蜜柚泛素蛋白连接酶RINGH2finger基因的克隆与表达分析 10页

园艺学报2014，41（8）：1689–1698http://www.ahs.ac.cnActaHorticulturaeSinicaE-mail:yuanyixuebao@126.com蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2finger基因的克隆与表达分析*金晓琴，康振，刘伟娜，潘永娟，王梨嬛，郭卫东，杨莉（浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004）摘要：在26S泛素蛋白酶体途径介导的蛋白质降解过程中，RINGfinger蛋白是一类特殊的泛素蛋白连接酶，参与植物多个生长发育及逆境胁迫响应过程。为探明柚RINGfinger家族成员的序列特征及表达模式，从红肉蜜柚和琯溪蜜柚果实汁胞中分离出两个RINGfinger基因cDNA片段（CgRHF1和CgRHF2），采用实时荧光定量PCR研究其在不同组织及果实发育不同时期的表达模式。结果表明，两个基因均属于RING-H2finger家族成员，且红肉蜜柚与琯溪蜜柚的两个CgRHF之间碱基序列均无差异；除根组织外，CgRHF1表达水平较CgRHF2高，且在红肉蜜柚茎、叶和花中的表达水平显著高于琯溪蜜柚；CgRHF2在组织及果实发育过程表达水平均较低，但在果实成熟采摘阶段急剧上升。CgRHF1与CgRHF2表达模式的差异暗示这两个基因在柚组织及果实发育进程中行使不同的生物学功能，而非功能互补基因。关键词：红肉蜜柚；琯溪蜜柚；RING-H2finger基因；克隆；基因表达中图分类号：S666文献标志码：A文章编号：0513-353X（2014）08-1689-10IsolationandExpressionAnalysisofTwoUbiquitin-proteinLigaseRING-H2FingerGenesfromPommelos[Citrusgrandis（L.）Osbeck]*JINXiao-qin，KANGZhen，LIUWei-na，PANYong-juan，WANGLi-huan，GUOWei-dong，andYANGLi（CollegeofChemistryandLifeScience，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua，Zhejiang321004，China）Abstract：RING（RealInterestingNewGene）fingerproteinsspecifythesubstratesinthe26Subiquitin-proteasomepathway，andplayimportantrolesinplantdevelopmentandstressresponses.However，thesequences，expressioncharacteristicsandphysiologicalfunctionsofRINGfingergenesinpommeloarelittleknown.Inthisstudy，twoRINGfinger（CgRHF1andCgRHF2）cDNAfragmentswereisolatedfromRed-fleshedandGuanxipommelo.TheresultsshowedthattwoCgRHFswerebelongedtoRING-H2fingersubfamilies，andthereisnoDNAbasedifferenceinthesequencesoftwocultivars.Quantitativereal-timePCRresultsshowedthatgeneexpressionofCgRHF1issignificantlyhigherthanCgRHF2，especiallyinthestems，leavesandflowersofred-fleshedpommelo.TheexpressionlevelsofCgRHF2wererelativelylowinthetissuesandfruitdevelopmentoftwopommelocultivars，butdramaticallyincreasedatthefruitmaturestage.ThisstudyhasimpliedthatCgRHF1andCgRHF2mayplaydifferentrolesinthetissuesandfruitdevelopmentofRed-fleshedandGuanxipommelo，andcannotfunctionallycomplement.收稿日期：2014–03–04；修回日期：2014–07–22基金项目：国家自然科学基金项目（30900978）；浙江省自然科学基金项目（LY14C150001）*通信作者Authorforcorrespondence（E-mail：yangli@zjnu.cn） 1690园艺学报41卷Keywords：red-fleshedpommelo；Guanxipommelo；RING-H2fingergene；clone；geneexpression26S泛素蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasomepathway）是已知真核生物中主要的蛋白质降解途径，通过调节功能蛋白周转和降解异常蛋白，实现对多种代谢过程的调节，在细胞周期、信号转导、细胞分裂与分化、胁迫反应和细胞程序性死亡等细胞生理活动中起重要作用（Frescas&Pagano，2008；Bedfordetal.，2009；Hochstrasser，2009；Navon&Ciechanover，2009）。泛素蛋白酶体途径的具体过程是：由ATP提供能量，泛素激活酶（ubiquitin-activatingenzymes，E1）激活泛素，并将泛素转移至泛素结合酶（ubiquitin-conjugatingenzymes，E2）的活性位点半胱氨酸（Cys），形成E2–泛素复合物；泛素蛋白连接酶（ubiquitin-proteinligases，E3）能识别靶蛋白，将E2和靶蛋白在空间上拉近，促进E2将泛素转移至靶蛋白，或是E2将泛素转移至E3，由E3转移泛素至靶蛋白。当靶蛋白泛素化水平达到一定程度后，转运至26S蛋白酶体进行降解（Moonetal.，2004；Lietal.，2011；Wang&Deng，2011）。26S泛素蛋白酶体途径是目前已知的具有高度选择性的蛋白质降解途径，是生命过程进行精确时空调控的重要方式（Hochstrasser，2009），拟南芥中约有5%的蛋白质参与该途径（Stoneetal.，2005）。26S蛋白酶体主要存在于细胞质与细胞核，识别泛素化的蛋白并将其降解是一非特异性的过程。因此E3连接酶在此过程中发挥了至关重要的作用，决定反应的特异性。在泛素介导的选择性蛋白降解途径中，E3连接酶是识别靶蛋白N端不稳定氨基酸信号的关键酶（宋素胜和谢道昕，2006；Budhidarmoetal.，2012）。目前发现的E3连接酶主要有HECT（homologoustoE6-APcarboxyterminus）结构域家族、RING（RealInterestingNewGene）finger结构域家族和U-box（Ubiquitinchainelongationfactor）结构域家族3大类。其中RING结构域家族是一个庞大的蛋白家族，其环指结构域（RINGfingerdomain）是RINGfinger类蛋白具有E3连接酶功能的重要结构。标准的RINGfinger蛋白包含1个2+至多个特定位置的Cys和组氨酸（His）残基组成的锌指结构域，由两个Zn和相应的氨基酸残基形成“cross-brace”结构，将E2和靶蛋白拉近，从而使E2–泛素复合物上的泛素高效地转移至靶2+蛋白（Leckeretal.，2006；Metzgeretal.，2012）。根据Zn结合残基Cys和His的数量与位置不同，RINGfinger家族又可分为RING-HC、RING-H2、RING-v、RING-C2、RING-D、RING-S/T、RING-G、RING-mH2和RING-mHC9大亚类（Lietal.，2011）。现有研究表明，RINGfinger蛋白家族成员独立或以多亚基复合体的形式在光形态建成、激素反应、生理节奏、胁迫反应、种子粘液、木质化以及花的发育等过程中起到十分重要的作用（Osterlundetal.，2000；Maetal.，2002；Molnaretal.，2002；Xu&Li，2003；Guo&Ecker，2004；Moonetal.，2004；Seoetal.，2004；Kepinski&Leyser，2005；Serranoetal.，2006；刘辉志和韩世平，2010；李彦泽，2011；Wang&Deng，2011）。Welsch等（2007）发现包含RINGfinger结构域的SINAT2（SEVENinABSENTIAofArabidopsis2），可能与转录因子AtRAP2.2共同调控拟南芥类胡萝卜素含量，是否存在其他E3连接酶参与调控植物类胡萝卜素的生物合成与代谢尚不清楚。此外，本实验室前期基因芯片分析发现一个RING-H2finger基因在琯溪蜜柚及其突变体红肉蜜柚中的表达具有较大差异。作者从两种蜜柚中分别分离出两个RING-H2finger基因，研究其在不同组织及果实不同发育时期的表达规律，为进一步研究该基因在特异靶蛋白选择性降解过程中的作用，以及红肉蜜柚果实变异的分子机制提供基础。1材料与方法1.1试验材料供试材料为福建省平和县小溪镇锦盛公司育种基地的10年生琯溪蜜柚及其红肉早熟突变体红 8期金晓琴等：蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2finger基因的克隆与表达分析1691肉蜜柚。于2012年4月采集幼嫩的须根，春梢（茎），完全伸展的叶片，盛花期的全花，以及盛花期后75、105、135、165和195d的果实汁胞，样品用液氮速冻后于–80℃贮存备用。试验所使用的实时荧光定量PCR（quantitivereal-timePCR，qPCR）仪为AppliedBiosystem公TM司StepOnePlusPCR仪，FastStartUniversalSYBRGreenMaster购自Roche有限公司，qPCR8连TM管和管盖购自杭州宝诚生物技术有限公司，RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit购自Fermentas公司，NEB（NewEnglandBiolabs）PhusionDNA聚合酶购自上海基因科技有限公司，限制性内切酶、pMD18-T载体、DNaseⅠ、T4DNA连接酶、DNAmarker等购自宝生物工程（大连）有限公司，引物（表1）由上海英骏生物技术有限公司合成。1.2总RNA的提取及cDNA合成参照徐昌杰等（2004）建立的改良Bugos法提取样品总RNA，DNaseⅠ去除残留的基因组DNA。提取出的总RNA经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测质量与浓度后，取1.5μg参照使用说明合成cDNA一链和二链，保存于–20℃备用。1.3CgRHF1与CgRHF2的分离根据NCBI数据库RINGfinger基因序列（CK936064.1与CX668248.1）为探针，通过HarvEST：Citrus软件（http：//harvest.ucr.edu/）相应的柑橘ESTs，拼接成两条一致性的RING-H2finger序列。根据获取序列分别设计引物，以柚DAF105d果实汁胞cDNA二链为模板，采用PhusionDNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系为：cDNA二链0.5μL（稀释10倍），1×PCRbuffer，0.4μL上游-1和下游引物，0.6μLdNTPs（2.5mmol·L），1UTaqDNA聚合酶，添加ddH2O至总体积20μL。PCR反应程序为：98℃预变性30s；98℃变性8s，60℃退火40s，72℃延伸50s，35次循环；最后72℃延伸10min。PCR产物加A后经回收、纯化，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞TG1，蓝白斑筛选、菌落PCR、质粒提取及酶切验证均参照《分子克隆实验指南》（萨姆布鲁克和拉塞尔，2002）方法操作。阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序验证。1.4CgRHF1与CgRHF2的生物信息学分析利用NCBI网站中的BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行两条CgRHFs序列同源性比对；BioXM2.6软件推导其氨基酸序列；在线软件ProtParam（http：//www.expasy.org）预测编码蛋白的分子量和理论等电点；TMHMM2.0在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析跨膜结构域；DNAman和MEGA4.0软件构建氨基酸序列进化树；STRING9.1在线软件（http：//string-db.org/）预测可能的互作蛋白；YLoc在线软件（http：//abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/YLoc/webloc.cgi）预测亚细胞定位。1.5CgRHF1与CgRHF2在琯溪蜜柚与红肉蜜柚果实发育进程中的表达分析根据CgRHFcDNAs测序序列设计qPCR引物（表1），以柚β-tubulin为内参研究CgRHF1与CgRHF2基因在红肉蜜柚与琯溪蜜柚不同组织及果实不同发育时期的表达。qRT-PCR反应体系中分-1-1别加入2×SYBRGreen10μL，10μmol·Lforwardprimer0.4μL，10μmol·Lreverseprimer0.4μL，50×ROXReferenceDyeⅡ0.4μL，cDNA一链1μL（稀释10倍），ddH2O补足总反应体系至20μL。每个样品重复3~6次，共3个生物学重复。qRT-PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性3s，退火及延伸45s，40次循环。反应结束后进行熔解曲线分析及琼脂糖凝胶电泳鉴定产物特异性。采-ΔΔCT用2法分析qRT-PCR数据，应用Origin7.0软件对数据作图。 1692园艺学报41卷表1引物序列Table1PCRprimersusedinthisstudy靶基因引物序列引物用途预期扩增长度/bpTargetgeneSequence（5′–3′）CommentPredictedlengthCgRHF1Forwardprimer：TGGGCCTCGCTAGTATGCCGTCCG基因分离477Reverseprimer：AAAACACTCTCACCAGAAACAAGAGeneisolationCgRHF1Forwardprimer：GTGAAGATGCAGAGCATGACTGTT基因表达114Reverseprimer：CCACTTCTCCAAGCACACTTTATGeneexpressionCgRHF2Forwardprimer：ATGTGGGGTTCAGGTATGA基因分离573Reverseprimer：CTAATTTCCAGGAACAGAGTGeneisolationCgRHF2Forwardprimer：CTGTTTGTCGGTTACCATTACAAG基因表达128Reverseprimer：GAAGTCTCAGGACTATCAACAGCGeneexpressionβ-tubulinForwardprimer：TTTTCCGTCTTCCCGTCTCCTA内参基因106Reverseprimer：CACCATACATTCATCGGCATTReferencegene2结果与分析2.1柚CgRHF1与CgRHF2cDNAs的分离及序列分析提取的红肉蜜柚与琯溪蜜柚果实汁胞与组织中总RNA条带清晰完整，无蛋白质、多糖、盐或其他杂质的污染（图1）。图1红肉蜜柚与琯溪蜜柚果实不同发育时期汁胞及组织总RNA75、105、135、165和195为花后天数。R：根；S：茎；L：叶：F：花。Fig.1TotalRNAextractedfromjuicesacsofRed-fleshedpommeloandGuanxipommelothroughoutfruitdevelopmentanddifferenttissues75，105，135，165and195showdaysafterflowering.R：Root；S：Stem；L：Leaf；F：Flower.采用生物信息学与同源克隆法，分别从红肉蜜柚和琯溪蜜柚盛花后105d果实汁胞cDNA中分离出长约500bp与600bp的条带，回收目的片段，连接T载体并转化至大肠杆菌TG1，筛选阳性克隆，送上海英骏生物有限公司测序，分别命名为CgRHF1（474bp，编码蛋白含157aa，理论分子量约17.7kD，pI4.49）和CgRHF2（573bp，编码190aa，理论分子量约21.2kD，pI7.10）；两个基因编码氨基酸序列C端均包含Cys-X2-Cys-X14（X15）-Cys-X1-His-X2-His-X2-Cys-X11（X10）-Cys-X2-Cys（X为除Cys与His之外的任意氨基酸），保守基序为C3H2C3型RING-H2finger蛋白家族成员（图2）。此外，琯溪蜜柚的CgRHF1与红肉蜜柚的CgRHF1，琯溪蜜柚的CgRHF2与红肉蜜柚的CgRHF2cDNA片段完全一致，无碱基差异。CgRHF1cDNA片段与枳RING-H2finger基因PII-C02（Poncirustrifoliata，GenBankNo.DQ158860.1）相似度达99%，相邻连接法绘制进化树（图3）结果显示CgRHF1推导的氨基酸序列与枳（ABA42952.1）的亲缘关系最近；蛋白N端第9~32位氨基酸是可能的跨膜螺旋结构，YLoc软件预测该蛋白定位于叶绿体；STRING软件以拟南芥AtXERICO（GenBankNo.NP_178507.1，与CgRHF1有56%相似性）为模板分析表明CgRHF1可能与ASK1-interactingF-boxprotein（TLP9）、UBC8（泛素结合酶8）、RGL2（RGA-Like2，编码DELLA蛋白）、At2g31470（F-box家族蛋白）等互作（图4）。CgRHF2cDNA片段与草莓、蓖麻、黄瓜等 8期金晓琴等：蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2finger基因的克隆与表达分析1693RING-H2finger蛋白相似度相对较高（图5，图6）；蛋白N端第3~23位氨基酸是可能的跨膜结构域；YLoc软件预测该蛋白是一分泌蛋白，定位于质膜；STRING软件未获取可能与之互作的蛋白。图2CgRHF1编码的氨基酸序列同源性比对Fig.2DeducedaminoacidsequencescomparisonofCgRHF1withotherhomologoussequencesAtRHF-XERICO：ArabidopsisthalianaNP_178507.1；BdRFP：BrachypodiumdistachyonXP_003572327.1；BnRHF：BrassicanapusAEQ19306.1；CgRHF1：CitrusgrandisKF310530；CtRHF：CitrustrifoliataABA42952.1；EhRHF：EutremahalophilumAAM19707.1；HbC3H4-typeRZF：HeveabrasiliensisAAP46154.1；MtRHF/ATL4K：MedicagotruncatulaXP_003601512.1；RcRHF/ATL3J：RicinuscommunisXP_002533895.1；SlRHF/ATL10-like：SolanumlycopersicumXP_004251547.1；SnRHF：SolanumnigrumADW66146.1；ZmTPA：ZeamaysDAA40340.1.图3CgRHF1编码的氨基酸序列系统进化树分枝上的数值为1000次建树中该位置出现的置信度值。Fig.3PhylogeneticanalysisofdeducedaminoacidsequencesofCgRHF1withotherbranchhomologoussequencesBootstrappingwasdonebyresamplingfromthedata1000times. 1694园艺学报41卷图4AtXERICO（CgRHF1同源蛋白）互作蛋白预测红色直线表示蛋白间经酵母双杂交验证互作。Fig.4InteractiveproteinspredictionofAtXERICO（homologueofCgRHF1）Redlinesrepresentprotein-proteininteractionsidentifiedbyyeasttwo-hybridassays.图5CgRHF2编码的氨基酸序列同源性比对Fig.5DeducedaminoacidsequencescomparisonofCgRHF2withotherhomologoussequencesAt4g33565：ArabidopsisthalianaABF19017.1；BdRHF/ATL80-like：BrachypodiumdistachyonXP_003580356.1；CgRHF2：CitrusgrandisKF322036；CsRHF/ATL54-like：CucumissativusXP_004145049.1；FvRHF/ATL16-like：Fragariavescasubsp.vescaXP_004306846.1；GmRHF/ATL51-like：GlycinemaxXP_003552363.1；MtRHF：MedicagotruncatulaXP_003623843；OsRHF：OryzasativaAAX92760.1；RcRHF：RicinuscommunisXP_002511792.1；SlRHF/ATL16-like：SolanumlycopersicumXP_004229851.1；TuRHF/ATL28：TriticumurartuEMS54905.1；VvRHF/ATL7：VitisviniferaXP_002270058.1；ZmRHF/ATL2M：ZeamaysNP_001148220.1. 8期金晓琴等：蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2finger基因的克隆与表达分析1695图6CgRHF2编码的氨基酸序列系统进化树分枝上的数值为1000次建树中该位置出现的置信度值。Fig.6PhylogeneticanalysisofdeducedaminoacidsequencesofCgRHF2withotherbranchhomologoussequencesBootstrappingwasdonebyresamplingfromthedata1000times.2.2CgRHF1与CgRHF2的表达模式应用qRT-PCR法检测琯溪蜜柚和红肉蜜柚的CgRHF1与CgRHF2在根、茎、叶和花4个组织以及盛花期后果实5个不同发育时期果实汁胞中的表达水平。如图7所示，CgRHF1在红肉蜜柚茎、叶和花中的表达显著高于琯溪蜜柚，其中在茎的表达量最大；CgRHF2在根和茎中的表达红肉蜜柚与琯溪蜜柚间无差异，在红肉蜜柚叶中的表达低于琯溪蜜柚，在花中却高于琯溪蜜柚。图7柚不同组织CgRHF1与CgRHF2的相对表达量Fig.7ExpressionanalysisofCgRHF1andCgRHF2indifferentorgansoftwopommelospecies**P<0.01.除花后135d之外，CgRHF1在红肉蜜柚果实汁胞中的表达水平均高于琯溪蜜柚，且在果实发育过程中呈逐渐上升趋势。CgRHF2在整个果实发育进程中表达丰度相对较低，基本呈上升趋势，但在成熟采摘阶段（花后195d）表达急剧提高，且琯溪蜜柚表达显著高于红肉蜜柚（图8）。 1696园艺学报41卷图8柚果实发育不同时期CgRHF1与CgRHF2的相对表达量Fig.8ExpressionanalysisofCgRHF1andCgRHF2infruitdevelopmentoftwopommelospecies**P<0.01.3讨论蛋白质是细胞内最重要的生物大分子之一，主要通过降解来调节主要代谢物的数量，清除错误折叠的蛋白质。植物体内的蛋白质大约每4~7d更新50%，大多半衰期较短的蛋白质及异常蛋白质的降解是由泛素蛋白酶体途径完成的（Vierstra，1996）。由于蛋白酶体识别泛素化的蛋白并将其降解是一个非特异性的进程，因此E3在泛素蛋白酶体途径中十分重要，是决定泛素依赖的蛋白质降解特异性的关键因子。每一种E3都携带识别底物特异性的信息，只特异地识别一种或一类底物，因此26S泛素蛋白酶体途径中E3的种类与数量均较E1、E2多（杜国华等，2010）。RINGfinger是目前E3中最为庞大的家族，人体中RINGfinger类蛋白超过600种（Lietal.，2008），拟南芥、水稻和苹果中分别有469、488和688个可能的RINGfinger（Stoneetal.，2005；Limetal.，2010；Lietal.，2011），与柚亲缘关系较近的克里曼丁橘和甜橙基因组中RING-H2finger成员分别有214与250个（Guzmán，2014）。目前动物中RINGfinger基因或蛋白相关生物学功能研究较多，在植物中的研究则刚刚起步。本试验中以琯溪蜜柚及其红肉早熟突变体红肉蜜柚为材料，分离得到两个RING基因，均属于典型的RING-H2finger家族成员。琯溪蜜柚与红肉蜜柚CgRHF1、CgRHF2序列完全一致，无碱基差异，暗示这两个CgRHF并非红肉蜜柚果实成熟期提早及果肉颜色变异的关键调控基因，但变异性状对两个基因的转录存在较大影响。在枳幼苗中，与CgRHF1基因高度同源的PII-C02基因响应冷胁迫和干旱胁迫，而在柚幼苗中该基因只对干旱胁迫敏感（Sahin-Cevik&Moore，2006）。CgRHF1基因同源性较高的拟南芥AtXERICO能够与E2酶，以及脱落酸信号转导途径中AtTLP9等具有互作关系，通过降解DELLA蛋白，增加胞内脱落酸水平，提高植株对干旱的耐受性（Koetal.，2006）。玉米ZmXERICO的表达也受赤霉素和光的调控（Gaoetal.，2012）。本试验中发现除根与处于发育早期的果实（果实中无明显的红色色素积累）外，红肉蜜柚各器官中CgRHF1表达丰度均高于琯溪蜜柚，但是否意味着该基因与红肉蜜柚早熟及果实色泽变异性状有关仍需进一步的试验证据。目前尚无CgRHF2同源基因相关生物学功能的报道，但分析其序列发现该基因隶属于ATLs亚家族（Serranoetal.，2006）。现有研究表明ATLs家族成员在调控防御反应，营养阶段向生殖阶段转变的C/N比值，根与胚乳发育进程中的细胞凋亡，以及短日照条件下的开花进程中均起到重要的调控作用（Guzmán，2012）。本试验中发现CgRHF2基因在组织中转录水平相对较低，在果实成熟采摘阶段表达丰度迅速上升，推测该基因可能与果实成熟相关。CgRHF1与CgRHF2表达模式的差异暗 8期金晓琴等：蜜柚泛素蛋白连接酶RING-H2finger基因的克隆与表达分析1697示这两个基因在柚组织及果实发育进程中行使不同的生物学功能，并非功能互补基因。最近，刘顺枝等（2013）以红肉蜜柚与琯溪蜜柚成熟果肉为材料，采用抑制差减杂交技术分离出44个差异表达的Unigenes，涉及信号转导、蛋白质合成、应激反应、转运等多条代谢途经，表明红肉蜜柚早熟及果实色泽变异性状受到复杂的调控网络控制。包括CgRHFs在内的相关基因在柚生长发育过程中的生物学功能仍有待于进一步深入研究。ReferencesBedfordL，PaineS，RezvaniN，MeeM，LoweJ，MayerRJ.2009.TheUPSandautophagyinchronicneurodegenerativedisease：Sixofoneandhalfadozenoftheother-ornot?Autophagy，5(2)：224﹣227.BudhidarmoR，NakataniY，DayCL.2012.RINGsholdthekeytoubiquitintransfer.TrendsinBiochemicalSciences，37(2)：58﹣65.DuGuo-hua，ZhangLi-jun，FanJin-juan，RuanYan-ye，LiuChun，XuHong-mei.2010.Proteinspecificdegradationsystemsinhigherplants.MolecularPlantBreeding，8(3)：567﹣576.(inChinese)杜国华，张立军，樊金娟，阮燕晔，刘淳，许红梅.2010.高等植物蛋白质的特异性降解系统.分子植物育种，8(3)：567﹣576.FrescasD，PaganoM.2008.DeregulatedproteolysisbytheF-boxproteinsSKP2andbeta-TrCP：Tippingthescalesofcancer.NatureReviewsCancer，8(6)：438﹣449.GaoY，LiH，DengDX，ChenSQ，JiangW，ChenJM.2012.CharacterizationandexpressionanalysisofthemaizeRING-H2fingerproteingeneZmXERICOresponsivetoplanthormonesandabioticstresses.ActaPhysiologiaePlantarum，34(4)：1529﹣1535.GuoHW，EckerJR.2004.Theethylenesignalingpathway：Newinsights.CurrentOpinioninPlantBiology，7(1)：40﹣49.GuzmánP.2012.TheprolificATLfamilyofRING-H2ubiquitinligases.PlantSignaling&Behavior，7(8)：1014﹣1021.GuzmánP.2014.ATLsandBTLs，plant-specificandgeneraleukaryoticstructurally-relatedE3ubiquitinligases.PlantScience，(215﹣216)：69﹣75.HochstrasserM.2009.Introductiontointracellularproteindegradation.ChemicalReviews，109(4)：1479﹣1480.KepinskiS，LeyserO.2005.TheArabidopsisF-boxproteinTIR1isanauxinreceptor.Nature，435(7041)：446﹣451.KoJH，YangSH，HanKH.2006.UpregulationofanArabidopsisRING-H2gene，XERICO，confersdroughttolerancethroughincreasedabscisicacidbiosynthesis.ThePlantJournal，47(3)：343﹣355.LeckerSH，GoldbergAL，MitchWE.2006.Proteindegradationbytheubiquitin-proteasomepathwayinnormalanddiseasestates.JournaloftheAmericanSocietyofNephrology：JASN，17(7)：1807﹣1819.LiW，BengtsonMH，UlbrichA，MatsudaA，ReddyVA，OrthA，ChandaSK，BatalovS，JoazeiroCAP.2008.Genome-wideandfunctionalannotationofhumanE3ubiquitinligasesidentifiesMULAN，amitochondrialE3thatregulatestheorganelle’sdynamicsandsignaling.PLoSONE，3(1)：e1487.LiYZ，WuBJ，YuYL，YangGD，WuCG，ZhengCC.2011.Genome-wideanalysisoftheRINGfingergenefamilyinapple.MolecularGeneticsandGenomics，286(1)：81﹣94.LiYan-ze.2011.FunctionalchareacterizationofF-box-containinggeneAtPP2-B11andgenome-wideanalysisoftheRINGfingerproteinsinapple[Ph.D.Dissertation].Tai’an：ShangdongAgriculturalUniversity.(inChinese)李彦泽.2011.拟南芥F-box基因AtPP2-B11的功能分析及苹果RINGfinger型泛素连接酶E3的家族分析[博士论文].泰安：山东农业大学.LimSD，YimWC，MoonJC，KimDS，LeeBM，JangCS.2010.AgenefamilyencodingRINGfingerproteinsinrice：Theirexpansion，expressiondiversity，andco-expressedgenes.PlantMolecularBiology，72(4–5)：369﹣380.LiuHui-zhi，HanShi-ping.2010.Progressinstructuralandfunctionalstudyofring-fingerproteins//ProceedingofHenanPlantPhysiologicalSociety.Henan：5﹣9.(inChinese)刘辉志，韩世平.2010.泛素–蛋白连接酶（E3）—RING-finger蛋白的研究进展//河南省植物生理学会30周年庆典暨学术研讨会论文集.河南：5﹣9.LiuShun-zhi，HuangZhong，HuWei-rong，JiangYue-ling，WangXiao-lan.2013.Constructionandanalysisofsuppressionsubtractivehybridization 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