毕业论文--蜜环菌液体发酵条件的优化研究 20页

西南大学食品科学学院本科毕业论文本科毕业论文（设计）题目蜜环菌液体发酵条件的优化研究学院食品科学学院专业年级08级学号222008324姓名指导教师成绩2012年5月2日17 西南大学食品科学学院本科毕业论文目录摘要1Abstract11文献综述21.1生物学特性21.1.1菌丝体21.1.2子实体21.1.3发光性21.1.4与天麻的共生关系研究21.2蜜环菌多糖的理化性质31.3蜜环菌多糖的作用31.3.1蜜环菌多糖抗衰老作用31.3.2蜜环菌多糖降血糖作用41.3.3蜜环菌多糖的免疫增强作用41.3.4蜜环菌多糖的保护作用41.3.5蜜环菌多糖抗眩晕症作用研究51.3.6蜜环菌多糖的其它作用51.4前景展望52引言63材料与方法63.1实验材料63.1.1菌种63.1.2菌种保存斜面培养基63.1.3多糖生产培养基63.1.4主要试剂63.1.5主要仪器73.2实验方法73.2.1蜜环菌的接种和培养73.2.2母种的保藏73.2.3蜜环菌菌索预处理73.2.4菌种的选取83.2.5最适培养天数的确定83.2.6最佳碳源组合的选择83.2.7最佳氮源组合的选择83.2.8最适培养温度的选择.......................................................................................83.2.9多糖含量的测定8(1)葡萄糖标准曲线的制备8(2)样品多糖含量测定9(3)多糖得率的计算94结果与分析94.1扫描蜜环菌多糖的最大吸收波峰917 西南大学食品科学学院本科毕业论文4.2菌种的选取94.3最适培养天数的确定104.4最佳碳源组合的筛选104.5最佳氮源组合的筛选124.6最适培养温度的选择................................................................................................125结论14参考文献15致谢1717 西南大学食品科学学院本科毕业论文蜜环菌液体发酵条件的优化研究吕龙西南大学食品科学学院，重庆400715摘要：蜜环菌作为一种药用价值极高的真菌，吸引了广大学者的关注和研究。本文论述了蜜环菌的属性、生物学特性和理化性质，以及蜜环菌的研究现状和前景展望，并提出了现阶段蜜环菌生产过程中存在的问题以及改进的方法。在几种不同蜜环菌种类(M3、M4、M6、M7、A9)中选择了一种最佳菌种作为培养菌种，确定了其最适培养天数，筛选出最佳碳源组合和氮源组合，研究了不同培养条件下蜜环菌菌丝干重和胞内多糖的变化情况，为后续的蜜环菌多糖的研究打下了坚实的基础。关键词：蜜环菌；菌丝干重；胞内多糖；培养条件ResearchonoptimizationofliquidfermentationconditionsofArmillariaLvLongCollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,ChinaAbstract:ArmillariamelleaasakindofFunguswhichhashighmedicinalvalue,attractedwideattentionfromscholars.Thispaperdiscussestheproperties,biologicalpropertiesandphysicochemicalpropertiesofArmillariamellea,aswellastheresearchstatusandProspectofit,italsoputforwardtheproblemsandimprovingmethodsintheproductionprocessofArmillariamelleaAtthepresentstage.ThisexperimentchoseabestmicrobesascultureInseveraldifferentspeciesofArmillariamellea(M3,M4,M6,M7,A9),determinedtheoptimumculturedays,selectedthebestcarbonsourcecombinationandnitrogensourcecombination.ResearchedthedryweightofmyceliumandintracellularpolysaccharideChangeconditionofArmillariamelleaindifferentcultureconditions,laidasolidfoundationbforthefollow-upresearchofArmillariamelleapolysaccharide.Keyword:Armillariamellea;drymycelialweight;intracellularpolysaccharide;cultureconditions17 西南大学食品科学学院本科毕业论文1文献综述蜜环菌(Armillariellamellea)属于担子菌亚门的一种真菌，其菌丝体和菌丝均能在暗处发光。属于白菇科真菌，是兰科天麻属植物天麻的共生菌，它们二者形成菌根。它与天麻相似，具有镇痉熄风，治疗癫痫惊悸等相当高的药用价值1790年由Vahl首次鉴定蜜环菌，此后发现蜜环菌可以引起多种针叶树及阔叶树根腐病，其寄主植物多达300属[1]。已报道的蜜环菌有36种，我国记载9种，主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、河南、河北、山西、山东、甘肃、陕西、青海、新疆、四川、安徽、福建、浙江、湖南、湖北、云南、贵州、广西、海南、内蒙古、西藏及台湾等省区。本文主要研究蜜环菌在不同的培养条件下蜜环菌胞内多糖的合成情况[2-3]。1.1生物学特性[4-5]1.1.1菌丝体菌丝体是蜜环菌的基本结构，一般以菌丝和菌索2种形式存在。菌索由一层红褐或黑褐色的鞘所包被，内有一束白色菌丝，直径一般为2～5mm，幼嫩菌索为棕红色，随着生长发育的进行，颜色逐渐变为红褐或黑褐色，菌索前端为菌丝生长点，生活力旺盛，菌索老化后，失去再生能力，不能再繁殖出新的菌丝体。菌索可保护菌丝免受外部不良环境的侵害，合理分配内部资源，同时增强单个菌丝对内部刺激的敏感性。1.1.2子实体丛生成伞状，菌盖幼时半球形，后平展，肉质，浅土黄色、蜜黄褐色、淡黄褐色，中部有平伏或直立的小磷片，盖缘常有放射状条纹；菌肉白色，菌褶白色或稍带肉粉色；菌柄中生或近偏生，纤维质内部松软或中空；菌环白色，着生于菌柄中上部；孢子椭圆形、卵圆形或近球形，颜色为印白色[6]。1.1.3发光性蜜环菌是一种能发光的真菌，在夜间或黑暗处，其菌丝和幼嫩的菌索能够发出荧光，这种光是一种冷光，无热感，为菌体内化学能直接转化为光能的一种现象。有研究人员发现，这种发光性与外界条件和其本身发育阶段有关。如菌种衰老时不能发光，且与外界环境条件有关如温度、氧气、乙醇浓度、空气相对湿度等[7]。1.1.4与天麻的共生关系研究天麻是一种名贵中药，具有平肝息风，止痉之功效。天麻属兰科Orchidaceae多年共生草本植物，无根无绿色叶片，不能进行光合作用。徐锦堂[10]研究发现蜜环菌对天麻种子发芽有抑制作用。王贺等发现蜜环菌是通过菌索侵染天麻，17 西南大学食品科学学院本科毕业论文而天麻皮层的大型细胞消化蜜环菌而获得营养；兰进[8]等利用H-葡萄糖以打孔浇灌法标记天麻，追踪标记化合物，显微镜放射显影的结果表明，蜜环菌能从天麻中获取营养，蜜环菌和天麻之间存在营养物质的相互交流，菌麻之间存在着特殊的共生关系；王贺[9]等引用溶酶体酸性磷酸酶的细胞化学方法详细研究了天麻块茎内3种不同的染菌细胞消化真菌的能力，发现只有最内层的染菌细胞才能释放水解酶消化真菌，外部两种细胞无消化作用。为了使所获得的优良蜜环菌菌株尽快地应用到天麻优质高产栽培中，王秋颖[10]等收集了国内外近20种蜜环菌，并进行了复壮，选择了其中11种有代表性的菌株培养成菌枝，对天麻进行了伴栽试验；孙士青[11]等采用不同生物学类型的蜜环菌对同一品种的天麻进行侵染实验，结果表明，不同类型的蜜环菌对天麻生物量及药效的影响差异显著。天麻与蜜环菌的关系，是高等兰科植物与真菌之间的一个生物相关问题，也是天麻发育生物学的一个重要问题。1.2蜜环菌多糖的理化性质蜜环菌多糖是蜜环菌的主要活性成分，主要包括胞内多糖和胞外多糖。目前关于蜜环菌多糖的组成有多种报道，洪毅[12]等从蜜环菌菌索中分离出蜜环菌胞内多糖，多糖组分与咔唑乙醇呈粉红色反应(Dische反应)，分析证明其中含有糖醛酸。气相色谱分析其组成单糖为D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖，组成单体为吡喃糖，不含蛋白质。李立恒[13]等从蜜环菌的发酵液中分离出的胞外多糖中含有一种中性多糖和多种酸性多糖，并且研究发现其中的一种中性多糖为葡聚糖，无蛋白质，含B2型糖苷键。另外，对蜜环菌菌丝体和发酵液的研究表明，蜜环菌多糖为单一葡萄糖组成的葡聚糖；菌索和子实体多糖由葡萄糖、木糖组成，这2种单糖在菌索多糖中的摩尔比为l:14，在子实体多糖中的摩尔比为1:10[14]。1.3蜜环菌多糖的作用[15]1.3.1蜜环菌多糖抗衰老作用衰老过程中自由基的大量产生可加速组织损伤，促进衰老。NO和MDA可以反映体内自由基累积的水平，而生物体主要依靠SOD等抗氧化酶来清除自由基。而蜜环菌菌索多糖能使上述变化逆转。表明蜜环菌菌多糖可从增强体质及调节机体免疫功能等方面达到延缓衰老的功效，蜜环菌菌索多糖能显著降低衰老小鼠体内MDA与NO含量，提高SOD活性，通过改善自由基代谢发挥抗衰老作用，此研究还显示，蜜环菌多糖亦可显著延长果蝇的平均寿命和最高寿命，进一步从整体水平上验证了蜜环菌多糖的抗衰老作用。17 西南大学食品科学学院本科毕业论文1.3.2蜜环菌多糖降血糖作用蜜环菌多糖（PolysaccharidefromtheRhizomorphofArmillariamellea,AMP)的组成及结构和一些降血糖多糖的有效成分有相似之处，蜜环菌菌索可在较短时间内大量获得，多糖含量高。于敏[16]等根据其纯化时所用的洗脱液的不同，得到了2种组分AMP-1和AMP-2。证实AMP-1能使正常小鼠的糖耐量增强，能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖；AMP-2能使正常小鼠在腹腔注射葡萄糖后升高的血糖快速降至正常，显著降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖，作用持久温和。为了探讨蜜环菌菌索多糖降血糖的作用机理，陶文娟[17]等选用了α-葡萄糖苷酶抑制剂分子模型。从酶活性抑制试验可看出，蜜环菌菌索多糖具有抑制活性，并且随着水解浓度的加大抑制率增加。1.3.3蜜环菌多糖的免疫增强作用[18-19]蜜环菌菌索多糖能加快正常小鼠生长，在正常范围内增加正常小鼠外周血白细胞数，对免疫抑制剂环磷酰胺(CY)所致的生长缓慢甚至体重减轻、CY作用前期白细胞数下降和CY作用后期白细胞数过分升高均有抵抗作用，表明AMP可增强机体的免疫功能。一定剂量的蜜环菌菌索多糖能显著地降低肝脏重量，表明AMP对免疫器官有一定程度的影响。蜜环菌菌索多糖能显著增强T细胞介导DTH反应(迟发型变态反应)，说明蜜环菌菌索多糖可增强小鼠的体液免疫反应及细胞免疫反应能力。蜜环菌菌索多糖能在体外显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用，并可诱导巨噬细胞产生NO且呈现一定的浓度相关性，在高浓度时，对巨噬细胞分泌IL-1有一定的促进分泌作用。蜜环菌菌索多糖能增强机体的特异性和非特异性免疫功能。可作为免疫增强剂，由于免疫反应过程十分复杂，目前还有许多环节尚未完全清楚，有待进一步研究。1.3.4蜜环菌多糖的保护作用蜜环菌多糖对环磷酰胺所致小鼠骨髓细胞损伤有较好的保护作用。环磷酰胺是一种氮芥类的抗肿瘤药物。在体外无活性。进入体内后在肝脏或血液中进行活化，变成具有烷基化的代谢产物。而发挥抗肿瘤的作用，它的副作用是严重损伤骨髓细胞造血功能。研究结果显示，保护组小鼠骨髓有核细胞数增多，尤其是早幼粒、分叶核细胞增多，说明蜜环菌多糖刺激骨髓细胞产生幼稚细胞增多，分化成成熟细胞，致使分叶核细胞增多，拮抗环磷酰胺对骨髓细胞的损伤，保护骨髓造血系统，其作用结果呈剂量依赖性关系。实验表明，一定浓度的蜜环菌多糖可以提高受试果蝇蛹的孵出率，降低当代及F2代果蝇突变率，同时染色体水平上的检测也证实了此结论，这说明蜜环菌多糖对于低能离子束诱变有一定程度的防护作用。17 西南大学食品科学学院本科毕业论文1.3.5蜜环菌多糖抗眩晕症作用研究眩晕是临床常见症状之一。前庭、视觉和本体感觉系统(平衡三联系统)中的任一系统有病变或受到刺激都会出现眩晕，眩晕症可以由多种病因以及外界条件刺激而产生，但由于病症的特殊性，难以客观定义和测量。目前抗眩晕药物的筛选主要采用行为实验方法，虞磊等采用了2种实验方法综合验证蜜环菌多糖药物对抗由机械旋转所致眩晕症的效果。小鼠眩晕模型在蜜环菌胞内多糖及盐酸地芬尼多片给药后均显示出明确、肯定的药效作用。市场上销售的蜜环菌片己被用于治疗晕眩，但对其作用机理和临床疗效还有待进一步研究。1.3.6蜜环菌多糖的其它作用蜜环菌菌索多糖还具有其它药理活性。在小鼠腹腔中注射蜜环菌发酵液可以延长小鼠的睡眠时间。小鼠尾静脉注射试验证明，蜜环菌发酵液能保护戊四氮引起的惊厥，能降低尼古丁引起的小鼠死亡数，能增加狗的脑血流量与冠状动脉血流量，小鼠口服蜜环菌发酵液试验证明无毒害作用。应用蜜环菌片还可以治疗高脂血症。大量试验都证明，蜜环菌菌丝和发酵液都具有镇静、抗惊厥、治疗心脑血管疾病等功效，并无毒副作用。经常食用蜜环菌子实体，可以预防视力失常、眼炎、夜盲、皮肤干燥、粘膜失去分泌能力，并可抵抗某些呼吸道和消化道感染的疾病蜜环菌多糖还具消炎和抗肿瘤的活性。1.4前景展望随着对蜜环菌研究的深入，其多糖的生理作用也逐渐被人们所了解，特别是其抗衰老、调节免疫和抗肿瘤作用，为以后蜜环菌的运用提供了理论基础。因此有必要对天麻共生蜜环菌及同属真菌进行分类鉴定及系谱学分析。目前市场上销售的蜜环菌商业种来源不明，分类混乱，对于天麻的人工栽培非常不利。虽然秦国夫等[20]人从分子生物学的角度对中国的蜜环菌生物种做了较详细的研究，郭顺星等人从应用的角度对与天麻共生的蜜环菌进行相关研究，但是对与天麻共生的蜜环菌的分类及分子鉴定尚未见相关报道[21]。蜜环菌是一种药用真菌，要工业化生产就首先要解决菌种确切来源及菌种鉴定的问题，加强对蜜环菌深层发酵的研究与利用，有望开发出一系列的保健产品，如饮料、浓缩口服液、片剂、胶囊等。为了进一步促进蜜环菌产业的发展，提高产品开发水平，需要做到以下几点：(1)蜜环菌生产一定要走规模化和全年生产化的道路。生产工艺上应该向液体菌种、固体栽培的方向发展。(2)继续开展蜜环菌有效成分检测、分离和纯化技术的研究，17 西南大学食品科学学院本科毕业论文为开发新的保健品和药品奠定基础。(3)加强细胞水平和分子水平上作用机制的研究。(4)开展对蜜环菌有效成分的化学修饰研究，以求大幅度提高其疗效。(5)蜜环菌的产品开发应由简单的直接粗加工向提取、精制和深加工方向转化，扩大其药用范围，提高其产品质量。2引言随着现代生活节奏的加快、工作压力的加大以及工业生产对环境的破坏，人类免疫系统功能降低，各种疾病的发病率呈上升趋势。真菌多糖，在国际上被称为生物反应调节剂(BiologicalRe-sponseModifier，BRM)，是目前公认的具有较高效应的免疫增强剂[22]。而且与大多数药品不同的是，由真菌多糖制成的药物，人类即使高剂量摄入，毒副作用也很小，是一类重要的保健食品，是当今医药和食品工业共同关注的焦点。蜜环菌多糖就是一种著名的真菌多糖，具有较高的研究价值。近年来，国内外学者分离得到了蜜环菌多糖、倍半菇类化合物和嚓吟类化合物等多种活性成分，对其各方面进行了研究。其中蜜环菌多糖是衡量蜜环菌保健功能的一个主要指标。应用现代发酵技术生产蜜环菌规模大，周期短，不受季节和环境限制，而且发酵实验研究发现液体发酵蜜环菌不仅能在短期内获得大量菌体，其菌体多糖的得率和糖含量也远远高于人工栽培菌索[23]，可以大幅度降低其作为保健品和药物开发的成本。本实验对蜜环菌培养的条件进行了研究，得出蜜环菌多糖产率最高的最佳条件，使后续的实验有了可靠的依据，为深入研究蜜环菌菌丝体多糖奠定了基础，也为开发蜜环菌保健食品提供了理论依据。3材料与方法3.1实验材料3.1.1菌种：蜜环菌购自华中农业大学食用菌研究所(M3、M4、M6、M7、A9)。3.1.2菌种保存斜面培养基：PDA斜面。3.1.3多糖生产培养基:碳源2%、氮源1%、鲜土豆打浆15%、KH2PO40.15%、MgSO40.075%、VB10.001%。3.1.4主要试剂试剂名称规格生产厂家苯酚　　　　　　　　　分析纯　　　　　　　重庆川东化工有限公司浓硫酸　　　　　　　　分析纯　　　　　　　重庆川东化工有限公司葡萄糖　　　　　　　　分析纯　　　　　　　重庆川东化工有限公司17 西南大学食品科学学院本科毕业论文蔗糖　　　　　　　　　分析纯　　　　　　　成都市科龙华工有限公司MgSO4　　　　　　　　　　　　　　　　分析纯　　　　　　　成都市科龙华工有限公司KH2PO4　　　　　　　　　　　　　　　分析纯　　　　　　　成都市科龙华工有限公司无水乙醇　　　　　　　分析纯　　　　　　　重庆川东化工有限公司磷酸二氢钠　　　　　　分析纯　　　　　　　成都市科龙华工有限公司糊精、红薯粉、蚕蛹粉、花生粉、豆饼粉、玉米浆干粉均购自北碚农贸市场。3.1.5主要仪器仪器名称型号生产厂家可见分光光度计　722-P　上海现科仪器有限公司电子天平　FA2004N上海精密科学仪器有限公司粉碎机　　YF103　瑞安市永历制药有限公司离心机Centrifuge5810　德国eppendorf公司电热恒温箱　HH-BII600-5型上海跃进医疗器械厂振荡培养箱　BS-4G　金坛市富华仪器有限公司高压灭菌锅　SW-CJ-1F型　日本TomyDigitalBiology公司医用型洁净工作台SW-CJ-1F　中日合资苏州安泰空气技术有限公司电子天平　CH-8606型瑞士天平仪器有限公司紫外分光光度　　　UV-2450型　　日本岛津公司3.2实验方法3.2.1蜜环菌的接种和培养用250ml的三角瓶，装量培养基100ml/瓶，接种3块1cm2等量菌块，在旋转式摇床中，设置转速150/min，温度25℃培养7天。3.2.2母种的保藏利用低温对微生物生命活力有抑制作用的原理，采用电冰箱低温条件保藏母种，是常用且简便的保藏方弦。其具体方法是：将已长好的试管菌种管口用玻璃纸或牛皮纸包扎后移入4-6℃的冰箱持藏室内也可用橡皮塞代替棉塞封试管口，然后放置冰箱中，每隔一定时间转管移植一次。用此法保藏可维持3-5个月[24]。3.2.3蜜环菌菌索预处理17 西南大学食品科学学院本科毕业论文用纯水将培养所得蜜环菌菌索洗净，然后冷冻干燥，研磨成成菌粉备用。3.2.4菌种的选取在相同蜜环菌培养条件下，分别同时培养五种蜜环菌M3、M4、M6、M7、A9，根据其分别的菌丝干重和多糖得率，选出合成胞内多糖最多的最佳培养菌种。3.2.5最适培养天数的确定培养最佳菌种，从培养3天后开始，每天测定菌丝的干重和多糖得率，确定最适培养天数。具体操作为取15个250ml三角瓶，做15个最佳菌种培养平行试验，从第四天开始每天取3个平行组进行测定，一直到第八天。每天记录其菌丝干重和多糖得率数据，选出蜜环菌合成多糖最多的培养天数。3.2.6最佳碳源组合的选择分别以葡萄糖、红薯粉、糊精、蔗糖四种碳源两两组合，以1:1的比例混合作为培养基的碳源成分，得到六种碳源。培养最佳菌种，并在最适培养天数分别测定六种碳源培养的最佳菌种的菌丝干重和多糖得率。根据其菌丝干重和多糖得率选出有利于合成多糖最多的最佳碳源组合。3.2.7最佳氮源组合的选择分别以蚕蛹粉、豆饼粉、花生粉、玉米浆四种氮源两两组合，以1:1的比例混合作为培养基的氮源成分，得到到六种氮源。碳源成分为选取的最佳碳源，培养最佳菌种，并在最适培养天数分别测定六种氮源培养的最佳菌种的菌丝干重和多糖得率。根据其菌丝干重和多糖得率选出有利于合成多糖最多的最佳氮源组合。3.2.8最适培养温度的选择　　　以最佳碳源组合和最佳氮源组合培养蜜环菌M7菌种，分别将菌种的液体培养液置于22℃、24℃、26℃、28℃、30℃下培养，五天后测定M7菌种的菌丝干重和多糖得率。根据其菌丝干重和多糖得率选出最适培养温度。3.2.9多糖含量的测定(1)葡萄糖标准曲线的制备：精密量取干燥到恒重的葡萄糖标准品10ml，置于250ml容量瓶中，定容、摇匀，得到40ug/ml葡萄糖标准液，精密移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml置于干燥具塞试管，分别加入蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2ml，再分别加5%的苯酚1.0ml，并迅速加人浓硫酸5.0ml，充分摇匀，沸水浴20分钟，冷却至室温，在490nm处测定其吸光度并以蒸馏水为空白，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线得到回归方程：17 西南大学食品科学学院本科毕业论文A=0.010C+0.073，R2=0.997，(A-吸光度，C-浓度(μg/ml))。(2)样品多糖含量测定：称取所研磨菌粉0.3g，以料液比1:20，水温85℃水浴2h，离心（3000r/min）取上清液，反复提取三次，合并上清液，加4倍无水乙醇静置24h后，离心（4000r/min）取沉淀，用75%乙醇清洗两次（清洗至表面无还原糖反应），然后加人适量的蒸馏水，加热溶解多糖，定容到100ml容量瓶中，采用苯酚-硫酸法[25]测定吸光度，并根据标准曲线计算多糖含量[26]。(3)多糖得率的计算：多糖得率%＝粗多糖重量/材料重量×100%。4结果与分析4.1扫描蜜环菌多糖的最大吸收波峰用紫外分光光度计在400nm到600nm波段扫描，结果如图1所示。图1蜜环菌多糖的最大吸收波峰扫描图Figure1Armillariamelleapolysaccharide’sthemaximumabsorptionpeak由图1可知，蜜环菌胞内多糖的最大吸收波峰在490nm处，且只有一个波峰。4.2菌种的选取培养五种蜜环菌菌种M3、M4、M6、M7、A9，测定五种菌种分别的菌丝干重和多糖含量，结果如表1所示。17 西南大学食品科学学院本科毕业论文表1蜜环菌不同菌种的菌丝干重和多糖得率测定情况Table1DifferentspeciesofArmillariamelleamyceliumdry’weightandyieldofpolysaccharide菌种M3M4M6M7A9菌丝干重/g0.9940.9680.9431.2130.898多糖得率/%4.9254.9464.9085.5085.459由表1可知，在相同条件下培养M3、M4、M6、M7、A9，其中M7菌种所得菌丝干重和多糖得率最大，多糖含量最高。A9菌种多糖得率稍微比M7差一点，但是它的菌丝干重最小，影响了整体的多糖含量。M3、M4、M6在菌丝干重和菌丝得率方面都明显不及M7，所以选取M7为最佳培养菌种。4.3最适培养天数的确定培养菌种M7，从培养第四天开始到培养第八天，分别测量M7菌种的菌丝干重和多糖含量，并观察随着培养天数的增加其菌丝干重和多糖得率的变化情况。结果如表2。表2蜜环菌M7菌种菌丝干重和多糖得率的变化情况Table2M7Armillariamelleastrains’dryweightofmyceliumandpolysaccharideyieldvariation培养天数第四天第五天第六天第七天第八天菌丝干重/g　　0.176　　　　0.285　　　　0.274　　　0.308　　　　0.207多糖得率/%　5.3497.5795.3295.4043.047由表2可知，蜜环菌M7菌种在培养过程中，其菌丝干重整体呈现先上升后下降的状态，在第七天达到最大值，随后开始老化，菌丝干重迅速下降，而多糖得率在第五天达到最高值，第五天后开始下降，可能是由于五天后蜜环菌自身消耗多糖增加，影响了多糖得率。通过计算，培养五天为最适天数，此时的蜜环菌M7菌种的多糖合成量最多。4.4最佳碳源组合的筛选以不同碳源组合作为碳源培养蜜环菌M7菌种，培养五天后观察对比菌丝颜色、大小、形态，结果如图2、表3所示。17 西南大学食品科学学院本科毕业论文图2不同碳源组合培养下蜜环菌菌球Figure2ArmillariafungusballofDifferentcombinationsofcarbonsources17 西南大学食品科学学院本科毕业论文表3不同碳源组合培养下蜜环菌菌丝颜色、形态、大小情况Table3Armillariahyphae’scolor,shapeandsizeofdifferentcombinationofcarbonsources碳源组合菌球颜色、形态、大小情况糊精+红薯粉　菌球颜色为白色，有突起，刺小且短，菌球大小不一。蔗糖+糊精　菌球颜色为微褐色，刺粗壮，菌球大小中等、均匀。红薯粉+葡萄糖　菌球颜色为白色，有突起，刺小且短，菌球大小中等。葡萄糖+蔗糖　菌球颜色为浅棕色，刺多毛多，菌球小。葡萄糖+糊精　菌球颜色为白色，刺粗壮，菌球较大、均匀。红薯粉+蔗糖　菌球颜色为土黄色，有突起，刺粗短，菌球大小不一。以不同碳源组合作为碳源培养蜜环菌M7菌种，培养五天后分别测量菌种的菌丝干重和多糖得率，结果如表4所示。表4不同碳源组合对蜜环菌M7菌种的影响情况Table4DifferentcombinationsofcarbonsourcesonM7strainofArmillaria葡萄糖+葡萄糖+葡萄糖+蔗糖+蔗糖+糊精+碳源组合蔗糖糊精红薯粉糊精红薯粉红薯粉菌丝干重/g1.013　0.9700.818　0.9190.6790.232多糖得率/%5.0614.9455.1035.0423.81310.514由表4可知，蜜环菌M7菌种在不同碳源组合培养下，其菌丝干重和多糖得率有较大差别。其中，在葡萄糖和蔗糖组合培养下，菌丝干重最大，葡萄糖和糊精组合次之；而多糖得率方面，在糊精和红薯粉组合培养下，多糖得率大于其他组合，但是其菌丝干重最小，说明红薯粉和糊精组合有利于蜜环菌体内合成多糖，但不利于其自身生长。红薯粉作为碳源具有很丰富的营养物质，在本实验中，它和其它碳源物质组合作为碳源后，蜜环菌的多糖产量反而下降，说明蜜环菌多糖产量与碳源物质本身所含有的糖的种类和比列有关。在实验过程中，由于糊精作为碳源物质时，发生了明显的糊化反应，影响实验观察，因此，选择葡萄糖和蔗糖组合作为最佳碳源组合，其在培养蜜环菌时多糖合成量也是最大的。4.5最佳氮源组合的筛选以不同氮源组合作为氮源培养蜜环菌M7菌种，培养五天后观察对比菌丝颜色、大小、形态，结果如图3、表5所示。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17 西南大学食品科学学院本科毕业论文图3不同氮源组合培养下蜜环菌菌球Figure3ArmillariafungusballofDifferentcombinationsofnitrogensources表5不同氮源组合培养下蜜环菌菌丝颜色、形态、大小情况Table5Armillariahyphae’scolor，shapeandsizeofdifferentcombinationofnitrogensources氮源组合　　　　　菌球颜色、形态、大小情况　花生粉+豆饼粉菌球白色，多数菌球小，绒毛细。个别菌球大，饱满，突刺短粗。　蚕蛹粉+豆饼粉菌球白色，多数菌球小，绒毛细。个别菌球大，瘪扁，突刺短粗。　蚕蛹粉+玉米粉菌球白色，无明显突刺，绒毛细而均匀，多数菌球小个别菌球大。　玉米粉+豆饼粉菌球颜色为棕色，菌球形态圆而大，饱满，突刺较细但明显。　蚕蛹粉+花生粉菌球颜色为浅棕色，菌球大，瘪扁，突刺粗短。　花生粉+玉米粉菌球颜色为棕褐色，菌球小但饱满，突刺较细但明显。以最佳碳源组合为碳源，以不同氮源组合作为氮源培养蜜环菌M7菌种，17 西南大学食品科学学院本科毕业论文培养五天后分别测量菌种的菌丝干重和多糖得率，结果如表6所示。表6不同氮源源组合对蜜环菌M7菌种的影响情况Table6DifferentnitrogensourcesonM7straineffectofArmillaria蚕蛹粉+蚕蛹粉+蚕蛹粉+花生粉+花生粉+玉米浆+氮源组合玉米浆豆饼粉花生粉豆饼粉玉米浆豆饼粉菌丝干重/g0.970　0.6410.472　0.8610.2630.223多糖得率/%4.301　2.7682.8383.7425.091　5.061由表6可知，在最佳碳源组合作为碳源培养下，以蚕蛹粉和玉米浆组合作为氮源培养蜜环菌M7菌种时，菌丝干重最大，且多糖得率也高，其多糖得率仅次于以花生粉和玉米浆作为氮源时，合成多糖总量最大。以花生粉和玉米粉浆组合为氮源培养蜜环菌M7菌种时，虽然其多糖得率最高，但其菌丝干重太低，多糖合成量较低。因此，以蚕蛹粉和玉米浆组和作为氮源时，更有利于蜜环菌合成胞内多糖。发酵温度的选择。4.6最适培养温度的选择以最佳碳源组合和最佳氮源组合培养蜜环菌M7菌种，分别将蜜环菌菌种的液体培养液置于22℃、24℃、26℃、28℃、30℃下培养，五天后测定M7菌种的菌丝干重和多糖得率，结果如表7所示。表7不同温度对蜜环菌M7菌种的影响情况Table7　DifferenttemperatureonM7straineffectofArmillaria温度/℃2224262830菌丝干重/g　　　　0.374　　　0.583　　　0.952　　　0.551　　　0.407多糖得率/%4.043　　　5.148　　　5.203　　　5.151　　　3.549由表7可知，随着培养温度的升高，蜜环菌菌丝干重和菌丝得率均不断增加，但在26℃以后，继续升温，菌丝干重和多糖得率均呈现下降趋势。所以，26℃是蜜环菌M7菌种的最适培养温度。5结论(1)在本实验条件培养下，蜜环菌M7菌种在菌丝干重和多糖得率两方面优于其它四种菌种，有利于后期实验对于蜜环菌多糖量的要求，因此选择蜜环菌M7菌种为最佳培养菌种。(2)培养蜜环菌M7菌种，在第五天，其多糖含量就达到了最大值。17 西南大学食品科学学院本科毕业论文比相关文献记录的培养时间缩短了1-3天，因此得出在本实验条件下，蜜环菌M7菌种的最适培养天数为5天，提高了实验效率。且在培养过程中，培养基的颜色逐渐加深，透明度降低，由开始的米黄色最后变为紫褐色。(3)筛选最佳碳源组合实验中，葡萄糖和蔗糖组合的菌丝干重最高，多糖得率也好，多糖得率仅次于糊精和红薯粉组合。由于其多糖合成量最大，因此选为最佳碳源组合。糊精和红薯粉组合有利于多糖的合成，但糊精的糊化作用影响了蜜环菌的正常生长，使得菌丝干重太低，而红薯粉的营养物质丰富，和其它碳源组合后没有显现优势，可能是因为与其他碳源的比例不当。(4)筛选最佳氮源组合实验中，蚕蛹粉和玉米浆明显优于其它组合。蚕蛹粉是很好的有机氮源，玉米浆在充当氮源物质时，由于其较大的淀粉颗粒，在生长的开始阶段不提供营养物质，到了后期生长才提供营养物质，所以使得蜜环菌在生长过程中都能有很好的营养保证。(5)最适培养温度的选择实验中，在26℃培养时，菌丝干重和多糖得率均达到最大值，所以本实验条件下，蜜环菌液体培养的最适培养温度为26℃。参考文献[1]RizzoDM,SlaughterGW.Root,diseaseandcanopygapsindeve1opedareasofYosemitevally,California[J].ForestEcologyandMnaagement,2001(146):159-167.[2]卯晓岚.中国经济真菌[J].北京:北京科学出版社,1998,135-140.[3]黄燕,罗强,胥成浩等.固体发酵蜜环菌多糖提取工艺研究[J].四川食品与发酵,2005.[4]李福后,王伟霞,许冰.蜜环茵的研究进展[J].安徽农业科学,2007,35(25):7741-7749.[5]邹容,康冀川.蜜环菌研究进展[J].山地农业生物学报,2005,24(4):260-264.[6]王永强，何秀玲，靳远祥.家蚕蛋白质组研究现状与趋势[J].蚕业科学,2006,32(4):541-457．[7]PAZOSF,STERNBERGMJ.Automatedpredictionofproteinfunctionanddetectionoffunctionalsitesfromstructure[J].ProeNatlAcadSciUSA,2004,10l(41):14754-14759.[8]徐锦堂,冉砚珠,王孝文.天麻种子发芽的营养来源及其与蜜环菌的关[J].中草药,1980,11(3):125-128．[9]兰进,徐锦堂,李京淑.蜜环菌和天麻共生营养关系的放射性自显影研究[J].真菌学报,1994，13(3):219-222．[10]王贺,许京秋,徐锦堂.天麻大型细胞消化蜜环菌过程中溶酶体小泡的作用[J].植物学报,1992,34(6):405-049.[11]王秋颖,郭顺星,关凤斌.不同来源蜜环菌对天麻产量影响的研究[J].中草药,2001,32(9):838-841．[12]孙士青,陈贯红.不同蜜环菌对天麻生物产量及天麻素含量的影响[J].山东科学,2003,16(2):7-10．[13]洪毅,沈业寿,樊叶杨等.蜜环菌菌索多糖分离纯化及其部分理化性质[J].中国食用菌1998,18(1):38-40．[14]李立恒,王征,谢达平等.蜜环菌深层发酵液多糖的分离纯化和组成[J].湖南农业大学学报,17 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西南大学食品科学学院本科毕业论文致谢：缙云山依旧，嘉陵水长流！转眼间，我已在缙云山脚下的西南大学度过了四个年头。四年，一段不短的时间，让我从青涩走向成熟。在这宝贵的四年生活中，首先我要感谢我的导师——杜木英教授。“授人以鱼，不如授之以渔”，杜老师正是这样以言传身教来教导着我们。 感谢我的母校—西南大学。感谢我的曹妍师姐，这片论文的每个实验细节和每个数据，都离不开你的细心指导。而你开朗的个性和宽容的态度，帮助我能够很快的融入我们这个实验室。 感谢我的室友们，从遥远的家来到这个陌生的城市里，是你们和我共同维系着彼此之间兄弟般的感情，维系着寝室那份家的融洽。四年了，仿佛就在昨天。四年里，我们没有红过脸，没有吵过嘴，没有发生上大学前所担心的任何不开心的事情。只是今后大家就难得再聚在一起吃每年元旦那顿饭了吧，没关系，各奔前程，大家珍重。    感谢我的家人——我的父母和姐姐。没有你们，就不会有今天的我！我一直感恩，感恩于我可以拥有一个如此温馨的家庭，让我所有的一切都可以在你们这里得到理解与支持，得到谅解和分担。我爱你们，爱我们的家！一个人的成长绝不是一件孤立的事，没有别人的支持与帮助绝不可能办到。我感谢可以有这样一个空间，让我对所有给予我关心、帮助的人说声“谢谢”！今后，我会继续努力，好好工作！好好学习！好好生活！！　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　吕龙　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2012年5月于重庆．北碚17