维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑血栓及其作用机理的研究 47页

分类号：R743密级：公开单位代码：10760学号：9100新疆医科大学XinJiangMedicalUniversity硕士学位论文THESISOFMASTERDEGREE同等学力申请学术性学位（学位教育）论文题目：维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑血栓及其作用机理的研究研究生徐金凤指导教师吕书勤教授学科专业名称中医内科学研究方向脑血管病方向研究起止时间2011.12~2012.9所在学院中医学院2012年08月万方数据 维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑血栓及其作用机理的研究研究生徐金凤指导教师吕书勤教授学科专业名称中医内科学研究方向脑血管病方向2012年08月万方数据 UighurMedicineStrongMadetuliayateHoneyOintmentTreatmentofCerebralThrombusanditsMechanismofResearchＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByXuJinfeng(InternalMedicine)DissertationSupervisor:Pro.LvShuqinAugust,2012万方数据 论文独创性说明本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：导师签名：签字日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定，（选择“同意/不同意”）以下事项：1.学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文；2.学校有权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》或其他同类数据库，传播本学位论文的全部或部分内容。学位论文作者签名：签字日期：导师签名：签字日期：万方数据 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名MiddleCerebralMCAO大脑中动脉闭塞ArteryOcclusionCICerebrlInfarction缺血性脑梗死DNDDelayedNeuronalDeath迟发性神经元死亡CCACommonCarotidArtery颈总动脉ICAIcaabbrCarotidArtery颈内动脉ECAExternalCarotidArtery颈外动脉PPAPterygoPalatineArtery翼腭动脉NDSNeuralDificitScore神经功能缺损评分万方数据 目录摘要……………………………………………………………………………………………………1ABSTRACT…………………………………………………………………………………………2…前言……………………………………………………………………………………………………3研究内容与方法……………………………………………………………………………………………51.实验动物…………………………………………………………………………………………………52.药物与试剂………………………………………………………………………………………52.1药物………………………………………………………………………………………………52.2试剂………………………………………………………………………………………53.器材与仪器……………………………………………………………………………………………54.实验方法…………………………………………………………………………………………64.1动物模型建立………………………………………………………………………………74.2动物分组及给药……………………………………………………………………………………74.3标本采集与观察指标……………………………………………………………75.统计方法…………………………………………………………………………………………………8结果……………………………………………………………………………………………………9讨论……………………………………………………………………………………………………14小结……………………………………………………………………………………………………25致谢……………………………………………………………………………………………………26参考文献………………………………………………………………………………………………27综述……………………………………………………………………………………………………31攻读硕士学位期间发表的学位论文…………………………………………………………………39个人简历………………………………………………………………………………………………40导师评阅表……………………………………………………………………………………………41万方数据 新疆医科大学硕士学位论文维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑血栓及其作用机理的研究研究生：徐金凤导师：吕书勤教授摘要目的：观察维药强力玛得土力阿亚特蜜膏对局灶性脑缺血大鼠ICAM-1、IL-1β、TNF-α含量的影响，探讨其脑保护作用及机制。方法:采用线栓法制成大脑中动脉阻塞的局灶性脑缺血模型；将60只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、对照组、治疗组。假手术组为正常饲料组，模型组给予生理盐水灌胃，后两组动物分别给予步长脑心通胶囊、维药强力玛得土力阿亚特蜜膏灌胃，分别于造模成功后灌胃7天，末次灌胃后1h作神经功能缺损评分，检测血清及脑组织中IL-1β、TNF-α的含量，ICAM-1的活性，并取部分样本进行脑组织病理标本的观察。结果:（1）局灶性脑缺血模型组的神经功能缺损评分高于假手术组(P<0.01),而治疗组此项指标较模型组均有降低(P<0.01)。（2）局灶性脑缺血模型组的血清中IL-1β、TNF-α的含量，ICAM-1的活性较假手术组均有提高，而维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗组以上生化指标的含量较模型组均有降低，较对照组无明显统计学差异(P>0.05)。结论:维药强力玛得土力阿亚特蜜膏对SD大鼠局灶性脑缺血模型具有保护作用，且疗效与对照组步长脑心通相近，其机制可能与抑制脑缺血后多种炎症相关细胞因子ICAM-1、IL-1β、TNF-α、的级联性表达有关。关键词:维药强力玛得土力阿亚特蜜膏；局灶性脑缺血；细胞间粘附分子(ICAM-1)；白介素-1β（IL-1β）；肿瘤坏死因子α(TNF-α)-1-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文UighurMedicineStrongMadetuliayateHoneyOintmentTreatmentofCerebralThrombusanditsMechanismofResearchPostgraduate:XuJin-fengSupervisor:Pro.LvShu-qinAbstractObjective：ToinvestigatetheeffectofUighurmedicineonthechangingofICAM-1andIL-1βandthelevelofTNF-ainratsofmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)model.TostudythemechanismsofUighurmedicineinpreventingandtreatingischemicapoplexy.Methods：Themodeloffocalcerebralischemiainratswasestablishedwiththesuture-occuludedmethod.Sixtyratswererandomlydividedintofourgroup:Sham-operatedgroup,Modelgroup,Controlgroupandtreatmentgroup.Sham-operatedgroupwasgivenordinaryfeed,PhysiologicalsalinewasfedbylavageinmodelgroupandBuchangNaoxintongcapsuleinControlgroupandUighurmedicinestrongmadetuliayatehoneyintreatmentgroup.Thesetherapycontiniueforsevendaysafterduplicatingthemoldsuccessfully.After1hourRatswereorallyadministeredandtheneurologicalfunctionwasscored.MeanwhilewedetectedserumactivityofICAM-1andlevelofTNF-a,IL-1β.Brainpathologystudywereperformedsoonaftertheexperiment.Results：AfterMCAO,thescoreofneurologicalfunctionwerebothincreasedobviouslybuttheUMSMHcanreducedit.AfterMCAO,theserumIL-1β,TNF-αandICAM-1wereincreasedbuttheUMSMHcanreduceditanditstreatmentresultwasn’tdifferentwiththeBCNXT.Conclusion：Uighurmedicinestrongmadetuliayatehoneyointmenthadaprotectiveeffectforratswithfocalcerebralischemia.anditstherapyisassimilareffectiveasBuchangNaoxintong.UighurmedicinestrongmadetuliayatehoneyointmentforthepositivetreatmentofacutecerebralinfarctionmayberelatedtotheinhibitionofcytokinesICAM-1,TNF-aandIL-1βexpression.KeyWords：Uighurmedicinestrongmadetuliayatehoneyointmentfocalcerebralischemic；ICAM-1；TNF-α；IL-1β-2-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文前言目前，脑中风的高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率严重危害人类健康，特别是老年人，其一直受到广大临床和基础科研工作者的高度重视。因为脑卒中而[1]死亡的连续五年位居第二。据不完全统计，57%-80%为缺血性脑卒中。DND(delayedneuronaldeath)又称迟发性神经元死亡,这是引起缺血性脑中风致残率高的重要原因,很多人因此而出现不同程度的神经功能缺损后遗症:如言语不清、吞咽障碍、肌力及肌张力障碍、认知功能下降、二便失禁、情绪改变、头晕头痛等。据不完全统计，缺血性脑中风后遗症的病人只有不到三分之一的可以恢复工作及正常生活,三分之二的病人遗留后遗症,不能完成正常的工作和生活,甚至卧床生活不能自理,给自己的家庭带来沉重的负担,给社会带来巨大的社会负担和经济损失，所以目前需要紧急解决的问题就是脑中风的预防及治疗研究工作。目前国内外无数学者为此研究更多的治疗措施及手段，近些年，中医中药民族医药越来越多的受到广泛的关注，并且发现中医民族医治疗本病具有一定优势。对此，我们从维吾尔医的角度进行研究,用药干预后再深入探讨缺血性中风病的病理机制,从而寻找安全、有效的治疗方法，这样缓解脑中风引起的神经功能缺损症状，预防脑中风的复发，有着很重要的意义。缺血性脑中风急性期对脑组织的损害程度不同，结果也不同。它影响到以后病情的发展及以后机体功能康复的程度.如何减轻早期脑损伤,对于缺血性脑中风死亡率的降低，致残率的减少,各类的并发症的出现减少发生具有很重要的现实意义。现在有关脑损伤急性期相关原因很多，也有不少研究者发现这种情况,许多细胞因子介导出现在炎症反应之前，比如ICAM-1、IL-1β、TNF-α的表达。有文献报道,这些指标具有参与免疫调节,促进免疫趋化的作用，还会使白细胞依附内皮细胞的几率增加，它会使使白细胞从血管内反而向缺血的脑组织来转移，脑缺血损伤会因为这些微观的改变而引发并加重了。因此，如何减轻脑缺血后出现的炎症反应,减轻神经细胞的快速凋亡是减轻脑中风后细胞损伤的很重要的方法。查阅近些年资料发现近年来多采用西方生物医学模式制作动物模型,其中制造动物疾病模型为多,又由于大鼠的脑血管及神经的系统解剖和人类是极为接近的，所以在选用模型动物时常常采用大鼠作为实验动物。脑缺血动物模型目前有很多种,但是常见的可见以下几种，包括:开颅法、线栓法、单侧颈总动脉阻断术、双侧颈总动脉[2,3]阻断术、四血管阻断术、大脑中动脉阻断术、三血管阻断术、光化学法、栓塞法等。但是，开颅法需行开颅，其死亡率及并发症非常高；光化学法需要的设备又很特殊，血栓形成的时候还会很容易引起微血管的损伤；栓塞法虽然能相对好的模拟出人体脑梗塞的发病过程，但受到血栓的栓塞部位不稳定、血栓又容易自溶这些因素的影-3-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文响，比较适合研究溶栓治疗的研究。而线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞的模型有以[4]下有点：1.不用开颅，2.损伤较小，3.机制明确，4.效果肯定，对临床具有启发和指导意义,故本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞模型进行基础研究。对于维吾尔医药学体系的基本理论的形成,是非常早的，考古学研究发现，维吾尔医学理论典籍及医药学书籍早在公元前400多年前就有发现,而异常黑胆质体液的[5]异常被认为是引起中风病变的主要原因。由于异常黑胆质体液是由进入人体的营养物质及寒性形成的，在中风等老年疑难杂症中发现其异常类型所占比例愈发升高，为各种异常体液”燃烧”而形成的最终产物或表现形式,异常黑胆质体液表现出的疾病往往病变复杂，病程冗长,反复发作，难以根治，异常黑胆质体液量的增加导致在血[6,7]管壁和神经组织上沉淀和刺激，又是使机体发生中风的主要病理因素的物质基础，引起本病发生。在治疗中我们使用异常黑胆质的成熟及清除剂，可以有效的缓解脑血栓病人的症状，防治脑血栓疾病的发生。本课题使用的维药强力玛得土力阿亚特蜜膏即是从调节异常黑胆质体液辩证，使用传统蜜膏制剂治疗脑血栓疾病，主要基于对这种异常体液质进行基础实验研究,试图发现其有效地作用机制和治疗途径。-4-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文研究内容与方法1实验动物SD大鼠60只，雄性，体重250±20g，由新疆医科大学动物实验中心提供，准用许可证号：SYXK（新）2003-0001。2药物与试剂2.1药物2.1.1维药来源维药强力玛得土力阿亚特蜜膏由新疆维吾尔自治区维吾尔医医院药剂科负责执行制备。处方制备：维药强力玛得土力阿亚特蜜膏的制备和剂量确定：处方:干姜30g胡椒（黑）30g荜拨30g肉桂30g余甘子30g毛诃子肉30g白花丹30g广防己30g中亚白及30g奶桃30g白皮松子仁30g洋甘菊30g洋甘菊子15g葡萄干（红）流浸膏90g药品按照《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》标准，由新疆维吾尔自治区维吾尔医医院药剂科负责执行制备。2.1.2步长脑心通胶囊来源步长脑心通胶囊0.4g/粒，购自咸阳步长制药有限公司,批号20120622。2.2试剂肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒中国人民总军总医院科技开发中心放免所白介素-1β（IL-1β）试剂盒中国人民总军总医院科技开发中心放免所细胞粘附因子（ICAM-1）试剂盒购自晶美生物工程有限公司3器材与仪器直径0.20mm进口尼龙渔线日本第一株式会社LD4-2型离心机北京医用离心机厂JA5003电子分析天平上海天平仪器厂DDJ-5离心机上海安亭科学仪器厂瑞士HAMILTMICROLABSTAR酶联仪江苏省医疗电子研究所GMJ型全自动放射免疫r计数器购自江苏省医疗电子研究所YZ20T4型手术显微镜苏州医疗器械总厂SD-78双极电凝器上海医疗器械高技术公司灌胃针北京生物器材公司显微镊上海医疗器械有限公司手术器械厂显微剪上海医疗器械有限公司手术器械厂-5-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文眼科剪上海医疗器械有限公司手术器械厂小镊上海医疗器械有限公司手术器械厂止血钳上海医疗器械有限公司手术器械厂持针器上海医疗器械有限公司手术器械厂血管夹上海医疗器械有限公司手术器械厂带线缝合针宁波市成和显微器械厂4实验方法4.1动物模型的建立[8]MCAO（大脑中动脉栓塞)模型的制作参照Longa等人报道的实验过程，改良后制作MCAO（大脑中动脉栓塞)模型：栓塞的线栓采用尼龙渔线,单股，直径约0.20mm，尼龙线剪成长度约5cm的线段，手持尼龙线一端,另一顶端放入已溶化的硅橡胶中,后迅速取出,晾约30秒,取顶端直径约0.26-0.28mm正圆光滑的线栓，予酒精清洁后距头端20mm处作一标记，置于1%肝素钠水中以备用。术前12小时SD[9]大鼠禁食不禁水。SD大鼠用氯胺酮、安定及阿托品各一支配伍稀释至10ml(0.75ml/100g)腹腔注射麻醉，观察大鼠，麻醉成功后将大鼠保定于手术平板上,呈仰卧位，予备皮消毒,避开气管,颈部皮肤沿正中剪开,长度约20~25mm,小心分离皮下组织,手术显微镜下分离并暴露出右侧颈总动脉(commoncarotidartery,CCA),沿CCA向头端分离出颈内动脉，手术显微镜下分离并暴露右侧颈外动脉(externalcarotidarteryECA)，分别结扎由ECA发出的甲状腺动脉及从ICA、ECA分叉处发出的枕动脉,沿着颈内动脉继续向颅底方向分离翼腭动脉,颈内动脉外侧在鼓泡膨大处发出的翼腭动脉分离出来(pterygopalatineartery,PPA)。结扎颈外动脉,距右侧颈总动脉(commoncarotidartery,CCA)分叉处约5mm处，再用微动脉夹分别夹住颈内动脉(icaabbrcarotidartery,ICA）及颈总动脉(commoncarotidartery,CCA)近心端,剪断颈外动脉,在距颈外动脉结扎处尾端约1mm处，选择合适的栓线由颈外动脉(externalcarotidarteryECA)断端插入,用8.0单尼龙丝线连同栓线结扎颈外动脉(externalcarotidarteryECA)断端,此时松开颈内动脉和颈总动脉的微动脉夹,用微动脉夹夹住翼腭动脉,将栓线向颈内动脉方向顺利插入约18~20mm,约拴线标记处，当感到明显阻力时停止继续插入,松开翼腭动脉(PterygopalatineArtery)的微动脉夹,将线栓的尾端部分剪[10,11]去,逐层缝合皮下组织及皮肤。手术结束后，维持大鼠肛温37℃左右，大鼠保持侧卧位,注意呼吸道通畅，必要时吸痰。模型组大鼠的制备与脑梗死模型的制备基本是相同的,其区别在于栓线由颈外动脉的断端插入颈内动脉后,保留1分钟左右,就即将栓线拔出,将颈外动脉断端结扎,其余同脑梗死模型组的制备。具体方法如下:栓塞的线栓采用尼龙渔线,单股，直径-6-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文约0.20mm，尼龙线剪成长度约5cm的线段，手持尼龙线一端,另一顶端放入已溶化的硅橡胶中,后迅速取出,晾约30秒,取顶端直径约0.26-0.28mm正圆光滑的线栓，予酒精清洁后距头端20mm处作一标记，置于1%肝素钠水中以备用。术前12小时[9]SD大鼠禁食不禁水。SD大鼠用氯胺酮、安定及阿托品各一支配伍稀释至10ml(0.75ml/100g)腹腔注射麻醉，观察大鼠，麻醉成功后将大鼠保定于手术平板上,呈仰卧位，予备皮消毒,避开气管,颈部皮肤沿正中剪开,长度约20~25mm,小心分离皮下组织,手术显微镜下分离并暴露出右侧颈总动脉(commoncarotidartery,CCA),沿CCA向头端分离出颈内动脉，手术显微镜下分离并暴露右侧颈外动脉(externalcarotidarteryECA)，分别结扎由ECA发出的甲状腺动脉及从ICA、ECA分叉处发出的枕动脉,沿着颈内动脉继续向颅底方向分离翼腭动脉,颈内动脉外侧在鼓泡膨大处发出的翼腭动脉分离出来(pterygopalatineartery,PPA)。结扎颈外动脉,距CCA(右侧颈总动脉)分叉处约5mm处，再用微动脉夹分别夹住颈内动脉及颈总动脉近心端,剪断颈外动脉,在距颈外动脉结扎处尾端约1mm处，选择合适的栓线由颈外动脉断端插入颈内动脉,保留大约1分钟,即将栓线拔出,将颈外动脉断端结扎,后分层缝合皮下的组织及皮肤。手术结束后，同样维持大鼠肛温37℃左右，可取暖水袋放至大鼠肛门处,将大鼠保持侧卧位,注意呼吸道通畅，痰多时吸痰。将60只SD雄性大鼠随机分为假手术组,予正常饲料，自由饮水;模型组,造模成功后生理盐水灌胃;阳性药物组,造模成功后步长脑心通水溶液灌胃;治疗药物组,造模后给予强力玛得土力阿亚特蜜膏灌胃。后三组造模采用线栓法制成MCAO（大脑中动脉栓塞)模型。动物麻醉清醒后予神经功能缺损评分(Neurologicdeficitscore,NDS)：采用ZeaLonga评分法，在各组SD大鼠造模成功后及灌胃1周后，末次灌胃2小时[12]由两位协作者分别采用进行神经功能缺损评分，评分标准如下:0分:没有神经系统功能缺失的症状，活动完全正常者;1分:有轻微的神经系统功能缺失症状，不能完全伸展对侧前肢及前爪者;2分:出现左侧的Homer征，爬行时出现向右侧转圈者:3分:行走时身体向右侧倾倒,甚至右侧偏瘫者;4分:不能自行行走，甚至意识丧失者;4.2动物的分组及给药假手术组：共15只，正常饲料，自由饮水。模型组：共15只，造模成功后生理盐水2ml灌胃，连续灌胃7天，每日一次。阳性药物组：共15只，造模成功后给予步长脑心通水溶液1410㎎/kg灌胃，连续给药7天，日一次。-7-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文治疗药物组：15只，造模成功后给予维药强力玛得土力阿亚特蜜膏8ml/kg灌胃，连续给药7天，日一次。4.3标本采取与观察指标造模成功后，动物分组，分别连续灌胃7天。末次灌胃后1h，用氯胺酮、安定及阿托品各一支配伍稀释至10ml(0.75ml/100g)腹腔注射麻醉，打开腹腔，经腹主动脉取血3～4m1，待其凝固后，以3000r/min转速离心10分钟，血清分离，用移液器吸取血清，移入EP管，-80℃冰箱保存，以备测ICAM-1的活性，IL-1β、TNF-α的含量、水平。经腹主动脉取血后，断头开颅，取出脑组织，取生理盐水冲洗，将残血洗净，用滤纸吸干水分，部位选右侧大脑额叶皮层同一部位取脑组织100mg左右，按照100mg/1ml比例加入生理盐水用匀浆器溶浆3～5分钟，离心机3000r/min的转速离心10分钟，用移液器抽取上清液，移入EP管，-80℃冰箱保存，以备测定脑组织脑组织ICAM-1的活性，IL-1β、TNF-α的含量及水平。大鼠断头取脑后，各组随机留取2只SD大鼠，切除其额极和枕极，于-20℃冰箱中速冻2-3分钟后，再行冠状切片,以2mm的间距切片，将其浸入2%TTC的磷酸盐缓冲溶液中，避光染色30min，在37℃的水浴箱中进行。将制作好的脑片取出后放入10%的甲醛溶液中固定上24小时，再用数码相机拍照。大鼠快速断头取脑后，各组随机留取2只SD大鼠，截取视交叉前后2mm的脑组织行冠状切片，后迅速置于10%多聚甲醛固定液中固定24h，标本常规进行脱水、透明、浸腊、包埋，作连续冠状切片,厚度约5μ),进行HE染色，步骤简述如下:（1）用苏木素染色5分钟后，用自来水进行充分的冲洗;（2）用盐酸酒精分化10秒后，用自来水进行充分的冲洗;（3）用l:500氨水洗15秒，再用自来水进行充分的冲洗;（4）伊红染色1分钟，再用自来水进行充分的冲洗;（5）二甲苯透明5分钟X2;（6）晾干，中性树胶封片。5统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，计量数据以x±s表示。神经功能行为学评分采用秩和检验Kruskal-WallisHtest，用Mann-WhitneyTest进行组间比较；其它指标采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，用LSD法进行组间比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。-8-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文结果1一般情况的观察大鼠在手术前行为完全正常，皮毛润泽，精神良好，喜群居，较活跃，进食及排便正常；假手术组动物清醒后，大鼠活动是正常的，喜四处活动，当提鼠尾大鼠悬空时，大鼠能自如伸展，有防御动作，无运动障碍，因伤口疼痛，会舔舐或互相舔舐伤口，情绪稳定，不易激惹，进食正常，鼻饲时配合，每日称重体重逐渐增长，二便正常。模型组动物术后清醒时活动减少，其缺血侧(左侧)瞳孔缩小，眼球内陷，眼裂变小，霍纳征(+),当提鼠尾倒立时，大鼠躯体向右侧扭转，右前肢向内收紧紧贴胸壁，行走时动作缓慢，会出现右侧追尾，或向右侧倾倒，大鼠肢体右前爪部分屈曲，严重时甚至完全屈曲，大鼠防御能力下降，甚至无防御动作，至操作台边缘时不知躲避危险，不知向内行走或变道，坠落于操作台下。大鼠喜蜷伏在一角，不愿活动，不易聚集，进食减少，二便减量，每日称重体重缓慢减轻或保持不变；有些大鼠甚至嗜睡，不思饮食，不与同组大鼠交流，大鼠时有急躁不安，易激惹，鼻饲时不配合，有撕咬动作。实验过程中，1只麻醉意外死亡；4只因梗死面积较大，不能耐受而死亡，2只造模成功后，精神状态欠佳，3日未进食水而极度衰弱剔除。2神经系统功能行为学评分测定结果显示，造模后一周，模型组与假手术组相比神经系统功能行为学评分之间有明显差异，具有统计学意义（P<0.01）；治疗药物组强力玛的土力阿亚特蜜膏组和阳性药物组步长脑心通组与模型组相比神经系统功能行为学评分有差异，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。表1对大鼠神经功能行为学评分的影响neurologicdeficitscoregroupn01234假手术组12100000*模型组1201262**阳性组1204520**治疗组1204430与假手术组比较*P<0.01；与模型组比较**P<0.05-9-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文3对局灶性脑缺血大鼠血清中TNF-α、IL-1β、ICAM-1的测定结果显示，治疗药物组强力玛的土力阿亚特蜜膏组和阳性药物组步长脑心通组与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，但治疗药物组强力玛的土力阿亚特蜜膏组和阳性药物组步长脑心通组组间差异均无统计学意义，见表2。表2对血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量的影响（x±s）groupnTNF-αIL-1βICAM-1假手术组120.455±0.03447.563±4.23411.298±1.432***模型组121.301±0.13678.392±8.64823.181±2.602******阳性组120.872±0.12769.760±8.29721.545±2.783△△△治疗组120.865±0.13069.279±7.63018.480±2.582与假手术组比较*P<0.001；与模型组比较**P<0.05，△P<0.014对局灶性脑缺血大鼠脑组织溶浆TNF-α、IL-1β、ICAM-1的测定结果显示，药物组强力玛的土力阿亚特蜜膏组和阳性药物组步长脑心通组与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)，但药物组强力玛的土力阿亚特蜜膏组和阳性药物组步长脑心通组组间差异均无统计学意义，见表3。表3对脑组织溶浆TNF-α、IL-1β、ICAM-1含量的影响（x±s）groupnTNF-αIL-1βICAM-1假手术组120.273±0.26063.221±6.101238.610±11.996***模型组120.682±0.120111.443±27.897451.921±43.347******阳性组120.461±0.08587.810±18.198396.201±41.824△△△治疗组120.443±0.08187.400±20.891400.997±42.180与假手术组比较*P<0.001；与模型组比较**P<0.05，△P<0.01-10-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文5大鼠TTC染色比较：大鼠脑组织切片可见：脑组织呈红白区域交界，缺血坏死区颜色呈白色，正常脑组织区域呈红色。模型组可见白色区域较多，提示缺血面积较大（见图1）；步长脑心通胶囊组，白色区域较模型组明显缩小，提示脑组织缺血面积较模型组有明显减少（见图1、2）；维药强力玛的土力阿亚特蜜膏组，白色区域较模型组明显缩小，较步长脑心通胶囊组白色区域变化不大，提示较模型组，其缺血面积较明显减少，较阳性药物步长脑心通胶囊组脑组织缺血面积变化不大。（见图1、2、3）图1模型组图2步长脑心通胶囊组图3维药强力玛的土力阿亚特蜜膏组-11-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文6大鼠脑组织病理图片比较6.1假手术组此图片可见其皮层的深层神经原胞浆细胞丰富，分布均匀，皮髓质交界明显，细胞胞核核仁较清晰，细胞核呈椭圆形及正圆形；其胶质细胞形态正常，无间质水肿，其神经原组织形态正常，无间质水肿，细小血管结构完整，形态正常。（见图4）6.2模型组此图片可见皮髓质交界不清、周边不规则，其胞膜的形态、皮层的深层及神经原胞浆边界不清，周边不规则，胞核着色较深，胞核有缺血的表现，浓缩呈三角形。此图片病灶侧的细小血管细胞的间隙有显著增宽；脑组织神经原形态异常，细胞间隙增宽，有间质水肿；胶质细胞的形态异常，细胞间隙有增宽，伊红淡染，空泡样变可在神经纤维网上见到。（见图5）6.3步长脑心通胶囊组此图可见皮髓质交界区相对完整，形态比较清晰；大多数的神经原在皮层深层，结构的较为完整，形态较为清晰。上图可见病灶侧胶质细胞结构相对完整，间质水肿轻，形态较正常；脑组织神经原结构相对完整，形态相对正常，间质水肿轻；细小血管形态结构相对完整正常，间质水肿程度轻。（见图6）6.4维药强力玛的土力阿亚特蜜膏组此图片可见其皮层的深层神经原胞浆细胞相对丰富，分布规则，皮髓质交界形态规则，细胞胞膜形态规则；可见伊红染色相对淡染，其胶质细胞形态正常，周围间隙有增宽，无间质水肿，神经原组织形态正常，周围间隙有增宽，无间质水肿，细小血管结构完整，形态正常。（见图7）6.5结论模型组与假手术组相比,皮髓质,胞膜的形态,皮层的深层及神经原胞浆边界不清楚,周边不规则,伊红淡染，有空泡样变,细小血管、细胞脑组织神经原、胶质细胞的形态异常，细胞间隙增宽，间质水肿,提示造模成功,对脑组织细胞造成缺血性脑损伤;步长脑心通胶囊组与假手术组相比,皮髓质,胞膜的形态,皮层的深层及神经原胞浆有边界不清,周边不规则,细小血管、细胞脑组织神经原、胶质细胞有形态异常，有细胞间隙增宽，有轻度间质水肿,提示造模成功,较模型组相比,其皮髓质,胞膜的形态,皮层的深层及神经原胞浆的边界不清,周边不规则,细小血管、细胞脑组织神经原、胶质细胞的形态异常/细胞间隙增宽、间质水肿等情况明显减轻,提示药物干预后病理结果有变化,其缺血性损伤较轻;维药强力玛的土力阿亚特蜜膏组与假手术组相比,皮髓质,胞膜的形态,皮层的深层及神经原胞浆有边界不清,周边不规则,细小血管、细胞脑组织神经原、胶质细胞有形态异常，有细胞间隙增宽，有轻度间质水肿,提示造模成功,较模型组相比,其皮髓质,胞膜的形态,皮层的深层及神经原胞浆的边界不清,-12-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文周边不规则,细小血管、细胞脑组织神经原、胶质细胞的形态异常、细胞间隙增宽、间质水肿等情况明显减轻,提示药物干预后病理结果有变化,其缺血性损伤较轻;与步长脑心通胶囊组相比病理结果变化不大,提示两种药物干预后均能减轻缺血损伤。图4假手术组图5模型组图6步长脑心通胶囊组图7维药强力玛的土力阿亚特蜜膏组-13-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文讨论1.线栓法制作大鼠MCAO模型的评价缺血性脑中风是一种高发病，严重危害人类尤其是老年人的身体健康，给家庭和社会带来了沉重的负担，而临床上缺血性脑中风最常见的发病部位是大脑中动脉[13,14]的闭塞，这与大脑中动脉特殊的生理解剖结构相关。对于缺血性脑中风，现代医学研究有很多成果，但目前尚没有确切快捷有效的治疗方法。在疾病发生早期，4.5小时内，临床上可行动静脉溶栓治疗，但因临床知识普及及多方面因素影响，大多数患者不能在有效时间窗内及时就诊，且溶栓同时带来的合并出血及脑组织的缺[15]血再灌注损伤依然困扰着临床工作者。在目前现状下,中医民族医治疗本病具有一定优势,对此，我们从维吾尔医的角度进行研究,用药干预后再深入探讨缺血性中风病的病理机制,从而寻找安全、有效的治疗方法，这样缓解脑中风引起的神经功能缺[16]损症状，预防脑中风的复发，有着很重要的意义。制备一种接近人类发病情况，模拟人类发病过程，模型情况稳定，复制成功率[17]高的动物模型，是研究疾病及其治疗效果的一个前提，也是研究的一个重要手段。目前进行脑缺血动物实验的动物主要有以下几种：大鼠（SD、Wistar）、小鼠、黑爪[18]蒙古沙土鼠（Mongliangerbils）、家兔等。小鼠因其体积小，血管纤细，造模难度较大，加之不能耐受手术，故采用较少；黑爪蒙古沙土鼠（Mongliangerbils）的脑动脉环发育不全，故用于脑缺血的研究，但它不能完全模拟人类发病的过程，血管的变异性大，它作为病原体储存宿主，多为某些自然疫原性病原体，所以在流行病学方面的意义更为重要。家兔的价位较高，抗感染能力相对较差，血管变异系数大，且价位较高，故选用较少。目前研究脑缺血模型时使用最多的是大鼠，经过很多学者的研究它有以下几点优势：1、大鼠的脑血管解剖结果与人类极为相似；2、大鼠经过多代繁殖，种系纯合性好；3、大鼠抗感染能力强，能抵抗术后切口感染；4、大鼠体质好，造模成功后存活时间较长；5、大鼠生殖能力强，生长周期短，成本较低。目前常用的大鼠品系有以下三种：Fischer-344大鼠，Wistar大鼠及SD大鼠，大[19]鼠品系不同其MCAO（大脑中动脉栓塞）模型效果也有不同。首先Fischer-344大鼠大脑中动脉闭塞后，测量其脑梗死体积一致性较好，因其（大脑中动脉）MCA变异系数较小；而Wistar大鼠因其血管变异系数较大，其脑梗死体积不等，而且其脑梗死体积是这三种大鼠中最小的；SD大鼠的MCAO（大脑中动脉栓塞）模型效果居[20,21]于Fischer-344大鼠和Wistar大鼠之间。Fischer-344大鼠现饲养较少，价格高，虽然Fis-cher-344大鼠的的MCAO（大脑中动脉栓塞）模型效果最理想，但因为鼠源[22]紧张，目前少选用Fis-cher-344大鼠，多选用Wis-tar大鼠或者SD大鼠。相对于Wis-tar大鼠，SD大鼠MCAO（大脑中动脉栓塞）后，脑梗死体积大，能模拟人类-14-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文[23]发病过程，且性情温和，生长周期短，价格便宜，故选用SD大鼠。有研究表明，[24]对于永久性大脑中动脉闭塞，雌激素有神经保护作用，会影响对脑梗死的面积，而且雄性大鼠有好的体质，稳定性强，能够提高造模成功率，故选用单一性别的雄性大鼠动物进行试验。目前为了研究缺血性脑中风的发病规律和发病机制，研究者依据临床缺血性脑中风病人的一般情况，成功创建了很多局灶性的，脑缺血动物模型。现报道较多的有1、大脑中动脉线栓法，2、微栓子栓塞阻断法，3、化学刺激诱导血栓性闭塞法，[25,26]4、开颅机械闭塞法。但是，栓塞法虽然能相对好的模拟出人体脑梗塞的发病过程，但受到血栓的栓塞部位不稳定、血栓又容易自溶这些因素的影响，比较适合研究溶栓治疗的研究；化学法需要的设备又很特殊，血栓形成的时候还会很容易引起微血管的损伤；开颅法需行开颅，其死亡率及并发症非常高；MCAO大脑中动脉线栓法是由ZeaLonga首创的，该模型目的是阻断流向基底节区、额顶皮质区的大部分血供，通过阻断解剖结构特殊的大脑中动脉，将栓线通过颈内动脉达到大脑中动脉，[27]阻塞MCA的开口处，而线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞的模型有以下优点：1、不用开颅，2、缺血部位恒定，3、若进行缺血再通时间能够自行控制4.可以模拟人类永久性脑缺血模型及短暂缺血再灌注模型，5、效果肯定，对临床具有启发和指导[28,29]意义。多研究者将Longa等人的模型进行复制，并且在实验过程中加以改进，包括栓线、实验过程、动物品系、体重、性别加以比较，设计了新的栓线，现已有成品栓[27]线，统一栓线插入深度在18-20mm左右，动物品系选用SD大鼠为佳，体重在250g加减20g左右，选用雄性大鼠，经过以上改进，MCAO（大脑中动脉栓塞）成功率提高了15-20%，使模型更加稳定。在进行动物实验期间，实验前查阅大量关于动物实验的资料，详知实验过程、实验注意事项及大鼠脑血管解剖，在新疆医科大学第一附属医院动物实验中心指导兽医的指导下，很好的完成了预实验及后续动物实验过程。1、栓线的选择是手术过程中一项不起眼但很重要的一步，栓头小不能将大脑中动脉闭塞，栓头大了不能够入颅骨缝，栓头不圆润会划伤血管内膜，栓头不牢固会术中或术后脱落。目前文献报道较多的有酒精灯旁加热，这样做出的栓线不光滑，且栓头很难烧出正圆形，影响手术效果；另一种报道较多的是蘸加热的石蜡油晾干备用，这类线栓栓头光滑圆润，但容易脱落。现有成品栓线出售，但价格昂贵，课题费用难以承受。在实验过程中，自行摸索出自制栓线的好方法。实验用栓线选自日本第一株式会社的直径0.20mm进口尼龙渔线，自制栓线。将渔线剪为50mm左右的栓线，将硅橡胶置铁质容器内，酒精灯缓慢加热，待硅橡胶溶化后将剪好的渔线轻放至硅橡胶中，迅速取出，栓线头可见圆形栓头，晾干后取顶端直径约0.26-0.28mm正圆光滑的线栓，酒-15-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文精擦净后用黑色记号笔标记，使栓线头呈黑色，在距线头20mm处做一标记，便于实验过程中操作的顺利及控制栓线插入深度。此方法制作的栓线，栓头光滑、圆润，便于循行血管，栓头经轻微加热后与渔线结合紧密，不会脱落，在灌胃1周采集脑组织时能看到栓线仍完好无损的在血管中，没有移位，也没有脱落。自制栓线简便、快捷、成本低，可供后续行动物实验的同学参考。2、既往使用4%水合氯醛进行麻醉较多，但存在麻醉剂量不好掌握，容易在手术过程中大鼠清醒，躁动，且麻醉后动物喉中分泌物较多，加之水合氯醛有致爆的风险，实验中采用氯胺酮、安定及阿托品各一支配伍稀释至10ml(0.75ml/100g)腹腔注射麻醉，可以有效解决以上问题，这样配伍能够抑制腺体分泌，使大鼠镇静又有欣快感，麻醉深度好掌握，提高造模成功率。3、在预实验过程中，反复揣摩手术技巧，认真练习，以期在正式实验期间提高成模率。在正式实验时操作熟练，在计划时间内完成，且造模成功。按照大脑中动脉线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，实验动物状态稳定，重复性好、成模率高，按照实验步骤有序进行,并进行预实验,实验过程中严格控制手术操作时间,动物实验有序有效完成。2维药强力玛得土力阿亚特蜜膏的方剂学研究2.1强力玛得土力阿亚特蜜膏的来源及功效zhikuquan20150807“维药强力玛得土力阿亚特蜜膏”出自维医经典医著《如意处方》,属《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》1999年第一版收载品种，是维医临床常用传统[30]古方.本药是由新疆维吾尔自治区维吾尔医医院药剂科负责执行制备，在传统医方基础上，经现代生产工艺加工制成的现代维药.维药强力玛得土力阿亚特蜜膏是由干姜、胡椒（黑）、荜拨、肉桂、余甘子、毛诃子肉、白花丹、广防己、中亚白及、奶桃、白皮松子仁、洋甘菊、洋甘菊子、葡萄干（红）流浸膏等药物组成。性状为棕色的蜜膏，气特异，味甜、辛、微辣。具有强壮肌体，止痛，益肾，补脑之功效，用于偏瘫，关节骨痛，痴呆舌重，腰酸阳痿，齿松等。2.2强力玛得土力阿亚特蜜膏的维吾尔医理论基础2.2.1基于维吾尔医学基本理论传统的维吾尔医学认为，人体分为四种体液，第一种为血液质，第二种为粘液质，第三种为黑胆质，它是人类生命的旺盛及生理活动过程的四大基本物质。而正常的黑胆汁质体液是一种颜色略黑、味道酸涩的液体，相对于其他体液而言较浓，属性为干寒。它能够限制胆汁质、粘液质、血液质等物质的过度燃烧，能够形成沉[31]淀，能保持器官的形状与特质，也防止其它正常体液溢于体外而蔓延。维吾尔医学认为，随着年龄的增大，进入人体的营养物质及寒性物质逐渐增多，-16-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文体液上黑胆质渐占优势，异常黑胆质体液逐渐沉积于体内，且随着年龄的老化，人体气质属性越来越接近“干寒”,正常黑胆质体液当人体热量由于各种内外因素的影响而升高,体液在强热作用下"燃烧",黑胆汁体液中易挥发成分蒸发后体液过度变浓,形[31]成被燃烧的黑胆质体液。本身就较浓的黑胆质体液遇到强烈燃烧后,其干寒属性会加剧,这种异常黑胆质体液极易黏附在血管壁上,使血管硬化,管腔变窄。其次，胆液质、血液质、粘液质体液因内外因素导致体热升高,体液在强热作用下"燃烧"，体液的易挥发成分挥发后变浓,这种异常体液质地稠,份量重,易在血管壁上沉积可使动脉管壁增厚、变硬，失去弹性、管腔变小,也容易在神经中形成阻滞，在神经组织上沉淀和刺激，引起诸病发生。除此以外，还有很多病因引起的异常黑胆质体液造成血管的沉淀、阻塞,使各个器官的营养及供氧不足，及支配器官的不足，引起心脑血管疾病。2.2.2基于维吾尔医学对脑血栓疾病的认识经验研究发现，人体随着年龄的增大，他的气质属性会越来越往“干寒”的气质发展，这个时候，如果其他异常体液如血液质、粘液质、胆液质等长期的滞留下来，在内外因素的影响下“燃烧”，或者黑胆质本身出现质或量的异常变化，很快便会产生异常黑胆质，异常黑胆质体液量的增加导致在血管壁和神经组织上沉淀和刺激，引起[32]脑血栓疾病的发生，且在临床研究中发现中风等老年疑难杂症中发现异常黑胆质zhikuquan20150807体液所占比例愈发升高，故异常黑胆质体液的异常被认为是引起脑血栓疾病的主要原因。另一方面，胆液质、血液质、粘液质和黑胆质“燃烧”后产生异常黑胆质，继而“沉淀”，异常黑胆质作为这些过程的最终产物或表现形式，是使机体发生脑血栓的主要病理因素的物质基础；异常黑胆质是对人体非常有害的异常体液，但也因其病机复杂，异常黑胆质表现出的疾病往往病变复杂，顽固难治，是最难成熟和清除[33]的，所需时间也较长，是中风顽固难治，恢复较慢的主要因素。在治疗疾病尤其是体液性疾病时，在辩证施治方面，古维吾尔医学治疗大法，同样是虚则补之，实则泻之，寒者热之，热者寒之。维吾尔医学药学方面也将药物[31]根据其四大物质的理论分为四种属性“干热、干寒、湿热、湿寒，古维吾尔医学即运用这四种相互制约的属性治疗疾病。如运用干热的药物治疗湿寒性的疾病，运用湿热性的药物治疗干寒性的疾病等。治疗可先使异常黑胆质的干寒属性逐渐降低，可用成熟剂调整，使致病体在干寒环境中无法生存，再运用成熟剂，成熟剂能够稀释有毒物质，使之能通过血脑屏障，再由清除剂的作用下随时可排出体外。2.3强力玛得土力阿亚特蜜膏的维吾尔药学基础2.3.1干姜：药物属性：二级干热。各家学说：《拜地依药书》:“干姜能够开通湿寒性的肝脏”[30]阻塞，消除肠胃陈旧性气结，补肝，补胃，增强性欲。《注医典》:“能够化燥咽部-17-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文及头部湿性不适，增强记忆力，提高视力，改善眼部不适，干燥胃中多余湿气，温[30]暖肝脏，温暖胃部，帮助消化，激发性欲，燥湿止泻等”《药物之园》:“主治瘫痪，泌尿器官虚弱，寒性尿不尽，筋肌寒盛，阻塞性黄疸，消化不良性腹泻，肠道生虫，毒虫咬伤等。”2.3.2胡椒药物属性：三级干热。各家学说：《拜地依药书》：“清除异常黏液质和黑胆质等，温通大便，使排便顺畅，治疗寒性便秘，治疗白内障，视物昏花，斑秃，瘫痪，肢体麻木不仁等症。”《注医典》：“祛寒，使筋骨温通，祛除皮肤斑点，使皮肤润泽生辉，软坚散结，利湿退肿，减轻体重，消退脾肿，温肺止咳，祛除寒气，温通利尿等；治疗筋肌盛寒，皮肤白斑，淋巴结核，肥胖，脾脏炎肿，肺寒咳嗽，寒性尿[14]闭等。“《药物之园》：“消除寒性的伤寒，温补肺脏，平喘止咳，热血除浓，增强”[30]性欲，温肠通阻等；治寒性血黏度增高，寒性哮喘，寒性肠梗阻，性欲减退等。2.3.3肉桂药物属性:二级干热。各家学说:《白色宫殿》：“具有清除胸部异常和无用体液，散发邪物，防止腐蚀，开通阻塞，矫正腐败，补肝气，明亮眼睛，补胃，清脑爽心的作用。”《注医典》:“具有开通、散发作用，消除腐败体液和腐蚀因素引起的创疡[30]黄水。”《拜地依药书》：“具有软化结节，防止腐败物质生成，平喘止咳，润滑咽zhikuquan20150807喉，清脑爽心，明目，解除震颤，开通肝胆，温宫止痛，利尿退肿，补身增智，补胃消食，祛斑愈伤，清理脑部，消除健忘，消除头晕，增强嗅觉，强筋健肌，除癫”[30]止痛。2.3.4余甘子药物属性:二级干、一级寒。各家学说：《药物之园》：“收敛固涩作用，阻止异常体液流入胃脘和肠道，阻止黑胆质混入其他体液之中，能防止体液腐败，阻止烧焦黑胆质和胆液质性邪气混入正气之中，从全身中能清除黑胆质。燥湿补胃，停止久泻，清理血液，使眼睛明亮，解除抑郁，增强记忆理，增强食欲，强筋健肌，滋补神经，缩尿，生发乌发。”《拜地依药书》:“清除异常黑胆质和黏液质。”《注医典》：“增强智力，使头发乌黑浓密，不易脱落，滋补神经，增强心脏力量，起搏心脏，使[30]眼睛明亮，补胃，清理胃脘，消除痔疮。”2.3.5毛诃子药物属性：一级干，二级寒。各家学说：《注医典》:“燥湿补胃，止泻软便等。治湿盛胃虚，腹泻，便秘等。”《白色宫殿》:“调节胃中津液，滋补胃部肌肉等。治疗胃下垂等。”《拜地依药书》:“使眼睛明亮，控制眼中分泌物，滋补肛肌等，治视”[30]物不清，迎风流泪，肛门脱出等。《药物之园》:“清除异常黑胆质和胆液质，补胃开胃，散气止痛，消除痔疮等，治异常黑胆质和胆液质过盛，胃虚纳差，气滞头-18-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文[30]痛，痔疮胀痛等。”2.3.6白花丹药物属性：三级干热各家学说：《白色宫殿》:“治异常体液增多，散发致病物质。”《拜地依药书》:“祛风止痛，使皮肤红润有光泽，除癣康肤，消炎退肿等。治关节炎，[30]坐骨神经痛，皮肤白斑，各类癣症，白癜风，脾脏肿大，牙痛等。”2.3.7中亚白及药物属性：一级湿热各家学说：《注医典》:“干寒性或黑胆质性疾病，强筋健肌，[治四肢瘫痪，激发性欲，治性欲低下，开漏止脓等，治漏病流液，漏口封闭等。”《药物之园》:“生湿养筋，治干性抽筋，面瘫，祛寒强肌，寒性肌松，生发补发，治血少[30]精稀，脱发发稀等。”2.3.8奶桃药物属性：二级湿热《药物之园》：“干寒性或黑胆质性疾病，如寒性瘫痪，脑力虚弱，视力减退，视物不清，筋肌松弛，忧郁症，胎动不安，贫血体瘦，肾虚精少，[30]毒疫流行2.3.9洋甘菊药物属性：二级干热《注医典》：“开通各种阻塞，祛除寒气止痛，稀化各种体液，解除肌肉抽筋，消炎明目，软坚退肿，补脑强筋，化痰利水，消除黄疸，利尿排石，消退发热。《白色宫殿》：“开通各种阻塞，补脑强筋，化痰止咳，软化结节，松弛和散发致病物质，祛寒止痛，消除黄疸，消除眼部脓疮，堕胎催盘，利尿通经，通畅肠阻的作用。”《拜地依药书》：“具有消除黑胆质性和黏液质性伤寒，开通阻塞，祛寒止痛，软坚消炎，补神经，补脑，利尿，排出肾结石，清理全身，通经，堕胎，[30]祛风止痒，消除眼痛，消除肝脏炎肿”。2.3.10葡萄干药物属性：一级干热各家学说：《注医典》。“补胃，治胃虚，补肝，治肝虚，补心，治心虚等。”2.4维药强力玛得土力阿亚特蜜膏现代药理研究2.4.1干姜干姜油含挥发性成分，辛辣成分，二芳基庚烷类，6－姜辣醇5－碘酸5－羟基龙脑－2－O－β－D－吡喃葡萄糖苷及姜糖脂。现代药理研究认为有抗溃疡作用、抗血栓及抗血小板聚集、消炎镇痛、减轻缺血症状、停止呕吐、促进消化、抗变态反应、[34]对肾上腺皮质功能的影响的作用:2.4.1.1.抗溃疡作用干姜饮片经过水炮制后做成水煎剂给动物灌胃，发现能够抑制大鼠的应激性溃疡,醋酸诱发的胃溃疡,对大鼠幽门结扎后引起的胃部溃疡也有明显-19-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文抑制。2.4.1.2.抗血栓及抗血小板聚集作用动物实验将干姜水提物或挥发油给大鼠灌胃，后检测血栓形成的时间,实验结果显示干姜水提取物及其挥发均能够延长实验性血栓形成,且干姜挥发油能够将部分凝血活酶时间延长,提示其挥发油有增强其内源性凝血功能的作用.实验研究还发现,对ADP及胶原诱导引起的血小板聚集也有明显的抑制作用.2.4.1.3.对心血管的作用静注干姜甲醇提取物后，心率会出现短暂性的减慢,血压一过性增高,并能够增强豚鼠离体心房自发性的运动。2.4.1.4.对肾上腺皮质功能的影响幼年小鼠经过干姜灌胃后,其胸腺会萎缩；大鼠的肾上腺的维生素C会显著降低,经过干姜酚酸的灌胃.2.4.1.5.其他作用小鼠皮下注射干姜甲醇的提取物,能够有效的镇静、镇痛,也能够起到抗血吸虫作用及灭螺作用。2.4.2胡椒果实含胡椒碱，胡椒新碱，胡椒酯碱，挥发油，油中含二氢葛缕醇，胡椒醛，氧化石竹烯，水芹烯，隐品酮，顺-对-薄荷烯酸，顺-对-薄荷二烯醇及反-松香芹醇。现代药理研究认为有中枢神经抑制、抗炎、抗惊厥等作用;2.4.2.1.中枢神经抑制作用将戊巴比妥给大鼠灌胃,待大鼠催眠后予胡椒碱,能够延长大鼠催眠的时间。胡椒碱可对抗大鼠及，胡椒碱能够对抗大鼠听源性发作,对大鼠电惊厥及戊四氮惊厥有抑制作用。2.4.2.2.抗炎作用胡椒碱通过刺激垂体-肾上腺皮质轴,能够抑制大鼠的急性及慢性炎症。2.4.2.3.其他作用喂饲大鼠时在饲料中加入胡椒碱,大鼠尿酸排出增加;口含胡椒,血压正常的人也会引起血压升高。2.4.2.4.毒性喂饲时饲料中加入胡椒提取物,长期如此会引起埃及蟾蜍的肝脏肿瘤,并多处转移。2.4.3荜拨果实含假蒟碱，假蒟亭碱，1-（3，4一亚甲二氧基苯基)十四碳一1E一烯，N－（苯丙一3一烯酰基)吡咯，墙草碱，β-谷甾醇，α一细辛脑，细辛醛。假蒟二氯甲烷提取物对血小板活化因子诱导的兔血小板聚集有抑制作用。2.4.4肉桂含挥发油1.98％～2.06％，其主要成分为桂皮醛,还含原矢车菊素B2－8－C－β－D－葡萄糖苷，锡兰肉桂素，锡兰肉桂醇，原矢车菊素B2－8－C－β－D－葡萄糖苷，脱水锡兰肉桂素，脱水锡兰肉桂醇等，另外还含有肉桂苷，桂皮苷和桂皮多糖AX等化合物。现代药理研究认为有抗溃疡、抑制血小板聚集、抗凝血酶、抑制血栓形-20-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文[35]成、增加脑血流量、扩张外周血管作用。2.4.2.1.对胃肠运动的影响桂皮油多胃肠道有良性刺激作用,它可以促进消化液即唾液的分泌,增强消化功能,它是一种芳香性健胃驱风剂，能够消除胃肠平滑肌的痉挛从而减轻肠道痉挛样的疼痛。2.4.2.2.抗溃疡作用应激性的大鼠胃溃疡通过将肉桂水提取物灌服，能够有效缓解疼痛,对应激性大鼠胃溃疡有较强的抑制作用。2.4.2.3.抗血小板聚集作用桂皮醛、肉桂甲醇提取物能够延长凝血酶原时间,抑制血小板聚集,能够抑制内毒素诱发的大鼠实验性血栓的形成。2.4.2.4.对心血管系统的作用肉桂能使离体豚鼠心脏及麻醉犬的外周血管扩张,增加冠脉及脑部的血流量。当内源性儿茶酚胺分泌增加会损伤血管内皮细胞及心肌细胞,肉桂水提取物及挥发油能够抑制其引发的诸多现象,保护血管内皮及心肌细胞，恢复心肌细胞膜结合酶的一些异常的变化。2.4.2.5.其他作用肉桂提取物能够增强毛细血管通透性,降低非特异性免疫功能和抗体的产生,桂皮醛能够杀灭真菌。肉桂甲醇提取物及桂皮醛能够抑制酪氨酸酶的产生。肉桂有中枢解热镇痛,抗惊厥镇静作用。2.4.5余甘子果实含鞣质，诃子酸，原诃子酸，诃黎勒酸，诃子次酸葡萄糖没食子鞣苷，没食子酸，3，6－二没食子酰葡萄糖，并没食子酸，鞣料云实精；干果含黏酸；果皮含[36]余甘子酚，油柑酸，没食子酸。现代药理研究认为有抗炎、杀菌、降脂作用。2.4.5.1抗炎作用果实中能提取抗菌活性物质,抑制大肠杆菌、葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等有较强抑制作用,对真菌作用较弱。2.4.5.2降脂作用对高脂血症模型家兔胃饲半月有降脂作用。2.4.5.3其他作用对中枢神经系统也有解痉及抑制作用。2.4.6毛诃子含β－谷甾醇，没食子酸乙酯，没食子酸，诃子酸、鞣花酸，甾体皂苷成分。现代药理研究认为有抗氧化、强心、抗血小板聚集作用。2.4.7白花丹含白花丹素，3，3＇双白花丹素，3－氯白花丹素，白花丹酸，四氢双白花丹素，蛋白酶，蔗糖酶，氢化白花丹苷，果糖，葡萄糖等。现代药理研究认为有抗微[37]生物作用、延长凝血酶原时间、抑制肿瘤生长等作用。2.4.7.1对心血管的作用白花丹素能够麻痹离体袜心,抑制家兔的呼吸、血压;白花丹素结构与维生素K相似,有类似维生素K的作用,它可以延长大鼠的凝血酶原时间，能够引起肝脏中碱性磷酸酶及血清总蛋白的升高。2.4.7.2抗微生物作用白花丹素能有杀灭金黄色葡萄球菌,抑制黑色银霉、脑膜炎双-21-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文球菌、流感杆菌的生成。2.4.7.3其他作用白花丹素对P388淋巴性白血病有效,能够抑制甲基胆蒽所致的大鼠肿瘤。低浓度时作用已很明显。2.4.8中亚白及淀粉、黏液质，黏液质主要由半纤维素组成。现代药理研究认为有增强血小板第三因子活性、抗炎、抑制纤维蛋白溶酶活性等作用。2.4.9奶桃含游离脂肪酸，羊脂酸，羊蜡酸，羊油酸，油酸，棕榈酸，脂蜡酸，月桂酸，豆甾三烯酸，豆甾醇，α－菠菜甾醇及甾醇，岩藻甾醇，β－豆甾醇。有抗炎、利尿、消肿，杀虫等作用。2.4.10洋甘菊含兰香油薁、原薁、α-甜没药萜酸、金合欢烯、甜没药萜醇氧化物-A，母素内酯，愈创内酯，母菊内酯酮，金丝桃苷，芸香苷等。现代药理研究认为有以下作用：抗菌消炎、解痉、抗溃疡作用。2.4.10.1解痉作用洋甘菊的中某些成分能够起到类罂粟碱样肌肉解痉作用。洋甘菊煎剂预防豚鼠及家兔因组胺引起的哮喘,它通过抑制豚鼠离体支气管及家兔离体肠管的收缩,抑制家兔气管分泌物的生成而达到预防作用.2.4.10.2抗菌消炎作用洋甘菊有抗真菌作用,其中的总挥发油、黄酮类、环醚类起作用,黄酮类物质还有抗炎成分。大鼠代谢性肿胀也可由洋甘菊中挥发油成分及其衍生物的作用得以消除。2.4.10.3抗溃疡作用洋甘菊中含甜没药萜醇,是抗溃疡的主要成分,它能够促进小鼠溃疡愈合,乙醇性溃疡可以在洋甘菊中总提取物的作用下得以愈合。2.4.10.4其他作用洋甘菊能增强家兔网状内皮系统的功能,洋甘菊的水或酸水提取分离物在动物实验及人体血液指标检测中证实有增强免疫的作用。2.4.11葡萄干含葡萄糖，单葡萄糖苷，酒石酸，苹果酸，双葡萄糖苷，果糖，木糖，蔗糖，草酸，枸橼酸。现代药理学认为：黄酮原关车菊酚（procyanidol)的低聚物能清除实验系统中的氧自由基，抗氧化活性，抑制脂质过氧化。3维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑血栓的作用机理3.1细胞间粘附分子（ICAM-1）细胞间粘附分子（ICAM-1）是一种介导细胞，是一种糖蛋白，在细胞与外基质之间相互粘附,含寡糖分子数，存在于细胞膜表面蛋白。在血管内皮细胞表达最高[38]的是ICAM-1，其次为外周白细胞。有文献报道，炎症刺激后ICAM-1的表达-22-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文[39]明显增加，说明ICAM-1的表达是可以诱导的。sICAM-1是由ICAM-1褪落而来，是ICAM-1的可溶性形式，是由血管内皮细胞表面表达的，当血清sICAM-1有变化的时候时，一定程度上可以反反映脑血管内皮细胞ICAM-1，在脑梗死时表达水平的变化。有试验结果显示，药物治疗组与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，维药强力玛得土力阿亚特蜜膏能够明显降低ICAM-1水平，抑制其表达，阻断ICAM-1的表达后也将与白细胞表面粘附受体的结合阻断，IL-1β的神经毒性作用阻断，打断之间的级联反应,挽救脑梗死区周围的缺血半暗带，减轻脑水肿,减轻脑缺血炎症,使半暗区神经元重新获得氧和营养，挽救受损的神经细胞,减轻局部缺血后的炎症反应,以改善神经功能,促进神经功能恢复。3.2白介素1β（IL-1β）白介素1β（IL-1β）可以激活磷脂酶A2，使磷脂过度的降解,它作为一个关[40]键因子，可以启动炎症反应网络，它参与白细胞的激活，小胶质细胞的激活，一系列潜在的神经毒性物质，如氧自由基，超氧化物出现等释放，直接或间接的引起[41,42]细胞膜损伤，内皮细胞转变为促凝状态而不是正常的抗凝状态，可此相关；它还会促进白细胞和内皮细胞之间的粘附,使介导粘附分子ICAM-1的表达升高，ICAM-1的表达上调会使白细胞聚集，从而引起血管的炎性反应；以促进IL-1β、[43,44]TNF-α、克隆刺激因子和IL-1β自身的合成；使局部兴奋性氨基酸增多,诱导一[45]氧化氮合酶表达,加重毒性损伤。动物试验结果显示，治疗药物组与模型组相比，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，维药强力玛得土力阿亚特蜜膏能够明显降低IL-1β水平，阻断其级联反应，以减轻脑水肿。3.3肿瘤坏死因子（TNF-α）肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种活性细胞因子，具有广泛生物学活性，一直存在争议，有的报道提示其加重神经元损伤，有的报道称减轻神经元损伤。后来大量研究发现，抑制TNF-a后，ICAM-1的表达也会下降，通过下调ICAM-1的表达，它会减轻脑缺血后的炎症反应，从而减轻脑水肿，来减轻缺血神经元的损伤。而且有研究发现脑组织早期缺血时如果降低TNF-α水平，会减轻大脑皮质及皮质下损伤，能够增加梗死周边区域的血流量，减轻神经功能缺损。参与机体免疫应答和炎症反[46]应，并且有浸润白细胞的作用。（1）脑组织损伤因白细胞引起，其途径可能是：微血管的阻塞；改变血管的顺应性；氧自由基的产生，细胞毒性酶的释放；增加细[47]胞因子和化学趋化因子释放等因素。(2)血管内皮细胞的作用：有研究指出，脑组织缺血后前列腺素，血小板活化因子合成增加及白三烯会增加，是通过触发花生四烯酸产生的级联反应。通过增加血脑屏障的通透性，改变局部脑血流量，改变血流变学，诱导中性粒细胞及血小板的活化、粘附。而且例如IL-1β、IL-8和MCP-1等细胞，这类炎症细胞因子和趋化因子，通过缺血内皮细胞也可表达及释放，内皮-23-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文[48,49,50]细胞粘附分子表达会通过介质而上调，最终缺血区会受到使白细胞浸润。(3)胶质细胞的作用：而胶质细胞活化后，它可以产生很多细胞因子，激活iNOS通路[51]产生过量的NO，可引起神经元凋亡等。维药强力玛得土力阿亚特蜜膏能够明显降低TNF-α水平，通过抑制TNF-α的大量表达与释放，减轻脑水肿的形成，较少对血脑屏障的破坏，减轻神经元的变性坏死，促进神经元的修复。4维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑血栓维医探讨处方中的干姜、胡椒（黑）荜拨、肉桂，属二级干热，白花丹属三级干热，消散寒气、开通湿寒阻塞，清脑爽心，驱寒强筋，健脑理肺；余甘子、洋甘菊、洋甘菊子二级干热，毛诃子一级干级二级湿，可成熟及清除异常黑胆质，开通湿气寒阻，可促进机体自然随和。中亚白及,一级湿热，奶桃，二级湿热，生湿养筋，驱寒强肌，滋补强身,温肾壮阳,生血益肝；葡萄干，一级干，补益神经，止痛消肿，发汗通便，利尿通经。诸药协调有序，既能使驱寒气外出，使邪气外达，又能断其异常体液之源，阻断病情进展而奏效。成熟异常胆质并清除之，扶助正气，健脑益肾，故偏瘫、舌中、肢体僵硬之疾可平。5维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑血栓现代医学探讨研究结果显示：维药强力玛得土力阿亚特蜜膏具有减轻和改善缺血后的炎症损伤的作用,且疗效与步长脑心通相接近。其机制可能是通过抑制TNF-α、IL-1β、ICAM-1的产生,达到缓解缺血缺氧后炎症级联反应,从而控制局部组织的水肿、坏死的发生,间接地达到保护神经细胞的作用。其进一步的机制仍需进行深入的研究以待结果。-24-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文小结1.本实验采用SD大鼠制作大脑中动脉栓塞的脑缺血模型，稳定可靠。2.维药强力玛得土力阿亚特蜜膏可改善MCAO大鼠神经功能缺损症状，减少脑梗死面积，减轻脑组织病理学损伤的改变;3.通过抑制TNF-α、IL-1β、ICAM-1的产生,达到缓解缺血缺氧后炎症级联反应,从而控制局部组织的水肿、坏死的发生,间接地达到保护神经细胞的作用可能是维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑缺血疾病的基础。-25-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文致谢三年时光转瞬即逝，即将告别相伴三年的老师，同学和师兄师姐师弟师妹们，告别带给我欢笑与艰辛的实验室，激动之情难以言表。这段我人生中黄金时光的经历，在我的人生中将是无可代替的宝贵财富，将是我一生中最值得记忆与回味的时光。此刻，对长期以来关心爱护，支持和帮助过我的老师，同学，学友和亲人致以深深的谢意。首先，我要向导师吕书勤教授表示由衷的敬意和诚挚的感谢。感谢导师的精心指导和谆谆教诲，特别是在工作、学习、科研等方面，老师指引了我人生发展的方向，培养了我的科研意识。虽然伴有许多挫折，但因为老师的精心指导和鼓励，使我顺利完成学业和课题的研究。导师精湛的医术、高尚的医德、严谨的科研态度及忘我的敬业精神，是我终生学习的楷模。感谢新疆医科大学附属中医医院神内二科张震中主任、吕光耀副主任、吕安坤主治医师、张倩主治医师，在实验设计及研究过程中给我的巨大帮助。新疆医科大学附属中医医院临床研究基地王晶老师，新疆医科大学附属中医医院病理科吴燕老师对我的指导。感谢在新疆医科大学一附院动物实验中心实验期间卓菲娅护士长、姜涛主任、苗老师、魏琴、寿玺及所有工作人员对我的帮助，感谢新疆医科大学一附院动物实验中心显微外科马嵋老师对实验动物模型的精心指导。感谢中医学院中心实验室刘宏炳老师、田树革老师给予的大力协助。感谢新疆维吾尔医院吐尔洪主任、古丽娜孜药师、阿依古丽老师对我维药基础及制剂学习的帮助。感谢阿不力孜、何丽娟、陈海英、宋建国同学在实验过程中给予我的帮助。在本课题统计设计及统计处理过程中，得到了统计教研室老师给予的精心指导和帮助，在此表示衷心感谢！-26-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文参考文献[1]ZhangLH,WeiEQTimecourseofbraindamageandexpressionofrelatedmoleculesinratswithtransientglobalcerebralischemia[J].ZhejiangUnivMedSci2002,31:77～80；[2]SelakovicV,ColicM,JovanovicM,etal.CerebrospinalfluidandplasmaconcentrationofsolubleintercellularadhesionmoleculeI,vascularcelladhesionmoleculeIandendothelialleukocyteadhesionmoleculeinpatientswithacuteischemicbraindisease[J].VojiosanitPregl,2003,60(2):139～146；[3]吴忧等.脑缺血动物模型的制备及影响因素[J].中国脑血管病杂志,2007,1（2）:56-57.[4]屈会化等.缺血性中风动物模型研究现状[J]中国实验动物学报,2010,18(4):67-68.[5]雅森米吉提等.维吾尔医学体液辩证分型及其相关疾病[J].新疆医科大学学报2010,33(6)43-44[6]巴吐尔·买买提明.复杂性疾病维吾尔医异常黑胆质证的代谢组学研究[J].中南大学2011,24,(4)39-40[7]徐卫芳等.异常黑胆质与肾虚痰瘀关系的研究[J]新疆医科大学学报2005,5(5),62-63[8]MontanerJ,RoviraA,MolinaCAetal.Plasmaticlevelofneuroinflammatorymarkerspredicttheextentofdiffusion-weightedimagelesionsinhyperacutestroke[J].JCetebBloodflowMetab;2003,23(12):1403～7；[9]肖莹等.线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型的研究进展[J]中国康复理论与实践,2006,11(4)102-104;[10]欧润姝等.大鼠脑缺血模型的制备方法与评价指标总结[J]中国现代实用医学杂志2005,12,(6),69-70;[11]谢宁等,线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血动物模型影响因素探析[J]中医药管理杂志,2006,12,(9)45-46[12]BernhardS,RudolfGCerebralIschemiaandReperfusion:ThePathophysiologicConceptasaBasisforClinicalTherapy.JCerebBloodFlowMetab,2004,24:351-371;[13]邵晓军等,缺血性脑血管病患者颅内外动脉狭窄的分布特征及预后研究[J]中华内科杂志2009,12,(7)38-39;[14]ClemensJA,SmalstigEB,RashKS,etal.Theantioxidant,LY341122,reduceshippocampalCA1neuronaldamageafterglobalischemiainrats.JCerebBloodFlowMetab,2009(suppl1):S183;[15]DianeS,TingguiY,BarrySE,etal.Transcriptionfactornuclearfactor-kappaBisactivatedinneuronsafterfocalcerebralischemia.JCerebBloodFlowMetab,2000,20:592-603;[16]李文星等,中风的中医预防研究概况[J]安徽中医药,2008,5,(7)98-99;[17]WangJDengHY,MaierCMetal.MildhypothemrisreducesICAM-1expressionneutrophilinfiltrationandmicroglia/monocyteaccumulationfollowingexperimentalstroke[J].-27-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文Neuroscience,2002,1141081～90；[18]BitterLS,OrozcoJA,CoullBM,etal.Leukocyteaccumulationandhemodynamicchangesinthecerebraimicrocirculationduringearlyreperfusionafterstroke[J].Shake,200031(5):1153～61；[19]YinL,OhtakiH,NakamachiTetal.DelayedexprssedTNFRIco-localizewithICAM-1inastrocyteinmicebrainaftertransientfocalischemia[J].NemasciLett,2004,370(1):30～35；[20]吴志远等,中风后运动功能恢复的功能磁共振成像研究[J]中国脑血管病,2008,9,(7)75-76;[21].DianeS,TingguiY,BarrySE,etal.Transcriptionfactornuclearfactor-kappaBisactivatedinneuronsafterfocalcerebralischemia.JCerebBloodFlowMetab,2000,20:592-603;[22]VemugantiR,DempseyRJBowenKKInhibitionofIntercellularadhesionmolecule-1proteinexpressionbyantisenseoligonucleotidesisneuroprotectiveaftertransientmiddlecerebralarteryocclusioninrats[J].Shake,2004,5(1):179～184；[23]温仲民等,大鼠急性局灶性脑缺血动物模型实验研究,[J],中国实验动物学报2004,4(2):107；[24]BroderCD,DinarelloCA,SaperCD.Interleukin-1immunoreactiveinnervationofthehumanhypothalamus.Science,1988，240:321；[25]戴炯等,改良线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型[J]上海交通大学学报：医学版2007,10,(8)90-91；[26]InamasuJ,HoriguchiT,SugaS,etal.Hypothermiaattenuatesexpressionofintercellularadhesionmolecule-1(ICAM-1)proteinintransientfocalmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)modelinrats.JCerebBloodFlowMetab,1997，17:S702；[27]徐佳等,大鼠栓线法MCAO模型中栓线插入深度的研究[J]上海实验动物科学,2002,4[28]HillhouseEW,KidaS,IannottiF.Middlecerebralarteryocclusionintheratcausesabiphasicroductionofimmunoreactiveinterleukin-1βinthecerebralcortex.NeurosciLett.1998,249(2-3):177；[28]王耀明等,MRI评价改进的大鼠可逆性局灶性脑缺血模型[J],卒中与神经疾病,1999,3；[30]刘勇民等.维吾尔药志[M].新疆：科技卫生出版社，1999.9；[31]哈木拉提·吾甫尔.维吾尔医气质、体液论及其现代研究，新疆科学技术出版社，第一版.2003，93-98；[32]雅森米吉提等,维吾尔医学体液辩证分型及其相关疾病[J]新疆医科大学学报,2010,33(6)67-77；[33]哈木拉提·吾甫尔等,维吾尔族异常黑胆质型患者基因多态性研究[J]中华医学遗传学杂志,2003,1；[34]吴建华等,药用姜研究进展[J]陕西中医学院学报,2002,1,(6)70-71；-28-万方数据 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新疆医科大学硕士学位论文[51]StrollG，JanderS，SchroeterM.Inflammationandglialresponsesinischemicbrainlesions[J].ProgNeurobiol，1998，65(2):149～171.-30-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文综述脑缺血后的炎症反应及相关治疗进展徐金凤综述吕书勤审校摘要近年来，越来越多的资料提示免疫炎症反应，尤其是炎症细胞和细胞因子，在脑缺血损伤中起着重要作用。本文从基础研究和临床试验两方面介绍了炎症细胞和细胞因子与脑缺血的关系，并探讨影响调节免疫炎症反应治疗的因素及应用前景。关键词脑缺血损伤;免疫炎症反应;炎症细胞;细胞因子以往观点认为，脑组织细胞仅具有很低的免疫活性，处于“免疫逃避”状态。近年来，越来越[1]多的资料提示免疫炎症反应在脑缺血损伤中起着重要作用。脑缺血后，缺血区常伴有各种炎症介质生成，脑微血管内皮功能障碍，白细胞粘附活化，并出现以白细胞浸润、大量炎症介质释放、脑水肿为特征的急性炎症的发生，进一步加重缺血神经元的损伤。针对脑缺血后炎症级联反应机制，有选择性的进行干预在动物实验及临床试验中都取得了很大进展，本文就有关内容做一综述。1脑缺血后的炎症细胞活化网络免疫炎症细胞在脑缺血时被激活以及作为细胞因子和炎症介质的释放和接受靶细胞在脑缺血损伤中具有举足轻重的作用。许多研究表明，在脑缺血后数小时内，神经胶质细胞迅速活化，白细胞开始向缺血区迁移并浸润等一系列反应发挥神经毒性作用。1.1中性粒细胞中性粒细胞在脑缺血后迟发性神经元损伤(DND)中起着关键作用，有三方面的证据:(1)再灌注缺血区内中性粒细胞聚集/粘附的时间过程与脑损伤扩展显著相关;(2)循环中中性粒细胞减少可以改善脑缺血损伤;(3)防止中性粒细胞粘附有脑保护作用。脑缺血再灌注后，循环中的中性粒细胞通过和脑微血管内皮细胞上表达的私附分子间的相互作用而浸润入缺血区脑组[2]织。中性拉细胞造成组织损伤的机制可能有以下几种:(1)活化的中性粒细胞释放溶酶体酶损伤生物膜，造成细胞破坏或溶解死亡;(2)中性粒细胞被激活后耗氧量明显增加，再灌注后重新获得氧气供应，使激活的白细胞产生大量氧自由基一氧爆发(oxygenburst)，导致细胞损伤;(3)大量中性粒细胞在微血管内积聚造成机械性阻塞，而其释放的血管活性物质引起血管痉挛，导致缺血区再灌注后“无复流”现象;(4)血管活性物质的释放进一步加重内皮细胞的损伤，血管通透性增加，脑水肿加重。髓过氧化物酶(MPO)是中性粒细胞表面的特征性酶，大量研究表明脑缺血后MPO活性明显升高，抗中性粒细胞抗体可以明显减轻脑损伤，降低Mpo免疫活[3]性.-31-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文1.2小胶质细胞近年来，小胶质细胞作为中枢神经系统固有的免疫效应细胞参与免疫反应受到人们广泛关注。小胶质细胞在脑缺血后异常活跃，脑缺血损伤诱发的小胶质细胞反应极其复杂，已远远超出了对神经细胞的营养支持和清除坏死组织的作用范围。实验表明小胶质细胞是第一个针对损伤产生应答的细胞，中枢神经系统缺血后，小胶质细胞迅速被激活。小胶质细胞对脑缺血产生的应答反应包括三个方面:I期是最初的、范围广泛而短暂的反应，发生于缺血后起始期尚无神经元变性的部位，也包括那些以后不出现神经元变性的部位，如海马CA3区，这种反应的特点是几乎没有形态学上的改变，小胶质细胞表达主要组织相容性复合物(MHC-I)类抗原，该期反应出现于缺血后20min到24h以内;II期是持久的、特异性的应答，发生于有神经元变性坏死的部位。该期见于缺血后48h，伴形态改变和细胞增殖，形态上表现为从带有分支的静.息状态转化为体积较大、胞体变圆并具有变形和吞噬作用的激活状态。功能上小胶质细胞表达MHC-II类杭原和补体受体CR3，起抗原递呈细胞的作用，启动脑缺血后的免疫炎症反应。同时，被激活的小胶质细胞开始显著上调许多细胞因子的分泌水平，其中一小部分如胶质细胞源性神经营养因子(glia-derivedneurotrophicfactor,GDNF)可能在神经元的存活中起重要作用，但大部分细胞因子被认为具有神经元损害作用，如TNF-a,IL-1β,等构成炎症反应的基础;III期即缺血后期，小胶质细胞转化为吞噬细胞，清除缺血坏死组织，缺血区形成为中风囊。2缺血后的炎症介质释放网络已有实验表明，NF-KB,TNF-a,IL等作为重要的炎症细胞因子，在脑缺血和再灌注损伤中通过促进神经胶质细胞释放细胞因子，内皮细胞表达私附分子等促进白细胞浸润，释放炎症介质，加速局部炎症反应，使脑组织损伤范围扩大和功能障碍加重。2.1NF一KB核因子是一种重要的氧化反应转录因子，广泛存在于真核细胞中，参与许多基因表达的调控，NF-KB由众多蛋白亚单位组成，其中P65和P50研究最为广泛。静息状态下，NF-KB与抑制亚单位IKB以无活性体的形式NF-KB/IKB存在于胞浆中。当细胞受刺激后，在蛋白激酶作用下，IKB发生磷酸化并与NF-KB解离，此时NF-KB激活。近年来许多研究表明，脑缺血后神经细胞、脑血管内皮细胞和胶质细胞中的NF-KB激活进入胞核并与靶序列结合，调节相关基因的转录活性，如ICAM-1,TNF-a,IL-1β等，其基因增强子和启动子中均含有与NF-KB的结合位点。已有实验发现，脑缺血急性期NF-KB表达明显升高，同时NF-KB可以通过上调ICAM-1的表达而介导循环中的中性粒细胞通过血脑屏障，触发脑缺血区炎症反[4][5.6]应。有学者应用抗氧化剂，如LY341122或蛋白酶阻滞剂(CVT634)或乙酞半脱氨酸治疗脑缺血动物模型，发现这些处理因素对局灶或全脑缺血模型都具有脑保护作用，可以明显抑制哪一KB活性，缩小脑梗死体积。矛盾的是，随着研究的深入越来越多的资料开始强调NF-KB在神经元损伤中的保护作用。有研究发现P50基因敲除小鼠海马区神经元对缺血后兴奋-32-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文[7][8]性氨基酸毒性耐受性降低，抑制NF-KB的活性反而加重神经元兴奋性毒性损伤。还有研[9]究发现NF-KB在抗缺血后神经元凋亡及增加神经突触可塑性方面起着重要作用哪一KB[10]的双重作用可能与其调节不同基因的转录及表达NF-KB的细胞种类有关.2.2TNF-aTNF-a作为一种具有广泛生物学活性的细胞因子，在脑缺血损伤中的作用日益受到人们的重视，但对于其是加重缺血神经元的损伤还是保护神经元免受损伤，报道尚不一致。1997[11]年，Nawashiro等运用TNF结合蛋白抑制剂阻断TNF-a的作用，发现实验组小鼠脑梗死体[12]积明显减轻。1998年，Yang等实验发现，拮抗TNF-a可通过下调ICAM-1的表达，减轻[13]脑缺血后的炎症反应而改善缺血神经元的损伤。同年，Lavine等进行了抗TNF-a循环抗体干预大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤作用的研究，发现脑缺血再灌注早期即有TNF-a迅速而短暂的释放入血，预先静脉给予抗TNF-a抗体可减轻大脑皮质(71%)和皮质下(58%)损伤，使梗死周围区血流量增加，神经功能缺损减轻。近年来，有不少实验发现预先应用TNF-a可提高脑缺血耐受性(ischemictolerance,IT)，达到与缺血预处理(ischemicpreconditioning,IP)相同的[14.15]脑保护作用。小鼠MCAO前48h经脑池给予TNF-a可以明显缩小脑梗死体积，TNF-a的这种脑保护作用可能与其增强神经元在再灌注过程中抗氧自由基损伤能力有关，此外，TNF-a尚可刺激神经生长因子在许多细胞中的表达，促进神经元的修复。IP和TNF-a预处理使细胞内神经酞胺升高2一3倍，与IT同时发生，FumonisinBI为一种神经酞胺合成酶抑制剂，可减弱神经酞胺上调和IP效应，因此有人提出IP诱导的IT是由TNF-a触发的神经酞胺合成介导的，TNF-a预处理可代替不现实的IP诱导IT。2.3ILIL主要是由单核细胞(包括淋巴细胞和单核-巨噬细胞)产生的一组免疫活性因子，作用于白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和其他细胞，发挥多种生物学效应，共同参与机体免疫反应、应激反应和炎症调节。不同类型的IL，在脑缺血时发挥不同的作用。IL-1和IL-6具有神经毒性和神经保护双重作用;IL-8介导脑缺血后的炎症反应;而IL-3和IL-10具有保护缺血神经元的作用。IL-1日是一种重要的促炎因子，可以协同NF-KB、TNF-a上调粘附分子的表达，介导缺血后的炎症反应。有学者用携带IL-1受体拮抗剂基因的腺病毒为载体通过侧脑室转染永久性脑缺血小鼠，[16]发现脑缺血区ICAM-1蛋白表达量明显减少50-60%。IL-8又称单核细胞衍生的中性粒细胞趋化因子(monocyte-derivedneutrophilchemotacticfactor,MDNCF)、中性粒细胞激活肤(neutrophil-activatingpeptide,NAP),T细胞趋化因子等，其主要生物学功能是在炎症反应过程中趋化中性粒细胞及T淋巴细胞，使细胞表面表达粘附分子，增强炎症细胞和血管内皮细胞的粘附，并诱导细胞变形、脱颗粒反应、呼吸爆发和溶酶体酶释放，使细胞得以激活。Matsumoto[17])等通过兔脑缺血再灌注模型研究发现，再灌注后6h脑组织内IL-8水平明显升高，利用免疫组化法在血管内皮细胞和浸润的中性粒细胞内检测到IL-8，用抗IL-8抗体可显著减轻脑水肿，缩小梗死面积，说明IL-8参与缺血后的炎症反应，加重损伤。-33-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文2.4粘附分子粘附分子是由细胞产生、介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的分子。包括四大类:免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择素家族和钙粘蛋白家族。白细胞私附至内皮、迁移并穿越内皮过程中，各种粘附分子和受体间的相互作用十分复杂。已提出用多步骤“私附级联反应”解释白细胞在血循环中的聚集及渗出至炎症部位的过程。这一过程一般分为细胞滚动、粘附、移行及渗出等四个阶段，在每一阶段，都有相应的粘附分子与其配体相结合发挥重要作用，如ICAM-1/LFA-1(CD18/11a).ICAM-1/Mac-1(CD18/llb),VCAM-1/VLA-4等。目前研究较多、作用较明确的有细胞间私附分子-1(ICAM-1),P-选择素(P-selectin)。[18][19]Connolly在1996年，和1997年，分别对ICAM-1和P-selectin在脑缺血再灌注损伤中的作用做了大量研究，作者分别选用ICAM-1-/-的裸小鼠与野生型小鼠(ICAM-l+/+),P-selectin-/-的裸小鼠与野生型小鼠(P-selectin+/+)进行大脑中动脉闭塞(MCAO)模型对照研究，发现裸小鼠脑梗死体积及缺血区白细胞聚集数均明显少于野生型小鼠，前者再灌注后梗死区[20]血流量及神经功能缺损均较后者有所改善;Raghu等运用ICAM-1寡义反核普酸通过侧脑室注射干预自发性高血压大鼠脑缺血再灌注模型，发现干预组大鼠ICAM-1蛋白表达抑制，脑[21]梗死体积缩小56%;Prestigiacomo等用CD18基因表达缺陷小鼠和正常小鼠对照研究亦取得[22]上述相似结果;Zhang等应用抗ICAM-1单克隆抗体对大鼠MCAO模型进行干预治疗，亦发现干预措施仅对脑缺血后的再灌注损伤有保护作用，而对永久性MCAO未显示治疗效果，提示再灌注状态是抗粘附分子治疗取得疗效的前提条件。[23]Zhang等，联合应用Northern-blot和免疫组化法最早研究大鼠脑缺血后私附分子的表达时间规律，发现ICAM-1mRNA的表达在MCAO2h再灌注1h开始升高，10-12h达高峰，可持续5-7天;而ICAM-1蛋白合成在再灌注1h开始增加，46h达高峰，持续7天。最近Berti(24)等通过大鼠MCAO2h模型分别在再灌注后3h,6h.12h.24h.72h时间点应用新技术定量即时RTPCR(real-timeRT-PCR)检测与炎症有关的几个重要基因的mRNA，研究发现再灌注3h后梗死区ICAM-1mRNA表达逐渐升高，24h是非缺血侧的5倍，72h升高达顶峰;E-selectinmRNA再灌注后6h升高达顶峰，此时缺血侧是非缺血侧的10倍，此后mRNA表达水平渐降低，但在再灌注后72h仍高于正常表达水平;VCAM-1mRNA在MCAO2h再灌注72h过程中，缺血侧与非缺血侧相比都没有差异，作者认为这可能是由于中性粒细胞不表达VLA-4,VCAM-1不参与缺血后早期中性粒细胞的趋化和迁移，但在缺血后期单核/巨噬细胞浸润、吞噬坏死组织过程中VCAM-1/VLA-4起着重要作用。3抗炎症反应脑保护治疗研究目前，对缺血性脑卒中治疗比较一致的观点，就是尽力挽救缺血梗死区周围的半暗带，一方面超早期溶栓治疗，尽早恢复半暗带血液再灌注，使半暗区神经元重新获得氧和营养，另一方面早期应用神经保护剂，竭力保护周围半暗区可逆性损伤的神经细胞免受再灌注损伤。1996年美国FDA重组纤溶酶原激活物(rt-PA)批准获得上市，使闭塞后的血管再通成为可能，是人类缺血性脑梗死治疗史上的一个重大里程碑。然而，到目前为止尚无一种被临床验证确-34-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文实有效的神经保护制剂问世，说明神经保护药物的研发是当今临床和基础神经科学工作者巫待攻关的科学难题。现在，有多种手段通过抑制炎性细胞因子的作用，减轻缺血后局部炎症反应，挽救受损神经细胞。如抗炎性细胞因子的单克隆抗体、受体拮杭剂、炎性细胞因子基因敲除等在动物实验中都取得了很好效果，但临床试验结果却让人失望。世人较为关注的Enlimomab(一种鼠[25]源性抗人ICAM-1单克隆抗体)临床试验，因为患者使用后感染、发热、预后差等因素而被[26]迫中途夭折。随后Furuyu等对无效原因进行了动物实验，认为Enlimomab的确能够减少缺血区白细胞聚集，但其有利作用可能被Enlimomab作为一种异源性蛋白刺激机体免疫系统的复杂反应所抵消;还可能与入选病人未能进行有效再灌注有关。亚低温疗法是目前比较有前途的一种神经保护治疗方法。低温可以明显降低脑组织耗氧量和代谢率，延缓能量的耗竭，减少乳酸生成，减轻酸中毒。国外有学者研究发现亚低温可以降低大鼠缺血再灌注后脑缺血区ICAM-1的表达，减少梗死区中性粒细胞的浸润，缩小梗[27][28]死面积和改善神经功能缺损。Kawai等，用RT-PCR研究发现，低温可以抑制ICAM-1mRNA的表达，同时检测相同标本的MPO活性，低温组明显低于常温组，认为亚低温的脑保护作用机制可能与其抑制中性粒细胞介导的炎症反应有关。在临床上对大量卒中患者观察发现，体温与病情严重程度、梗死体积、神经功能缺损存在独立的正相关关系，体温每升高1℃，预后不良的危险性增加2.2%，而卒中后数天内进行头颅降温可以明显改善患者预后。当然，亚低温治疗在临床也存在许多问题，诸如低温最佳温度、亚低温治疗有效时间窗、亚低温实施方案及患者的选择等都是今后在临床工作中需要解决的问题。近年来，“鸡尾酒”疗法受到神经科临床工作者的广泛关注。由于缺血后神经元损伤的机制是多途径的，治疗就应该针对缺血级联反应机制采取“多方式治疗(multimodalitytherapy)"。有学者动物实验研究发现，与单用抗ICAM-1或抗CD18相比，合用rt-PA及抗ICAM-1或抗CD18可显著减少脑梗死面积，改善神经功能评分，说明抑制缺血后的炎症反应可以增强溶栓[29.30]治疗效果另外，有实验发现NF一kB活化抑制剂PS-519在脑缺血后2h及4h应用可以减轻脑缺血损伤，而在脑缺血后6h没有效果，rt-PA在脑缺血后2h应用可以改善损伤，脑缺血后4h没有效果，然而两者联合应用即使在脑缺血后6h亦可明显缩小脑梗死面积，改善神经功能恢复，而不会增加溶栓治疗脑出血的危险性，说明抑制炎性细胞因子的作用可以延长[31]溶栓治疗时间窗。遗憾的是，所有这些都还处于动物实验阶段，“鸡尾酒”疗法要真正应用到临床还有很长一段路要走。当然，对于调节缺血后炎症反应在动物实验和临床试验中得出两种不同结果，究其原因很多。一方面与动物模型有关，由于种属的差异，人类卒中损伤级联反应与动物可能不同，而且动物可以耐受副作用、生理参数及给药时间的控制，而人类卒中后存在明显个体差异及系列参数的不可控性;另一方面与临床试验设计方案的不足有关，临床试验设计中，对于病例的选择过于笼统，没有充分考虑病因和有无自发性或医源性再通以及患者的个体情况。另外，由于供血动脉闭塞，药物能否在有效时间窗内进入梗死区，并达到有效浓度，这是目前应着重解决的问题。-35-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文综上所述，脑缺血后存在炎症细胞及其释放的炎症因子的复杂网络，共同组成脑组织由缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础。针对复杂的炎症反应网络，采取积极有效措施抑制缺血后炎症反应，或与溶栓药物联合、早期使用，这可能是今后治疗缺血性脑卒中的一个很好途径。参考文献[1]FrijnsC.J.M,KappelleL.J.Inflammatorycelladhesionmoleculesinischemiccerebrovasculardisease.Stroke,2002,33:2115-2122[2]JeanWC,SpdllmanSR,NussbaumES,etal.Reperfusioninjuryafterfocalcerebralischemiaaheroleofinflammationandthetherapeutichorizon.Neurosurgery,2008,43:1382-1397[3]MatsuoY,OnoderaH,ShigaY,etal.Correlationbetweenmyeloperoxidase-quantifideneutrophilaccumulationandischemicbraininjuryintherat.Stroke,2004,25:1469-1475[4]BernhardS,RudolfGCerebralIschemiaandReperfusion:ThePathophysiologicConceptasaBasisforClinicalTherapy.JCerebBloodFlowMetab,2004,24:351-371[5]ClemensJA,SmalstigEB,RashKS,etal.Theantioxidant,LY341122,reduceshippocampalCA1neuronaldamageafterglobalischemiainrats.JCerebBloodFlowMetab,2009(suppl1):S183[6]DianeS,TingguiY,BarrySE,etal.Transcriptionfactornuclearfactor-kappaBisactivatedinneuronsafterfocalcerebralischemia.JCerebBloodFlowMetab,2000,20:592-603[7]YuZ,ZhouD,Bruce-KellerAJ,etal.Lackofthep50subunitofnuclearfactor-kappaBincreasesthevulnerabilityofhippocampalneuronstoexcitotoxicinjury.JNeurosci,2009,19:8856-8865[8]BotchkinaGI,GeimonenE,BilofML,etal.LossofNF-kappaBactivityduringcerebralischemiaandTNFcytotoxieity.MolMed,2009,5:372-381[9]MattsonMP,CulmseeC,YuZF,etal.RolesofnuclearfactorkappaBinneuronalsurvivalandplasticity.JNeurochem,2000,74:443-456[10]FrankRS,AigangL,YangT,etal.Multiplemolecularpenumbrasafterfocalcerebralischemia.JCerebBloodFlowMetab,2000,20:1011一1032[11]NawashiroH,MartinD,HallenbeckJM.NeuroprotectectiveeffectsofTNFbindingproteininfocalcerebralischemia.BrainRes,2007,778:265-271[12]YangGY,GongC,QinZ,etal.InhibibionofTNF-aattenuatesinfarctvolumeandICAM-1expressioninischemicmousebrain.Neruroreport,2008,9:2131-2134[13]LabineSD,HofmanFM,ZlokovicBVCirculatingantibodyagainsttumornecrosisfactor-a-36-万方数据 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新疆医科大学硕士学位论文intercellularadhesionmolecule-1antibody:aedside-to-benchstudy.Stroke,2001,32:2665-2674[27]InamasuJ,HoriguchiT,SugaS,etal.Hypothermiaattenuatesexpressionofintercellularadhesionmolecule-1(ICAM-1)proteinintransientfocalmiddlecerebralarteryocclusion(MCAO)modelinrats.JCerebBloodFlowMetab,1997，17:S702[28]KawaiN,OkauchiM,MorisakiK,etal.Effectsofdelayedintraischemicandpostischemichypothermiaonafocalmodeloftransientcerebralischemiainrats.Stroke,2000,31:1982一1989[29]ZhangRL,ZhangZqChoppM.Increasedtherapeuticefficacywithrt-PAandanti-CD18antibodytreatmentofstrokeintherat.Neurology,2009,52:273-279[30]ZhangRL,ZhangZ几ChoppM,etal.Thrombolysiswithtissueplasminogenactivatoraltersadhesionmoleculeexpressionintheischemicratbrain.Stroke,2004,30:624-629[31]ZhangL,ZhangZGZhangRL,etal.Postischemic(6-hour)treatmentwithrecombinanthumantissueplasminogenactivatorandproteasomeinhibitorPS-519reducesinfarctioninaratmodelofembolicfocalcerebralischemia.Stroke,2001,32:2926-2931-38-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文攻读硕士学位期间发表的学术论文1.徐金凤,吕书勤等.脑缺血后的炎症反应及相关治疗进展（待发表）2.徐金凤,吕书勤等.维药强力玛得土力阿亚特蜜膏对脑缺血大鼠ICAM-1、IL-1β及TNF-a表达的影响（待发表）-39-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文个人简历徐金凤，29岁，汉族，住院医师。2007年7月毕业于新疆医科大学中医学院，获得学士学位。2007年12月至2010年1月进行住院医师规范化培训，2010年2月从事神经内科临床工作，担任住院医师；2009年3月在新疆医科大学攻读同等学力在职硕士学位。-40-万方数据 新疆医科大学硕士学位论文新疆医科大学硕士研究生学位论文导师评阅表研究生姓名徐金凤学号9100所在学院中医学院导师姓名吕书勤专业中医内科学研究方向脑血管病论文题目维药强力玛得土力阿亚特蜜膏治疗脑血栓及其作用机理的研究学术评语：脑血栓是中枢神经脑血管疾病，具有易复发和致残率高的特点。通过本试验研究初步探讨维药强力玛得土力阿亚特蜜膏对缺血性脑血管疾病可能的炎性脑保护作用机制；这对于进一步进行该药治疗脑血栓的有效机制和作用靶点奠定进一步研究的工作基础，具有良好的开发应用前景。该课题设计合理，思路新颖，有一定的临床实用价值。论文论述内容颇具深度，思路清晰，结构合理，层次分明，叙述到位，内容详实，图表规范，数据真实。论文水平反映该同学具有较为扎实的理论功底，清晰的科研思路，并能够利用所学知识解决实际问题，具备一定的科研能力。同意该生提交学位论文，并进行论文答辩。指导教师签字：年月日-41-万方数据