近红外和拉曼光谱法测定蜂蜜掺假-.研究 88页

张欣硕+}：学位论文目录ABSTRACTNearinfraredspectroscopyisefficientforthedetectionofreducingsugarinhoney，whichcostlittletimeandbewithhighaccuracy．Meanwhile，datapretreatmentmethods，suchasMSC，Norrissmooth，firstderivative，secondderivative．areusefultreatmenttoimprovetheaccuracyofthemodel．ThepredictionaccuracyofthemodeliShigherthanthosebuiltbyoverseasresearchers．Thisarticlestudiedthetestmethodsoffructose，glucose，sucroseandmaltosebyNear．infraredspectroscopy．Theresultsshowthat,Kennard—StonemethodiSaneffectivealgorithmtodevisethecalibrationsetandthevalidationset．MonteCarlocrossvalidationwasusedtoexcludetheoutliers．Thedeterminationcoefficientsofpredictvalueandtherealvaluefructose，glucose，sucroseandmaltoseare0．945，0．927，O．90l，0．610and0．971，0．940，0．949，0．750separatelybeforeandafterexcludedtheoutlier．Itefficientlyimprovedthedatadistributionandtheaccuracyofthemodel．ThemodelbuiltwithNearinfraredspectroscopyaftertheWavelettransfoIllliSnosignificantchange．butitiSlesstimeconsuming．whichiS2．76sotherthan3．65sbeforetheWavelettransforill．Thehoneysamplesthatwereusedtobuildmodel，werecollectedfromteensofprovident．thegeographicandpollenofthehoneyhavesomeimpactsonthespectrum．Itiswiderimplicatedundercomplexconditions．Toadapttheneedoftheactualdetection，theadulterationsampleswereincludedinthemodel．Byusingthechmometricmethods，theresultspredictedbytheNearinfraredspectroscopyareaccurateandreliable．SoitiSfeasibilitytobuildarapidonlinetestingtechnologyforthequalitycontrolofhoney．ThecrossvalidationcoefficientofdeterrninationofHⅣ匝andtotalacidwere0．571and0．640separately．ThebestpredictionaccuracyoftheBPneuralnetworkisover90％inallthedifferentwaysofadulterationinhoneysamplesincludingadulteratesucrose，glucoseseparatelyandadulteratesucroseandglucosetogether．ButtheBPneuralnetworkiswithpoorstability，andithadgottotallynI 张欣硕I：学位论文目录differentdiscriminateresultsforthesamesetofdata．UsingRBFneuralnetworkinstead，47iterationswaschosen，andsettheMSEaSO．05，theerrorrateofvalidationsetandtestsetwerelowerthanthatofBPneuralnetwork，andthetestseterrorrateiS0．Moreover，RBFneuralnetworkmodeliSwithagoodrepeatability．Insummary，thenear—infraredspectroscopymeetthedemandofhighperformancetestingandqualitycontroltechnologyforreducingsugar，fructose，glucose，sucroseandmaltose．ThefeasibilityofusingRamanspectroscopytodeterminechemicalcompositionofhoneyWasexamined．Theinfluencesofspectrumpretreatmentontheperformanceofcalibrationequationswerealsostudied．TheregressionmodelofSupportVectorMachines(SVM)Wasselectedforthecalibrationofhoneyfructose，glucose，sucroseandmoisture．Goodpredictionswereobtainedforfructose，glucoseandmoisturewithsquaredcorrelation(R)of0．84，0．87and0．75betweenthepredictedvaluesandthereferencevalues．Thepredictionaccuracyforsucroseinhoneywaspoorandunreliable．ThestudyindicatesthatRamanspectroscopycanbeusedforfastdeterminationofmajorcomponentsinhoney．Inthequalitativeidentificationofadulterationinhoney．thebaselinecorrectioniSunnecessary．Afterthecentralizationofthespectrum．thePLS．LDAmodelshadbeenbuiltandthecrossvalidationerrorratewerealllowerthan0．04．andthecorrectrateofthepredictionsetwas100％．Thelessadulatedvolumeandthemorecomplexmethodofadulteration．thehighererrorrate．Insummary，Ramanspectroscopycouldanalyzefructoseandglucoseinhoneyquickly．However，furtherresearchininstrumentsandchmometricsisneededfortheanalysisofsucroseandmaltose．KEYWORDS：Nearinfrared，Raman，Honey，qualitative，quantitativeIV 张欣硕士学位论文目录BPNNCARSCVGAPLSKSLDASVMMCCVMLRMSCNIRSPCAPCRQ2RRB刚符号与缩略词表BackPropagationNeuralNetwork反向传播神经网络Competitiveadaptivereweightedsampling竞争性自适应重加权采样CrossValidationGeneticAlgorithmParcialLeastSquaresKennard．StoneLinerDiscriminatAnalysisSupportVectorMachinesMonte．．Carlocross．．validationMultipleLinearRegressionMultiplicativeScatterCalibrationNearInfraredSpectroscopyPrincipleComponentAnalysisPrincipleComponentRegressionCrossValidationCorrelationCoefficientCorrelationCoefficientRadicalBasisFunctionNeuralNetworksRMSECVRootMeanSquareErrorofValidationRMSEPRootMeanSquareErrorofPredictionRSRandomSelectionSPXYSampleSetPartitioningbasedonjointX-YdistanceWavelettransformationV交互检验遗传算法偏最小二乘法线性判别分析支持向量机蒙特卡罗交互验证多元线性回归法多元散射校正近红外光谱法主成分分析主成分回归交互验证相关系数相关系数径向机神经网络交叉检验均方差毫预测均方差随机选择基于连接X．Y距离的样本集划分法小波变换 张欣硕二l：学位论文目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．III目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Vl第一章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1课题研究的背景和意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。l1．1．1课题研究背景⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1．1．2国内外蜂蜜鉴伪研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯．21．2近红外光谱技术介绍⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．2．1近红外光谱技术原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．2．2近红外光谱法的发展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．3近红外光谱法的特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41．2．4近红外光谱在食品安全领域的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．2．5近红外光谱技术在食品安全领域应用展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．3拉曼光谱技术介绍⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。91．3．1拉曼光谱原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．3．2拉曼光谱定性和定量分析技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．4近红外与拉曼光谱特点比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lO1．5研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第二章近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l52．2．1样品来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。l52．2．2样品光谱采集方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l52．2．3还原糖测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．152．2．4蜂蜜果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的液相色谱测定⋯⋯⋯⋯⋯。172．2．5蜂蜜中羟甲基糠醛测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．182．2．6蜂蜜中总氮测定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。192．2．7光谱处理方法与原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232．3．1还原糖的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．232．3．2近红外光谱对果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的测定⋯⋯⋯⋯⋯．．292．3．3蒙特卡罗交互验证法剔除奇异值⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3l2．3．4小波滤噪⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．35VI 张欣硕，I：学位论文目录2．3．5PLS校正模型的建立和检验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．372．3．6羟甲基糠醛和总酸的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．392．4结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39第三章近红外定性测定蜂蜜掺假⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l3．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4l3．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l3．2．1样品来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4l3．2．2样品光谱采集方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l3．2．3光谱处理方法与原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．423．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．433．3．1数据的预处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯433．3．2BP神经网络的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯433．3．3RBF神经网络的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46第四章拉曼光谱定量测定蜂蜜中主要糖分含量研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．474．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．474．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．474．2．1样品制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47．4．2．2高效液相色谱分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一474．2．3仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯484．2．4数据处理方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．484．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯494．3．1样本选择及光谱收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．494．3．2airPLS基线扣除法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l4．3．3CARS法选择变量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯534．3．4PLS模型的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯564．3．5SVM参数选择方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯564．3．6SVM模型的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．584．4结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6l第五章拉曼光谱定性判别蜂蜜掺假⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．625．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．625．2材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯635．2．1样品来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．635．2．2光谱采集方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯635．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64Vll 张欣硕士学位论文目录第六章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯666．1研究结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯666．2近红外光谱和拉曼光谱在蜂蜜检测应用中的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯676．3创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯686．4研究中存在问题和建议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯68参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。70致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯78攻读学位期间主要的研究成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯79 张欣硕I：学位论文绪论第一章绪论1．1课题研究的背景和意义1．1．1课题研究背景蜂蜜是一种药食同源的商品。在我国蜂蜜作为药用，历史悠久，最早记载于《神农本草经》，原名石蜜。具有补中润燥，止痛解毒之功能。之后著名医学家李时珍在《本草纲目》中也记载有“蜂蜜其药之功清热也，解毒也，润燥也，止痛也。“蜂蜜生凉熟温，不冷不燥，得中和之气，故十二脏腑之病，用无不宜之”。生则性凉，故能清热，熟则性温，故能补中。甘而和平，故能解毒。柔而润泽，故能润燥。缓可以去急，故能止心腹、肌肉、疮疡之痛。缓可以致中，故能调和百药与甘草同功。由于蜂蜜具有较强的防腐性和矫味作用，历来是许多中药炮炙“不可缺少的辅料"。蜂蜜久服能强志轻身，不饥不老。陶弘景也说：“石蜜道家丸饵，莫不须之，若炼后服用，云致长生不老也"。因此，千百年来我国对蜂蜜的滋补价值已有较高的认识【ll。’据现代科学分析：蜂蜜中含有果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及其他淀粉和多酶类物质，并含有人体所必须的丙氨酸，精氨酸等十多种氨基酸和蛋白质。蜂蜜中还含有重要的维生素如维生素D、硫胺酸(B1)、核黄素(B6)、吡哆醇(B6)、泛酸、什酸等。蜂蜜中还含有丰富的矿物质，与人体血液里所含的量十分接近，所以蜂蜜既是天然的滋补营养品，又是治病防病良药12j。我国既是蜂蜜生产大国，也是蜂蜜消费大国，同时也是蜂蜜出口大国。近些年来，蜂蜜的世界年贸易总量约在20万吨左右，其中我国出口约占40％。然而，在国际交易中，部分商家缺乏产品质量意识，我国蜂蜜质量不断下降，在贸易中信誉降低，主要原因之一就是蜂蜜产品掺假问题，最终导致蜂蜜出口量大幅下降13]。要解决蜂蜜生产行业中的这些问题，即要求生产者自己采取有效地质量控制措施，同时也需要相关标准的制定和监管部门强有力的检测手段。为此，国家有关部门已经制定了针对蜂蜜产假问题的C4同位素鉴定国家标准和强制性国家标准《蜂蜜》，这些措施已经在市场监督的具体实施中起到了积极地作用。但是，蜂蜜作为一种主要成分是糖的商品，掺假原料容易获得，一旦掺入又很难检测，加之不同种类的蜂蜜成分变化很大。例如，其果糖含量约为30．9l％．44．26％，葡萄糖约22．89％．40．75％，而果糖与葡萄糖的比率臣IJWG其变化范围在O．76到1．86之间【4l。另一个原因是因为蜂蜜掺假后其感官判定与大部分理化指标测定与天然蜂蜜产品极其相似，即便是按照国标的标准也不能确定其真假。所有这些因素都为鉴别蜂蜜是否掺假带来了很大的困难，使得检测手段本身程序繁琐，检测结果l 张欣硕，lj学位论文绪论的验证又难以得到确认I引。1．1．2国内外蜂蜜鉴伪研究进展当前蜂蜜掺假的检测方法主要包括以下手段：(1)高效液相色谱法高效液相色谱是一种广泛应用的化学成分测定方法，该方法很早就被应用于蜂蜜掺假的检测，Ferreres等人在食品与农业科学杂志发表了用高效液相色谱法测定蜂蜜蜜源植物的方法【61，李敬慈等人【7】早在1995年就公布了该方法在蜂蜜掺假方面的应用研究，但是这种方法难以应用于低浓度掺假或掺入与蜂蜜成分相似的糖浆的检测。同时高效液相色谱操作繁琐，对检验员技术要求较高。(2)示差扫描量热法(DSC)18J示差扫描量热法的原理是在程序控制温度下，测量输入到试样和参比物的功率差与温度的关系，例如这种关系可以以热的形式进行测量。Cordelia等人在2003年的研究包括摘要正宗蜂蜜和糖浆(工业和自制)热行为。首先他们确认了对蜂蜜掺假行为的热效应以前的结果，通过对30个蜂蜜样品(刺槐，薰衣草，板栗，杉木)，分析YDSC和它们的Tg结果。结果表明，这个参数是能够显著区分这些品种。5．10％的水平上的掺假水平可以测出【91。示差扫描量热仪记录到的曲线可以测定多种热力学和动力学参数，例如比热容、反应热、转变热、相图、反应速率、结晶速率、高聚物结晶度、样品纯度等，这种曲线称为DSC曲线fl01。另外Cordelia等人还对纯蜂蜜和纯糖浆进行DSC实验【9】，表明糖浆具有相当高的熔化焓(△H)，AH与糖浆浓度的线性方程的灵敏度可达到5％．10％，因此该方法可以用来区别蜂蜜和糖浆。(3)同位素分析、法l¨J单子叶植物也nqc4植物，双子叶植物称为C3植物，在单子叶植物和双子叶植物中，13C／眩C的比值有所区别，C4循环植物的13C含量高于C3循环的植物。起初，设定6bC值为．23．5％o作为为掺假界限，当被测蜂蜜样品的613C值大于。23．5％o时，将会怀疑可能在蜂蜜中掺入了其它的糖浆。但是为了应对这些监测，一些不法商贩在蜂蜜中掺加人造甜味剂，使613c值小于．23．5％o，为此Padovan等人【”J在此基础上设计出内标同位素比分析法用以鉴别这类掺假。但是其仪器造价昂贵，通常条件下绝大多数检测部门都难以支付得起这么大的一笔费用，因此难以推广。为了降低仪器成本，人们在此基础上通过液质联用技术，可以同时检测到蜂蜜样品中多种糖类(如葡萄糖、果糖和蔗糖)的6BC值。不同糖类该数值的不同特征作为依据，为蜂蜜掺假的检测提供了一些更为敏感的信息，从而达到监测更低浓度掺假糖浆的目的。用这种方法检测的最小掺假浓度在5％．10％之间，比上述方法有一定优势，然而仍不能避免仪器昂贵，测试方法繁琐的弊端1121。 张欣硕’l：学位论文绪论(4)双果糖酐(difructoseanhydrides，DFAs)检测法【13】双果糖酐是～类假二糖，这种假二糖由两个果糖分子缩聚产生，食物在加热过程中由糖类或含糖丰富的的焦糖化反应会产生该物质。Ruiz．Matute等人114l向纯蜂蜜样品巾分别掺加不同浓度的高果糖浆和玉米糖浆，之后采用GC．MS法测定掺假后的蜂蜜中DFAs的含量，发现在掺加糖浆蜂蜜样品中有13个DFA峰，而在掺加葡萄糖的样品中只有5个峰。同时由于DFA7和DFA9在洗脱时没有色谱干扰，其相对含量在蜂蜜中比真样本，因此它们可以作为检测蜂蜜是否掺假的标记物质。通过对这两利-在不同的蜂蜜样品中的含量的检测，可以看出纯蜂蜜和掺加浓度。利用DFAs作为标记物质检测掺假具有相当高的灵敏度，其检测限约为5％。(5)阴离子交换一脉冲安培检测色谱法(HPAEC．PAD)阴离子交换一脉冲安培检测色谱法相对于配备示差折光检测器的高效液相色谱法精确度较高，不受测试环境影响。Morales等人用该方法测试了蜂蜜中多糖等成分【1Sl。也有人的研究运用该方法从蜂蜜样品中分离13种主要糖类，并对它们进行线性判别分析(LDA)和偏最dx--乘(PLS)分析。Cordelia采用该方法结合模式识别成功鉴别了蜂蜜中的掺假ll61。这一方法的优点是可操作性相对于同位素方法操作要简单一些，同时其灵敏度高【l7，18】。(6)天然同位素核磁共振法{191特殊位点的天然同位素核磁共振法原理是基于对分子特殊位置的氘和氢的比率，通过测定这两种元素比率判别蜂蜜是否掺假。该方法需要繁琐的前处理过程，先经过发酵和蒸馏，分离出乙醇，之后再分析乙醇分子中的甲基和亚甲基，Lindner等人用该方法表征了以色列蜂蜜的主要特型201，这些成分分析后超出某一比值，样品就认为被掺假。因此该方法需要对大量数据进行处理以保证结果的有效性，操作繁琐，浪费人力物力。综上所述，蜂蜜掺假问题早就成为伞球化的难题，也是各国食品和分析化学科学家研究的热点。因此Ill前急需一种方法可以做到对绝大多数的掺假都有很好的检测能力【2¨。为此我们要开发一种具有盲测能力的监测技术，即无论掺入何种物质，在不知道掺入成分的情况下即可测得其是否掺假的一种技术，从而从根本上杜绝蜂蜜掺假。1．2近红外光谱技术介绍1．2．1近红外光谱技术原理近红外光(NearInfrared，NIR)介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间，通常可以将该区的电磁波划分为近红外长波(1100-2526nm)和近红外短波3 张欣硕一l：学位论文绪论(780．1100nm)两个区域【221。按美国试验和材料检测协会(ASTM)定义是波长在780．2526nm范围内的电磁波。由于不同的有机物含有不同的基团，而且不同的基团有不同的能级，不同的基团和同一基团在不同物理化学环境中对近红外光的吸收波长都具有明显差别。近红外光主要是对含氢基团X．H(X"--C、N、O)振动的倍频和合频吸收，其中包含了大多数类型有机化合物的组成和分子结构的信息。另外近红外光吸收系数小，发热少，因此近红外光谱可作为获取信息的一种有效的载体。选用连续改变频率的近红外光照射某样品时，由于试样对不同频率近红外光的选择性吸收，通过试样后的近红外光线在某些波长范围内会变弱，透射出来的红外光线就携带有机物组分和结构的信息。通过检测器分析透射或反射光线的光密度，可以确定该组分的含量【231。其原理是近红外光照射时，频率相同的光线和基团将发生共振现象，光的能量通过分子偶极矩的变化传递给分子；而近红外光的频率和样品的振动频率不相同，该频率的红外光就不会被吸收。1．2．2近红外光谱法的发展近红外光谱法的应用可追溯到l939年，直到上世纪60年代美国利用NIR漫反射技术测定了农产品中的水分、蛋白、脂肪等，这时近红外光谱才发展为实际分析技术。在计算机技术的带动作用下，自1980年开始，分析仪器的数字化和化学计量学科得到了迅速发展，加之近红外光谱在测样技术上所独有的不损坏样品的特点，在各方面的应用研究迅速开展。由于近红外光在光纤中良好的传输特性，90年代后有文献报道在线分析成功地应用于实际检测中的各个领域1241。目前大约有40多个国家和地区开展NIR的研究和应用工作，特别是一些发达国家都拥有有研究型、专用型、有供巡【旦l检测用的流动车等大量的各种类型的NIRS分析仪器配备到各行各业，最重要的是还有一些仪器直接安装在生产线的某个环节进行生产过程的质量检验或产品分捡125j。我国近红外技术研究起步较晚，尚有很多研究工作要做，同时也可以从国外现在的研究进展中获得有价值的信息。1．2．3近红外光谱法的特点近红外光谱分析技术能在几分钟内，仅通过对被测样品的一次近红外光谱采集测量，即可完成其多项性能指标的测定(最多可达十余项指标)，这些指标可以是化学指标，也可以是物理指标，这一点区别于传统分析技术不同之处。光谱测量时分析过程中不消耗其它材料，也不破坏样品；也不需要对分析样品进行前处理：近红外光谱仪稳定性好，因此分析蕈现性好、成本低。然而近红外光谱也有其固有的弱点：一般检测对象在样本中含量应>O．1％，这是由于物质在近红外区吸收弱，灵敏度较低；建模工作难度大，建立模型的过4 张欣硕I：学位论文绪论程需要有经验的专业人员参与和并采集来源丰富的有代表性的样品，并配备精确的化学分析手段，模型的建立工作量大，花费时间较长；每一种模型只能适应一定的时间和空间范围，因此随着样本种类、来源等变化要求对模型进行维护，此外用户的技术会影响模型的使用效果12引。1．2．4近红外光谱在食品安全领域的应用当前面临着诸多食品安全问题，这就要求制定全面合理的食品抽样检测方法，同时改进检测技术，将快速检测与最终判定相结合。现场的食品快速检测方法要满足如下要求：准备简化，使用的试剂少，配制好的试剂能够长期保存；样晶前处理简单，对操作人员的操作技能要求低；分析方法简单、准确和快速【22J。近红外光谱技术能够符合这些要求，实现现场的食品快速检测方法。针对不同的食品安全问题，近红外光谱技术在问题的不同方面所起到的作用也不尽相同。根据带来食品安全问题的因素，分别阐述如下：1．2．4．1检测病原微生物。病原性微生物仍然是中国最大的食品卫生问题，这些病原微生物主要会导致人们的腹泻、腹痛等急慢性肠胃炎症状126J。在国外，针对食品中病原微生物的近红外光谱的检测的研究报道，覆盖到果蔬及果蔬制品、肉类、鱼类等易被污染的食品中，在本研究中，这些方面的经验有诸多值得借鉴之处。Rodriguez．Saona等人通过建立多变量模式识别模型，对果汁中的病原微牛物进行了测定，在模型中建立了包含大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的数据库。这一研究认为傅里叶变换近红外光谱技术可以用于检测液体被细菌的污染程度，即可以应用与液态食品微生物的检测中【27】。AI．Qadiri等人开展了该技术在线监测牛奶的研究，测定了在6、21、3712时牛奶的变质情况。通过主成分分析和偏最小二乘建模，偏最小二乘法所建立的模型与5个潜在的变量相关光谱特征与细菌计数和pH的相关系数R分别为0．99和0．99，结果表明近红外光谱技术是一种可行的在线监测牛奶变质情况的检测方法128]。针对固态食品，近红外技术同样取得了进展，Suthiluk和Phunsiri等人在近红外在卷心菜的微生物评估检测中使用偏最小二乘法(PLS)，均质处理和水洗处理后的预测标准误校正偏差(SEPs)分别是0．46Iog／CFU昏1和0．44Iog／CFU分1。其结果表明，近红外光谱能够适用于卷心菜的快速无损检测技术，且检测精准129J。Ellis等人在肉类检测的应用中，介绍了利用傅里叶变换近红外光谱方法快速检测由微生物导致的肉类腐败。他们直接用光谱在肉类表面的照射，可以在得到由于微生物的代谢引起的蛋白水解的定量指标，从而对肉类是否新鲜进行判定130]。MenshiLin等人用快速近红外光谱技术检测到了虹鳟鱼鱼排的微生物导致的 张欣硕士学位论文绪论腐败，分别用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法(PLS)来对鱼进行预测，PCA方法清晰的区分了40C下储存ld和4d的样品。对210C下Oh和10h的样品也能区分清楚。PLS模型建立了鳟鱼鱼排在40c下的微生物测定模型，模型的R=0．97，预测标准误(SEP)=0．38log／CFU∥‘；210C下，R=0．82，SEP=0．82log／CFUg～。表明近红外光谱方法可以用于虹鳟鱼鱼排的腐败程度和微生物载荷的预测1311。此PI-AI-Holy等人通过FT-近红外光谱技术对蜡样芽胞杆菌、沙门氏菌、大肠埃希菌和李斯特菌进行了分类，建立了主成分回归模型，对菌群的分类正确率达到94％，由此可见近红外光谱技术有成为食品中病原微生物的快速鉴别和分类技术的可能性【32】。1．2．4．2检测农药、兽药和食品添加剂。有些食品制造者违规操作，他们为提高产量而滥用农药兽药，为改善食品的外观，不惜超量添加色素、增稠剂等食品添加剂，同时还存在使用未批准添加剂的情况，甚至有些商家添加有毒有害的化工原料。这些情况都使当前食品安全更加没有保障【241。农药兽药的残留由于食品中剂量较小，尚未见到有可以通过近红外光谱技术检出的报道。就农药和兽药的成分来讲，在较大剂量的情况下可以检测，AnwarG等人用近红外光谱技术检测了污水、土壤以及种植在被污染的土壤上的植物中的农药残留。但是要将这一技术应用于食品检测中，有待技术革新提高近红外光谱的分辨率[33】。1．2．4．3监察不法商贩的掺假制假行为。在食品行业中，由于某些奸商利欲熏心而出现的掺假制假和以次充好现象给食品安全同样带来了很大的影响。比如在食品中添加不能用于食用的工业原料，使消费者蒙受重大经济损失，扰乱社会秩序。更重要的是对消费者的健康带来了极大的威胁。近红外光谱技术对掺假食品的辨别能力优于现在的常规检测方法。体现出了这一方法的快速便捷，甚至在常规方法无法辨别的领域，近红外光谱技术都能够胜任。在固态食品检测中，AlessandraBorin等人采用最小二乘支持向量机(LS-SVM)作为一种替代多元校正法的算法，同时采用该方法定量分析奶粉中的常见掺假物(淀粉、蔗糖和乳清)。与偏最小二乘回归法(PLSR)相比，LS．SVM具有低预测误差和高性能的特点，结果表明近红外光谱结合LS．SVM对奶粉的常见掺假物质有很好的检出能力[34J。ZenglingYang通过偏最小二乘(PLS)判别分析和改良偏最小二乘法(MPLS)技术定量分析，对90个样本的纯鱼粉和96个掺杂了从10g／kg至U320g／kgl肉骨粉的鱼粉样本进行建模，外部验证集包括39个 张欣硕I：学位论文绪论纯样本和54个掺假样本。该方法成功的分辨出了掺假样本，同时成功的预测出肉骨粉的标准交叉验证误(SECV)为27．899／kgp引。JavierGayo和ScottA．Hale把可见光光谱与近红外光谱检测进行结合对蟹肉掺假的鉴别进行了研究，取得了良好的效果Ij6|。在液态食品检测中，M．J．C．Pontes等通过建立基于主成分分析的模型，采用近红外光谱鉴别了包括白兰地威士忌、、朗姆酒和伏特加69个样品。能够检测出在酒中掺入甲醇、乙醇或水的样本，检出正确率为100％，置信水平为95％t37J。Li-juanXie等人首先用主成分分析(PCA)来降低光谱数据维度，得出的主成分值用于径向基层神经网络(RBFNN)中。采用径向基层神经网络对杨梅汁的掺假进行检测。使用支持向量机和多元散射校正对数据进行前处理，对于兑水掺假的杨梅汁检出率为97．62％，但是还不能将具体兑水量检测出来138I。KellyJ．Daniel等人使用多元散射校正和二阶导数处理原始光谱数据后，用偏最小二乘(PLS)对掺入甜菜转化糖浆和高果糖玉米糖浆的爱尔兰蜂蜜进行检测，结果表明近红外光谱可以用于这种糖浆掺假蜂蜜的检测1391。除以上列举的实例，近红外光谱分析技术还可以应用于咖啡【401，油脂【41Ⅲ1等食品的掺假检测当中。1．2．4．4其它情况。预防由于改变的原料、技术和工艺可能产生的安全问题。研究表明，食品工业用的黑曲霉、米曲霉等也有可能产生毒素而对人身健康造成危害，甚至其中某些物质具有强致癌性。另外，保健食品原料的安全性问题、转基因食品的安全性问题、辐照食品的安全性问题等也已引起学术界的普遍关注【2引。SusumuHirano等人通过近红外光谱技术成功的分辨出了内部发霉的花生，这样检测将有效的避免由于花生霉变导致的黄曲霉中毒事件的发生1451。新的保健品原料发现有毒副作用的物质时有报道，PrivatLasme等人报道了瓦努阿图用近红外光谱技术检测卡瓦的研究，卡瓦是一种在欧洲和澳大利亚被禁用的保健品原料，原因是其被怀疑有肝脏毒性，这个研究中建立了偏最小二乘法(PLS)近红外反射光谱校正模型，校正模型的R2接近l，测量的重复性接近于高效液相色谱法，因此近红外光谱法可用于卡瓦的检测14酬。转基因食品是否对人有害还有待探讨。从当前报道来看，近红外光谱技术可以用于分辨出转基凶食品。这样将有利于维护消费者的知情权。KojiEmura等人LijuanXie等人对西红柿的光谱数据进行了多变量分析，用丰成分分析(PCA)、判别分析(DA)和偏最小二乘判别分析(PLSDA)对LeETR2转基因西红柿和它们的父本的非转基因西红柿进行了分类，结果表明转基因和非转基因西红柿之间存在差异。主成分分析、判别分析和偏最小二乘获得的正确率都是100％。所以近红外光谱技术与化学计量学的结合有效地避免了耗时、昂贵的化学分析和感 张欣硕：I：学位论文绪论官分析，更避免了对人体伤害很大的分子生物学检测方法【4‘71。1．2．5近红外光谱技术在食品安全领域应用展望1．2．5．1近红外光谱仪器的改进。由于近红外光谱技术在食品安全领域的使用还有一定的局限性，这～局限性是由其本身特点造成的。解决这些不足要求研究人员从软件和硬件两个方面对该技术进行改进。性能稳定，不受外界环境影响，即便是便携式的近红外光谱仪也能够在运输过程中不凶为振动，环境光线、噪声、振动等因素影响，这些都是近红外检测技术的基础和前提。目前，国际一LNIR光谱仪的类型较多，按单色器分类，市场上的NIR光谱仪可分为光栅色散型、滤光片型、声光可调滤光器型(AOTF)，傅立叶变换型(FT)等4类。除了采用单色器分光以外，也有仪器采用多种不同波长的发光二极管(LED)作光源，臣I]LED型近红外光谱仪。按照光栅色散型仪器又可分为扫描单通道检测器和固定光路阵列检测器两种类型。集中能力开发可以适应工厂化生产的在线近红外光谱检测装置，摆脱仅仅局限在实验室检测中取得的成功，将这一快速、无损检测技术应用到实际生产中，以期达到从源头上来控制食品的安全问题，提高工厂自身管理控制水平的目的【241。1．2．5．2化学计量学算法的研究。对于近红外光谱技术，应该继续深入探讨在光谱预处理方法和模型算法优化方面的技术，其中校正模型的建立是近红外光谱分析的核心技术之一。可以发现在上述报道中常用的方法有多元线性回归(MLR)、偏最dx-乘(PLS)[48J和人工神经网络(ANN)等。近年来出现了一些新算法和模型建立策略也为建立预测准确性好和稳健性强的近红外分析模型奠定了基础，这些方法包括基于核函数的非线性校正方法1491、集成(或共识)的建模策略、多维分辨与校正方法【50】、基于局部样本的建模策吲511、蚁群算法吲以及二维相关光谱f53’驯等。此外，如何建立性能稳定的数学模型是近红外光谱研究的一个重要课题，这将解决许多液态食品是非均质产品，静态检测下建立的稳定模型可能在实际生产中变得不稳定的问题。科学家们正在寻求解决影响近红外分析准确性的因素包括：标样的组分含量、数量、样品的物性、样品预处理方法、测试条件和仪器自身等问题的方法，比如意图降低水及一些干扰组分的近红外光谱吸收对样品信号的干扰，对相关检测器使用锁定放大器的办法提高仪器信噪比，通过该技术大大降低了检测误差p川。随着国家对食品安全的重视，食品领域的检测项目也越来越多。近红外光谱技术用于蜂蜜真实性鉴定将是未来的发展趋势，将成为蜂蜜企业在线快速监控蜂蜜质量的一个重要手段。同时，对于提高质检机构快速反应机制，提高蜂蜜品种及其品质的真伪鉴定水平均具有重要意义。而光谱仪器特别是近红外光谱仪由于具有在线检测优势突出、对样品几乎无破坏、分析速度快对环境无污染等特点，8 张欣硕：l：学位论文绪论必然将在食品安全检测、在线检测、生产质量控制等方面得到广泛的应用。1．3拉曼光谱技术介绍1．3．1拉曼光谱原理1982年印度科学家C．V拉曼在研究苯的光散射时发现了散射光中既有与入射光频率相同的谱线，义有与入射光频率发生了位移而且强度很弱的谱线。与入射光频率相同的谱线就是瑞利散射光，称为瑞利效应，后者以发现者拉曼的名字命名，称为拉曼效应。其中位于瑞利光低频一侧的谱线称为斯托克斯线，高频一侧的谱线叫做反斯托克斯线。拉曼光谱出现位置在近红外区和可见光区，拉曼位移通常为4000．25cm～，拉曼效应对应分子转动能级。用吸收光谱分析拉曼散射时，这种跃迁主要出现在红外光区，获得红外光谱。但是拉曼光谱是散射现象，由分子振动或转动时的极化率变化引起；相比之下红外光谱基于吸收现象，由分子振动或转动时的偶极距变化引起。总之，拉曼光谱和红外光谱同属分子光谱，它们在研究结构和振动光谱时互补。拉曼光谱和红外光谱产生原理都是分子的振动和转动，但是两种光谱产生机理还是有着本质的差别，当分子对红外光源光谱吸收时产生红外光谱，而分子对可见光散射产生光谱时产生的是拉曼光谱。红外光谱作为一种吸收光谱落在光谱的近红外和红外区，对应于hv=B；1一如：o的跃迁，拉曼光谱则是从激发态到振动态的B：1和如：o的跃迁产生。1．3．2拉曼光谱定性和定量分析技术拉曼光谱的定性和定量分析技术是以拉曼效应为基础建立起来的分子结构表征技术，分子的振动和转动提供了信号，分子的拉曼散射面积比较小，不同振动峰的重叠和拉曼散射强度受光学系统参数等因素的影响。HongYang等人应用傅里叶变换拉曼光谱无损检测苹果上包括大肠杆菌在内的六种不同病原微生物【56I。采用马氏距离的方法评估和量化六种不同微牛物谱的统计差异。发现拉曼光谱不仪可以正确判别菌株种类，也能够区分病原微生物和非病原微生物。其结果证明拉曼光谱可以作为一种有效的食品表面微生物污染的快速检测和分类的方法。香港大学的研究人员研究了拉曼光谱在食品蛋白质检测中的应用M。将三种蛋白质产品，大豆蛋白，乳清分离蛋白和喷雾干燥蛋白粉进行脱氨基作用。获得了对蛋白质构象变化的高相关系数。AnaM．Herrero通过对拉曼光谱进行比较1581，介绍了拉曼光谱对蛋白质溶解度、表观粘度、持水能力及其质地、二甲胺含量、过氧化值、脂肪酸组成等常用9 张欣硕：t=学位论文绪论与鉴定鱼肉等肉制品质量的评定结果，同时对经过预处理、加工和储存，以及这个过程中蛋白质、水合脂肪、肌肉的变化做了判别分析。结果表明拉曼光谱数据与传统方法测定的结构一致，能够用于评价肉制品质量。HainerWackerbarth等1591研究了利用拉曼光谱检测压力下猪肉中肌红蛋白机构变化，肌红蛋白是肉制品中的红色来源，在600．700Mpa采用413nm波长拉曼光谱选择性探测非热食品中的肌红蛋白。在很大程度上，由于压力条件的处理，肌红蛋白结构发生了改变，很大程度上避免了样对脱氧肌红蛋白的氧化能力。YanCheng采用便携式拉曼光谱检测奶粉中掺杂三聚氰胺【60】，建立了一个较好预测能力的PLS模型。意大利研究人员将拉曼光谱应用到了饮料葡萄糖的检测中1611。拉曼光谱作为食品工业产品中单一成分的定量检测工具，研究主要集中在商业运动饮料中的葡萄糖含量检测上。采用600．1200波数的拉曼光谱区域，很好的显示出葡萄糖、果糖和麦芽糖在此区域的振动指纹图谱。通过对特殊光谱的分离峰，获取葡萄糖含量的信息，之后采用了间隔偏最d,-乘法建立校J下模型，获得了很好的预测结果。Rubayiza等人探讨了傅里叶变换拉曼光谱判别绿色咖啡和烤咖啡的可行性162]，它们分属于阿拉比卡系列和罗巴斯塔系列，是两个具有重要的商业性品种。具体表现在它们有不同的脂肪含量，尤其是萜类物质含量差距甚远。在阿拉比卡咖啡豆中含有0．1％-0．3％，而罗巴斯塔系列中则小于0．01％。通过目测阿拉比卡、罗巴斯塔和利比里卡样本提取物的拉曼光谱，发现在中波数区域岑在明显差异：阿拉比卡光谱存在1567和1478cm。两个特征散射带。咖啡豆醇在此有相应的特征谱带。研究中应用了主成分分析以对光谱进行聚类，第一主成分即可包含93％的光谱信息。来自肯尼亚和牙买加的样本具有高咖啡醇含量，相比之下低海拔生长的澳大利亚样本中咖啡醇含量较低。拉曼光谱的数据分析处理可以获得被分析物质的各种性质和特征，是光谱分析中的重要环节。光谱的分析技术正是当前拉曼光谱应用研究的热点问题。但是目前拉曼光谱主要是利用典型物质的光谱做成标准谱图，之后与未知光谱比较以实现比较、鉴别和定性分析。标准光谱库的建立存在极大难度，光谱数据处理和分析十分复杂，尤其是对于多组分混合物样品的拉曼光谱的定量分析，目前困难较大，但是随着仪器的进步，拉曼光谱在有机化学、无机化学、生物化学、催化等研究领域中都有了广泛应用。1．4近红外与拉曼光谱特点比较10 张欣硕-L-学位论文绪论拉曼光谱和近红外光谱有许多相同点，它们的光谱提取快速简单，又有很好的可重复性，最重要的是无需样品前处理，能够完成无损伤的定性定量分析。在其光谱区域，允许采用石英光纤。石英光纤与其它光纤相比比较便宜且坚固耐用，容易买到，在光纤末端的滤光系统和聚光系统能够激励和收集这些光谱，同时阻挡不需要的光子，具备了远程测量的条件。其光纤探头能够抗高温高压，通过人造橡胶环，黄铜或浸挚圈的保护，既保证窗口密封，且兼容性好，容易获取，部分专用型材料还能够耐强酸强碱。为极端环境监测奠定了基础。近红外光谱和拉曼光谱都是用来检测分子的振动和转动能级的，但是两者理论基础和检测方法完全不同。物质分子在无时不刻地振动和转动，这些振动包括简J下振动的叠加；从而产生偶极距的变化，在产生偶极距变化是能够吸收相应的红外区域的光波，因此简正振动具有红外活性。与之不同的是当振动时产生极化度变化时，分子与入射光子产生能量交换，使散射光子的能量与入射光子能量产生差别，从而产生拉曼位移，这一现象与分子振动能级有关。从检测原理来看，近红外光谱检测直接用红外光检测处于近红外区的分子振动以及转动时产牛的能量。当一束近红外光透过样品时，通过检测样品对红外光的吸收情况来获取样品信息。而拉曼光谱检测使用的是可见激光，它是一种间接的方法，能够将红外区的信息变到可见光区，通过差频的方法来检测。可见光区是电子跃迁的能量区，拉曼光谱会因为电子跃迁产生的光受到干扰。但是可以通过使用不同的激光发射器避免这一现象的发生。在实时在线检测方面，拉曼光谱具有独到的优势，它不同于红外和近红外光谱，作为一种散射光谱，拉曼光谱受到样品厚度影响要远远小于其它两类光谱。另一方而，拉曼光谱包含了基本的振动模态，不是近红外光谱中所观察到的倍频和几种分子振动频率的组合，这使光谱数据对分子结构有更好的反映。近红外光谱对水敏感，而水的拉曼散射很弱，这一点使拉曼光谱检测与近红外光谱检测有了很好的互补性，因此拉曼光谱也是研究水溶液种生物样品和化学样品的理想工具。拉曼光谱谱峰清晰尖锐，既适合定量研究，又有利于在之后的研究中通过积累实现数据库搜索，并通过差异分析进行定性比较。拉曼光谱光源使用了激光，其直径聚焦部位通常只有O．2．2ram，因此与红外光谱相比，拉曼光谱可以检测更小量更小面积的样品。近红外光谱的分光系统复杂，例如滤光片型由于滤光片数量有限，只能用作专用仪器，而难以用于复杂体系样品。光栅扫描式光谱仪信噪比和分辨率较高，但是其可动部件的高强度和连续工作在运行中会带来磨损问题，长期使用会影响到光谱可靠性。配备傅里叶变换系统的近红外光谱仪同时具备了高分辨率和高扫 张欣硕l：学位论文绪论描速度，但是也会因为仪器中的移动部件难以适应严格的工作环境。声光可调滤光器在实现仪器稳定性的同时则牺牲了分辨率，价格也比较昂贵。相比之下拉曼光谱可以同时覆盖50．4000cm一的波数范围，与近红外光谱相比优势明显。红外光谱通常可以用能斯特灯、碳化硅棒或白炽线圈作光源，选择范围广，取材便宜，拉曼光谱则用激光作为光源。对于具有对称中心的分子来说，具有互斥规则，与对称中心有对称关系的振动，拉曼光谱可见而红外不可见：相反，与对称中心无对称关系的振动，红外光谱可见而拉曼不可见，因此两者具有互相补充的特点。与近红外光谱相同的特点是：拉曼光谱通常灵敏度也比较低，主要用于分析浓度在0．1％以上的样品，在工厂中应用时，光纤探头与光谱仪之间距离一般小于160m。综上所述，近红外光谱和拉曼光谱是重要的光谱分析手段，既有相同的优缺点，在某些方面又可以互相补充，能够广泛应用于定性和定量检测。1．S研究内容本论文应用近红外光谱和拉曼光谱结合化学计量学方法进行蜂蜜荤要组分的定量研究和掺假蜂蜜的定性判别。分别建立光谱模型，分析各种计量学方法对模型的影响。通过试验得到一种新的检测蜂蜜掺假的方法。为蜂蜜的品质和真实性鉴定提供了一个良好的技术，F台。(1)采集10个省市的17种蜂蜜作为真蜂蜜样本，同时对不同方法掺假的蜂蜜原料进行收集。掺假蜂蜜包括蔗糖掺假，葡萄糖掺假，蔗糖和葡萄糖混合掺假，并检测不同比例的掺假。(2)针对求导、多元散射校正、Norris平滑等方法对光谱进行预处理，探索最适合的光谱预处理方法。(3)分别采用国标方法检测蜂蜜中的蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、羟甲基糠醛等的含量。然后通过化学计量学方法应用TQ、MATLAB软件建立数学模型。(4)分别采用小波变换方法和CARS方法选取模型变量。(5)采用蒙特卡罗交互验证方法剔除奇异值和杠杆值。(6)比较不同的神经网络算法在蜂蜜掺假模型中的预测能力。(7)比较网格搜寻法、遗传算法和粒子群算法在支持向量机参数选择中的实际表现。试验的最终目的是利用近红外光谱和拉曼光谱分析技术通过建立不同的建模方法实现蜂蜜化学成分的快速在线检测。另一方面利用近红外光谱分析技术和12 张欣硕：匕学位论文绪论拉曼光谱技术通过建立不同的建模方法实现快速蜂蜜鉴定是否掺假。实验中要解决的关键问题是通过新的建模方法在分析中的应用，并对建立的模型进行判别，以实现近红外光谱技术在蜂蜜掺假鉴别中的应用，提高鉴定的准确性和精确度。 张欣硕：匕学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分2．1引言第二章近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分由于蜂蜜中富含糖类，还有蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素等多种对人体有益的营养成分，因而不少消费者夏季常饮蜂蜜解暑。它既可保证体内所需的营养，又可减轻胃的负担。众所周知蔗糖是一种双糖，来自蜜蜂采集的花蜜。蔗糖需经过人体中相应的酶的降解才能被吸收，在此过程中需要胰岛素等人体内激素的参与，这一点对糖尿病病人将产生很大的影响。在蜂蜜中的还原糖与蔗糖虽同是糖类，但还原糖易被人体直接吸收。因而低蔗糖、高还原糖是检验蜂蜜品质优劣的重要指标。蜜蜂在酿蜜过程中，通过分泌的唾液酶的作用，将蔗糖转化为还原糖。蔗糖含量高而还原糖低的蜂蜜，表明其中有不法商贩直接在蜂蜜中掺假或者未经蜜蜂充分酿造。蜂蜜的还原糖测定方法目前主要有液相色谱法、滴定法、气相色谱法【63】等等，除此之外，也有其它方法的报道畔，65】，但是这些方法或者操作复杂、或者耗时耗力、或者分析结果不够准确，都是在常用方法的基础上做了一些改进，没能从根本上解决问题。近红外光谱分析技术作为一种快速无损的检测技术正在被各行各业应用到实际生产和检测当中，这一技术在食品检测中的应用研究国内外都有报道【z2，M"35l。近红外谱区主要包含0．H，C．H，N．H等基团原子间振动的倍频与合频信息f371。蜂蜜巾的糖类物质中正含有这些信息基团中的某些基团。本试验针对近红外光谱应用于蜂蜜检测时，研究光谱数据的预处理方法、数学模型的选择和评价，以期达到实时在线测定蜂蜜还原糖的目的。通常蜂蜜中含量最高的四种糖分别是果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖。这些糖含量在蜂蜜的营养功效、结晶状态等方面起着重要作用。同时对这些成分的检测，通过其比例的变化，可以很容易地判定蜂蜜中是否掺假。但是针对这些糖类的传统检测方法，存在成本高，污染环境，检测要求技术水平高等缺点睁l。近红外光谱分析技术具有高效、快速、成木低、不破坏样品化学性质和绿色环保等优点，因此将其用于蜂蜜成分检测和在线实时检控具有传统测量方法不可比拟的优点。．如果能把近红外线检测方法应用于蜂蜜的品质分析中，就可以用一种仪器快速检测多种成分，从而开发出_种可以用于蜂蜜的生产、收购、加工、商检、技术监督、卫生防疫、外贸等方面的检测技术。*本研究在前人的基础上进一步探索近红外光谱在蜂蜜成分检测中的光谱前处理方法，奇异样本剔除法，光谱数据压缩和校正模型的建立方法。通过这些方法的比较和探讨，选择更适合的化学计量学方法，从而提高模型的预测精确性和14 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分泛化能力。2．2材料与方法2．2．1样品来源样品由湖南省明园蜂业有限公司提供，分别由厂方采自湖南、山西、陕西、广西、广东、宁夏、浙江、湖北、江西、四川10个省。包括荆条蜜、苹果蜜、柑橘蜜、桂圆蜜、油菜蜜、洋槐蜜、荔枝蜜、益母草蜜、黄芪蜜、枸杞蜜、九龙藤蜜、枣花蜜、野菊花蜜、山桂花蜜、老瓜头蜜、紫云英蜜和雪脂莲蜜共计17个品种，包含经过加工的商品蜜和直接由蜂农采集的非成品蜜。为提高模型的适应性，在试验室另调配了果葡糖浆掺假6个样品和麦芽糖浆掺假6个样品。整个试验共计135个样品。其中样本集分为两部分，校正集100个样品，验证集35个样品；试验用样品在测定前先经过50℃水浴溶解其中的结晶，之后置于25℃室温下静置过夜后采集光谱。2．2．2样品光谱采集方法’试验采用美国ThermoScientific公司AntarisII型傅立叶变换近红外光谱仪，采用积分球和旋转台测定样品漫反射光谱，配备丹麦FOSS公司浆体杯(slurrycup)、镀金反射器(goldreflector)。将样品置于浆体杯中，用镀金反射器压实，注意避免有气泡压入当中。采用透反射积分球模式采集光谱，扫描次数32次；分辨率8cm～；透反射光程0．1mm，光谱测定范围4000．10000cm～。每个样本重复3次，取3次光谱的平均光谱作为样本的原始光谱。2．2．3还原糖测定(采用sN厂r0852—2000铁氰化钾滴定法测得)。2．2．3．1试剂和材料(1)所有用到的试剂为分析纯，水为蒸馏水。(2)1％铁氰化钾溶液配制方法：溶解109铁氰化钾于水中，转移到1000mL容量瓶同时，用水定容至刻度。按下法标定其滴定度。称取蔗糖lg(精确至0．00029)，在减压条件下70。C以内干燥后溶解于水中，减压过程中压力不超过50mmHg，定容至250mL，混匀。吸取此溶液25mL，于100mL容量瓶中，加5mL盐酸和25mL水。将容量瓶在70"C条件下水浴10rain，取出后快速冷却至20℃。加入7mL30％氢氧化钠溶液，之后用约10％氢氧化钠中和。用蒸馏水定容，混匀。(3)准确吸取已经配好的铁氰化钾溶液5mL于150mL锥形瓶中，自滴定管加入转化糖标准溶液19mL，煮沸2min后加入3滴次甲基蓝指示剂，然后在微沸条件下继续低价转化糖标准液，在此过程中注意避免加热温度过高，直 张欣硕：E学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分至次甲基蓝的蓝色消失，记下消耗的转化糖标准溶液毫升数(假如指示剂后的滴定在lmin内完成)。(4)按下式计算出每10mLl％铁氰化钾溶液相当于转换糖的质量(g)：T=—婴．×100(2．1)1000xo．95式中：卜滴定度(每10mLl．％铁氰化钾溶液相当于转化糖的质量)，g；m——纯蔗糖的质量，g；VL一滴定所耗糖液的体积，mL；0．95——蔗糖换算为转化糖的系数。1％次甲基蓝指示剂：溶解lg次甲基蓝于100mL水中。(5)氢氧化钠水溶液：10％。2．2．3．2操作程序：(1)样液的制备：称取0．59蜂蜜样品(精确至0．00019)于小烧杯中，加入适量水溶解后定容到250mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。吸取稀释溶液25mL定容至100mL作为待测液。(2)还原糖预滴定：用移液管吸取10mL已配好的铁氰化钾溶液和2．5mL氢氧化钠溶液置于100mL锥形瓶中，用水稀释l倍后加入几粒玻璃珠，煮沸后滴入l滴次甲基蓝指示剂。在保持溶液沸腾的条件下将盛有样液的滴定管移至锥形瓶上，缓慢滴加，用样液滴定至蓝色消失为止。记下样液消耗毫升数。(3)还原糖滴定：用移液管吸取10mL铁氰化钾溶液和2．5mL氢氧化钠溶液置于100mL锥形瓶中，用水稀释1倍后加入几粒玻璃珠，从滴定管中放入较上述预滴定是所消耗量大约少0．3mL的样液，迅速煮沸，然后滴入l滴次甲基蓝指示剂。在保持溶液沸腾的条件下将盛有蜂蜜样本液的滴定管移至锥形瓶上，用样液滴定至蓝色消失为止。记下样液消耗毫升数。(4)结果计算：还原糖含量按照下式计算：x=等×100(2-2)式中：X——试样中还原糖含量(以转化糖计算)，％；卜滴定度，每10mLl％铁氰化钾溶液相当于转化糖的质量，g；V_一滴定10mLl％铁氰化钾溶液所消耗样液的体积，mL；M——．{式样质量，g。16 张欣硕l：学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分平行试验结果允许误差为0．5％。2．2．4蜂蜜果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的液相色谱测定蜂蜜样品净水溶解后用乙腈定容，通过0．459m滤膜过滤，采用液相色谱示差折光检测器测定。通过外标法定量。(1)试剂和材料：水：GB／T6682规定的一级水。乙腈：色谱纯。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准物质：纯度≥99％。果糖葡萄糖标准储备溶液配制方法：于同一100mL容量瓶中称取0．59果糖标准物质和0．49葡萄糖标准物质，精确至0．00019，之后加入60mL水溶液，用乙腈定容至刻度，摇匀。蔗糖、麦芽糖标准储备液配制方法：于同一100mL容量瓶中分别称取0．29蔗糖和0．29麦芽糖标准物质，精确至0．00019，加入60mL水溶液，用乙腈定容至刻度，摇匀。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作液配制方法：吸取不同体积的果糖、葡萄糖标准储备溶液和蔗糖、麦芽糖储备液，用乙腈+水(40+60)稀释垒体积，乙腈和水溶液应在之前配好，并用超声混合均匀。然后配成不同浓度的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准工作溶液，用于回归标准工作曲线。每种标准储备溶液的用量和定容体积见表：(2)仪器：高效液相色谱仪(岛津LC．20AT)：配有示差折光检测器(岛津RID．10A)分析天平：感量O．1mg和0．0019各一台。注射器：10mL。有机相过滤膜：0．45lun。样晶瓶：1．5mL。 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分容量瓶：lOmL，25mL，50mL，100mL。(3)试剂制备与保存：试样的制备：对无结晶的实验室样品直接将其搅拌均匀。对于有结晶的样品，在密闭的情况下，置于不超过55℃的水浴中温热，振荡，待蜂蜜样品中的结晶全部融化后搅匀，冷却至室温。密封。称取0．59样品精确至O．00019。置于100mL烧杯中，先加入30mL水，使其完全溶解，转移至100mL容量瓶中，然后加入10mL水洗烧杯三次，所有溶液均转移至上述100mL容量瓶中，用乙腈定容至体积，混匀。用0．451am滤膜将样液过滤后供液相色谱测定。(4)液相色谱条件：色谱柱：LichrospherNH2柱(10nm*51am，4．6"250mm，江苏汉邦)流动相：乙腈+水(77+23)；流速：1．0mL／rain；柱温：30℃；检测器池温度：35℃；进样量：15此。(5)液相色谱测定：用配制的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准工作溶液绘制以检测器获取峰高为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标的标准工作曲线，保证样品溶液中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的响应值均在工作曲线的范围内，以保证标准曲线符合线性规律，样品溶液与标准工作溶液等体积进样进行测定。按照以上步骤，对同一试样进行两次平行试验测定。结果以下公式进行计算：X：c×旦(2．3)m卜试样中被测组分含量单位为g／lOOg；卜从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度单位为UIOOmL；卜样品溶液定容体积单位mL；卜所称试样的质量，单位为g。2．2．5蜂蜜中羟甲基糠醛测定方法(1)试样的制备：未结晶的样品搅拌均匀。有结晶析出的样品也要通过搅匀的方法备用。(2)试剂和材料：所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。澄清剂l：溶解159亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H20]与水中，稀释至100mL。18 张欣硕：t=学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分澄清剂2：溶解309乙酸锌[Zn(CH3C02)2。2H20]于水中，稀释至100mL。0．20％亚硫酸氢钠溶液：溶解0．209亚硫酸氢钠于水中稀释至100mL，临时用时配制。无氧蒸馏水：经煮沸、冷却的蒸馏水。(3)仪器：紫外分光光度计(284nm，336nm)。(4)样品液的制备：称取蜂蜜样品59(准确至0．0019)用蒸馏水定容至50mL，加入0．5mL澄清剂l混合后加入O．5mL澄清剂2，用水稀释至刻度，如果有泡沫可选择乙醇作为消泡剂。过滤并弃去最初的lOmL滤液。(5)操作程序：吸取滤液各5mL于2个试管中，在一个试管中加入5mL硫酸氢钠溶液混匀作为参比液，另一试管加入5mL蒸馏水，作为待测液。以参比液作为对照，调整紫外分光光度计波长至284nm和336nm，测定溶液的吸光度。(6)结果计算：羟甲基糠醛计算公式：X=．(．A．．．．2．．a．．4．．．-．．．A．．．．a．．a．．6．．．)．．．．．x．．．1．．．4．．．．．9．．7．．．x．．5．m(2．4)式中：k试样中羟甲基糠醛含量，mg／lOOg：14．97——一换算系数；彳28广于284nm波长下测得的吸光度；彳j3矿一于336nm波长下测得的吸光度：卜样品质量，g。2．2．6蜂蜜中总氮测定方法蜂蜜中总氮含量参照凯氏定氮法(GB厂r5413．1997)，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差不超过算术平均值的1．5％。该实验操作每个样品平行测定三次。2．2．7光谱处理方法与原理2．2．7．1光谱预处理近年来随着化学计量学的发展及相关方法的确立，有以下光谱前处理方法被用于消除光谱数据无关信息和噪音的预处理。比较常用的有：数据增强变换、平滑、导数、标准正态变量变换、多元散射校正、傅里叶变换。同时，也将小波变换应用到了光谱预处理当中。目的是为了将近红外光谱中噪声滤除、消除斜坡背景、实现数据的压缩和光谱范围的优化及消除其它因素对谱图信息的影响。(1)平滑(smoothing)算法～19 张欣硕=l：学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分光谱中信号中包含了仪器噪声和背景噪声。消除噪声首先要假设光谱中含有噪声均为随机噪声，多次测量取平均值是降低仪器噪声提高信噪比的一种方法。采用信号平滑的方式是消除仪器噪声的一种方法。常用的信号平滑方法包括：窗13移动平均平滑法(WindowMovingAverageMethod)和窗13移动多项式最小二乘平滑(WindowMovingPolynomialLeastSquaresSmoothing)，即Savitzky-Golay卷积平滑法，以及Norris平滑法。Savitzky．Golay于1964年提出了卷积平滑法【67】。与窗口移动平均平滑基本思想相似，不同之处在于Savitzky．Golay卷积平滑法实质是一种加权平均法，通过多项式来对移动窗口内的数据进行多项式最d,--乘拟合，其强调中心点的中心作用。移动窗口宽度及多项式次数是该方法使用中的重要参数。(2)导数算法(derivative)导数算法也可称为微分，根据需要可以选择一阶或二阶导数处理，一阶导数可以去除同波长无关的漂移，二阶导数可以去除同波长线性相关的漂移。三阶及以上的导数处理用到的很少。光谱的导数变换会将噪声引入光谱。同时应注意根据导数的阶数窗口的大小也应作出选择。微分方法被用来消除光谱基线漂移、强化谱带特征、克服谱带重叠，是常用的预处理方法之一【681。一阶导数：X(i)=【X(i+g)一x(i)]／g(2-s)二阶导数：X(i)=【x(i+g)一2x(i)+x(i)]／92(2-6)式中X为微分前的光谱吸光度；X为微分后的光谱吸光度；g为微分窗口宽度。(3)多元散射校正(multiplicativescattercorrection，MSC)MSC是I主IMartens等人【68】提出，之后在NIR固体漫反射和浆体物透(反)射分析时的到了广泛的应用‘691。MSC算法的属性与标准化的算法原理相同，也是基于样品光谱阵进行运算的。MSC算法如下：样品的平均光谱的计算；石：—∑n=l—AI,I(2-7)将xi与平均光谱叉进行线性同归，xi=lat+-bt，(2-8)求取at和lot；Xt,MSC=(xt—lai)／bt(2·9)其中，i为校正集样本数；l为单位向量，m为波长点数。使用MSC时应注意，在对校正集外的样本进行校正时，用到的平均光谱应20 张欣硕：L学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分该是原校正集中用到的又，之后再进行MSC变换。对于进行MSC处理的光谱单位应该是Iogl／R或Kubelka．Munk形式。同时，有证明MSC与SNV是线性相关的，所以两种方法的处理结果也是相似的【70】。多元散射校正是为了消除颗粒分布不均及颗粒大小产生的散射影响。(4)小波变换(wavelettransfoITII，WT)WT理论起源于工程学、物理学及纯数学领域，在80年代得到了迅速发展，被认为是泛函分析、傅里叶分析、样条分析、调和分析和数值分析的完美结合。当前小波变换在分析化学中被应用于光声光谱、伏安分析、红外光谱、可见．紫外光谱、核磁共振谱、质谱、流动注射分析、高效液相色谱等分析化学信号的去除背景、平滑滤噪、数据压缩以及重叠信号的解析。小波变换基本定义：、^／Tf(a,b)≤f(t)，lI，(aJb)≥去ef(t)lit*伴)dt(2．⋯将信号x(t)投影到小波ya，b(t)上是小波变换的主要思想，这一算法是为了获得便于处理的小波系数，对小波系数进行反变换得到处理后的信号前，先按照分析的需要对小波系数进行处理。其中、I，(a，b)=a-、I，卢与，、I，为小波母函数。在分析信号处理中，往往采用离散小波变换(DiscreteWaveletTransform，DWT)，这时对伸缩因子和平移因子都进行离散化，获得离散小波函数：ym，n(t)=aom／2v(aom／2t—nbo)(2．11)离散小波函数可以表示为：Wf(m，n)≤f(t)，ym，n(t)≥aom／2正：f(t)V(aomt—nbo)dt(2．12)这时信号是由一组小波函数线性表示出的权重：fit)=∑一+o。o厶一+。。ooWf(m，n)、l，mn(t)(2．13)与WFT相比，两者十分相似，不同之处在于WT中没有三角函数项，取而代之的是伸缩因子a，对于小的伸缩因子a，基函数变成收缩的小波；对于大的伸缩因子其基函数为展宽的小波，这两种变换分别相当于高频窗口和低频窗口。通过这些窗口变换使小波具有多分辨特征，即自动变焦能力。FT所用基本函数为三角函数，相比之下WT用到的小波函数不具有唯一性，因此小波变换结果具有多样性，同一问题可能获得结果相差甚远。小波函数的选择是WT应用当中难以解决的一个问题，当前只能通过多次尝试或已有经验来选择最佳小波函数。Symlets小波、Coiflet小波、Haar小波和Daubechies小波被证明在光谱分析中是比较有效的。、l，m，。(t)的数值计算通常通过多分辨信号分解算法或塔式算法实现，它是由Mallat提出，所以也成为Mallat算法。小波变换的发展基础是傅里叶变换，作 张欣硕L学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分为一种全新的信号处理工具在应用数学领域独具魅力。近年来小波变换在图像处理和信号处理中应用广泛且趋于成熟。与傅里叶变换相比WT具有时频局部化的特性。之后由于大量基函数的出现，加之快速算法的建立，WT在许多领域得到了应用。在WT被引入化学领域并形成化学小波分析后，WT能够将化学信号根据频率不同分解成多种尺度成分，并对大小不同的成分采用相应粗细的取样步长，从而获得聚焦于信号中的任何部分的信号。2．2．7．2偏最小二乘法(PartialLeastSquares，PLS)偏最小二乘方法的思想是在考虑到对光谱矩阵X进行分解以消除无用的噪音信息的同时，浓度矩阵Y也应作同样的处理，这一点与主成分分析的只考虑矩阵x不同，它在分解光谱矩阵x适应考虑浓度矩阵Y的影唰711。PLS首先对光谱矩阵X和浓度矩阵Y进行分解，模型为：X=TP+E(2．14)Y=UQ+F．(2-15)式中T和U分别为X和Y矩阵的得分矩阵；P和Q分别为X和Y矩阵的载荷矩阵；E和F分别为x和Y矩阵的PLS拟合残差矩阵。PLS克服了多元线性回归(MLR)不满秩求逆和光谱信息不能充分利用的弱蒯721，它的优点在于它对光谱数据可随意选取，可以使全谱，也可是其中的部分谱段，充分利用光谱的信息；PLS消除了变量之间线性相关的问题；考虑到了光谱矩阵与样品成分矩阵之间的内在联系，建立的模型更为稳健；它适合于复杂分析体系。接下来PLS要对T和u做线性回归：U=TB(2．16)B=(TTT)一tTTY(2．17)在预测时，首先根据P求出未知样品光谱矩阵的得分，之后由下式得到浓度预测值：Y=TBQ(2-18)当处理实验研究中变量较多而样本数较少时，能够通过PLS高效地抽提信息。2．2．7．3校正模型评价参数：(1)交叉验证均方根误差：(RootMeanSquareErrorofCross．Vlidation，RMSECV)RMSECV：／＆玉业(2-19)Vn(2)相关系数(correlationcoefficient，R) 张欣硕-上学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分阽√卜誉搿沼2。，(3)预测均方根误差(RootMeanSquareErrorofPrediction，RMSEP)RMSEP=／—3墨1(6—-ci)2(2-21)1m(4)预测残差平方和(PredictiveResidualErrorSumOfSquares，PRESS)PRESS=∑＆1(ci—G)2(2．22)公式中n是训练集样本数，m是预测集样品数；焉表示包括训练集和预测集所有样本实际值的均值，Ci是实际值，G是预测值。2．3结果与分析2．3．1还原糖的测定2⋯311光谱预处理近红外光谱仪采集的信息中，包含了样品背景、噪音和散射光。这些信息导致了近红外光谱的基线漂移和光谱的不重复，它们混在光谱中可能会对光谱的准确性、模型的稳定性产生影响。在本研究中选用了一阶导数(firstderivative)、二阶导数(secondderivative)、多元散射校正(MSC)、平滑处理(sm00thing)等4种预处理方法对波段选择后的光谱进行预处理。(1)多元散射校正(MSC)：为了有效地消除散射影响，增强了与成分含量相关的光谱吸收信息，本研究中采用了多元散射校正方法，由经过散射校正后得到的光谱数据进行建模。该方法的使用首先建立一个待测样品的光谱，该光谱的变化与样品中成分的含量满足直接的线性关系，以该光谱为标准要求对所有其他样品的近红外光谱进行修正。由图2．1和图2．2的对比可知，在没有经过多元散射校正的光谱存在一定程度的基线漂移，由于光传播过程中散射也影响到了光谱的重复性。通过多元散射校正这一技术有效地消除了样品问散射影响所导致的基线平移和偏移现象，提高了原吸光度光谱的信噪比。 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分图2．1未经处理的原始光谱Fig．2．1The饥删a乇嘲ⅫbaIl∞叩暇沲啪ofhoney图2．2经逝VtSC校正的光谱Fig．2．2TheMSCNIRs讲；c|嘶ofhoney(2)对光谱做一阶导数和二阶导数，近红外光谱测量到的是样品的振动光谱3级和4级倍频吸收，样品的背景颜色和其它因素会使测量的光谱出现位移或漂移。对光谱求导一般有两种方法：直接差分法和Savitzky．,Golay求导法。对于分辨率高、波长点多的光谱，直接差分法即可；但对于稀疏波长采样点的光谱，该方法所求的导数则存有较大误差，Savitzky-Golay求导法可以减少此类误差的出现【73】。本研究对象是近红外光谱，分辨率高且波长点多，因此采用了直接差分24 张欣硕：f：学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分法。求导后比较了2种求导后光谱所建立模型的优劣。目的是为了扣除仪器背景或漂移对信号的影响。图2．3为光谱经过一阶导数得到的谱图，图2．4为光谱经过二阶导数得到的谱图。(3)Norris求导平滑处理：光谱信号中通常有用信息会对应大方差，而随机噪声对应小方差。平滑的基本思路是假设随机噪声在一个处理窗口内均值为零，以平滑点为中心的一个窗口内进行多点的平均或拟合，以求得此平滑点的估计值。从平滑的思路来看信号平滑就是消除小方差保留大方差的信号处理方法【1741。平滑窗口宽度是移动平均平滑法的一个重要参数：若窗口宽度太小，不能获得理想的去噪效果；若窗口宽度太大，这种简单求均值运算，将会平滑掉有用信息，造成光谱信号的失真。为此，通过反复测试窗口宽度获得了平滑参数值。图2．3经过一阶求导获得的光谱Fig．2．3Firstderivativespectra薹光谱求导数后虽然可以消除基线和其他背景干扰以提高分辨率和灵敏度，但同时也会将原有光谱中包含的噪声放大。从图4中可知，毛刺极多，图3中也有大量毛刺，噪声被显著放大。图2．5和图2．6分别No盯is一阶求导和Norris二阶求导后获得的光谱，对比图2．3和图2．4可以看出，选用Norris求导平滑处理可以消除噪声，尽可能去处无关的信息变量。 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分图表2．4经过二阶求导获得的光谱Fig．2．4Secondderivativespect随图2．5经过No硝s导数平滑的一阶导数后的图谱Fig．2．5NorrissmoothedFirstderivativesp∞tl"Bgr葛口1gP葛a1 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分莹雪L刮L一．产I．。图2．6经过No竹is导数平滑的二阶导数后的图谱Fig．2．6NorrissmoothedSecondderivativespectra2．3．1．2蜂蜜还原糖近红外分析模型的建立采用偏最小二乘法建立多元统计模型。校正模型的最佳因子个数由舍一交互验证法(1eave-one．out)确定，计算出不同主因子数对应的PRESS(predictedresidualerrorsumofsquare预测残差总和)值和RESECV(rootmeansquareerrorofcrossvalidation交叉验证均方差)，然后以最小的PRESS值所对应的因子数作为模型的最佳因子数。图2．7Norris平滑后交gCi正-RMSECV6t和PLS主成分因子关系图Fig2．7NorrissmoothedrelationshipbetweenRMSECVandPLSfactor 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分图2．7显示TNorfis平滑后糖度模型中交互验证PRESS值随PLS因子变化的趋势，随着PLS因子数的增加，PRESS逐渐降低，当PLS达到7时，PRESS最小，当PLS因子数大于7时，PLS模型拟合了部分噪声信息，导致PRESS值逐渐增大。因此，蜂蜜还原糖模型的最佳主因子数为7。2271．858l·6574193．4101．3975189．7131．3846188．6521．380；C、Norris平滑、一阶导数、二阶导数处理后，建立的蜂蜜还原糖的表2．1。从表2．2可知，4种预处理方法及原始模型的相关系数均大于毒于傅里叶变换近红外光谱的蜂蜜还原糖检测具有可行性。立的模型，交互验证相关系数越大，交互验证均方差RMSECV越小，的光谱信息与分析组分的相关性越好，所得到的模型的预测能力也就 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分主莲蛊图2．8光谱模型预测值与真实值值相关性Fig．2．8Relationshipbetweenpredictionandactual从表2．2可知，经过MSC校正后，NorrisZ阶导数处理的光谱模型最优，交互验证相关系数达到0．962，交叉验证均方差也只有1．36。图2．8表明，这一模型可以很好的预测蜂蜜中的还原糖含量。在近红外4000．10000cm-1范围获得蜂蜜透反射光谱，应用多元散射校正(MSC)处理，并经过Norris-阶导数平滑后的PLS模型优于经典PLS算法所建立的模型。表2．29同预处理方法后蜂蜜还原糖校正模型的预测性能对照Table2．2Resultofdifferentpretreatment2．3．2近红外光谱对果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的测定2．3．2．1样品集划分方法Kennard．Stone法是根据已经被选择的样品计算未被选择的样品的最小欧式距离，随后通过选择计算出来的欧氏距离，选择欧氏距离最大的样品进入校正集，反复进行这一步骤，直至选出指定的样品数f75】。K．S算法具体步骤如下：①首先 ～．f张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分计算两两样本之间的距离，选择距离最大的2个样品；②分别计算剩余的样本与已选择的2个样本之间的距离；③对于每个剩余样本而言，其与已选样品之间的最短距离被选择，然后选择这些最短距离中相对最长的距离所对应的样本，作为第3个样品；④重复步骤③，直至所选样品的个数等于事先确定的数目为止【J撕】。由于随机选择法是从样品集中随机选取样本作为校正集，通过该方法所获得模型预测结果会不稳定。而根据主成分分析三维投影划分校正集和预测集可以作为寻找建模校正集的依据，但是其选取过程依赖于建模这的主观意识，同样具有不确定性，因此本研究中采用K．S算法划分样本，研究中共计120个样本，通过Kermard-Stone法挑选出了90个样本作为校正集，余下的30个样本作为预测集。图为Kennard．Stone法挑选出的90个样本的第一主成分和第二主成分得分图。由图可以看出预测集样本包括在了校正集样本的分布空间当中，校正集样本在主成分上分布均匀。因此研究中用到的校正集样本具有代表性，预测集样品的光谱信息被包括在了校正集样本的光谱信息中，通过这样的划分能够提高预测模型的精度和泛化能力。1驾2．9样本的第一和第二主成分分布Fig-2．9Distibutionofsamplesinthefirstandthesecondprinciplecompnents2．3．2．2光谱中噪声和背景的去除：选用了平滑处理(smoothing)、一阶导数(firstderivative)、二阶导数(secondderivative)、多元散射校正(MSC)4种预处理方法对波段选择后的光谱进行预处理，增强了与成分含量相关的光谱吸收信息，有效地消除了样品间散射影响所导致的基线平移和偏移现象，提高了原吸光度光谱的信噪比，尽可能去除无关的信息变量。这里的PLS因子数等同于主成分分析中的主成分数。以果糖为例，没有经过 张欣硕：L学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分预处理的光谱所选择PLS因子数较多，原因是光谱中包含了较多的噪声信息，通过平滑、求导和多元散射校正后，可以通过选择较少的PLS因子数，采用原始光谱建立模型需要选取16个主成分，最终建立模型的交互验证均方差为0．629，Q2可达0．971。从模型评价的角度来看该模型已经具备了较高的预测精确度。但是通过多元散射校正后再用校正后的光谱建立模型，选取主成分数仅为13个，较少的主成分数能够加快模型的运算速度，也有利于提高模型的稳定性，其交叉验证均方差为0．625，虽然这一精度变化不明显，仍然可以认定经过光谱处理后的模型，总体评价优于末处理光谱建立的模型。从表2．3可以看出，对于果糖和麦芽糖，导数处理并没能很好地提高模型的预测能力，可能是因为仪器本身噪声本来不大，在求导过程中，扣除了有限的基线平移和偏移现象，同时却放大了噪声，降低了信噪比，整体看来得不偿失。而在葡萄糖和蔗糖的处理中，多元散射校正没有起到明显的作用，推断应该是因为由于MSC假定散射波长及样品浓度无关，因此当分析组分性质变化较小的样品时，MSC校正结果并不理想。而且蜂蜜本身是一种均匀的粘稠液体，没有颗粒度大小等因素的影响，即便是其粘稠度会造成一定程度的基线漂移，也没有产生影响到模型的精确度。同时通过四种糖的预处理方法的比较可以看出，并不是光谱预处理做的越多获得的模型预测能力越好。过多的光谱预处理反而会在处理中删除有用的光谱信息，导致预测能力下降。2．3．3蒙特卡罗交互验证法剔除奇异值奇异值的识别是多元校正研究的热点问题。这些诊断方法通常都是单个奇异样本的识别，现有马氏距离判别法、光谱残差的检验、杠杆值和学生t检验等。稳健回归如MVT(MultivariateTrimming)【77】和MCD(MinimumCovarianceDeterminant)等可以识别多个奇异样本，但是重点是识别光谱方向的奇异点。2009年提出了基于蒙特卡罗交互验证的奇异值检测方法【7引。该方法考虑到了光谱阵、性质阵和模型方向奇异点对模型稳健性的影响，能够同时识别三个方向的奇异点，以此降低了掩蔽效应带来的影响，与以上方法相比表现出更高的奇异样本识别能力t791。 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分表2．3果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的不同前处理方法建模结果Table2．3Theresultsofdifferentpretreatmentforfructose，glucose，sucroseandmaltose模型譬PLS校蓉关酱馨兰篡Q2罕器果一阶求导+平滑10O．9840．4790．9770．6430．9701,3，3糖二阶求导+平滑60．9620．7410．9271．5740．8192,9．9MSC+-"阶求导+平滑1O．982O．529O．9670．6460．9702，1l，ll翌一阶求导+平滑140．9790．5660．9420．9380．9401,9，9羹二阶求导+平滑9o．9600．7970．9001．0070．93l2，9，9蔗一阶求导+平滑100．9740．2740．9640．3840．9491,13，13麦一阶求导+平滑130．8390．4640．9260．6160．7371,9，9薹二阶求导+平滑l。。．843。．432。．8ll。．633。．7222，7，7 张欣硕：l：学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分本研究即采用了蒙特卡罗交互验证法检验奇异值。算法步骤为：首先利用PCR确定最佳主成分数，之后用将整个数据随机分为两部分，即训练集和验证集。训练集通过PCR已经确定的主成分数建立校正模型，验证集则用来预测样本的预测误差，反复循环多次以保证每个样本都被检测到。从以上步骤获得每个样本的预测误差分布，并计算每个样本的预测残差的均值和标准偏差，对样本的均值和标准偏差作图后，那些高均值和高标准偏差区域的样本往往可以认定为奇异样本。图2．10果糖蒙特卡罗交互验证结果Fig．2．10ResultofcrossvalidationforfTuctose图2．11葡萄糖交互验证结果Fig．2．1lResultofcrossvalidationforglucose 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分图2．12蔗糖交互验证结果Fig．2．12Resultofcrossvalidationforsucrose图2．13麦芽糖交互验证结果Fig．2．13Resultofcrossvalidationformaltose蜂蜜作为一种复杂的混合物，其中成分繁多，每一种蜂蜜的特定成分有所差异。本研究采集到的蜂蜜来源广泛，多数为直接来自于蜂农采收的原蜂蜜。这些蜂蜜样本个体往往有个别组分的差异，比如总样本中92号样本水分含量远高于其它样本含量。这种个别样本的性质范围远远超出校正集样本范围时，如果仍然在模型建立中使用该样本，就会容易使模型出现较大的偏差，不能够准确的预测未知样本。因此在建立校正模型之前，检测并剔除掉奇异样本是获得一个稳定模型的关键。在本研究中使用了蒙特卡罗交叉验证方法检验奇异点。每次随机去除80％的样本建立PLS模型，剩余样本用于模型的预测。共随机采样1500次，之后计算获得样本的预测残差均值和方差，绘制均值．方差分布图。从图中可以看出，虽然样本光谱相同，但是针对彳‘同成分的检测，每一种成分对应了完全不同的奇 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分异值，果糖作为检测目标时14和69号样本将被剔除掉；葡萄糖作为检测目标时92号样本将被剔除掉：蔗糖作为检测目标时，奇异值的情况比较复杂，需要将均值和标准差距离大多数样本比较远的个体逐个剔除，之后建立模型，再通过评价模型参数来决定需要剔除的奇异值。最终决定剔除21号和69号；麦芽糖作为检测目标时54，98和77号号样本将被剔除掉。从表2．4可以看出扣除这几个奇异值之后，模型的交互验证均方差和交互验证决定系数都有不同程度的提高，麦芽糖模型的预测精确度从不能接受到可以一定程度地为研究提供参考价值。总之，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的模型质量都有了提高。表2．4奇异值扣除对模型结果的影响Table2．4Theimpactofoutlieronthemodel2．3．4小波滤噪小波滤噪是对信号和噪声的小波变换系数进行处理，根据信号和噪声在不同尺度上小波变换的不同形态表现，构造出相应的规则，处理的实质最大限度地保留有效信号对应的小波系数。同时减小甚至完全剔除由噪声产生的系数。经多次筛选和比较，参考相关文献和多次试验研究，小波滤噪参数选择为：用Birge．Massart策略来确定各尺度的阈值，小波基采用db7，采用5尺度分解。 张欣硕士学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分图2．14小波变换前的图谱Fig．2．14Thespectrumbeforewavelettransform图2．14小渡变换后的图谱Fig．2．14Thespectrumafterwavelettransform小波变换前后预测结果并没有因为大量变量的剔除而发生明显的变化。通过小波压缩，建模过程中由1557个变量变为几十个变量，大大缩短了建立模型及通过模型预测蜂蜜中糖含量所需的运算时间，有效地提高了检测效率。袁2．5小波变换前后的光谱模型对比Table2．5Thecomparisonofthemodelofspectumbeforeandafterthewavelettransform 张欣硕-J：学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分表2．6小波变换前后的光谱模型计算时问Table2．6Thecomparisonofthetimecostofthemodelbeforeandafterthewavelettransfonn2．3．5P1．5校正模型的建立和检验表2．7化学计量学方法处理后建立的PLS模型Table2．7PLSmodelbuildedafterthepretreatmentofchemometricsmethods对每个样品都采用了透反射的光谱采集方式，在采用外部验证的方法对模型的预测能力进行了评测。首先采用表2．6中的前处理方法对数据处理，通过蒙特卡罗交互验证方法扣除奇异值之后通过Kemard．Stone方法划分训练集和预测集，最后建立PLS校正模型，模型结果见表2．6。由该表可知，果糖、葡萄糖和蔗糖的交互验证决定系数均在0．94以上，预测误差也都较小，预测效果良好。只有麦芽糖的预测能力较差，可能是因为麦芽糖在蜂蜜中含量太低，且其基团与其它几种糖十分相近，影响到了近红外光谱的预测能力。这些指标的预测结果与传统化学方法测定值之间的相关性如图2．15，图中R2为果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的预测结果与真实结果的决定系数分别为0．967、0．923、0．958和0．738，表示其相关性，从数值来看，与交互验证决定系数相近，能够反映模型的精确性和准确性。从图中可以直观地看出近红外预测值可以准确地逼近其真实化学值。 张欣硕：l：学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分4237322735葡萄糖27323742273210323742麦芽糖02460l234图2．15真实值与近红外预测值之间的相关图Fig．2．15TherelationshipofrealvalueandforecastingvaluebyNIRspectroscopy表2．8果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的部分预测值和真实值对比Table2．8Thecomparisonofrealvalueandthepredictvalueoffructose，glucose，SUCTOSCandmaltose果糖(％)葡萄糖(％)蔗糖(％)麦芽糖(％)真实值预测值真实值预测值真实值预测值真实值预测值33．3734．4736．4638．541．381．180．86O．7335．1935．1l35．8335．202．201．801．381．5337．9337．9435．6335．540．100．471．341．0531．7932．0934．9034．950．180．431．761．6236．2536．2l36．1035．494．073．5l2．262．3l28．9l29．6927．8030．194．4l4．561．150．9637．4537．1329．9831．392．342．381．821．4537．7038．6435．6536．760．870．691．63O．7235．3836．2634．5735．682．102．111．591．1633．4433．3230．2930．841．791．402．722．76表2．8列举了四种糖的真实值与预测值的确切数值，从这些数值也可以看出近红外光谱建立的预测模型可以精确地预测蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖38 张欣硕：I：学位论文近红外光谱技术定蟹测定蜂蜜成分的含量，麦芽糖含量大于1％时其预测能力是能够满足商检需求的。2．3．6羟甲基糠醛和总酸的测定如下表所示，将羟甲基糠醛和总酸的预测指标与蜂蜜中含量较高的几个糖分的测定结果相比，近红外光谱模型的预测结果远远不能达到一个理想的准确度。表2．9羟甲基糠醛和总酸化学计量学方法处理后建立的PLS模型Table2．9PLSmodelsofHMFandtotalacidbuildedafterthepretreatmentofchemometricsmethods虽然模型的校正决定系数都接近O．8，但是其验证集均方差和交叉验证均方差都反映了模型的预测结果误差太大，还不能够用来作为一种可靠地检测方法应用到商检中。2．4结论在本研究中已经包含了十几种蜂蜜，因此试验结果能够证明近红外透反射光谱技术适合于多种蜂蜜还原糖的检测，同时，MSC、Norris导数平滑、一阶导数、二阶导数等数据预处理方法对利用近红外透反射无损定量检测蜂蜜还原糖起重要作用，提高了模型的泛化能力和预测准确度。并且经过处理的光谱所建立模型优于LuizC．M．Pa眦a等人110l和KasparRuoff【⋯的试验结果，近红外光谱技术可在较短时间内快速检测蜂蜜还原糖含量，而且能达到满意的检测精度。试验模型中包含了来自多个省份的十几种蜂蜜样品，不同的地理位置和不同的植物来源都会对光谱产生影响。但是正是在这样的复杂条件下建立的模型才有更广的适用范围，试验模型中加入了掺假样品也是为了是模型更好地适应实际检测中的需要。本文使用近红外光谱技术进一步对蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量检测进行了研究。结果表明，采用蒙特卡罗交互验证法法，剔除了奇异值，有效地改善了数据分布，提高了模型的准确性。通过上述几种化学计量学方法，得到的蜂蜜中四种糖的近红外光谱模型准确、可靠。本文方法为蜂蜜快速检测和在线39 张欣硕}：学位论文近红外光谱技术定量测定蜂蜜成分实时质量控制提供了可行性和依据。本研究将进一步研究近红外光谱技术在蜂蜜其他指标成分含量检测的应用，寻找利于建模的敏感波段，扩充蜂蜜的样本数量，并且进一步优化建模方法。综上所述，近红外透反射光谱技术满足蜂蜜检测质量控制的需求，是适合蜂蜜还原糖以及果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量检测和质量控制的高效检测技术。 张欣硕一I：学位论文近红外定性测定蜂蜜掺假3．1引言第三章近红外定性测定蜂蜜掺假蜂蜜作为一种极常见的营养食品，在近年来的质量调查中，合格率一直不能尽如人意。其成分复杂，而主要成分又都足糖类，掺假原料易于获得，但是掺入后难以鉴别。因此建立一种快速有效的质量检测方法迫在眉睫。近红外光谱分析技术的应用当中，一个重要的特点就是在只需要知道样品的类别或等级，不需要知道样品中组分数和含量的情况下可以进行定性分析。这是可以借助化学计量学中的模式识别方法实现这一分析。依靠模式识别计算机自动将待识别的模式分配到各自所属的模式类中去。在化学分析中，模式对应的是化学数据的变量。在近红外测定蜂蜜当中，模式指的就是蜂蜜的真和假两个类别。人工神经网络既可以在定量校正方法中应用，同时也在聚类分析和模式识别中也有一定优势，人工神经网络本身具有一定的非线性映射能力，用于有监督模式识别的基本思路与普通的判别分析方法相同。3．2材料与方法3．2．1样品来源试验用样品在测定前先经过50℃水浴溶解其中的结晶，之后置于25℃室温下静置过夜后采集光谱。(样品由湖南省明园蜂业有限公司提供，包括100个真蜂蜜样本，分别来自lIJ西、陕西、湖南、广西、广东、宁夏、湖北、江西、浙江、四川10个省。)假蜂蜜样本通过实验室配制，配制方法如下表：袁3．1掺假蜂蜜配制方法Table3．1Preparationmethodofadulteratedhoney3．2．2样品光谱采集方法41 张欣硕‘I：学位论文近红外定性测定蜂蜜掺假AntarisII型傅立叶变换近红外光谱仪(美国ThermoScientific公司)采用积分球和旋转台测定样品漫反射光谱，配备丹麦FOSS公司浆体杯(slurrycup)、镀金反射器(goldreflector)；将样品置于浆体杯中，用镀金反射器压实，注意避免有气泡压入当中。采用透反射积分球模式采集光谱，透反射光程0．1mm，扫描次数32次；光谱测定范围4000．10000cm一；分辨率8cm～。每个样本分别采集3次，取3次采集平均光谱作为样本的原始光谱。3．2．3光谱处理方法与原理主成分分析：将光谱矩阵分解为k个向量的外积之和，分别为得分向量和载荷向量。各个得分向量之间正交，同时各个载荷向量之间也正交，而且每个载荷的向量长度为l。光谱矩阵的协方差矩阵的前n个特征值的和除以它的所有特征值的和称为其前n个主成分的累积贡献率，选取主成分的个数取决于主成分的累积方差贡献率，累积方差贡献率大于某一值时所需的主成分数能够代表原始变量所能提供的绝大部分信息。BP神经网络(BackPropagation)是南Rumelhart和McCelland所在的科学小组提出，从1986年到现在，得到了广泛的应用，是应用最广的神经网络之一。它的原理是将误差逆向传播，以训练网络，建立成一个多层前馈网络。BP网络无需事前揭示描述这种映射关系的数学方程，即可学习和存贮大量的输入．输出模式映射关系。它的学习规则是使用最速下降法，通过反向传播来不断调整网络的权值和阈值，使网络的误差平方和最小。BP神经网络模型拓扑结构如下：包括输入层(input)、隐含层(hidelayer)和输出层(outputlayer)。输入层隐含层输出层图3．1BP神经网络拓扑结构Fig．3．1BPneuralnetworktopology近红外光谱主成分分析使用MATLAB内置函数处理，神经网络的建立使用了MATLAB自带的神经网络工具箱。径向机神经网络(RBFjNN)：可以提供完备的、最优逼近功能具优秀的离42 张欣硕士学位论文近红外定性测定蜂蜜掺假散数据内插特性；同时具有结构简单、训练速度快、函数逼近能力和分类能力强，不存在局部最优问题等特点，由该网络构成的系统是有界、稳定的。属于前向神经网络模型，与多层前向网络相似。其第一层为输入层，由信号源节点组成，在光谱巾就是指光谱数据。第二层为隐藏层，节点数与光谱分类具体应用相关，其中神经元的变换函数是指径向基函数多中心点镜像对称且衰减的非负线性函数，它是一个局部响应函数，而以前的前向网络变换函数都是全局响应函数。第三层为输出层，用于对输入的数据作出响应。3-3结果与分析3．3．1数据的预处理数据的标准化，以数据集的平均值作为坐标轴的原点改变数据空间的坐标轴和原点。标准化处理后的光谱矩阵每列元素均值为0，方差和标准差为l。通过数据标准化消除量纲和数量级的限制。主成分分析主要目的是将数据降维，概率观点认为，一个随机变量的方差越大，该随机变量包含的信息越多。主成分分析中误差矩阵主要是由测量噪声引起，忽略掉误差矩阵数据中大部分信息不会有损失，同时可以起到数据压缩和特征变化提取的目的。因此，对原变量进行转换以后可以组成新变量，这些新的变量是原变量的线性组合，同时新变量能够尽可能多地表征原变量，不会丢失原变量的数据特征。3．3．2BP神经网络的建立图3．2人工神经网络迭代次数与预测精确度关系图Fig．3．2Therelationshipofartificialneuralnetworkresponsetimesandthepredictionaccuracy43 张欣硕：I：学位论文近红外定性测定蜂蜜掺假在本研究中创建了一个BP人工神经网络，分为三层，包括输入层、隐含层和输出层。隐含层设置了20个神经元，输出层2个神经元。隐含层神经元和输出层神经元使用都是Sigmoid函数，训练使用量化链接梯度训练函数trainscg算法。数据分为三部分，即校正集、验证集和测试集。数据分组使用了RS(RandomSelection)方法，RS法是随机选取样本组成校正集的方法，该法采用完全随机的原则，方法简单且不需要对数据进行挑选，以期获得有代表性的样本。图3．3校正集中错判个数与迭代次数关系图Fig．3．3Thenumberoffailedpredictionofcalibrationmodelandtheiterationsnumberrelationship首先用校正集建立神经网络，在实际操作中神经网络的迭代次数将直接影响验证结果的正确率，以5％蔗糖掺假为例，在迭代41次时验证集获得的错误率最低。从图3．2中也可以看出，随着迭代次数的增加，校正集错误率在不断降低，但是验证集错误率在迭代41次处出现了拐点。这说明在41次迭代之后的运算中，神经网络出现了过拟合，而且这一趋势将随着迭代次数的增加越来越严重，继续增加迭代次数不但增加神经网络的响应时间，同时也会降低模型的预测能力。同时，从图3．2中也可以看出测试集的错误率与验证集错误率呈现出相同的趋势，在验证集错误率从拐点处升高的同时，测试集也呈现出这一趋势。 张欣硕士学位论文近红外定性测定蜂蜜掺假图3．4同一样本集多次建立模型预测准确率对比图Fig．3．4Thepredictionaccuracyofmodelsbuildedindifferenttimsforonesetofsamples神经网络的隐含层节点数对其预测精度有较大影响：节点数太少，网络不能很好的学习，需要增加训练次数，而且不能建立复杂的映射关系训练的精度也受影响；节点数太多，训练时间增加，网络容易过拟合，这时候即便训练样本预测准确，其它样本预测误差也会很大。表3．2BP神经网络模型对不同掺假的辨别能力Table3．2ParameterofBPartificalneuralnetworkmodelfordistinguishingadulterationindifferentamount从上表可以看出，虽然BP神经网络获得均大于90％的预测正确率，但是从MSE很难找到BP神经网络对不同中糖分掺假预测能力的规律，也不能找到掺假量对BP神经网络预测能力的影响。45 张欣硕士学位论文近红外定性测定蜂蜜掺假P—知m嚯n∞h0．0411m,o∞I■005I—Train}I—v■目djMII=!塑J＼～．3．3．3RBF神经网络的建立RBF神经网络具有结构简单，学习收敛速度快的特点，适合于逼近非线性函数，在模式识别中也能够发挥重要的作用。RBF的SPREAD是扩展系数，对其模型的预测能力有非常大的影响。通过在1．100之问的选择，最终选定33作为模型的SPREAD值，建立神经网络。表3．2RBF神经网络模型对不同掺假的辨别能力Table3．2ParameterofRBFartificalneuralnetworkmodelfordistinguishingadulterationindifferentamountRBF神经网络选取迭代次数为47，设置MSE值为0．05，所建立网络的验证集错误率和测试集错误率均小于BP神经网络的错误率，同时，RBF神经网络建立的模型重复性好，通过多次重复，获得结果相同。 张欣硕士学位论文拉曼光谱定最测定蜂蜜中主要糖分含量研究第四章拉曼光谱定量测定蜂蜜中主要糖分含量研究4．1引言拉曼光谱是近年来发展十分迅速的一种光谱分析方法，它在某些方面具有着无法替代的优势。物质的拉曼光谱谱峰数目、强度和位移直接与样本的分子振动和转动能级有关。在采用拉曼光谱进行分析时，该方法具有与测试样品非接触性、非破坏性、时间短以及需要样品量小的特点。同时，拉曼光谱谱峰尖锐，后续数据处理简单，更适合谱库搜索和运用差异分析进行研究。在拉曼光谱应用开发的这些年，国内外人型实验室使用增多，但均需人工谱峰对比，对仪器和人员的要求较高。由于拉曼光谱具有高效快速检测的优势，且不需要样本前处理，同时拥有高的检测灵敏度，现在拉曼光谱已被应用于农业和食品化学领域，用于检测样品中的单糖、多糖、蛋白质、脂肪和核酸等[80-83]。近年来，光纤样品探头、微型二极管激光器、去高灵敏性光电耦合器件和组合光学设计、计算机数据挖掘等领域飞速发展，为体积小易操作的便携式拉曼光谱仪的研发铺平了道路。4．2材料与方法4．2．1样品制备共采集75个蜂蜜样本，其中包含了来自于17种不同蜜源植物的蜂蜜。蜂蜜样=耷=分为校正集和验证集两部分，分别约占75％和25％。所有样本保存在4"C下。采集光谱之前，将样本置于50℃水浴中过夜至其中的糖结晶完全溶解，取出放置至25℃。4．2．2高效液相色谱分析按照国标蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法一液相色谱示差折光检测法(GBT18932．22．2003)测定。其中高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)，配有示差折光检测器(岛津RID．10A)。实验条件如下：色谱柱：LichrospherNH2柱(10nm*5ttm，4．6"250mm，江苏汉邦)流动相：乙腈+水(77+23)：流速：1．0mL／min；柱温：30℃：检测器池温度：35℃；47 张欣硕士学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜中主要糖分含量研究4．2．3仪器采用i-Raman拉曼光谱仪(BWS415-785H，B&WTEKInc．USA)，配备了拉曼光纤探头，CCD检测器和功率为495mW波长为785nm激光发射器，发射波数为l75．2600cm～。仪器分辨率为3cm一。将约109样品加入到石英比色皿中，置于仪器配备的比色皿支架上。收集光谱时间为15s，选用光谱发射功率为总功率的60％。系统操作软件为BWSpee。M3．26。每个样本采集三条平行光谱。最后将采用三条光谱的平均光谱。下图为试验用拉曼光谱仪及配备的光纤探头。图4．1试验用拉曼光谱仪及配备的光线探头Fig．4．1．Ramanspectroscopyandthelightprobe4．2．4数据处理方法4．2．4．1遗传算法(geneticalgorithm，GA)遗传算法于1975年首先被Holland提出，70年代以来，在分析化学领域得到了广泛应用，在特征变量筛选方面获得了很好的结果。该算法借鉴了生物界自然选择和遗传机制的原理，利用交换、选择和突变作为算子的操作方法，随着不断地遗传迭代是目标函数值计算结果更接近于实际值的变量保留，不能获得响应值的结果在迭代中被淘汰，最终获得最优结果。遗传算法的实现由5个基本要素：参数编码、群体的初始化、适应度函数的设计、遗传操作设计、收敛判据和变量的选取等。该算法在近红外光谱处理的应用中，实现步骤如下：a．参数编码。b．群体的初始化。c．适应度函数的设竹。d．遗传操作。 张欣硕I：学位论文拉曼光谱定缋测定蜂蜜中主要糖分含量研究在光谱处理中通过计算时间、计算机变量或从解的质量方面等确定判据。选取遗传迭代次数是常用的收敛终止条件，其取值范围一般为100．1000次。这种收敛判据方法叫做启发式的收敛判据法。遗传迭代完成后，所有变量将会按照选取频率进行排列，由选取适应度函数和变量数为依据选定最佳变量数，最终获得所选的变量。计算新一代种群中每个个体的适应度，然后返回第三步。评价个体优劣的适应值函数为：F=再而1，其中预测均方根误差(RootMeanSquareerrorofPrediction，RMSEP)由对模型的评价指标进行变换获得。4．2．4．2粒子群优化算法(PSO，ParticleSwarmOptimization)粒子群优化算法是模仿鸟类捕食行为的一种智能优化算法，每只鸟在捕食时，找到食物最简单有效的方法是搜寻距离食物最近的周围区域。算法中每个例子都代表问题的潜在解，粒子的速度决定粒子移动方向和距离，从而实现空间的寻优。其算法流程如下：首先实现粒子和速度初始化，对初始粒子位置和速度赋值，所赋值随机：计算粒子适应度；根据初始自适应度确定个体极值和群体极值；更新粒子速度和位置：根据新种群中粒子适应度值更新个体极值和群体极值。4．2．4．3支持向量机(SupportVectorMachines，SVM)SVM是一种基于统计学习理论(StatisticalLearningTheory)的新的机器学习算法。大多数机器学习方法采用的是经验风险最小化(EmpiricalRiskMinimization，ERM)准则，需要的样本数目大，不利于提高模型的泛化能力。支持向量机基本思想是把训练数据集从输入空间非线性地映射到高维空间(Hibert空间)，之后在高维空间中求解凸优化问题(典型二次规划问题)。通过采用结构风险最小化准则，要求在是样本点误差最小化的同时缩小模型泛化误差的上界，从而得到唯一全局最优解。4-3结果与讨论4．3．1样本选择及光谱收集拉曼光谱取决于分子中振动的极化率的变化，因此可以提供谱图的官能团信息。尤其是对于红外是弱吸收的S．S，C=C，N=N等官能团能够给出强的拉曼信息。表4．1中表示了校正集和验证集中蜂蜜样本的糖含量。这些蜂蜜样本中所含的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖符合中华人民共和国蜂蜜标准GB18796．2005中的规定。所选样品来源，“泛，品种齐全，具有代表性，因此建立的预测模型能够49 张欣硕}=学位论文拉曼光谱定鼍测定蜂蜜巾主要糖分含量研究直接应用于实际检测中。表4．1校正集和验证集蜂蜜样本果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量Table4．1Chemicalcompositionofhoneysamplesincalibrationandvalidationsetsdeterminedbyreferencemethods蜂蜜中特征峰主要在351，425，517，592，629，705，778，824，865，915，981，1065，l127，1264，1373和1461cm一等波数上【弘鲫。这和Paradkar和Irudayaraj的研究相一致。其中在351，425，517，592，629，778和981几个波数上的吸收官能团尚不明确。705cm_对应于COO和CCO，OCO基团；865和824cm“对应于CH和CH，CH2；915cm。1与CH和COH相关；1065cmd碳水化合物中的C．H和COH以及蛋白质和氨基酸中的C-N相关；1127cm以与糖中的C．O和蛋白质和氨基酸中的C-N基团相关；1264cm。用于定量C(6)．OH和C—OH；1373cmo与C．H和O．H有关；1461cm。与CH2和COO．基团有关【871。图4．2蜂蜜的拉曼光谱Fig．4．2Ramanspectraofhoney 张欣硕．J：学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜中主要糖分含量研究4．3．2airPLS基线扣除法图4．1为纯蜂蜜的拉曼图谱，从中可以看出由于背景光所导致的基线漂移非常明显。背景光通常来自于试样，容器和环境，在本试验中，样品置于石英比色杯中，且用比色杯架盖严，基本可以排除容器和环境的影响。因此背景光主要是样本中的荧光。常见有机分子中的荧光发色团包括羰基、乙烯基、硝基等，这些基团单独存在它们只会在紫外波段吸收光子，但是多个基团构成Ⅱ电子系统内的飞溅和电予集团会使光吸收向较长的波长偏移。从而使吸收范围的长波长段会延伸到可见光区，产生十分强烈的荧光背景。荧光的出现会严重掩盖光谱中的信息，降低了拉曼光谱的信噪比。因此需要采取一定方法来去除这些基线漂移。现阶段主要有两种手段用于降低荧光的影响：一是通过样品的预处理，通过表面增强等手段，提高拉曼光谱信息的获取，这一方法操作繁琐，成本较高，并不能突出表现光谱检测的实时在线的优势。另一方法是通过化学计量学的方法扣除拉曼中的荧光背景。本研究采用了中南大学化学化工学院编写的airPLS【锚】和baselinewavelet两种方法进行基线扣除。从结果可以看出，通过airPLS和baselinewavelet两种方法对背景的基线漂移进行扣除，都获得了很好的效果，其中airPLS更适用于蜂蜜的拉曼光谱的基线漂移的校正，校正模型的预测能力得到了显著提高。图4．3airPI_$法扣除基线后的蜂蜜拉曼光谱Fig．4．3RamanspectraofhoneydeductedthebaselinebyairPLS同时，在样品的拉曼数据采集过程中，数据采集的时空差异会引起样品数据间的波动性，这些波动性将影响到拉曼光谱定量分析的准确性和精确性。 张欣硕：}：学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜中主要糖分含量研究下图表示果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖标准物质的拉曼光谱。四种糖的标准物质表现出不尽相同的特征吸收，而蜂蜜的拉曼光谱正是综合了所有四种糖的特征峰。虽然可以借助拉曼特征光谱图库来溯源，获得相应特征峰对应的化学键，但是鉴于蜂蜜是一种复杂的混合物，其中包含了糖、蛋白质和矿物质等成分。尤其是有机物的特征峰出现了严重的重叠，以筛选相应特征峰作为定量标定的标准的工作难以实现。例如，果糖的特征峰是847nm～，葡萄糖的特征峰为868nm～，而麦芽糖的特征峰同时包含了847nm-1和868nm～。因此也需要借助化学计量学的方法来建立相应的预测模型。图4．4果糖溶液的拉曼光谱Fig．4．4Ramanspectraoffructosesolution图4．5葡萄糖溶液的拉曼光谱Fig．4．5Ramanspectraofglucosesolution52 张欣硕士学位论文拉曼光谱定最测定蜂蜜中主要糖分含营研究图4．6蔗糖溶液的拉曼光谱Fig．4．6Ramanspectraofsucrosesolution图4．7麦芽糖溶液的拉曼光谱Fig．4．7Ramanspectraofmaltosesolution4．3．3CARS法选择变量CARS在本研究中作为一种筛选变量的方法，对提高模型的预测能力和稳定性起到了重要作用【891。在建立果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量的预测模型前，分别针对所将要预测的成分进行光谱的变量筛选。以果糖为例，图a为筛选过程中选出变量数量的总趋势趋势，随着运行次数的增加，越来越多的变量被选中。图b为经过lO折交互验证所得的残差变化图，在前46个变量筛选过程中，残差逐渐降低，表明通过该方法选中了与样本性质，即果糖含量相关的变量，而从第47个变量往后的筛选中，残差迅速增大，可以认定筛选到了与性质无关的变量。图C中¨”对应的点为残差最低点，图中的线条表示在每次运行中每个变量的回归系数的变化趋势。 张欣硕士学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜中主要糖分含量研究1∞0O50∞O．5∞0图4．8CARS法选取变量Fig．4．8ThevariableselectionofRamanspectrumbyCARS图4．9中的黑点表示通过CARS方法筛选到的变量。筛选到的变量绝大多数都刚好落在相应的特征峰上。同时，也有部分变量的位置难以解释其物理意义，但是这些变量并不能去除，去除这些变量将会严重影响模型的预测能力，当前的研究水平下这一现象暂不能解释。筛选获得的变量集中在476cm。到1625cm‘1共计l150个变量。经过CARS的筛选，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖分别仅用了46，3l，27和64个变量建立模型，远远少于原来的1150个，与相应化学成分无关的变量被剔除，因此可以极大提高模型的运算速度，同时经过CARS法筛选变量后模型的预测精确度有了明显提高。图4．9CARS法选取的果糖支持向量机模型变量Fig．4．9VariablesselectedbyCARSforSVMmodeloffructosec卫ol呈△E西啡芑．I卫E3zc_Bd西_岳I。I茧50cQ西∞2黛匣 张欣硕一I：学位论文拉曼光谱定最测定蜂蜜中主要糖分含量研究图4．10CARS法选取的葡萄糖支持向量机模型变量Fig．4．10VariablesselectedbyCARSforSVMmodelofsucrose图4．11CARS法选取的蔗糖支持向量机模型变量Fig．4．11VariablesselectedbyCARSforSVMmodelofglucose图4．12CARS"&选取的麦芽糖支持向量机模型变量Fig．4．12VariablesselectedbyCARSforSVMmodelofmaltose55 张欣硕I：学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜中丰要糖分含量研究4．3．4PtS模型的建立本研究首先采用经典的偏最d,-乘法建立校正模型，之后采用支持向量机(SVM)建立校正模型作对比。表4．2是果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的PLS模型评价参数。在数据经过了扣除基线并筛选变量后，结果虽然有所改观，但是作为最重要的评价指标，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的Q2值仅为0．6733，0．7217，0．7598和0．6808。表4．2果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的PLS模型评价参数Table4．2PLSmodelevaluationparametersoffructose，glucose，sucroseandmaltose4．3．5SVM参数选择方法采用径向机人工神经网络获得的校正模型出现了严重过拟合现象，所有预测值和实际验证集的数值决定系数均低于0．6，通过PCA提取主成分后仍然没有得到改观，人工神经网络不适合应用到蜂蜜的拉曼光谱模型建立当中。Bestc=256g=O．035897图4．13网格寻参法二维示意图Fig．4．13Two-dimensionalschematicdiagramof鲥dsearchparametermethod56 张欣硕。}=学位论文拉曼光谱定置测定蜂蜜巾丰要糖分含量研究在支持向量机模型的建立中，参数v(在程序运行获得的图中中用c表示)和02(在程序运行获得的图中用g表示)的筛选对模型起着至关重要的作用，g为RBF核的核参数，c为回归误差的权重。g的值太小，会对样本数据造成过学习的现象；g的值太大，会对样本数据造成欠学习现象。本研究中采用了格点搜索法(gridsearchingtechnique)和交叉验证(crossvalidation)对训练集进行训练以获得最佳参数。除此之外本研究还探索了遗传算法和粒子群算法在参数选定中的应用。采用网格搜索选择参数时，先选定参数c和g，在c．g坐标系上构成一个二维网格，对每一组v和02利用交叉验证评价算法算取最小的均方差(MSE)。从图中可知选定c为256，g为0．035897。粒子群算法设置迭代次数为100次，种群规模20个。获得c为276，g为0．0309。与网格搜索法选择参数明显差异，以此参数建立的模型预测能力也没有明显改变。但是需注意的是PSO算法会受到环境影响，当选在同一组数据中选取不同的样本作为校正集和验证集时，所获得结果变化较大，因此结果不够稳定。遗传算法在果糖模型建模中，设定遗传代数为200，交换概率为O．2时，获得最佳拟合结果，校正集决定系数达到0．989，但是此时的预测值与验证集实际值决定系数仅为0．570，最终选择c，g不能够达到可以接受的预测效果。将遗传算法应用到蔗糖、葡萄糖和麦芽糖中，预测值和验证集真实值决定系数分别为0．342、0．601和0．491，均不能获得一个满意的预测结果。10806山c0乏0．4020Bestc=256g=O035897一．．．叫一‘。一’。‘·．．：．．I0929a图4．14网格寻参法三维示意图Fig．4．14Three-dimensionalschematicdiagramoferasearchparametermethod57 张欣硕：t学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜中主要糖分含量研究4．3．6SVM模型的建立表4．3果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的支持向量机模型建立前处理主要参数Table4．3．TheSVMmodelmainparameteroffructose，glucose，sucroseandmaltose403s302520TestS戚鼬簪e∞i∞Pmaict时SⅧl∥～q／⋯0246810121l16"820a图4．15果糖的支持向量机校正集和验证集真实值和预测值比较Fig．4．15ComparisonofactualvalueandpredictedvaluebySVMofcalibrationsetandvalidationset． 张欣硕士学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜中丰要糖分含量研究加T髂ls醴Re峭mionPrwliO时乳懈辍。}I◇哮划：型【§渡＼；砖盈一⋯口。二jO246810’214"61820b图4．16葡萄糖的支持向量机校正集和验证集真实值和预测值比较Fig．4．16ComparisonofactualvalueandpredictedvaluebySVMofcalibrationsetandvalidationset．432"OTe醴Sd黜伊皓si啊lPl氐融碲S、棚。厶之⋯l辜掣}蔫／／。、涔熏塞、．．刁j⋯⋯。—’弋—r024681012C图4．17蔗糖的支持向量机校正集和验证集真实值和预测值比较Fig．4．17ComparisonofactualvalueandpredictedvaluebySVMofcalibrationsetandvalidationset．59 张欣硕士学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜巾主要糖分含量研究Te磺S矗Ro艄ionP嘲byS嘲图4．18麦芽糖的支持向量机校正集和验证集真实值和预测值比较Fig．4．18ComparisonofactualvalueandpredictedvaluebySVMofcalibrationsetandvalidationset．最终拉曼光谱的预测结果仍然没有近红外光谱的预测结果准确。可能存在以下问题：试验中所用样品分别取样于2008、2009和2010年，样品的长时间保存中发生褐变，当中的一些发色团正是对拉曼光谱检测造成严重影响的荧光物质。这些荧光的产生掩盖了部分糖成分的信息。与此同时，由于试验样本较多，部分掺假样品需要配制，因此收集样本光谱花费时间较长。时空差异必然对拉曼光谱的稳定性产生影响。表4．4果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖cARS选取变量后建立的支持向量机模型Table4．4TheSVMmodelmainparameteroffructose，glucose，sucroseandmaltoseafterCARS拉曼光谱仪本身的分辨率和信噪比不够高，太多的仪器噪声掩盖了有用的光谱信息，从而导致预测的精确度不够高。进一步的研究可以采用较高分辨率的拉 张欣硕：}学位论文拉曼光谱定量测定蜂蜜巾主要糖分含量研究曼光谱仪进行尝试。值得注意的是高分辨率的拉曼光谱仪所用发射波长不同，在其所用波长下会对荧光物质更为敏感，由此造成的基线漂移同样会严重影响光谱信息的收集。今后的研究中不妨采用加入金属溶胶等表面增强的拉曼光谱方法提高信噪比。傅里叶变换．表面增强拉曼光谱，是当前研究的降低荧光影响的途径之一。除了样品处理和仪器增强的方法，化学计量学研究中，通过不同统计学方法的处理，扣除背景也是一个研究方向。4．4结论通过针对基于拉曼光谱技术对蜂蜜的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量检测的研究，得出了这四种糖的最佳测量模式。同时采用airPLS结合libsvm进行建模，所得结果明显优于原光谱建模结果。CARS方法筛选变量能够明显提高模型的稳定性和准确性，结果由于全谱建模的预测能力，因此，CARS同样适用于拉曼光谱的变量筛选。Libsvm方法建立的校正模型好于PLS建立的校正模型。在libsvm的参数选取过程中，网格搜寻法获得结果最稳定，应用该参数建立的校正模型预测能力最好，粒子群算法和遗传算法不适用于本研究中的参数选择。拉曼光谱技术可以快速分析蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量，对于蔗糖和麦芽糖的研究有待进一步的研究证实其可行性。6l 张欣硕rJ：学位论文拉曼光谱定性判别蜂蜜掺假5．1引言第五章拉曼光谱定性判别蜂蜜掺假拉曼光谱(Ramanspectra)，是一种散射光谱。1928年印度科学家C．V．拉曼(Raman)发现了拉曼散射效应，这一现象在同一年也在法国和苏联被发现。当光穿过透明介质被分子散射的光发生频率变化，称为拉曼散射。之后基于拉曼散射效应的原理，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析从而获得分子振动、转动方面信息，在以往的研究巾拉曼光谱被应用于分子结构的研究凹1。拉曼光谱与近红外光谱测定相同的特点是：对样品无接触，无损伤；样品无需制备；光谱成像快速、简便，分辨率高；仪器稳固，体积适中，维护成本低，使用简单。Ⅻdm敏·蛔R柚雏R耐l—曲Aria-Stokeslbmtsm]F知tm41蕾e红井新托克新控曼琦利教射反斯托鲫}垃曼荧光Real&te·h真失靛级VT咖蠢st■璋⋯⋯⋯虞能级vib删∞蛆stteI振动能较_{}M～l图5．1拉曼光谱能级示意图Fig．5．1EnergyleveldiagramofRamanspectroscopy线性判别分析(LinearDiscriminantAnalysis，LDA)，是在l996年由Belhumeur引入模式识别和人工智能领域的。该方法与其它矩阵线性回归不同，其基本思想是将高维的模式样本投影到最佳鉴别矢量空间，以达到抽取分类信息和压缩特征空间维数的效果，投影后保证模式样本在新的子空间有最大的类问距离和最小的类内距离191i，能够避免与方法有关的屏蔽问题。因此，将达到模式在该空间中有最佳的可分离性的目的。由于最小乘方推到LDA方向未对特征使用高斯假定，62 张欣硕士学位论文拉曼光谱定性判别蜂蜜掺假其方向实用性可以扩充到高斯数据之外的领域。该方法作为一种有效的特征抽取方法，可以使投影后模式样本的类间散布矩阵最大，并且同时类内散布矩阵最小。就是说，它能够模式在该空间中有最佳的可分离性，即保证投影后模式样本在新的空间中有最小的类内距离和最大的类间距离。在模式识别中，识别对象的基本特征会被当做波形或数字图像计算出来，这些特征的数量可能很大，处于一个高维空间中。通过映射的方法可以用低维空间来表示样本，这个过程就是特征提取。LDA是以样本的可分性为目标寻找一组线性变换【921，使得同一类的样本聚集在一起，这个方法适合于模式识别问题。传统LDA方法的缺点是没有足够多的训练样本就不能够保证类内离散度矩阵可逆。偏最dx--乘判别分析法在多元校正中应用广泛，是一种基于特征变最的回归方法。该方法不同于主成分分析，不同之处在于它即对矩阵x进行正交分解的同时，也将Y的影响考虑进去。基于以上分析，本文采用了中南大学化学化工学院改进的线性判别分析算法PLS．LDA，该算法在原始Fisher准则的基础上对样本类内离散度矩阵进行标量化处理，可以有效地解决上述小样本问题。5．2材料与方法s．2．1样品来源试验用共计100个真蜂蜜样本，分别来自山西、陕西、湖南、湖北、江西、广西、广东、宁夏、浙江、四川10个省。试验用样品在测定前先经过50℃水浴溶解其中的结晶，之后置于25℃室温下静置过夜后采集光谱。(所有样本由湖南省明园蜂业有限公司提供)。假蜂蜜样本通过实验室配制，配制方法如下表：s．2．2光谱采集方法采用i-Raman拉曼光谱仪(BWS415．785H，B&WTEKInc．USA)，配备了拉曼光纤探头，CCD检测器和功率为495mW波长为785nm激光发射器，发射波数为175．2600em～。仪器分辨率为3cm～，。 张欣硕士学位论文拉曼光谱定性判别蜂蜜掺假将约lOg样品加入到石英比色皿中，置于仪器配备的比色皿支架上。收集光谱时间为15s，选用光谱发射功率为总功率的60％。系统操作软件为BWSpecTM3．26。每个样本采集三条平行光谱。最后取三条光谱的平均光谱作为研究用光谱。5．3结果与讨论在本模型的建立中，没有采用微分求导等前处理方法，也没有采用基线扣除的处理方法，直接使用原始光谱进行校正模型的建立，仅采用KS法对校正集和验证集进行了筛选。图5．2真蜂蜜和掺假蜂蜜拉曼光谱对比Fig．5．2Ramanspectroscopyofauthenticandadulteratedhoney直接比较真蜂蜜和掺假蜂蜜，难以判定具体是哪个基团导致峰形发生了改变，同时也不能判断是基线漂移导致图谱的变化，还是环境因素不稳定或是噪声导致了谱线的不同。因此需要通过建立计量学模型来判定蜂蜜的真伪。中心化和自归一化是两种最常用的光谱数据处理方法，在蜂蜜的PLS．LDA拉曼光谱定性模型的建立中【93】，中心化处理的数据需要提取更多的主成分数，但是能够获得较低的错误率，因此决定建立模型前使用中心化方法处理。从错误率可以看出蔗糖掺假的错判率最低，其次是葡萄糖，蔗糖和葡萄糖混合掺假错判率稍高，验证了掺假越复杂，错判率越高的推测。伴随着掺加量的减少，错判率逐渐增高。但是在大于5％的范围内预测误差为0，已经可以满足常见的掺假检测，因此可以认为拉曼光谱满足实际检测的需求。 张欣硕士学位论文拉曼光谱定性判别蜂蜜掺假在定性判别的研究中，拉曼光谱建立的模型与近红外光谱模型相比，拉曼光谱不需要太多的光谱预处理即获得了精确可靠地预测模型，预测准确度和稳定性高于近红外光谱模型。在一定程度．}：可以得到结论：本研究中，拉曼光谱建立的模型更适用于蜂蜜的定性判别，拉曼光谱中出现的基线漂移没有对其定性判别产生明显的影响。这一点不同于在拉曼定量测定中则必须扣除基线，即便如此拉曼光谱模型预测结果也没有近红外光谱更精确。表5．2PLS—LDA模型参数及预测能力Table5．2PLS·LDAmodelparametersandpredictiveability除此之外，光谱采集同样方便，无需样品预处理。拉曼光谱可以满足常规环境中快速的鉴别。也可应用于生产中的产品品质监控和在线实时监测。在我们的研究中遇到了如下问题：一方面个别样品出现严重的基线漂移，尤其是颜色较深的枣花蜜，基线漂移远远超出拉曼光谱仪的检测限，不能够获得有效的样品光谱，图谱中仅有局部特征峰可以收集到，刁、=能够满足定量测定的需要，但是可以在一定程度上用于定性分类。另一方面，便携式拉曼光谱本身仪器受到环境影响较大，不同的环境温度下所获得的谱图仍存在一定程度上的微小差别。仪器开启后的预热时间也有影响。考虑到此冈素，在研究中都预先将仪器开启并预热30min。即便如此，还是要求平行测定并取平均光谱才能获得相对稳定的结果。65 张欣硕士学位论文结论6．1研究结论第六章结论首先近红外光谱技术应用于不同种类蜂蜜还原糖的检测中具有可行性，该技术可在短时间内快速检测蜂蜜还原糖含量，而且能达到满意的检测精度。同时，MSC、一阶导数、二阶导数、Norris导数平滑等数据预处理方法对利用近红外透反射无损定量检测蜂蜜还原糖起重要作用。并且经过处理的光谱所建立模型优于国外相似课题试验结果。本文使用近红外光谱技术对蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量检测进行了研究。结果表明，Kennard．Stone法是一种高效的划分校正集和验证集的算法。采用蒙特卡罗交互验证法，剔除了奇异值，果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖在奇异值剔除前模型预测值和相应实际值决定系数分别为0．945、0．927、0．901和O．610，在奇异值提出后其决定系数提高到0．971、0．940、0．949和0．750，蒙特卡罗交叉验证扣除奇异值的方法能够有效地改善了数据分布，提高了模型的准确性。小波变换算法处理后的光谱所建立的蜂蜜的PLS校正模型与小波变换前精确度无明显变化，但是建模用时间由3．65s减少到2．76s。不同的地理位置和不同的植物来源都会对光谱产生影响，因此本研究中试验模型中包含了来自多个省份的十几种蜂蜜样品，正是在这样的复杂条件下建立的模型才有更广的适用范围，试验模型中加入了掺假样品也是为了使模型更好地适应实际检测中的需要。通过上述几种化学计量学方法，得到的蜂蜜中四种糖的近红外光谱模型准确、可靠。本文方法为蜂蜜快速检测和在线实时质量控制提供了可行性分析和操作依据。本研究进一步研究了近红外光谱技术在蜂蜜其他指标成分含量检测的应用，寻找利于建模的敏感波段，扩充蜂蜜的样本数量，并且进一步优化建模方法。在真假蜂蜜定性判别中，BP神经网络最好能够达到90％的预测正确率，但是BP神经网络稳定性很差，同一组数据重复建模获得结果有很大差异。改用RBF神经网络时，选取迭代次数为47，设置MSE值为O．05，所建立网络的验证集错误率和测试集错误率均小于BP神经网络的错误率，测试集错误率为零，同时，RBF神经网络建立的模型重复性好，通过多次重复，获得结果相同。综上所述，近红外光谱技术满足蜂蜜检测质量控制需求，是适合蜂蜜还原糖以及果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的含量检测和质量控制的高效检测技术 张欣硕：l：学位论文结论拉曼光谱对蜂蜜的定量测定采用airPLS法能够有效地扣除基线漂移，通过针对基于拉曼光谱技术对蜂蜜的果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量检测的研究，得出了这四种糖的最佳测量模式。同时采用airPLS结合libsvm进行建模，所得结果明显优于原光谱建模结果。CARS方法筛选变量能够明显提高模型的稳定性和准确性，结果由于全谱建模的预测能力，因此，CARS同样适用于拉曼光谱的变量筛选。Libsvm方法建立的校J下模型优于PLS建立的校正模型。在libsvm的参数选取过程中，网格搜寻法获得结果最稳定，应用该参数建立的校正模型预测能力最好，而粒子群算法的不稳定性以及遗传算法陷入了局部最优，这两种方法不适用于本研究中的参数选择。在对掺假蜂蜜的定性判别中，不在要求对光谱进行基线扣除即可获得理想的判定正确率。首先用中心化方法处理光谱，之后建立PLS．LDA校正模型。蔗糖掺假、葡萄糖掺假和蔗糖葡萄糖混合掺假模型的交互验证错判率，均低予O．04，预测集判断正确率为100％。掺加量越小，掺假方法越复杂错判率越高。拉曼光谱技术可以快速分析蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量，对于蔗糖和麦芽糖的研究有待进一步通过仪器的改造和化学计量学方法的开发，实现其实际检测应．用。6．2近红外光谱和拉曼光谱在蜂蜜检测应用中的比较在本研究中拉曼光谱和近红外光谱对蜂蜜检测有许多相同点，它们的光谱提取方法简单，速度快，又有很好的可重复性，最重要的是无需样品前处理，能够完成无损伤的定性定量分析。在试验中已经实践了使用光纤采集样本光谱，过程中对光谱信息无损失，为日后实现实时在线远程检测奠定了基础。从检测原理来看，近红外光谱检测直接用红外光检测处于近红外区的分子振动以及转动时产生的能量。当一束近红外光透过样品时，通过检测样品对红外光的吸收情况来获取样品信息。而拉曼光谱检测使用的是可见激光，它是一种间接的方法，能够将红外区的信息变到可见光区，通过差频的方法来检测。可见光区是电子跃迁的能量区，拉曼光谱会因为电子跃迁产生的光受到干扰。但是可以通过使用不同的激光发射器避免这一现象的发生。虽然近红外光谱和拉曼光谱都是用来检测分子的振动和转动能级的，但是两者理论基础和检测方法完全不同。这些区别表现在，近红外光谱对周围环境温度变化敏感，对样本本身温度稳定也有较高要求。因此在试验中一直用空调恒温以保证试验进程不受温度影响。而在拉曼光谱的检测中样品暴露在常规检测环境中容易出现基线漂移，在试验过程中则力求样本处在无自然光环境中。拉曼光谱谱峰清晰尖锐，有利于在之后的研究中通过积累实现数据库搜索，67 张欣硕士学位论文结论并通过差异分析进行定性比较。在数据分析中相对于近红外光谱也更容易找到样本光谱中差异较大的谱段，方便了校正模型建立中变量的选取。拉曼光谱与近红外光谱相同的特点是：它通常灵敏度也比较低，但是在本研究中通过计量学方法的应用，两者获得的结果已经能够满足常规的商业检测和在线质量控制。由于在本研究中使用了便携式拉曼光谱仪，最终建立模型的预测结果，拉曼光谱还不能达到近红外光谱获得的高精确度的结果。总之，近红外光谱和拉曼光谱是重要的光谱分析手段，既有相同的优缺点，在某些方面又可以互相补充，能够应用于蜂蜜的定性和定量检测。6．3’创新点(1)试验样本包括分别来自湖南、广西、广东、山西、陕西、宁夏、湖北、江西、浙江、四川10个省市，荆条蜜、柑橘蜜、桂圆蜜、黄芪蜜、枣花蜜、野菊花蜜、洋槐蜜、荔枝蜜、益母草蜜、枸杞蜜、九龙藤蜜、山桂花蜜、油菜蜜、老瓜头蜜、苹果蜜、紫云英蜜和雪脂莲蜜共计17个品种。应用近红外光谱和拉曼光谱结合化学计量学方法建立了种类和地域范围广泛的模型，并比较了不同方法对模型的影响。(2)在近红外光谱模型的建立中，进一步探讨了各种光谱预处理方法对模型的影响。采用蒙特卡罗交互验证方法判定校正集样本中的奇异值，并将其扣除。采用小波变换方法选取变量以提高模型稳定性，减少模型建立和运行时间。(3)采用拉曼光谱对蜂蜜进行果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的定量分析。建立了蜂蜜的拉曼光谱定量测定模型。将airPLS方法应用到蜂蜜的拉曼光谱的基线扣除中，减少基线漂移对光谱模型的影响。采用CARS方法对蜂蜜光谱变量进行筛选。(4)分析了拉曼光谱定性鉴别蜂蜜掺假可行性，建立了蜂蜜的拉曼光谱定性判别模型。6．4研究中存在问题和建议近红外光谱在分析蜂蜜中羟甲基糠醛和总氮时，结果不能尽如人意。究其主要原冈还是近红外光谱不能适用于微量成分分析。加之水分对红外光吸收明显，在一定程度上也会影响到其它物质的检测。最终拉曼光谱的预测结果仍然没有近红外光谱的预测结果准确。可能存在以下问题：6R 张欣硕：l：学位论文结论试验中所用样品分别取样于跨度时间长，样品的长时间保存中产生一些发色团可能正是对拉曼光谱检测造成严重影响的荧光物质。这些荧光的产生掩盖了部分判定的信息。与此同时，由于试验样本较多，部分掺假样品需要配制，因此收集样本光谱花费时间较长。时空差异必然对拉曼光谱的稳定性产生影响。试验中采用的是便携式拉曼光谱仪，本身的分辨率和信噪比不够高，太多的仪器噪声掩盖了有用的光谱信息，从而导致预测的精确度不够高，在一定程度上能够反映将来用便携式设备可能遇到的问题。进一步的研究可以采用较高分辨率的拉曼光谱仪进行尝试。同时作为便携式拉曼光谱，本身仪器受到环境影响较大，不同的环境温度下所获得的谱图仍存在一定程度上的微小差别。仪器开启后的预热时间也有影响。考虑到此因素，在研究中都预先将仪器开启并预热30min。即便如此，还是要求平行测定并取平均光谱才能获得相对稳定的结果。值得注意的是高分辨率的拉曼光谱仪所用发射波长不同，在其所用波长下会对荧光物质更为敏感，由此造成的基线漂移同样会严重影响光谱信息的收集。今后的研究中不妨采用加入金属溶胶等表面增强的拉曼光谱方法提高信噪比。傅里叶变换．表面增强拉曼光谱，是当前研究的降低荧光影响的途径之一。除了样品处理和仪器增强的方法，在化学计量学研究中，通过不同统计学方法的处理，扣除背景也是一个研究方向。在本研究进行中个别样品出现严重的基线漂移，尤其是颜色较深的枣花蜜，基线漂移至远远超出拉曼光谱仪的检测限，不能够获得有效的样品光谱，图谱中仅有局部特征峰可以收集到，不能够满足定量测定的需要，但是可以在一定程度上用于定性分类。 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张欣硕．1：学位论文致谢毕业论文暂告收尾，这也意味着我在中南大学的三年研究生学习生活既将结束。回首既往，自己一生最宝贵的时光能在众多学富五车、才华横溢的老师们的熏陶下度过，实是荣幸之极。在这这几年的时间里，我在学习上和思想上都受益非浅。这除了自身努力外，与各位老师、同学和朋友的关心、支持和鼓励是分不开的。衷心感谢尊敬的导师单杨教授j年来的悉心培养和精心指导。老师开阔的视野和敏锐的思路引导了我的求学之路。老师渊博的知识、严谨的态度、精益求精的作风、诲人不倦的师德和朴实无华平易近人的人格魅力将对我影响深远。老师敦促我树立了远大的学术目标的同时更使我明白了许多接人待物和为人处世的道理。老师在工作学习上和生活中对我的关心和照顾使我感受到恩师的良苦用心和深情厚望。感谢中南林业科技大学李水芳老师在我的论文试验研究期问给予的指导和帮助，尤其是李老师矢志不移、勇于进取的精神不停的鼓舞着我，我们一起在紧张疲惫的试验中一直坚持到最后。感谢湖南省农产品加工研究所的李高阳老师、张菊华老师、张群老师、付复华老师、苏东林师兄、刘伟师兄、朱向荣师兄、吕慧英师姐及其他同事等在我试验研究和论文写作期间给予的指导和帮助。感谢化学化工学院范伟师兄在化学计量学专业领域的指导。正是各位老师和师兄师姐的热心指导使我受益匪浅!感谢隆平分院各位老师在我研究生学习期间的谆谆教诲，你们的工作使我在辛苦的求学路上时刻感受到温暖与关爱。最后感谢父母在我迷茫的时候给予的鼓励和支持，他们的任劳任怨和无私奉献时刻鞭策我珍惜美好的时光，他们是我战胜一切困难的精神支柱和前进动力!张欣2011年4月 张欣硕．L学位论文攻读学位期问的卡要研究成果攻读学位期间主要的研究成果已发表学术论文：1．张欣，单杨．基于多元散射校正和偏最小二乘(MSC／PLS)的傅里叶变换近红外光谱检测蜂蜜中还原糖．食品与机械：2009，25(06)．2．张欣，单杨．国外近红外光谱分析技术在食品安全问题中的应用．食品工业科技：2010，31(09)．3．李水芳，张欣．近红外光谱检测蜂蜜中可溶性固形物含量和水分含量．光谱学与光谱分析：2010，30(09)．