1∶1的混合液为终溶剂来活化柱子.终溶剂的洗脱强度一般低于上样溶剂的强度,若强于上样溶剂的洗脱强度,可能会造成样品在上样时丢失,样品的R…降低.淋洗条件:分析物得到保留后,需要用洗脱强度略强于或等于上样溶剂的淋洗液来淋洗固定相,以洗掉尽可能多的干扰组分.实验发现用5mLV(二氯甲烷)∶V(正己烷)=1∶1的混合液作为淋洗剂不会造成氯霉素的损失.洗脱条件:由于氯霉素在硅胶柱上有较强的保留,即使选用极性较强的有机溶剂乙腈或甲醇,R…也低于70%.5mLφ=20%乙腈溶液洗脱可以使大部分氯霉素洗脱下来.洗脱液再用3mL乙酸乙酯分3次提取.不同量的氯霉素标准表1不同量的氯霉素在硅胶柱和C18柱上的RŠ(n=3)样品在上述预处理条件下氯霉素上样量R…(硅胶柱)R…(C18柱)sr(硅胶柱)sr(C18柱)测定的R…见表1.由表1可见,m/ng%次数标准样品在硅胶柱上的R…10596.699.35.74.36基本上均达到90%以上,10.595.298.86.74.261.0593.496.5117.86sr也在11%以内.[829]2.2.3C18柱的净化及不同量氯霉素在C18柱上的R…根据以上固相萃取柱净化原理,通过实验摸索确定C18柱的净化条件为:5mL乙腈、5mL水活化;φ=5%的乙腈溶液溶解残留物上样;5mL水淋洗;5mL乙腈洗脱.不同量氯霉素标准品在C18柱上的R…见表1.从表1数据看出,R…均在95%以上,sr也在8%以内.2.3方法的实际应用2.3.1蜂蜜中氯霉素的净化富集应用上面建立的最优提取和净化富集方法,对氯霉素阴性蜂蜜样品及氯霉素加标蜂蜜样品进行预处理和气相色谱质谱定量测定.图2和图3为经过净化后的氯霉素阴性蜂蜜样品和氯霉素加标蜂-1蜜样品(加标量为0.5μg·kg)的色谱图.从图中看出,蜂蜜样品得图2加标蜂蜜样品的气相色谱图到了良好的净化和富集,在氯霉素 第2期刘宜孜等:固相萃取-气相色谱-质谱联机分析蜂蜜中的氯霉素残留量235衍生物色谱峰(tR=8.80min)附近没有杂质峰的干扰.2.3.2加标蜂蜜中氯霉素的R…及最低检出限准确称取氯霉素阴性蜂蜜样品,分别在其中加入不同量的氯霉素标准品,经提取、固相萃取净图3氯霉素阴性蜂蜜样品的气相色谱图化富集、衍生化和气相色谱质谱分析测定来考察检测方法的R…和最低检出限,其结果见表2.从表2数据可看出,不同加标量氯霉素的表2氯霉素在蜂蜜样品中的RŠ(n=3)R…在80%到95%之间.当氯霉素的加入量为0.加标量R…sr-11ng·g时,其色谱峰的信噪比大于3.根据对测定次数-1%ng·g痕量残留物检出限的规定,该方法对蜂蜜中氯0.180.518.212-1霉素残留量的最低检出限为0.1μg·kg.在检0.285.316.78出限氯霉素的R…>80%,s1.091.212.38r=18.2%,均优于痕2.093.48.68量残留物检测要求的指标.10.094.27.282.4蜂蜜样品中氯霉素的检测对不同来源的氯霉素阳性蜂蜜样品1～4号利用上述方法进行样品的提取、富集、净化和气相色谱质谱的-1定量分析,其中氯霉素的残留量分别为0.18,1.20,0.85,0.45μg·kg.3参考文献[1]LongA,HsiehL,BelloA,etal.Methodfortheisolationandliquidchromatographicdeterminationofchloramphenicolinmilk[J].JAgricFoodChem,1990,38:427[2]GantvergA,ShishaniI,HoffmanM.Determinationofchloramphenicolinanimaltissuesandurineliquidchromatography2tandemmassspectrometryversusgaschromatography2massspectrometry[J].AnalChimActa,2003,483:125[3]ImpensS,ReybroeckW,VercammenJ,etal.Screeningandconfirmationofchloramphenicolinshrimptissueusing22ELISAincombinationwithGC2MSandLC2MS[J].AnalChimActa,2003,483:15[4]PosyniakA,ZmudzkiJ,NiedzielskaJ.Evaluatinofsamplepreparationforcontrolofchloramphenicolresiduesinporcinetissuesbyenzyme2linkedimmunosorbentassayandliquidchromatography[J].AnalChimActa,2003,483:3073[5]谢孟峡,刘媛,蒋敏.固相萃取气相色谱质谱分析肉样中盐酸克伦特罗的残留量[J].分析化学,2002,30(11):1308[6]刘媛,丁岚,谢孟峡,等.动物组织中阿莫西林残留的液相色谱分析方法研究[J].色谱,2003,21(6):541[7]KijakPJ.Confirmationofchloramphenicolresiduesinbovinemilkbygaschromatography/massspectrometry[J].JournalofAOACInternational,1994,77(1):34[8]GudeT,PreissA,RubachK.Determinationofchloramphenicolinmuscle,liver,kidneyandurineofpigsbymeansofimmuoaffinitychromatographyandgaschromatographywithelectron2capturedetection[J].JournalofChromatography,1995,B673:197[9]AkhtarMH,DanisC,SauveA,etal.Gaschromatographicdeterminationofincurredchloramphenicolresiduesineggsfollowingoptimalextraction[J].JournalofChromatography,1995,A696:123 236北京师范大学学报(自然科学版)第40卷DETERMINATIONOFCHLORAMPHENICOLRESIDUEINHONEYBYCOUPLINGSOLID2PHASEEXTRACTIONWITHGASCHROMATOGRAPHY2MASSSPECTROMETRYLiuYiziXieMengxiaHanJieLiuYuanQiuYuemingDingYayunZhangLei(AnalyticalandTestingCenter,BeijingNormalUniversity,100875,Beijing,China)AbstractSolidphaseextraction(SPE)andgaschromatography2massspectrometricmethodareappliedforthedeterminationofresiduesofchloramphenicolinhoneysamples.TheretentionbehaviorofchloramphenicolonSPEcolumnsisinvestigated.ItisfoundthattherecoveryofdifferentquantitiesofchloramphenicolontheSI21columnsisabove90%.Theaveragerecoveryofchloramphenicolinhoneysamplesis73%295%.Therelativestandarddeviationis7.2%218.2%andthedetectionlimitis0.1μg-1·kgforhoneysamples.Theselectedionmode(SIM)detectionmethod(ionsselected:466,468,470)isusedforthedetectionofthechloramphenicolderivatives.Thereisagoodlinearcorrelation(r=0.999-18)betweenthepeakareasandtheconcentrationofchloramphenicolintherangeof01552220μg·L.Keywordschloramphenicol;gaschromatography2massspectrometry;solidphaseextraction;honey