依提菲力白热斯蜜膏的药效学及毒理学研究 47页

分类号：通过中图分类号查询并填写密级：公开单位代码：10760学号：9160新疆医科大学XinJiangMedicalUniversity硕士学位论文THESISOFMASTERDEGREE同等学力申请学术性学位（学位教育）论文题目：依提菲力白热斯蜜膏的药效学及毒理学研究研究生阿布都吉力力•阿布都艾尼指导教师斯拉甫•艾白学科专业名称药理学研究方向维吾尔医配伍研究起止时间2010年7月所在学院新疆医科大学基础医学院2013年10月万方数据 依提菲力白热斯蜜膏的药效学及毒理学研究研究生阿布都吉力力•阿布都艾尼指导教师斯拉甫•艾白学科专业名称药理学研究方向维吾尔医配伍2013年10月万方数据 StudyonthePharmacodynamicsandToxicologyofIttirfilBarasＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByAbudujililiAbuduainiPharmacologyDissertationSupervisor:SilafuAibaiOctober,2013万方数据 论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：导师签名：签字日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定，（选择“同意/不同意”）以下事项：1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；2.学校有权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》或其他同类数据库，传播本学位论文的全部或部分内容。学位论文作者签名：签字日期：导师签名：签字日期：万方数据 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名MDAMalondialdehyde丙二醛CHEcholinesterase胆碱酯酶MAOmonoamineoxidase单胺氧化酶tumornecrosisTNF-α肿瘤坏死因子-αfactor-alphaIL-2Interleukin-2白细胞介素-2tyrosinase-relatedTRP-1酪氨酸相关蛋白-1protein1TyrTyrosinase酪氨酸酶tyrosinase-relatedTRP-2酪氨酸相关蛋白-2protein2Achacetylcholine乙酰胆碱SODSuperoxideDismutase超氧化物歧化酶GlutathioneGSH-PX谷胱甘肽过氧化物酶peroxidase万方数据 CATCatalase过氧化氢酶PhosphateBufferedPBS磷酸盐缓冲液SalineDMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜MPOmyeloperoxidase髓过氧化物酶celladhesionmoleculeICAM-1细胞间粘附分子-11IFN-ϒInterferonϒ干扰素-ϒIL-6Interleukin-6白细胞介素-6IL-8Interleukin-8白细胞介素-8IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GIgMImmunoglobulinM免疫球蛋白MIgAImmunoglobulinA免疫球蛋白A万方数据 目录中文摘要…………………………………………………………………….…………1ABSTRACT……………………………………………………………………...……2前言………………………………………………………………………….…………4.内容与方法……………………………………………………………………………71.依提菲力白热斯蜜膏对氢醌致C57BL小鼠白癜风模型的疗效研究…71.1.材料与方法……………………………………………………………71.1.1材料………………………………………………………………..………71.1.2方法………………………………………………………………..………91.2.结果……………………………………………………………………141.2.1肉眼观察……………………………………………….………141.2.2依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠血清中MDA、CHE、14MAO、TNF-α、IL-2水平德影响…………………………………1.2.3依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠皮肤组织匀浆MDA、15CHE、MAO水平……………………………………………….…1.2.4依提菲力白热斯蜜膏对小鼠脾脏、胸腺系数的影响….……161.2.5依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠对皮肤含黑色素毛囊计17数的影响………………………………………………………………1.2.6依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠基底层黑素细胞的影18响……………………………………………………………………..1.3.讨论………………………………………………………192.依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375细胞增殖及酪氨酸酶、黑素合成的20研究………………………………………………………………………………2.1.材料与方法…………………………………………………….………212.1.1材料………………………………………….……………21万方数据 2.1.2方法……………………………………………..……………222.2.结果…………………………………………………………………..242.2.1依提菲力白热斯蜜膏含药血清给药后A375细胞增殖及形态24变化……………………………………..………2.2.2A375细胞的形态学变化……………………………………252.2.3依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375酪氨酸酶及黑素合成25的影响……………………………………………………………….…2.2.4依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375黑素合成的影响……263.依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠白癜风相关基因转录水平的研究……..273.1.材料与方法……………………………………………….…………..273.1.1材料…………………………………………………………..273.1.2方法…………………………………………..……………….293.2.结果……………………..…..303.2.1小鼠皮肤组织总RNA的完整性检测………………..……303.2.2给药后CAT和TYR基因转录水平的变化…………….…313.3.讨论……………………………………………..…………….…………334.依提菲力白热斯蜜膏毒性研究…………………………………………354.1依提菲力白热斯蜜膏小鼠灌胃急性毒性试验………………………354.1.1实验材料与仪器……………………………………………….354.1.2试验方法…………………………….,………………..……364.1.3实验结果………………………………………………..………384.1.4结论…………………………………………………….………394.1.4讨论………………………………………………………..……394.2依提菲力白热斯蜜膏小鼠灌胃长期毒性试验……………….……..40万方数据 4.2.1材料……………………………………………………………404.2.2实验方法……………………………………………………424.2.3结果………………………………….………………………454.2.4讨论……………………………………………………………484.2.5结论…………………………………………………..………49讨论………………………………………………………………………..…50小结……………………………………………………………………..…51致谢……………………………………………………………………..…52参考文献………………………………………………………………..…53综述60攻读硕士学位期间发表的学术论文科研论文74新疆医科大学硕士研究生学位论文导师评阅表75附件76万方数据 新疆医科大学硕士学位论文依提菲力白热斯蜜膏的药效学及部分机理研究研究生：阿布都吉力力·阿布都艾尼导师：斯拉甫·艾白研究员教授协作导师：热比姑丽·伊斯拉木摘要目的：依提菲力白热斯蜜膏按维吾尔医配伍组成规律进行拆方，探讨各组成部分对白癜风所引起的药理效应。方法：选用C57BL小鼠，用化学脱色法建立白癜风模型；观察蜜膏不同拆方组分对小鼠表皮毛囊黑色素生成，小鼠血清及局部皮肤组织匀浆丙二醛（MDA）、胆碱酯酶（CHE）、单胺氧化酶（MAO），及小鼠血清肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-2（IL-2）水平的影响。蜜膏按维吾尔医拆方，四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定对细胞增殖的影响，用酶学方法测定对酪氨酸酶活性的影响，比色法测定对黑素含量的影响。结果：蜜膏（主药+辅助药、全方）能血清MAO降低水平（p<0.01）；蜜膏（主药、主药+辅助药、全方）能降低皮肤组织匀浆MAO水平（p<0.05～p<0.01）；蜜膏（主药、主药+辅助药、主药+调节药、全方）能降低皮肤组织匀浆MDA水平（p<0.05～p<0.01），蜜膏（主药+调节药）能降低皮肤组织匀浆CHE水平（p<0.05）。蜜膏全方组（主药+辅助药+调解药）对A375细胞的增殖促进作用最强，其次为主药组；主药组对酪氨酸酶活性上调作用最强，其次为（主药+调节药）组；主药组对黑素合成具有较强的促进作用，其次为（主药+调解药）组。结论：蜜膏对实验性白癜风有治疗作用，可能是通过降低血清MAO水平，降低皮肤组织匀浆MAO、MDA、CHE水平。依提菲力白热斯蜜膏对A375人黑素瘤细胞株促进细胞增殖、酪氨酸酶活性增强和黑素含量增加作用。关键词白癜风，配伍，依提菲力白热斯，维吾尔医，黑色素瘤细胞StudyonthePharmacodynamicsandSomeMechanismofIttirfilBarasPostgraduate：AbudujililiAbuduainiSupervisor：Prof.SilafuAibaiAssistant:RebiguliYisilamuAbstract1万方数据 新疆医科大学硕士学位论文Objective:UyghurmedicineprescriptionIttirfilBarasistobedismantledaccordingtotheUyghurMedicineTheorytoexplorethepharmacologicaleffectsofthevariouscomponentgroupsonvitiligo.Methods:C57BLmicewereselectedandmicemodelofvitiligowasformedbychemicaldecolorization.TheeffectofdifferentdismantlegroupofIttirfilBarasontheformationofmelanininmousehairfolliclewasobserved.Besides,malondialdehyde(MDA),cholinesterase(CHE),monoamineoxidase(MAO)inserumandthelicalskintissue,andserumtumornecrosisfactor(TNF-alpha)andinterleukin-2(IL-2)levelwereobservedaswell.IttirfilBaraswasdismantledaccordingtotheUyghurMedicineTheory.A375cellsproliferationwastestedbyMTTmethod,tyrosinaseactivitywasmeasuredwithenzymaticmethod,melanincontentwasmeasuredbyColorimetry.Results:IttirfilBaras(themaindrugs+supportingdrugs,thewholePrescription)reducedserumMAOlevel(p<0.01),serumMDAandCHElevelwasnotstatisticallysignificant(p>0.05);IttirfilBaras(themaindrugs,themaindrugs+supportingdrugs,themaindrugs+adjustingdrugs,thewholePrescription)reducedtheskintissue(MDA)levels(p<0.05top<0.01),(themaindrugs+adjustingdrugs)reducedthelevelofskintissuehomogenateCHE(p<0.05),(themaindrug,themaindrugs+supportingdrugs,thewholePrescription)reducedtheskintissuehomogenateMAOlevels(p<0.05top<0.01);IttirfilBaras(themaindrugs,themaindrugs+supportingdrugs,themaindrugs+adjustingdrugs,thewholePrescription)ontheserumTNF-alpha,IL-2levelwasnotstatisticallysignificant(p>0.05).Thewholeprescriptiongroup(maindrugs+supportingdrugs+adjustingdrugs)showedthestrongestA375cellproliferationpromotingeffect,followedbythemaindrugsgroup.Themaindrugsgroupraisedthestrongesteffectontyrosinaseactivity,followedby(themaindrugs+adjustingdrugs)group.Themaindrugsgrouphadastrongroleinpromotingmelaninsynthesis,followedby(themaindrugs+adjustingdrugs)group.Conclusion:IttirfilBarasmighthavetheroleofreducingthelevelofserumMAOandtheskinhomogenateMAO,MDA,CHElevelinexperimentalmicemodelofvitiligo.IttirfilBarashastherolesofpromotingA375humanmelanomacellsproliferation,raisingtyrosinaseactivity,andincreasingmelanincontent.KeyWords:Vitiligo,Prescription,IttirfilBaras,UyghurMedicine,MelanomaCells2万方数据 新疆医科大学硕士学位论文前言白癜风(vitiligo)是一种常见的后天性色素性皮肤病，发病“居无定处”，具风邪特点，风行到何处，该处即变白，故称之为“白癜风”。白癜风的症状为皮肤出现局限性或泛发性白斑，白斑的形态不一，可以发生在身体的任何部位，但一般多发生于皮肤外露及易受摩擦的部位，如颜面部、颈[1-2]部、前臂、手背、小腿、腰腹部等。此病由皮肤和毛囊的黑色素脱失所引起，临床上易于诊断而难于治疗。虽然白癜风基本不影响患者的身体健康和生理活动，但是由于本病造成的皮肤损害直接影响着患者的外观容貌，给他们带来了极[3]大精神压力和心理负担，对大部分患者的生活、学习、工作、社交等方面都带来了许多负面因素。白癜风的发病原因到目前为止还不十分清楚，因此，治疗起来存在一定困难，无法从病因上去寻找解决方法。治疗白癜风的良药极少，疗效不满意，有的患者病急乱投医，盲目用药的后果可能会导致病情的进一步恶化，给治疗增加难度。白癜风是一种病因复杂的疾病。其具体致病原因和发病机理目前尚未完全明确。国内外大量研究表明，该病发病可能与多种因素综合作用有关。关于白癜风[5]患者黑色素缺失的原因与机制主要有以下几种学说：3万方数据 新疆医科大学硕士学位论文[6](1)免疫异常学说：白癜风的发病与免疫系统异常有关，黑色素细胞的破坏，[7]很可能是自体免疫反应的结果。[8](2)黑素细胞自身破坏学说：该学说包括了几种看法，有学者认为，白癜风患者皮肤黑色素细胞存在遗传缺陷，超微结构出现异常;黑素细胞生长因子缺乏学说则认为白癜风的发病可能是由于维持黑素细胞正常结构及功能的生长因子缺乏所致。(3)神经化学因子学说。约有2/3患者在起病或皮损发展阶段有精神创伤、过度劳累等精神过度紧张情况，其机制可能为:酪氨酸是黑色素合成以及神经介质[9]合成的共同的前体，其间可以发生竞争性抑制。(4)微量元素及自由基学说：研究表明，白癜风患者体内自由基增多，超氧[10]化物歧化酶水平降低，微量元素缺乏。[11]维吾尔医学认为白癜风发生是由于人体气质(密杂吉)和体液(合力提)平衡失调，支配器官功能减弱,贫血，饮食习惯，遗传因素，外伤，外界环境等复杂的内外因素相结合引起，累及肤表所致的,局限性或全身性白斑为主要特征的病症,其中异常黏液质所致的尤为多见。虽然白癜风很难治愈，但是治疗方法还是比较多。目前多采用综合疗法、局部与整体结合疗法、中西医相结合疗法以及药物理疗结合疗法等多种方法，旨在提高治疗效果，减少副作用。白癜风的西医范畴的疗法主要包括光化学疗法[12-13][14][15]、免疫疗法及手术疗法。2.维吾尔药配伍维吾尔药是以中医理论为基础，用于防治疾病的植物、动物、矿物及其加工品。维吾尔药文化，底蕴丰富，有着数千年的悠久历史，是中华民族的国粹，也是我国人民在长期的生产劳动、生活实践与医疗实践中不断地进行积累总结的结果，伴随着中华民族文明的产生而产生。维吾尔药有着独特的理论体系和应用形式，充分反映了我国自然资源及历史和文化等方面的特点。维吾尔药源远流长，它作为中华文明的一项重要遗产，不仅是中国医药经济中独具特色的组成部分，也是国际医药的重要组成部分，由于维吾尔药主要以天然产品为原料，具有疗效好、毒副作用小等特点而被世界广泛认可，在人类健康中发挥着不可替代的作用。民族医药学是祖国医学的重要组成部分。维吾尔医药学是维吾尔族人民同疾病作斗争的经验和智慧结晶，也是一门具有鲜明民族特点的民族医药学科学。维吾尔医药按来源可分为植物类维吾尔医药、动物类维吾尔医药、矿物类维吾尔医药及它们的化学制品，绝大多数的维吾尔医药取自野生植物。维药往往是混合给药，由此产生的药理作用往往是多种成分相互作用的综合结果，即维药的相互作用是通过不同类型的化合物药物配伍来实现的。配伍是指将两种或两种以上的药物配合应用，药材药效不同，相互配伍后可起到协同或拮[16-17]抗的作用，从而对机体进行整体调节并治疗疾病。因此，进行维药的相互作用研究，对发挥维药协同增效作用、提高疾病治疗效率、降低毒副作用的发生、逆转药物多药耐药等具有重要意义，为更有效临床用药提供依据。同时也是优化植物化学物配伍组合来进行新药研究和维药现代化的需要。维药配伍理论是维吾尔医药理论的精华，开展方剂配伍规律的现代研究是维吾尔医药现代化研究的重要组成部分，对于继承和发展维药配伍理论具有重要理论意义。以药效学为研究手段，探讨依提菲力白热斯蜜膏配伍对实验动物的药理效应，从配伍的体内和半体内药理效应的变化的内在联系，阐明配伍内涵。4万方数据 新疆医科大学硕士学位论文近年来，一些学者在维吾尔医药的临床治疗、剂型改革方面取得了一定成果，但对于某种方剂发挥药效的物质基础研究较少，因此有必要进行深入研究以探讨维吾尔医药方剂配伍的作用机理及配方规律。维药经过了约近两千年的千锤百炼，也是人们科学实验经验的结晶，具有疗效好、毒性低、不易产生多药耐药等优点。因此，进行治疗白癜风维药的研究，阐明其药效物质基础、作用机制、作用靶点、配伍协同、增效减毒等机制对丰富和发展我国的维药现代化奠定基础，也为预防和治疗各种疾病提供新的契机。同时，本课题是首次从现代药理学的角度来研究依提菲力白热斯蜜膏的药理效应，从而阐明本配伍具有一定的治疗白癜风作用。该研究结果将为依提菲力白热斯蜜膏的配伍合理性提供实验依据，为临床应用依提菲力白热斯蜜膏的治疗疾病提供实验依据，进一步丰富维吾尔医配伍理论。研究内容与方法1.依提菲力白热斯蜜膏对氢醌致C57BL小鼠白癜风模型的疗效研究白癜风作为一种色素障碍性疾病，其最主要表现为皮肤黑色素细胞及黑色素颗粒数量的减少。依提菲力白热斯蜜膏是维吾尔医治疗白癜风的常用复方，由驱虫斑鸠菊、补骨脂、黑种草籽、除虫菊、丁香等14味药材组成。其中，驱虫斑鸠菊、补骨脂、黑种草籽为处方中的主药，除虫菊、丁香、干姜、洋茴香、芥子等为处方中的辅助药，其余的西青果、白桦酸藤果子、诃子、毛诃子、余甘子、西红花等在处方中起到调节作用。维吾尔医理论认为，依提菲力白热斯蜜膏是通5万方数据 新疆医科大学硕士学位论文过调节人体四种“赫立特”的平衡、通脉、理血等达到治疗白癜风的治疗目的。目前该药在临床应用中能显著逆转患者皮损处的色素脱失斑，使白斑区的黑素细胞水平恢复至正常水平。但由于其处方中含有西红花、余甘子等部分毒性药材，因而严重限制了该药的应用及发展。本研究通过氢醌致C57BL小鼠白癜风模型，评价依提菲力白热斯蜜膏中的主药、主药+辅助药、主药+调节药以及完整处方的药效作用，为该药的合理配伍、增效减毒及临床合理安全用药奠定基础。1.1.材料与方法1.1.1材料1.1.1.1实验药材驱虫斑鸠菊、补骨脂、黑种草籽、除虫菊、丁香、干姜、洋茴香、芥子、西青果、白桦酸藤果子、诃子、毛诃子、余甘子、西红花等均购自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院。1.1.1.2实验动物C57BL小鼠（18±2g）70只，雌雄各半，由新疆医科大学实验动物中心提供，可证号：SCXK（新）2003-0001。1.1.1.3实验试剂试剂、耗材名称品牌产地丙二醛（MDA）测试盒南京建成生物工程研究所生产美国单胺氧化酶(MAO)测试盒南京建成生物工程研究所生产中国考马斯亮兰试剂盒南京建成生物工程研究所生产中国胆碱脂酶（CHE）试剂盒中生北控生物科技股份有限公司生产中国肿瘤坏死因子（TNF-α）放射免疫试剂盒北京北方生物技术研究所生产中国白细胞介素-2（IL-2）放射免疫试剂盒北京北方生物技术研究所生产中国驱虫斑鸠菊、补骨脂、黑种草籽等14种药材自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院药剂中国科一次性移液器枪头（10µl、200µl、1000µl）AXYgen美国EP管AXYgen美国1.1.1.4实验仪器仪器名称型号，品牌产地二氧化碳培养箱MCO-18AIC，三洋美国酶标仪Biorad550，伯乐美国超低温冰箱三洋美国倒置显微镜37XB中国离心机Allegra64R中国6万方数据 新疆医科大学硕士学位论文超声波清洗机SK8210HP，科导中国高压蒸汽灭菌锅LDZX-75KBS，申安中国4℃/-20℃冰箱Haier中国精密电子天平FA2104S中国冷冻离心机TGL-16G中国AMS全自动生化分析仪PM4000/3意大利，罗马紫外分光光度计CINTRA澳大利亚(721)分光光度计WFJ-1中国粉碎机DFY-600中国酶标仪Anthos2010中国1.1.2方法1.1.2.1主要试剂的配制1）脱毛膏的配制分别将油相部分及水相试剂加热，熔化至温度为70-75°C，然后将水相缓慢加入到油相中，定向搅拌至将研匀的另相部分加入，继续搅拌至冷凝，既得均匀细腻的软膏。备注：2.5g氢醌+0.5g无水亚硫酸钠（共同研磨后）+57.3g水=60.3gA油相名称作用用量（g）十八醇油相成分6硬脂酸油相成分8白凡士林油相成分8氮酮促透剂2B水相名称作用用量（g）三乙醇胺水相成分1.6甘油促湿剂5十二烷基硫酸钠乳化剂1尼泊金乙酯防腐剂0.1水水相成分与药物溶剂60.3丙二醇调节乳剂性状5C另相名称作用用量（g）甘油另相2硬脂酸抗氧剂12）5%过氧化氢溶液量取40mL30%H2O2溶液，加纯化水至240mL，搅匀，即可。3）Bouin氏液苦味酸18.3g，蒸馏水1500mL，搅拌至完全溶解，然后加入甲醛（40%）500mL，冰醋酸100mL，搅拌均匀，即可。7万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4）0.01M的磷酸盐缓冲液（pH7.2-7.4）将PBS磷酸盐缓冲液包用蒸馏水溶解至2000mL。5）0.5%伊红染液取伊红Y（水溶）10g，溶于990mL蒸馏水中，再加入5mL冰醋酸，摇匀即可。6）Harris氏苏木素液A液：苏木素10g溶于100mL无水乙醇中；B液：硫酸铝钾200g溶于2000mL蒸馏水中；C：一氧化汞5g先将A液加热溶解后，密封待用，再将B液加热溶解至沸，去火，待溶液处于小沸腾状态时将A液缓缓倒入B液中，全部混匀后，再使溶液在短时间内加热至沸腾，去火，最后，将氧化汞缓缓分次倾入溶液中，此时液体变为深紫色，待氧化汞全部放入后，再将溶液加温至沸腾片刻，立即将溶液放入流动的冷水中，并缓缓的连续摇晃至溶液完全冷却为止。隔夜后过滤，加入冰醋酸105mL，混匀，再过滤后保存于4℃备用。7）1%盐酸酒精分化液浓盐酸1mL，70%乙醇99mL，混匀即可。8）氯化铁和铁氰化钾混合液A液：1%铁氰化钾溶液；B液：2%三氯化铁溶液，临用前将A液和B液等体积混匀。9）0.2%硫脲-乙醇溶液称取0.20g硫脲溶于100mL95%乙醇中，摇匀即可。10）0.5%CMCNa溶液将每5gCMCNa自然溶胀于1000mL蒸馏水。1.1.2.2试药的处理及配制将驱虫斑鸠菊、补骨脂、黑种草籽、丁香、洋茴香、阿纳其根等14种药材按照处方比例称重，于高速粉碎机中粉碎至细粉，然后过孔径0.15mm（100目）药筛。药材粉末用0.5%CMCNa配制混悬液备用。1.1.2.3具体实验方法将购自新疆医科大学实验动物中心的C57BL小鼠饲养于新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所普通动物房IVC盒中，提供灭菌饲料及蒸馏水，适应性喂养1周后，开始造模。根据动物体重，将C57BL小鼠70只，利用PEMS3.1医用软件随机分成7组，每组10只，雌雄各半。剪去小鼠背部长毛，剃去面积约2cm×3cm短毛。造模第一天开始，除阴性对照组外，其余组小鼠在脱毛区涂3％氢醌霜1g，2次/d，连续25d，建立白癜风小鼠模型；阴性对照组小鼠在脱毛区涂蒸馏水lml，2次/d，连续25d。实验期间，各组小鼠剃毛1次/3d。具体分组情况及造模实验方法如下表组别组名造模处理方法1正常对照组脱毛区涂抹生理盐水，剂量1.0mL/d，bid，连续45天。2模型组脱毛区涂抹氢醌，1.0mL/d，bid，连续45天。3主药脱毛区涂抹氢醌，1.0mL/d，bid，连续45天。4主药+辅助药脱毛区涂抹氢醌，1.0mL/d，bid，连续45天。5主药+调节药脱毛区涂抹氢醌，1.0mL/d，bid，连续45天。8万方数据 新疆医科大学硕士学位论文6全药脱毛区涂抹氢醌，1.0mL/d，bid，连续45天。连续涂抹45天后，按处方比例灌胃给药，1次/d，20ml/kg，共30d。末2次给药后，肉眼观察疗效判定标准：以小鼠用药部位中心2cm为一观察单位，优为受试区色素基本恢复正常；良为受试区出现色素面积>50％；中为受试区色素面积<50％；差为受试区皮肤呈苍白或白斑状；总有效率以（优+良）计算。之后将小鼠摘眼球取血，TGL-16G冷冻离心机分离血清，用PM4000/3全自动生化分析仪，丁酰硫代胆碱法测定CHE活性；用WFJ-1（721）分光光度计，TBA法和考马斯亮兰法测定MDA和总蛋白含量；用CINTRA紫外分光光度计测定MAO活性。用Anthos2010酶标仪，酶联免疫分析（ELISA）法测定TNF-α、IL-2。2同时，取给药部位1×1cm皮肤，以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后对黑素细胞的观察，进行Dopa-氧化酶染色和Lillie染色观察豚鼠基底层中黑素细胞（melanocyte，MC）数和表皮中含黑素颗粒的细胞数。1.1.2.4质量控制1）血样低温运送到实验室，经低温离心分离血浆，并保存于-80℃冰箱。运送过程、离心操作以及血浆标本等体积组合等过程均慎重、规范，以减少系统误差。2）全自动生化分析仪，酶标仪，721分光光度计和紫外分光光度计每次运行之前先调试校正，操作程序的设置确保准确无误，以减少系统误差。1.1.2.5统计方法各项数据均以X±S表示，用四川大学华西公共卫生学院统计学教研室研制的PEMS3.1医学统计软件进行统计分析。若方差齐，用单因素方差分析；若方差不齐，对原始数据进行秩和检验；检验水准α=0.05。1.2.结果1.2.1肉眼观察C57BL小鼠给药后的皮肤变化2以小鼠用药部位中心2cm为一观察单位，优为受试区色素基本恢复正常；良为受试区出现色素面积>50％；中为受试区色素面积<50％；差为受试区皮肤呈苍白或白斑状；总有效率以（优+良）计算。与阴性对照组比较，模型组小鼠皮肤变白，有的甚至长出白毛，表明氢醌致C57BL小鼠白癜风模型造模成功。此外，与模型组比较，蜜膏（主药、主药+辅助药、主药+调节药、全方）肉眼观察皮肤变化情况差异较显著（见表1），其治疗总有效率仍以全方的作用最高。表1各组小鼠肉眼疗效比较Table1Efficacycomparisonofeachgroupmicewithnakedeye组别n优良中差总有效率（%）正常组1010000—模型组100146—主药10313340主药+辅助药10422260主药+调节药10322350全方108101901.2.2依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠血清中MDA、CHE、MAO、TNF-α、IL-2水平德影响9万方数据 新疆医科大学硕士学位论文由表2中数据可以看出，与阴性对照组比较，模型组小鼠血清MAO升高（p<0.01）、TNF-α降低（p<0.05），对血清MDA、CHE、IL-2水平的影响无统计学差异（p＞0.05）；与模型组比较，蜜膏（主药+辅助药、全方）小鼠血清MAO降低（p<0.01），蜜膏（主药、主药+辅助药、主药+调节药、全方）对血清MDA、CHE、TNF-α、IL-2水平的影响没有统计学差异（p＞0.05）（见表2）。表2各组小鼠血清MDA、CHE、MAO、TNF-α、IL-2水平比较（x±s）Table2ComparisonofCHE,MAO,MDA,TNF-α,IL-2ineachC57BLmicemodelofvitiligo(serum)（x±s）MDACHEMAOTNF-αIL-2组别(nmol/m)(U/L)(U/ml)(ng/ml)（fmol/ml）阴性对照组10.28±2.3511020.10±1130.823.69±0.475.10±0.7618.08±2.41***模型组13.33±4.9911766.00±1008.926.85±0.683.92±0.9419.50±3.15主药12.68±3.8911393.80±1878.245.28±0.984.47±0.4518.85±2.57##主药+辅助药10.63±2.5611592.50±1577.994.76±0.414.67±1.0718.61±3.39主药+调节药10.00±4.3110616.80±1629.925.49±0.334.68±0.3018.43±3.11##全方9.15±2.5511333.40±1582.354.10±0.434.94±1.3418.22±1.41***###与阴性对照组比较p<0.05,p<0.01；与模型组比较p<0.05,p<0.01***###Comparedwithgroupp<0.05,p<0.01；comparedwithmodelgroupp<0.05,p<0.011.2.3依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠皮肤组织匀浆MDA、CHE、MAO水平与阴性对照组比较，模型组小鼠皮肤组织匀浆MDA、CHE、MAO升高（p<0.05）；与模型组比较，蜜膏（主药、主药+辅助药、主药+调节药、全方）小鼠皮肤组织匀浆MDA降低（p<0.05～p<0.01），蜜膏（主药+调节药）CHE降低（p<0.05），蜜膏（主药、主药+辅助药、全方）降低MAO（p<0.05～p<0.01）（见表3）。表3各组小鼠皮肤组织匀浆MDA、CHE、MAO水平比较（x±s）Table3comparisonofCHE,MAO,MDA,ineachC57BLmicemodelofvitiligo(skintissue)（x±s）组别MDA(nmol/mgprot)CHE(U/L)MAO(U/mgprot)阴性对照组2.31±1.09378.00±49.8928.46±14.47***模型组4.79±6.19489.00±83.1939.09±11.69####主药0.36±0.25422.60±57.7613.63±4.04###主药+辅助药0.49±0.86433.60±66.468.11±1.51##主药+调节药0.69±1.02370.80±65.6123.83±10.39##全方0.43±0.26446.40±45.2917.56±11.99***###与正常组比p<0.05,p<0.01；与模型组比p<0.05,p<0.01***###Comparedwithnormalgroupp<0.05,p<0.01；comparedwithmodelgroupp<0.05,p<0.0110万方数据 新疆医科大学硕士学位论文1.2.4依提菲力白热斯蜜膏对小鼠脾脏、胸腺系数的影响将取血处死后的小鼠，分别摘取脾脏及胸腺，称重，计算其脏器系数。胸腺指数=，脾脏指数=，用SPSS13.0软件对实验结果进行t检验统计学处理。表4依提菲力白热斯蜜膏对小鼠脾脏系数和胸腺系数的影响（x±s）组别胸腺指数(♂)脾脏指数(♂)胸腺指数(♀)脾脏指数(♀)1组14.79±2.3923.39±1.3521.98±1.6033.95±2.432组14.17±2.0322.87±2.3920.72±2.4329.93±2.693组15.58±2.3225.79±2.5423.31±2.7529.18±2.01△4组17.57±2.54*24.79±2.4223.12±2.2827.39±2.34△△5组16.76±1.24**24.72±2.7621.61±2.0427.57±2.19△△6组16.30±2.05*24.69±2.3723.64±2.8827.84±2.87△△*△[注]P＜0.05（与模型组比较）；P＜0.05（与正常对照组比较）1.2.5依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠对皮肤含黑色素毛囊计数的影响沿小鼠脊椎中线剪取1cm×1cm大小的皮肤，将所取皮肤用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，HE染色后，进行皮肤组织学观察、毛囊计数，用光镜观察50个毛囊，计算其中有黑色素的毛囊数，结果见表5。表5依提菲力白热斯蜜膏对皮肤含黑色素毛囊计数的影响（x±s）组别动物数（只）黑色素分布有黑色素毛囊数（个）1组10+++434±2.2**2组10±19.6±2.63组10++38.6±3.5*4组10++35.4±3.0*5组10+++41.4±4.2**6组10+++42.1±3.2**[注]*P＜0.05（与模型组比较）11万方数据 新疆医科大学硕士学位论文“+++”示90以上有黑色素；“++”示1/2以上有黑色素；“+”示1/3~1/2有黑色素；“±”示偶见黑色素。1.2.6依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠基底层黑素细胞的影响小鼠皮肤组织取材后，依次经75%、95%I、95%II、无水乙醇I、无水乙醇II、、二甲苯I和二甲苯II等脱水透明后，沾干，取出曲别针，将标本干浸蜡缸内（浸蜡缸在烘箱上层，为液体混合蜡）。之后用两块F型金属相对合（注意用刀片整理平整，以防熔蜡流出），中间流入熔蜡（干净蜡，自购），然后用加热后的镊子将浸蜡后组织放于石蜡中，然后放入标本编号。切片，粘片后，及时置于60℃干燥箱将蜡烤溶（第一次烤片应烤过夜），第二天取出备用或直接染色。将在烤箱内烤溶的标本立即置于二甲苯I内脱蜡，石蜡切片脱蜡、各级乙醇脱水（所有染色前的第一步）。二甲苯I5min→二甲苯II10min→无水乙醇、95%乙醇I、95%乙醇II、80%乙醇各5秒→水洗（直接入自来水洗一遍）。苏木素染色5-10min。自来水洗。洗去多余的染液（可多洗几遍）。盐酸乙醇分化（先备好足够的自来水，将切片在盐酸乙醇缸内快速沾一下，立即入自来水中返蓝，换一遍自来水继续返蓝1分钟）。伊红染液3-5分钟。自来水洗，洗去多余的染液（可多洗几遍）。水（梯度酒精80%、95%I、95%乙醇II、无水乙醇各5秒）。透明（二甲苯I、二甲苯II各5秒），取出封片（中性树胶）。Dopa-氧化酶染色后，黑素细胞阳性显示为棕黑色染色。分别于光镜下观察每个高倍镜视野内各组MC数量。结果显示，MC数量在全方组中多，其次为主药+辅药、主药+调节药，这表明依提菲力白热斯蜜膏的全方配伍具有一定的科学规律。图1不同给药组小鼠皮肤基底层MC的数量变化1.正常组2.模型组3.主药4.主药+辅助药5.主药+调节药6.全方1.3.讨论到目前为止，白癜风的发病机制仍旧未能明确，科研工作者关于白癜风的发病原因及药物的研制的工作仍在进行。许多实验证据表明，特定的环境和化学物质对黑素细胞有选择性毒害作用，可能是白癜风发病的因素之一。苯酚和儿茶酚的芳香族和脂肪族产物，对体内外对黑素细胞有明显的毒性作用。本试验采用氢醌脱色法制造的白癜风动物模型，就是利用了苯酚和儿茶酚的芳香族对黑素细胞的选择性毒性，导致黑素细胞的坏死或者凋亡。本试验采用依提菲力白热斯蜜膏治疗化学脱色所致的黑素细胞脱失的白癜风动物模型，通过治疗可以看出，给药组动物皮肤受试区较未经药物治疗动物的黑素细胞明显增加，因此可以得出结论：依提菲力白热斯蜜膏可促进黑素细胞的生物修复或者生成。由于皮肤发生局部病变后，可生成过量的自由基，使生物膜脂质双层中的不饱和脂肪酸过氧化，形成脂质过氧化产物，从而使膜结构及其功能发生障碍。MDA和SOD是反映自由基损伤的指标，自由基对神经细胞的损害作用是引起生物膜上PU-FA发生脂质过氧化反应，生成大量的髓过氧化物酶（MPO），MPO12万方数据 新疆医科大学硕士学位论文的代谢产物MDA可使磷脂、蛋白质发生交链、变性，同时其含量变化间接反映了组织中氧自由基含量的变化。SOD是主要存在于细胞浆和线粒体中的一种金属蛋白酶，可催化歧化反应，清除引发自由基连锁反应的起始基-超氧阴离子，通过一系列化学反应缓冲剂清除自由基而具有抗自由基损伤作用，是机体内抗氧化系统的重要组成部分，其活性高低可间接反映组织自由基的含量和脂质过氧化程度。朱光斗等对58例白癜风进行染色体畸变和自由基清除系统水平的测定。结果表明，白癜风患者染色体断裂和结构重排现象显著，同时伴有血浆中脂质过氧化物丙二醛升高和红细胞中超氧化物歧化酶和铜蓝蛋白水平降低。Yu等研究发现，在白癜风病人中，IL-6和IL-8升高，IL-6能提高黑素细胞上ICAM-1的表达，ICAM-1能增加白细胞与黑素细胞之间的相互接触及黑素细胞的破坏。此外，临床结果显示TNF-与IFN-在白癜风患者外周血单核细胞上释放均减少，这可能与白癜风患者皮损处炎症反应的减少有关。TNF-与IFN-等可诱导黑素细胞表面ICAM-1的表达。因此，测定MDA含量、SOD活性、TNF-、IL6等指标变化，可以直观反映机体的病理变化。本实验中的数据显示，模型组MDA含量升高，SOD活性降低，TNF-水平降低，IL6升高。通过给药依提菲力白热斯蜜膏后，小鼠血清中的MDA含量和IL6显著降低，而SOD活性及TNF-水平明显上升，这表明依提菲力白热斯蜜膏可能通过清除机体内多余的氧自由基及调节免疫水平，从而达到治疗白癜风的作用。2.依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375细胞增殖及酪氨酸酶、黑素合成的研究zhikuquan2015080720世纪80年代中期，日本学者IwamaH等在对汉方的研究体系进行探讨的过程中，用动物血清进行汉方制剂的药理实验，提出了”血清药理学方法”。该实验方法为药物载体避免了多种血清的干扰，可以较清楚地认识W维吾尔药复方中主要药物的有效部分及活性部位，是目前W维吾尔药及复方进行体外药理学实验的最佳方法之一。随着细胞生物学与生化学技术的不断发展，使得人们能够更加快速、准确、深刻地认识W维吾尔药药理与毒理。体外实验方法对于药理学研究非常重要，具有需要样品少，实验效率高等特点，特别是在细胞、亚细胞、分子等水平进行深入的机制研究，没有体外实验的精细分析是很难实现的。本实验利用SD大鼠制备依提菲力白热斯蜜膏的含药血清，进而将其作用于A375黑色素瘤细胞，观察其对细胞增殖、酪氨酸酶及黑素合成的影响，为依提菲力白热斯蜜膏治疗白癜风的药用效果提供进一步的佐证。2.1.材料与方法2.1.1材料2.1.1.1实验药材驱虫斑鸠菊、补骨脂、黑种草籽、除虫菊、丁香、干姜、洋茴香、芥子、西青果、白桦酸藤果子、诃子、毛诃子、余甘子、西红花等均购自新疆维吾尔自治区维吾尔医医院，经斯拉甫·艾白主任药师鉴定药材均为正品。2.1.1.2实验动物雄性SD大鼠（200±20g）70只，由新疆医科大学实验动物中心提供，可证号：SCXK（新）2003-0001。13万方数据 新疆医科大学硕士学位论文2.1.1.3实验试剂试剂、耗材名称品牌产地DMEM(高糖)Gibco公司美国氨苄青霉素钠和硫酸青霉素Anersco公司美国胎牛血清（FBS）Hyclone公司美国MTTSigma公司美国L-DopaSigma公司美国TritionXSigma公司美国PBS北京中杉金桥中国HEPESSigma公司美国胰蛋白酶Sigma公司美国2.1.1.4实验仪器仪器名称型号，品牌产地二氧化碳培养箱zhiMCOku-18AICquan，三洋20150807美国酶标仪Biorad550，伯乐美国超低温冰箱三洋美国倒置显微镜37XB中国离心机Allegra64R中国超声波清洗机SK8210HP，科导中国高压蒸汽灭菌锅LDZX-75KBS，申安中国4℃/-20℃冰箱Haier中国精密电子天平FA2104S中国冷冻离心机TGL-16G中国AMS全自动生化分析仪PM4000/3意大利，罗马紫外分光光度计CINTRA澳大利亚(721)分光光度计WFJ-1中国粉碎机DFY-600中国酶标仪Anthos2010中国2.1.2方法2.1.2.1相关试剂的配制1）DMEM培养基的配制DMEM（高糖）培养基1包，以1000ml双蒸水充分溶解，加入NaHCO33.7g，HEPES4.766g，加入青霉素、链霉素，使其浓度各为100U/ml，盐酸调节培养基pH值至7.2左右，超净工作台中过滤除菌。14万方数据 新疆医科大学硕士学位论文2）磷酸缓冲液（PBS）配制PBS粉末1包，以2000ml双蒸水充分溶解，加入青霉素、链霉素，使其浓度各为100U/ml，超净工作台中过滤除菌，分装后置于4℃冰箱备用。3）0.25胰酶配制称取0.25g胰酶，加入100ml冰冷的PBS溶液中，充分搅拌至完全溶解，超净台下0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装于无菌安剖瓶中，长期-20℃保存备用,4℃两周内用完，终浓度为0.25%。4）MTT溶液配制称取250mgMTT粉末，加入50mlPBS溶液中充分搅拌至完全溶解，超净台下0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装于无菌安剖瓶中，长期-20℃保存备用，4℃两周内用完，终浓度为5mg/ml。2.1.2.2依提菲力白热斯蜜膏含药血清的制备雄性SD大鼠（200±20g）50只，饲养于新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所普通动物房IVC盒中，提供灭菌饲料及蒸馏水，适应性喂养1周后。根据动物体重，将SD大鼠50只，利用PEMS3.1医用软件随机分成5组，每组10只。除正常组给予CMCNa外，其余均给予不同配伍组合的依提菲力白热斯蜜膏，每天给药2次，连续给药7天。末次给药2h后，腹主动脉采血，静置并分离血清。将装含药血清置于56℃水浴灭活30min后，在超净工作台中，用无菌的0.22m的滤头过滤除菌。分装，-70℃冻存备用。2.1.2.3依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375细胞形态和细胞增殖的影响从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，弃去细胞培养基，PBS冲洗2-3次。加入2ml的0.25%的胰蛋白酶，轻轻晃动培养瓶，弃去胰酶，消化zhikuquan2015080730s后，于倒置显微镜下观察细胞是否变圆。待消化完成后，立即加入DMEM（含10%FBS）终4止消化。细胞培养板计数，并以DMEM培养基调整细胞浓度至2～5×10个/ml，移至96孔培养板中，每孔100l，于37℃培养箱培养24h。将含药血清从-70℃取出，放入-20℃2-3h，转入4℃冰箱3h，于室温融化。以DMEM培养基（不含血清）配制含药血清。配制方法：20%血清（1ml）：200l血清+800lDMEM；10%血清（1ml）:100l血清+900lDMEM；5%血清（1ml）：50l血清+950lDMEM。用注射器吸去96孔培养板中的培养基，加入含药血清，每孔200l。给药48h后，于倒置显微镜下观察细胞形态变化，之后加入5mg/ml的MTT20l/孔，作用4h，弃去液体，每孔加入200lDMSO，震荡，酶标仪上490nm测定吸光度值。计算细胞促增殖率=（给药组-正常组）/正常组×100%。2.1.2.4依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375酪氨酸酶的影响含药血清给药A375细胞同上。作用48h后，弃去培养液，用PBS洗涤2次，每孔加入1%的TritonX-100溶液50l，迅速置于-80℃冰箱30min，随后室温融化使细胞完全裂解。然后加入0.25%L-Dopa溶液10l/孔，37℃培养箱放置2h，于酶标仪490nm测定吸光度值。酪氨酸酶活性用给药组A490/正常对照组A490的百分率表示。[27-28]2.1.2.5依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375细胞黑素合成的影响含药血清给药A375细胞同上。作用48h后，弃去培养液，用PBS洗涤2次，每孔加入100l的1mol/LNaOH。37℃培养箱放置48h，于酶标仪405nm测定吸光度值。黑素含量用每个给药组A490/正常对照组A490的百分率表示。2.1.2.6统计方法15万方数据 新疆医科大学硕士学位论文各项数据均以X±S表示，用四川大学华西公共卫生学院统计学教研室研制的PEMS3.1医学统计软件进行统计分析。若方差齐，用单因素方差分析；若方差不齐，对原始数据进行秩和检验；检验水准α=0.05。2.2.结果2.2.1依提菲力白热斯蜜膏含药血清给药后A375细胞增殖及形态变化表6依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375细胞增殖的影响Table6InfluenceofserumcontainingIttirfilBarasonproliferationofA375cells组别5%含药血清10%含药血清20%含药血清A490促增殖率A490促增殖率A490促增殖率对照组0.5348——0.1103——0.1533——主药0.457200.51883.70210.10360主药+辅助药0.58680.09720.15940.44470.09450主药+调解药0.399400.24861.25320.16500.0767主药+辅助药0.62920.17640.60524.48520.35201.2969+调解药由表6中数据可以看出，依提菲力白热斯蜜膏10%的含药血清各组对A375细胞均具有增殖促进作用，其促进强度为：主药+辅助药+调解药（全方）＞主药＞主药+调解药＞主药+辅助药。这与其细胞形态及数量的表现是一致的（图2）。2.2.2A375细胞的形态学变化与空白血清组相比较，给药48h后，A375细胞生长状态良好，药物作用后可见部分给药组细胞胞体变大，树突变多，延长；胞内黑素颗粒变多，并集中在树突顶端。图2含药血清对A375细胞形态的影响（400×）1.正常组2.主药3.主药+辅助药4.主药+调解药5.全方2.2.3依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375酪氨酸酶及黑素合成的影响与正常对照组比较，依提菲力白热斯蜜膏含药血清的不同配伍组对A375细胞的酪氨酸酶活性均具有激活作用，且尤以主药+辅助药+调解药（全方）的作用最强。表7依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375细胞酪氨酸酶活性的影响Table7InfluenceofserumcontainingIttirfilBarasontyrosinaseactivityofA375cells5%含药血清10%含药血清20%含药血清A490活性A490活性A490活性16万方数据 新疆医科大学硕士学位论文对照组0.0148——0.0323——0.0192——主药0.02321.56760.04241.31270.03061.5938主药+辅助药0.02281.54050.02680.82970.02021.0521主药+调解药0.02341.58110.03641.12690.02521.3125主药+辅助药+调解0.01601.08110.02720.84210.04382.2813药2.2.4依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375黑素合成的影响由表8中数据可以看出，依提菲力白热斯蜜膏含药血清的不同配伍组对A375细胞的黑素合成亦具有促进作用，其强度仍有以主药+辅助药+调解药（全方）的作用最强。进一步佐证了该复方配伍的科学性。表8依提菲力白热斯蜜膏含药血清对A375细胞黑素合成的影响Table8InfluenceofserumcontainingIttirfilBarasonmelaninsynthesisofA375cells5%含药血清10%含药血清20%含药血清A490黑素含量A490黑素含量A490黑素含量对照组0.0035——0.0167——0.0114——主药0.051214.6280.02101.25740.01050.9211主药+辅助药0.01765.02850.01681.00590.01571.3772主药+调解药0.02306.57140.02761.65270.01421.2456主药+辅助药+调解0.00681.94280.01430.85620.02061.8070药3.依提菲力白热斯蜜膏对C57BL小鼠白癜风相关基因转录水平的研究白癜风是由于表皮黑素细胞缺失引起的色素缺失性皮肤病。目前研究发现白癜风与一些基因突变或表达异常有关，与白癜风易患性有关的基因包括黑素生物合成的重要基因、与氧化压力有关的基因和调节自身免疫的基因。白癜风的发病与黑素生物合成有着密切关系。黑素生物合成两种基因家族的调控：1）酪氨酸酶基因家族2）Pmel17基因家族。有研究表明酪氨酸酶基因家族调节黑素合成是在黑素生物合成途径的近端步骤，而Pmel17基因家族是在黑素生物合成途径的远端步骤。在白癜风发病机制的学说中，自毁学说和生化模型提示黑素生物合成过程中毒性介质导致细胞溶解。在白癜风患者中存在着一些与生俱来的相关生化物质缺陷，改变了黑素生物合成的过程，削弱了表皮对氧化压力的反映。过氧化氢酶（CAT）能催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气，阻止高活性氧来源的自由基对细胞的破坏。由于CAT活性的下降会导致白癜风患者全层表皮H2O2的相应过度聚集，因此CAT基因是白癜风发病相关的一个重要基因。17万方数据 新疆医科大学硕士学位论文本研究通过半定量RT-PCR检测依提菲力白热斯蜜膏对氢醌诱导C57BL小鼠的酪氨酸酶和过氧化氢酶基因的转录水平，为阐明该药治疗白癜风的作用机制奠定基础。3.1.材料与方法3.1.1材料1.1.1实验样本实验用样本取自C57BL小鼠的给药皮肤。1.1.2实验试剂试剂、耗材名称品牌产地TRIpureLSReagent总RNA抽提试剂北京百泰克中国TIANScriptRTKitTIANScriptcDNA第一链Tiangen公司中国合成试剂盒PCRMsterMixtureTiangen公司中国琼脂糖Sangon公司中国TrisSangon公司中国EDTA·2NaSangon公司中国DNAmarkerTiangen公司中国焦碳酸二乙酯(DEPC)Sangon公司中国Taq酶Sangon公司中国溴化乙锭（EB）Sigma公司美国3.1.1.3引物序列Primer名称序列(5"to3")预期扩增长度CAT上游TCATCTATTCCTGAATGGAACACG240bpCAT下游AATGAGTGCAACCAGTAACAAAGCTyr上游TTCAAAGGGGTGGATGACCG435bpTyr下游GACACATAGTAATGCATCC内参基因引物序列GAPDH上游ACCACAGTCCATGCCATCAC458bpGAPDH下游TCCACCACCCTGTTGCTGTA以上引物均由上海生工生物工程有限公司负责合成。3.1.1.4仪器YJ-875净化工作台，中国上海；XD-101倒置显微镜，中国江南光电；MCO-18AIC型CO2培养箱，日本SANYAO公司；GeneAMPPCRSystem9700DNA扩增仪，美国PE公司；GeneQuantⅡDNA/RNA紫外分光光度仪，PharmaciaBiotech公司；GelImageSystem凝胶成像系统，上海天能公司Tanon；ALLEGRA64R型超速低温离心机美国BECKMAN公司；H4水平电泳槽大号,上海市精益有机玻璃制品仪器厂；18万方数据 新疆医科大学硕士学位论文DY-A电泳仪,上海生化所西巴斯生物技术开发公司。3.1.2方法1.2.1小鼠皮肤组织总RNA的提取（参照北京百泰克公司的TRIpureLSReagent说明）1）称取小鼠皮肤组织0.1g，置于研钵中，加入液氮，迅速研磨至细粉。将其转入1.5ml的EP管，并加入900ulTRIpureLSReagent试剂。用移液枪反复吹打，帮助细胞裂解。2）室温放置5min后，加入250ul氯仿，盖紧管盖，快速振荡15s。3）室温放置2—15min后，4℃，12000rpm离心15min。4）吸上清至一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温放置10min。5）4℃，12000rpm离心10min。6）倒出液体，加入1ml75%乙醇，洗涤沉淀一次。7）倒出液体，瞬时离心，吸干液体后，于室温下自然干燥。8）加入20ul的Rnase-Free水，于1%琼脂糖凝胶电泳。9）利用分光光度计测定RNA在OD260nm的吸光度，将RNA浓度调节一致。1.2.2cDNA第一链的合成（参照北京Tiangen公司的TIANScriptRTKit）1）各管取等量的RNA准备做RT（反转录）。2）在冰浴的无核酸酶的离心管中加入Rnase-freeddH2O7.5ul、总RNA2ul、Oligo(dT)2ul、dNTP2ul后，70℃加热5min后，迅速在冰上冷却2min。3）瞬时离心后，继续在离心管中加入5×First-strandbuffer4ul、0.1MDTT1ul、Rnasin0.5ul、TIANScriptM-MLV1ul。4）42℃，恒温50min（在PCR仪上可以进行）。5）95℃加热5min终止反应后，待冷却后冷冻保存。1.2.3内参基因的扩增1）在一灭菌的薄壁管中，加入ddH2O13.8ul、10×Taqbuffer2ul、dNTP1ul、MgCl21.2ul、内参GAPDH（上下游）引物1ul、cDNA产物0.5ul、Taq酶0.5ul。总体系为20ul。2）反应条件为：94℃5min，94℃30s、55℃30s、72℃45s（25cycles），72℃7min，4℃∞。3）电泳后，根据其亮度差异，调整cDNA产物的浓度，直到调整至各泳道所扩增内参基因GAPDH的亮度一致。1.2.4白癜风相关目的基因的扩增1）在一灭菌的薄壁管中，加入ddH2O8.5ul、CAT/TYR（上下游）引物1ul、cDNA产物0.5ul、2×PCRMasterMixture10ul。总体系为20ul。2）反应条件为：94℃5min，94℃30s、56℃30s、72℃45s（25cycles），72℃7min，4℃∞。3）经1%的琼脂糖凝胶电泳后，吸取10lPCR产物于1%的琼脂糖凝胶进行电泳。紫外透射仪下观察结果并拍照，通过Tannon凝胶成像系统测定条带光密度值。计算CAT/GAPDH和TYR/GAPDH比值，并利用Excel2003处理数据。3.2.结果3.2.1小鼠皮肤组织总RNA的完整性检测19万方数据 新疆医科大学硕士学位论文提取的总RNA经1%的琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统中观察后，发现均可见清晰的3条带，分别为28S、18S和5SRNA(图3)，表明从小鼠皮肤组织中提取的总RNA无明显降解，可以进行下一步的RT。图3小鼠皮肤组织总RNA电泳图1.主药2.主药+辅助药3.主药+调节药4.全方3.2.2给药后CAT和TYR基因转录水平的变化综合CAT和TYR基因RT-PCR的电泳结果(图4)和其光密度结果(表3)发现：与模型组比较，“依提菲力白热斯蜜膏”各拆方组的TYR基因转录水平均表现为上调。且全方给药组对该基因的转录影响最为明显，这与我们本研究前期实验当中的A375细胞酪氨酸酶活性上升的结果是一致的。同时，各给药组对小鼠CAT基因的转录水平亦具有上调作用，这表明该药对白癜风治疗作用可能与调控CAT基因的转录具有相关性。图4给药后小鼠皮肤组织中CATRT-PCR电泳图1,2阴性对照3,4模型组5,6全方7,8主药+调节药9,10主药+辅助药11,12全方表9给药后小鼠皮肤组织CAT基因转录水平变化组别nBcl-2mRNA阴性对照100.6192±0.047073模型组100.5766±0.038804全方100.8231±0.03691**主药+调节药100.6128±0.047766*主药+辅助药100.6059±0.105688*主药100.5942±0.035648*图5小鼠GAPDH基因RT-PCR扩增电泳图1-4．阴性对照5-8．模型9-12．主药13-16．主药+辅助药17-20．主药+调节药21-24．全方图6小鼠TYR基因RT-PCR电泳图1-4．阴性对照5-8．模型9-12．主药13-16．主药+辅助药17-20．主药+调节药21-24．全方表10给药后小鼠皮肤组织TYR基因转录水平变化组别nBcl-2mRNA阴性对照100.5184±0.02706320万方数据 新疆医科大学硕士学位论文模型组100.4769±0.038605全方100.7635±0.07693**主药+调节药100.6194±0.04726*主药+辅助药100.6079±0.05589*主药100.5847±0.03868*3.3.讨论白癜风是一种常见的色素性皮肤病，临床表现为色素减退或消失。早期研究结果表明白斑处黑素细胞完全消失。但LePoole以16种单克隆抗体研究表明白斑处黑素细胞未完全消失。Husain等报道白斑处仍可检测到残留的酪氨酸酶活性，这表明白斑处黑素细胞并未完全消失。有实验从白癜风患者的病变边缘取材，建立了人黑素细胞系。这些均表明刺激白斑处色素的恢复，对于白癜风的临床治疗具有重要意义，对于开发促进色素恢复的维吾尔药具有一定的前景。黑素是皮肤颜色的主药决定性物质，它由人体皮肤的黑素细胞产生，可维持正常的肤色。黑素细胞生物合成黑素主药发生于黑素小体，以酪氨酸为底物，在酪氨酸酶的作用下合成黑素。影响黑素合成的途径有多种，可能通过促进细胞增殖或酪氨酸酶活性或二者兼有来增加黑素含量。治疗白癜风可通过刺激黑色素细胞的增殖和迁移、促进细胞内黑色素的生成（包括激活酪氨酸酶及其他途径）或增加和色素向角质形成细胞迁移等途径。黑素的产生过程是一个复杂的生物化学过程，而黑素的前体多巴来源于酪氨酸，经酪氨酸酶（tyrosinase，Tyr）基因、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)基因，他们调节者真黑素的合成和转变。酪氨酸酶是一个含铜的氧化还原酶，是酪氨酸转变为黑素的催化剂，Tyr在黑素合成过程中起到非常关键的限速酶作用。根据以上结果推测一些CAT活性下降与白癜风的发病可能相关机制。1）各种原因提高H2O2水平而导致CAT活性的抑制；2）患者黑素细胞或角质形成细胞基因表达或酶结构/功能的组织特异性差异。病例对照和家族遗传相关性研究提示，CAT活性下降可能是由于CAT基因突变，影响了皮肤CAT活性。CAT基因是一些白癜风患者的易患基因，进一步支持了表皮氧化压力是白癜风的病因。经过统计分析，本研究中小鼠皮肤组织CAT基因转录水平上调显著，间接表明依提菲力白热斯蜜膏在恢复患者皮损部位黑素细胞及黑素颗粒水平过程中，其可能与大量清除体内氧自由基有关。综上所述，CAT（过氧化氢酶）和TYR（酪氨酸酶）在黑素细胞增殖及黑素合成过程中具有重要作用。无论是复方“依提菲力白热斯蜜膏”的全处方，还是其中的主药、主药+辅助药、主药+调节药均对上述二基因转录水平具有上调作用。我们可以推测，依提菲力白热斯蜜膏通过激活酪氨酸酶基因，进而大量合成黑色素颗粒，通过激活过氧化氢酶基因，进而维持黑色素细胞的增殖稳定。兼之二者，从而达到治疗白癜风的目的。目前，促进黑素合成信号途径有多种，有4条与黑素细胞（MC）增殖和黑素生成有关的信号转导途径研究较为清楚，即二脂酰甘油/蛋白激酶C（DAG/PKC）途径；一氧化氮/环磷酸鸟苷/蛋白激酶G21万方数据 新疆医科大学硕士学位论文（NO/cGMP/PKC）途径；丝裂原激活的（MAPK）级联途径和环磷酸腺苷/蛋白激酶A（Camp/PKA）途径。而维药依提菲力白热斯蜜膏是通过何种途径治疗白癜风的研究是我们今后工作需要解决的问题。4.依提菲力白热斯蜜膏毒性研究4.1依提菲力白热斯蜜膏小鼠灌胃急性毒性试验白癜风是色素障碍为特征的系统性疾病。现代医学认为白癜风的病因包括免疫功能异常、内分泌失调、体内自由基等有毒物质对黑色素细胞杀伤、酪氨酸酶活力减弱等。白癜风维吾尔医发病机理是机体长处于湿寒环境，因自然力下降所致肝脏生成正常体液的生理功能紊乱，使粘液质发生异常变化生成异常粘液质；同时，体内过盛的异常黏液质沉着在皮肤底部，阻碍皮肤的正常血液循环，使营养成分不能输送到皮肤，黑色素细胞不能正常生长发育，从而皮肤脱色，出现白癜风灶。新疆维吾尔族是白癜风易发、多发人群，依提菲力白热斯蜜膏是最有效的、传统的维吾尔医治疗白癜风病症的处分，目前作为院内制剂在新疆维吾尔自治区维吾尔医医院被临床广泛用于治疗白癜风疾病，其效果明显，治愈率高且不易复发，目前为更好的开发研制依提菲力白热斯蜜膏，使其由院内制剂提升为国药准字，我们课题组对此作了一定的研究工作。其中依提菲力白热斯蜜膏小鼠灌胃急性毒性研究更是开展其深入研究的基础。通过依提菲力白热斯蜜膏小鼠灌胃给药急性毒性试验，观察其出现的中毒症状、中毒程度、性质、恢复情况及死亡等，了解该药的急性毒性作用，了解其急性毒性靶器官，为长期毒性试验选择剂量提供依据，为临床毒副反应监测提供依据。4.1.1实验材料与仪器4.1.1.1实验动物昆明种小鼠，40只，雌雄各半，SPF级，体重18±2g，新疆实验动物研究中心提供，scxk(新)2011-0001。4.1.1.2试剂依提菲力白热斯蜜膏（SR），新疆维吾尔自治区维吾尔医医院;羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，天津市光复精细化工研究所，批号：100409。22万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4.1.2试验方法4.1.2.1实验动物分组将40只雄性小鼠根据体重随机分为2组,每组20只,♀♂各半。设溶媒对照组（0.5%羧甲基纤维素钠溶液、依提菲力白热斯蜜膏组。4.1.2.2剂量设计（1）新疆维吾尔自治区维吾尔医医院提供的临床用量资料：口服，一日3次，每次10克g。成人每日用量为30g生药。成人体重按60kg计算，即成人每日每公斤体重用药量30g/60kg=0.5g/kg.bw。（2）小鼠急性毒性预试验结果：SR最高配制浓度55.6%（w/v），最大给药体积（0.2ml/10g.bw）一日内2次(隔4小时)灌胃给予小鼠，动物未出现死亡，其最大给药量为22.24g/kg。相当于成人每日每公斤体重用药量的171倍。（3）急毒正式试验根据小鼠急性毒性预试验结果，测定最大给药量，以SR最高配制浓度55.6%（w/v），最大给药体积（0.2ml/10g.bw）灌胃给予小鼠，2次/天(共2次，隔4小时)。小鼠灌胃急性毒性试验剂量分组，如表9。表9、SR小鼠灌胃急性毒性试验剂量分组人拟用剂量（或动物数（只）组别剂量（g/kg）等效剂量）的倍♀♂数溶媒对照组--1010SR22.241711010实验开始前小鼠适应性饲养3天，经一般行为观察，选用符合要求的动物作为实验动物。分组后单次灌胃给药，动物给药前禁食不超过12h，不禁水。4.1.2.3试验过程4.1..2.3.1实验给药昆明种小鼠40只，分为依提菲力白热斯蜜膏22.24g/kg组和CMC-Na溶媒对照组，雌雄各半，给药组为人临床用药量的171倍，灌胃给药，共计2次，间隔4小时，给药体积为0.2ml/10g.bw。23万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4.1.3.2试验指标检测给药当天，给药后6小时内严密观察动物，记录2h、4h、6h时动物对供试品的反应，从给药第2天开始，每天上、下午各观察一次，连续观察14天。症状反应参照《急性毒性试验一般观察指标》（SOP/S-001-013-01），主要观察动物外观、行为、分泌物、排泄物等；记录动物毒性反应情况，包括中毒症状、中毒发生时间、持续时间、恢复时间及动物死亡时间；分别于接收时、D0天禁食前（分组时）、D0天禁食后、给药后D1、D4、D7、D11、D14（剖解前）天称取动物体重；实验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及实验结束时仍存活的动物，均进行大体解剖。任何组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，均记录并进行组织病理学检查。4.1.3.3统计学方法采用EXCEL和（或）PEMS统计软件对实验数据进行统计分析，体重计摄食量等计量资料结果以表示，组间比较时采用单因素方差分析，方差齐时用t检验，方差不齐时用秩和检验，检验水准0.05；计数资料描述其变化趋势，2必要时用χ检验进行组间比较。4.1.3实验结果4.1.3.1一般症状一般性观察溶媒对照组未见异常，SR组小鼠给药当天表现皮毛无光泽、疏松。给药第2天恢复正常。与溶媒对照组比较，动物体重增长正常。观察期间未出现死亡或濒死动物。4.1.3.2体重SR组动物体重与溶媒对照组比较，未见统计学差异。见表10，图3、图4。表2.依提菲力白热斯蜜膏小鼠急毒体重均数数据分析（X±SD，n=10）性接收禁食禁食D1D4D7D11D14组别别时前后溶媒18.81±20.30±18.93±21.03±27.51±31.72±34.81±37.26±2.9♂对照0.970.961.131.132.182.702.86424万方数据 新疆医科大学硕士学位论文18.75±20.34±18.75±20.85±28.07±32.32±35.74±38.73±2.7SR组0.991.020.990.991.982.322.510溶媒18.41±20.36±18.41±20.51±24.92±27.99±30.41±31.20±2.0对照0.500.530.500.500.730.962.032♀18.47±20.20±18.47±20.57±25.76±28.25±30.28±33.00±1.8SR组0.460.780.460.461.692.351.933图1、斯日坎吉本布祖日地提力颗粒（浸膏）小鼠急毒体重均数变化图（雄性）25万方数据 新疆医科大学硕士学位论文图2、斯日坎吉本布祖日地提力颗粒（浸膏）小鼠急毒体重均数变化图（雌性）4.1.3.3大体解剖观察各组动物组织器官未见体积、颜色、质地的异常表现。4.1.4结论在本实验条件下，依提菲力白热斯蜜膏最大给药量为22.24g/kg，相当于临床人用剂量的171倍。主要毒性反应为皮毛无光泽、疏松。4.1.5讨论依提菲力白热斯蜜膏急性毒性实验中溶媒对照组一般观察未见异常，依提菲力白热斯蜜膏组小鼠给药当天表现皮毛无光泽、疏松、给药第2天恢复正常；与溶媒对照组比较，给药组动物体重未见明显改变，观察期间未见死亡或濒死动物，大体解剖观察给药组动物组织器官未见体积、颜色、质地的异常表现。通过依提菲力白热斯蜜膏急性毒性实验结果，为使维吾尔族治疗白癜风传统“圣药”依提菲力白热斯蜜膏由院内制剂进一步提升为国药准字，本课题组拟对依提菲力白热斯蜜膏进行长期毒性药效学评价研究。4.2依提菲力白热斯蜜膏小鼠灌胃长期毒性试验4.2.1材料4.2.1.1供试品26万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4.2.1.1.1供试品：依提菲力白热斯蜜膏（1g提取物相当于10g生药材）；4.2.1.1.2状态：棕色粉末；4.2.1.1.3贮存方式：常温、干燥处贮存；4.2.1.1.4提供单位：新疆维吾尔自治区维吾尔医院；4.2.1.1.5配制方法：用0.5%CMC-Na溶液配制成所需浓度。4.2.1.1.6临床拟用剂量：一次10g，一日三次，1片所含生药量相当于原药材1.16g，即成人每日用量按原药材计为10.44g。依提菲力白热斯蜜膏1g干浸膏相当于10g生药材，成人每日用量按依提菲力白热斯蜜膏计为1.044g；4.2.1.1.7临床拟用给药途径：口服。4.2.1.2溶媒4.2.1.2.1名称：羧甲基纤维素钠（CMC-Na），天津市光复精细化工研究所，批号：100308；4.2.1.2.2配制方法：用纯化水配制成0.5%CMC-Na水溶液使用；4.2.1.2.3贮存方式：2～8℃贮存。4.2.1.3实验动物4.2.1.3.1品系：SD大鼠；等级：SPF级；性别：雌雄各半；数量：120只；周龄：6～8周龄；4.2.1.3.2供应单位：新疆实验动物研究中心；许可证号：SCXK（新）2003-0002。4.2.1.3.3动物饲养与管理4.2.1.3.3.1实验动物饲养设施：动物房为新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药物安全性评价中心SPF级动物房，实验动物使用许可证号：SCXK（新）2011-0006，新疆维吾尔自治区科学技术厅颁发；动物饲养于大鼠塑料笼盒内（475×350×200mm3），每笼饲养同性别动物不多于5只，自由饮水、摄食，室温20-26℃，相对湿度40-70%，光照12h，黑暗12h。4.2.1.3.3.2饲料、垫料及饮用水：饲料为北京科澳协力饲料有限公司生产的SPF鼠繁殖饲料，将饲料放入金属笼盖上给料专用位置，自由摄食；垫料为新疆实验动物研究中心提供的杉木木屑垫料，每周换2次；饮用水为新疆维吾尔自治区维吾尔医医院提供纯化水。饲料经传递窗消毒后使用；垫料、纯化水经121℃、30分钟蒸汽高压消毒后使用。4.2.1.4实验仪器及试剂4.2.1.4.1主要检测仪器4.2.1.4.1.1全自动生化仪：PM-4000/3，意大利产；4.2.1.4.1.2血液细胞自动分析仪：BC-3000，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；4.2.1.4.1.3血凝仪：S22，深圳市鹏瑞佳电子有限公司；4.2.1.4.1.4电解质仪：HK-2003，郑州市汇科电子有限公司；4.2.1.4.1.5高速冷冻离心机，TGL-16G，金坛市华峰仪器有限公司；4.2.1.4.1.6生物显微镜：DM2500，德国莱卡公司；4.2.1.4.1.7切片机：RM2235，德国莱卡公司；4.2.1.4.1.8生物组织自动包埋机：BMG-1，天津天利航空机电有限公司；4.2.1.4.1.9自动组织自动脱水机：TSG-1A，天津天利航空机电有限公司；27万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4.2.1.4.1.10摊片烤片KZPG-1，天津天利航空机电有限公司；4.2.1.4.1.11电子精密天平：BS110S，北京赛多利斯天平有限公司。1.4.2主要试剂4.2.1.4.2.1血液生化试剂：四川省迈克科技有限责任公司提供。批号分别为：ALT，AST，ALP，BUN，Crea，TP，ALB，TCHO，GLU，TBIL，CK，TG，GGT；4.2.1.4.2.2血象试剂：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供，溶血剂，稀释剂，冲洗液；4.2.1.4.2.3血凝试剂：PT，太平洋凝血制品公司提供；4.2.1.4.2.4电解质检査：A液，B液，郑州市汇科电子有限公司提供。4.2.2实验方法4.2.2.1动物分组SD大鼠观察检疫1周后，随即分为4组，分别为溶媒对照组（0.5%CMC-Na溶液）、依提菲力白热斯蜜膏低（435mg/kg）、中（870mg/kg）、高（1740mg/kg）三个剂量组；每组30只，雌雄各半。4.2.2.2剂量设计及依据4.2.2.2.1剂量设计依据4.2.2.2.1.1前期毒性研究资料：急性毒性试验结果表明，依提菲力白热斯蜜膏最大给药浓度45%（w/v），最大给药体积（0.4ml/10g.bw）灌胃给予小鼠，一日2次，2次给药间隔6h，动物未出现死亡，其最大耐受量（MTD）为36g/kg。提示依提菲力白热斯蜜膏毒性可能很小。长毒预试验结果表明，依提菲力白热斯蜜膏300、600、1200mg/kg.bw，分别约相当于临床剂量的17倍、34倍、68倍，灌胃给予大鼠，每日1次，连续给药4w，未见动物出现明显毒性反应；4.2.2.2.1.2临床成人每天每公斤体重用药量：一枝蒿泡腾片临床拟用剂量：一次3片，一日三次，1片所含生药量相当于原药材1.16g，即成人每日用量按原药材计为10.44g。依提菲力白热斯蜜膏1g干浸膏相当于10g生药材，成人每日用量按依提菲力白热斯蜜膏计为1.044g（1044mg）。成人体重按60kg计算，即成人每日每公斤用药量为1044mg/60kg=17.4mg/kg.bw。4.2.2.2.2剂量设计一般3个月大鼠长期毒性实验，低剂量选用临床剂量的10～20倍，中剂量用30～50倍，高剂量用50～100倍。结合急性毒性实验和长毒预实验结果，未发现受试药物的明显毒性反应。因此，本实验分别选用435、870、1740mg/kg.bw作为低、中、高剂量，分别相当于临床剂量的25倍、50倍、100倍。剂距：2倍。见表1。表1大鼠反复给药毒性试验分组剂量设计剂量人临床♂♀组别（mg/kg.bw）拟用剂量倍数动物数动物数溶媒对照组--1515低剂量组435251515中剂量组870501515高剂量组1740100151528万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4.2.2.3给药方法4.2.2.3.1给药途径及选择理由：临床上拟用口服给药，本实验采用与临床一致的给药途径，灌胃给药；4.2.2.3.2给药时间：大鼠进行观察检疫1周后，连续给药3个月；4.2.2.3.3给药频率：每天给药1次，每周给药7天；4.2.2.3.4给药体积：1ml/100g.bw。4.2.2.4观察指标与时间4.2.2.4.1一般症状观察：每日观察大鼠一般形态外观、行为活动、饮食情况、分泌物、排泄物等。同时观察动物毒性反应的症状，起始时间，严重程度，持续时间，是否可逆，填写笼旁观察表；4.2.2.4.2体重：每周测定体重一次，并根据体重调整给药剂量；4.2.2.4.3饲料消耗量：每周称量动物的给料量和剩余量，计算动物以周的饲料消耗量。摄食量（g）=给料量-剩余量；饲料消耗量（g/100g.bw）=摄食量/体重×100；4.2.2.4.4血液学指标：给药结束（即给药第90天）和恢复期（即停药15天）各测一次，检测下列项目：红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数（PLT）、白细胞计数（WBC）、淋巴细胞百分含量（LYMPH%）、中间细胞百分含量（MID%）、粒细胞百分含量（GRAN%）、网织红细胞数（RET%）、凝血酶原时间（PT）；4.2.2.4.5血液生化学指标：给药结束（即给药第90天）和恢复期结束时（即停药第15天）各测一次，检测下列项目：丙氨酸氨基转换酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转换酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血糖（GLU）、尿素氮（BUN）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、肌酐（Crea）、总胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）、肌酸磷酸激酶（CK）、钾离子浓度（K+）、钠离子浓度（Na+）、氯离子浓度（Cl-）；4.2.2.4.6大体解剖：肉眼观察动物各器官、组织病理变化情况。给药结束（即给药第90天）和恢复期结束时（即停药第15天）各检查一次。给药后濒死或给药期间死亡动物均应及时进行大体解剖；4.2.2.4.7脏器重量及脏器系数：给药结束（即给药第90天）和恢复期结束时（即停药第15天）各测一次，共1次，检测下列脏器：脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫。脏器系数=脏器重量/体重×100；4.2.2.4.8组织病理学检查：给药结束（即给药第90天）和恢复期结束时（即停药第15天）各检查一次，检测下列脏器：脑（大脑、小脑、脑干）、垂体、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脊髓（颈、胸、腰）、胸腺、胃、胰腺、大肠和小肠、膀胱、淋巴结（颈部、肠系膜淋巴结）、甲状腺、甲状旁腺、主动脉、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、气管、食管、胸骨（骨髓）、唾液腺；4.2.2.4.9给药末期和恢复期观察：给药结束（即给药第90天），动物禁食过夜后，每组各取2/3动物（雌雄各半），麻醉，腹主动脉取血，处死，病理解剖。剩余1/3动物常规饲养，停药2周进行恢复期观察，观察动物毒性反应的可逆程度及可能出现的延迟性毒性反应，恢复期结束时，同样方法处死全部动物，病理解剖（同给药末期）；29万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4.2.2.4.10数据统计处理方法：采用PEMS统计软件进行统计分析，体重、摄食量等计量资料结果以表示，组间比较时采用单因素方差分析，方差齐时用t检验，方差不齐时用秩和检验，检验水准0.05。4.2.3结果4.2.3.1一般状况观察各组大鼠均未见死亡或明显毒性症状。4.2.3.2体重变化低剂量组雌性大鼠给药2周与对照组比较明显降低（P﹤0.05），第13周与对照组比较明显升高（P﹤0.05）。但未见受试物使体重减少或增加的规律性变化。其余各组大鼠体重变化基本符合大鼠体重增长规律。体重增长直观图见图-1，图-2；体重系数变化见表1-1、1-2。4.2.3.3饲料消耗量4.2.3.3.1图-3，图-4和表2-1，2-2显示，大鼠给药初期（3周以前）饲料消耗量较大。但3周以后，饲料消耗量逐渐趋向稳定；给药末周各组动物饲料消耗量无明显差异；4.2.3.3.2雌性大鼠：低剂量组第8周与对照组比较显著升高（P﹤0.05）；中、高剂量组第7周则显著降低（P﹤0.05）；高剂量组第1、2周与对照组比较显著升高（P﹤0.01，P﹤0.05）；4.2.3.3.3雄性大鼠：中剂量组第3周与对照组比较显著降低（P﹤0.01）。4.2.3.4外周血液学检查（含血凝指标）4.2.3.4.1末期4.2.3.4.1.1MID%：与对照组比较，低（♂）明显升高（P﹤0.05）；中（♀、♂）和高剂量（♂）显著升高（P﹤0.01）；4.2.3.4.1.2GRAN（%）：与对照组比较，中剂量（♂）显著降低（P﹤0.01）；中剂量（♀）明显降低（P﹤0.05）；4.2.3.4.1.3PLT：与对照组比较，低剂量（♀）明显升高（P﹤0.05）。4.2.3.4.1.4除上述指标外，其余血液学指标与对照组比较无统计学差异。结果见表3-1，3-2。4.2.3.4.2恢复期4.2.3.4.2.1MID%：与对照组比较，中剂量（♀）显著升高（P﹤0.01）；4.2.3.4.2.2RET（%）：与对照组比较，中剂量（♂）明显升高（P﹤0.05）。4.2.3.4.2.3除上述指标外，其余血液学指标与对照组比较无统计学差异。结果见表3-3，3-4。4.2.3.5血液生化学指标和电解质检查4.2.3.5.1末期4.2.3.5.1.1BUN：与对照组比较，中剂量组（♂）明显升高（P﹤0.05）；高剂量组（♂）明显降低（P﹤0.05）；4.2.3.5.1.2电解质：K+：与对照组比较，中剂量组（♂）、高剂量组（♀）明显升高（P﹤0.05）；Na+：与对照组比较，高剂量组（♂）明显降低（P﹤0.05）；Cl-：与对照组比较，低剂量组（♂）显著升高（P﹤0.01），高剂量组（♂）明显升高（P﹤0.05），中剂量组（♀）明显降低（P﹤0.05）；30万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4.2.3.5.1.3除上述指标外，其余血液生化学指标与对照组比较无统计学差异。结果见表4-1，4-2。4.2.3.5.2恢复期4.2.3.5.2.1电解质：Na+：与对照组比较，中、高剂量组（♀）明显降低（P﹤0.05）；高剂量组（♂）显著升高（P﹤0.01）；Cl-：与对照组比较，低、中、高剂量组（♂、♀）均升高（P﹤0.05-0.01）。4.2.3.5.2.2除上述指标外，其余血液生化学指标与对照组比较无统计学差异。结果见表4-3，4-4。4.2.3.6大体解剖检查4.2.3.6.1末期：对照组♀16、18号大鼠出现子宫充血；高剂量♂15出现肠胀气，♂17出现精囊萎缩；其余各组动物大体解剖检查未见异常；4.2.3.6.2恢复期：各组动物大体解剖检查未见异常。4.2.3.7脏器系数4.2.3.7.1脑：与对照组比较，末期低、中剂量组（♀）明显降低（P﹤0.05）；4.2.3.7.2心脏：与对照组比较，末期高剂量组（♂）明显降低（P﹤0.05）；4.2.3.7.3肺脏：与对照组比较，末期低、中剂量组（♀）明显降低（P﹤0.05）；恢复期中剂量组（♂）明显降低（P﹤0.05）；4.2.3.7.4肾上腺：与对照组比较，末期中剂量（♀）右肾上腺明显降低（P﹤0.05）；4.2.3.7.5睾丸：与对照组比较，恢复期低剂量组（♂）有明显降低（P﹤0.05）；4.2.3.7.6除上述指标外，其余脏器系数与对照组比较无统计学差异。结果见表5-1，5-2，5-3，5-4。4.2.3.8组织病理学检查组织病理学检查未发现明显的毒理性靶器官，但个别脏器有轻微的病理学改变。4.2.3.8.1肺脏：末期空白对照组4例及低、中、高剂量组各有5例、4例、3例肺脏小动脉管壁平滑肌增生，导致管壁增厚，管腔狭窄，各组间病变例数差异不大，考虑为动物自身病变，而非药物毒性所致。4.2.3.8.2肝脏：末期空白对照组出现肝细胞点状坏死2例，高剂量肝细胞脂肪变1例、点状坏死3例；恢复期空白对照组出现肝细胞脂肪变1例、点状坏死1例，高剂量肝细胞脂肪变1例、水肿1例。各组间病变例数差异不大，考虑为动物自身病变，而非药物毒性所致。4.2.3.8.3胃：空白对照组与高剂量组黏膜腺体均由轻度增生，各组间病变例数差异不大，认为是由于大鼠自身原因所致；4.2.3.8.4除上述脏器外，其余脏器未见明显病理变化。组织病理学检查结果详见病理报告（附件三）。4.2.4讨论4.2.4.1一般观察与体重给药组大鼠一般症状观察未见明显异常；体重除低剂量大鼠体重与对照组比较偶有差异外，未见受试物使体重减少或增加的规律性变化。各组大鼠体重变化符合大鼠体重增长规律。进食量亦无减少或增加的规律性变化。31万方数据 新疆医科大学硕士学位论文4.2.4.2外周血液学检查4.2.4.2.1末期依提菲力白热斯蜜膏各剂量组MID%均有所升高，GRAN%中剂量组均有所降低，恢复期与对照组比较无明显差异（中剂量♀除外），但变化均在本中心SD大鼠背景数据范围内（MID%：3.5-18.0%；GRAN%：12.5-50.6%）；4.2.4.2.2PLT：与对照组比较，低剂量（♀）明显升高（P﹤0.05），但变化无剂量规律性，且恢复期与对照组比较无明显差异；4.2.4.2.3RET（%）：恢复期中剂量（♂）与对照组比较有统计差异（P﹤0.05），考虑与标准差太小有关。4.2.4.3血生化指标和电解质检查4.2.4.3.1BUN与对照组比较，末期中剂量组（♂）明显升高（P﹤0.05），高剂量组（♂）明显降低（P﹤0.05）。但变化无剂量规律性，且恢复期与对照组比较无明显差异；4.2.4.3.2K+、Na+、Cl-等电解质指标与对照组比较，虽有统计学差异，但考虑与标准差太小有关；4.2.4.4大体解剖检查虽然对照组2例大鼠出现子宫充血，高剂量1例出现肠胀气、1例出现精囊萎缩，但组织病理学检查未见明显病理变化。4.2.4.5脏器系数虽然末期给药组大鼠心脏、脑、肺脏系数偶有统计学差异，但无剂量规律性变化；恢复期中剂量组大鼠（♂）肺脏、低剂量组睾丸与对照组比较虽有统计学差异，但无剂量规律性变化，末期与对照组比较无明显差异，考虑与供试品无关。4.2.5结论在本次试验系统条件下，SD大鼠灌胃给予依提菲力白热斯蜜膏3个月，剂量分别为435、870、1740mg/kg，停药恢复2周。总结如下：435、870、1740mg/kg三个剂量组大鼠一般状况、体重、饮食、血液学、血液生化学、脏器重量及脏器系数和病理学检查，未见有依提菲力白热斯蜜膏引起的明显异常。依提菲力白热斯蜜膏大鼠未见明显毒性反应剂量为1740mg/kg，相当于人临床拟用剂量倍数的100倍。讨论传出神经系统包括植物神经系统和运动神经系统。植物神经系统又称自主神经系统，可分为交感神经和副交感神经，支配心脏、平滑肌、腺体、皮肤等效应32万方数据 新疆医科大学硕士学位论文器。大部分交感神经节前纤维末梢释放去甲肾上腺素，单胺氧化酶是（MAO）水解去甲肾上腺素的酶。全部副交感神经节前和节后纤维末梢释放乙酰胆碱，胆[29][30]碱酯酶（CHE）是水解乙酰胆碱的限速酶。研究表明交感神经兴奋性增加，可能导致褪黑激素等介质的释放增加，使黑色素合成减少；另一方面交感神经兴奋可能会导致MA0活性增加，进而出现过氧化氢聚集导致黑色素合成减少。当CHE活力增强时，乙酰胆碱（Ach）代谢增加、在突触间隙内含量减少，致使副交感功能减弱而交感功能增强，导致黑色素合成减少。白癜风皮肤损伤部位与自[29][30]由基的氧化性损伤有密切的关系。已有研究显示，白癜风患者血清中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等抗氧化酶活性下降，而脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量升高。白癜风是色素障碍为特征的系统性疾病。现代医学认为白癜风的病因包括免疫功能异常、内分泌失调、体内自由基等有毒物质对黑色素细胞杀伤、酪氨酸酶活力减弱等。在这些病因中黑色素细胞功能和机体氧化-抗氧化系统功能失调方面的研究越来越引起研究人员重视。酪氨酸酶是黑色素细胞生物合成黑色素过程中的关键酶，而白癜风的发病机制正是由于人体皮肤和毛囊的黑色素细胞内酪氨酸酶的活性减低或消失，导致黑色素体(黑色素颗粒)生成进行性减少或消失而引起的局限性或泛发性脱色素病变。白癜风维吾尔医发病机理是机体长处于湿寒环境，因自然力下降所致肝脏生成正常体液的生理功能紊乱，使粘液质发生异常变化生成异常粘液质；同时，体内过盛的异常黏液质沉着在皮肤底部，阻碍皮肤的正常血液循环，使营养成分不能输送到皮肤，黑色素细胞不能正常生长发育，从而皮肤脱色，出现白癜风灶。因此，临床治疗白癜风时主张首先应用异常粘液质成熟剂”成熟、清除异常体液、纠正异常气质，促进正常体液的生成”，继而”恢复各脏器的功能状态”从而恢复机体自然力。机体体液和气质恢复平衡后，使用热性专用药治疗白癜风如：依提菲力白热斯蜜膏。本文探讨依提菲力白热斯蜜膏不同拆方组分对A375黑色素瘤细胞的增殖、酪氨酸酶活性、黑色素合成的影响。小结依提菲力白热斯蜜膏是维吾尔医经典方剂，由驱虫斑鸠菊、补骨脂、黑种草籽、丁香、洋茴香、阿纳其根等14种药材组成，其维吾尔医处方组成是主药、辅助药、调节药。本实验结果显示，蜜膏可使白癜风模型小鼠降低血清MAO，降低皮肤组织匀浆MAO、CHE、MDA水平，说明蜜膏能改善白癜风病变，对白癜风有一定的治疗作用与增加黑色素的生成，清除过量自由基，保护皮肤免受自由基损伤有关；同时，蜜膏的处方组成有一定的意义，但此方面待遇深入研究。33万方数据 新疆医科大学硕士学位论文致谢四年的研究生生活转瞬即逝，但这却成了我人生中最为重要的一个阶段。在这四年的硕士研究生生涯中我收到了诸多人士的无私帮助和关怀。首先由衷地感谢我的指导老师斯拉甫·艾白教授，从选题、学术和技术指导到论文发表无不渗透着他们的心血。导师广博的学识、严谨的工作态度和对科学研究孜孜不倦的追求精神，深深地感染和激励着我，令我终生受益。他的言传身教为我树立了良好的榜样，他的支持和鼓励更是我今后工作的动力和源泉。在此，对我尊敬的导师表示衷心的感谢和深深地敬意！衷心感谢新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所药理毒理室主任热比古丽老师对我工作学习上的指导和帮助，使我丰富了专业知识、掌握了实验技能，为我今后的学习和工作打下了坚实的基础。感谢我的同事尤丽都孜·买买提，艾西木江·热甫卡提，肖开提·艾白都拉和买合苏提·卡德尔在我进入课题组的两年里对我无私的帮助和关心，是你们的鼓励和支持给了我不断进取的信心。感谢研单位所有的兄弟姐妹：在做课题期间我们互相鼓励、互相帮助，一同发现和解决问题。正是有了团结向上的团队精神，才能让我顺利、如期地完成课题，参加答辩。最后，还要感谢我的家人，感谢他们一直以来对我默默的支持和理解。在我即将完成三年学业的时候，谨在此向所有关心、帮助我的老师、同学们以及我的家人致以最诚挚的谢意和美好的祝福！34万方数据 新疆医科大学硕士学位论文参考文献[1]NationalInstituteofArthritisandMusculoskeletalandSkinDiseases(March2007).“WhatIsVitiligo?FastFacts:AnEasy-to-ReadSeriesofPublicationsforthePublicAdditional”.Retrieved2010-07-18.[2]HalderRM,etal.(2007).“72.Vitiligo”.InWolffK,FreedbergIM,FitzpatrickTB(eds).Fitzpatrick"sdermatologyingeneralmedicine(7thed.).NewYork:McGraw-HillProfessional.[3]PicardiA,PasquiniP,CattaruzzaMS,GaetanoP,MelchiCF,BalivaG,CamaioniD,TiagoA,AbeniD,BiondiM(2003).“Stressfullifeevents,socialsupport,attachmentsecurityandalexithymiainvitiligo.Acase-controlstudy”.PsychotherapyandPsychosomatics72(3):150–8.[4]NathSK,MajumderPP,NordlundJJ(1994).“Geneticepidemiologyofvitiligo:multilocusrecessivitycross-validated”.AmericanJournalofHumanGenetics55(5):981–90.[5]Halder,RM;Chappell,JL(2009).“Vitiligoupdate”.Seminarsincutaneousmedicineandsurgery28(2):86–92.[6]LIYL,YuCL,YuHS.IgGanti-melanocyteantibodiespurifiedfrompatientswithactivevitiligoinduceHLA-DRandintercellularadhesionmolecule-1expressionandanincreaseininterleukin-8releasebymelanocytes.JInvestDermatol，2000,115(6):969一977.[7]HedstrandH,EkwallO,OlssonMJ,etal.(2001).“ThetranscriptionfactorsSOX9andSOX10arevitiligoautoantigensinautoimmunepolyendocrinesyndrometypeI”.TheJournalofBiologicalChemistry276(38):35390–5.[8]刘瓦利.白癜风.北京:科学技术文献出版社，2001:22一24.[9]CucchiML，FrattiniP，SantagostinoG，etal.Higherplasmacatecholamineandmetabolitelevelsintheearlyphaseofnonsegmentalvitiligo.PigmentCelRes，2000，13(1):28一32.[10]Jimbok.Biologicalroleoftyrosinase-relatedproteinanditsrelevancetoPigmentarydisorders(vitiligovulgaris).JDermatol，1999，26(11):734一737.[11]易沙克江·马合穆德。中国医学百科全书——维吾尔医学[M]．上海：上海科学技术出版社，2005：137.[12]Scherschun,L;Kim,JJ;Lim,HW(2001).“Narrow-bandultravioletBisausefulandwell-toleratedtreatmentforvitiligo”.JournaloftheAmericanAcademyofDermatology44(6):999–1003.[13]Don,Philip;Iuga,Aurel;Dacko,Anne;Hardick,Kathleen(2006).“TreatmentofvitiligowithbroadbandultravioletBandvitamins”.InternationalJournalofDermatology45(1):63–5.35万方数据 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