天麻Gastrodiaelata的仿野生栽培实验及共生蜜环菌Armillaria的遗传多样性研究 66页

云南大学2013届硕士学位论文天麻(Gastrodiaelata)的仿野生栽培实验及共生的蜜环菌(Armillaria)遗传多样性研究GeneticdiversityofArmillariaspeciesandthelJ●·●一■●■●●11●CUltⅣatlon0I“傩Z阳口l口倒口以laSlnWllnenVlronmentS研究生：张德著学号：1201001008导师：张汉波教授专业：微生物学项目资助叶内共生真菌对入侵植物紫茎泽兰逃逸天敌作用的影响(国家自然科学基金项目编号：30960077) 扉页：独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果，对本文的研究做出贡献的集体和个人均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：鎏i爱荛日期：塑垒垒：垒论文使用和授权说明本人完全了解云南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文和论文电子版；允许论文被查阅或借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。(保密的论文在解密后应遵循此规定)研究生签名：邀熊!塞导师签名：本人及导师同意将学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”进行电子和网络出版，并编入CNKI系列数据库，传播本学位论文的全部或部分内容，同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。研究生签名：．一j——导师签名：．一日 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究摘要天麻为古老的兰科植物，具有悠久的入药历史。对天麻人工栽培的研究，不但可以缓解天麻在市场及药用方面紧缺的现状，更有利于我国山区经济的发展。本研究以天麻、蜜环菌、树木为研究对象，针对培养蜜环菌的基本营养、碳源、氮源和培养温度探索蜜环菌的培养条件，在天麻仿野生栽培中，对影响天麻产量的蜜环菌接种量、树木类型及无机元素进行考察，于云南昭通小草坝天麻种植基地开展天麻的仿野生栽培实验。此外，对昭通天麻共生蜜环菌的遗传背景进行了分析。初步得出以下结论：1、实验室培养蜜环菌受多种因素的影响，在传统培养真菌的PDA培养基上蜜环菌长势并不好，而以玉米粉和麦芽粉为基本营养的培养基更有利于蜜环菌的生长，其菌索长度均值为2．88cm、分支数均值为26．8，生长速度几乎为PDA培养基的两倍；2、不同树木对蜜环菌生长的影响不同，在测试的木材中，十齿花无论是在实验室条件下还是野外种植实验中均对蜜环菌的生长有较好的促进作用，且用于天麻栽培较另外两种木材产量高；不同木材的韧皮部较木质部更有利于蜜环菌的生长，并达到显著差异；3、天麻仿野生栽培实验，其产量随接种蜜环菌量的增加而增加，接种量为5008／穴的天麻产量(O．35kg)，与接种量为2509栽培的产量(O．27kg)达到显著差异；伴栽的树木种类明显影响其产量；施加于土壤的无机元素对其产量无显著影响；4、不同种植环境下天麻的产量不同，林外裸地种植天麻产量(O．28kg／穴)高于林内(0．22kg／穴)，且种植周期短；5、昭通小草坝地区的蜜环菌具有一定程度的遗传多样性及地域独特性，外来的蜜环菌可以长期存在并影响当地蜜环菌对天麻的侵染。研究结果不论对人工仿野生天麻种植具有重要指导意义，对今后当地的蜜环菌菌种资源开发也奠定了重要前期基础。关键词：天麻，蜜环菌，共生，栽培，遗传多样性 AbstractGastrodiaisanancientplantoftheOrchidaceaefamily,asavaluabletraditionalChinesemedicinefornearlytwocenturies．ToresearchthecultivationofGelata，itisnotonlyrelievethesituationthatGastrodiadisappearanceorshortsupplyinthemarketandinmedicalpractice，butalsopromotetheeconomydevelopmentinthemountainarea·Inthisstudy,TheGelata，ArmillariaandtreewoodwereresearchedtostudythecultivatingconditionofArmillariaincludingbasicnutrition，carbonsources，nitrogensourcesandtemperature．AndtheinoculationvolumesofArmillaria，thetypesoftreewoodsandinorganicelementswereinvestigatedthateffectonyieldofGelataincultivationofGelata．ThecultivationexperimentWascarriedoutinXiaocaoba,Zhaotong，YunnanprovenceofChina．Inaddition，thegeneticbackgroundofArmillariainthisareawasalsostudied，severalconclusionsweremade：1．AvarietyoffactorsCanaffectthecultivationofArmillariaspeciesinlaboratory．Inthiscase，thetestedstraingrowsnotwellinthePotatoDextroseAgarmedium(PDA)，butsupplementofthecomflourandmaltextractpowdersignificantlystimulatethestrain’Sgrowth，andthelengthandthenumberofrhizomorphwere2．88cm，26．8，respectively．ItWastwicefasterthangrowthonPDAmedium．2．TheleachingsolutionsofdifferenttreewoodsshoweddistincteffectsonthegrowthofArmillariaspecies．Amongofthetestedtreewoods，DipentodonsinicusWasthebestonebothforthegrowthofArmillariainthelabandformeproductionofGelatainwildcultivationexperiment．AndtheyieldofGastrodiacultivated、析thD．sinicuswashigherthantheothertwotreewoods；besides，thephloemleachingsolutionWasmoreconducivetothegrowthofArmillariathanthexylemleachingsolution．3．TheyieldofGastrodiaisincreasedastheinoculationvolumeofArmillariaspeciesincultivationofGelata．TheyieldofGastrodiacultivatedwith5009perholeWassignificantlydifferentfromthatwith2509perhole．ThetypeoftreewoodsalsosignificantlyaffectedtheyieldoftheGastrodia，however,inorganicelementsaddedinsoilhadnoeffectsonthecultivationofGealta．4．Relatively,theyieldofGastrodiacultivatedontheopenground(0．28kgperhole)Waslargerthanthatintheforest(0．22kgperhole)andshorterontheculturecycle．II 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究5．TheArmilIariastrainshadavarietyofgeneticdiversityintheZhaotongregion，andthegeneticstructureisendemic．Inaddition，ourdatashowedthattheartificiallyintroducedArmillariaspeciescouldaffecttheinfectionoflocalArmillariaontheGelataandsuchaneffectcouldlastforsixyears．OurdatanotonlyprovideasuggestionforartificialcultivationofGelatainwild，butalsoconstructthestrainresourceforexploringtheendemicArmillariainfuture．Keywords：Gelata，Armillaria，symbiotic，cultivation，geneticdiversityIII 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．IAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．II第一章前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11研究背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1天麻简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．1天麻的药用价值⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2天麻的种类及其生境分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1．3天麻栽培的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2蜜环菌的研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．1蜜环菌的生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．2蜜环菌的培养特性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2．3蜜环菌的分类及遗传多样性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．3蜜环菌、天麻与树材之间的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72本研究的目的及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9第二章蜜环菌培养条件初探⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．1蜜环菌培养条件筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．111．1．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．1．2正交实验设计⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．111．1．3蜜环菌菌株的活化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．1．4蜜环菌培养条件的筛选以及培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．2不同木材浸出液对蜜环菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．121．2．1不同木材的采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．121．2．2木材的处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一131．2．3蜜环菌的接种和培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一l31．3数据记录和处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究2．1蜜环菌培养条件的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1．1基于菌索长度的分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．142．1．2基于菌索分枝数的分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．172．2不同木材浸出液对蜜环菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．2．1韧皮部浸出液对蜜环菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．212．2．2木质部浸出液对蜜环菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．2．3韧皮部和木质部浸出液影响蜜环菌生长的对比分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24第三章天麻的仿野生栽培试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．251材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．251．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．251．2试验设计及安排⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．251．3菌材的培育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．261．4天麻的无性栽培⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．261．5天麻的采收及数据分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．262结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272．1天麻仿野生栽培中各因素对天麻产量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．272．2林下和林外裸地两种不同种植环境对天麻产量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29第四章昭通地区天麻共生蜜环菌的遗传多样性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3l1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯311．1蜜环菌菌株的采集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．311．2蜜环菌菌株的分离和纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．311．3蜜环菌菌株的分子鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．321．3．1基因组DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯321．3．2ITS／IGSrRNA的基因扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．331．3．3PCR产物的纯化测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯331．3．4序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．341．3．5系统发育树的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．1菌株的采集情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．34 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究2．2ITS／IGSrRNA的基因扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．3ITS／IGSrRNA的基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．352．3．1ITSrRNA的基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．352．3．2IGSrRNA的基因序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．362．4系统发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．40第五章结论和讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．421蜜环菌的生长受多种因素的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯■．422不同树木、同一树种的韧皮部和木质部浸出液对蜜环菌生长的影响有差异．423仿野生栽培的天麻其产量明显受蜜环菌接种量及菌材种类的影响，无机元素对其产量影响不显著⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434林外裸地种植天麻其产量高且种植周期短⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．445昭通地区与天麻共生的蜜环菌具有一定程度的遗传多样性及独特性，外来蜜环菌可以长期存在并影响本地蜜环菌对天麻的侵染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯456展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．47附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．48参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．57 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究1研究背景1．1天麻简介1．1．1天麻的药用价值第一章前言天麻在我国已有2000多年的应用历史，早在东汉时期的《神农本草经》中就以赤箭为名有所记载(孙星衍，等，1996)，而“天麻”这一名称首次出现在刘翰和马志等人编撰的《开宝本草》中。古人认为，天麻生长神奇，若上天赐予、天所设施，且其状，类古时麻之鞋，故名谓天麻(赵存义和赵春塘，2000)。《中华人民共和国药典》记载天麻有平肝息风止痉的功效，用于治疗头痛眩晕、肢体麻木、癫痫抽搐、d,JL惊风、破伤风等疾病(潘正安和孙小芳，2005)。作为中药中的上品，天麻能延年益寿、可长期服用并且无毒副作用(Pei．JuChenandLee．YanSheen，2011)，广泛用于治疗头痛、眩晕、偏瘫、风湿等疾病(TangandEisenbrand，1992)。天麻的许多组分或提取物，诸如：天麻素、香草醛、对羟基苯甲醛等，具有抗惊厥作用以及抗氧化活性，能清除自由基、保护神经细胞免受由于红藻氨酸、氯化铁等物质引起的损伤，还可以抑制由于过氧化氢和氯化铁等引起的脂肪过氧化反应。对多巴胺神经元细胞的保护作用显示天麻提取物可能对帕金森疾病有治疗效果。此外，天麻也有用于治疗抑郁、焦虑、精神分离等疾病，在动物实验中发现天麻提取物具有很好的抗抑郁疗效，在改善记忆方面，天麻提取物、天麻素以及对羟基苯甲基醇等组分对由东莨菪碱、环己酰亚胺、阿朴吗啡、氯化铝等药物诱发的记忆障碍具有治疗效果(ChenandSheen，2011)。日本用天麻治疗老年性痴呆，其效率达81．8％(徐锦堂，1993)。随着天麻改善记忆与抗衰老作用以及对免疫系统药理作用研究的不断深入，天麻的用途越来越广泛(田代华，2002)。天麻的许多其他功能诸如：抗癌、治疗哮喘以及治疗心脑血管疾病(ChenandSheen，2011)也有被发现。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究1．1．2天麻的种类及其生境分布天麻(Gelata)属于兰科(Orchidaceae)、树兰亚科(Epidendroideae)、天麻族(Gastrodieae)、天麻亚族(Gastrodinae)、天麻属(Gastrodia)(张光明和杨廉玺，2007)。全世界已发现该属植物约有30余种，主要分布于热带、亚热带、温带及寒温带的山区(徐锦堂，1993)，中国确认有14个种(张光明和杨廉玺，2007)。中国天麻分布区，主要是天麻(Gelata)，根据花的颜色、花茎的颜色、块茎形状等将其分为4个变型：红天麻(Gelataf．elata)、绿天麻(Gelataf．viridis)、乌天麻(Gelatafglauca)、黄天麻(Gelataf．flavida)(周铉等，1983)。全国天麻栽培区主要是红天麻、乌天麻和绿天麻(徐锦堂，1993)。野生的天麻主要在杂木林或杂木林遭到破坏后进入林中生长(周铉，1973)，在林区大森林深处很少有天麻分布(徐锦堂，1993)。天麻生长地区除了要求有丰富的森林资源外，对分布区的气候条件也有特殊要求，主要表现为分布地区常年多雨、潮湿、凉爽等。我国的天麻分布大致可以划为三大部分：东北沿长白山山脉地区(海拔300～1000m)；沿秦岭以东、西两条线延伸，包括陕南、川北及云贵高原等高山区(海拔1000～2700m)；四川由峨眉至乌蒙山地区。总体上天麻在同一纬度下的垂直分布受一定海拔限制，其适宜天麻生长的气候条件也比较特殊，就我国天麻主要产区来看年平均气温在11℃左右、1月最低平均气温在．4℃左右，年降水量范围在700～1700mm上下，相对湿度在90％左右，具有180-220d的无霜期，偏好腐殖质或比较疏松湿润的土壤(徐锦堂，1993)。1．1．3天麻栽培的研究现状天麻在我国虽有2000年的入药历史，但我国历代古籍除记录其分布、药性和采收加工外，并未见天麻人工栽培成功的论述。其来源靠大量的采挖野生的天麻，自然资源遭到严重的破坏，天麻曾经在市场上一度处于无货供应的状态。为解决医疗用药对天麻的需求，50年代末至60年代，中国医学科学院药物研究所及湖北、四川、云南等省一些科研和生产部门，相继开展了天麻野生变家栽的研究工作(徐锦堂，1993)，并于1965年利用自然感染蜜环菌的木材栽培天麻获得高产，尤其是1971年在海拔50m的北京平原地区栽培天麻获得成功，使得天麻栽培范围得到进一步的扩展(中国医学科学院药物研究所，湖北省利川县国营福宝山药材场，2 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究1973)。此外1967年四川省采用蜜环菌菌索、新鲜木段和天麻种“三下锅”的栽培方法获得成功(徐锦堂，1993)。周铉用种子繁殖实验，达到了1％．10％的发芽率，播种所产的块茎获得了数倍的产量(周铉，1974)。并且有性繁殖解决了由于无性繁殖产生的种麻退化问题(XuandGuo，2000)。1989年徐锦堂等完整的阐述了天麻的生活史：由天麻种子萌发到作无性栽培种的白头麻，只需要半年时间，白头麻播种后经过一年半时间即可收获商品麻(箭麻)，完成由种子到下一代种子成熟的全部生活史只需要三年的时间(徐锦堂，等，1989)。G(引自徐锦堂，1993)A．播种当年：B．第二年；C．第三年；D．种子；E．原球茎；E米麻；G白麻；H．箭麻；I．死亡的原球茎；1．种子接萌发菌；2．未能蜜环菌；3．接蜜环菌；4．早期接菌；5．晚期接菌：6．箭麻抽茎、开花、结种。A．theyearwhentheseedissowed；B．thesecondyear；C．thethirdyear；D．seed；E．theprotocorms；EjuveniletuberS；Gimmaturetubers；H．maturetuberS；I．perishedoriginalstemtuber1．肱osmundicolalarge-infectedseedsprouts；2．non彳．mellea-infectedseed；3．A．mellea-infectedseed；4．seedinfectedwithA．melleaatanearlytime；5．seedinfectedwithA．melleaatalatertime；6．maturesprouts，bloomandseeds．天麻的整个栽培史，总体上是50年代开始人工栽培试验并于60年代获得成功；70年代形成一套较完整的天麻无性繁殖栽培技术且人工栽培的天麻开始供应 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究市场；80年代天麻的有性繁殖理论研究以及其播种技术有突破性进展，并形成了一套行之有效并适合大面积生产的种子播种方法，其栽培的天麻开始大量供应市场(徐锦堂，1993)。现今对于天麻的栽培，主要围绕如何提高天麻产量来展开，王秋颖等发现不同来源的蜜环菌对天麻产量具有不同的影响。蜜环菌的长势对天麻产量的影响是呈正相关的，即菌株生长速度快、菌索粗壮且分枝多、菌索内菌丝色白，其伴栽的天麻产量高、品质优(王秋颖，等，2001；季宁和李玉，2008)。华秀爱(2004)通过液体培养蜜环菌，并利用秸秆包裹木屑等原料替代木段栽培天麻，获得了高产并缩短了栽培周期。不同菌材(杨志兵，等，2011)、不同海拔(曾勇，等，2011；余昌俊，等，2008)对天麻种植产量的影响也相继被研究。1．2蜜环菌的研究概况1．2．1蜜环菌的生物学特性蜜环菌(Armillaria)属于担子菌纲(Basidiomycota)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)，是一种兼性寄生菌，以腐生为主，兼营寄生生活。作为腐生菌，在林间倒木、死树根、枯枝及落叶上较常见，以分解木质素及纤维素为营养，将腐木分解为腐殖质从而加快了物质循环、加大了森林土壤的肥力，同时减少了害虫寄生和越冬的场所，为森林清理出有利于再生长的空间(徐锦堂，1993)，这是蜜环菌作为腐生菌有利的一面。但作为寄生菌，在温带和热带地区蜜环菌常作为植物的病原菌引起植物根腐病并导致其死亡(Hood，eta1．1991；Coetzee，2001)，可寄生在大约600种灌乔木上，好气、需有氧才能生长，对蜜环菌根腐病的研究也一直是蜜环菌研究的热点，关于研究蜜环菌根腐病的文献在相关文献中所占比例也是最大的(孙立夫，2003)。但蜜环菌并非完全致病，相反有些植物必须有该菌侵染才能正常生长，甚至有些大型真菌茵核，如：猪苓(polyporusumbellatus)也必须靠蜜环菌侵染为其提供营养才能生长繁殖(邓艳芹，2007)。蜜环菌在不同的生长发育阶段，有菌丝体和子实体两种形态，其中菌丝体为蜜环菌的营养体，有菌丝和菌索两种形式：初生菌丝为极纤细的丝状体(3～51am)，在高倍镜下为无色透明、有分隔、管状的多细胞；菌索由菌丝束组成，似绳索状4 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究或植物根状，表面由排列紧密的菌丝组成，角质化，对不良环境具有较强的抵抗力，具有高度的功能分化，在侵染寄主和营养传递方面具有重要的作用。蜜环菌的子实体丛生于树桩、倒木或死树上，其菌盖肉质，多呈伞状，半球形，密黄色或土黄色，菌柄纤维质，海绵状、松软，圆柱形，具有双环或者脱落，其基部有根状菌索，孢子圆形或者椭圆形(7～8×5～5．5pm)、孢子印白色(徐锦堂，1993)。各种生态因子对蜜环菌生长有很大的影响(云南省昭通地区科学技术委员会，1977)：在6～30℃温度范围内蜜环菌均能生长，但以25℃的生长速度最快；在自然条件下，蜜环菌的生长环境与多雨潮湿相联系，Benton和Ehrlich(1941)发现蜜环菌在木材中生长的最适湿度是150％，在大气相对湿度为90％以上时才能大量产生子实体；光能抑制蜜环菌菌丝的生长，处于目光照射下的菌索，其老化速度较快、再生能力弱，Doty和Cheo(1974)通过观察培养在连续光照条件下的蜜环茵，发现蜜环菌生长受抑制程度高达80％。在野生自然条件下，蜜环菌虽然可以寄生或腐生于多种树木上，但在不同的树木上其长势具有差异。据徐锦堂描述蜜环菌以壳斗科的板栗、槲栎、栓皮栎、杨柳科的旱柳及桦科的桦木长势最好，以毛白杨、白皮松次之，而在刺槐、合欢、杉树上的长势最差(徐锦堂，1993)。在实验室内培养蜜环菌，光照射培养基后会产生对蜜环菌生长有抑制作用的物质，接种蜜环菌后菌索生长情况不如新配制的培养基好且易产生色素；葡萄糖是蜜环菌的最佳碳源，芝麻粉和黄豆饼粉等有机氮对菌丝生长有促进作用，无机氮硫酸铵对其生长没有促进作用(张光明和杨廉玺，2007)。而以蜜环菌生物量为考核指标的研究中显示，蜜环菌对碳源的选择性高于对氮源的选择性，且可以利用的碳源范围较广，但对不同碳源的利用能力有较大的差异，其中甘露糖在促进其生物量方面最为有效，而乙醇则能促进蜜环菌产生更多的非皮壳状的气生菌丝(程显好和郭顺星，2006)。彭述敏等发现蜜环菌对单糖的利用效率最好，醇类次之，不易利用多糖；有机氮中的酵母膏、蛋白胨有利于菌索的生长，无机氮和氨基酸次之，酸水解酪蛋白最差(彭述敏，等，2010)。在实验室培养蜜环菌，初长出的菌丝乳白色、绒毛状，随着培养时间的延长，颜色逐渐加深为红褐色并分化为菌索，通气量不足则菌丝体生长不良。蜜环菌为 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究发光真菌家族中的一员，其菌丝和幼嫩的菌索可以发出青白色的荧光，虽然其发光机理的研究很少，但其发光特性已经被应用于蜜环菌的鉴定以及根据在培养蜜环菌过程中有杂菌污染时不会出现发光现象，来排除并停止培养已经污染的培养物，此外其发光特性也有用于在野外寻找被蜜环菌侵染的树材，利用夜间找寻发光的树根来栽培天麻并获得增重的天麻块茎(徐锦堂，1993)。在野外条件下，蜜环菌虽然可以腐生或寄生在数百种树木上，但是不同的树种培养蜜环菌，蜜环菌的长势不一样(徐锦堂，1993)，而蜜环菌的生长速度与天麻的产量成正相关(王秋颖，等，200．1)。因此，在天麻种植过程中，须选择最适合蜜环菌生长的树种。。1．2．3蜜环菌的分类及遗传多样性研究蜜环菌的分布范围较广，不同环境下生长的蜜环菌，其形态多样化，按照形态特征分类具有很大的局限性。我国学者以蜜环菌(Armillaria)为属名，按形态特征鉴定了6个中国蜜环菌种(邓叔群，1963)，戴芳澜(1979)鉴定了蜜环菌属和小蜜环菌属(Armillariella)的6个种(戴芳澜，1979)，其属名和种名对后来蜜环菌的鉴定具有一定的影响。但随着分类学的发展，尤其是Korhonen发现蜜环菌的四极性异宗配合遗传交配机制(KorhonenK．，1978)，根据培养蜜环菌时，不同种类的菌丝间由于相互拮抗无法融合，从而在两个菌落之间产生明显的拮抗黑线，判断为两个互交不育群(intersterilitygroup)，即不同的生物种(biologicalspecies)。自此，蜜环菌的分类由过去纯形态的、人为的主观分类转向了以互交不育群(生物种)为基础的客观分类(赵俊和赵杰，2007)。尤其是随着分子生物学手段运用于蜜环菌的鉴定，使得蜜环菌的分类更为系统和科学。李海波等(2008)用ITS和IGS序列对黄绿蜜环菌(Armillarialuteo．vireens)进行分子鉴定，其ITS序列系统发育关系表明黄绿蜜环菌与口蘑科内其它属间物种的系统发育关系较远，基于IGS的系统发育分析也表明黄绿蜜环菌与蜜环菌属内的其它种序列差异较大，’系统发育关系较远，而与Lepiota属内的部分种具有较近的系统发育关系。有文献报道，在原有蜜环菌属的分类体系中，大部分种类已经不属于蜜环菌属，相继转移到伞菌目其它属中(赵俊，等，2005)。此外，P6rez等对英国不同蜜环菌种的IGS扩增片段进行了酶切，发现A．mellea、A．gallica和 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究A．tabescens具有独特的酶切类型，并且A．ostoyae可以通过酶切将其与A．borealis和A．cepistipes区分开(Pdmzeaa1．，1999)。Tsykun等对IGS扩增片段采用4种不同限制性内切酶，对喀尔巴阡山脉森林保护区的蜜环菌进了限制性片段长度多态性(restrictedfragmentlengthpolymorphisms)分析，首次鉴定了A．cepistipesandA．gallica两个种在当地的土壤里和根上比较频繁(Tsykuneta1．，2011)。除ITS基因和IGS基因外，EF．10【基因也被用于蜜环菌的鉴定(Maphosaeta1．，2006；Antonineta1．，2009)，Hasegawa等(2010)发现EF．10【基因相对于ITS、IGS基因更适合用于蜜环菌的鉴定。最近日本学者采用EF—ls基因、ITS基因对日本未知的蜜环菌菌株进行了鉴定，根据EF．1s和ITS的系统发育关系分析，显示其序列与之前报道的蜜环菌种不相同，而与来自澳大利亚、新西兰以及印度的彳．novae-zelandiae在一个姐妹支上且具有很高的支持率(Otaeta1．，2011)。根据王汉臣(2010)对全球蜜环菌的分类总结：目前世界蜜环菌生物种的报导情况是欧洲7个，北美10个，非洲5个，澳洲5个，亚洲根据报道至少存在19个生物种，且发现新种的可能性较大。全球至少存在40种不同的蜜环菌(Baumgartnereta1．，2010)，而对天麻共生蜜环菌的研究较少。1．3蜜环菌、天麻与树材之间的关系天麻的祖先为较原始的兰科植物，经过长期演化其叶绿体退化，缺少叶绿素，除极度退化的膜质鳞片外，无根和叶的分化(周铉，1973)，需要与两类真菌(小菇和蜜环菌)共生才能完成从种子萌发形成米麻、白头麻、箭麻以及到下一代种子成熟的整个生活史(徐锦堂，等，1989)。前者在天麻有性繁殖阶段促进其种子的萌发，后者在天麻无性繁殖阶段为其提供生长所需的营养，自1911年日本学者Kusano发现天麻靠消化浸染的蜜环菌菌索获得赖以生存的营养物质以来(Kusano，1911)，学术界对二者间关系的讨论就存在共生、寄生、气生、腐生及相互寄生、食菌植物等不同的见解(张光明和杨廉玺，2007)。这种特殊关系主要表现为：天麻的无性繁殖阶段需与蜜环菌建立共生营养关系才能正常生长发育(徐锦堂和兰进，2001)，蜜环菌也能从天麻中获取营养(兰进和徐锦堂，2004)，当侵染天麻的蜜环菌菌索延伸至天麻块茎时，菌索顶端生长点突破天麻块茎表皮后侵入皮层内部并利用块茎细胞内含物使其成为空胞，而当蜜环菌菌索侵入到位于天麻块茎 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究的中柱与皮层交界处的几层特殊“消化层"细胞时，菌索反被这些细胞消化利用，成为天麻的营养，也即是二者为相互寄生关系(王桂琴，2007)。当天麻生长缓慢且与其共生的蜜环菌生长过旺时，两者问的营养关系失衡，天麻会被蜜环菌分解从而出现反消化现象。在天麻生活史的不同阶段，与蜜环菌的关系要经历拒菌、控菌、开放三个阶段：拒菌期，天麻的新生球茎开始形成，会抗拒蜜环菌的侵入，这时它的体表及内部均无蜜环菌；控菌期，天麻次级球茎出现，原球茎接受蜜环菌侵入，并将其控制在表皮组织或接菌组织中，进行细胞内的分解、消化而构成天麻内生菌根的特殊结构，这时蜜环菌的活动受到严格控制；开放期，当天麻次级球茎发育完成后，原来的球茎完成其使命，这时它对蜜环菌全部开放，被蜜环茵消化吸收(徐锦堂，1993)。作为兼性寄生真菌，蜜环菌能在600多种树木或草本植物及竹类上生活，除能在活树、草根上寄生外，还可以腐生在死树根或树干、落叶上生长。天麻又需要与蜜环菌共生，依靠蜜环菌提供营养才能生长。所以树材便是天麻、蜜环菌生长的营养物质基础，“天麻一蜜环菌一树材”三者之间已构成了一个自然“食物链”，下图为徐锦堂描述天麻、蜜环菌、树桩之间的关系示意图，生动地说明了三者之间的关系(徐锦堂，1993)。(引自徐锦堂，1993)虽然在世界范围内已有很多蜜环菌生物种被报道，亚洲报道的蜜环菌生物种数量远多于其它洲，推测在亚洲至少有19个蜜环菌生物种，且迄今为止在亚洲包 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究括中国的一些地区仍然有大量的地区是蜜环菌生物种研究的空白(王汉臣，2010)。但如此多的生物种中与蜜环菌存在共生关系的仅仅只有几个生物种被报道，其中日本学者报道了其中有六个与天麻共生的蜜环菌生物种：A．ostoyae，A．gallica“．bulbosa)，A．jezoensis，A．sinapina，A．singula及A．nabsnona(ChaandIgarashi，1995；Sekizakietal，2008)，中国学者认为适合天麻生长的蜜环菌只是少数的几种(王秋颖和郭顺星，2002)。在每一生物种内，根据产地不同又分为不同的菌株，在适合天麻生长的蜜环菌菌株范围内，每一种菌株对天麻产量的影响也是不同的(张光明和杨廉玺，2007)。因此，对于优良的蜜环菌菌株的选育工作用以提高天麻的产量和质量的工作也有在研究(王秋颖，等，2001；季宁和李玉，2008)。2本研究的目的及意义我国天麻大都分布在山区，其气候条件和丰富的森林资源为天麻生长提供了优越的自然条件，但是大部分山区适耕地少，陡坡多、交通不便，先进农业技术推广不平衡，经济较落后的地区，农民收入低。由于在山坡种植天麻，不与农田争地；利用山区丰富的森林自然资源培菌伴栽，不用农家肥和化肥，不与农田争肥且无污染；并可利用老、弱劳力于闲散时间栽种、用工少，不与农业争劳动力和时间(徐锦堂，1993)。加上在山区进行天麻的仿野生栽培，即模仿天麻野外生长环境进行人工栽培，在保持野生天麻的品质的同时，还能增加天麻产量(曲宏国，2003)。因此在山区大力推广发展天麻的种植，不但有利于山区经济的发展，还可以缓解天麻在市场上紧缺的状况，更为其药用价值的进一步开发提供原材料。本研究主要围绕蜜环菌的生长条件、适合蜜环菌生长的木材以及当地与天麻共生的蜜环菌的遗传多样性方面展开研究，并考察了不同种植环境对天麻产量的影响。拟解决以下几个问题：1、是否可以找到某种木材用以促进天麻的产量，从而停止使用不能提高天麻产量或者对提高天麻产量效果不明显的树材，以减少对当地森林的毁坏?2、不同种植环境下栽培天麻，其产量有何不同?3、外地引入的蜜环菌是否会与本地野生的蜜环菌形成竞争从而影响本地蜜环菌与天麻的共生?4、当地野生的蜜环菌与已经报道的蜜环菌种在遗传背景方面是否有差异，甚 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究至有着独特的遗传背景?通过以上的研究，希望可以找到快速培养蜜环菌的培养基和适合天麻种植的树材，从而提高天麻产量、缩短种植周期；其次，筛选最适合天麻种植的木材，以避免不必要的木材浪费，并建议当地政府鼓励、支持当地农民种植适合天麻生长的树木，从而减少对当地森林的破坏；此外，对不同来源的蜜环菌的系统遗传分析，为以后选择具有促进天麻高产作用的蜜环菌菌株提供依据。10 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究第二章蜜环菌培养条件初探蜜环菌的生长速度与天麻产量成正相关(王秋颖，2001；季宁和李玉，2008)。在实验室条件下，探索优良的培养条件，可以为野外条件下培育菌材(被蜜环菌浸染的树木)以及大规模种植天麻奠定基础。其次，天麻的仿野生栽培过程中，木材种类影响蜜环菌的生长(徐锦堂，1993)，最终影响蜜环菌对天麻的感染及产量(王守现，等，2010)。蜜环菌虽然可以寄生或腐生在数百种树木上，但在不同树木上蜜环菌的长势不一样。此外，在天麻伴栽实验中发现蜜环菌的菌索很少浸染至树木的木质部，猜想是否树木的韧皮部较木质部更有利于蜜环菌的生长。鉴于此，本章围绕蜜环菌的培养条件以及用不同树木的韧皮部和木质部来探究蜜环菌的生长条件。1材料与方法1．1蜜环菌培养条件筛选1．1．1材料供试蜜环菌菌株(Mi)购买于云南大学微生物所。1．1．2正交实验设计实验选择培养蜜环菌常用的几个组分，考察了4个因素，每一因素设置3个不同的水平，采用L9(34)正交表对适合蜜环菌生长的条件进行筛选，因素及水平见表2．1。按照表2．2的实验方案得出9种不同的水平和因素组合，即制作9种不同的培养基。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究表2．1L9(34)正交实验的因素和水平(每个因素标注为字母A．D)Table2-1FactorsandlevelsfortheorthogonaidesignL9(34)(A-Daretherespectivecodesforeachfactor)上述物质的用量如下：马铃薯、天麻20朗，用自来水煮沸30min后取其浸出液，麦芽粉和玉米粉各取15酣，葡萄糖、蔗糖、甘露醇分别取20酬，蛋白胨、酵母膏分别取lg／l，无机氮元素包含29／1的KN03和29／1的NH4N03。1．1．3蜜环菌菌株的活化提前将蜜环菌Mi接种于PDA培养基(配方见附录1)上并于28℃避光培养2周，待菌株长好后备用。1．1．4蜜环菌培养条件的筛选以及培养按照表2．2的实验方案得出的培养基，121℃下灭菌20min，于无菌条件下分别倒入9cm的培养皿中制成平板，将活化后的蜜环菌(Mi)接种于上述各培养基中，每一个接种的菌块保持大小相同，每个处理进行3个重复，接种后的平板在相应的温度下避光培养(附录2)。1．2不同木材浸出液对蜜环菌生长的影响1．2．1不同木材的采集昭通地区常用来栽培天麻的树木：苹果树(Malusdomestica)、花楸(Sorbuspohuashanensis)、高山栲(CastanopsisdelavayiFranch)、算盘子(Glochidionpuberum)、十齿花(Dipentodonsinicus)、华榛(Coryluschinensis)、短柄稠李(Padus12 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究braehypoda)、峨眉栲(Castanopsisplatyacantha)、八角(Illiciumverum)、楠木(Phoebezhennan)、桦木(Betulaspp)、木荷(&办砌口superbaGardn)、野樱桃(Cerasusserrula)、五裂槭(Aceroliverianum)、小叶楠(Phoebemicrophylla)、山矾(Symplocoscaudata)、桤木(Alnuscremastogyne)、猴面石栎(Lithocarpusbalansae)。采集砍伐后的树木小段(长约20cm、直径5～10cm左右)带至实验室备用。1．2．2木材的处理采自昭通天麻种植区的木材，用刀将每一种树木的韧皮部和木质部分开，并切碎、晾晒干，按照干重109的量加100ml自来水的比例煮30min，然后取其浸出液100ml加29的葡萄糖、1．89琼脂制作固体培养基。1．2．3蜜环菌的接种和培养上述18种树木，以其韧皮部和木质部浸出液为基本营养制作36种不同的培养基，121℃下灭菌20min，于无菌条件下制作成平板，接种活化后的蜜环茵(Mi)，每一种培养基进行5个重复，保持接种量一致，接菌后置于25℃下避光培养(附录4)。1．3数据记录和处理观察上述培养的蜜环菌，当有菌索生长至培养皿边缘时(培养lOd左右)，记录菌索分支数及生长速度最快的菌索长度。以菌索分支数和菌索长度作为考核指标，应用SPSS软件(SPSSl3．O)，用其一般线性模型(GeneralLinearModel)中的单因变量(Univariate)分析方法对正交设计的数据进行方差分析(邓振伟，等，2009)。不同木材浸出液对蜜环菌生长的影响采用SPSSl3．0软件中单因素方差分析中的Games．Howell进行配对比较。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究2结果与分析蜜环菌培养条件的筛选按照表2—2安排的实验组合进行实验，记录菌索的长度和分支数，其均值及标准误差如下。表2-2L9(34)正交试验安排及结果Table2-2TheexperimentdesignL9(34)orthogonalarrayandresults注：A、B、c、D注释见表2．1，括号内为标准误差。2．1．1基于菌索长度的分析结果以蜜环菌(Mi)菌索长度为分析指标，通过SPSSl3．0软件分析上述四个因素对蜜环菌生长的影响，其方差分析结果见表2．3。14 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究表2-3基于菌索长度的方差分析Table2-3AnalysisofvarianceforthelengthoftherhizomorphDependentVariable：长度单位：cm8RSquared=．862(AdjustedRSquared=0．800)由其均方(MeanSquare)值可知：基本营养(马铃薯浸出液、天麻浸出液和玉米粉及麦芽粉)对蜜环菌菌索长度的影响最大(均方为42．01)，其次是碳源(6．11)，最后是氮源(5．15)，且在统计学上都达到了显著水平(p0．05)。 翁只t?岬?t?鼍?e导：暑：暑=三≤≥寸∞署u嚣赫苫。。(啪)砑并举照(Ⅲo)瑁坍拳熙、～，阜才肇幂岔??＼-／∞甘(∞)搿并肇熙o∞o∞o一式式一一(Ⅲ3)翠坍肇孽，矗v譬盘一．Iu∞．Io盘等∞_葺。‘喾II口．II厶．Io—葺。篁二．IoII--o蛊_∞葺。一。嗣_盎o∞一Q》。一_目∞‘a!葛帽々_矗∞‘霉-矗．I。(I—葺。_。二_-o_。若固^—巳”lI岛．Io—管。葛蛊．I。蛊_-o蛊-∞盒Q—Q蛊_皇o∞一Q≯。一_盎p-尝帽弓_露叻。u．I暑o∞葺。∞^"J岩口。蛊_-o_。∞螨啊阉^uv帅lI盘-Io—置oN删声．I。II_-oII_眦葺。一Q蛊_皇。砚一Q净。__宣舡IJ脚葛删口_矗的Qu‘昌。的盘o(I．I爵u。茸_-o_u避回^∞v一置盘．Io—葺。葛盂．IQ皇_-ol；I-∞口Q一。；_葺。协一。≯。一_口a．-a：葛一它_畏皇。帽_幡．I_昌蜀u一曲爵盎。五--o：lu星回^《v一。N∞一-!I。僬僻^。，o毒v带蚪譬匣k暖单榔嘲霉厘}*匿长。善醯蛊半甜馘半嵌粗灰警一窖卜}繁匡k^盆v一善避暑举删巡半摹_粗茛酶黛霉卜}簧窿k^uv一蜃遭6目半划巡半嵌粗茛骚舔蛊卜}*窿恃^笛v一蜃酸譬半蝌避半嵌粗靛滁机恃郴蛊卜}繁匿恃^《v一山匝^pv}*匿kg巡赠”N盐皓扣}繁匿海g熙谨姆樾器籽耀酶暴限}*匣kg翳蛹鞭时链捶皿嘲集撤掣实*用}*匣乓S糕瓤将醐臻丑燃莲怅矮丑醛脚承唧昧S赳．姿讯$删譬悃媾撕划眯《繇妹毒f《斟奸$譬长畎 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究不同水平下的基本营养对蜜环菌菌索长度的生长影响不同，且在统计学上都达到了显著水平(图2．1A)，具体表现为：水平A3(玉米粉和麦芽粉)的菌索长度(4．33cm)>A2(天麻浸出液)的菌索长度(3．12cm)>A1(马铃薯浸出液)的菌索长度(0．91cm)，也就是说加有玉米粉及麦芽粉的培养基更有利于蜜环菌的菌索长度的生长。不同碳源对蜜环菌菌索长度的影响(图2．1B)表现为：菌索的均值B1(葡萄糖)>B3(甘露醇)>B2(蔗糖)，且B1(葡萄糖)与B2(蔗糖)问达到显著(p<0．05)，B3(甘露醇)与B2(蔗糖)间也达到显著(p0．05)。 o∞NH磉军影攀孽磉革髟举照／，、e蟊善∞NH骠革髟拳孽p}．n*N匣kg{毯赠．sl∞≯o一-目2喾州口-矗一mo．0>盘_)Qo目∞‘a：器删口_盎矗。口叫盘叫删∞Q_矗3l口蛊叫产o，o，露_)叻-盘帽．Iu叻．Io盘霉的_皇2∞露帽盆．羞盘．Io—葺。簋置．IoII--o．IQ盆—葛昌盘Q蛊_葺。叻一o≯∞一_蛊nIJ脚葛一弓=I爵∞‘昌-矗．Io盘—葺Q=lo蛊_-o_o∞蛹叫固产邑”蛊盘．Io_皇。恩II．IQ眉_-o．IQ盆—葛昌皇Q二_葺。的一Q≯Q一_口p_A誓一它-氐叻Q3．一昌。现蛊oM6IJ葛置Q蛊_-o_u∞蛹-固^U_)一蛊盘．Io—葺oN—1．IQ二_-o．IQ叠—葺暑盎oll_目o∞一o≯al_盎oka!器删它-爵叻Qp一昌o∞葺。盆．I爵uQ皇_-o_ua!_叫图一酋v”l；I盘．Io_口。葛j．Io二_-o．IQ盆—置=皇Q蛊_葺o∞一o>o一_茸nIJa!警一它_矗叠。一-州．I_昌皇u州的再盆Q置--o_o尝阔^《一N．N眦一函。惰僻^u』≤v甘忡蛊匠k旺掣摊嘲雹厘}*窿傣。蜃遗留豢似求嵌粗莨避赠留卜}簧窿际^盆v一晷醯窨糕似求嵌粗莨骚聪譬卜}繁匿k^3一善避雹糕愀求髅祖莨骚氍譬卜}*匿k^∞v”譬醯蛊搽蚁求梭粗莨称粗幡郴容卜}*窿k^qvN^匝链瞎扯睁*匠恃署爨舔鬃糍舞精髂o．0o“鼹。．0I割髟暑一释o．o∞一∞一聪幂限}长匿悻g爨酶鬻甘枯蟮皿嗵}*匠佟g栋牧埒醐集撤骶+集*嗣疑丑燃雀嗽蹩丑螂徘$唧o．兮No．0∞一go．兮∞一《v妖每赳．婪讯肇蚪譬植蟋糊斟球《冬妹毒f《耐奸皋譬长畎 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究由图2-2A可知：A2(天麻浸出液)的菌索分支数均值(27．67)>A3(玉米粉和麦芽粉)．的菌索分支数均值(21．00)>A1(马铃薯浸出液)的菌索分支数均值(6．24)，且它们间都达到显著(pB3(甘露醇)>B2(蔗糖)，茵索分支数的均值分别为：25．67、16．91、12．33，且B1(葡萄糖)与B2(蔗糖)、B3(甘露醇)的均值差异在统计学上达到显著(p<0．05)，即是蜜环菌更趋向于利用葡萄糖且分支数最多，其次是甘露醇和蔗糖。就氮源(因素C)来看(图2-2C)：有机氮C1、C2(均值21．89、22．56)较无机氮C3(均值10．47)更能促进蜜环菌菌索分支数的增加，且二者间达到显著(p<0．05)，有机氮中的酵母膏虽较蛋白胨有利于蜜环菌的生长，但二者在统计学上达不到显著(p=0．84>0．05)。根据图2-2D，培养于28℃下的蜜环菌有更多的菌索分支数(均值25．11)，虽然较23。C的均值(15．II)具有显著差异，但较培养于25。C下的菌索分支数(22．20)在统计学上达不到显著水平(p=0．204>0．05)。综合以上的分析可知在此次优化方案中，培养蜜环菌的最优组合为：A2+BI+C2+D3，此组合为优化方案中4号组合。结合蜜环菌菌索长度及分支数的分析结果来看，虽然天麻浸出液(A2)有利于蜜环菌菌索的分支，但不利于菌索长度的生长且成本较大，故实际使用时候采用对菌索分支数仅次于天麻浸出液的玉米粉及麦芽粉(A3)作为培养基的基本营养物质。基于此，我们得到实验室培养蜜环菌的最佳培养基：A3+BI+C2，即玉米粉及麦芽粉(各159)、葡萄糖209、酵母粉19、琼脂209、水1000ml。综合温度对蜜环菌生长的影响，采用25℃用于蜜环菌的培养。这与用菌索长度分析得到的结果是一致的，只是在本次实验中使用的碳源和氮源对菌索长度和分支数的影响程度不尽一样，其中碳源对长度的影响大于氮源，而氮源对菌索的分支影响程度更大。相同时间内，利用优化后的培养基培养蜜环菌菌索长度(2．88em)几乎是用PDA培养的蜜环菌菌索长度(1．56cm)的2倍，其茵索分支数(26．8)也较PDA上多(16．4)且在统计学上达到显著。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究2．2不同木材浸出液对蜜环菌生长的影响2．2．1韧皮部浸出液对蜜环菌生长的影响以上述18种树木的韧皮部浸出液作为基本营养制作成培养基，接种蜜环菌Mi后置于25℃暗处培养，当菌索长至培养皿边缘时(培养大约10天)，观察记录菌索的长度及其分支数，通过SPSS13．0软件分析，其统计结果如下(表2．5)：由表2—5可以看出：不同树木，以其韧皮部的浸出液为基本营养配制的不同培养基对蜜环菌生长的影响是不同的，且对其菌索的长度和分支数的影响不尽相同。就所选择的18种树木来看，其中十齿花、算盘子、短柄稠李更能促进蜜环菌长度的生长，且与高山栲、山矾、桤木之间的差异性在统计学上达到了显著水平(p<0．05)。相对于算盘子、短柄稠李，以十齿花韧皮部的浸出液为基本营养的培养上培养蜜环菌Mi，其菌索长度均值更大，但是这种差异在统计学上达不到显著水平(p>O．05)；就菌索分支数量来看，相对于十齿花来说，虽然以五裂槭、野樱桃的浸出液制作的培养基培养蜜环菌，其菌索分支数较多，但是这种差异在统计学上达不到显著水平(p>0．05)。因此可以认为十齿花的韧皮部含有的化学成分更有利于蜜环菌Mi的生长。总体上，以不同树木浸出液为基本营养制作的培养基培养蜜环菌Mi，同一种树木对其菌索长度和分支数生长的影响保持一致，其中以高山栲、山矾、桤木的浸出液制作的培养基培养蜜环菌，其菌索的长度和分支数都要次于其它的树木。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究表2-5不同木材韧皮部浸出液对蜜环菌(Mi)生长的影响Table2-5EffectsofthephloemleachingsolutionofdifferenttreesonthegrowthofArmillariaMi注：菌索长度和分支数的标准误差附于其括号内2．2．2木质部浸出液对蜜环菌生长的影响同韧皮部一样，上述树木的木质部采取同样的方法制作培养基，接种蜜环菌(Mi)后，以其茵索长度和分支数为考察指标，分析不同树木木质部浸出液对其生长的影响，结果如下(表2．6)： 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究表2-6不同木材木质部浸出液对蜜环菌(Mi)生长的影响Table2-6EffectsofthexylemleachingsolutionofdifferenttreesonthegrowthofArmiilariaMi注：茵索长度和分支数的标准误差附于其括号内以上树木中，在以苹果树、华榛、桤木的木质部浸出液为基本营养制作的培养基上培养蜜环菌Mi，其菌索的长度和分支数的均值要高于其它的树木，但在统计学上达不到显著。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究2．2．3韧皮部和木质部浸出液影响蜜环菌生长的对比分析将韧皮部和木质部的数据(菌索长度和分支数)通过SPSSl3．0分析软件中的独立样本T检验进行分析(图2．3)。分析结果显示：以树木韧皮部浸出液作为基本营养制作的培养基，培养的蜜环菌菌索长度(1．93cm)和菌索分支数(14．05)都显著高于以木质部浸出液为基本营养培养的蜜环菌(其菌索长度和菌索分支数分别为O．76cm和7．62)，其差异在统计学上达到极显著水平(p=0．000．05)。27 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究(A)O．35(B)O．40O．35堂0．30j四0．25酝蜘o．10卷O．050．00十齿花花楸菌材类型桦木500250接种量(g)OKH2P04K2S04无机盐图3．1(A)不同菌材对天麻块茎重量的影响；(B)接种量对天麻块茎重量的影响；CO)无机盐对天麻块茎重量的影响。不同水平间的显著性(p0．05)。2．2林下和林外裸地两种不同种植环境对天麻产量的影响表3．3林内与林外天麻产量的独立样本T检验结果Table3-3IndependentsampleTtestforthedifferenceoftubers’yieldcultivatedundertheforestandontheopenground林内、外不同种植环境下的天麻块茎，根据商品麻(箭麻)和白头麻的数量及重量用SPSSl3．0分析软件中的独立样本T检验(Independent．samplesTtest)进行分析，由于两个总体数据未通过Levene方差齐性检验(方差具有显著性差异)，所以T检验结果在方差不相等的情况下给出，根据Equalvariances 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究notassumed(假设方差不相等)一行的结果(表3．3)可知：林内、外天麻的产量存在显著差异(p<0．05)。表3-4林内与林外种植环境下天麻产量比较Table3-4ComparisonoftheyieldoftheGelatacultivatedundertheforestandontheopenground由表3．4可知：林外商品麻的产量(数量3．22个／穴和重量0．21kg／穴)几乎为林内产量(数量1．83个／穴和重量0．1lkg／穴)的两倍，说明不同种植环境对商品麻的产量具有很大的影响，在统计学上达到了极显著水平(p<0．01)(表3．3)；此外，林内的白头麻产量(数量8．47个／穴和重量0．1lkg／穴)比林外产量(数量5．06个／穴和重量O．07kg／穴)的高且二者差异达到了极显著(p<0．01)(表3．3)，虽然林内天麻数量(10．29个／穴)大于林外(8．28个／穴)，但由于林内白头麻数量多而且块茎比商品麻小，相对而言重量轻，因此在总重量上仍然是林外的天麻产量(0．28kg／穴)高且与林内(0．22k∥穴)在统计学上达到显著(p<0．05)(表3．3)。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究第四章昭通地区天麻共生蜜环菌的遗传多样性分析不同的蜜环菌菌株对天麻生长的影响不同(张光明和杨廉玺，2007)，优良的蜜环菌菌株可以提高天麻的产量(王秋颖，等，2001；季宁和李玉，2008)。孙士青和陈贯虹(2003)发现用不同的蜜环菌菌株栽培天麻，其天麻素含量显著不同。而我国对蜜环菌的基础研究较薄弱，对栽培天麻所用的蜜环菌缺乏科学系统的选种、育种措施，导致栽培的天麻产量不稳、品种退化、病害有逐年加重的趋势(孙士青和陈贯虹，2003)。其次在天麻种植产区，有不同公司在销售商业用的蜜环菌，且其来源混乱。由于蜜环菌在环境中可以长期存在并大面积的延伸(Smitheta1．，1992；Coetzeeeta1．，2001)。外来真菌会对当地的生态环境造成很大的影响(Pringleeta1．，2009a；Pringleeta1．，2009a)。因此本章围绕昭通地区与天麻共生的蜜环菌的遗传多样性展开研究，并分析了外来的商业蜜环菌对当地蜜环菌与天麻共生关系的影响，以及由此带来的生态学效应。1材料与方法1．1蜜环菌菌株的采集上述天麻仿野生栽培实验中，未加有商业蜜环菌(M1)伴栽的样地，也出现了蜜环菌和天麻共生的现象。为了比较加M1伴栽与不加M1伴栽两种情况下，感染天麻的蜜环菌的菌株差异性。从此次实验种植基地选取13个没有加蜜环菌M1伴栽的巢穴和7个加蜜环菌M1伴栽的巢穴，以及远离此实验种植基地的4个天麻种植样地，从不同天麻块茎上取依附于块茎上的蜜环菌菌索(附录6)，并记录样地编号。此外为了考察小草坝地区，自然条件下，在野外生长的蜜环菌遗传多样性，生长于不同树皮上的蜜环菌菌索也被采集。上述所有采集的蜜环菌菌索带回实验室，进行分离纯化。蜜环菌菌株的分离和纯化将不同天麻块茎上共生的蜜环菌菌索用水洗净后，将其剪成lcm左右大小的片段，用镊子将菌索片段浸入2％的次氯酸钠溶液中lmin，再浸入75％酒精 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究溶液中lmin，用无菌镊子将菌索片段贴于上述实验筛选的培养基(配方如上所述)平板上(培养基含有氨苄青霉素40ppm，硫酸链霉素80ppm用以抑制细菌的生长)，25。C暗处培养，并进行观察。若有新的菌索长出，切取其顶端接种于同样的培养基上进行纯化培养。1．3蜜环菌菌株的分子鉴定1．3．1基因组DNA的提取分离得到的蜜环菌纯培养物(菌丝或菌索)(附录3)采用CTAB法(ZolanandPukkila,1986)提取DNA，具体操作步骤如下：(1)预先在1．5ml离心管中装入少许灭菌石英砂，再取平板或斜面上的蜜环菌纯培养物装入管中，最后再加入适量的石英砂；(2)加入200pl的CTAB裂解液(配方见附录1)，用研磨棒将菌丝体研磨充分后加入400“1的CTAB提取液；(3)65℃水浴1h(期间每隔10min翻转混匀一次)；(4)各加300p1氯仿和Tris一饱和酚并混匀，以13000r／min的转速离心10min，收集上层水相转移到新的1．5ml离心管中；(5)重复步骤4(2～3次)至两相液面间无沉淀；(6)加等体积的氯仿抽提一次，以13000r／min的转速离心10min，收集上层水相；(7)加入预冷的异丙醇(0．5～1倍体积)，于4℃下以13000r／min的转速离心10min，弃上清液，用纸吸干残留液体；(8)沿离心管内壁缓慢加入75％的冷乙醇(1m1)，尽量将壁上的沉淀洗入管底，轻柔混匀，以13000r／min的转速离心10min后弃上清液，重复1~2次；(9)室温过夜或者置于真空系统进行干燥；(10)加入30-40p1灭菌ddH20，一20℃保存备用。32 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究1．3．2ITSflGSrRNA的基因扩增使用的引物ITS4(5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC一3’)和ITS5(5’一GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG．3’)(Whiteeta1．，1990)对其ITS序列进行体外扩增(引物使用前先于13000rpm离心10min，按照引物合成单稀释成10}tM浓度备用)。反应体系(501a1)：llxl(10-50ng)DNA模板；5山10XPCRbuffer(100mmoll‘1啊s．HCl(pH7．6)，500mmoll‘1MgCl2)；lgldNTP混合物(浓度为10mmoll’1)(TaKaRa)；0．25UTaq酶(TaK撒)；两个引物各lgl(浓度为109moll。1)；加无菌ddH20水至501al。扩增程序：94。C4min；94。Clmin，54。Clmin，72。Clmin，35个循环；72℃3min，4"COO。(PCR扩增仪为Biometra)使用引物LRl2R(5’一CTGAACGCCTCTAAGTCAGAA一3。)(Veldmanetal，1981)andO-1(5’-AGTCCTATGGCCGTGGATCAGAA-3’)(DuchesneandAnderson，1990)对蜜环菌的IGS序列进行扩增。引物使用前先于13000rpm离心10min，按照引物合成单稀释成10州浓度备用。反应体系：同ITS。扩增程序：94。C2min；94"C40s，50℃lmin，72℃lmin，30个循环；72℃10min，4℃OO(Sekizaki．eta1．2008)。1．3．3PCR产物的纯化测序扩增产物以1％的琼脂糖凝胶(GeneCompanyLimited，ChaiW-觚，HongKong)于电压130V电压下进行水平电泳(电极缓冲液配方见附录1)，然后在紫外灯下拍照检测扩增结果，扩增产物使用San_Prep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司)切胶纯化后送北京华大测序公司进行测序。【核酸染料：Genefinder(10000x)(百维信生物科技有限公司，厦门，中国)；6×Loadingbuffer(宝生物，大连，中国)；Trans2KDNAMarker(北京全式金生物技术公司，北京，中国)；凝胶电泳系统(BIO．RAD，北京，中国)，紫外凝胶成像系统(UVTECsave，U．S．A)，微量移液器(eppendorf，Hamburg，German)o33 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究1．3．4序列分析对测序成功的序列，先用DNAStar5．0、Chromas2．0两个软件对所测序列进行校对，再用软件ClustalX1．83进行剪切，然后利用PHYLIP3．65软件在基于一个碱基差异的基础上分析其单倍型。1．3．5系统发育树的构建使用DNAStar5．0、Chromas2．0两个软件对序列校对，然后于NCBI搜索与之相似度最高的序列，并下载蜜环菌属不同种的相应序列保存，并与测序所得的序列一起做成FAS文件，使用PHYLIP3．65软件构建Neighboe-Joining树。2结果与分析2．1菌株的采集情况在此次天麻实验种植基地中，共选择20个天麻种植巢穴(13个没有加蜜环菌M1伴栽的巢穴以及7个加蜜环菌M1伴栽的巢穴)，在没有加蜜环菌伴栽的天麻块茎上分离到菌株27个，加有蜜环菌伴栽的块茎上分离到菌株17个，加上其他菌索来源(包括远离此次实验种植基地的样地A、B、C、D的天麻块茎上的蜜环菌菌索以及生长于不同树皮上的蜜环菌菌索)的菌株11个，此次实验共采集到55个蜜环菌菌株(表4．3)。2．2ITS／IGSrRNA的基因扩增上述菌株，接种于培养基上培养，取其纯培养物使用CTAB法提取DNA，采用相应的引物扩增后得到相应的PCR产物，经1％琼脂糖凝胶电泳后，于紫外灯下拍照检测，其ITSrRNA(见图4-1)和IGSrRNA(图4．2)，大小在750bp左右。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究图4-1ITSrRNA扩增结果(部分)Fig4-1RepresentativeITSrRNAgeneamplificationofDNAextractedfromArmillaria注：l-10代表此次实验分离到的蜜环菌菌株(依次为：s2a、、396d、s2b、211d、418b、218a、218c、8llb、HSS、YYT)，M为Trans2kDNAmarker图4-2IGS“讯A扩增结果(部分)Fig4-2RepresentativeIGSrRNAgeneamplificationofDNAextractedfromArmillaria注：l-12代表此次实验分离到的蜜环菌菌株(依次为：829c、829a、218a、218b、218c、46a、46b、532a、532c、533a、33a、33b)，M为Trans2kDNAmarker．2．3ITS／IGSrRNA的基因序列分析此次实验采集的55个蜜环菌菌株，测序成功的序列基于一个碱基差异的基础上划分的单倍型见表4．3。2．3．1ITSrRNA的基因序列分析所有测序成功的ITS序列在基于一个碱基差异的基础上共分为3个单倍型，加上来自于云南大学微生物所的参照菌株Mi共有4个单倍型(表4．1)。由基35 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究于ITS序列所分的单倍型来看(表4．1)，加商业蜜环菌MI伴栽的天麻块茎上分离得到的菌株包括M1都聚于一个单倍型(单倍型1)，未加M1伴栽的菌株分布在两个单倍型中，其中来自树皮十齿花的菌株SCH和来自样地B的菌株s3c聚于一个单倍型(单倍型3)，剩下的菌株和M2聚于一个单倍型(单倍型2)。参照菌株Mi分布于另一个单倍型(单倍型4)。表4-1基于ITS序列的单倍型Table4-1HaplotypeanalysiswiththeITSsequence注：菌株来源及样地处理见表4．3：M2为6年前于此实验种植基地使用的商业蜜环茵菌株。2．3．2IGSrRNA的基因序列分析所有测序成功的菌株其IGS序列在基于一个碱基的基础上共分为6个单倍型，外加参照菌Mi共7个单倍型(表4．2)。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究表4-2基于IGS序列的单倍型Table4-2HaplotypeanalysiswiththeIGSsequence注：菌株来源及样地处理见表4·3；M2为6年前于此实验种植基地使用的商业蜜环菌菌株。由基于IGS序列的单倍型可以看出：来自本次实验加有商业蜜环菌(M1)伴栽的天麻块茎上分离到的17个菌株包括M1都归为一个单倍型(单倍型1)：未加商业蜜环菌(M1)栽培的天麻块茎分离的菌株分为两个单倍型，其中24个菌株以及6年前于此种植基地用于天麻栽培的商业蜜环菌菌株M2被划归在单倍型2中，1个菌株829a单独在一个单倍型(单倍型3)；此外，在利用其他来源的商业蜜环菌栽培天麻的样地C、D中分离到的菌株分别分布于两个单倍型(单倍型1和单倍型6)；当地用自然环境下被蜜环菌侵染的树木栽培的天麻块茎以及从当地森林中被蜜环菌侵染的树皮上分离到的菌株被划为两个单倍型(单倍型4和单倍型5)。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究表4-3采集的蜜环菌(Armillaria)菌株的单倍型分布Table4-3ThehaplotypeabouttheCollectingArmillariastrains38 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究注：8+表示加蜜环菌M1种植的巢穴，一表示未加蜜环菌M1种植的巢穴，样地A、B为利用自然条件下感染蜜环菌的木材栽培的巢穴，样地c、D为用不明商业蜜环菌菌株栽培的巢穴，菌株YyT、SLZ、SCH、HSS分别从长有蜜环菌菌索的树皮(野樱桃、石栎子、十齿花、华山松)上分离得到。ITS及IGS的单倍型情况见表4．1和表4．2。39 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究上述采集的蜜环菌菌株，由ITS、IGS序列的单倍型分布(表4—3)可知，在同一个ITS序列单倍型中的大多数菌株，也分布于同一个IGS序列单倍型。但是有少数菌株(829a、s2a、s2b、SLZ、YYT)例外，这些菌株都在ITS序列所分的单倍型2中，但基于IGS分的单倍型将其分为两个单倍型，其中829a单独在一个单倍型中(IGS单倍型3)，菌株s2a、s2b、SLZ、YYT在一个单倍型中(IGS单倍型5)。2．4系统发育分析以下是基于IGS和ITS序列使用PHYLIP3．65软件构建的Neighboe．Joining系统发育树(图4．3和图4．4)。卜————一|0．005图4．3ITSrRNA基因构建的系统发育树mellea．AB510880Fig4-3PhylogenegictreeconstructedfromITSrRNAgenesequences注：加粗字表示菌株所在的不同单倍型，括号内数字为此单倍型内的菌株数，Mi为参照菌株；其余为GenBank查询到的参考序列及登录号。Bootstraping进行1000此重复，大于或等于50％的支持率标注于各自的分支处。比例尺代表0．5％的序列差异。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究509187AB286125图4-4IGS“讯A基因构建的系统发育树Fi94—4PhylogenegictreeconstructedfromIGSrl矾Agenesequences注：加粗字表示菌株所在的不同单倍型，括号内数字为此单倍型内的菌株数，Mi为参照菌株；其余为GenBank查询到的参考序列及登录号。Bootstraping进行1000此重复，大于或等于50％的支持率标注于各自的分支处。比例尺代表2％的序列差异。无论是基于ITS序列构建的系统发育树(图4．3)，还是基于IGS序列构建的系统发育树(图4．4)都显示，本次采集到的菌株相对于NCBI收录的蜜环菌属的不同种，其ITS以及IGS序列具有独特性。由于此次蜜环菌菌株的序列在测序过程中，发现其ITS序列普遍在620bp左右出现套峰的现象，故人工矫正、剪切后的序列较短，构建的系统发育树的支持率较低。但根据其IGS序列构建的系统发育树可以推测，单倍型l的蜜环菌可能为A．cepistipes，单倍型6中的蜜环菌可能是A．calvescens、彳．gallica中的一种，而单倍型2、3、4、5显示其序列具有独特性，与其他报道的蜜环菌种不同。41 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究第五章结论和讨论1蜜环菌的生长受多种因素的影响蜜环菌在实验室培养受多种因素影响，传统培养真菌的PDA培养基并不适合蜜环菌的生长。在本次实验所选择的培养基组分中，玉米粉及麦芽粉作为基本营养物质对蜜环菌菌索长度的生长具有较大的影响(图2．1A)；天麻浸出液对蜜环菌菌索分支数的影响较大(图2-2A)；本次所选择的三种碳源，葡萄糖最适合蜜环菌的生长(图2．1B，图2-2B)，这与之前文献报道的结果一致(彭述敏，等，2010)；有机氮明显的影响蜜环菌的生长，其中酵母粉较蛋白胨更能促进蜜环菌的生长(图2．1C，图2-2C)；在本次设置的温度范围内，温度对蜜环茵的生长在统计学上达不到显著水平(表2．3，表2．4)，估计是由于设置的温度范围太小所致，因为文献报道的适合蜜环菌生长的温度范围为10～35℃，适宜温度25～30℃(柳焕章，等，2007)。除天麻浸出液更能促进对菌索分支外，其余组分对菌索长度和分支数的影响保持一致。生长于不同培养基上的蜜环菌感染上木材的时间不同(姜月华，等，1996)，以至于影响后期对天麻的感染及产量(王守现，等，2010)。黄燕芬等(2005)使用优化的培养基制作生产种，并与用PDA培养基直接制作生产种相比，发现其培养时间短而且成本低，华秀爱(2004)使用有利于蜜环菌快速生长的液体培养基培养蜜环菌并接种秸秆包裹的木材，获得了较高的天麻产量并缩短了栽培周期。因此对蜜环菌培养条件的优化，在天麻生产上具有较大的意义。本次优化得到的培养基，以玉米粉和麦芽粉为基本营养培养蜜环菌，相对于马铃薯浸出液来说，制备简单，来源广泛且经济实惠，在天麻的种植中，可就地取材，并可以节约时间、减少种植成本。2不同树木、同一树种的韧皮部和木质部浸出液对蜜环菌生长的影响有差异在所选用的18种树木中，以其浸出液为基本营养制作的培养基培养蜜环菌，菌索分支数和长度的生长情况不同(表2．5，表2．6)，就所选用的树木中，十齿花的韧皮部含有的化学成分最能促进蜜环菌菌索长度的生长，对菌索分支数的影响也较大(表2．5，表2．6)。林鹏(1978)探究了同一个蜜环菌菌种对742 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究种不同木材的适应性实验，发现在小叶赤楠上生长的蜜环菌菌索总长度、菌索分支数都要好于其余的树木，徐锦堂也描述了蜜环菌在不同树木上的长势不一样(徐锦堂，1993)。但是除了营养成分不同外，不同木材对同一种蜜环菌菌株的适应性，还与木材的结构、树皮牢固程度有关(林鹏，1978)。目前并未见同一树木的韧皮部和木质部提取物影响蜜环菌生长的报道。在我们的实验中发现，生长于木质部浸出液的蜜环菌，其生长情况远不及韧皮部，似乎韧皮部的浸出液含有的化学成分比木质部更能促进蜜环菌的生长(图2—3)。因此，今后制作人工复合型菌材，可以考虑加入适当的树木韧皮部。3仿野生栽培的天麻其产量明显受蜜环菌接种量及菌材种类的影响，无机元素对其产量影响不显著在本次仿野生天麻种植实验中，加有蜜环菌伴栽(加入量分别为：5009／穴、2509／穴)的样地其天麻块茎的产量(O．35kg／穴、0．27kg／穴)要显著高于不加的样地(0．083kg／穴)，且天麻的产量随着加蜜环菌量的增加而增加(图3．1B)。但是在天麻与蜜环菌伴栽的实验中并不是加入蜜环菌的量越多越好，因为根据文献报道蜜环菌与天麻的共生关系较为复杂，二者需要达到一个生长上的平衡，其共生关系才能对彼此都有利。蜜环菌生长过于旺盛的话，会消耗天麻块茎的营养而使天麻减产甚至出现“空穴”(没有产量)的现象(容丽华和蔡传涛，2010)。由于本次实验没有设置更多不同梯度的蜜环菌接种量，无法确定在天麻仿野生栽培中最适合天麻产量的蜜环菌伴栽量，因此这一发现有待于进一步的探究。天麻栽培实验中使用的三种树材：十齿花(Dipentodonsinicus)、花楸(Sorbuspohuashanensis)、桦木(Sorbuspohuashanensis)所对应的天麻块茎的重量分别为0．284kg／穴、0．259kg／穴、0．164kg／穴，即利用十齿花栽培天麻可以获得较多的块茎。这可能与十齿花有利于蜜环菌的生长有关，因为据有关报道称长势好、菌索分支数多的蜜环菌伴栽可以获得更高的天麻产量(张光明和杨廉玺，2007)。同样地，在我们利用不同菌材浸出液作为基本营养来培养蜜环菌的实验中也发现十齿花对菌索长度的生长具有较好的促进作用，而对其菌索的分支也有相对好的效果。43 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究目前，在昭通小草坝天麻种植区，多采用多种木材混合接种蜜环菌的方式进行天麻的人工栽培。这样那些在种植过程中不能提高天麻产量或者提高效果不明显的木材就造成了浪费，造成了当地森林资源多样性的破坏。基于我们的实验结果，建议当地政府鼓励、支持当地农民种植十齿花林用于天麻的人工栽培，缓解由于天麻栽培导致的森林毁坏。另外，虽然有研究报道天麻可以以渗透方式从土壤里面获取无机元素(如N、P、K)作为第二营养来源(吴沿友，1990；庄毅，等，1983)。但在我们的实验中发现在天麻栽培过程中施加的无机元素对天麻的产量没有显著的影响(图3．1C)，这或许是因为天麻的主要来源是靠蜜环菌提供(黄海瀛，等，2004)，而来自土壤的营养甚微。当然，也不排除是由于当地土壤里面本来就含有充足的无机元素，足以供给天麻生长所需，所以我们这次实验所加的无机盐对天麻产量没有明显的影响。因此基于此次实验结果，我们并不建议在当地天麻仿野生种植中额外施加无机营养，这样不仅可以减少天麻人工栽培的成本，对当地生态环境也有保护作用。4林外裸地种植天麻其产量高且种植周期短天麻的块茎根据其发育程度不同分为米麻、白头麻和箭麻(商品麻)。其中米麻和白头麻为生长不完全成熟的天麻块茎，一般用于来年无性栽培的种麻使用，很少作为商品销售以及药用，尤其是米麻由于块茎甚小只作为无性繁殖用；而箭麻是指生长完全的天麻块茎，来年可以抽苔进行天麻种子的培育，在生产上主要是作为商品使用和药用。在我们的实验中发现种植于不同环境下的天麻在白头麻和商品麻的产量上有差异(表3．4)，且这种差异在统计学上达到了显著水平，具体表现为林外的商品麻产量(重量、数量)高于林内；林内的白头麻产量(重量、数量)高于林外；就总的天麻块茎产量来看，林外天麻块茎(白头麻和商品麻)在数量上占优势(林外均值10129个／穴，林内均值8．28个／穴)，但块茎的总重量上小于林外(平均重量分别为：0．22kg／穴、0．28kg／穴)。基于以上的实验结果，在林外裸地进行天麻的仿野生种植其产量较好，相对于林内来说可以收获更多的商品麻。徐锦堂于1965年分析了市场收购的天麻 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环茵的遗传多样性研究情况及商品麻与白头麻的折合情况：数量40％的白头麻，其重量只占14％；商品麻3．66kg(鲜重)可以加工成品lkg(干重)，而白头麻6．64kg(鲜重)才能加工成品lkg(干重)(徐锦堂，1993)。也即是说明白头麻的含水量要比商品麻多，鉴于市场需求和药用的主要是商品麻，因而在我们的实验中主要考察的是商品麻的产量，另外白头麻还需要再经过一年多的时间才能生长发育成生长完全的商品麻(徐锦堂，等，1989)。故总体上在林外种植天麻，可以得到较好的产量，且在收获相同商品麻产量的基础上，林外种植天麻可以缩短种植周期。5昭通地区与天麻共生的蜜环菌具有一定程度的遗传多样性及独特性，外来蜜环菌可以长期存在并影响本地蜜环菌对天麻的侵染本次实验的菌株其ITSrRNA和IGSrRNA两个基因在基于一个碱基差异的基础上所分的单倍型(表4．2和表4．3)不太一样，ITS基因所分的单倍型少于IGS所分的单倍型，具体体现在基于IGS所分的单倍型3(829a)和单倍型5(YYT、HSS、SLZ、s2a、s2b)的菌株在ITS基因所分的单倍型里面都聚在同一个单倍型中(单倍型2)。可能的原因是我们所分析的ITS序列(-620bp)比IGS序列(-830bp)短所致，另外一个原因也可能是蜜环菌的ITS序列较ITS序列更为保守(Dunne，etal，2002；Sekizaki，eta1．，2008)，菌株间的差异性在ITS序列上未体现出来。尽管此次实验所用菌株的两个基因(ITSrRNA和IGSrRNA)所分的单倍型有差异，但是在我们分析的序列中无论用ITS序列还是用IGS序列分析其单倍型，加有商业蜜环菌(M1)种植的天麻块茎上分离到的所有菌株包括M1都归为一个单倍型(单倍型1)；而未加有商业蜜环菌(MI)栽培的天麻块茎上分离到的菌株，包括6年前在此种植基地使用过的蜜环菌(M2)被分到另一个单倍型中(829a的IGS序列例外)。在上述加有商业蜜环菌(M1)种植的天麻样地里面分离到的蜜环菌菌株与M1都聚在同一个单倍型中。这说明在天麻的种植过程中人为接种的商业蜜环菌一旦侵染天麻(侵染率为95．56％)，其它的蜜环菌菌株就很难再侵染天麻；而在未加有M1栽培的样地分离到的菌株除829a外都聚于同一个单倍型，且与6年前于此地使用的商业蜜环菌(M2)聚在同一个单倍型中，因此我们推测用45 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究外来的商业蜜环菌栽培天麻会阻止当地的野生蜜环茵对天麻的共生，并且这种效应会持续6年之久，虽然商业菌株M2在野外自然情况下对天麻的侵染率不足30％，但是这也影响了当地野生的蜜环菌与天麻的共生，因为在我们此次栽培的实验样地中除829a外并未发现有其它不同于商业菌株(M1或者M2)的当地野生蜜环菌与天麻共生的现象。然而，在远离实验种植基地的自然环境下收集的被蜜环菌感染的木材以及用其种植的天麻块茎上分离到的菌株(YYT、SLZ、SCH、HSS及s3c、s2a、s2b)，其IGS序列分布在两个不同的单倍型中：SCH、s3c归在一个单倍型；YYT、SLZ、HSS、s2a、s2b归入另一个单倍型。基于IGS基因构建的系统发育树显示，各单倍型代表菌株与当前报道的蜜环菌属的不同种不尽相同，在IGS序列上表现出其独特性，且各单倍型的代表菌株之间在遗传距离上有一定的差异。表明，昭通小草坝地区与天麻共生的蜜环菌具有一定程度的遗传多样性和地域独特性。此外，不存在寄主的情况下，蜜环菌以腐生于倒木或死树根的形式，可以长期存在土壤里，其扩散范围可达15公顷(Smitheta1．，1992)，Coetzee(2001)报道由欧洲引入至非洲开普敦的蜜环菌(彳．mellea)占据了直径至少345m的生长范围，其存在时间超过300年。尽管很多真菌产生大量的孢子，借助风等媒介进行传播，但是大多数只寄生当地的寄主(Tayloreta1．，2006；Lumbscheta1．，2008)，部分原因可能是存在传播上的障碍(Litchman，2010；Peay,2010)。在自然状况下，大多蜜环菌存在地理分布(Ke6aetal，2011)，但是由于天麻栽培中的人为因素，导致不同地区的蜜环菌在不同地区问扩散较为频繁。这些外来的蜜环菌势必会对当地的生态环境造成影响，因为有文献报道入侵的菌根真菌与加利福尼亚州的植物形成一种新的共生关系(Pringleetal，2009a)。这种共生关系不仅影响植物的生存，还影响到了物质营养的循环及其它生态性能(Pringleetal，2009a)。而且蜜环菌具有寄生特性而对寄主致病，不同的蜜环菌种致病力大小不等(Prosperoeta1．，2003)，因此外地引入的其它蜜环菌种可能会对当地植被造成威胁。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究6展望尽管我们在实验中探究了不同栽培环境下天麻的产量差异，也探明了昭通地区的蜜环菌具有一定程度的遗传多样性及地域独特性，但在研究过程中也发现一些不足和有待于进一步解决的问题。l、在以树木浸出液为基本营养培养蜜环菌的实验中，十齿花韧皮部对蜜环菌菌索的生长具有较好的促进作用，而在天麻仿野生栽培实验中使用的三种树木中，十齿花栽培天麻也获得较高的天麻产量。然而由于在野外天麻伴栽实验中所使用的树木类型种类少，因此尚不能得出十齿花就是最适合天麻种植的菌材。况且在用菌材浸出液作为基本营养制作的培养基培养蜜环菌Mi的实验显示除十齿花外，其它类型的树木在促进蜜环菌生长方面也具有较好的效果，但是在与天麻伴栽的实验中是否如十齿花一样也同样具有促进天麻产量的效应，这还需要在以后的实验中逐一与天麻伴栽进行验证。2、在我们实验中得到了不同遗传背景的蜜环菌菌株，但是具有不同遗传背景的这些菌株是否对天麻的生长具有不同的影响，则需要在以后的实验过程中进行考察。其次，昭通地区的野生蜜环菌在遗传背景上具有独特性，它们与其它的天麻共生蜜环菌并不相同。其物种地位需要借助形态学以及其它分子生物学手段进行界定。3、不同品种的天麻与共生蜜环菌的不同菌株间，以及不同遗传背景的蜜环菌与不同树木之间，在长期的共生演化过程中，由于不同物种的可塑性差异，以及对不同环境的适应性进化，是否会产生在不同树木、不同蜜环菌菌株、不同天麻品种问具有一定的匹配关系，目前很少涉及对这种匹配关系的研究，因此这种匹配关系对天麻产量的影响需要深入研究。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究附录附录1：实验用的培养基及溶液配方PDA培养基配方：马铃薯(去皮)：2009，蔗糖(或葡萄糖)：209，琼脂：209，水：1000ml，PH：自然。称取去皮马铃薯2009，切成小块置于锅中加水煮30min后用四层纱布过滤，取其滤液再加入其它组分即可。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液：CTAB2kg，NaCl8．189，EDTA-Na20．749，1MTris-HCI10ml，13一巯基乙醇200lal，以ddH20定容到100ml。电极缓冲液配方(TBE)：三羟甲基氨基甲烷(Tris)：549，硼酸(Bodeacid)：27．59，0．5mol／1乙二胺四乙酸二钠(EDTA．Na2)溶液(PH=8．O)：20ml，使用前称取3．229乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)溶解于ddH20中，并调节PH至8．0。 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究附录2蜜环菌Mi在不同培养基上的生长情况翟■■■曩罗国曩■巍蓠鬣蕊毒概＼、二锱灞谶挚，漓辍》毒漤一≤Y一注：实验分离到的不同形态的代表菌株(培养基为优化方案得到的最优组合，培养时间2周)。49 。^希蟋长憾悄对仆"÷．希谜罩憔悄甘蚪研Kv嚣博恒爨，长靶，罨r11，操亡÷，繁磔旧。饕郓簖，挺长，长鞋，长耀，娱、厂，鞑尽『彗，卅器染壤，蜷洱，樱蜩+，m辎琳，枢r11幄，釜樱，塔咪蚪擎_。状呆求世擎～对外毯。燃C)Ird赆阜I半删g叫郴称辩g罄茁醛萁长忙曩柑Ⅷ窆粗薛栅寸幞莲妖嚣掣婆娥匙删譬楹薛镪“眯《禽眯枣《划奸姆譬长吣 天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究附录5天麻仿野生种植的样地照片林外种植样地林内种植样地附录6表面附有蜜环菌菌索的天麻块茎5l 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天麻的仿野生栽培实验及共生蜜环菌的遗传多样性研究发表的论文1．De—ZhuZhang，LiangMei，JingGuo，Yong-ZhouWang，Hai-YanHe，Yu-ChuanWang，An—JiangCao，Ming-ZhiYang，Han—BoZhang．FactorsofcultivationoforchidGastrodiaelata，atraditionalChinesemedicine．PlantDiversityandResources．2013．(Submitted)2．De-ZhuZhang，LiangMei，JingGuo，Yong-ZhouWang，Hai—YanHe，Yu—ChuanWang，An—JiangCao，Ming-ZhiYang，Han-BoZhang．CultivationoforchidGastrodiaelatawiththeintroducedArmillariaandtheeffectsonlocalecosystem．JournalofMicrobiology．2013．(Submitted)3．MeiL，ZhuM，ZhangDZ，WangYZ，GuoJ，ShaT，YangMZ，ZhangHB．GeographicalandtemporalchangesoffoliarfungalendophytesassociatedwithaninvasiveplantAgeratinaadenophora．FEMSMicorobiologyEcology，2013．(revised)4．XuCW,YangMZ，ChenYJ，ChenLM，ZhangDZ，MeiL，ShiYT,ZhangHB．Changesinnon-symbioticnitrogen—fixingbacteriainhabitingrhizospheresoilsofaninvasiveplantAgeratinaadenophora．AppliedSoilEcology，2012，54：32-28．5．美亮，蒋欢，张德著，马红英，郭静，王咏舟，张汉波．入侵植物紫茎泽兰叶内生真菌多样性研究．云南大学学报，2013．(Accepted)6．陈云娇，陈莉敏，美亮，张德著，史云涛，张汉波．核酸染料Genefinder使用方法的比较．生物技术，2011，21(5)：66．68．58