β-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假elisa中的应用 47页

分类号——UDC——学位论文学号密级p．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用指导教师姓名：申请学位级别：姜威硕士论文提交日期：2Q12生垒月学位授予单位：扬必盘鲎答辩委员会主席：论文评阅人：学科专业名称：!堕鏖簦匡鲎论文答辩日期：2Q12生鱼旦学位授予日期：2Q12生鱼目2012年4月 13I一呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用PreparationoftheMonoclonalAntibodiesagainst13-fructofurnosidaseandestablishmentandPreliminaryoftheELISAMethodforHoneyadulterationdetection研究生：姜威导师：王捍东教授学科：临床兽医学M．S．Candidate：JiangWeiSupervisor：Pro￡WangHandong扬州大学兽医学院临床兽医学教研室2012年4月 姜威13一呋喃果糖苷酶抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用中文摘要蜂蜜是蜜蜂从开花植物的花中采得的花蜜在体内经过转化并吐回蜂巢中酿制成的。蜂蜜的成分除了葡萄糖、果糖外，还含有丰富的各种维生素、矿物质和氨基酸。其味道甜蜜，所含的单糖不需要经消化就可以被人体吸收，对妇、幼特别是老人更具有良好的保健作用，因而是一种营养丰富的天然滋养食品。蜂蜜的需求量很大，受利益驱使，近年来国内蜂蜜掺假造假现象十分严重，危害消费者身体健康，并严重阻碍中国蜂业的健康发展。检测掺假蜂蜜的方法有很多，例如3C／12C同位素比率分析法、高效阴离子交换色谱．脉冲安培检测法、双果糖酐(DFAs)检测法、高效液相色谱法、近红外光谱法、旋光法、高效毛细管电泳等，但这些方法都或多或少的存在着设备要求高、操作复杂、鉴定类型单一等缺点。而免疫学方法，特别是酶联免疫吸附法(ELISA)，由于其具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简单等优点，为蜂蜜掺假的检测提供了新的思路。p．呋喃果糖苷酶(13-fructofumosidase)是食品工业中用来水解蔗糖的D．果糖p糖苷的果糖苷键的酶，在高浓度的蔗糖溶液中，p．呋喃果糖苷酶可催化转糖基作用，在蔗糖的果糖基上通过p．(2，1)糖苷键连接l～3个果糖而形成果糖寡聚体。在低浓度蔗糖溶液中，p．呋喃果糖苷酶则主要是催化蔗糖水解，生成果糖和葡萄糖。如果将蔗糖水解后的果糖和葡萄糖掺入蜂蜜中，用一般的方法会难以鉴别，而通过检测蜂蜜中掺入转化糖而残留的p．呋喃果糖苷酶有助于确定是否存在掺糖造假。本研究旨在建立一种快速、灵敏、简便且经济的p．呋喃果糖苷酶酶联免疫检测方法并将其应用于植物转化糖类的蜂蜜掺假检测为目的。采用杂交瘤技术制备抗B．呋喃果糖苷酶单克隆抗体并建立双抗夹,L,ELISA法检测蜂蜜中p．呋喃果糖苷酶残留的方法。通过对比不同来源的蔗糖转化酶，分别采用考马斯亮蓝法和BCA法，SDS．PAGE测定其蛋白质浓度和纯度，结果表明每10mg蔗糖酶溶于lmL超纯水中所得溶液蛋白浓度为5．6mg／mL，且纯度很高。用其作为免疫原免疫小鼠后，采用杂交瘤技术获得9株杂交瘤细胞株，分别命名为1D6F2、8F8C5、8F8A9、1D6D12、8F8G3、8F8A6、8F8F10、1D6810、1D6811。用前四株制备4种腹水，制备的腹水效价基本在1：16，000以上，腹水以及包被抗原的工作浓度分别为1：16000和1：8000。通过相加实验测定8F8C5和8F8A9两株是针对不同抗原表位，并以此为基础建立双抗夹，L,ELISA的检测方法，检验建立后的双抗夹心ELISA法特异性良好，敏感性高，无明显的交叉反应。在对于蜂蜜掺假的检测中，对样品做8倍稀释后，在5-80ng／mL范围内，标准线性方程为：y=--0．2359x+0．6421，《=0．9878。关键词：B．呋喃果糖苷酶：单克隆抗体；双抗夹心ELISA；蜂蜜；掺假。 扬州大学硕士学位论文PreparationoftheMonoclonalAntibodiesagainstp-fructofurnosidaseandestablishmentandPreliminaryoftheELISAMethodforHoneyadulterationdetectionABSTRACTn—Honeyisnectarfromtheflowersoffloweringplantscollectedbybeesfromthebrewingofhoneyinthehive。Honeyisalsorichinvariousvitamins，mineralsandaminoacids，Additiontoglucose，fructose．Itssweettaste，andmonosaccharidewhichdoesn’tdigestedcanbeabsorbedbythebodyforwomen，young，especiallytheelderlygoodhealth，SOitisanutrient-richnaturalnourishingfood．Honeyisingreatdemand．Drivenbyprofit，domestichoneyadulterationhasaveryseriousprobleminrecentyears，endangeringthehealthofconsumers，andaseriousimpedimenttothehealthydevelopmentofChinaapiculture．Therearemanywaystodetectadulterationofhoney,suchasIsotoperatioanalysis，highperformanceanionexchangechromatography—pulsedamperometricdeletionHighperformanceliquidchromatography,near-infraredspectroscopy，polarimetryandhi曲performancecapillaryelectrophoresis．However,thesemethodshavesomekindsofshortcomings，forexampleequipmentrequirements，complexoperation，singletypeofidentification．Immunologicalmethods，especiallyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)giveUSanewapproachforthedetectionofhoneyadulterationbecauseofitshighsensitivity,specificity，speed，andeasytooperate，Thebeta-fi-uctofuranosidaseisusedtothehydrolysisofsucroseintheFoodIndustry．Inthehighconcentrationsofsucrosesolution．the13-fructofuranosidasecatalytictransfersglycosylationrole．Inthelowconcentrationofsucrosesolution，thebeta-fructofuranosidasecatalyzesthehydrolysisofsucrosetogenerateofthefructoseandglucose．Iffructoseandglucosearemixedinhoney，itwillbedifficulttodetect．Anditwillbehelpingtodeterminewhetherthereisforgeryoftheplantconversionofcarbohydrateinthedetectionofbeta-fructofuranosidaseresiduesinhoney．Inthisstudy,weaimstoestablisharapid，sensitive，simpleandcost13-fmctofumosidaseenzyme—linkedimmunoassaymethodandusedinplanttransformationofsugarsofhoneyadulterationdetection．WemanufactureAnti—p-fructofuranosidasemonoclonalantibodypreparedbyhybridomatechnique，Andtoestablishthesideofthedouble—antibodysandwichELISAforhoneyinthebeta．fructofuranosidaseresidues． 姜威13一呋喃果糖苷酶抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用ARercomparingdifferentsourcesofBeta·fructofuranosidase，wedeterminetheproteinconcentrationandpuritywithcoomassiebrilliantblueG-250，BCAandSDS．PAGE．Theresultsshowthatproteinconcentrationwas5．6mg／mLinevery10mginvertasedissolvedinlmLultrapurewater．ThenitWasusedasimmunogentoimmunizethemice．Bythehybridomatechnique，weget9hybridomacellswhichwerenamedas1D6F2，8F8C5，8F8A9，1D6D12，8F8G3，8F8A6，8F8F10，1D6810，1D6811．fourkindsofabdominaldropsyweremadebyinjecting1D6F2，8F8C5，8F8A9，1D6D12tumorcellstoabdominalcavityofmice，andtheirtiterswereallabove1：16000．ThebestconcentrationofascitestiterandcoatedantigenWasgained，whichwere1：16000and1：8000．McAb-1D6F2andMcAb一8F8A9mightdirecttothedifferentantigenicdeterminantandonthisbasis，weestablishthemethodofdouble—antibodysandwichELISA．AfterresultshowsthattheELISAhasagoodspecificity，highsensitivity，andnosignificantcross-reactivity．Thismethodwasinitiallyappliedtothedetectionofhoneysamples．Do8-folddilutionofthesamplesforthedetectionofhoneyadulteration，within5～80ng／mLthescope，thestandardlinearequation：Y=-0．2359x+0．6421，R2=0．9878．Keywords：Beta--fructofuranosidase；monoclonalantibodies；double·-antibodysandwichELISA；honeyadulteration． 扬州大学硕士学位论文中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯ABSTRACT目录⋯⋯目录符号说明⋯⋯⋯⋯⋯⋯第一章绪论⋯⋯⋯⋯。。Ⅵ11蜂蜜的组成及功效⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12掺入植物糖类造假蜂蜜的鉴别方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12．1一些简单的辨别方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22．2碳同位素比率分析法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22．3高效阴离子交换色谱-腑：冲安培检测法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22．4双果糖酐检测法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．5高效液相色谱法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．6近红外光谱法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．7显徽镜检测法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．8旋光法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32．9高效毛细管电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43蜂蜜的食品安全国家标准⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44蔗糖酶概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54．1蔗糖酶的来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54．2酶学性质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54．3瞅喃果糖苷酶的作用方式及其机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．64．4瞅喃果糖苷酶在生产中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．74．5酶活力的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯85本研究的目的及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9第二章叫}响果糖苷酶纯度及蛋白浓度的测定⋯⋯1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．1主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．2仪器与设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．3主要溶液系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．4p呋喃果糖苷酶纯度的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．5蛾喃果糖苷酶蛋白浓度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯112结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．122．1SDS-PAGE结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．2酶蛋白质浓度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．123讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第三章雎呋喃果糖昔酶抗体的研制及鉴定⋯⋯141材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．14 姜威B一呋喃果糖苷酶抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用∑1．1主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．2仪器与耗材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．3实验动物和生物材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．4主要溶液系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．151．5单克隆抗体的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．161．6单克隆抗体性质的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．191．7ELISA检测方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．202结果及分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1包被抗原工作浓度、封闭液以及阳性血清效价的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2单克隆抗体细胞株的建立及其稳定性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．3腹水的制各⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．4单克隆抗体的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．223讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯253．1单抗的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．253．2抗体的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．26第四章双夹心应用ELISA方法的建立和应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．271材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．271．1实验样品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．271．2试剂和仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．271．3双抗夹心法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．271．4包被抗体的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．281．5双抗夹心ELISA反应条件的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯281．6双抗夹心ELISA特异性鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯281．7样品基质千扰检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．281．s敏感性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．291．9样品添加回收试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．292结果及分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．292．1包被抗体的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．292．2双抗夹心ELISA反应条件的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．3双抗夹心ELISA特异性的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．4样品机制干扰检测结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．302．5敏感性试验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．312．6标准曲线的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3l2．7添加回收率及重复性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323{寸论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32结论⋯⋯⋯⋯。参考文献致谢扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书⋯⋯⋯⋯．3537 扬州大学硕士学位论文符号说明VI 姜威B一呋喃果糖苷酶抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用ng／L纳克每升Nanogramperlitrepg／L微克每升MicrogrammeperlitrenggmL纳克每毫升Nanogrampermillilitremin分钟Minites秒Secondr／rain转每分钟RoundperminuteCV(RSD)变异系数ConstrainedvariationSD标准差StandarddeviationOD光密度Opticaldensity 姜威B．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用第一章绪论蜂蜜是由蜜蜂采集植物的分泌物或者花蜜，经充分酿制而成的一种天然滋补品，具有多种生理功能，例如抗氧化、杀菌、增强免疫和消食等。我国是养蜂大国，蜂蜜的大量出口为国家创汇作出了重要贡献。’然而，近年来我国蜂产品的质量问题令人担忧，在各个蜂蜜进口国中的信誉也不断降低。这其中的原因之一就是我国的蜂蜜质量在严重下滑，导致该情况发生的直接原因是某些不法生产者、加工经营者为了谋取不当利益，生产、销售造假掺假蜂蜜，这种现象几乎已经司空见惯。要解决蜂蜜掺假这一问题，行业自律固然重要，但是相关的标准和检测手段也是必不可少的。卫生部于2011年4月20日发布了新的蜂蜜食品安全国家标准，国际食品法典和欧盟蜂蜜标准等其他国际标准的发布对遏制蜂蜜掺假以及规范蜂产品市场都产生了积极的作用。但是蜂蜜这种天然食品是极易造假的，它的成分变化很大(果糖和葡萄糖的比率在0．76到1．86之间)，这就给蜂蜜的鉴别和检测带来了一定的困难，尤其是当掺假蜂蜜发展到了掺入葡萄糖和果糖等植物转化糖类物质时，这些掺假蜂蜜的感官指标和部分理化指标与天然蜂蜜产品的都极为相似。对于已颁布的国标也难以鉴别其中的真假，因此，对于建立新型有效的掺假蜂蜜检测方法的呼声也越来越高。1蜂蜜的组成及功效蜂蜜是复杂的糖过饱和溶液，其中60％"-"80％是人体易吸收的葡萄糖和果糖，这使得蜂蜜具有甜味、触变性和吸湿性等特性。蜂蜜含蔗糖极少，不超过8％，此外还有麦芽糖、松二糖、海藻糖以及海藻糖等，水分16％"---25％，此外，蜂蜜中还含有淀粉酶、蔗糖酶、色素、维生素、有机酸、微量元素、无机盐，蜂花粉、激素等。蜂蜜具有很高的营养价值，能够护肤美容、抗菌消炎、促进消化及组织再生、提高免疫力、保护心脑血管、消食、润肺、解酒等多重功效，而不同类型的蜂蜜也有不同的功效。2掺入植物糖类造假蜂蜜的鉴别方法由于蜂蜜所具有的多重功效从而受到了广大人民群众的喜爱，其中的高额利润也让许多不法商贩看到了商机。良质蜂蜜具有纯正的清香味和各种本类蜜源植物的花香味，无其他任何异味；而劣质的蜂蜜香气淡薄或者无香气，有发酵味及其他不良气味。根据国际食品法典，欧盟蜂蜜标准等其他国际标准对蜂蜜的定义，蜂蜜作为纯天然食品不可以添加外来物质或从蜂蜜中去除某些成分【11。对于掺假蜂蜜的鉴别方法有很多种，下面介绍几种常用的方法。 扬州大学硕士学位论文2．1一些简单的辨别方法蜂蜜掺假的方式有很多，有的加水提高产量，蔗糖加香精调配，用蔗糖喂蜂蜜后摇蜜，掺入人工转化糖、淀粉、食盐、饴糖、羧甲基纤维素钠、糊精、土豆泥、石蜡、矿蜡，直接将蔗糖掺入蜜蜂，混入低值蜂蜜等等。通过一些简单的方法，如看、闻、尝、挑、捻等，就能够辨别掺入水、淀粉、蔗糖、饴糖、香精等。例如好的蜂蜜用牙签搅起一些向外拉时，可以拉出又细又透亮的黄金丝；无拉丝现象说明水分高：也可以滴在纸上，水迹易扩散者说明水分高，纯净的蜂蜜呈珠球状，不扩散；用烧红的铁丝插进蜂蜜后如果是好的会有青烟冒出，且有瓜果花朵的香味；纯正的蜂蜜不但香气宜人，而且口尝会感到香味浓郁。将蜂蜜置于舌上，以舌抵上颚，蜂蜜缓缓入喉，会感到微甜而稍有酸味，口感细腻，喉感略有麻辣，余味悠长。掺假的蜂蜜，上述感觉变淡，而且有糖水味、较浓的酸味或咸味等；如果品尝后发现有涩涩的感觉，很可能是因为在掺假的蜂蜜中加入了白糖，为了防止白糖沉淀而加入了一些白矾造成的，等等。2．2碳同位素比率分析法13C／12c同位素比率分析法【2】大多用于C4植物糖掺假的检测，在双子叶植物(如大部分为蜜蜂提供花蜜的开花植物包括小麦、大麦、马铃薯、油菜、棉花以及多种水果蔬菜，简称C3植物)和单子叶植物(如甘蔗、向日葵、高粱、玉米等，简称C4植物)中的13C／12C比值(613C值)不同，c4循环植物的613C值在．12‰到．19％o之间，而C3循环植物的613C值在．2l‰到．32％o之间，因此最初人们将613C值为．23．5‰作为界限，大于是就被怀疑可能掺假。但后来一些掺入人造甜味剂的掺假蜂蜜的613C值小于．23．5，所以研究人员设计了另外一种检测方法内标同位素比分析法(ISCIRA)，该方法首先检测蜂蜜样品中的蛋白质613c值，该值等于与之同源的未掺假蜂蜜中的6”C值，然后与样品中的613C值比较，差值大于1％o就认为是掺假蜂蜜。2．3高效阴离子交换色谱．脉冲安培检测法高效阴离子交换色谱．脉冲安培检测法(HPAEC．PAD)是目前糖类化合物分析的首选方法之一，具有选择性好、灵敏度高和操作简单等优点[3】。其基本原理是单糖在碱性溶液中以阴离子形式存在，并可在阴离子交换柱上被保留和分离。在碱性条件下糖类会在金属电极表面被氧化，通过测量分离单糖在工作电极表面发生氧化还原时产生的电流变化进行分析。运用该方法对蜂蜜中分离出13种主要的糖类进行线性判别分析(LDA)和偏最小二乘(PLS)分析，LDA是用来对样品分类，以区别样品的不同来源和是否掺假；PLS贝,U是对样品进行掺假程度的量化。 姜威B一呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用三2．4双果糖酐检测法双果糖酐(DFAs)是由两个果糖分子缩聚产生的一类假二糖，它是由糖类物质在加热过程中的焦糖化反应后的产物，可以用来标记检测某些富糖食品(蜂蜜等)的产品质量。Montilla等研究发现，向纯蜂蜜中加入不同浓度(5％、10％、15％)的葡萄糖、果糖和蔗糖转化糖浆后经过焦糖化反应和气象色谱／质谱联用法测定DFAs含量后，掺入果蔗糖转化糖浆和果糖的蜂蜜样品中有13个DFA峰，而在加入葡萄糖的样品中只有5个峰，其中的DFA7和DFA9在洗脱时没有色谱干扰以及相对含量较高。纯的蜂蜜中的DFA7和DFA9的含量为零，其他样品中均不为零，所以这两种物质被选用作为检测蜂蜜是否掺假的标志，尤其是对于检测掺入果糖和蔗糖转化糖浆的蜂蜜有更好的效果。2．5高效液相色谱法高效液相色谱法一度被广泛应用于蜂蜜掺假的检测中嗍，但是对于低浓度掺假和掺入与蜂蜜成分相似的糖浆掺假时则不能检测。特殊微点的天然同位素核磁共振法是在近二十年才发展成熟的，是以对分子特殊位置的氚和氢的比率分析为基础来检测蜂蜜是否掺假，缺点是需要处理大量数据才能保证结果。2．6近红外光谱法近红外光谱分析法(NIRS)今年来被广泛的应用于医药、食品、农业等领域，该方法具有速度快、成本低、无污染等优点。根据陈兰珍【5】等人的研究，用近红外光谱技术结合判别偏最dx--乘法能够快速鉴别掺入糖浆后的掺假蜂蜜。该方法是一种附加方法，主要借助于简单的显微镜分析可能检测用蔗糖及蔗糖产品的掺假蜂蜜。根据黄文诚[研的研究显示，通过显微镜筛查可以检测出蜂蜜中不含有的甘蔗组织，计算甘蔗组织，能够得到蜂蜜中蔗糖数量的指示，与羟甲基糠醛值相结合，可以区分蜂蜜掺假。2．8旋光法蜂蜜中的糖类物质具有旋光性，果糖的旋光性为左旋，葡萄糖的旋光性为右旋，大多正常蜂蜜中的果糖含量高于葡萄糖，因此蜂蜜为左旋。根据史琦云‘71等人的研究显示，不同蜜种随着掺入的糖类浓度不同，蜂蜜的旋光性成线性变换。掺入蔗糖或者糖稀，蜂蜜的旋光性会向右变化：当蜂蜜的旋光性向左变化时，表示掺入了果糖或者转化糖。 ——一扬州大学硕士学位论文’4—————’————————————————‘————————————————————————二——==_———一一一2．9高效毛细管电泳高效毛细管电泳的原理是毛细管区带电泳能够区分不同单糖在相同介质条件下与硼酸盐的络合物所具有的有效淌度差异，根据叶建农【81等人的研究结果显示，对两种蜂蜜样品中的糖分进行的分离测定显示效果ft．好。3蜂蜜的食品安全国家标准卫生部于2011年4月20日发布了新的蜂蜜食品安全国家标准，新标准中对于蜂蜜的范围、定义、原料、污染物限量、兽药残留限量、农药残留限量、嗜渗酵母计数、感官要求和理化性质进行了修改，此标准适用于蜂蜜，不适用于蜂蜜制品，定义蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿制而成的天然甜物质。蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露应安全无毒，不得来源于雷公藤、博落回、狼毒等有毒蜜源植物。其中感官要求、理化标准及微生物限量标准如下表l、表2、表3191。表1感官要求Tab．1Sensoryrequirements项目要求检验方法色泽依蜜源品种不同，从水白色(近无色)至深色(暗按SN／T0852的相应方褐色)法检测滋味、气味具有特有的滋味、气味，无异味状态常温下成粘稠流体状，或部分及全部结晶在自然光下观察状态，杂质不得含有蜜蜂肢体、幼虫、腊屑及正常视力可见检测其有无杂质杂质(含蜡屑巢蜜除外)表2理化标准Tab．2Mandatoryphysicalandchemicalrequirementsinthehoney项目指标检验方法果糖和葡萄糖／(g／1009)260蔗糖／(g／lOOg)GB／T18932．22桉树蜂蜜、柑橘蜂蜜、紫苜蓿蜂蜜、荔枝蜂蜜、野桂花蜜耋10其他蜂蜜兰5锌(Zn)／(mg／kg)耋25GB／T5009．14 姜威B·呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用表3微生物限量1’ab．3Microbiallimit对于掺入葡萄糖、果葡糖浆等成分的物质，感官要求及理化指标都与天然蜂蜜产品极为相似，新的国标也难以辨别其真假。4．1蔗糖酶的来源B一呋喃果糖苷酶(p．fructofumosidase，EC3．2．1．26，简称FFS)又称为蔗糖酶或转化酶。广泛的存在于生物界中，其中以酵母为最好的酶源，其在植物中的酶活性很弱，并受到季节的影响。1860年fl了Berthelot从酵母菌中得到B．呋喃果糖苷酶之后，许多研究人员对其进行了深入的研究。p一呋喃果糖苷酶最早发现于Penictilliumsptlo]和AspergillusspulI。工业上生产的低聚果糖一般是采用微生物酶法，此类酶为p．果糖基转移酶([3-fructosyltransferase，EC2．4．1．19，FTase，2)或具有转果糖基活力的p．呋喃果糖苷酶(13-fi"uctofuranosidase，2．1．26，FFase，1)。文献报道能产生上述酶的微生物有米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)【12】、节杆菌(圳lrobacter)【12，131、短梗霍j；(Aureobasium)t14】等。4．2酶学性质不同来源的肛呋喃果糖苷酶所具有的酶学特性略有不同，能够产生B一呋喃果糖苷酶的微生物很多，近年来对p．呋喃果糖苷酶的研究也很多。马歌丽等对来源于黑曲霉的p．呋喃果糖苷酶的酶学性质进行了研究，表明其最适温度为504C，在pH值为5．0～7．0之间，温度40～60℃时有较好的稳定性，另外p一呋喃果糖苷酶活性受到金属离子的影响。Ca2+和Mn2+能明显增强酶的活性，而cu2+和A矿则能抑制酶活 扬州大学硕士学位论文6————————————————————————————————————_————————————————————一一-一Bs]0朱桂兰等对来源于节杆菌10137的p．呋喃果糖苷酶的酶学性质进行了研究，结果表明其最适温度为30。C，pH值为6．5，在pH／fl呈为6．0～8．0，温度45"C以下稳定，M92+7F【IEDTA对酶活有一定的影响【161。通过对日本曲霉产p．呋喃果糖苷酶性质进行的研究，赵秀红【171等发现其分子量约为89KDa，最适温度和pH分别为506C和5．5，稳定条件为40～606C，pH值为5～7。反应时间为3h～4h。对于米曲霉产的p．呋喃果糖苷酶的酶学特性研究表明，当温度90℃时最稳定，最稳定pH值为5～9，最适反应温度为35"C"-一45。C，最适pH值为7～9【181。4．3p一呋喃果糖苷酶的作用方式及其机理4．3．1肛一呋喃果糖苷奠的作用方式不同来源的p呋喃果糖苷酶特异性和作用方式不尽相同。FoldF吗ita【l3】等对节杆菌来源的p．呋喃果糖苷酶的特异性和作用方式进行了研究，结果表明p．呋喃果糖苷酶可以完全水解蔗糖、淀粉糖和棉籽糖等的B．D．果糖苷键，但很难水解1．蔗果三糖。当和蔗糖单独存在时，具有转移果糖基和水解蔗糖的作用。当存在像乳糖等特异性受体时，就会将果糖基优先转移至受体上，合成为低聚乳果糖。Hirayama[19】研究发现Aspe略i11usnigerATCC20611生产的B．呋喃果糖苷酶只能将2-9．D呋喃果糖分子中的糖苷键分解并催化果糖基转移到2-1j-D呋喃果糖的果糖基末端的1-OH上，形成蔗果三糖。4．3．2p一呋喃果糖苷酶的作用机理不同来源的酶作用机理不同，大多数微生物来源的p．呋喃果糖苷酶能够独立的作用于底物。Dickerson[20】于1972年首先提出了果糖基转移酶催化形成异蔗果三糖型低聚果糖反应机理：sucrose+sucrose---}F2．6G1F+Gsucrose+F2---}6G1叶2F_÷F2_lF2一÷6G1---}2F+GGupta和Bhatia于1980年提出了Fusariumoxysporuml3．呋喃果糖苷酶作用机理：首先果糖从供体转移到果糖化核苷酸桥上，然后转移到受体蔗糖上形成GF2，GF4是最高级的葡果聚糖。Aspergillusniger和Aureobasidiumsp．果糖基转移酶有同样的作用机理：GFn+GF。_GF。．1+Cmn+1(n=1—3)按照这一机理，酶与蔗糖之间的反应并不是按比例进行的，2分子的蔗糖分别作为受体和供体分子。根据Kim[21】等人的研究，当蔗果三糖、蔗果四糖和蔗糖同时存在时，蔗果三糖与蔗果四糖是最佳受体，而蔗糖不易得到果糖基，有些p．呋喃果糖苷酶具有与Duan等 姜威13-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用一7人提出模型不同的合成机制，能够选择性的合fi戋GF4，Duan[22]等对上述机理提出了修改模型：产物葡萄糖并不会抑制蔗果四糖和蔗果三糖的合成，而蔗果四糖和底物蔗糖的水解会抑制本反应，尤其是黑曲霉和出芽短梗霉p．呋喃果糖苷酶对底物具有很强的空间结构特异性，能选择性的将蔗糖分子上的果糖集团转移到另一个蔗糖分子的1-OH呋喃糖苷键上，形成1．蔗果三糖型低聚果糖。4．4p一呋喃果糖苷酶在生产中的应用4．4．1生产功能型低聚果糖低聚果糖(FOS)是一种新型的保健食品，是一类天然存在于许多水果蔬菜中的碳水化合物。主要通过增殖双歧杆菌从而调节人体肠道内的微生态平衡【231，是功能型低聚糖中的代表性食品。早在20世纪50年代初，人们就发现了微生物能够产生低聚果糖，到了80年代末，通过Hidaka等人对低聚果糖合成酶进行的研究成功将Aspergillusniger应用于工业化生产低聚果糖糖浆。目前工业上生产的FOS主要采用微生物果糖基转移酶作用于蔗糖，进行分子内的转移果糖基反应，或者采用微生物内切菊粉酶水解菊粉生产低聚果糖，与植物来源的p．呋喃果糖苷酶不同，大多数微生物来源的B．呋喃果糖苷酶技能转化蔗糖为低聚果糖，又可以水解蔗糖和低聚糖进行可逆反应。4．4．2生产功能性低聚过乳糖低聚乳糖(LS)是一种新型甜昧剂和食品原料，被广泛地应用于乳酸菌饮料、固体饮料、果冻、糖果、乳制品、冷饮、糖果等，以其优异的保健功能和优质的甜味而受到广大消费者的喜爱。低聚乳糖是一种三糖，它是由p．D．呋喃果糖苷残基、0L．D．葡萄糖苷和D．D．半乳糖苷组成。乳糖和蔗糖是目前低聚乳果糖工业化生产的主要原料，在节杆菌源的B．呋喃果糖苷酶作用下降蔗糖分解产生的果糖基转移到乳糖还原性尾端的C1位羟基上，生成低聚乳果糖【24|。4．4．3提高大豆低聚糖的功能性大豆低聚糖是是从大豆籽粒中提取出的可溶性寡糖总称，是功能型低聚糖的一种，其主要成分为蔗糖(Sucrose)、棉子糖(Raff"mose)和水苏糖(Stachyose)，由于有棉子糖和水苏糖的存在，大豆低聚糖具有改善血脂代谢、调节人体内微生态环境、防止便秘和腹泻等。大豆低聚糖的功能性由于较高含量的蔗糖而降低，因此为了提高大豆低聚糖功能因子(棉子糖和水苏糖)的含量和功能，使用p．呋喃果糖苷酶催化大豆低聚糖，通过酶改性将其中的非功能性蔗糖转化为功能性低聚糖，能够有效的提高大豆低聚糖的功能。 扬州大学硕士学位论文4．5酶活力的测定目前测定p-呋喃果糖苷酶活力的方法主要3，5．二硝基水杨酸(DNS)法【251、总还原糖和葡萄糖测定方法的联用和高效液相色谱法三种。4．5．13,5．二硝基水杨酸法3，5．二硝基水杨酸(DNS)法样品处理简单、成本低廉、操作简单，适合实验室粗放测定和工业化生产中使用。分别使用低浓度和高浓度的蔗糖溶液反应，来检测酶的水解活力和转移活力。在低浓度下蔗糖溶液中测定的为总还原糖含量，而在高浓度的蔗糖溶液中测得的值也是总还原糖含量，但是其中大部分是葡萄糖，反应液中的游离葡萄糖含量近似表明了参与转果糖基反应的果糖含量口61。4．5．2总还原糖和葡萄糖测定方法的联用用葡萄糖试剂盒或葡萄糖氧化酶或者葡萄糖感受器测定葡萄糖含量以反应酶的总活力。#j：Somogyi．Nelson【2‘7】法或DNS法和葡萄糖含量的葡萄糖氧化酶法【28】结合，或者将苯酚．硫酸法与葡萄糖分析仪测葡萄糖含量的方法集合，来分别测定总还原糖和葡萄糖含量，依次来计算反应液中游离葡萄糖和果糖含量。这种方法是对DNS法的改进，成本比DNS法高，操作也较为复杂。由于葡萄糖氧化酶的引入使结果存在着产物产率的问题，即生成的葡萄糖也许无法充分被氧化分解生成葡萄糖从而产生较大的误差。4．5．3高效液相色谱法高效液相色谱(HPLC)具有应用广泛、分离效率高、分析速度快等特点，是重要的现代分析手段之一，相对于其他检测B一呋喃果糖苷酶活力的方法，高效液相色谱法具有很高的准确性和灵敏性，但使用成本较高。用HPLC检测一定浓度的蔗糖反应液中的各种糖的含量，来计算酶活力。于国萍【29，30】等用20％(WⅣ)的乳糖和20％(WⅣ)的蔗糖与等体积的酶液混合反应，测定乳果糖的生成量来反应酶的转移活力。邵佩霞【3l】则用测定反应体系中的葡萄糖来衡量酶的转移活力，通过测定反应体系中的果糖和葡萄糖含量来准确测定B．呋喃果糖苷酶的转移活力和水解活力。由于p．呋喃果糖苷酶可以将蔗糖水解为葡萄糖和果糖【231，也可以催化棉籽糖生成蜜二糖和果糖，王介平【32】等利用高效液相色谱法测定蜜二糖的含量来鉴别掺假蜂蜜中残留的B．呋喃果糖苷酶，结果表明当以浓度为25％(w／v)的蔗糖为反应底物时，通过测定反应体系中的果糖和葡萄糖含量可以准确计算p．呋喃果糖苷酶的转移活力和水解活力。 姜威B-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用一95本研究的目的及意义我国是世界蜂蜜生产和出口的大国，年产量约为二十万吨，其中约十万吨出口到美国、欧盟、日本等国家。随着近几年人民生活水平的不断提高，蜂蜜作为良好的功能性食品备受消费者的喜爱，其消费量逐年上升。一些简单的造假方式可以很容易的辨别出，但现在的许多掺假的蜂蜜已经开始以食品安全国家标准中的蜂蜜标准作为参考，以葡萄糖浆、葡萄糖、果葡糖浆等成分为原料，辅助添加蜂蜜香精、色素等进行造假，其造假程度足以以假乱真，不管是旧的检测方法，还是新颁布的蜂蜜国家标准和辨别蜂蜜真伪的同位素鉴定国家标准不仅很难辨别其真假【33】，而且操作复杂，在实际生产生活中不易广泛使用。掺假后的蜂蜜即使各项技术指标符合国家标准也不会具有天然蜂蜜所应有的营养成分，更不会有天然蜂蜜所应有的保健功能和营养功能，甚至危害消费者的身体健康，并严重阻碍了中国蜂业的健康发展。鉴于现有检测掺假蜂蜜方法的诸多缺点以及掺假蜂蜜的危害性，提高蜂蜜质量的市场竞争力，加强对掺假蜂蜜的检测，尤其是对于掺入植物转化糖这一类掺加蜂蜜的检测鉴别就显得格外重要。在工业生产中，p。呋喃果糖苷酶被用来水解蔗糖得到果糖和葡萄糖，如果将这些果糖和葡萄糖掺入蜂蜜后将难以检测，而通过酶联免疫法检测蜂蜜中残留的B．呋喃果糖苷酶有助于确定是否存在植物转化糖类的造假。本研究旨在建立一种快速、灵敏、简便且经济的B一呋喃果糖苷酶酶联免疫检测方法并将其应用于植物转化糖类的蜂蜜掺假检测为目的。建立并确定分泌针对肛呋喃果糖苷酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备亲和力高、特异性强的抗体，在获得针对不同抗原表位抗体的基础上建立双抗夹心法，从而进一步用于检测试纸条的研制。 扬州大学硕士学位论文第二章p．呋喃果糖苷酶纯度及蛋白浓度的测定10_●一p．呋喃果糖苷酶的分子量在55800～89000Da左右，具有较好的免疫原性和反应原性。在免疫小鼠之前首先通过考马斯亮蓝法和BCA法测定p．呋喃果糖苷酶的蛋白浓度并以此为基础建立免疫方法，为之后单克隆抗体的制备奠定基础。I材料与方法I．I主要试剂p．呋喃果糖苷酶(p—fructofurnosidase，EC3．2．1．26，FFS)、牛血清白蛋白(BSA)购白Sigma公司；四甲基乙二醇(TEMED)、甘氨酸(Glycine)、p-巯基乙醇(p-Mercaptoothan01)、-蝴(Glycer01)、TRIS-base、Acrylamide、过硫酸铵(APS)，均购自上海生物工程有限公司；考马斯亮蓝R-250(CoomassieBrilliantBlue)购自国药集团化学试剂有限公司，甲醇、冰乙酸等其他有关的试剂均为分析纯或优级纯。1．2仪器与设备电子分析天平，Sartorius公司；蛋白质定量试剂盒(BCA法)购白普利莱基因技术有限公司；78．1型磁力搅拌器，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；PS．9000705超纯水制备装置(美国Labconco公司)；723光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。1．3主要溶液系统5xTns．甘氨酸电泳缓冲液(pH=8．3)-15．1gTris．base，949甘氨酸，SDS59，加超纯水溶解；定容至1000mL，室温保存。30％聚丙烯酰胺溶液：290g丙烯酰胺，10gN,N"-亚甲双丙烯酰胺溶于600mL超纯水中，加热至37"C溶解，定容至1000mL，0．451xm滤膜过滤，40C避光保存备用。1．0mol／LTris．C1(pH=6．8)-24．22gTris—base溶于超纯水中，用浓盐酸调pH值至6．8，定容至200mL。10％SDS溶液：称59SDS，加超纯水至50mL，微热使其溶解，置棕色试剂瓶中，40C贮存。1．5mol／LTds．HCl(pH=8．8)-Hs碱181．5g，去离子水800mL，用浓盐酸调pH值至8．8，加去离子水定容至1000mL。1．0mol／LTris．C1(pH=6．8)：24．22gTris-base溶于超纯水中，用浓盐酸调pH值至6．8， 姜威13．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用旦定容至200mL。10％过硫酸铵：19过硫酸铵溶于10mL超纯水中，4"C保存，使用两周左右。5xSDS凝胶上样缓冲液：0．6mL1mol／LTris．C1(pH=6．8)，0．5mL巯基乙醇，2mL10％SDS，0．01g溴酚蓝，2．5mL甘油，加入超纯水定容至10mL，4～10"C存放可用数周，．20。C存放可用数月。10％SDS聚丙烯酰胺(分离胶)：1．9mL超纯水，1．7mL30％丙烯酰胺溶液，1．3mL1．5mol／LTris．C1(pH=8．8)，0．05mLlO％SDS，0．05mL10％过硫酸铵，0．002mLTEMED。5％SDS聚丙烯酰胺(浓缩胶)：3．4mL超纯水，0．83mL30％丙烯酰胺溶液，0．63mL1．0mol／LTris．C1(pH=6．8)，0．05mL10％SDS，0．05mL10％过硫酸铵，0．05mLTEMED。考马斯亮蓝G250：100mg考马斯亮蓝溶于50mL95％乙醇中，加lOOmL85％的磷酸，用蒸馏水稀释至lL，之后用滤纸过滤，置于棕色瓶中避光保存。脱色液：90mL甲醇：水(1：1)，10mL冰乙酸。0．2mg／mL的标准蛋白质溶：100．00标准蛋白加生理盐水溶解至100mE，使用时用取1．0mg／mL进行稀释。1．4p-呋喃果糖苷茸纯度的测定p．呋喃果糖苷酶纯度的测定采用SDS．PAGE法，具体步骤如下：(1)首先将凝胶板洗涤干净，晾干后，用无水乙醇擦拭试样格并按说明书安装电泳装置。(2)将5mL配好的10％分离胶加入制胶板中，在胶上轻轻的覆盖一层蒸馏水约1～2mm。(3)30min后分离胶聚合，将蒸馏水吸出，加入5mL的5％浓缩胶。插入试样格时要避免气泡的产生。(4)将B．呋喃果糖苷酶样品与5×样品处理液(样品处理液：样品为4：1)，沸水浴5min，将沉淀物离心。(5)拔出试样格，依次加样。当染料到达离凝胶底部一厘米处时，关闭电源。(6)将胶转移至考马斯亮蓝染液中，慢摇2h，回收染色液后进行脱色2h，边摇边脱色，每隔半小时左右换液一次，最后用清水脱色并过夜。1．5p．呋喃果糖苷酶蛋白浓度测定p．呋喃果糖苷酶的蛋白浓度测定采用考马斯亮蓝法‘341和二辛可宁酸(BCA)法，考马斯亮蓝法首先绘制标准曲线，用O．1mg／mI蜃白标准液作梯度稀释后用于测定，分别测定空白值和测定值，用测定值减去空白值得到真实值，并根据真实值绘制标准曲线。将p-呋喃果糖苷酶样品做梯度稀释测定后计算真实值。BCA"法按照试剂盒说明进行操作。 扬州大学硕士学位论文2结果与分析2．1SDS．PAGE结果在对比不同来源的FFS对比后，购买来自Sigma公司的p一呋喃果糖苷酶，通过电泳图图1显示所购买的D-呋喃果糖苷酶纯度较高，可以作为免疫原免疫小鼠。MFFS2．2酶蛋白质浓度95KD72KD55KD图1SDS—PAGE电泳鉴定Fig．1SDS·PAGEidentificationof13一fructofurnosidase考马斯亮蓝法测蛋白的标准曲线如图2，根据标准曲线计算后得出p一呋喃果糖苷酶的实际蛋白含量为1．2mg／mL。BCA法测定蛋白浓度的标准曲线如图3，根据标准曲线计算后得出p．呋喃果糖苷酶的实际蛋白含量为5．6mg／mL。图2考马斯亮蓝法标准曲线O0O0筋加垢加0 姜威t3．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用旦1．20001．00000．8000N童0．6000o0．40000．20000．00003讨论Fig．2thestandardCUINgofcoomassiebreiliantblueG-2500．00000．20000．40000．60000．80001．0000标准蛋白浓度图3BCA法标准曲线Fig．3thestandardcurveofBCA考马斯亮蓝法G-250[34】是1976年由Bradord首先建立的，它是以G．250三种离子形式的变化为基础的，Compton等人提出G．250以三种形式的离子(阳离子、阴离子以及兼性离子)存在。它们的最大吸收峰不同并且呈现的颜色也不同。因此凡是影响三种离子平衡的试剂均可引起干扰，从而改变测定值。G．250阳离子净转变为阴离子的潜力决定反应的直线性，阳离子浓度最终将限定测定的直线范围。干扰Lowry法和荧光胺法的游离氨基酸不会干扰本法，干扰Lowry法的几种物质如钾离子、镁离子、Tris、巯基试剂、EDTA和蔗糖都不会影响本法。在工业生产中获得的B．呋喃果糖苷酶是经过浓缩纯化(乙醇法、热处理、超滤浓缩等)以及固化(戊二醛．海藻酸钠交联法、海藻酸钠包埋法等)等流程后获得的，生产p．呋喃果糖苷酶的碳源多为蔗糖，在得到的酶产品中不可必免的含有较多的蔗糖等物质。另外p．呋喃果糖苷酶有3种(酸性、碱性以及中性)不同的存在形式，而考马斯亮蓝法主要用来测定碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基较多的蛋白质。因此在本实验中用考马斯亮蓝法测得的蛋白浓度结果明显偏低不够准确。二辛可宁酸(BCA)法是近年来广为应用的蛋白定量方法，其原理与Lowery法相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Ca2+还原成Cul+。BCA与Cul+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的吸光值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与考马斯亮蓝法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性良好，并且受干扰物质影响小，最显著的优点是不受去垢剂的影响。本实验中通过BCA法测定后得到的蛋白浓度为5．6mg／ml，SDS．PAGE结果表明蛋白纯度很高，可以作为免疫原进行小鼠免疫。 扬州大学硕士学位论文第三章p-呋喃果糖苷酶抗体的研制及鉴定14__一用常规免疫的小鼠脾细胞进行细胞融合，经过单克隆抗体技术及酶联免疫检测技术筛选出能够稳定分泌抗p．呋喃果糖苷酶的单克隆抗体杂交瘤细胞9株，经过4次亚克隆后扩大培养并冻存。选取其中4株制备腹水，建立ELISA方法。I材料与方法I．I主要试剂D．呋喃果糖苷酶、弗氏完全、不完全佐剂(Freund’SAdjuvantcompleteorincomplete)、50％PEG溶液(10t36k2321)、次黄嘌呤(Hypoxanthine，H)、胸腺嘧啶核苷(Thymidine，T)、氨基喋呤(Aminopterin，A)、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(Goatanti—mouseIgG-HRP)均购自Sigma公司；新生牛血清(已灭活)，购自山东银香国际有限公司；DMEM(Dulbecco’SModifiedEagleMedium，lot1331089)，购自GIBCO公司；明胶、牛血清白蛋白、二甲基亚砜(DMSO)、尿素过氧化氢(Ureahydrogenperoxideadduct)购自上海生工生物技术工程服务有限公司；其它相关试剂均为优级纯或分析纯。1．2仪器与耗材Sunrise酶标仪(Tecan公司)；C02"叵温培养箱(美国FormaScientific)；电子天平(Sartorius公司)；5810R型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；HJ．型磁力搅拌器、水浴恒温振荡器(江苏金坛国华仪器厂)；台式低速离心机0406．1型(上海医疗器械有限公司)；KY-KI微型空气压缩机、细菌滤器(浙江绍兴微型医疗设备有限公司)；超低温冰箱(SanYoElectricBiomedicalCo．Ltd)；96孔、24孔细胞培养板(Greiner公司)；倒置相差显微镜(U2000，Nikon)；超纯水制备装置(美国LABCON公司)；YJ．875B型医用净化工作台(苏州金燕净化设备厂)；细胞培养瓶、改良牛鲍氏血细胞计数板YDS．35．125型液氮生物容器(成都金凤液氮容器有限公司)；旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)；96孔酶标板(丹麦NUNC公司)等。1．3实验动物和生物材料6～7周龄雌性BALB／c小鼠，7周龄雌性ICR小鼠，由扬州大学兽医学院比较医学中心提供。SP2／0骨髓瘤细胞，本实验室保存。 姜威13-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用堕1．4主要溶液系统包被缓冲液(碳酸盐溶液)：取0．2mol／LNa2C038mL，与0．2mol／LNaHC0317mL混合，再加75mL双蒸水，调pH值到9．6。稀释缓冲液(0．01mol／LPBS，无钙和镁)：2．99Na2HP04·12I-120，0．29KH2P04"2H20，O．29KCL，8．09NaCL，加双蒸水至1L，调pH值7．O～7．2。洗涤缓冲液(PBS．Tween20，0．5‰)：Tween．200．5mL，加入到1L稀释缓冲液(PBS)中，搅拌混匀，调pH值到7．0～7．2之间。底物缓冲液(0．2mol／LPB，pH5．2)：取0．2mol／LNa2HP04溶液3mL，0．2mol／LKH2P04溶液97mL，混匀，调pH至5．2。20x底物使用液A：取TMB21mg，充分溶解于5mL乙醇中。100x底物使用液B：取尿素过氧化氢(Ureahydrogenperoxideadduct，UHP)16．5mg，溶解于lmL双蒸水中。终止液(2mol／LH2S04)：双蒸水178．3mL，滴加浓硫酸(98％)21．7mL。不完全DMEM培养基：DMEM(1L包装)粉剂1袋，超纯水1000mL，NaHC033．79，lmol／L盐酸调节pH值到7．O～7．2，过滤除菌，分装4"C保存。20％完全DMEM培养基：不完全DMEM培养基80mL，小牛血清20mL，无菌条件下配制。HT培养基：完全DMEM培养基99mL，加100xHT贮存液lmL，无菌条件下配制。HAT培养基：完全DMEM培养基98mL，加100xHT贮存液lmL，lOOxA贮存液lmL，无菌条件下配制。氨基喋呤(A)贮存液(100x)：称取1．76mg氨基喋呤(Aminopterin)溶于90mL超纯水中，滴加lmol／L的NaOH0．5mL中和，再补加超纯水到100mL。过滤除菌，分装小瓶，．20"C保存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100x)：称取136．1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine，H)和38．8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine，T)，加超纯水到100mL，置50。C水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，．20。C冻存。8．氮杂鸟嘌呤贮存液(100x)：配置10‘2moFL8．氮杂鸟嘌呤分装，．20"C冻存。青、链霉素(双抗)溶液(100×)：取青霉素100万单位和链霉素19，溶于100mL灭菌超纯水，分装，．20℃冻存。饱和硫酸铵溶液：称取429无水硫酸铵加入50"C蒸馏水50mL，待完全溶解后趁热过滤，冷却后用浓氨水调pH至7．4即可。醋酸盐缓冲液(O．06mol／LHAc-NaAc，pH4．8)：称取0．4929无水醋酸钠，加入240pL冰醋酸，加水定溶至179mL，用2mol／LNaOH调pH至4．8即可。结合Buffer：用61mLA液(将0．7169Na2HP04溶于100mL超纯水中)，39mLB液(将0．3129N棚2P04溶于100mL超纯水中)，混合A液与B液调pH为7．0即可。 扬州大学硕士学位论文洗脱Buffer：50mLB液(1．59Gly溶于100mL超纯水中)与A液(8．62mL浓盐酸稀释至500mL)混匀后调pH至2．7，用超纯水定容至100mL。Tris．HCh12．1lgTris加80mL超纯水用浓盐酸调pH至9．0，定容100mL。TBS-T：2．429Tris碱，89NaCl，加入800mL去离子水，调节pH值至7．6，加0．5mLTween．20，加水定容至1000mL。电转移冲液：2．925g甘氨酸，5．813gTris-base，3．75gSDS，加200mL甲醇，加水至总量为1000mL：膜封闭液：用0．05％Tween．20现配的5％脱脂奶粉1．5单克隆抗体的制备1．5．1动物免疫采用商品化的弗氏完全佐剂和不完全佐剂与p-呋喃果糖苷酶混合进行小鼠的常规免疫，参考相关文献制定相关免疫程序，具体操作如下表4表4小鼠常规免疫程序Tab．4immunizedprogramofmousebyroutineway注：分别在三免后7d和五免后7d采血测效价及抑制情况1．5．2细胞融合及培养融合前10d复苏SP2／0骨髓瘤细胞，用加入20％dx牛血清的DMEM培养基培养。当细胞呈对数生长时，细胞状态良好，大小均一，浑圆透亮，形状规则，排列整齐，边缘清晰，呈半致密分布。此时，按照1：3的比例稀释传代，一般每两天进行一次传代或扩大培 姜威B．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用旦养，最后选取状态良好、生长旺盛、处于对数生长期的细胞进行融合。1．5．2．2饲养细胞的准备融合前1d选取7周龄健康的雌性ICRdx鼠，拉颈处死，置于75％乙醇中浸泡5min。在超净台中剪开腹部皮肤，掀起后充分暴露腹膜，用注射器将约10mLHAT培养基注射到小鼠腹腔中，轻轻按摩腹部两侧lmin左右，最后将含有小鼠腹腔细胞的HAT培养基抽出至100mL玻璃瓶或细胞培养瓶中，计数细胞并调整浓度在4x105左右，再滴加至96孔板中，每孔100IIuL，放入37。C，5％C02恒温培养箱中，24h后融合使用。1．5．2．3细胞融合、按照刘秀梵【35】介绍的方法将骨髓瘤细胞与脾细胞融合。将PEG溶液、30mL不完全培养基、80mLHAT培养基进行37。C预热。将之前选定的骨髓瘤细胞用DMEM吹下，收集并离心(1200r／min，5rain)，弃去上清后，将细胞重新悬浮于10mL不完全培养基中，细胞计数。取免疫的BALB／c小鼠，眼球采血，制备阳性血清(37℃水浴30min)，拉颈处死后，浸泡在75％乙醇中5一-10min，在超净台内无菌操作取出脾脏。将取出的脾脏置于10mL不完全培养基中，轻轻研磨，制成脾细胞悬浮液，离心(1200r／min，5min)重悬后进行细胞计数。将上述准备好的脾细胞与骨髓瘤细胞加入50mL融合管中，离心(1200r／min，5min)弃上清后，轻轻分散沉淀细胞。在37。C的水浴中进行融合，首先将已37℃预热的50％PEG在60s内N入到融合管中，边加边摇，静止90s后，用37。C预热好的不完全培养基进行终止，加完后37。C水浴静止10min。离心(500r／rain，10min)后弃去上清，加入适量HAT培养基后轻轻混匀融合后的细胞，补加m叮培养基后分装与96孔细胞板中，每孔2～3滴，置于37。C，5％C02恒温培养箱中。24h后观察细胞孔有无污染，4,-一5d后可根据情况继续补加HAT培养基或半数换液，7～9d后将HAT培养基换成HT培养基，之后每天注意观察杂交瘤细胞的生长状况，待细胞长到全孔面积的40％～50％时进行阳性细胞筛选。1．5．2．4包被抗原工作浓度、封闭液以及阳性血清效价的确定利用方阵实验确定包被抗原的工作浓度以及最佳封闭液，将包被抗原和阳性血清均按比例稀释成不同的浓度梯度，按照方阵实验确定包被原的最佳工作浓度和阳性血清效价。取96孔酶标条，按上述方法加入所确定的抗原包被浓度包被酶标条，2h后洗涤拍干， 扬州大学硕士学位论文然后加入不同浓度小牛血清、明胶、OVA溶液封闭，37。C作用2h或4。C过夜，洗涤拍干后，设置阴性(N)、阳性(P)以及空白对照(空白对照直接加入酶标二抗)，反应后显色终止，依据空白最浅(应基本无色)、P／N>2，挑选出最佳的封闭液。1．5．3杂交瘤细胞的筛选以及建株1．5．3．1阳性孔的筛选采用间接ELISA筛选阳性孔，先用iELISA筛选出阳性孔，在挑选检测OD值较高的控进行进一步的检测，排除假阳性孔，将经过3次连续检测为阳性的阳性细胞株扩增，即使冻存和亚克隆。1．5．3．2杂交瘤细胞的亚克隆培养及建株采用有限稀释法【361进行亚克隆，亚克隆的筛选方法同1．5．3．1，当每块板的阳性率到达100％时，可以得到稳定的细胞株再将其逐步扩大培养并及时大量冻存。1．5．4杂交瘤细胞株稳定性试验对已经亚克隆建立的杂交瘤细胞株进行进一步的稳定性试验。在体外连续传代培养30代和冻存6个月后复苏培养，取细胞液上清检测抗体效价。检测体外连续传代培养和较长时间的冻存对杂交瘤细胞的抗体分泌能力是否产生影响。1．5．5腹水的制备采用动物体内诱生单克隆抗体的方法进行腹水的制备，选取8周龄的ICR雌性小鼠，按照每只0．5mL的灭菌液体石蜡进行腹腔注射，7～10d后腹腔注射以不完全培养基稀释的杂交瘤细胞(处于对数生长期)，3x105(0．5mL)／只。之后每天关注小鼠腹水的产生情况，约7ddx鼠腹部膨胀到一定程度，用12号针头采集腹水，离心弃去上层脂肪、下层细胞以及其他沉淀物，取中间澄清液体，．70。C保存备用。 姜威13．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用旦1．6单克隆抗体性质的鉴定1．6．1腹水的纯化采用辛酸．硫酸铵法【37’3引和按NHiTrapProteinGHP纯化柱的说明书两种方法进行纯化腹水，辛酸．硫酸铵法操作如下：用醋酸钠缓冲液(0．06mol／L，pH4．8)将2mL腹水稀释3倍，将稀释好的腹水置于4。C，逐滴加入669L正辛酸，并用磁力搅拌器搅拌30min离心后取上清，加入约为上清体积额1／10的O．1mol／L的PBS，并用1．0mol／L的NaOH调节pH为7．4左右，然后在温度为4℃的条件下磁力搅拌，并逐滴加入等体积的饱和硫酸铵溶液(pH=7．4)，静置6h，然后离心弃去上清，将沉淀溶液溶解于2mL0．01mol／LpH为7．4的PBS中透析除盐，提纯后的样品．20。C保存。HiTrapProteinGHP纯化柱具体操作如下：首先处理腹水，将腹水与结合缓冲液按1：8稀释，用0．45I_tm滤纸过滤或者4℃过夜，3000r／rain，离心5min，离心两次；将预先要收集洗脱液的EP管中加入lmol／LpH值为9．0的Tris．HCl，每管60此；在注射器中加满结合缓冲液，将注射器通过该提供的接头和柱子相连接，拧开柱子上口的开端，用lO倍体积的集合缓冲液以0．6mL／min的速度冲洗柱子。冲洗平衡后用注射器加处理的腹水5mL(0．5mL／min)，再用10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子直到没有物质流出，并重复一次。然后用5倍体积的洗脱缓冲液洗过脱，保存收集液体，再用5倍体积的结合缓冲液冲洗平衡柱子，为了防止滋生微生物用5倍体积的20％乙醇冲洗柱子，柱子中充满20％乙醇，保存在4。C底部，用专用接口拧紧封口，最后痕量分光光度计测定蛋白浓度并记录数据。1．6．2纯化前后腹水中蛋白质浓度的测定采用考马斯亮染色法测定蛋白浓度，用牛血清白蛋白作为标准蛋白，制定标准曲线，对照标准曲线计算出腹水中的蛋白质浓度。1．6．3抗体特异性的鉴定Western-blot检测纯化后的抗体的特异性：先FFS溶液SDS．PAGE电泳结束后，取下凝胶，在去离子水中漂洗一下。剪取与转印凝胶同等面积的硝酸纤维素膜和两层滤纸，在去离子水及转印缓冲液中浸泡各5min。负极一层Whatman滤纸，然后放凝胶，再放硝酸纤维素膜、膜上再放一层Whatman滤纸(阳极)，做好标记，赶尽各层之间的气泡；置半湿转印系统中转印，50V，2．5h。封闭时，转印结束后， 扬州大学硕士学位论文拆下转印装置，用去离子水漂洗一下NC膜，在封闭液中4"C封闭过夜；用PBST洗3次，每次5min，之后加入一抗，血清为一抗(1：100封闭液稀释)，NC膜放入其中，37℃作用2h；用PBST洗3次，每次5min。再加加二抗：NC膜放入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1：8000稀释)溶液中，37℃作用2h；用PBST洗3次，每次5min，最后将NC膜转移至新鲜配制的底物显色液(10mLPBS+6mgDAB+1501．tL30％H202)中避光显色20min，用蒸馏水冲洗终止反应。1．6．4单抗亚类鉴定按鼠类单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书进行操作。操作中腹水作1：75000稀释，上清作1：50稀释。测定OD450的值。以OD450读值明显高于其他孔所加亚类试剂为单抗所属亚类类型。1．6．5单抗表位抗原的分析参照文献【39,40]所提供的方法进行ELISA相加试验。样品为腹水，加入方法为：首先每株腹水以每孔50pL单独加入孔中，并补加501．tL稀释液，然后将两株腹水按每孔501aL混合后加入孔中，其他方法如ELISA方法。抗体之间产生相加效应的程度用指数(柚表示，其计算公式为：AI=『塑塑生-11×100其中Al、A2分别为ELISA相加实验中单独加入的第一株腹水和第二株腹水所得的OD值，而Al+2)则是同时加入该两株上清所得的OD值。结果以相加之数(m)大于或者小于50％判定，当趾值大于50％时，具有相加性，说明针对不同表位，小于50％时，无相加性，即针对相同或者相近表位。1．6．6抗体效价的测定采用iELISA测定腹水中的抗体效价1．7ELISA检测方法的建立1．7．1iELISA操作程序采用iELISA检测抗体效价，主要步骤如下： 姜威13-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用型(1)包被：用CBS包被的抗原做系列稀释，按每孔100pL加入，37"C水浴2h，之后用PBST洗涤3次，每次5min，拍干。(2)封闭：用2％的明胶(0．01mol／LpH7．4PBS稀释)作为封闭液，满孔封闭，37"C水浴封闭2h，PBST洗涤3次后拍干。(3)加一抗：用0．01mol／LPBS稀释液将样品做系列稀释，按每孔lOOpL加入，同时用阴性血清做阴性对照，稀释液做空白对照。37℃水浴lh，PBST洗涤5次后拍干。(4)加酶标二抗：将羊抗鼠IgG酶标二抗用稀释液稀释至工作浓度，按每孔lOOpL加入，37℃水浴lh，PBST洗涤5次后拍干。(5)显色：每孔加入1001aLTMB，37℃避光显色15rain。(6)终止：每孔加入50皿2mol／LH2S04。(7)读值：在450rim波长下测定每孔的OD值并记录。结果判定：以样品血清孔的OD450值在1．0左右，P／N值在2以上并呈现最大者的反应条件作为确定ELISA最佳反应条件的判定依据(P表示待检样品血清孔的吸光度值；N表示阴性对照血清孔的吸光度值)1．7．2抗原抗体工作浓度的确定用包被抗原和腹水分别作系列浓度稀释，做方阵试验，确定包被抗原和腹水的最佳工作浓度。1．7．3酶标单抗的制备及工作浓度的确定及其工作浓度的确定采用简易过碘酸钠法【4l】标记McAb．1D6F2。具体操作步骤：(1)称取2．5mgHRP溶于lmL超纯水中，再加入0．1mL新配的0．1mol／LNal04溶液，室温下避光搅拌20rain，之后用醋酸钠缓冲液(ImmoULpH4．4)4"C透析过夜。(2)加碳酸盐缓冲液(113I皿0．2mol／LpH9．5)，使pH升高到9．O～9．5，立即加入5mgIgG抗体，在碳酸盐缓冲液(1mLO．Olmol／L)中，室温避光搅拌2h。再加0．05mL新配的4mg／mLNaBH4液，混匀，4"C静置2h。转入透析袋中，用浓度为0．15mol／L，pH值为7．4的PBS在40C条件下透析过夜。(3)过夜后边搅拌边逐滴加入等体积的饱和硫酸铵，4"C静置1h后离心(3000r／min，30min)，取沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次，最后将沉淀物溶于少量O．15mol／LpH7．4的PBS中。将溶液转入透析袋中，用O．15mol／LpH7．4的PBS透析。(4)将上述溶液在4"C下离心(10000r／min)30min，去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装，．70。C保存备用。采用方阵的方法确定酶标单抗的工作浓度，以OD450值接近1的酶标抗体稀释倍数作为其工作浓度。 扬州大学硕士学位论文2结果及分析2．1包被抗原工作浓度、封闭液以及阳性血清效价的确定。通过ELISA方阵实验测得包被抗原的最佳工作浓度为1：4000，阳性血清效价为1：8000．用上述抗原浓度包被，用不同浓度的小牛血清、明胶和OVA作为封闭液进行封闭实验。结果如下表5：表5封闭试验结果Tab．5：Determinationofoptimalblockingsolution封闭液BSA(％)OVA(％)明胶(％)浓度％5101551015124P1．1361．1771．2141．1231．1401．1651．0161．1291．1010DN0．131O．1350．1780．1460．1520．1630．1240．1160．129空白0．0940．0880．089O．1190．0950．0970．0960．0860．084P／N8．678．716．827．697．327．148．199．738．53通过上述结果可以看出选用2％的明胶作为封闭液效果最好，P／N值最高，空白值很低。2．2单克隆抗体细胞株的建立及其稳定性选择五免后的小鼠尾尖采血测血清效价，结果表明效价可达1：8000。小鼠冲击3d后，取小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，接种于96孔细胞培养板中，融合的克隆细胞状态良好，融合率可达98％以上。筛选阳性值高且克隆数目比较少的进行克隆，通过3次亚克隆后，筛选出9株杂交瘤细胞株，分别命名为1D6F2、8F8C5、8F8A9、1D6D12、8F8G3、8F8A6、8F8F10、1D6810、1D6811。经过体外连续传代培养30代和冻存5个月后复苏培养，上清中的抗体效价基本不变，表明其稳定性良好。2．3腹水的制备选取处于对数生长期的4株细胞(1D6F2、8F8C5、8F8A9和1D6D12)注入ICR雌性小鼠腹腔，共制备腹水约90mL。2．4单克隆抗体的鉴定2．4．1腹水蛋白浓度的测定和纯化用考马斯亮蓝法测定腹水(1D6F2)纯化前的蛋白浓度为29．5mg／mL。经过辛酸-硫酸铵法和纯化柱纯化后的蛋白浓度分别为18．64mg／mL和10．82mg／mL 姜威B一呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用2．4．2抗体特异性的鉴定用免疫原FFS进行SDS．PAGE电泳，用4株杂交瘤细胞(1D6F2、8F8C5、8F8A9和1D6D12)的培养上清进行1：100稀释作为一抗进行Western．blot试验，结果如下图4。M细胞上清95KD72KD55KD2．4．3抗体亚类的鉴定图4单抗的Western．blot鉴定Fig．4Western．blotofMcAbs将腹水做1：75000稀释，细胞上清作1：50稀释，按鼠类单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书进行亚类鉴定，结果如下表6，检测的6株抗体亚类全部为IgG2a，除1D6D12和1D6F2是K轻链外，其他4株全部为九重链。表6亚类鉴定结果Tab．6isotypingofMcAbs亚类鉴定1D6F2IgG2a8F8C5IgG2a8F8A9IgG2a1D6D12IgG2a8F8G3IgG2a1D6811IgG2a2．4．4单抗表位抗原的分析针对6株单抗(1D6F2、8F8C5、8F8A9、1D6D12、8F8G3和1D6811)进行相加试验，分别测定其OD450如表7。 扬州大学硕士学位论文表7相加试验结果Tab．7DeterminationofadditivityindexofthereactionbetweentwoMcAb从上表中甜值可以看出，1D6F2、1D6D12、8F8G3、1D6Bll是针对一种相同抗原表 姜威13一呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用位，而8F8C5和8F8A9是针对另一种相同抗原表位的，因此选用1D6F2和8F8A9作为双抗夹心法的抗体。2．4．5抗原抗体工作浓度的确定用FFS包被后，用4株杂交瘤细胞制备的腹水做稀释后做方阵实验。结果表明包被抗原和抗体的最佳工作浓度都为1：8000，1D6F2、8F8C5、8F8A9和1D6D12四种腹水的最佳工作浓度分别为1：16000，1：8000，1：10000和1：4000。2．4．6奠标单抗工作浓度的确定以OD450值接近1．0的稀释倍数作为其工作浓度，结果表明McAb．1D6F2的工作浓度为1：1600。3讨论3．1单抗的制备首先常用的免疫途径有皮下、皮内、腹腔、静脉、脾脏和淋巴结免疫的等方法，对抗原的吸收速度为：静脉=脾脏=淋巴结>腹腔>皮下>皮内。皮内注射容易引起细胞免疫反应，有利于抗体的产生，通常认为半抗原适合皮肤多点注射[421。腹腔内的血管分布广泛而稠密，有利于免疫原的吸收，可以提高免疫速度，产生高效价血清本实验采用腹腔注射与皮下注射相结合的方法进行小鼠免疫。在免疫小鼠开始时，分别采用不同剂量、不同方法对小鼠进行免疫，剂量分为四个梯度30、50、100和15099／只。免疫方法有两种，一种是每次免疫的剂量相同，另一种是免疫剂量随着免疫次数的增加而增加，如首免3099／只，二免增加到40pg／只，三免增加为50I_tg／只。结果显示当免疫剂量达到1001．tg／只时，小鼠的血清效价最高，剂量过低或过高，会导致没有免疫应答或者免疫，因此选择以50I．tg／只作为首免剂量并逐步增加到100pg／只的免疫方法。其次细胞融合是单抗制备过程中最基本也是最重要的一环。本实验采用由聚乙二醇(PEG)介导的化学融合方法，因此排除了病毒的污染问题并且对特殊仪器没有要求。融合之前要注意观察骨髓瘤细胞的状态，选择状态良好(边缘轮廓清晰、细胞浑亮透明、贴壁生长且大小均一)、无污染、处于对数生长期和传代初期的细胞，因为SP2／O生长状态的好坏直接影响了细胞融合的成败以及杂交瘤细胞生长的好坏。骨髓瘤细胞与脾细胞的比例从1：2到1：10不等，常用的比例为1：4。在融合过程中，滴加PEG之前，要充分的将离心好的细胞打散，保证融合细胞充分暴露于PEG中，并尽量将培养基吸干净，防止培养基稀释PEG。滴加过程中的速度、反应 扬州大学硕士学位论文时间等都会直接影响融合的效果，因此需要操作人员的细致与精确。融合结束后对96孔板的各种动作要轻柔，因为融合细胞的生命力是非常脆弱的，要尽量减少移动，以免打散融合好细胞，在观察融合状况时也要小心翼翼。对于无菌操作要求必须严格，以免因污染而导致几个月的实验成果丧失。再次，融合成功后要注意观察细胞液的颜色、融合细胞的状态以及克隆的数量，及时补液和换液。细胞在融合后15d左右会出现不稳定的现象，导致阳性克隆不分泌抗体，因此在培养上清检测之前换液2～3次，以防止出现假阳性。在选择阳性孔时要选择单克隆，并多次克隆，防止假阳性的出现，即使有一个孔未显色也要进行亚克隆，并对需要亚克隆的阳性孔进行扩大培养并冻存，防止因污染而导致整个实验的前功尽弃。对于筛选出来的细胞株要及时冻存。细胞筛选是个费时费力的工作，需要实验者极大的耐心和细致。最后，复苏细胞时对于温度的要求比较高，要快速准确的融化冻存的细胞，减少对冻存细胞株的浪费。复苏后的细胞培养上清液和制备的腹水都要保存。在制备腹水的过程中，因为小鼠的个体差异以及人员操作等问题导致每只小鼠的腹水量不同，在抽取一次腹水之后，不少小鼠腹部异常膨大，导致只能采一次腹水。因此，本次实验每株细胞选取4只小鼠制备腹水。第2次采腹水时就将腹腔打开，直接抽取，保证腹水的不浪费。3．2抗体的鉴定在抗体的鉴定过程以及制备的过程中ELISA的操作占据了大部分的时间，因此对于其操作的规范要求就显得格外重要。首先是串孔问题，导致串孔现象的原因有很多，但大部分都是由于洗板时，洗液加的过多导致溢出，从而出现串孔，吸水纸由于多次使用导致其较为潮湿，使拍干时出现串孔。因此在洗板和拍干时要格外注意。另外对于时间的把握以及光线的要求都要准确，减少实验数据的误差。自从1975年淋巴细胞杂交瘤技术出现以来，这一技术就在生物学领域迅速推广，但是在许多研究和应用中，首先遇到的问题就是单克隆抗体的纯化问题。在小鼠的腹水中出，来含有特异性的单克隆抗体外，还含有多种杂蛋白【431，因此就必须对其进行纯化，以获得免疫活性较高、纯度较高的单克隆抗体。目前单克隆抗体的纯化方法比较多，但因各种单抗理化性质的差异导致纯化的方法和效果都不相同。本实验采用辛酸一硫酸铵法和纯化柱两种方法，结果表明纯化后的蛋白质浓度大幅度下降表明杂蛋白被大量滤除，用辛酸-硫酸铵法纯化后的抗体纯度不如使用纯化柱的抗体纯度高，但纯化柱的成本较高，因此在生产和生活中要根据自身情况选择合适的纯化方法。在相加试验中，如果两种单抗针对同一抗原表位，则AI为O；如果两者针对完全不同的两种抗原表位则灿为100。根据m值的大小可以判断两种单抗所识别的抗原表位情况。在本实验中1D6F2、1D6D12、8F8G3、1D6811是针对一种相同抗原表位，而8F8C5和8F8A9是针对另一种相同抗原表位的，其中1D6F2、1D6D12和1D6Bll的相加指数很小，接近0，很可能是针对同一抗原表位，而8F8G3与这三种单抗的相加指数仅仅小于50％，表示8F8G3 姜威13-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用一27与1D6F2、1D6D12和1D6811所识别的抗原位点接近。对于8F8C5和8F8A9两种单抗，其相加指数表明其可能针对的是两种相近的抗原表位。相加试验已经证明本次实验获得了至少两种针对不同抗原表位的抗体，因此选用腹水效价较高的1D6F2和8F8A9两株针对不同抗原表位的抗体作为双抗夹心法的抗体。过碘酸钠法是一种简单、高效、快速的辣根过氧化物酶标记抗体方法，根据文献所述方法，在低PH时进行过碘酸钠氧化HRP，省去了用二硝基氟苯封闭HRP的过程，经过氧化后的醛化酶与抗体在透析袋中对碳酸缓冲液透析使之结合，最后用NaBH4将其还原成稳定的酶标结合物。在酶标的过程中，标记抗体时活性、浓度、用量、温度等都有较高的要求，因此要严格控制。对于HRP的第四章双夹心ELISA方法的建立和应用在筛选出两种针对不同抗原表位的细胞基础上，选取1D6F2和8F8A9两株作为抗体建立双抗夹心ELISA法，用来检测蜂蜜中是否存在p．呋喃果糖苷酶掺假现象。1材料和方法1．1实验样品洋槐蜂蜜，购自扬州大学实验蜂场。1．2试剂和仪器新生牛血清，购自山东银香国际有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(Goatanti-mouseIgG．HRP)，购自Sigma公司；二甲基亚砜(DMSO)、尿素过氧化氢(Ureahydrogenperoxideadduct)、明胶，购自上海生工生物技术工程服务有限公司；TMB(Tetrarnethylbenzidine)，购自BBI公司；其它相关化学试剂均为优级纯或分析纯；5810R型台式高速冷冻离心机(德国eppendorf公司)；Sunrise酶标仪(Tecan公司)；96孔酶标板条(江苏省通州市南兴申海玻仪厂)；HJ．型磁力搅拌器(江苏金坛国华仪器厂)；旋涡混合器(上海沪西分析仪器厂)；超低温冰箱(SanYoElectricBiomedicalCo．Ltd)。1．3双抗夹心法的建立首先用McAb．8F8A9包被板条，每孔100vL，4℃过夜或者37*C水浴2h，}毛jPBST洗板3次后拍干。然后用明胶封闭，37。C水浴2h，PBST洗板3次后拍干。再力【lfi．McAb-1D6F2，每孔1001xL，37。C7燃lh，PBST洗板五次后拍干。之后用TMB37℃避光显色15min，最 扬州大学硕士学位论文后用2mol／LH2S04每孔加入50rtL终止反应并测定OD450，保存并记录。以待测抗原孔的OD450值在1．0左右，P／N值呈现最大者的反应条件作为确定ELISA最佳反应条件的判定依据(P表示待检抗原的吸光度值；N表示阴性孔的吸光度值)1．4包被抗体的选择分别用McAb．8F8C5和McAb．8F8A9抗体包被板条，重复1．3中的步骤，比较两种抗体包被对结果的影响，选择最适包被抗体。1．5双抗夹心ELISA反应条件的选择1．5．1抗体最佳包被浓度的确定通过方阵实验确定包被浓度，以待测抗原孔的OD450值在1．0左右，P／N值呈现最大者的反应条件作为ELISA最佳反应条件的判定依据。1．5．2最佳封闭液的确定用不同浓度的OVA、BSA以及明胶做封闭液，同时设置阳性(P)孔、阴性(N)孔以及空白对照组，选取P／N最大且空白颜色最浅的封闭条件最为最适封闭液。1．5．3抗原抗体的最佳稀释度的确定用最佳抗体的最佳包被浓度包被酶标板，抗原和抗酶标抗体均作系列稀释，方阵试验确定抗原和酶标抗体的最佳稀释度，具体操作步骤见1．3。以P／N值进行判定抗原和酶标抗体的最佳稀释度。1．6双抗夹心ELISA特异性鉴定分别使用p．呋喃果糖苷酶(FFS)、阴性FFS、菊粉果糖基转移酶(礤T)和淀粉糖化酶(GA)作为检测样品，做双抗夹心ELISA实验来判断是否有交叉反应。1．7样品基质干扰检测用空白样品分别作1、4、8、16倍稀释，添加系列浓度的药物，添加量分别为0、5、10、20、40、80、160ng／mL的FFS溶液，比较样品基质对ELISA检测的影响情况。 姜威13．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用望1．8敏感性试验分别用间接ELISA和双抗夹心ELISA法测定样品的效价，根据效价高低判定双抗夹心的敏感性。1．9样品添加回收试验1．9．1标准曲线的确定以特异性单抗的最佳浓度和酶标单抗最佳稀释度，添加系列浓度的药物：0，5，10，20，40，80和160ng／mL的FFS溶液进行双抗夹心ELISA试验，以药物浓度的对数为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。1．9．2回收率的测定根据检测范围确定加标浓度，对样品分别作5、10、20ng／mL三个加标浓度回收率测定[441。回收率=[样品测定值．空白样品测定值]／已加入标量x100％。2结果及分析2．1包被抗体的选择1．41．210．80．6O．40．20图5双抗夹心法不同包被抗体直方图Fig．5Thehistogramofdifferentantibodiesindouble-antibodysandwichELISA 扬州大学硕士学位论文分别用McAb．8F8C5和McAb．8F8A9抗体包被板条，比较不同抗体包被原对测定结果的影响，结果如图5，可以看出McAb．8F8A9作为包被原OD值更高，因此选用McAb．8F8A9作为包被抗体，建立双抗夹心法。2．2双抗夹心ELISA反应条件的选择通过方阵实验确定包被单抗的最佳包被浓度为16mg／mL，FFS溶液的最佳稀释倍数为1：200，抗FFS酶标单克隆抗体的最佳稀释倍数为1：800，最佳封闭液为2％明胶。2．3双抗夹心ELISA特异性的鉴定分别使用p一呋喃果糖苷酶(FFS)、阴性FFS、菊粉果糖基转移酶(IFT)和淀粉糖化酶(GA)作为检测样品，进行双抗夹心ELISA特异性的鉴定，结果表明无交叉反应。结果如下图6一圉FFS+FFS——IFTGA图6双抗夹心ELISA特异性直方图Fig．6Thespecializationhistogramofdouble—antibodysandwichELISA2．4样品机制干扰检测结果空白样品分别作1、4、8、16倍稀释，添加系列浓度的药物，添加量分别为0、5、10、20、40、80、160ng／mL的FFS溶液，比较样品基质对ELISA检测的影响情况。具体结果如下图7，从图中可以看出先做8倍稀释然后再进行双抗夹心ELISA法检测。42l86420lO0 ——．姜威B-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用1．61．41．2l0．80．60．4O．20O2．5敏感性试验结果204080160图7不同稀释倍数时样品加标曲线Fig．7thecurvesofdifferentdilutionofsampleextract分别使用间接ELISA和双抗夹心ELISA法检测样品效价，具体结果如下表8，从表中可以看出双抗夹心ELISA法检测样品的敏感度更高。表8两种实验方法的敏感性Tab．8Thesensitivityofthetwotestmethods检测方法样品1样品2样品3样品4间接ELISA法1：201：401：801：160双抗夹心ELISA法1：401：801：1601：3202．6标准曲线的确定标准曲线的具体结果如下图8，其线性方程为y：一0．2359x+0．6421(R2=0．9878) 扬州大学硕士学位论文00．5l1．522．53图8抗原检测标准曲线Fig．8Thestandardcurveofantigendetection2．7添加回收率及重复性将样品液作8倍稀释后，在蜂蜜样品中分别添加5、10、20ng／mL的FFS溶液，用图7中所得的标准曲线测定回收率，具体结果如下表9表9样品中回收率的测定Tab．9therateofrecoverybyELISAassayofsample3讨论近年来随着蜂蜜掺假的不断出现，对于蜂蜜掺假检测要求的呼声也是越来越高。本实验建立的双夹,巴‘,ELISA检测方法，使用了自己制备的酶标抗体，它具有比间接竞争ELISA敏感性更高的优点f451，通过双夹,巴‘ELISA敏感性测定及其与间接ELISA的比较发现其敏感性是间接ELISA的两倍，同时通过对B．呋喃果糖苷酶(FFS)、菊粉果糖基转移酶(IFT)和淀粉糖化酶(GA)的检测显示本法无交叉反应。样品的基质干扰是影响检测灵敏度和准确性的重要原因，基质影响的类型有很多【461，首先是很多与分析物结构相似的成分能与抗体发生反应，从而导致交叉反应；其次蛋白质浓度过高时会干扰分析物与抗体之间的分离；另外一些脂类，尤其是脂肪酸能充当清洗剂7654321O0O0O 姜威B．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用一33使抗体失去自然属性；此外一些有机成分、金属离子以及pH等都可能产生影响。对于基质干扰的处理方法不同，存留在样品中的基质也会不同。最常用的消除基质干扰方法就是对样品进行稀释。经过试验发现，通过8倍稀释样品液后能有效的消除基质的影响。4添加回收率是评价ELISA方法准确度的重要指标，它是通过模拟的方法在空白样品中加入一定浓度的标准被测物，制成已知含量的模拟样本，然后按照拟定的方法进行样本的提取、净化以及检测。当回收率在90％"--"10"5％之间时较好，70％"--"120％之间也是可以接受的【471。回收率高于100％时，说明样本基质干扰大或者试剂盒特异性低，容易出现假阳性；当回收率低于100％时，说明在样品前处理中残留药物损失过多，会出现假阴性。本实验的回收率在74％"--"93％之间，批内差异小于10％，批间差异小于15％，重复性较好郴J。 扬州大学硕士学位论文缩论l。翮用单克隆抗体技术和酶联兔疫学方法筛选如9株可持续分泌针对$。呋瞒果糖苷酶抗体麴杂交瘤细驻株。2，亚类鉴定，6株单抗均为IgG2a，除ID6D12和1D6F2是髓轻链外，其他4株为丸重链，且都能与抗原产生特异性反应3。单抗糯加实验，表明ID6F2、1D6D12、8F8G3、1D6BIl是针对一群楣嗣摭原表位，而8F8C5和8FSA9是针对另一稀榍闭抗原裘位的，选用1D6F2和8F8A9作为取抗夹心法的抗体。4。采用辣根过氧化物酶傩张p》篱翁过碘酸钠法标记McAb。ID6F2，8FSA9抗体为包被抗体，建立蹶撬夹心ELISA，5～80ng／mL范瓣内，标准线性方程为严一0x均。l，霹2：．。 姜威13-呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用一35参考文献【l】CorbellaE．，D．Cozzolino．TheuseofvisibleandnearinfraredspectroscopytoclassifythefloraloriginofhoneysamplesproducedinUruguay[刀．Journalofnearinfraredspectroscopy,2005，13(2)：63．【2】朱青，王毕妮，梁艳，等．蜂蜜掺假检测方法的研究进展叨．中国蜂业，2008，59(10)：35．37．[3】牟世芬，于泓，蔡亚岐．糖的高效阴离子交换色谱!脉冲安培检测法分析[J]．色谱，2009．[4】SwallowK．W．，N．H．Low．Analysisandquantitationofthecarbohydratesinhoneyusinghigh-performanceliquidchromatography【J]．Journalofagriculturalandfoodchemistry,1990，38(9)：1828-1832．[5】陈兰珍，赵静，叶志华，等．蜂蜜真伪的近红外光谱鉴别研究叨．光谱学与光谱分析，2009，28(11)：2565-2568．[6】黄文诚．显微镜检测用蔗糖和蔗糖产品掺假的蜂蜜【J]．中国蜂业，2011，62(4)：40-42．[7]史琦云．旋光法检验蜂蜜中掺入糖类的研究阴．食品科学，2003，24(009)：111．114．[8】叶建农．蜂蜜含糖量的高效毛细管电泳测定研究【J】．分析测试学报，1998，17(003)：34-36．[9】伍季，朱海华，竹磊，等．GBl4963--2011《食品安全国家标准蜂蜜》解读田．中国蜂业，2012(2)：36—37．[10】KitahataS．，S．Suetaka，S．Okada．PurificationandtransfructosylationreactionofpfructofuranosidasefromPenicilliumsp．K25[J】．NipponShokuhinKogyoGakkaishi，1986，33：826-830．[11】HidakaH．，M．Hirayama，N．Sumi．AFmctooligosaccharide-producingEnzymefromAspergillusnigerATCC20611(BiologicalChemistry)【J]．Agriculturalandbiologicalchemistry,1988，52(5)：1181-1187．【12】ChangC．T．，YyLin，MsTang，eta1．Purificationandpropertiesofbeta-fructofuranosidasefromAspergillusoryzaeATCC76080[J】．Biochemistryandmolecularbiologyinternational，1994，32(2)：269-270．[13]FujitaK．，K．Hara，H．Hashimoto，eta1．Purificationandsomepropertiesofbeta．fructofuranosidaseIfromArthrobactersp．K-1[J]．Agriculturalandbiologicalchemistry,1990，54(4)：913-915．【14】HayashiS．，K．Ito，M．Nonoguchi，eta1．Immobilizationofafructosyl-transferringenzymefromaureobasidiumsp．onshirasuporousglass[J]．Journaloffermentationandbioengineering，1991，72(1)：68-70．[15】马歌丽，张学军，靳丽．黑曲霉产B一呋喃果糖苷酶酶学性质研究[J】．中国酿造，2009(006)：22-24．[16】朱桂兰，童群义．节杆菌10137产B．呋喃果糖苷酶条件及酶学性质[J]．无锡轻工大学学报，2004，23(5)：78-81．[17】赵秀红，李长彪，刘长江，等．日本曲霉产13一呋喃果糖苷酶的性质研究[J】．生物技术，2006，16(3)：33-35．[18】谢福斌，马莺．13—D一呋喃果糖苷酶酶学特性[J】．生物技术，2001，11(005)：7．8．[19】HirayamaM．，N．Sumi，H．Hidaka．Purificationandpropertiesofafructooligosaccharide-producingfmctofuranosidasefromAspergillusnigerATCC2061l[J]．Agric．Bi01．Chem，1989，53(3)：667-673．【20]DickersonAg．Ap—D-fructofuranosidasefromClavicepspurpurea【J】．BiochemicalJournal，1972，129(2)：263．[21】KimBw,HjKwon，HyPark，eta1．ProductionofanoveltransffuctosylatingenzymefromBacillusmaceransEG-6[J】．BioprocessandBiosystemsEngineering，2000，23(1)：11-16．[22】DuanK．J．，J．S．Chen，D．C．Sheu．Kineticstudiesandmathematicalmodelforenzymaticproductionoffructooligosaccharidesfromsucrose川．EnzymeandMicrobialTechnology,1994，16(4)：334—339．[23】于家鹏．13一呋喃果糖苷酶菌株筛选工艺及酶的应用研究[D】．东北林业大学，2007．[24】朱桂兰，周衍茂．微生物源13-呋喃果糖苷酶及其在功能性低聚糖工业中的应用[J】．合肥师范学院学报，2009(006)：100．102． 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姜威B．呋喃果糖苷酶单克隆抗体的研制及其在蜂蜜掺假ELISA中的应用翌致谢本论文是在导师王捍东教授的悉心指导和大力帮助下完成的。从实验设计到毕业论文的撰写，王老师以其渊博的学识、严谨求实、言传身教、身体力行、平易近人的品格，深深的影响和激励我，这必将成为我以后工作生活中的宝贵财富。感谢导师三年来在学习、生活上的关心，在工作上的支持和信任。在此谨向我敬爱的导师致以最诚挚的谢意!衷心感谢本教研组刘宗平教授、卞建春教授、刘学忠副教授、任建新老师、袁燕老师等给我科研和论文的完成提供的指导与帮助。感谢成勇教授、焦库华研究员、许小琴教授、李建基教授、李金贵教授等对我学业上的指导与帮助。感谢李荣娥、朱静、梁娟、薄智勇、朱秀高、张敏、王棋文等师兄师姐对我实验的帮助和指导，们工作顺利!卢守英、胡颖、孙雅、付应霄、张义冉、以及在学．--j生活上的关心和鼓励，祝他感谢张丹、汪惠泽、宋瑞龙、甄建伟、江辰阳、王世涛、黄佳佳等同学给予我科研和生活上的关心和支持!感谢李双喜、冯云飞、刘云迎等师弟和师妹的友好协作和诚挚帮助，祝他们实验顺利，早日取得优异科研成果!在此，我还要深深地感谢我亲爱的家人，是他们多年如一日的给予我无私的奉献和浓浓深情，使我能够顺利完成学业。感谢他们一直以来的艰辛的付出，衷心祝愿我的家人健康幸福、万事如意!特别感谢参加本论文评审和答辩的各位专家、教授和学者!最后，再一次衷心感谢所有关心、帮助和支持过我的老师、同学、朋友和亲人们!谢谢你们!姜威2012年4月于扬州 扬州大学硕士学位论文扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文版权使用授权书本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，lip．学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到<中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。学位论文作者签名：狐签字日期：加f乙年‘月E1