毕业论文--天麻蜜环菌优良菌种初筛 18页

贵州师范大学（专科）毕业论文题目：天麻蜜环菌优良菌种初筛学院：生命科学学院专业：园艺技术年级：2008级作者：指导教师：完成时间：2011年5月20日17 摘要为了筛选出适宜于贵州天麻栽培种植的优良菌株，应用于贵州天麻的生产中，从而提高贵州天麻的产量与品质，保证天麻产量的稳定性与高价值性。本实验对不同来源的天麻密环菌，进行生物学塔尔的观察研究，利用蜜环菌在PDA培养基中菌丝的生长特性，菌索生长情况。着重研究不同品种的蜜环菌的菌丝生长速度，分枝情况，菌索粗细，菌索颜色，发光情况进行对照分析。本研究，选用了5个不同来源的栽培品种与野生分离菌种，蜜环菌045、开212、AM-17、大方九龙、开3号。采用PDA母种培养基培养蜜环菌观察研究蜜环菌菌落形态以及菌丝菌索生长情况，对5种菌种进行对比筛选。研究结果表明，五种菌株的生长速存在明显差异。且蜜环菌045菌索比较粗壮，分枝较多。AM-17菌索生长速度最快，但是菌索较细，分枝较少。关键词：天麻；蜜环菌；菌索；菌丝17 1、引言天麻是一种无根、无绿叶的异养兰科植物，以蜜环菌为主要营养，用干燥的块茎入药，是主产于中国的名贵药材。据《神农本草经》记载：“赤箭（天麻）味辛温，主杀鬼精物，蛊毒恶气。久服益气力，长阴肥健，轻身增年。”被列为上品。中国明朝杰出医学家李时珍（公元1518-1593年）在《本才纲目》中记载，天麻有主诸风湿痹、四肢拘挛、小儿风痫惊气，利腰膝，强筋力。久服益气，轻身长年。“的功用。据2000年《中国药典》记载：“天麻气微，味甘，其功能是平肝息风止痉，主治头痛眩晕，肢体麻木，小儿惊风，癫痫抽搐，破伤风。”古代对天麻的记述始见于《神农本草经》，它成书于东汉末年，距今约2000年，故天麻入药已有2000年左右的历史。在历代草本中都有关天麻的记述，特别是《本草纲目》对天麻的分布、形态、生长情况、草药与加工炮制、药性、药效与配方均有较完整的叙述。天麻长期以来不能进行人工栽培，主要是未对天麻进行研究，不了解天麻的生长发育规律，不了解天麻生长发育主要是以蜜环菌为主要营养。其实天麻和蜜环菌的关系古人已有技术，在中国晋代葛洪所著《抱朴子》一书中对天麻写到：“此草为物，下根如芋魁，游子十二枚周环之，去大魁数尺，皆细跟如白发，虽相须而时不不想连，但以气相属耳。”系指天麻的生长繁殖与蜜环菌的关系，这是世界上的首次发现与记录。古人早已观察到了天麻与蜜环菌的关系，但长期以来未被人们所认识。了解认识天麻与蜜环菌的关系，是天麻野生变家种成败的关键。1.1天麻概述植物分类学是一门区分植物类群，探索植物群之间亲缘关系，阐明植物界自然统的科学，植物分类的目的是使人们更好的认识植物，利用植物和改造之物。1.1.1生物学特征天麻属（GastrodiaR.Br.)为寄生草本，无绿叶。地下具肥厚的块状茎，块茎通常肉质，平卧，偶有直立者，不延长，具节，节上轮生膜质鳞片，节间特短，呈球茎特征。地上茎直立，一般淡褐色至肉黄色，中部以下具节数，节上生有简状抱茎的鞘，顶端为总状花序。总状花序疏生数朵至多花。花苞片宿存、膜质。花梗有时在花后继续伸长。萼片与花瓣合成花被简，花被简原状至罐状，顶端5裂，前方（及两枚侧萼片合生处）具深浅程度不同的裂口。3枚萼片裂片相似，或有时中央一枚较大或较小。花瓣裂片一般较小，位于两萼片之间凹缺的内侧，唇瓣连生与蕊柱足上，通常不裂，略短语花被简。蕊柱长，及少病变短，基部具短的、明显的蕊柱足，两侧具狭翅，翅连接于药床，在顶端前方呈耳状伸出。花药内倾。柱头位于蕊柱前方基部，线性以至椭圆形。17 1.1.2地理分布天麻属（GastrodiaR.Br.）在兰科中隶属树兰亚科（Epidendroidae）天麻族（Gastridieae）天麻亚族（Gastrodinae），全世界有20种以上，分布于热带、亚热带、温带以至寒温带山地。天麻在中国的分布地区很广泛，以下地区均有分布：云南的丽江、昭通、威信、镇雄、彝良、大关、三江口、楚雄等地区；贵州的贵阳、遵义、安顺、毕节、黔西南、黔东南、黔南、铜仁、六盘水等9个地（州）的40多个县（市）；四川的绵阳、达川、乐山、宜宾、雅安、凉山、温江、甘孜、阿坝等地（州）的40多个县（市）；重庆的涪陵、万州等所辖的部分县（市）；辽宁的凤城、丹东本溪、新宾、东沟、宽甸等县（市）；吉林的抚松、靖宇、浑江、辉南、柳河、安图、桦甸、蛟河、舒兰、敦化、长白等县（市）的部分山区；黑龙江的五常、尚志、宁安等县（市）；陕西的宁强、略阳、城固、勉县、陇县、安康等县（市）；湖北的利川、郧县、秭归等地；山东的泰安地区；浙江的天目山等地。此外，甘肃、青海、西藏、湖南、江西、安徽、福建、河南、河北、台湾等地也有分布。1.2天麻的生活习性植物的生态习性是长期对环境适应而形成的，每种植物一般只能在它所适应的环境里生活。所谓环境，主要指气候和土壤等条件的综合。天麻是一种植物，也有它所适应的生活环境。但天麻与其他职务不同的是没有根和绿叶，因此不能进行光合作用，不能自己制造养分，而是与真菌蜜环菌共生获取营养，过着异养的生活。1.2.1天麻与气候因素的关系温度温度是影响天麻生长发育的起主导作用的因素。天麻喜生长于夏季冷凉潮湿、冬季又不十分寒冷的环境。天麻主产区的年平均最低温度为3～13℃，最高月平均温度为24～29℃，最低月平均温度为1.3～16℃的范围内。天麻和蜜环菌生长最适宜温度为15～25℃。天麻在系统发育过程中，形成了低温生理休眠特性，需要在低温条件下休眠越冬。当深秋温度降至10℃左右时，天麻停止生长进入休眠。低温条件能打破生理休眠。如贵州气温条件，天麻在1.6～12℃情况下，徐休眠5-6个月才能萌发生长。二陕西宁强天麻研究所将做种用的天麻块茎置于2～5℃的低温条件，历史约2个月左右的处理，就能萌发生长。水分任何植物都离不开水，植物在生长、发育过程中，只要水分供应失调，就会对植物产生不良影响，是产量降低，品质变劣。水是植物体的重要组成部分，一般植物都含有60%-80%的水分，有的甚至含水达90%以上。水又是植物生命活动的必要条件，营养物质的吸收、运输，光合作用、呼吸作用的进行和细胞内一系列的化学变化，都必须有水参加。但是，不同植物由于长期生活在不同的水分条件下，对水分的需求量是不同的。天麻长期生活在多雨潮湿冷凉的气候环境条件下。全国天麻主产区的年降水总量在1000-1500mm左右，空气相对湿度在80%-90%17 左右，土壤含水量在40%-60%左右。水是天麻块茎的重要组成部分，成熟天麻块茎含水分80%左右。水是天麻生命活动的必要条件，天麻只有保持细胞质的水分饱和，细胞呈膨胀的状态才能正常生长。如果水分不足细胞发生萎蔫时，则天麻停止生长。满足天麻对水分的需要，除要求适宜的大气湿度外，主要还是要求适宜的土壤含水量。土壤含水量是否适宜，常因土壤不同的质地而有较大的差异。如云南昭通地区的野生天麻分布区，一般基物含水量都保持在45%-60%，对天麻和蜜环菌的生长都有利。若基物含水量高达65%时蜜环菌只能以菌索的形式生长，但已找不到天麻的踪迹。若含水量降到40%时，对蜜环菌和天麻生长均不利。天麻产区的土壤含水量常年都保持在50%以上。如果土壤湿度过高，特别是在天麻生长后期，则容易硬气天麻腐烂。光照天麻是一种无根、无绿叶的植物，失去了进行光合作用的生理机能。天麻从栽种到收获，整个无性繁殖过程都是在地下完成的。因此，天麻的块茎生长不需要光照，光照只能为它的生长提供热量，故天麻可以在室内栽培。1.2.2天麻与土壤土壤是天麻生长发育的极为重要的环境生态条件。天麻的生长发育需要土壤经常不断的供给一定数量的水分温度、空气、养料及微生物（主要指共生萌发菌及蜜环菌）。土壤性状与天麻的分布有着密切的关系，尤其是浅层土壤性状对天麻生长影响很大。野生天麻多生长在含较多腐殖质、疏松湿润的砂质土壤中。这种土壤具有良好的排水性喝透气性能，适合天麻和好气得蜜环菌生长。粘土中很少有天麻生长，因为粘土的透气性差，透水性也差，遇渍水过多，空气相对减少，影响天麻和蜜环菌生长，甚至造成天麻腐烂死亡。因此，在粘土中很少发现野生天麻，也不适合栽种天麻。1.3天麻的栽培1.3.1商品麻栽培技术场地选择选择栽培场地时，应考虑天麻和密环菌对环境条件的要求，选择适宜的坡向、植被，土质等条件，首先应根据不同的海拔高度先择坡向，陕南在海拔1400米以上的高山区，温度低雨水足，宜选择无荫蔽的阳山栽培；在海拔900-1400左右的中山区，宜选择半阴半阳的早晚阳山栽培天麻；海拔900米以下的低山区，气候主要特点是雨水少，土壤含水量低，夏季温度高，应选择阴山和树林遮荫的条件栽培天麻；在夏季地温长期超过3℃的平原地区栽培天麻就必须有遮荫条件或半地下室的环境。可利用防空洞、山洞、地下室等场所栽培天麻。土壤应选择砂土和砂壤土，或富含腐殖质、土层疏松、排水良好的壤土，忌粘土及涝洼积水地。粘土透气性差，不但影响蜜环菌生长，也易感染杂菌降低天麻产量。蜜环菌菌材与菌麻的培养菌材是长有蜜环菌的段木的简称，为培养菌材或用于培育天麻而设置的窖（坑），称为麻床。17 （1）培育菌枝利用树枝培养菌种，密环菌长的快，培养时间短，容易控制杂菌，菌枝不但可用来培养菌材和菌床，在栽天麻和播种时，还可在菌长的较差的地方补充菌种。（2）树枝的选择选直径1-2cm的阔叶树枝条或砍菌材时砍下的枝条都可用来培育菌枝。（3）培养时间一年四季都可以培养，但以3-8月份为好，此时气温较高，湿度大，菌生长快。（4）培养方法先将树枝削去细枝、树叶，斜砍成7-10cm，浸泡在0.25%硝酸铵溶液中l分钟左右，挖宽30cm，深60cm见方的坑，先在坑底铺一层树叶，然后一根靠一根摆两层树枝，覆盖一层腐殖土或沙土(以盖严树枝为准)，大约40天左右蜜环菌就可以在树枝上长好，称作菌枝。培养菌材及菌床一般阔叶树都可以用来培养蜜环菌，但以木质坚实的壳斗科植物最好，如板栗、槲栎、栓皮栎等都可以。（1）培养菌材挖坑深50-60cm大小以培养菌材数量而定，一般以100-200根树棒为宜，底铺一层树叶，平摆树棒一层，两根树棒间加入菌枝2-3根，用土填好空隙。（2）培养菌床一般在6-8月份培养菌床，当年可栽种天麻。1.3.2天麻的有性繁殖技术1.3.2.1培育禾麻（1）建立育种圃育种圃选择较平坦的内槽地树荫下，以砂质壤土为宜，为提早采种和播种，也可以利用温室育种。（2）人工授粉天麻靠昆虫传粉，但昆虫活动与气候变化及环境状况有关，如雨天昆虫活动少，即影响授粉，故必须进行人工授粉，才能获得质好量多的种子。（3）采收种子天麻果实是由果穗下部向上部陆续成熟，当下部果色渐转深暗，纵缝线日益明显，表明蒴果即将成熟。1.3.2.2播种技术（1）播种期即种子成熟期，各地不一，汉中地区6月中旬至下旬播种适宜。（2）播种量一个天麻果实中虽有种子三万到五万粒，但凶目前发芽率只有7%左右。另外，接菌率低．种子萌发后若不能和蜜环菌及时共生结合，就得不到营养而死亡。以每平方米播30-50个果实的种子为宜。（3）播种方法播种时揭开预先培养好的菌床，取出全部菌材和覆盖物，然后在地上铺上1-2cm淋湿的青冈树落叶，将采收种子撒播于落叶层上，覆盖一薄层落叶，再铺排一层菌棒，棒间又撒少量种子，盖上树叶及原土，再用同法铺撒树叶，恢复菌床原状，温室培育的种子，播种期在4-5月份。1.3.2.3田间管理（1）温度的调节冬天要注意防冻，夏季要注意遮荫。17 （2）土壤水分的控制6、7、8月份是其生长旺盛时期，需水量较大，9月下旬后，天麻处于养分积累阶段，不需要太多水分。1.3.2.4病虫害及其防治（1）介壳虫主要是粉蚧为害天麻块茎，一般是由菌棒带入麻窝内，如果大部分天麻窝都有介壳虫为害，就应将天麻全部加工，并将窝内的菌棒烧毁以防蔓延。（2）蚜虫为害花苔及花，喷40%氧化乐果1000倍液。（3）甘灼病这是一种生理病害，天麻抽苔开花后，由于搭栅遮荫在向阳的一面，受强光照射而变黑，在天麻出土前搭好荫栅遮荫即可防止此病。1.3.3天麻无性繁殖栽培技术无性繁殖又叫营养繁殖，是以天麻的小球茎作种麻的一种栽培繁殖法。无性繁殖的优点是简单易掌握，栽培过程中如温、湿度适宜，蜜环菌长势旺盛，白麻(长2-11cm以内的称之白麻)甚至有一部分米麻（2cm以下的称之米麻），当年即可长成箭麻(即商品天麻)或白麻。因此，目前我国大部分地区均采用这种方法栽培。1.3.3.1选地整地选择土层深厚、土质疏松、排水良好的砂质壤土或富含有机质的腐殖土为好黄泥地、涝洼地和砂石地一般不适宜栽培天麻。栽麻场地的空气要清新凉爽、湿润一般选择参后地或林间树下，人、畜不易践踏，便于管理的地方为好。对整地要求不严，一般除掉地面杂物或砍掉过密小灌木，便可培床或挖穴栽种天麻。1.3.3.2菌材的准备（1）茵枝的准备一般选用2-3cm粗的柞树或桦树,斜砍成8-10cm的小段备用。（2）茵棒的准备一般阔叶树的木材均可做菌棒的材料,常用的有柞树、桦树、花楸树等。选粗5-10cm的树干或枝桠，锯成长40-60cm的木棒。在木棒的两面或三面每隔3-5cm处砍一鱼鳞口，砍至木质部。（3）茵材的处理用水50kg、硝铵0.5kg、硫酸镁0.5kg配成营养液。把菌枝、菌棒放在营养液中浸泡一小时捞出，风干表面水分就可以用了。1.3.3.3栽麻天麻在生产上以营养繁殖为主(块茎繁殖)，这种繁殖方法是以天麻块茎作为播种材料，使其直接产生新个体，大的收获加工，小的继续做播种材料。（1）种栽的选择不论是箭麻、白麻、米麻，天麻的块茎均可作播种材料。从收获块茎入药的角度讲，白麻好于米麻，米麻好于箭麻。生产上多选择中、小白麻(重量2.5-20g)做播种材料，因中、小白麻生长速度快，繁殖能力强，是最好的播种材料。不论什么麻种都应选择个体发育完整，色泽正常无破损和无病害的麻种为种植材料。（2）栽麻时间天麻栽培既可以春栽也可以秋栽。春栽一般在5月1日前后．秋栽在l0月份以后。17 （3）栽麻方法在床(穴)底部先放入薄薄的一层树叶，将准备好的菌棒顺床(穴)摆入，菌棒间距3-5cm左右，填上原土，使菌材半露，然后在茵棒间按八字形或斜平行摆入菌枝，菌枝两端靠近菌棒鱼鳞口，在菌枝鱼鳞口处均匀放入鸡蛋大小菌种，在菌种之间放入麻种，再盖上一层树叶，在树叶上再按同样方法摆上菌棒、菌枝、菌种和麻种按土层厚度可栽2-3层，这种方法每层每平方米用菌种约6-7袋麻，种0.4-0.5kg。最后在床（穴)上覆盖10cm左右的腐殖土。1.3.3.4田间管理（1）防旱天麻和密环菌的生长要求有较高的湿度，栽麻后要经常浇水保持床(穴)内湿度适宜。一般床(穴)内湿度保持在50%-60%。（2）防涝天麻喜湿润条件，但怕积水，进入雨季要注意排水。（3）防冻天麻越冬时，要床穴、上面覆盖厚土、树叶或膜。1.3.3.5病虫害防治天麻在栽培过程中病虫害多，主要是杂菌的危害较重，创造密环菌生长的优良环境，抑制杂菌的生长要做到以下几点：（1）要选择新鲜的茵棒：新的木棒可以减少杂菌的感染。（2）选地得当：栽天麻的地一定要选排水良好、土质疏松参后地或林下，避免雨后积水。（3）菌种要纯，要充足：多优质菌种，使密环菌生长加快，借密环菌的优势来抑制杂菌的长。（4）加强床（穴)内水分、温度的管理：注意床（穴内的温度和湿度的变化，保持床（穴)内的湿度稳定，以有利于密环菌的生长而抑制杂菌的生长。1.4天麻的营养1.4.1天麻种子萌发的营养天麻种子萌发的营养一部分来源于从周围溶液中吸收养分，一部分与萌发菌（石斛小姑和紫萁小菇）共生获取营养。蜜环菌对天麻种子的作用，过去在学术界看法各异：有的认为天麻种子发芽仍需蜜环菌提供营养；有的认为接于天麻原生球茎基部的菌丝，很可能也是蜜环菌呈现的这一形式；有的认为天麻种子胚萌动初期所要求的菌根菌不是蜜环菌，而是别的真菌；有的实验证明，蜜环菌对天麻种子萌发有显著抑制作用，无外源营养供给，种子不能萌发。因此，天麻种子胚萌动初期所需的菌根菌并不是蜜环菌，而是紫萁小菇一类的真菌。萌发菌以菌丝形态侵入种子。萌发菌可由种皮的任何部位侵入种子，对细胞无选择性。被萌发菌侵染的天麻种子萌发过程：伴有萌发菌的天麻种子，播种后5天即可见侵入种皮的萌发菌，大都集结在胚的吸器残迹周围；播后10天，萌发菌通过胚的吸器残迹侵入胚柄细胞，分生细胞开始分裂；播后15天，菌已侵入胚柄细胞前端2-317 层，分生细胞旺盛分裂，胚逐渐长大，胚与种皮达到同等宽度；播后20-25天，生活力旺盛的菌丝侵入原胚细胞，并逐步侵入中心原胚细胞（及大型细胞）后，菌丝被消化，胚细胞核变形并逐渐破裂，产生圆形更新核，有的具双核仁，此期分生细胞已大量分裂，胚体也迅速增大；到播种后25天，有少数种子已突破种皮而发芽；播后55天左右，大量种子发芽。此期间，只靠紫萁小菇一类萌发菌供给营养，已远远不能满足天麻无性繁殖的需要，如不能和蜜环菌建立营养关系，营养繁殖经则很细长，顶端小茎块（初生茎块）也极小，越冬期大量未被蜜环菌侵染的个体，因缺乏营养而死亡。因此，天麻种子萌发后，进行无性繁殖，需要消化蜜环菌获得营养，蜜环菌逐渐代替紫萁小菇一类真菌，成为天麻的异养养源。1.5蜜环菌的生物学特性及生长特征1.5.1蜜环菌分类学地位蜜环菌属Armillaria，是口蘑科（Trieholomataeeae）中一个非常重要的属，分布于世界各大洲。该属真菌不仅具有很高的食药用价值，而且是世界上危害最严重的两大林木病原菌之一，加上其个体发育和形态结构的复杂性、特殊性，在大型真菌中显得十分突出，故一直是大型真菌的研究热点之一（2010年，王汉臣）。也是种植天麻的共生菌。1.5.2蜜环菌的形态特征蜜环菌为白蘑科蜜环菌属一种兼性寄生真菌，根据蜜环菌的发育阶段的不同可分为菌索培养和菌丝培养两种。菌丝体一般是以菌丝和菌索两种形态存在茵丝是一种肉眼看不见的丝状体，在纯培养中最初为白色，很快变为粉红色透明的细丝。菌丝常寄生或腐生于树根、树干的组织内，导致树木的腐朽，在衰老的天麻块茎组织内也有大量的菌丝分布。菌索是由无数条菌丝网结而成，外边由红褐色的鞘所包盖，幼嫩菌索棕红色，尖端有白色生长点，可不断伸长达数尺，扯拉时具有弹性。菌索老化后变成黑褐色，这样菌索失去了再生的能力，不能再繁殖出新的菌丝体。菌素常附着在树根、树干和天麻块茎的表面以及木质部和韧皮部之间。子实体常于夏末秋初湿度较大的条件下，在老树根的基部以及榛柴林内成批产生。菌盖蜜黄色或土黄色，是一种很好的食用菌，称为榛蘑。菌体高度平均为10cn1左右，菌柄基部与菌索相连，菌盖卵圆形至突出平展形，表面中央有多数褐色毛鳞。菌柄纤维质呈海绵状，松软，中上部具一双环或不明显，孢子白色。1.5.3蜜环菌的生长特性1.5.3.1兼性寄生17 蜜环菌可生长在200种左右的乔木树上，特别是一些阔叶树，它既能在死树上营腐生生活，又能寄生在活的树根上而引起森林病害，我们所以利用砍伐的木段培养出大量的优质菌材，就是利用蜜环菌腐生这个特性。1.5.3.2发光发光蜜环菌是一种能发光的食用菌，在夜间或黑暗处，常可以看到菌丝和幼嫩菌索发光，蜜环菌的发光与外界条件有关，受温度和氧气的影响，氧气充足时发光强；氧气缺乏时则发光弱。蜜环菌的发光温度在15～28℃，以25℃发光最强，10℃以下、28℃以上对发光不利。蜜环菌的发光特性是鉴别真假蜜环菌主要标志之一。在液体培养基中加麦麸摇床培养3天可见荧光，静止后保持湿度，荧光可持续一周。1.5.3.3好气好气性蜜环菌是一种好气性真菌，在嫌气条件下生长不良，所以，在人工培菌或栽麻时的选地以及箱栽所采用的培养料都必须考虑通气这个条件，蜜环菌才能生育良好。1.5.3.4温度菌丝在6～28℃均可生长繁殖，但以20-25℃生长最快，低于20℃或高于25℃生长不良。9月温度降至13～16℃，相对湿度保持80％～90％时，产生大量子实体(榛蘑)。1981年中国农科院特产研究所春季于温室内集中培菌，同年9月15日，当温度降至l5℃，培养料湿度为60％时，大量出现子实体，由于菌量大，子实体生育健壮，群丛内子实体数量最多达184个。每平方米收鲜子实体达10kg。实践表明，通过培菌可收获大量子实体，可以做到一举双丰收。1.5.4生长习性1.5.4.1温度蜜环菌生长的温度范围为6～30℃，最适生温度为25℃，超过30℃菌丝停止生长。1.5.4.2湿度蜜环菌适宜多雨湿润的土壤，大气相对湿度为80%～90%。1.5.4.3光线蜜环菌生长一般不需要光线，光照对蜜环菌生长有抑制作用。1.5.4.4酸碱度适宜的酸碱度为pH5.0～6.0。1.5.4.5适宜的树种多种阔叶树适宜蜜环菌生长，但以壳斗科的茅栗、白栎、槲栎等，与蜜环菌有很好的亲和力，最适宜蜜环菌生长。1.5.5蜜环菌的培养1.5.5.1蜜环菌的分离培养密环菌可采用菌索分离和孢子分离两种方法。菌索分离较简单，但所得的菌索可能是经过长期无性繁殖，生活力较弱。担孢子是经过子实体形成时的核配而产生，交配核17 的双方遗传物质经过重组和分离，孢子重新萌发形成新的菌丝进而形成菌索，生活力较强。（1）菌索分离法采用PDA培养基，在蜜环菌的野生分布区．从树桩或砍落的树杆上选粗壮呈棕红色的菌索，取其1-2cm的尖端，用清水冲洗干净，再用0.1％的升汞水消毒1分钟，然后用无菌水冲洗数次，放在培养皿上剪成约5cm的小段，用镊子刮烂菌索的鞘膜至露出白色髓，置斜面面培养基上，于25℃下培养15-20天。以上均在无菌条件下进行，所用工具器皿均应严格灭菌。蜜环菌菌丝絮状，具轮廓分明的边缘。初期生长缓慢，呈单独结节状，灰白色。7～9d后在絮状菌丝体中央呈现褐色，颜色逐渐加深并向四周蔓延，有荧光，能形成红棕色菌索，向斜面培养基里面生长。（2）孢子分离法，在秋天蜜环菌形成于实体时采种。先将采集孢子用的装置用纱布包好进行高压灭菌后送入无菌室备用。造成熟、健壮和菌裙未外露的子实体，剪去基部整体取下，置无菌室中。用0.1％～0.2％的升汞冰消毒1分钟，再用无菌水冲洗3—4次，将其插在孢子收集装置内的支架上，菌褶向下，外用钟罩罩住。在17℃下培养1～3天，孢子释放后，在培养皿中可见有咖啡色粉末状的拖子橱。孢子收集后应及早进行分离，一般用稀释培养挂。取接种针挑取少量孢子，放人有无菌水的三角担中，稍加摇动制成悬浮液，用接种针蘸取1滴孢子悬浮液在斜面或平板培养基上划线接种置25℃下培养，7～10d即可萌发。由于是多孢子接种，孢子萌发成单核菌丝后，很快与对应的单核菌丝配对，形成双核菌丝，双核菌丝体进一步发育成红棕色根状菌索。挑取萌发生长快、红棕色块状菌索、有荧光、生活力旺盛、无杂菌的菌落，移接到新的斜面培养基上，即可育成母种。除上述两种方法外。也可从童环菌材的木质部或天麻组银中分离培养童环菌菌种。蜜环菌的培养必须在无菌条件下进行，需要有接种室、接种箱或超静工作台、接种工具；菌种培养室、恒温培养箱、菌种培养架；高压蒸汽灭菌锅、电热干燥箱、紫外灭菌灯；菌种保藏用电冰箱；化学药品、试管、天平等。2材料和方法2.1材料2.1.1供试菌株选用菌株材料均由贵州省农业生物技术重点实验室提供，保存于PDA试管培养基上。菌株标号及来源如表1：表1蜜环菌供试菌株编号及来源菌株编号原名来源GZAAS.AM01045普定野生子实体分离GZAAS.AM02开212开阳天麻上伴生菌索分离GZAAS.AM03开3号开阳县种植户栽培菌种GZAAS.AM04大方九龙贵州省大方县九龙天麻开发有限公司17 GZAAS.AM05AM-17本室保存2.1.2主要仪器设备本实验所用到的相关仪器及设备规格及厂家如表2：表2：实验涉及到的相关的仪器设备仪器设备型号厂家高压灭菌锅生化培养箱GZ-250S韶关市广智科技设备发展有限公司光照培养箱GZ-250-GI韶关市广智科技设备发展有限公司无菌操作台SW-CJ-1G苏州净化设备有限公司培养架PYJ*5*2上海咏星生物科技有限公司电热鼓风干燥箱101-AB天津泰斯特仪器有限公司微波炉G80F20CW2L-B8(RO)格兰仕超纯水机CM-230电磁炉SH2131B美的数码相机SONY数码摄像机SONY倒置荧光数码显微镜IX71+DP72Olympus2.1.3培养基及相关试剂PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉10g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B10.01g，蒸馏水定容到1000ml，pH自然。配置方法：称取马铃薯200g，洗净去皮后切成均匀的土豆片，加800ml蒸馏水煮沸20min后使土豆熟而不烂，用6层纱布或者60目筛过滤取滤液；然后用万分之一电子天平称取葡萄糖20g，琼脂粉10g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5g、维生素B10.01g，加蒸馏定容到水1000ml，pH自然；最后将培养基加热使琼脂粉、KH2PO4等试剂完全溶解。试管斜面培养基制作：将18*180mm的试管洗净干燥后，将配置好的培养基趁热用分装器分装于试管中，装液量为试管的1/5—1/4的量，分装时切忌将培养基滴在试管口的内壁上；然后筛上硅胶试管塞或者棉花筛，将试管10只一捆有2层报纸包住试管口，放入高压灭菌锅内121℃，103.4kPa灭菌30min，最后将试管取出后摆成斜面等完全冷却后备用。平板培养基制作：将配置好的培养基趁热分装到洁净的500ml三角瓶中，装液量为300ml，然后用封口膜封三角瓶瓶口，经103.4kPa、121°C条件下灭菌30min后取出。趁热将培养基倒入90mm的洁净无菌的平皿中，每个平皿10ml左右，待培养基冷却凝固后备用。相关试剂，本实验用到的相关试剂及规格如表3：17 表3本实验用到的相关的试剂试剂规格AR/CP生产厂家KH2PO4500gAR天津市致远化学试剂有限公司MgSO4500gAR天津市致远化学试剂有限公司葡萄糖500gAR天津市科密欧化学试剂有限公司琼脂粉500gAR天津市科密欧化学试剂有限公司VB125gAR上海蓝季科技发展有限公司2.2实验方法2.2.1子实体组织块分离法选用9成熟无病虫害的蜜环菌子实体，先经0.1％升汞水或70％酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。将试管放在恒温箱中培养中25℃恒温避光培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养，得到纯的蜜环菌菌株。（黄年来，1993）2.2.2菌索分离法选用生长旺盛，白嫩的蜜环菌菌索，先经0.1％升汞水或70％酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。用无菌解剖刀将菌索切成0.5-1cm小段，然后，移放在斜面培养基中央。放在恒温箱中培养中25℃恒温避光培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养，得到纯的蜜环菌菌株。2.2.3无菌操作无菌操作需要对接种室消毒灭菌，按每平方米用量计算：40%的甲醛溶液8ml，高锰酸钾5g进行熏蒸。先关闭窗户，取甲醛溶液装入容器中，再放入高锰酸钾，人随之离开接种室，关闭房门，熏蒸1h即可。熏蒸后应隔1d使用。无菌操作接种时，先将各种器具放入接种室内，开启紫外灯灭菌30min后即可工作。超净工作台或接种箱开启紫外灯灭菌30min后，再进行操作，操作时需在酒精灯火焰附近进行。2.2.4供试菌株活化将供试菌株045、大方九龙、开212、AM-17及开3号用接种钩取玉米粒大小的菌种块放入平板培养基中央，每组3个重复，用封口膜封口后放人25℃恒温生化培养箱中培养，待菌索和菌丝发育后，直到长满平皿为止，备用。2.2.5蜜环菌菌落特征观察将5个活化后的供试菌株，用打孔器打成直径为6mm的琼脂块。取1块琼脂块接种于PDA平板培养基中，用封口膜密封后放入生化培养箱中25℃17 恒温培养。然后，每隔6h观察一次菌丝萌动情况。待菌丝萌动后，每天观察记录蜜环菌菌索的生长方式，菌索出现时间，菌索分枝出现的时间，分枝数以及菌索生长点长度等，知道菌索出现第二次分枝。每一个菌株3个重复。2.2.6蜜环菌菌丝菌索生长速度研究将5个活化后的供试菌株，用打孔器打成直径为6mm的琼脂块。取1块琼脂块接种于PDA平板培养基中，用封口膜密封后放入生化培养箱中25℃恒温培养。然后，每隔6h观察一次菌丝萌动情况。待菌丝萌动后，用记号笔以菌种块为中心画菌落生长十字架，然后每隔1d就用记号笔沿着菌落边缘在十字架的线条上画出菌落直径的边缘线并记录画线时间，直到菌丝长满整个平板为止，最后，用直尺测量菌丝菌落或者菌索的生长的直径与距离，计算出蜜环菌菌丝和菌索在PDA平板培养基上的平均生长速度。每一个菌株3个重复。3结果与分析3.1蜜环菌菌落特征以及菌丝菌索生长特性蜜环菌菌落特征以及菌丝菌索生长特性如表4和图1所示：由此可知，蜜环菌生长过程中主要以菌索方式存在，菌索幼嫩时呈黄白色或浅黄色，成熟后呈黄褐色或深褐色，不同菌株之间菌索的密集度、粗细以及颜色有所差异。用低浓度的乙醇溶液滴加到蜜环菌菌丝中菌索发生荧光反应。蜜环菌在液体摇瓶中培养先形成菌丝球，静置培养一段时间后就会形成菌索。在五个不同的供式菌株中，GZAAS.AM01GZAAS.AM02、GZAAS.AM03菌株在PDA培养基上生长最好，菌丝密集程度高，粗壮，幼嫩部分菌丝活力强，在天麻种植中，具有很大的利用价值。表4蜜环菌菌落特征菌株编号菌索密集程度菌索粗细菌索颜色GZAAS.AM01+++较粗+++菌索幼嫩时呈黄白色或浅黄色，成熟后呈黄褐色或深褐色GZAAS.AM02++较粗+++菌索幼嫩时呈黄白色，成熟后呈黄褐色或深褐色GZAAS.AM03++较粗+++菌索菌索幼嫩时呈白色或黄白色GZAAS.AM04轿稀+粗++菌索菌索幼嫩时呈白色或浅黄色，成熟后呈深黄色，培养基外为深褐色GZAAS.AM05密++较粗++菌索幼嫩时呈白色或黄白色，注：“+++”菌索较密/菌索较粗；“++”菌索密/菌索粗；“+”菌索稀。17 图1天麻蜜环菌在PDA固体培养基和液体培养中的菌落形态（部分照片）3.2蜜环菌菌丝菌索生长特性蜜环菌菌丝菌索生长特性如表4和图2所示：由此可知，蜜环菌接种到培养基中显现出菌丝，2-3d后开始出现菌索，菌索生长过程中经过5-8d后开始在菌索的顶端分支，形成新的菌索，刚长出的菌索颜色白色，具有很长的生长能力，这一具有生长活力的菌索称之为生长点，不同的菌株具有不同的生长点，菌索分支间的距离也各不相同，菌索开始形成时间，菌索分支多少，两个分支之间的距离，以及生长点的长度都可以作为蜜环菌优良菌株的一个前期判断指标。表4蜜环菌菌索特征（1）菌株编号菌索形成时间（h）平均±标准误差菌索分枝时间（h）平均±标准误差菌索数（只）平均±标准误差123123123GZAAS.AM0190849088±3.46BC961029698±3.46D45533947±7.02AGZAAS.AM0254664856±9.16F841149096±15.88D38312936±5.36BGZAAS.AM0390120114108±15.87B114120108114±6.00C29303531±3.21CGZAAS.AM0490849690±6.00B174168174172±3.46B21284531±12.34CGZAAS.AM0513896126120±21.63A366360366364±3.46A12151414±1.53E表4蜜环菌菌索特征（2）菌株编号菌索分支数（条）平均±标准误差菌索生长点长度（mm）平均±标准误差菌索分支间长（cm）平均±标准误差123123123GZAAS.AM016766.3±0.58A26302828.0±2.00A30283430.7±3.06DGZAAS.AM025575.7±1.15B26252325.7±1.53B38294035.7±5.86CGZAAS.AM033322.7±0.58E18101614.7±4.16D20223425.3±7.57EGZAAS.AM046455.0±1.00BC18191918.7±0.58C40443941.0±2.65BGZAAS.AM050010.3±0.58F20222221.3±1.15C56506256.0±6.00A17 图2不同蜜环菌菌索在PDA培养基中的生长特性3.3蜜环菌菌丝菌索生长速度蜜环菌菌索生长速度如表5和图3所示：由此可知，不同供试菌株之间的生长速度具有显著差异性，其中，GZAAS.AM01速度生长最快，其次是GZAAS.AM02和GZAAS.AM05。生长最慢的是GZAAS.AM04。表5不同蜜环菌菌株在PDA中的生长速度菌株编号萌动时间（h）生长速度（mm/d）平均±标准误差差异显著性1230.050.01GZAAS.AM0136-485.607.806.706.70±1.10AaGZAAS.AM0236-484.354.043.493.96±0.44BbGZAAS.AM0336-721.751.461.502.57±1.68CcGZAAS.AM0436-721.250.961.141.12±0.15CcGZAAS.AM0536-723.663.563.783.60±2.06Bb图3不同蜜环菌菌株在PDA中的生长速度柱状图3.4蜜环菌菌丝菌索的发育特性通过本实验研究可知，蜜环菌菌丝菌索的发育特性为，从子实体或者菌索上分离蜜环菌菌种时17 ，组织块或者菌索段先萌发形成菌丝，然后菌丝通过生理成熟逐渐形成菌索，菌索生长初表现出白色或者黄白色，随着菌索的不断伸长，菌索颜色逐渐变深为深黄色，衰老时呈棕黑色。同时，在菌索形成的7-10d后菌索的尖端进行分枝，形成新的菌索，新的菌索进一步生长发育又进行分支，如此就形成了网状的菌索。菌索老化后停止分支，分枝少的菌索比较粗，生长点越长生长力越旺盛。蜜环菌菌索的生长能力，以及菌索发育进度和生长能力的强弱对天麻的产量、质量以及稳产率具有很大的决定作用。4结论菌的实验室评价指标有蜜环菌菌索的颜色、粗细，菌索分枝多少，菌索生长点长短，分支间距离，菌丝发光情况等。菌索越粗壮，蜜环菌的生长力越旺，但是如果生长力越旺盛，菌索的分枝就会增加，菌索就会越来越细。蜜环菌菌索生长点越长，说明菌索的生命力越强。但生命越强，菌索的分枝就会越少，老化速度就会加快。发光性越强，则菌索的生命力就越强。但是发光体不是菌索，而是菌丝及幼嫩菌索周围的菌丝，而且蜜环菌的发光性需要充足的氧气或适宜的低浓度的乙醇，低浓度的乙醇对蜜环菌菌丝不是侵湿作用，如果过湿，则会导致蜜环菌的光学性消失，加适量的乙醇后可看到荧光，保持发光时的湿度，荧光可保持一周左右，在液体培养基内加适量的麦麸或玉米粉，摇床培养3天可看到荧光，保持此适度静置培养，荧光可保持一周右的时间。参考文献[1]神农本草经.北京：人民出版社，1982[2]徐锦堂，冉砚珠.天麻栽培技术.北京：农业出版社，1987[3]沈栋侠，等.天麻种子无菌萌发的研究.南京药学院学报，1979（1）：88-93[4]徐锦堂，郭顺星.供给天麻种子萌发营养的真菌--紫萁小菇.真菌学报，1989,8（3）：221-226[5]徐锦堂，牟春.天麻原球茎生长发育与紫萁小菇及蜜环菌的关系.植物学报，1990,32（1）：26-31[6]王贺，刘俭，等.天麻吸收蜜环菌营养基质的细胞学研究.植物学报，1997,39（6）：500-504[7]冉砚珠，徐锦堂.蜜环菌抑制天麻种子发芽的研究.中药通报，1988,（13）：591-593[8]张维经，李碧峰.天麻与蜜环菌的关系.植物学报，1980,22（1）：314-315[9]草野俊助.天麻与蜜环菌的共生联系.东京帝国大学农科大学纪要，1976,4（1）：1-67[10]秦国夫，等.蜜环菌的生物学研究进展[J].东北林业大学学报，2004。，32（6）:89-94[11]李喜战，等.蜜环菌的培养I菌种培养[J].食用菌，2002，24（2）：35-36[12]熊鹰，等.蜜环菌母种培养基筛选试验[J].中国食用菌，2004,23（5）：25-26[13]吴兴亮，等.贵州蜜环菌资源及其生态研究[J].贵州科学，2003,21（3）：56-6017 [14]谭周进，等.蜜环菌发光条件的研究[J].激光生物学报，2001,10（3）:187-190[15]程显好，郭顺星.蜜环菌固体培养特性[J].中国医学科学院学报，2006,28（4）：553-557[16]徐锦堂.天麻营养繁殖茎被蜜环菌侵染过程中细胞机构变化[J].植物学报，1997,39（6）：500-504[17]徐锦堂，等.天麻有性繁殖方法的研究.药学学报,.1980，15:100[18]徐锦堂，等.天麻种子发芽的营养来源及其与蜜环菌的关系.中草药，1980,11:125[19]周铉.天麻的有性繁殖[J].植物学报，1974,16（3）：288-290[20]郭顺星,徐锦堂,等.蜜环菌的化学成分及应用研究.生物学报，1996,23（4）：239-24617