酒中甜蜜素检测技术研究 48页

南京农业大学硕士学位论文酒中甜蜜素检测技术研究姓名：臧光楼申请学位级别：硕士专业：食品科学与工程指导教师：董明盛200804 中文摘要酒中甜蜜素检测技术研究摘要甜蜜素是我国广泛使用的甜味剂，但是过多食用会对人体产生不良影响，所以我们要严格控制食品中甜蜜素的含量．目前国标对于甜蜜素的检测方法不适于酒类的检测。本论文采用高效液相色谱法测定酒中甜蜜素的含量，分析条件如下：色谱柱ODSHypersil(5／zm，125mmx4mm)，流动相：CH30H：H20=80；20，流速：1．0mL，检测波长：314nm。此方法简便可靠，适用于酒中甜蜜素含量的测定．本研究的主要试验结果如下：1．通过高效液相色谱法(I-IPLC)获得了空白白酒以及不同甜蜜素浓度白酒酒样(100夥g／mL、50m／mL，2毗g／mL、lOng／mL、5pg／mL、2#g／mL)的高效液相色谱图；根据甜蜜素浓度和峰面积的线性关系建立了标准曲线，并求出回归方程：y--0．0008x+0．0147(R2-0．9991)；对比空白酒样和添加甜蜜素的白酒酒样，差异明显，在7-8分钟时有明显的吸收峰，其中甜蜜素浓度为100／llg／niL的白酒酒样峰面积最大，随着甜蜜素浓度的减小，峰面积也逐渐减小；将不同甜蜜素浓度的酒样进行回收率和精密度分析，得到回收率范围在97．115％，经重复测定，得到RSD为4．1％，定性检测下限为1．5／zg／mL，定量检测下限为5．0pg／mL．2．通过高效液相色谱法获得了空白黄酒以及不同甜蜜素浓度黄酒酒样(100／tg／mL、50ug／mL、20re／mL、lOng／mL，跏g／mL、弘g／mL)的高效液相色谱图；根据甜蜜素浓度和峰面积的线性关系建立了标准曲线，并求出回归方程：y=5E-05x+0．06929(R2-0．995)；对比空白酒样和添加甜蜜素的黄酒酒样，差异明显；不同甜蜜素浓度酒样所得色谱中，甜蜜素浓度为100／比g／mL的酒样峰面积最大，并且随着甜蜜素浓度的减小，峰面积也逐渐减小；对不同甜蜜素浓度的酒样进行回收率和精密度分析，得到回收率范围在94．5．115．6％，经重复测定，得到RSD为3．7％，定 酒中甜蜜索检测技术研究性检测下限为2．1／比g／mL，定量检测下限为7．0／【‘g／mL．3．对江苏市场销售的白酒和黄酒进行了甜蜜素使用情况调查，结果表明：调查的10份白酒合格率为8；0％，10份黄酒的合格率为60％，其中不舍格样品多为小型企业产品，而市场占有率较高的大中型企业的产品全部合格，说明酒类市场上甜蜜素的使用仍有待规范化，尤其是小型企业，更应加强企业自身管理，建立完善的质量标准体系，政府管理层也应该加强卫生监督管理．关键词：甜蜜素；白酒；黄酒；高效液相色谱法Ⅱ 英文摘要ANAIYSIS0FCYCI。AMAl’EINTHEALCoHOLDI江NKBYHPLCCyclamateiswidelyusedassweetenerinourcountry．However,excessiveconsumptionwillhaveanadverseimpactonthehumanbody．WeshouldstrictlycontroltheUSeSofsodiumcyclamateinthefood．TherearemanydetectionmethodsofCyclamate．TheHPLCmethodwasusedtodeterminethecyclamatecontentsintheliquorinourexperiment．Chromatographycolumn：ODSHypersil(Sam，125nmamm)，mobilephase：CH30H：H20=80：20，flowrate：1．0mL,detectionwavelength：314nm．Thismethodisconvenientandreliable，andissuitableforthedetectionofcyclamatecontentsintheliquor．Resultsoftheseexperimentswcrcshowedasfollows：1．TheHPLCehromatogramsoftheblankliquorandliquorwithdifferentconcentrationsofcyclamate(100#g／mL、50#g／mL、2陬g／mL、lOgg／mL、靴g／mL、2ag／mL)wereobtained．Thestandardcurveandregressionequationwereestablished：y=0．0008x+O．0147(Re=0．9991)．nedifferenceofblankliquorandliquoraddedwithcyclamatewassignificant．Peakareaofliquorwith100／l‘g／mLcyclamatewasthelargestoreandwiththeconcentrationofcyclamatereducing，peakareawasreduced．TherecoveryrateandRSDresultswere97·115％and4．1％respectively．Itslowerlimitofquantitativedetection：1．5／比g／mL,higherlimitofquantitativedetection：5．0#g／mL2．TheHPLCehromatogramsoftheblankliquorandliquorwithdifferentconcentrations(100Ⅳg／mL、50m／mL、20／llg／mL、lOng／mL、私g／mL、犁g／mL)ofcyclamatewereobtained．Thestandardcurveandregressionequationwereestablished：y=5E-05x+O．06929(Rz=O．995)．ThedifferenceofblankliquorandliquoraddedwithcyclamateWassignificant．PeakareaofliquorwithlOOgg／mLcyclamateWasthelargestOllCandwiththeⅢ 酒中甜蜜素检测技术研究concentrationofcyclamatereducing,peakareawasreduced．TherecoveryrateandRSDresultsWere94．5-115．6％and3．7％respectively．Itslowerlimitofquantitativedetection：2．1pg／mL,higherlimitofquantitativedetection：7．0／zg／mL3．TenkindsofliquorandyellowricewineinthemarketofJiangsuprovinceweresampledtoinvestigatetheusingconditionofcyclamate．Theresultshowedthatqualifiedrateof’liquorWas80％andqualifiedrateofyellowricewinewasonly60％．Theunqualifiedproductsweremostfromsmallenterprisesandtheproductsfromlargeormediumenterpriseswithhighproductmarketsharewereallqualified．Thereasonswereanalyzedandsomesuggestionsaboutqualitystandardsystem，sanitationmanagementandenterpriseself-managementweregiven．KEYWORDS：Cyclamate；liquor；yellowricewine；HPLCIV ．‘上---k刖蟊食品中环已基氨基磺酸钠(甜蜜素)的检测方法主要有液相色谱法、分光光度法、气相色谱法、离子交换色谱法、比色法等。目前食品中甜蜜素的国家测定标准是GB／T5009．97，该标准规定了食品中环已基氨基磺酸钠的三种测定方法一气相色谱法、比色法、薄层层析法，其中气相色谱法采用填充柱，但其适用范围不包括酒类。国标的检测原理是：先使硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，再对其定性和定量食品中环己基氨基磺酸钠的测定。该法是针对食品的通用检测方法，检验时可能由于白酒中环己醇及环己基的类似物质与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，而被误认为是环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠的反应，会造成酒中含有甜蜜素的假象。白酒是我国的传统蒸馏酒，按风味特征可分为浓香、清香、酱香、米香等四种基本香型。不论那种香型的白酒，保持适度的甜味，不仅可掩盖其他一些苦涩味，还能使酒体甘冽、醇厚、绵软。尤其是浓香型白酒，棉、甜、软、净、香是其典型风格，对酒的甜度更有特殊要求。风味化学研究表明，味觉是由一定的呈味物质引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因为酒中含有一定量的甜味物质，如高级醇、多元醇、氨基酸等。这些甜味物质，是由名优白酒的特殊生产工艺决定的，如浓香型大曲酒的低温入池、缓慢发酵，就是为了有利于醇甜物质的生成，一般无需添加。而普通白酒，尤其是产量占我国白酒很大一部分的液态法白酒，其甜味物质主要是依靠勾兑过程中添加适当品种和数量的甜味剂。甜味剂是赋予食品以甜味感的食品添加剂，在食品行业中应用广泛。一种理想的甜味剂应具备以下条件：具有生理安全性；有清爽、纯正、糖的甜味：低热量：高甜度；化学和生物稳定性高；不会引起龋齿；价格合理。1986年，我国曾批准使用甜味剂甘草、甜菊糖苷、糖精钠、甜蜜素、蛋白糖、麦芽糖酵和D．山梨糖醇等7种，1989年又新增许可使用木糖醇和异麦芽糖醇两种。酒中甜蜜素的检测报道目前较少，主要是在黄酒中的报道，方法有气相色谱、液 酒中甜蜜素检测技术研究相色谱法和液质联用两种方法。在白酒中只有采用液质联用方法检测甜蜜素的报道，但液质联用设备较昂贵，普及性不高。而液相色谱在一般的检验部门均有，目前未见采用液相色谱方法检测白酒中甜蜜素的报道。本论文旨在研究采用液相色谱方法检测酒类中甜蜜素的方法，为我国修订国家标准中酒类甜蜜素的检测方法提供参考。2 第一章文献综述1．1甜蜜素的性质甜蜜素学名为环己基氨基磺酸钠(SodiumCyclamate)，结构式为／CH2--CH2＼H2CCHNHSO小Ia＼CH2--CH2／通常是指环己基氨基磺酸的钠盐或钙盐，是以环己胺为原料，用氯磺酸或氨基磺酸盐磺化成环己基氨基磺酸后与氢氧化钠作用而制得的，属于人工合成的磺胺类无营养性食品甜味剂【111。1．1．1性状环己基氨基磺酸钠为白色结晶或白色晶体粉末，无臭，昧甜，易溶于水，难溶于己醇，不溶于氯仿和乙醚。对热、光、空气稳定。加热后微有苦味，分解温度280"(2。以酸性条件下略有分解，在碱性条件下稳定【2】。1．1．2呈甜性能环己基氨基磺酸钠的甜度为蔗糖的40．50倍，为无营养甜味剂。其浓度大于0．4％时带苦味，溶于亚硝酸盐、亚硫酸盐含量高的水中，产生石油或橡胶样的气味。此外，环己基氨基磺酸钠没有吸湿性，无不良后味，还具有掩盖苦昧的能力。甜蜜素甜味纯正，不参与人体代谢，有着热量低、适合糖尿病人饮用等优点【2】。3 酒中甜蜜素检测技术研究1．1．3质量标准指标项目GBl2488．1995FAO／WHO(魑!IB型l1980)环己基氨基确唆糙加黼PH值(1009几)僦(眺峨计)．砷(咖计)蝴(槲)透明度(以1009／II溶淘!I勺!i勐悟际)9&O1．O15．55．51．5O．05O．0001o．00l9598．O1．OO．003O．ool环己胺0．00250．0025婴塑丝燮Q：咝1．1．4鉴别方法【3】(1)取铂丝沾取本品少许，在无色火焰上燃烧，火焰呈黄色。(2)取本品约O．39，溶于约20mL水中，取,水ImL，加入硝酸银溶液(179／L)2mL，30s以后生成环己氨基磺酸银白色沉淀。(3)取本品约O．39，溶于20mLTk，加入亚硝酸钠溶液(1009／L)5mLle．10％(质量分数)盐酸溶液3mL，置水浴上加热约15rain。取出冷却后，加乙醚20mL振摇抽提。将乙醚层放入蒸发皿中，置水浴上蒸发除去乙醚，再加水1mL，加10％(质量分数)硝酸溶液0．5mL，置水浴上加热20rain，在沙浴上蒸发至干涸、不碳化。冷却后，残留物加水3mL溶解，调pH至4．5-7，加入硝酸银(179／L)lmL，生成白色沉淀。加入硝酸呈酸性，白色沉淀溶解。(4)将(3)中经乙醚抽提后的水层加入氯化钡溶液(509／L)lmL，生成白色沉淀。1．1．5毒理学依据(1)．LD50小鼠口服18000Im班g体重；大鼠口服1525mg／kg体重。4 第一章文献综述(2)ADIO—llmg／kg体重(FAO／WHO，1994)。1．1．6代谢食后用尿(40％)和粪便(60％)排出，无营养作用。1970年因用糖精．环己氨基酸磺酸钠喂养的白鼠发现患有膀胱癌，故美国、日本相继禁止使用。在随后的继续研究中，没有发现本品有致癌作用。1982年，FAO／WHO联合食品添加剂专家委员会(JECFA)将ADI值提高到11m眺g体重【4】。．1．1．7甜蜜素的生产我国甜蜜素的生产与研制在广东发展较快，广东肇庆香料厂于1986年开始生产，产品叫甜素；之后广东中山市食品添加剂厂、广东佛山市微生物研究所也分别于1987年和1988年开始投产；1991年国内产量为1500t’生产厂8家；2000年甜蜜素生产能力约3万t，实际产量2．5万t，有40余家企业生产；2002年我国年产甜蜜素5万t，出口1．5万t，创汇约1500万美元，出口去向主要是东南亚和西欧。目前全国甜蜜素生产能力超过6万t，国内市场供过于求；今后国内甜蜜素不宜再建新装置，而是改造现有装置，增加出口的同时，加大国内市场的开发，并开拓其应用领域【51。5 酒中甜蜜素检测技术研究1．1．8应用甜蜜素有一定的后苦味，常与糖精9：1或10：1的比例混合使用，能够互相掩盖对方的不良风味，从而可提高味质。与天门冬酰苯丙氨酸甲酯混合使用也有增甜、改善味质的效果【61。1．2甜蜜素的发展历史及相关规定甜蜜素于1937年由美国伊利诺大学的研究生MichaelSveda无意中发现并申请美国发明专利USP2275125；1949年美国将其用于食品；1958年，美国食品和药物监督管理局(FDA)将其列入公认安全物质(GRAS)名单：1960年工业化生产；1969年美国医药研究人员用大鼠对高浓度的甜蜜素与糖精钠的混合剂进行毒理实验，发现白鼠有发生膀胱肿瘤的现象，该实验结果导致美国国家科学研究委员会否决了甜蜜素的GRAS地位：1969年10月，美国FDA决定禁止甜蜜素在食品中使用；日本、英国亦随之于1970年禁用；1982年食品添加剂专门委员会(JECFA)从多项长期试验得出甜蜜素没有致膀胱癌性，其确定的毒性表现为雄性大鼠的睾丸萎缩和相关的病理表现，代谢研究表明甜蜜素很少被胃肠道吸收，吸收后基本上以原型(尿40％+粪便60％)排出，未吸收的甜蜜素由肠道微生物代谢产生环己胺，这是睾丸病变的原因：1982年，世界卫生组织食品添加剂专门委员会根据甜蜜素转换成环己胺的比例以及两者分子量的差异，计算出甜蜜素的无作用量(NOEL)为1058mg／kg，进而得到每日最大摄入量(ADO值1lmg／kg，以60ks体重的人计，每天最多允许摄／X．660mg，并将其列入食品添加剂品种名单，编号为952；1984年7月美国科学技术委员会的研究结果，又排除了甜蜜素的致癌性；但因1985年，美国国家科学研究会和国家科学院Ocac／NAS)报告本品有促进致癌的可能，故至今在美国联邦法规中仍规定甜蜜素“禁止直接加入或用于食品”r丌。目前，虽然美国、英国、法国、日本、印度、中国香港、中国台湾等国家或地区禁用甜蜜素，但仍有包括中国、欧盟、澳大利亚、新西兰等80多个国家和地区批准其作为非营养型甜味剂使用。在日本，环己基胺基磺酸钠因未被列入食品添加剂的使用标准，也不得在食品中使用is]。2003年至今，出口到日本的中国食品共有104批被检出环己基胺基磺酸钠，556 第一章文献综述个中国企业被列入日本厚生劳动省强制性检验环己基胺基磺酸钠的黑名单。有21种食品被检出环己基胺基磺酸钠，有的品种环己基胺基磺酸钠高达650#g／g。目前，部分生产葡萄罐头、果脯、水果汁、熟肉制品和调味饮料等产品的企业，在出口过程中已经受到限制。(1)我国《食品添加剂使用卫生标准》(GB2760．1996)[21规定：本品可在酱菜、调味酱汁、配制酒、糕点、饼干、面包、雪糕、果汁(味)型饮料、碳酸饮料中使用，最大使用量为0．65r,／kg；蜜饯1．09／kg；陈皮、话梅、话李、杨梅干8．09／kg。(2)实际使用参考【3l①冰淇淋：脱脂奶粉6009，玉米粉569，盐5．49，白糖2509，甜蜜素6．259，鸡蛋3949，钛白粉109，香精69，配成4．3kg。②柠檬果汁：柠蒙6009，白糖6009，甜蜜素159，冷开水72009。③蛋糕：面粉6009，鸡蛋10729，砂糖3439，甜蜜素8．69，牛-孚L2579，沙拉油2579，发酵粉39。④牛奶太妃糖：砂糖259，甜蜜素1．159，淀粉糖浆279，炼-孥L369，硬化油159，乳粉59，粉糖189，牛奶香精259。⑤果酱：番茄6009，白糖1509，甜蜜素3．759。⑥李子蜜饯：李子6009，白糖1009，甜蜜素2．59，麦芽糖509，氯化钙69。1．3甜蜜素的用途甜蜜素已广泛应用于食品加工业、制药业、农业等。它在食品加工中具有良好的稳定性，可以代替蔗糖或与蔗糖混合使用，能保持原有食品的风味，并能延长食品的保存时间；在医药上可做矫味剂，替代蔗糖，消除人体摄取过多蔗糖产生的许多不良后果，如引起肥胖症、冠心病、高血压、糖尿病、龋齿等疾病；也可作为糖尿病患者的甜食；在农业中用于苹果、梨、蓍茄等农作物，以增加果实甜味，缩短果实成熟期，是很有发展前途的果实催熟剂【叭。1．4甜蜜素的食品安全性最近‘。沱牌白酒添加有害物质甜蜜素”一事在业内闹得沸沸扬扬【41，由此更：bn弓l发7 酒中甜蜜素检测技术研究了大家对甜蜜素添加剂的关注。中国食品添加剂生产应用工业协会指出：食品添加剂最重要的是安全、有效。要保证食品添加剂使用安全，必须对其进行安全评价。这是根据国家标准、卫生要求，以及食品添加剂的生产工艺、理化性质、质量标准、使用效果、范围、加入量、毒理学评价及检验方法等做出的综合性的安全评价。测定其无作用量，再根据个体和种属差异等采用适当的安全系数(通常Ygxoo倍)，将动物试验所得结果推论到人，得到人的每日允许摄入量。此即是指人每日摄入物质直至终生，而不会产生可检测到的对健康产生危害的量。国际上最广泛应用的ADI值，通俗地讲，该标准是在动物试验以后缩小100倍用在人类食品中，以目前国家标准使用的甜蜜素为例，一个正常人(以70kg体重为例)每人每天最大允许摄人量为770mg。而GB2760-1996qb规定其在一些常用食品(酱菜、调味酱汁、配制酒、冰棍、果冻、糕点、饼干、面包、雪糕、冰淇淋、饮料等)中的最大使用量为0．659／kg。因此，它不会对人体产生任何危害【lo】。中国食品工业协会白酒专业委员会也为此召集了白酒、检测、食品添加剂和标准等不同学科的专家进行论证，专家认为：首先，白酒中的香味物质是由众多复杂成份组成的；目前，我们对白酒物质成分及其机理的认识还很不完全，已知的物质成分达三百余种，能够确定的只一百余种，还有很多不能够定性定量。白酒自身当中含有的环己醇、环己烯、环己酮及环己基类似物质的生成原因和数量多寡，尚有待进一步研究和判定【11】。其次，执法机关在查验中是采用食品中环己基氨基磺酸钠的测定(GB厂r5009．97)。该检测标准中气相色谱法的检测原理是：先使硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，再对其定性和定量。食品中环己基氨基磺酸钠的测定，是针对食品的通用检测方法，检验时可能由于白酒中环己醇及环己基的类似物质与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，而被误认为是环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠的反应，造成酒中含有甜蜜素的假象。所以对食品中环己基胺基磺酸钠的检测方法进行研究，对于人民的身体健康和企业对外出口食品监督，减少经济损失具有十分重要的现实意义【5】。1．5甜蜜素的检测方法目前，食品中环已基氨基磺酸钠的检测方法主要有气相色谱法、薄层层析法、离子选择电极测定方法、高效液相色谱法、比色法等。气相色谱法及比色法适用于饮料、8 第一章文献综述凉果等食品中环己基胺基磺酸钠的测定，薄层层析法适用于饮料、果汁、果酱、糕点中环己基胺基磺酸钠含量的测定。样品中含有0．19／l【g环己基胺基磺酸钠即可检出，高效液相色谱法直接检测采用RD．10A检测器，LC．10AdvpHPLC进行检测，采用双检测器HPLC可同时测定食品中环己基胺基磺酸钠、苯甲酸、糖精和山梨酸的含量。1．5．1气相色谱法气相色谱分析是重要的近代分析手段之一，原理是：在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯，利用气相色谱法进行定性和定量。由于它具有分离效能高，分析速度快，定量结果准，易于自动化等特点，且当其与质谱，计算机结合进行气一质联用分析时，又能对复杂的多组分混合物进行定性、定量分析，因此日益广泛地应用于石油化工、医药、生化、环境科学等各个领域，成为工农业生产、科研、教学等部门不可缺少的重要分离、分析工具。在封雷等人的《气相色谱法测定保健营养甜味剂中的甜蜜素》一文中，作者选择用高、中、低三种浓度，按试验步骤操作，各进行6次测定。结果：标准差为2．37％，相对标准偏差为3．05％，回收率96．1％一102．5％，显示出良好的精密度和回收率。这篇文章针对比色法测定样品前处理操作繁琐和薄层色谱法回收率低、精确度不好的缺点和不足，应用气相色谱法测定甜蜜素。该法不需要进行透析、萃取等处理，具有简便、快速、灵敏、回收率和精密度高等优点，适用于保健营养甜味剂中的甜蜜素含量的测定【61。在文君等人的《气相色谱法测定食品中甜蜜素》实验中发现氢：氧比为0．08mPa：0．08mPa时，效果最佳。在选定的色谱条件下。测得1．0mg／30mL甜蜜素标准溶液气相色谱图可见甜蜜素于3．85min左右出峰，峰形良好，干扰少【7l。1．5．2薄层层析法薄层色谱常用TLC表示，又称薄层层析，属于固一液吸附色谱。原理是：样品经酸化后，用乙醚提取，将样品提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开，经显色后，根据薄层板上环己基氨基磺酸的比移值及显色斑点深浅，与标准比较进行定性、概略定量。此方法是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品(几到几十微克，甚至0．0毕g)的分离：另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生9 酒中甜蜜素检测技术研究变化而不能用气相色谱分析的物资。在刘维华、那银燕的《薄层层析法同时侧定饮料中甜蜜素和糖精钠》一文中，对枯子、高橙、雪碧、荔枝等饮料中甜蜜素和糖精钠的添加回收率均在90％．100％之间。对同一样品分别用本法与GB5009．28．85糖精钠测定法测定，其结果无显著性差异(P>0．05)。甜蜜素、糖精钠的最低检出量分别为靴g、址g且显色斑清晰、稳定，一般能保持一星期，褪色后喷显色剂，斑点则重新出现【81．I．5．3离子选择电级测定法．离子选择性电极是一种对某种特定的离子具有选择性的指示电极。如玻璃电极就是对H+离子具有选择性的电极，是测定PH值最常用的Ir离子浓度的指示电极。玻璃电极于1906年问世以来，已有近百年的历史。但是离子选择性电极的迅速发展还是20世纪60年代以后的事。目前，已有几十种离子选择性电极投入使用，这是近年来迅速发展起来的一种新型的测量和检测工具。由于用离子选择性电极测量所用设备简单，操作方便，而且能快速连续测定，在工业自动分析，环境监测方面得到广泛应用。钟志雄等人的《离子色谱法测定食品中的甜蜜素和苯甲酸》的实验结果表明，当山梨酸：甜蜜素=68：1时，山梨酸干扰甜蜜素的测定；N03_：甜蜜素=155：1时，N03干扰测定。糖精钠、苹果酸、柠檬酸、乙醇酸、酒石酸等对甜蜜素和苯甲酸测定均无影响【们。林华影等人的《离子色谱法同时测定食品中的五种添加剂》实验测定NO：、、S042’、P043‘、F-、甲酸、乙酸、丁二酸等的I汀值(保留时间)分别为：4．82、5．64、6．48、1．26、2．14、2．62、3．08rnin，后四者与测定组份的RT值较接近，但由于分离柱的选择性强，干扰离子的响应值极低，且食品中很少共同存在甲酸、乙酸、丁二酸等杂质，所以对测定不会造成干扰。对于超过50mg／L的F，可加入沉淀剂如CaCl2为有机化合物的去除剂【10l。1．5．4高效液相色谱法高效液相色谱法是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约10 第一章文献综述占20％，而80％N需用高效液相色谱来分析。高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。液相色谱根据固定相性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱【121。1．5．．5比色法甜蜜素仅有微弱的紫外吸收，故不宜直接用紫外检测，需要进行衍生反应后，才能进行紫外测定。常用的衍生方法是重氮化和氯化。比色法是国标中第二法，利用甜蜜素在硫酸介质中与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯，与磺胺重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色染料，在550rim波长测定其吸光度。周婷【121用酸性乙醚提取样品中的甜蜜素，无水硫酸钠脱水后，挥干乙醚，加NaHC03溶液定容，并以NaHC03溶液作参比，在207rim处测定其吸光度，最低检出限为0．002rag。陈少波【13】用乙酸乙酯在酸性条件下提取食品中的甜蜜素，再以碱性水反萃取，调节溶液呈酸性，加入过量的次氯酸钠将甜蜜素转变为N，N．一二氯环己胺，溶于环己烷，在波长304rim处测定。甜蜜素的质量浓度在0．2～1．09／L范围内符合比尔定律，回收率为95．O％""102．7％，食品中共存的苯甲酸、山梨酸、糖精钠在10．09／L范围内，色素在2．09／L,范围内不影响测定。刘兆霖【14】利用甜蜜素的还原性，在0．03moⅥ磷酸介质中反应，定量的溴与甜蜜素在80℃反应20min后，测余溴间接测定了雪糕、大冰、面包等食品中甜蜜素的含量。1．6实验目的和意义近一段时间以来，由于查验方法不适，个别地方因检测出白酒中含有微量甜蜜素而查扣了大量产品。对此，我国食品添加剂主管部门卫生部监督司认为，食品中甜蜜素测定的适用范围不包括白酒。卫生部监督司5月11日在《关于白酒中甜蜜素检验方法给中国食品工业协会白酒专业委员会的复函》(卫监督食便函[2004]36号)中提出：“食品中环己基氨基磺酸钠的测定(GB／TS009．97)的适用范围不包括白酒。"现行的食品中甜蜜素检测标准中气相色谱法的检测原理是：先使硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，再对其定性和定量。食品中环 酒中甜蜜素检测技术研究己基氨基磺酸钠的测定，是针对食品的通用检测方法，检验时可能由于白酒中环己醇及环己基的类似物质与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，而被误认为是环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠的反应，造成酒中含有甜蜜素的假象。那么现实条件就迫切要求我们寻找切实有效、科学准确的新方法来对酒类食品中环己基氨基磺酸钠进行测定，以此来规范酒类行业秩序，建立明确的行业执行标准，完善社会主义市场经济运行。 第二章白酒中甜蜜素检测方法研究第二章白酒中甜蜜素检测方法研究摘要：本章采用高效液相色谱法(HPLC)检测白酒中甜蜜素含量，色谱条件如下：色谱柱ODSHypersil(5／zm，125mmx4mm)，流动相为CH30H"H20=80：20，流速为1．0mL，检测波长为314nm：获得了空白白酒以及不同甜蜜素浓度酒样(100／,tg／mL、50m／mL、20／tg／mL、10／,g／mL、靴g／mL、2m／mL)的高效液相色谱图：根据甜蜜素浓度和峰面积的线性关系建立了标准曲线，并求出回归方程：y=0．0008x+O．0147实验条件ODSHypersil色谱柱(靴m，125x4mm)，流动相CH30H．H20(80：20)，流速1．0mL／lain，检测波长314nm，进样量为1毗L。2．1．2．3实验注意事项(1)在标准品中加入试剂后，随着剧烈震荡会产生一些气体，使封闭的分液漏斗中的压力加大，有飞盖或漏液的可能，为了避免这种情况的发生，开始震荡时应震荡一下，开盖放气一下，等到觉得气体释放完毕后，再将盖子盖紧，剧烈震荡2分钟左右嘲15。(2)正己烷属易挥发液体，经它萃取的溶液要放在低温环境下保存。(3)微量的甜蜜素残留都会带来明显的差异，所以实验仪器一定要清洗干净。16 第二章白酒中甜蜜素检测方法研究2．2结果与分析2．2．1空白白酒的高效液相色谱图保留时间(Mill)图2-1空白白酒的高效液相色谱图Fi92-1HPLCchromatogrammapofblankcontrolalcoholgroup17 酒中甜蜜素检测技术研究从图2．1空白白酒的高效液相色谱图可以看出，除了在2分钟以前有个峰以外，其他时间图线基本在基线附近，图像平稳清晰，无其他峰的出现。因为空白酒样不含甜蜜素，说明该峰为杂峰。2．2．2高效液相色谱方法优化2．2．2．1pH值对测定的影响甜蜜素必须在强酸条件下与次氯酸钠进行氯代反应，将环己基氨基磺酸钠变成N"N-二氯代环己基胺。采用硫酸调pH值，吸甜蜜素标准溶液20／zg／mL1．00mL按实验方法进行测定，测定结果见表2．1。表2-lpH值对分析测定结果的影响Table2-1EffectofpRontheresultofidentification从表2．1可知，加入2mL50％硫酸时峰面积最大、灵敏度最高。故采用50％硫酸2mL作为调整pH的最佳量。2．2．2．2次氯酸钠用量次氯酸钠在强酸条件下，才能将环己基氨基磺酸钠衍生为环己酰胺。因此次氯酸钠加入量直接影响衍生物的含量。加入量少，衍生不完全、测定结果偏低。加入量过大，会产生杂质峰。吸1．00mL20肛g／mL甜蜜素标准溶液按实验方法进行测定，测定结果见表2．2。表2-2次氯酸钠对分析测定结果的影响Table2-2Effectofsodiumhypochloriteontheresultofidentification从表2．2可知，次氯酸钠加入量2．00mL较为合适，故采用次氯酸钠加入量为2．00mL。2．2．2．3碳酸氢钠用量环己基氨基磺酸钠在强酸条件下与次氯酸钠反应生成N，N．二氯环己基胺，经正18 第二章白酒中甜蜜素检测方法研究己烷萃取后，仍残留过量的次氯酸钠。残留的次氯酸钠必须除去，否则会损害色谱柱。试验用5％碳酸氢钠25mL洗涤1次，可除去过量的次氯酸钠，或每次用20mL纯水洗涤3"--"4次，也可除去残留的次氯酸钠。故采用5％碳酸氢钠25mL洗涤1次。2．2．2．4衍生物的稳定性按实验方法将经10,ug／mL甜蜜素标准溶液反应后的待测液于室温下放置。间隔一定时间测定其峰面积，观察生成的N，N．二氯环己胺的稳定性，结果见表2．3。表2-3N，N．二氯己胺稳定性实验(n-3)!塾垒!呈圣曼．塑：婪：璺i些翌：型堂塾皇型!璺堕垫堡!垒垒坚垫竖堡垒望堡坐一放置时间(h)峰面积放置时间(h)峰面积由表2—3可知，在12h内N，N-二氯环己胺基本无变化，峰面积下降仅2．11％。显示其在室温下稳定，能满足分析要求。2．2．2．5干扰试验在测定条件下，于10ug／mL的甜蜜素标准溶液中加入各种干扰物质，测定结果表明，在相对标准偏差小于5％时，200,ug／mL糖精钠、1000#g／mL苯甲酸和山梨酸均不干扰甜蜜素测定。19 酒中甜蜜素检测技术研究吸光值量2．2．3不同浓度甜蜜素标准品的高效液相色谱图图2-2100肛幽吡L，甜蜜素标准品高效液相色谱图Fi92-2HPLCchromatogrammapof100舭幽此standardcyclamate保留时间(Min)图2．35叩酌nI莉蜜素标准品高效液相色谱图Fi92-3HPLCchromalDgrammapof50／堪g／mLcyclamatestandard：20 第二章白酒中甜蜜素检测方法研究MhutN保留时间(Min)图242毗g，mI甜蜜素标准品高效液相色谱图Fi92-4HPLCchromatogrammapof20／比g／mLcyclamatestandardMnutm保留时间(Min)图2-51叩酌nI莉蜜素标准品高效液相色谱图Fi92-5HPLCchromatogrammapoflO／Mg／mLcyclamatestandard 一器箨然．恩Mh岫保留时间(Mill)图2石犁动m瓣}蜜素标准品高效液相色谱图Fi92-6HPLCchromatogrammapof5／l‘g／mLcyclamatestandard保留时间(Min)图2-7犁g／ml甜蜜素标准品高效液相色谱图Fi92-7HPLC曲【mmato|即mmapof2Ⅳg／nacyclamatestandard 第二章白酒中甜蜜素检测方法研究比较图2．2至图2．7不同浓度的甜蜜素标准品色谱图可知，其中10毗咖L的甜蜜素标准品峰面积最大，为185681，5吮咖L的甜蜜素标准品峰面积次之，为67795，20／比g／mL、lO／zg／mL和5／zg／mLl拘甜蜜素标准品峰面积分别为22010、6057和1793，犁g／mL的甜蜜素标准品峰面积最小，只有608。由图像可以说明，峰面积随着甜蜜素浓度的减小而减小，根据它们之间的线性关系，可以建立相应的标准曲线。2．2．4标准曲线与回归方程以10叩g／mL、50弘tg／mL、20／【‘g／mL、lO肛g／mL、靴咖L、犁咖L不同浓度甜蜜素标准品色谱图的峰面积和质量浓度作归化图，得到标准曲线。表“不同浓度的甜蜜素标准品与峰面积Table2-4I-IPLCchromatogrammapareaofdifferentconcentrationcyclamatestandard二1ZQ100：豸囝篓604020O甜蜜素标准品峰面积102心mL50／．,g／mL20／ug／mL1陬g／mL5／比g／mL弘咖L1856816779522010605717936080Z00I∞400006000080000l∞Q001=20002“000Q，峪蠲?枫图碣标准曲线及回归方程Fi92·8Cyclamatestandardb-：IirveandregressionequationofHPLCmethod 酒中甜蜜素检测技术研究根据甜蜜素浓度和锋面积的线性关系，我们可以建立标准曲线，并求出回归方程：y=0．0008x+0．0147(R2=0．9991)。2．2．5不同浓度甜蜜素酒样的高效液相色谱分析Mnutm保留时间(Mill)图2-9100ug／mL甜蜜素滔样的高效液相色谱图、Fi92—9HPLCchromatogrammapofliquorsampleadded10099／mLcyclamatestandard对比空白酒样和添加甜蜜素的酒样，差异明显，在7．8分钟时有明显的吸收峰，其中10099／mL甜蜜素酒样峰面积最大，随着甜蜜素浓度的减小，峰面积也逐渐减小。对照标准曲线，可求出实际测量浓度，并计算出回收率。将1毗咖蛹样重复测量六次，可求出精密度。2．2．6回收率和RSD对100／llg／mL、50#g／mL、20#g／mL、10ug／mL、5#g／mL、犁咖L不同甜蜜素浓度的酒样进行回收率和精密度的分析。通过计算，得到回收率范围在97·115％。经过重复测定，得到RSD为4．1％。 第二章白酒中甜蜜素捡测方法研究表2-5回收率数据Table2-5RecoveryrateofcyclamateusingHPLCmethodinforliquor表2-61印g／瑚I甜蜜素酒样重复六次结果数据Table2-6SixrepetitivedataofcyclamateusingHPLCmethodinforliquor2．2．7检测下限取不含甜蜜素的白酒lOmL作为空白试液，按前方法经前处理后进样，重复试验10次，以空白结果标准偏差的3倍求得定性检测下限为1．5／．,g／mL，以空白结果标准偏差的10倍求得定量检测下限为5．0／【‘g／mL。2-3小结。(1)本方法采用氯代反应，在酸性条件下，把环已基氨基磺酸钠转变成N，N-=氯代环已基胺，由于氨基没有丢失，不会产生GB厂r5009．97方法中有环己醇、环已基类化合物引起的假阳性，因而结果的判定较为准确。(2)关于检测波长的选择。N，N．二氯代环已基胺在210hm、314nm处有2个吸收峰，但210rim处会产生溶剂和流动相的吸收干扰，而314m处相应的干扰少、基线稳定，所以选择314nm为检测波长。(3)白酒中有大量的氨基酸营养成分，在前处理条件下也会吸收氯气发生氯代反应。随着次氯酸钠加入量增加，氨基酸峰和甜蜜素峰会增高，但当次氯酸钠溶液(有效率5％以上)增加到2mL后，甜蜜素峰面积基本不变。所以我们选择次氯酸钠的加入量为2mL。50％硫酸2mL作为调整pH的最佳量，同时采用5％碳酸氢钠25nlL洗涤1次。结果显示其在室温下稳定，能满足分析要求，且不受糖精钠、苯甲酸和山梨酸的干扰。 酒中甜蜜素检测技术研究(4)利用次氯酸钠将白酒中的甜蜜素转化为N，N．二氯代环已基胺，经正己烷萃取，用高效液相色谱法测定，线形范围宽，灵敏度、准确度及精密度均较高，能满足国家标准对甜蜜素检测的要求。(5)通过实验得到该方法白酒中甜蜜素标准曲线：y=0．0008x+0．0147