早晚熟温州蜜柑的msap分析 79页

独创性声明学位论文题目：呈晚塾量划蜜挝鲍丛墨△里金盘本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中己加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：々4刍即龟签字日期：沙}甲年6月弓日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院(筹)可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位文在解密后适用本授权书，本论文：圈"--T保密，口保密期限至年月止)。学位论文作者签名：千孽芝1受导师签名：两李，语，签字日期：沙／Lr年6月弓日签字日期：Ⅵ·中年6月)日 目录目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IAbstract．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．⋯⋯．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．，．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．]lI第一章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1果实在成熟过程中的激素和转录调节⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．2果实成熟过程当中的表观遗传调控⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．3DNA甲基化的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3，1DNA甲基化概述及其特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3，2DNA甲基化的发生机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．3．3DNA甲基化的遗传与变异⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．3．4DNA甲基化的生物学意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．3．5DNA甲基化的检测和研究方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12第二章20个同一时期温州蜜柑品种的MSAP分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．1主要溶液的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2，2所用的MSAP引物和接头⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一142．2．3DNA提取及检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2、420个温州蜜柑品种的MSAP扩增体系优化及建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．I62．2，5变性PAGE电泳及银染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．6胶的回收及测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202。2．720个早晚熟温州蜜柑品种果实生理生化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l2．3．120个早晚熟温州蜜柑品种果实生理生化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2I2．3．220个温州蜜柑品种的MSAP扩增体系优化及聚丙烯酰胺凝胶电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242．3．320个早晚熟温州蜜柑品种MSAP的带型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26 西南大学硕士学位论文2．3．420个早晚熟温州蜜柑品种MSAP差异片段测序分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：．⋯⋯⋯．282．3．5温州蜜柑品种的甲基化模式分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．3。6温州蜜柑品种之间的甲基化特异性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．322．3．7温州蜜柑品种的甲基化多态性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34第三章青岛温州和大分1号两个温州蜜柑品种不同时期的MSAP分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．373．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一373．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．2．1所用MSAP引物和接头⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．2．2DNA提取及检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．2．3青岛温州和大分1号两个品种的MSAP体系及聚丙烯酰胺凝胶电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．2．4胶回收及TA克隆测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．403．3结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯443．3．1青岛温州、大分1号的MSAP分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．44第四章讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯474．1MSAP分析植物DNA甲基化的可行性及温州蜜柑的基因组DNA甲基化水平⋯⋯⋯⋯⋯474，220个早晚熟温州蜜柑品种间的甲基化特异性及差异性序列⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯484．3青岛温州和大分1号的甲基化差异序歹lj⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯494．4两种不同提取DNA方法的MSAP分析及聚丙烯酰胺凝胶电泳⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．504．5论文的创新点及不足⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯514．5．1论文的创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l4．5．2论文的不足之处⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l第五章结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．55附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯67参加科研项目和发表文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7l 摘要早晚熟温州蜜柑的胚AP分析细胞生物学专业硕士研究生陈志友指导老师：向素琼研究员江东副研究员捅要柑橘是热带和亚热带地区最重要的水果之一。温州蜜柑是我国乃至东亚地区栽培面积最大的宽皮柑橘品种，具有重要的经济价值。绝大多数温州蜜柑品种来源于芽变选系，因此在DNA水平上的差异很小，即使在成熟期上存在显著差异的温州蜜柑品种，用一般的分子标记技术往往也难于区分。由于温州蜜柑芽变材料多，基因遗传背景较为一致，因此，温州蜜柑是研究果实发育与成熟的理想材料。本文通过～ISAP技术在同一时期检测了20个早晚熟温州蜜柑品种的基因组DNA甲基化模式，并利用同一方法对不同时期的晚熟温州蜜柑(青岛温州)和早熟温州蜜柑(大分一号)果实和叶片的基因组DNA甲基化变化进行了评估，对差异性条带进行测序，找出在温州蜜柑果实成熟和发育过程中受甲基化调控的基因，从而对研究早晚熟温州蜜柑品种问DNA甲基化的差异，探索柑檑果实在成熟过程中甲基化的改变，深入理鳃柑橘的成熟过程具有重要的作用。本研究主要获得如下结果：1、大分l号、岩崎早生、日南1号、温州8．76、隆园早温州、温州03．02、桥本、温州03．05、宫本、大浦十个早熟温州蜜柑品种以及寿太郎、尾张、清江、人津4号、宁红73．19、伊木力、青岛、杉山、林温州、石川十个晚熟温州蜜柑品种的MSAP分析表明，早熟温州蜜柑和晚熟温州蜜柑品种的基因组CCGG位点的甲基化程度和模式都存在显著差异。早熟温州蜜柑品种CCGG位点的外部平均甲基化(8．47％)明显多于晚熟温州蜜柑品种CCGG位点的外部平均甲基化(6．74％)；而早熟温州蜜柑品种CCGG位点的内部平均甲基化(24．98％)却明显少于晚熟温州蜜柑品种CCGG位点的内部平均甲基化(27．27％)。这暗示了温州蜜柑在成熟过程中，CCGG位点的胞嘧啶甲基化整体改变趋势是内部胞嘧啶甲基化趋于减少，而外部胞嘧啶甲基化趋于增加。早熟温州蜜柑品种中的两个特早熟品种2003．02温州和桥本的CCGG位点胞嘧啶外部甲基化最高分别为15．28％、15．46％；晚熟温州中大津4号的CCGG位点检测到的胞嘧啶外部甲基化也高达t3．77％，而其他晚熟品种均远低于这个水平；晚熟晶种伊木力中检测到CCGG位点胞嘧啶内部甲基化高达44．37％，远高于其他所有品种的内部甲基化水平。早熟温州蜜柑品种总的甲基化水平(33．45％)略低于晚熟温州蜜柑品种总的甲基化水平(34．01％)，这表明温少I,I蜜柑在成熟的过程中总的甲基化水平在降低。此外，在20个早晚熟温州蜜柑品种中，每个品种CCGG位点的胞嘧啶外部甲基化均少于其内部甲基化，检测到总的外部平均甲基化率仅为7．62％，而总的内部平均甲基化率高达26．11％。2、20个同一时期温州蜜柑品种MSAP分析的差异片段测序表明，编码G．蛋白a亚单位基因(G．proteinalphasubunit)和EST序列CX052976．1的甲基化模式在早熟温州蜜柑品种和晚熟温州蜜柑品种间有明显差异：青岛温州、大分l号两个温州蜜柑品种不同时期的MSAP分析表明，组氨酸三联体家族的锌结合蛋白基因(Zinc—bindingproteinofthehistidinetfiad(HITl 西南大学硕士学位论文family)和EST序列CX071135．1的甲基化模式在温州蜜柑成熟过程中，有显著改变。因此，G．蛋白。(亚单位基因(G-proteinalphasubunit)、组氨酸三联体家族的锌结合蛋白基因(Zinc-bindingproteinofthehistidinetriad(HIT)family)以及两个EST序列CX052976．1和CX071135．1可能在温州蜜柑果实成熟过程中扮演着重要作用，并且其功能受到甲基化的调控。3、本实验表明，MSAP是检测温州蜜柑品种之间DNA甲基化特异性的有效方法。在本文中，大分l号、岩崎早生、日南1号、温州8—76、隆园早温州、温州03-02、桥本、温州03—05、宫本、大浦、寿太郎、尾张、清江、大津4号、宁红73．19、伊木力、青岛、杉山、林温州、石川20温州蜜柑品种中，温州8-76、隆园早温州、桥本、清江、大津4号、伊木力、石川、青岛、岩崎早生、温州03．02、桥本、宁红73．19、杉山13个品种表现出了甲基化特异性。4、为了比较早晚熟温州蜜柑品种理化性状之间的差异，对20个温州蜜柑品种进行了果实理化性质分析。结果表明，采样时早熟温卅I蜜柑品种和晚熟温，·It蜜柑品种的可滴定酸含量、VC含量以及颜色都存在极显著差异：温州蜜柑果实转色成熟的过程中，可滴定酸含量在逐渐减少，VC含量在逐渐增加；而固形物、单果重与色差、可滴定酸的相关性并不显著。关键词：早晚熟温州蜜柑；DNA甲基化：MSAP 摘要StudyOnDNAMethylationPatternsofEarlyandLateSatsumawithMSAPAnalysisMastercandidateincellbiology：ChenZhiyouSupervisor：AssociateProf．JiangDongProf．XiangSuqiongAbstractCitrusisoneofthemostimportantfruitsintropicalandsubtropicalareas．Satsumashaveimportanteconomicalvalue，whichhavethehighestcultivatedin"calmaongmandarinsinChinaoreveninthewholeeasternAsia．Mostofsatsumacultivarsderivedfrombudmutation，thedifferencesonDNAlevelarctoosinailtobeidentifiedUSin【gtraditionalmolecularmarkersevenamongthoseculfivars，whoseripeningperiodisobviouslydifferent．Abundantbudmutationcultivarsandtheconsistencyofgeneticbackgroundmakesatsumastheidealmaterialtostudythedevelopmentandripeningoffruit．AnalysisofDNAmethylationof20earlyandlatesatsumavailetiesinthesametimeand2satsumavarieties(Ooitawase,Aoshimaunshiu)indifferentdevelopmentstageswereperformedinthisstudy．Basedonthemethylation-sensitivefragmentlengthpolymorphism(MSAP)technique，thedifferencesofDNAmethylationbetweenearlyand1atesatsumavarietieswereestimated．Theobviouslydifferentialbandsweresequencedtofmdthechangedgenesbymethylationmodificationinvolvinginthefruitripeningprocessofsatsuma．髓eaimofthisstudyistostudythedifferencesofDNAmethylationbetweenripeningearlyandlatesatsuma(Citrusunshiu朋她7：)，andexplorethechangesofmethyaltionduringthefruitripeningprocessofsatsuma．Furthermore，thisstudyprovideUSinsiglltintothemechanismofthefruitripeningprocessofsatsuma．nemainresearchresultsobtainedinthisstudyareasfollow：1．AccordingtotheMSAPanalysisontenripeningearlysatsumascultivars(Ooitawase,1wasakiUnshiuwase,Nic}linanNo．1．Satusama8—76,LongYuanZao。2003．2Satsuma,HashimoreWase,2003-5Satsuma，MiyamotoWase,OouraWase)andtenripeninglatesat．sun"mscultivars(Judarounshiu．Owariunsh沁．Aoeunshiu．OotsuNo．4unshiu．NingHong73一19．IkiriMunshiu,AoshimaUnshiu．SugiyamaUnshiu,HayashiUnshiu,IshikawaUnshiu)，TheextentandpatternofcytosinemethylationintheCCGGsequencesofgenomesbetweenearlyandlatesatsumavarietiesaleobviouslydifferent．111eexternalmethylationofCCGGsequencesinripeningearlysatsuma(8。47％)ismorethanitsinripeninglatesatsuma(6．74％)，whiletheinternalmethylationofCCGGsequencesinripeningearlysatsuma(24．98％)islessthanitsinripeninglatesatsuam(27．27％)．2003—2SatsumaandHashimotoWasearetheearliestcultivarsamongearlysatsumas，whoseexternalmethylationofCCGGsequencesarerespectively15．28％．15．46％．ThelatesatsumacultivarsOotsuNo。4unshiuhavehiIghexternalmethylationofCCGGsequences(13．77％)，Whi】etheexternalmethylationofCCGGsequencesinotherlatesatsumacultivarsaremuchlowerthanit．IkirikiunshiuhavethehighestinternalmethylationofCCGGsequencesamonglatesatsumacultivars．whiletheothercultivarsaremuchIowerthanit．ItindicatedthattheintemaIcytosinemethylationtendtoreduceandtheexternalcytosinemethylafiontendtoincreasewhensatsumaIll 西南大学硕士学位论文fruitsapproachripening．ThetotalDNAmethylationinearlysatsumacultivars(33．45％)isslighflylessthantha／oneinlatesatsumacultivars(34．01％)．Furthermore，alloftwentysatsumasdisplayedlowerexternalcytosinemethylafionthaninternalcytosinemethylation．Thetotalaveragemethylationinexternalcytosineis7．62％．whilethetotalaveragemethylationininternalcytosineis26．1l％．2．AccordingtoanalysisofDNAmethylationof20earlyandlatesatsumavarietiesintheSalTletime，themethylationpanernofG-proteinalphasubunitgeneandESTsequenceCX05297丘1hasobviousdifferencesbetween1ateandearlysatsumas；AnalysisofDNAmethylationofOoitawaseandAoshimaunshiuindifferentdevelopmentstagesshowedthatthemethylationpatternofZinc·bindingproteinofthehistidinetriad(HIT)familygeneandESTsequenceCX071135．1changedsignificantlyduringtheripeningprocess．Therefore，G-proteinalphasubunitgene，Zinc-bindingproteinofthehistidinetriad(HIT)familygeneandtwoESTsequences(CX052976．1andCX071135．1)mightplayallimportantroleduringtheripeningprocessofsatsumas．3．111isstudyshowedthatMSAPisalleffectivemethodtOdetecttheDNAmethylationmodificationinsatsumas．Inthisstudy,thirteensatsumacultivarsshoweddifferentDNAmethylationpatterniIlalltwentysatsumacultivars．4．Testingoffruitqualitycharacteristicof20satsumacultivarswereperformedtocomparethedifferenceofphysiologicalcharacteristicbetweenlateandearlysatsumas．Theresultsindicatedthatthephysiologicalcharacteristics(acidcontent、Vccontentandfruitcolor)betweenlateandearlysatsumashavesignificantdifferences．ItalsoshowedthattheacidcontentwerereducedandtheVccontentwereincreasedcompaniedwiththefruitcolorchangeduringthefruit—peningprocess；whiletotalsolublesolidandfruitweighthavenosignificantcorrelationwithcolorchangeandacidcontent．Keywords：Ripeningearlyandlatesatsuma；DNAmethylation；MSAP 第一章文献综述水果是被子植物的一个特征性状。发展至今，它们已有各种各样的表现形式和类型。原始的水果可能出现在白垩纪的早期，表现出干裂的性状，而肉质丰满的水果出现在自垩纪的晚期或第三纪的早期⋯。水果的多样化，从于裂的形式逐渐发展成肉质丰满的核果或浆果的过程，其又涉及到脊椎动物的出现，而脊椎动物成为了种子传播主要中间体【引。水果成熟是一个复杂且高度协调的发育过程。果实在成熟过程中涉及的主要变化包括果皮颜色的绿色逐渐退去，非光合色素逐渐的增加：细胞壁角质层的变化引起果实变软；酸的减少，糖的增加使味道变得可口；挥发性物质成分的增加使其香气变得独特13J。此外，水果也是重要附加食品的来源，可为人类提供矿物质、维生素、纤维素、抗氧化剂等。从农艺学角度米看，营养价值、风味、加工品质和储藏时间决定了水果的质量。温州蜜柑是热带和亚热带地区非常重要的柑橘水果之一，也是东亚地区栽培面积最大的宽皮柑橘品种，具有重要的经济价值。温州蜜柑品种繁多，生产上主要根据成熟期差异而将其分为特早熟、早熟、中晚熟等类型，而绝大多数温州蜜柑品种来源于芽变选系，因此在DNA水平上的差异很小卜51，即使在成熟期上存在显著差异的温州蜜柑品种，用～般的分子标记技术往往也难以鉴别。由于温州蜜柑芽变材料多，基因遗传背景较为一致，因此，温州蜜柑是研究果实发育与成熟的理想材料，通过表观遗传学研究早晚熟温卅I蜜柑品种问的差异，对揭开柑橘的成熟机制，深入理解柑橘的成熟过程具有重要的作用。现代分析工具可以从转录水平‘¨】、蛋白组学水平n叫21、代谢组学水平‘”。141对表型进行综合的分析，从而促使新陈代谢网络概观的形成【l卜16】。同时网络调控的综合分析，对果实发育的系统调节将产生越来越深入的理解。1．1果实在成熟过程中的激素和转录调节根据果实在成熟过程中的呼吸活动和乙烯生物合成，可以将果实分为呼吸跃变型果实和非呼吸跃变型果实。在番茄、苹果、香蕉等跃变型果实中，乙烯的合成对于果实的正常成熟，起着重要的作用，无论是阻碍乙烯的合成还是阻碍乙烯的获得，都将阻止果实的成熟[1’7J。首次在转录组水平上研究心皮和果实的发育，所用的是模式植物拟南芥的干裂长角果ll8J。这些研究阐明了几个MADs-box转录因子在组织特异性中的作用和裂果机理。然而，尽管干果和肉质果之间有显著的解剖学差异，但随后的研究主要集中于番茄，并且发现了几个MADs-box的同源基因参与了果实成熟的调节，而MADs．box基因曾在拟南芥中被描述[19_20】。目前已经知道部分果实发育的调控网络在肉质果的进化过程中是保守的[21-22J。理解调节果实成熟机理的大量进展，都来自于番茄单个基因突变的研究，包括PIN．NOR、CNR、GR、GF、HP』、HP2、NR等基因IzM91。RIN突变会导致MADs．box编码的蛋白质部分缺失，而CNR突变是一个表观遗传突变，其改变了SBP蛋白基因的启动子区的甲基化。NOR是NAC．domain转录因子家族的成员[301o最近针对NOR和RIN基因突变对于番茄成熟与发育影响的研究中，从转录组学、蛋白组学、代谢组学三个角度诠释了调节乙烯下调基因的表达情况，这也使我们对激素乙烯在蛋白质和代谢物两方面调节果实成熟的重要作用，有了更深刻的理解【311。此项研究的数据表明，NOR和RIN基因相互作用，共同调控果实的成熟 西南大学硕士学位论文口2J；并且显示了NOR基因比R1N基因，在乙烯或成熟相关基因的表达方面有更全面的影响，这暗含了NOR基因可能作用于RIN基因的上游。最近，通过染色质免疫沉淀和转录组途径共同分析表明，RIN基因编码蛋白与超过200个基因的启动子相互作用，通过激活或被抑制方式来调节目标基因的表达。RIN的目标基因都是调控成熟的重要调节因子，例如，CNR基因、NOR基因p引。草莓、柑橘、葡萄的果实等都被划分为非呼吸跃变型果实，因为它们的果实在生长停止到开始进入衰老期之间的时期，不会出现呼吸速率突然升高的情况，并且产生的内源乙烯的量与跃变型果实比起来偏倒34J。对胡椒果实研究发现，一些胡椒品种表现出对乙烯的应答不敏感：而其它的胡椒品种通过外源乙烯的刺激，却能够促使一些与成熟相关的基因表达mJ。对草莓的研究发现了非跃变型水果成熟的主要模式：在绿色果实中乙烯的含量相对高些，在白色果实中乙烯含量降低，而在果实成熟的红色阶段乙烯含量最终再次升蒯36J。有趣的是，最后乙烯含量的增加是由于呼吸率增强而引起的，这和跃变型果实在开始成熟时的表现类似p71。为了深入理解草莓成熟过程中乙烯所发挥的作用，已经通过各种各样的途径对其进行了研究。施加外源乙烯会使几个细胞壁相关的基因下调，例如，D．半乳糖苷酶(p．galactosidase)，果胶甲酯酶(pectinmethylesterase)，p木糖苷酶(p．xylosidase)p¨01。然而通过施加外源NO还发现一些基因对其并不敏感，例如，expansin基因家族和FaF_ⅨP2基因【4¨。最近对于草莓从转录组水平和代谢组水平的研究表明，转基因草莓对于乙烯应答的敏感性降低，这说明乙烯应答反应需要正常发育的果实，才能表现出其正常水平，而且在研究中还发现瘦果和花托两部分对于乙烯的敏感程度不同。这些结果表明，尽管乙烯在草莓中所发挥的作用并不是与跃变型果实那样相关联，但也可能在草莓成熟过程中扮演着一定作用。最近的一项关于跃变型果实(番茄)和非跃变型果实(胡椒)的比较研究，从转录组水平和代谢组水平对他们果实成熟过程进行分析表明，它们都有相似的调节乙烯的信号元件：然而在胡椒中，这些基因的调控却有明显的表现出不同，说明番茄和胡椒对于乙烯应答的敏感性不同，或者说它们调控乙烯的调控因子有所差异【42J。胡椒与番茄中乙烯生物合成的情况不同，在番茄中能够被诱导的乙烯生物合成基因ACC合成酶和ACC氧化酶在胡椒中不能够被诱导。乙烯应答的下游基因，例如细胞壁基因、ERF3以及类胡萝卜素生物合成基因等，在胡椒果实成熟的过程当中都是上调的【4引。在跃变型果实和非跃变型果实中的其它一些普通调控基因的功能也都有研究。在草莓中，一个SEPALLATA基因SEPl／2(MADs．box中的一员)对果实的正常发育与成熟有重要作用畔J。此种情况与香蕉很相似，香蕉被划分为跃变型果实，其M．ADs．box中的SEP3基因的表达与香蕉的成熟有很大联系【4引。在苹果中，MADs2基因的表达也涉及到了果实的坚硬度；而在越桔果实中发现，番茄TDR4基因的同源基因SQUAMOSAMADs．box有调控花青素生物合成的作用【4⋯。目前，除了乙烯之外，我们对于激素调节跃变型果实和非跃变型果实在发育与成熟方面的作用，了解的还是很有限的。番茄、胡椒、香蕉、甜瓜和草莓中，最多的游离生长素是吲哚一3．乙酸(IAA)，并且发现，在成熟开始之前其含量减少；这样的改变是由于认A的共轭物IAA．Asp增加引起的【471。此共轭反应是通过Ⅱ引哚乙酸氨基合成酶基因(GH3)表达催化完成的。番茄中，GH3基因家族的15个成员的功能都已有描述，但其中仅有两个基因的表达2 第一章文献综述模式涉及到果实的成熟【48]。番茄中，让胡椒的GH3基因超表达，可以使其成熟提前mJ。此研究结果表明了IAA和其共轭物IAA-Asp共同调节果实的成熟，而不只是IAA自身的水平调节的，这也有助于果实成熟的短暂调节【5叭。非跃变型果实中，似乎没有像乙烯那样的单个生长调节因子，对果实成熟扮演着正调控的作用；但在一些非跃变型果实中，观察到生长素能够对果实的成熟进行负调控。关于草莓的研究表明，通过外源生长素的处理，许多涉及成熟特异性基因的表达下调。用人工合成生长素对葡萄进行处理发现，许多涉及成熟的基因延迟表达，这表明生长素在葡萄成熟的过程中似乎也扮演着负调控的作用拉¨。因为生长素在一些非跃变型果实的发育与成熟过程中，有显著调节作用，所以对于其它植物激素可能的调控作用却较少被关注，例如赤霉素(GAs)。然而，在草莓中的研究结果表明，施力ngl-源的GA3可以使草莓的红色色素发育显著延迟152。，并且改变了涉及细胞增大p列和细胞壁降解的基因表达【541。在植物中，植物激素脱落酸(ABA)涉及到植物的各个方面，例如植物的生长、发育以及对环境的胁迫应答‘55。61。ABA能够促使肉质果中糖的积累‘571，并且能够调节跃变型果实和非跃变型果实的发育与成剥58】。在番茄中发现，催化ABA生物合成第一步的基因NCEDl受到抑制时，一些与成熟相关的细胞壁基因下调，例如，polygalacturonase和pectinmethylesterase，同时也会使果实硬度和储藏时间的增加p引。相似的情况在草莓中也出现了，如果NCED的表达量减少，草莓果实的成熟将被阻碍100J。在草莓和葡萄中，ABA被认为是成熟诱导因子161“2。。ABA的信号转导机理并不清楚；但在葡萄中，通过对GH3启动子的分析，鉴定出了ABA相似的反应元件；这也许意味着脱落酸和生长素含量的比例对于果实成熟的启动有很人关系【6引。近年来，在跃变型果实和非跃变型果实的成熟过程当中，对于转录组、生化、激素、代谢组等方面涉及到的分子调控机制的理解水平，已经有了很大提高。然而，我们对于果实从为未成熟到成熟过程当中所涉及到的激素调节的发育开关，仍然不是很清楚。至今，大部分已经发表的在时间和空间水平，对于转录组和代谢组方面的研究都是相对浅显的；并且只限于报道各种各样的细胞、分子的存在。但随着新的技术的出现，统计工具也得到了很大的改掣川。这有助于我们改善自己的分析能力，以便于处理一些相关的问题，例如，亚细胞区隔化作用，不同细胞类型的差异比较等【6引。此外，高质量的果实基因组序列的利用，将有助于我们对果实的发育与成熟遗传调控的理解【66I。1．2果实成熟过程当中的表观遗传调控基因表达的表观遗传调控，实际上就是通过不改变DNA原始序列的情况下所产生的一种干扰。目前，表观遗传调节基因组活动的机理已经逐渐的被我们所认识。植物中，在不改变DNA原始序列的情况下，自发地单基因表观遗传突变，可能引起可遗传的形态变化【67】。DNA甲基化是表观遗传调控的一种形式，在植物中普遍存在。它涉及到转录组调节、胁迫应答等，此外它在保护基因组的完整性，不被转录原件和其它重复序列活动干扰方面扮演着重要作用【68]。在植物中，DNA甲基化发生在三种不同序列(CG、CHG和CHH，H=A、C或T)的胞嘧啶残基【691，并且通过不同的调节因子影响脱甲基化和甲基化的发生[70I。拟南芥中的表观遗传变异分析表明，在具有表达能力的基因中，至少三分之一的甲基化存在其编码区，仅有5％的基因甲基化存在启动子区[_71】。然而，启动子区域甲基化的基因表 西南大学硕士学位论文达通常具有组织特异性【721。早在20多年前，首次对番茄胞嘧啶甲基化位点的频率和分布研究发现，在两个番茄品种之间的胞嘧啶甲基化多态性是相当丰富的，甲基化模式也是稳定的从亲代遗传到子代，并且符合孟德尔遗传分离定律。组织特异性甲基化模式的存在以及在发育组织当中发现5’胞嘧啶甲基化(5一mC)频率总体成减少的趋势，使得研究者们假定了植物发育过程当中，一些等位基因甲基化位点发生了突变【7引。最近，关于胞嘧啶甲基化对番茄果实成熟的影响研究中，发现胞嘧啶甲基化对番茄果实的成熟有显著影响，并且定义了CNR表型的分子本质。在番茄中CNR突变会导致果实不能够成熟，果实总表现出绿色果皮，且对施加外源乙烯不会产生应答反应。通过定位克隆技术鉴定，CNR是一个SPB蛋白相似的基冈，但其不成熟表型可能不是由于其编码序列改变所导致的。通过对CNR突变等位基因亚硫酸轻盐测序发现，在预测的ATG起始位点上游区域的胞嘧啶发生了高甲基化。这个位点发生的高甲基化，使CNR基因的表达量急剧下降【_H]。因此，番茄果实的不成熟表型，是由于包括CNR基因启动子在内的区域，发生可遗传的胞嘧啶高甲基化所引起的。此外，正常的番茄果实(cv．Liberto)发育过程中，仅在果实成熟的开始发现，在特定区域内CNR基因的启动子区表现出脱甲基化的现象。这就得出了一个结论：DNA甲基化对果实的成熟起着调控作用r751。Zhong等176J最近的研究对DNA甲基化位点与果实成熟之间的联系，提供了更深入的理解。先前对于CNR位点表观遗传突变的本质已经有了一些研究结果，在此基础上，研究者们对其开展了进一步的研究。他们对发育中的番茄果实注射一种叫5．氮杂胞苷(5-azacytidine)的胞嘧啶甲基化化学抑制剂。这种甲基化抑制剂可以诱导果实部分区域成熟，果皮转成红色；而且涉及番茄成熟的主要基因番茄红色合成酶1(phytoenesyathase1)和聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)的表达情况达到了预期的效果。此外，在果实成熟红色区域部分发现CNR的启动子区发生了脱甲基化现象，而在果实未成熟的绿色区域的CNR启动子区没有发生脱甲基化现象。这就表明CNR的脱甲基化作用是诱导果实成熟的有效的表观遗传信号。研究者们拓展了他们胞嘧啶甲基化作用的观点。他们报道了番茄中叶子、成熟果实、未成熟果实、以及成熟受损的突变体(CNR和刚Ⅳ)的DNA甲基化序列。整个表观基因组的测序结果，至少显示了三个重要的研究结果：(1)果实成熟的过程中，在转录起始位点上游区域的甲基化程度逐渐减少：(2)成熟受到抑制的突变体CNR和R／N中，未观察到转录起始位点上游区域的甲基化程度减少的现象。他们的转录起始位点上游区域的CG甲基化水平反而更高。(3)在野生型的果实发育过程中，与成熟相关的主要基因的启动子逐渐脱甲基化。通过对成熟过程中的RIN结合位点染色质免疫共沉淀测序，胞嘧啶甲基化与果实的成熟之间的联系得到了迸一步的证明。R．IN目标位点包含了292个己知在成熟过程中有作用的基因。RIN结合位点被发现是与转录起始位点上游的甲基化“热点”区域相邻或者重叠的。通过对这些区域的甲基化状态分析表明，在果实从绿色未成熟到红色成熟的过程当中，这些区域逐渐的脱甲基化，并且甲基化水平的降低使RIN靶基因转录水平更高。先前的研究表明，在CNR突变体中PIN结合到启动子区的限制位点受到了抑制，这也暗含了启动子区高甲基化可能阻J卜R／N的结合m]。这里主要有三个发现：(1)用一种可以使DNA甲基化脱去的化学试剂对未成熟的果实进行局部处理，这对未成熟的果实起到了加速成熟的作J}1j。(2)在果实的成熟过4 第一章文献综述程中，包含R／N结合位点的成熟基因启动子区逐渐的脱甲基化；但在成熟缺陷的突变体中，此区域仍然是保持稳定的高甲基化状态。(3)PdN并不结合高甲基化的CNR基因启动子区(也可能与所有其靶基因的高甲基化启动子区都不能结合)。总的来说，表观基因组结构和发育动力学对调节番茄果实成熟起着重要的作用。到目前为止的整个研究结果表明，涉及成熟相关基因启动子区的逐渐脱甲基化可能是转录因子结合的必要条件，从而促发与成熟相关转录产物的积累。然而，在正常果实的发育过程中，诱导启动子脱甲基化的机制仍然不是清楚。我们还需要做更进一步的研究来解开这一谜团。由于表观遗传修饰对影响果实成熟的生长重要性，我们能够想象得到，将来可以通过高通量测序技术对作物表观基因组进行日常的筛选。利用高通量测序技术对表观基因组进行研究，可以加速表观遗传突变的发掘。在将来，植物育种策略中除了常规遗传突变分析外，可能还会筛查表观基因组和动力学差异，以此来帮助育种过程。以表观遗传为基础的作物改良方法，可以彻底地改变果实的品质。同时，将来的典型研究工作将会是以整合表观遗传基因组分析和小RNA分析为目标的工作，并且会更频繁的围绕转录物、蛋白质、酶、代谢物等进行研究，这将有助于我们更深入的理解调控生物过程中复杂的动力学过程的变化。1．3DNA甲基化的研究进展1．3．1ONA甲基化概述及其特点在植物或者动物细胞中，DNA甲基化都是常见的共价修饰现象。DNA甲基化是通常指，通过DNA甲基化转移酶(DNAmethyl．transferase，Dnmt)将s．腺苷酰甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到DNA胞嘧啶第5个碳原子上(5-mC)的过程，但也存在有少量的N6．甲基嘌呤(N6．mA)和7一甲基鸟嘌呤(7．raG)。N6．mA在真核生物中存在较少，主要存在于原核生物中。在动物中，甲基化主要存在于CG序列中：而在植物中，甲基化存在于三种序列中：CG、CHG和CHH，其中H代表A、C或Tt78-79]。植物与动物相比较，植物胞嘧啶甲基化发生率(4．6％～30％)高于动物胞嘧啶甲基化发生率(约1％)【耻引】。经过研究发现，高等真核生物的甲基化大部分(90％)发生在CpG双碱基序列中，且模式常常是对称序列甲基化的。Kovarik等(1997)对11个被子植物的研究发现，11个植物中25SrDNA基因中的CG和CHG序列甲基化水平都不同：同时还发现它们中的CG序列中的胞嘧啶甲基化水平较高(40％～70％)。经研究发现，拟南芥中CG序列胞嘧啶甲基化比例约占总甲基化水平的45％。不同物种之间25SrDNA基因的CHG胞嘧啶甲基化水平所占总的甲基化比例差异较大，从1％～99％不等，拟南芥中CHG胞嘧啶甲基化水平低于4％，甘蓝、玉米、豌豆分别约为5％、40％、80％，而洋葱中高约90％。种属之间DNA胞嘧啶甲基化差异有很重要的系统学意义【82。。不同种属的植物，以及在同一种植物的不同器官、不同组织、不同的生长发育时期，其DNA甲基化的分布都存在差异，就算是在基因组内部DNA甲基化也不是均匀分布的【831。根据相关研究表明，植物中都存在不同程度的DNA胞嘧啶甲基化，但是其比例因不同的植物种类而不同。在裸子植物中，其胞嘧啶甲基化就比开花植物更少。对丁植物来说很有意义的是，相同植物的不同组织或者是同种细胞的不同发育阶段的基因组DNA的CpG像点甲基化都存在差异。Opaque2是编码玉米胚乳的基因，发现其在非表5 西南大学硕士学位论文达区域叶片中高度甲基化，而其在胚乳中却不存在此现象【841。通过对水稻的研究发现，水稻在不同的发育期DNA甲基化存在差异，水稻的幼苗比充分展开的旗叶DNA甲基化程度更高185]。经相关研究表明，拟南芥DNA甲基化水平在不同的发育阶段也存在着差异；拟南芥的DNA甲基化水平，幼苗低于成熟植株顶端的叶片，而种子的DNA甲基化水平却高于成熟植株顶端的叶片。小麦的种子在萌发的过程中，其5-mC逐渐的减少。对植物的研究发现，花粉在发育过程当中发生了大量的去甲基化【861。有相关研究表明‘871，种子在萌发的前面30个小时内，其DNA甲基化水平从23．7％降至15．2％。对番茄的研究表明【88J，其种子的胞嘧啶甲基化水平比其它发育时期的组织或器官都高，神子的甲基化水平为27％，而成熟组织、原生质体、成熟的花粉、成熟的组织分别约为20％、20％、22％、25％。此外，不同的环境胁迫也会使DNA胞嘧啶甲基化产生改变。华扬等[891对水稻的研究表明，冷处理两天可以使基因组CCGG位点的胞嘧啶甲基化模式和甲基化程度发生很大的变化：有些CCGG位点发生了重新甲基化，而有的CCGG位点发生了去甲基化。在植物中的研究发现，一些特定基因的启动子区胞嘧啶甲基化分布也存在着差异。例如，在叉枝蝇子草(Silene，幽归抛)中研究发现【901，MROSl基因在花粉的发育过程中，这个雄性繁殖器官特异性的基因在启动子区的上游序列中，CG序列有99％发生了胞嘧啶甲基化；而转录序列中的CG序列仅有7％发生胞嘧啶甲基化。对于芜菁甘蓝逆转录子S1Bn和SINE的研究表明【911，对称的CG、CHG位点中其胞嘧啶甲基化水平分别约为87％、44％：而非对称的CG、CHG位点中胞嘧啶甲基化水平仅平均约为5．1％。植物基因组内，DNA胞嘧啶甲基化也存在特异性。由于甲基化主要存在于CG含量丰富的区域，冈此植物中的细胞核的胞嘧啶甲基化也不是均等的。总之，植物在生长发育过程中，甲基化起着重要的调节作用。植物通过DNA胞嘧啶的甲基化和去甲基化可以调节基因表达，使其形成了各自独有的、复杂的甲基化系统，维持植物生理生化的变化过程。1．3．2DNA甲基化的发生机制1．3．2．1DNA甲基化的发生植物的生长发育过程中，基因组DNA甲基化模式也是逐渐变化的：而DNA甲基化的改变是有DNA甲基转移酶来调节的，这样的调节有三方面的作用：(1)基因组DNA中的去甲基化；(2)基因组DNA中的从头甲基化；(3)维持原有基因组DNA中的甲基化。DNA去甲基化恰好是与DNA甲基化相对应的一个过程，是植物整个生命过程一种重要的调节方式。目前，植物DNA去甲基化的分子机制并不明确，但对于植物DNA去甲基化的解释存在两种不同的假说：第一种假说是认为DNA去甲基化过程是一个被动的过程，这个过程与DNA的半保留复制有着密切的联系，且甲基化模式不能够遗传；在植物的传代过程中，DNA模板的甲基化被逐渐稀释从而造成了脱甲基化1921。第二种假说认为去甲基化是一个主动的过程，可能由于糖基化酶等对甲基化进行主动去除；或者是由于一些核内因子在DNA复制的过程中，结合于DNA上，进而阻碍甲基化酶识别DNA从而不能发生甲基化一引。基因纽DNA中的从头甲基化，指的是基因组中未发生甲基化的DNA引入甲基，从而形成DNA甲基化的过程。6 第一章文献综述维持原有基因组DNA甲基化，指的是甲基化模式通过遗传进行复制的一个过程。这个过程是通过DNA甲基化转移酶来实现的，利用DNA的半保留复制方式，按模板的甲基化模式，将亲代的甲基化模式遗传给子代。在这个过程当中，应该不只是DNA甲基化转移酶在起调节作用，可能还涉及到很多其它的调节因子。1．3．2．2DNA甲基转移酶无论是在植物还是在动物中，只要涉及到DNA甲基化的去除或者重建的过程，必然就要受到DNA甲基化转移酶(DNAmethyl．transferase，Dnmt)，这一重要调节因子的调控。根据DNA甲基化转移酶所催化的反应类型不同，可以将其分为三类：(1)给腺嘌呤6位N引入甲基生成N6．甲基腺嘌呤的DNA甲基转移酶；(2)给胞嘧啶4位N引入甲基生成N4-甲基胞嘧啶的DNA甲基转移酶；(3)给胞嘧啶5位C引入甲基生成C5．甲基胞嘧啶的DNA甲基转移酶。无论是在原核生物中，还是在高等真核生物中都发现有DNA甲基转移酶。在原核生物中三种酶都存在，而在真核生物中只存在第3种酶，即给胞嘧啶5为C引入甲基生成c5．甲基胞嘧啶的DNA甲基转移酶。第3种酶的甲基供体为s．腺苷．L．甲硫氨酸(SAM)。目前已在动物中鉴定了三种DNA甲基化转移酶：Dnmtl、Dnmt2、Dnmt3a和Dnmt3b。Bestor等【94】在1988年首次发现了DnmtI甲基转移酶基因，并对其进行了克隆。Dnmtl基因编码的1573个氨基酸，蛋白质分子量为190kD，在其羧基端(c．端)是催化甲基化反应的保守结构域一脯氨酸．半胱氨酸二肽，这被认为是所有的胞嘧啶甲基化转移酶的活性位点。Dnmtl的氨基端(N．端)可能与其它调节蛋白相互作用，也可能改变DNA局部双螺旋结构，从而影响羧基端(C一端)的活性。在Dnmtl甲基转移酶的氨基端(N)有一个富含半胱氨酸的区域，其结构与锌指结构类似，有可能作用于DNA大沟中的一些碱基。Dnmtl甲基转移酶在生物体内和体外都有酶的活性，将亲代的甲基化模式复制到子代。但在生物体内Dnmtl甲基转移酶不能催化DNA模板从头甲基化，而在生物体外却可以。Dnmt2甲基转移酶的结合能力较强，可在生物体外与DNA结合。其包含了胞嘧啶甲基转移酶10个保守的主要区域，例如，SAM结合域、DNA特异位点识别域。但Dnmt2甲基转移酶并不能催化DNA上面CG位点甲基化，只起着识别DNA上特异位点并与之结合的作用195】。Dnmt3a和Dnmt3b是两种从头甲基化酶，可以识别CG位点的胞嘧啶，从而引入甲基使其甲基化。这两种酶在体外也有催化活性，但是它们在催化甲基化的能力小于Dnmtl。可能是由于Dnmt3a和Dnmt3b两种甲基化酶催化甲基化的时候，还需要其它因子来调节其酶的活性ml。经研究表明，植物中普遍存在四类甲基转移酶，且它们的催化结构域都有10个基元，有5个在所有物种中都表现出高度保守的特征即l。第一类植物甲基转移酶—Met类，植物的甲基转移过程中起主要作用的甲基转移酶就是Met类，包括Metl、Met2a、Met2b、Met3等。Met类基因编码的甲基化酶在结构上与动物中的甲基化酶Dnmtl很相似，主要作用是维持DNA中重复序列和单拷贝序列中的甲基化p81。植物的胞嘧啶甲基化与控制许多性状有密切联系。在Metl的突变体中发现，CpG胞嘧啶甲基化的丢失可以使植物产生不正常的表型。目前己从西红柿、玉米等多种植物中分离出了Met基因[991。第二类植物甲基转移靴MT类(染色质甲基化酶)，这是属于植物中特有的DNA甲基化转移酶，在植物中普遍存在，其7 西南大学硕士学位论文作用是维持DNA甲基化模式。CMT类甲基转移酶的结构与甲基转移酶也很类似；但研究发现CMT-3突变不会使植物产生不正常的表型，与Dnmtl功能上又有了很大不同∞饥。第3类植物甲基化转移酶是结构域重排甲基转移酶(DRM)家族，其组成和动物中的Dnmt3很相似，只是它们的组成顺序不一样【1叭】。Dnmt3对基因组中的DNA从头甲基化起作用，DRM家族虽与Dnmt3结构类似，但其功能还不明确是否具有催化从头甲基化的作用。目前，已经知道DRM家族可能包括三个成员：DRMI、DRM2和Zmet3。第4类植物甲基化转移酶是DMTl04和DMTll，DMTl04是从玉米中发现的，而DMTll是从拟南芥中发现的；它们的结构都与DNMT2家族很相似，有可能是DNMT2的同系物；并且在许多植物中很保守，但功能尚不清楚‘1021。1．3．3DNA甲基化的遗传与变异1．3．3．1DNA甲基化的遗传无论是在动物中还是在植物中，DNA甲基化都能够被遗传的。但是植物和动物的DNA甲基化遗传模式有着很大的差异。在动物中，DNA甲基化是按照“消除．重建(Erasureandreset)”的方式在各代中进行遗传的【10那：而在植物中，DNA甲基化是通过减数分裂进行稳定遗传的【104J。经过研究发现，哺乳动物的一个表观等位基因axin-fused(AxinFu)，表型与其的一个逆转录转座子的甲基化模式有很大关系，而．4xinFu基因的这种甲基化模式可以通过父本和母本遗传给下一代¨05J。小黑麦中的研究发现，M1代植株经过甲基化抑制剂5．氮胞苷(5-azaC)处理后，一些没有在MI代植株中表达的基因在M2代植株中得到了表达【106】。这也说明了甲基化变异可以从M1代遗传给M2代，并引起M2代中相关基因表达量的改变。对于不同品种番茄的甲基化多态性研究表明，DNA甲基化多态性在番茄中是高度遗传的，并且符合孟德尔遗传定律u07J。Finnegan等对拟南芥的转基因植物和反义植物研究表明，甲基化是可以在传代过程中进行遗传的u叫j。在玉米中研究发现，Ac转座子甲基化降低的甲基化模式可以通过减数分裂稳定的遗传给子代1109]。Richards等研究发现，用拟南芥的核仁组织区高甲基化的品种和两个核仁组织区低甲基化的品种进行杂交，在Fl代植株，其中一个杂交种此区域的胞嘧啶甲基化含量按照孟德尔分离定律进行分离；另一个杂交种此区域的胞嘧啶甲基化含量在母本和父本之间，且与它们的甲基化模式一致【110]。因此，DNA甲基化的水平和受外界因素导致的甲基化的改变可以通过减数分裂从亲代遗传给子代。1．3，3．2DNA甲基化的变异高等真核生物的DNA甲基化水平和甲基化模式可以通过自己的方式遗传给子代；但在这个过程当中，如果受到外界因素的干扰或刺激，DNA甲基化会受到影响，DNA甲基化的水平和模式也会改变。在植物中，许多因素都可能使基因组DNA甲基化发生很大的改变。例如，转基因的植株甲基化分析发现，所转进的基因和转基因植株的DNA甲基化水平都有很大程度的减少(约为340／0．7l％)，而且还发现转基因植株中的DNA高度重复序列和低拷贝序列中的DNA甲基化水平都有所降低【l¨J。 第一章文献综述经研究表明，组织培养也可以使植物基因组DNA的甲基化发生改变，从而可能使一些性状发生变化。例如，番茄、胡萝b、马铃薯等的研究表明，组织培养其离体器官所产生的再生植株中，均有发现因DNA甲基化发生改变从而引起性状的变异【112】。对组织培养香蕉的再生植株进行MSAP分析表明，通过雄性花序培养获得的再生植株中DNA甲基化有3％发生变异，而通过新枝培养获得再生植株中DNA甲基化有1．7％发生变异。组织培养有可能引发DNA甲基化增加，也可能诱导其减少[113l。例如，通过玉米的幼胚组织培养获得的再生植株分析表明，再生植株与原来植株相比发生了超甲基化；而在油棕胚组织培养获得的再生植株中发现，DNA甲基化的水平比原来的植株低，并且DNA甲基化的改变造成了雄蕊雌性化的变异⋯4]。此外，植物的种间杂交、染色体数目变化、不良环境的影响都可以造成基因组DNA胞嘧啶甲基化的变异。Xiong等通过MSAP技术对两个水稻品种杂交的后代进行分析表明，杂交种旗叶总共得到1076条带中，有16条甲基化变异带(甲基化增加或者减少所表现出的带)；而杂交种幼苗总共得到的721条带中，有13条甲基化变异剖1151。Liu等通过Southern杂交技术，研究了小麦的二倍体以及其产生的多倍体，结果表明，多倍体植株中发生了广泛的基因组胞嘧啶甲基化变异，并且这种变异可以在世代间稳定遗传【1161。Steward等对玉米幼苗研究发现，低温胁迫可以使玉米根部发生大量的脱甲基化现象【11。7】；而Long等对水稻的研究也表明了，高压可以使水稻基因组相关的转座子区域发生胞嘧啶甲基化变异，并且可以将这种变异遗传给子代u瞄】。实际上，在高等生物中广泛的存在基因组DNA胞嘧啶甲基化变异，这有利于新品种的培育和扩充遗传资源，也有助于生物多样的产生，为物种的进化提供更多的机会。1．3．4DNA甲基化的生物学意义DNA甲基化是作为一种重要的表观遗传调控方式，广泛地参与动物、植物、真菌的生命活动调节‘11叫201。目前研究表明，DNA携带着两种遗传信息，一种是由自身核苷酸序列所承载的信息，另一种是由DNA结构所承载的表观遗传信息。表观调控不会改变DNA核苷酸序列的变化，但会通过调控DNA上相应基因的表达进而影响生物的性状特征【1zlJ。在高等真核生物中，5．甲基胞嘧啶(5-mC)可能是DNA发生甲基化唯一的位置。DNA的甲基化修饰使DNA的结构发生了改变，从而影响基因的表达，使DNA包含的信息更加的丰富。对于脊椎动物的研究发现，CpG位点有约60％的胞嘧啶被甲基化，并且不同的的物种和组织的甲基化水平也存在着差异[122】；而对于人类的研究表明，人类基因组约有60～70％的cpG位点胞嘧啶发生甲基化【123】。基因组DNA胞嘧啶的甲基化分布，有的地方密集，而有的地方稀疏，表现出一定的规律性；这对丁二体细胞的分裂过程发挥着重要的作用1124j。DNA发生甲基化以后，形成于DNA上的甲基可以阻碍转录因子的结合从而抑制转录的过程。被甲基化的DNA序列，还可以主动结合一些蛋白因子，例如，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)、甲基化CpG结合的蛋白(MBDs】，有助于染色质形成高级结构【125J。基因组DNA的甲基化与许多疾病关系密切。在人体中DNA甲基化变异，可以产生一些神经发育相关的疾病，例如，ICF、Rett、fragileX综合症等【I驯。在癌细胞中也发现DNA甲基化出现普遍异常的现象，研究者们逐渐意识到DNA甲基化异常与癌细胞的产生和发展具9 西南大学硕士学位论文有重要联系。经过研究发现，肿瘤细胞基因组中的重复序列常常表现出低甲基化水平，而其特定序列高甲基化的状态，这导致了基因组不稳定，从而影响基因组的表达，产生一些异常表型‘1271。在一些抑癌基因中的研究发现，高甲基化使抑癌基因不能够表达，从而导致了肿瘤细胞的发生；而通过甲基化抑制抑癌基因的表达和突变使基因不能够表达都是普遍存在的抑制方式，甚至甲基化抑制还更常见1128J。维持基因组稳定性、调控基因表达是基冈组DNA甲基化在植物中最主要的作用。目前已知DNA甲基化通过两种方式影响基因表达。第一种是直接干扰转录因子与DNA结合，从而对转录起抑制作用；而第二种是通过一些甲基CpG结合蛋白与转录因子竞争DNA上的结合位点，从而抑制转录过程【129J。目前研究表明，’基因组DNA的胞噎啶甲基化广泛参与了胚胎发育、细胞分化、基因组印迹、基因表达调控、X染色体失活、细胞记忆等生命活动；在不同组织或者相同组织的不同细胞中的DNA甲基化特异性构成了DNA甲基化图谱，无论是对动物或者是植物的生命过程，都起着非常重要的作用【l驯。1．3．4．1DNA甲基化调节基因的表达目前许多研究表明，植物基因组胞DNA嘧啶甲基化与基因的表达存在着密切的相关性。植物在不同的发育阶段或者是受到外界环境的刺激，需要开启基因表达，而此时DNA上的甲基化位点在甲基转移酶的帮助下，发生脱甲基化，从使相关的基冈的转录能够启动，表达出相应的物质来应对时空的响应。而随着生长发育的进行，一些基因需要关闭活性的时候，而甲基又会在DNA甲基转移酶的作用下，回到DNA上的相应基因位点(一般是启动子区)，阻碍转录的进行，从而关闭基因的活性。简单来说，DNA甲基化可以通过改变DNA构象、DNA稳定性、染色质结构、蛋白质与DNA相互作用方式，从而调节相关基因表达【l31J。1．3．4．2DNA甲基化与植物春化作用及开花有些植物需要经过春化作用能够促进开花。经研究表明，对春化作用敏感的植物，经过甲基试剂5-azaC处理也能够使其提早开花，但对春化作用不敏感的植物用甲基试剂5-azaC处理并不能够使其提前开花‘1321。在小麦中的研究发现，冬小麦的DNA甲基化水平比春小麦更高，经过春化作用后，DNA发生大量的脱甲基化，从而诱导开花033}。实验表明，春化作用诱导促进开花，可能是通过使开花相关的基因去甲基化从而使开花提前‘¨41。这也说明春化作用、DNA甲基化、开花三者之间存在着密切联系。1．3．4．3ONA甲基化与杂种优势在植物的生命过程中，DNA甲基化起着重要的调控作用，鉴于此，研究者们对于杂种优势开始从DNA甲基化方面进行了研究。在玉米中的研究发现，玉米的杂交种和亲本的甲基化水平存在着明显差异，亲本的甲基化水平分别为31．4％、28．3％，明显比杂交种的甲基化水平(27．4％)更高，并且还发现基因表达与DNA甲基化显著相关，相关系数为．0．739【l”J。因此，杂交种的DNA甲基化水平比亲本低，这可能会促使一些基因的表达，从而产生杂种优势。但后来在水稻中的研究表明，杂种的DNA甲基化水平(18％)高于其亲本的DNA甲10 第一章文献综述基化水平(都约为16．3％)，这就说明杂种优势不是整体的甲基化水平降低所导致的：有的基因低甲基化有利于杂种优势，而有的基因高甲基化也有利于杂种优势[1361。仪治本等研究了高粱杂交种Fl代的DNA甲基化发现，杂种优势确实与DNA甲基化模式的改变有密切联系[”71。1．3．4．4D№的甲基化与组织特异性表达经过大量的研究表明，不同组织DNA甲基化的水平和模式都存在着差异，甲基化存在着组织特异性表达。例如，红细胞中珠蛋白基因甲基化水平非常低，而非类红细胞的珠蛋白基因却存在着广泛的甲基化【1邛J。在玉米的研究中发现，胚乳中特异性表达的基因Opaque2的启动子区在一些非表达的组织中高度甲基化，例如，叶片中Opaque2的启动子区就是被高度甲基化【”91。玉米醇溶蛋白基因家族、一些编码叶微管蛋白基因等也发现了胚乳特异性的去甲基化现象1140]。在植物基因组，稀醇式磷酸丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因也存在很强的组织特异性甲基化现象，其启动子上游区域存在着甲基化的位点(PvuII)。在叉枝蝇子草(Silenelatifotia)e?，MROSl基因是雄性繁殖器官特异性表达基因，其上游序列中的CG位点胞嘧啶在花粉的发育过程中99％被高度甲基化，而在转录序列中仅有7％发生甲基化【14¨。对水稻研究表明，幼苗的基因组DNA甲基化水平和模式与充分展开的旗叶存在着很大的差异，幼苗的DNA甲基化程度明显比旗叶中更高¨4zJ。1．3．4．5DNA甲基化与转座子的关系在玉米中的研究表明，玉米存在两个转座子系统：Ac_Ds、Spin。经研究表明，转座子都是由结构单一专组分或者缺损元件组成，而转座的时间和频率等都受到发育调控”4引。在植物中，Spm转座子系统存在3种遗传形式：稳定活性形式、稳定非活性形式以及转化型。经研究表明，Spm的遗传形式与转录起始位点上游的调控区的胞嘧啶甲基化水平密切相关。非活性转座子的转录起始位点上游的CG序列的胞嘧啶为高甲基化，而活性转座子的此区域为低甲基化或者没有被甲基化。Spin转录产物可以作为反式作用因子，通过降低其他的Spm转化型转座子调控区的甲基化，从而使其得以表达；但不能够激活稳定非活性转座子的表达。Spm转录产物可以影响其它转化型转座子UCR、DCR等区域的甲基化水平，进而影响该转座子在发育调控过程当中对时相的设定。1．3．4．60NA甲基化与转基因沉默经大量的研究发现，转基因的沉默与DNA甲基化有密切联系。这可能是所转基因本身的甲基化导致的基因沉默，也可能是基因组中插入位点的甲基化导致的基因沉默。研究表明，将玉米中的Al基因转到矮牵牛中，得到3个不同插入位点的转基因品系。分析转基因植株中Al基因的转录水平发现，插入位点高甲基化的植株中检测不到A1基因的转录产物；插入位点低甲基化的植株中检测到低含量的转录产物；插入位点未甲基化的植株则可以检测到高含量的转录产物11441。转基因受到甲基化调控的模式是可以从亲代遗传到子代。对烟草的研究也发现，当外源基因Npt．II在烟草中被甲基化，其表达量随之下降，且对卡那霉素抗性降低；而用甲基化抑制剂azaC处理后，Npt-II基因在烟草中的表达量逐渐升高恢复正常，且对卡那霉素的抗性也增强1145‘。 西南大学硕士学位论文1．3．4．7DNA甲基化与亲本印迹在生物体中，通过印迹可以记录外界遗传信息。亲本印迹是指来自亲本的遗传信息可以保留在染色体的特定区域。无论在动物或者植物中，印迹基因与一般的基因不同，印迹基因是以自来亲本染色体特有的方式表达，而～般的基因在来自父本和母本的染色体上都可以同时表达。等位基因被抑制称为“印迹”，例如。在父系印迹基因座，只有母系来源的等位基因能够表达，而父系来源的等位基因不能够表达。基因印迹从分子水平上来说就是DNA甲基化。在许多印迹基因中，调控区域的甲基化印迹可以使一些母系基因或父系基因产生特异表达。目前找到了20种以上的印迹基因表达的产物，在人和老鼠的生长发育过程中起着重要的调节作用【146。。综上，目前已有许多DNA甲基化与基因表达相关的研究报道，然而尚存在许多问题需要解决。DNA先甲基化再使基因表达受到抑制。还是基因表达受到抑制之后才导致的DNA甲基化，这都是我们需要思考和解决的问题。只有通过对分子生物学进行更深入的研究，才能够彻底揭开这个疑惑。1．3．5DNA甲基化的检测和研究方法目前检测甲基化的方法有很多，大致分为3类：(1)MSAP检测方法【14”；(2)亚硫酸轻盐法1148]：(3)甲基化检测芯片技术㈣J。MSAP检测方法是从AFLP改进而来，利用的是一对甲基化敏感的同裂酶坳口II和MspI[15¨5¨。它们都识别相同的CCGG位点(真核生物主要的甲基化位点)，当双链的内外侧胞嘧啶都甲基化及任一胞嘧啶发生甲基化时，HpalI不能对其进行识别和切割，只能识别并切割一条链上的胞嘧啶甲基化(半甲基化)，而MspI对双链或单链的内部胞嘧啶甲基化都能识别并切割，但不能对外部胞嘧啶甲基化进行识别并切割。MSAP技术操作简便，易于分析，现已广泛用于许多植物的胞嘧啶甲基化模式和水平的分析{152—154)．12 第二章20个同一时期的温州蜜柑品种的MSAP分析第二章20个同一时期温州蜜柑品种的MSAP分析2．1试验材料20个同一时期的温州蜜柑品种均来自于中国农科院柑橘研究所国家柑橘资源圃。20个温州蜜柑品种，包括大分1号、岩崎早生、日南I号、温州8—76、隆园早温卅f、温州03．02、桥本、温州03—05、宫本、大浦10个早熟品种和寿太郎、尾张、清江、大津4号、宁红、伊木力、青岛、杉山、林温卅f、石川10个晚熟品种，果实取材时间为2012年lO月6日，此时正处于早熟温州蜜柑品种的转色期，而绝大部分晚熟温州蜜柑品种还未转色。本实验所做MSAP分析所用的DNA是分别提取其果实的DNA。2．2试验方法2．2．1主要溶液的配制CTAB溶液的配制：①CTAB49：②NaCi16．3649,③lmol／LTris·HCI20ml(PH8．0)i④o．5mol／LEDTA8ml。先用100mlddH20溶解，再定容至200ml，灭菌，冷却后加入400ul～2ml的D-巯基乙醇。1mol／LTris—HCI(PH8．0)溶液配制：称取12．1lgTris碱溶于75ml去离子水中，用浓盐酸将PH值调到8．0(大约加入4．5ml浓盐酸)或者7．5(需要加入约7ml浓盐酸)，冷却至室温，定容至100ml。0．5moFLEDTA(PH8．0、：称取18．619EDTA-Na．2H20溶于75m1去离子水中，用固体NaOH调节溶液PH至8．0(大约需要29NaOH，PH值调到8．0左右时EDTA-Na．2I-120才能完全溶解，最后定容至100ml。3mol／LNaAC(PH5．21：称取24．6099固体NaAC溶于75ml去离子水中，用醋酸调节PH值至5．2，再定容至100ml。苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液的配制：用移液枪分别吸取100ml的苯酚、96ml的氯仿、4ml的异戊醇，混匀于棕色瓶，低温避光保存。氯仿：异戊醇(24：1)溶液的配制：用移液枪分别吸取120ml的氯仿、5ml的异戊醇，混匀于棕色瓶，低温避光保存。引物的配制：先将装引物的离心管12000r／min离心30sec，再根据每个离-tl,管中引物的含量加入相应的去离子水，至10umol／ul。例如，离心管里有4．2nmol引物，就加入420ul的去离子水；又如，离心管里有5．5nmol的引物，就加入550ul的去离子水。13 西南大学硕_上学位论文6％变性聚丙烯酰胺工作液的配制：混合下列成分，加热溶解，定容至500mL，过滤后4"C保存备用。30％丙烯酰胺溶液(含有丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺29：1)尿素5xTBE双蒸水100ml228g100mL300mL变性胶加样缓冲液(Loadingbuffer，100％甲酰胺，10raMEDTA，0．1％溴酚蓝，O．1％二甲苯青)：混匀下列成分，4℃保存备用。去离子甲酰胺(deionizatedformamide，100％)0．5mol／LEDTA(pH8．0)溴酚蓝二甲苯青98mL2mL0．1g0．1g同定液(10％冰醋酸)：加200ml冰醋酸至1800ml双蒸水中。染色液(19／LAgN03，0．056％甲醛)：加入29AgN03和3．0ml37％甲醛至2L双蒸水中。显色液(309／LNa2C03，0．056％甲醛，2mg／LNaS203．5H20)：把609Na2C03溶于2L双蒸水中，在4-IO。C下冷却。在使用前几分钟，加入3ml37％的甲醛和400ul浓度为lOmgtml的硫代硫酸钠。2．2．2所用的MSAP引物和接头对20个温州蜜柑品种的MSAP分析的过程当中所用引物和接头见表1。表1中，HpaII．MspIadpter-5、HpaII-MspIadpter-3、EcoRIadapter-5、EcoRIadapter-3是接头序列，E+0、H+M+O为预扩增引物，剩F的序列为选择性扩增引物序列。表1用于MSAP分析的接头和引物序列Table1SequencesofadaptersandprimersusedinMSAPanalysis14 第二章20个同一时期的温州蜜柑品种的MSAP分析2．2，3DNA提取及检测20个温州蜜柑品种的果实DNA采用改良CTAB法提取‘1551。具体步骤如下：(1)将CTAB放入65℃水浴锅中预热lh，同时把异丙醇和NaAc放入一209U冰箱中预冷。(2)取一片适中大小的新鲜果皮，用酒精擦洗干净，放入研钵中，再加入少量PVP粉末，加入液氮，将叶片迅速研磨成面粉状，转入2ml离心管中，加入样品量达到离心管的l／3即可(不要多加，不然会影响裂解，使裂解不充分)。(3)加入lml预热的CTAB裂解液，并迅速摇匀，没有大块的不溶物为最佳，再放入事先调好的65。C水浴锅中温浴1h，在此期间一定要每隔15rain轻轻的上r颠倒摇晃一次。不然会容易形成褐化现象。严重影响DNA的裂解。(4)按25：24：1加入苯酚：氯仿：异戊醇(低于离心管盖子)，轻轻摇动10min，10000r／rain离心10min，取上清。(5)加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻摇晃10rain，10000r／min离心10min，取上清。(6)再次加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻摇晃10min，10000r／rain离心10min，取上清。加入预冷的0．06mlNaAc和0．6ml异丙醇，放入一20℃，30rain，8000r／min离心4min，弃上清，用75％酒精洗涤DNA2次，踪于，加入60-200ulddH20。得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度和纯度。DNA应在OD260有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug／ml双链DNA、40ug／ml单链DNA。OD260／OD280比值应为1．7．1．9，如果洗脱时不适用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pn值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。通过紫外分光光度计测定每管DNA浓度后，将用CTAB法提取的DNA稀释至300ng／ul，而用试剂盒提取的DNA稀释至lOOng／ul：因为试剂盒提取的DNA浓度明显比CTAB法提取的15 DNA浓度低。然后通过琼脂糖凝胶电泳检洲DNA的纯度，如凹幽1所提取DNA的琼脂糖凝胶电泳检测】堇I2420个温州蜜柑品种的MSAP扩增体系优化及建立要做MSAP分析．人扳的聚丙烯酰胺凝胶IU泳对PCR扩增产物要求很高，所以对于扩增体系优化的建立显得{H有必要。在将最终产物J{|丁聚丙烯酰胺凝胶电泳2前，还需要经历四个步骤：酶坍、连接、预扩增、选择性扩增。具体步骤如F：(1)模扳DNA的酶切(所Hj的酶均购丁Promega公司)MSAP酶切反戍体系包括F州成分：Ecorl05uIHpall／Msp105ul10xbuffer2u]AcelylaledBSA．10ug／ul02ul模板DNAlul(300ng)击离子水20ulL述成分混合后在37℃保温4h酶切是否能够彻底完全。主要是看所用酶的域和DNA模扳的最，以及酶切时间。柏‘20tflfI勺酶切体系中t300ngDNA，酶切4h．被证明能够充分酶切完全。传统的MSAP酶切实验，酶切过群一般都要过夜，本实验中井没有如此，是田为考虑到酶切过夜，时间太长有可能造成DNA自身的降解，从而影响厉续实验。(2)模板DNA酶切片段与接头的连接每个样品的连接反戍体系包括下列成分：模板DNA的酶切混台液12ulEcoRI接头lulHpall／MspI接头IⅢT4DNA连接酶O8ul10x1"4DNALigaseBuffer2ul 第二章20个同一时期的温州蜜柑品种的MSAP分析双蒸水补至20ul上述成分混合后于16℃下保温16h，于．20℃保存。连接产物稀释10倍后用于下一步预扩增。连接的时问要掌握好，不能太短，因为时间太短连接不上。经证明，16h或者18h都能够充分连接，为了节省时间，本实验采用16h作为连接时间。(3)DNA片段的预扩增每个样品的预扩增反应体系包括下列成分：10×Taq聚合酶buffer2ulTaqDNA聚合酶0．4uldNTPs0．4H+M如引物lulE+O引物lul模板DNA10倍稀释连接混合液5ul双蒸水补至20ul预扩增程序为：1．94℃4min2．94℃30see3．56℃lmln4．72℃Imin5．Gotostep220times6．72℃10min扩增完成后，取5ul产物用1．5％的琼脂糖凝胶电泳来检测预扩增的效果。然后取10ul预扩增产物用双蒸水稀释10倍后与未稀释的预扩增产物都于．20"C备用。(4)DNA片段的选择性扩增每个样品的选择性扩增反应体系包括下列成分：10×Taq聚合酶buffer2ulTaqDNA聚合酶0．4uldNTPs0．4uiHpall／Mspl引物1u1EeoRI引物lul预扩增产物10倍稀释液5ul双蒸水补至20111扩增程序为：1．94℃4min2．94℃30sec3．65℃30sec一0．7。C／cycle4．72℃lmin5．Gotostep2l2times6．94℃30see17 西南大学硕士学位论文7．56℃30see8，72℃lmin9．Gotostep630timeslO，72℃10rain11．4"C保存扩增完成后在扩增产物中加入4ul变性胶加样缓冲液，混匀，95℃变性5rain，立刻转移到冰上冷却。然后，取5ul变性产物在6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。2．2．5变性PAGE电泳及银染2．2，5．1变性PAGE电泳(1)玻璃板的处理本实验所用的聚丙烯酰胺电泳仪为北京六一公司所生产，玻璃板为配套的玻璃板(30cnl×25cm)，分为长玻璃板和短玻璃板。长玻璃板子的处理：先将长玻璃板用洗洁精洗净，再用大量水冲洗干净；用干净卫生纸将玻璃板上水搽干；再将干净卫生纸用95％酒精打湿，搽洗三次玻璃板；等到酒精干了之后，用移液枪吸取500ul亲和硅烷打在玻璃板上，再用棉花将玻璃板上面的亲和硅烷迅速涂抹均匀。3min后，再将干净卫生纸用95％酒精打湿，涂抹玻璃板，重复三次，以除去多余的亲和硅烷。短玻璃板的处理：用洗洁精洗净，再大量水冲洗；用干净卫生纸将玻璃板上水搽干：再将干净卫生纸用95％酒精打湿，搽洗三次玻璃板：等到酒精干了之后，用移液枪吸取2ml玻璃硅烷打在玻璃板上，再用棉花将玻璃板上面的亲和硅烷迅速涂抹均匀。5min后，再用棉花搽一次玻璃扳，以除去多余的玻璃硅烷。玻璃板处理好后，在两块玻璃板之间按上胶条，然后在用铁架子夹住除了倒胶一边的其它三边。(2)胶的制备选取一个干净韵200ml左右的烧杯用于配胶。先称取0．069的过硫酸铵(Ammoniumpersulphate，APS)；用移液枪吸取70ml事先制备好的6％的聚丙烯酰胺工作液于烧杯中，再吸取60“的四甲基乙二胺(TEMD)丁．烧杯中；将称好的过硫酸铵立刻转入烧杯中，并用枪头混匀。(3)灌胶看到过硫酸铵溶解后，开始灌胶。灌胶前要将准备好的玻璃槽倾斜一定的角度(约15度)，并且要将玻璃槽底部的两头都留一点空隙(这是为了减少玻璃槽灌胶的时候内部的压强，有利于胶溶液向底部流)。灌胶的时候，右手拿烧杯匀速缓慢地向玻璃槽倒胶，左手应拿一小碟卫生纸均匀用力的敲玻璃板(这是为了加速胶溶液的流动和不让气泡产生)。等到胶溶液流到底部的时候，再将玻璃槽两头的缝隙合上，灌胶完毕，将梳子倒插进玻璃槽的入口处。很关键的是插入梳子后，插入梳子的位置应该是没有气泡的，否则做胶失败。(4)电泳槽的组装在灌胶3h后，聚丙烯酰胺胶溶液凝固完毕，进行电泳槽的组装；将夹在玻璃板上的铁架子和玻璃槽底部的胶条取掉，并向去掉胶条的一边用枪头打入1xTBE电泳液以排除其中的气泡；将玻璃槽放入电泳槽中，然后向电泳槽的下面灌入1×TBE电泳液，使其刚好淹18 第二章20个同一时期的温州蜜柑品种的MSAP分析没玻璃槽下面的空隙；在灌入电泳液前应该先用一个铁夹子将电泳槽后面的排水管夹住，并且灌入电泳液的时候要注意，不能使其流到电泳槽下面的桌面上(因为这有可能造成在电泳的时候发生短路现象，如果不慎将电泳槽下面的桌面打湿，应用干卫生纸将其搽干，等一会儿再跑)；固定好电泳槽，再向电泳槽的上面加入1xTBE电泳液至到没过玻璃槽上面的胶；小一tl,拔出梳子，用枪头反复吸打拔出梳子的空间，将废胶打出加样孔；再将梳子正这插入玻璃槽(梳子的尖刚好插入胶就行)。(5)预电泳将电压调至1350V，电流调至100mA，功率调至60W，进行预电泳。电泳时问控制在30min。在此期间将事先准备好的选择性扩增产物，加入4ul变型加样缓冲液，混匀，用PCR仪，95"C变性5min，立刻转入冰水混合物中冷却。预电泳时间到了之后，先用10ml的移液枪反复吸打加样孔，打出其中残留的废胶，再进行加样，否则，加样孔会被堵住影响加样。(1)加样及电泳用10ul的移液枪吸取6ul的产物，缓慢匀速的将其打入加样孔。整个加样时间最好控制在25rain之内。电泳和预电泳的电压，电流，功率都一样。电泳时间大约90min。2．2．5，2银染银染包括了固定、漂洗、银染、漂洗、显色、再固定、漂洗等过程，所以要准备四个干净的盒子，分别作为固定槽、漂洗槽、银染槽、显色槽。具体步骤如下：(1)固定电泳时间到了之后，将电泳槽后面的排水管上的铁架子取掉，将电泳液放出回收；小心地将两块玻璃板取下，用薄的小刀向玻璃板的左上角或者右上角的两块玻璃板之间的胶插入，一些气泡进入两块玻璃板之间空间后，立刻用两手用力将两块板分开(用小刀是为了防止，剥离硅烷没有涂均匀，直接用力搬开有可能使胶损坏，甚至损坏玻璃)：将带胶的长玻璃板，带胶面向上(以下都是)放入固定槽里，倒入10％的固定液，淹没玻璃上的胶即可。震荡器上震荡30min。此期间可以用1000ml的烧杯，准备3杯去离子水，备用；配上显色液：称取609NaC03，用2L去离子水溶于2L的烧杯中，再将烧杯放入冰水混合物中预冷。(2)漂洗固定好了之后，将玻璃板放入漂洗槽中，用去离子水漂洗3次，每次2min，每次注意稍稍将其沥干。(3)银染将玻璃板放入银染槽中，进行染色32m／n。此期问可以用1000ml的烧杯准备两杯去离子水备用。在银染时间还剩下10min的时候，向预冷的显色液中加入3m137％的甲醛和6mg硫代硫酸钠(Sodiumthiosulfate)。(4)漂洗银染之后，先将一杯去离子水倒入漂洗槽中，再将玻璃板放入漂洗槽中漂洗，漂洗时间应严格控制在5-10see。(5)显色将显色液倒一半在显色槽中，再将玻璃板放入显色槽，进行显色；大约2min的时候开始出现条带，此时将正在用的显色液倒摔，用剩下的一半显色液继续显色，至到条带清晰可19 见。(6)再l嗣定将玻璃扳直接放^刚才所Ⅲ的l州定液中终止反麻，进行条带的闱定．时间为2～3min使条保持清晰-口见，否则显色太久条带会变得模糊不清。(7)潞洗将刚才准备的一杯古离于水倒入漂洗褙中，将再Ⅲ定过的带胶玻璃扳进行漂洗。时间为2～3min。条带清晰乩重复性好的玻璃板，进行编号，川分辨率高的单反相机进行拍照，作为分析的数据材料。26胶的回收及测序本实验中，通过跑聚丙烯酰胺凝胶【U泳获得的清晰的可重复的筹异性大的条带。对其进行同收，送英俊公司测序。聚丙烯酰胺胶的胶同收．与琼脂耱不同；聚丙烯酰胺胶的Ii嫩通过传统的胶同收试剂盒，并不能进行同收，闳为条带小，且含产：繁少。丰实验Hj了一个方便快捷的办法．对聚丙烯酰胺胶上的条带进行同收。具体步骤如F：川薄的小刀乖卟镊子配台将条带取F．艘入一个i5ml的离心管中，编上号．加入30ulTE溶液．65℃水浴lh。在65℃水浴的情况F，股上的DNA片段会有部分溶rTE溶液中。此时，H|10ul所得的DNA片段溶液，50ul体系．进打PCR扩增。扩增程序和进择性扩增程序一样。扩增引物就是扩增出此条筹异性条带的引物。取5ul扩增产物，川l2％的琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂耱凝胶电泳疆示{Ij单一的清晰明亮条带，如幽2，直接将I"CR产物送英俊公司*i序。__________________________________________________________________________________________________一三---图2重新扩增的单一条带2720个早晚熟温州蜜柑品种果实生理生化分析温州蜜柑果实在成熟度的过程中，可滴定酸含城、可溶性同形物、VC含嫱、果皮的颜色等都会发生变化，而这些变化是判断果实成熟度的重要标志．比如生产中Ii|J楚川Ⅲ酸比米衡域果实的成熟度。文章中对甲熟温州和晚熟温州进行甲基化分析，力{警I找出与成熟相芙联的标记，冈此需要在早晚熟温州品质差异较^的时埘进行采样分析，同时分析结果有利丁对早晚熟温州蜜柑品质进行判定。另外，即使是同一乩种，在不同的生态环境F(地域、气候等)．其成熟期都有可能发生根人的改变．冈此对果实品质的分析是必婴的。为比较早晚熟温州蜜柑品种在果实理化性状上的差异，对果实重城、果皮颧色、可溶性l州形物、转化糖、可 第二章20个同一时期的温州蜜柑品种的MSAP分析滴定酸、Vc含量进行了测量。测量时，每一个品种选取大小适中的10个果实。果实重量采用电子天平称量测定并取平均值，果皮颜色的测定采用色差计测量并取平均值，可溶性固形物采用折光仪进行测定，可滴定酸利用酸碱中和法测定，Vc含量利用2,6．二二氯酚吲哚酚钠滴定法进行测定。2．3结果与分析2．3．120个早晚熟温州蜜柑品种果实生理生化分析对20个温州蜜柑品种进行了果实理化性质的测试，结果见表2。在大分1号、岩崎早生、日南1号、温州8—76、隆园早温州、温州03．02、桥本、温州03．05、宫本、大浦10个早熟品种中，在10月6日可滴定酸含量最低为岩崎早生(0．33g／100m1)，最高为隆园早温州(0．79g／100rrd)，而在寿太郎、尾张、清江、大津4号、宁红、伊木力、青岛、杉山、林温州、石川10个晚熟品种中，可滴定酸最低为伊木力(0．61g／100m1)和林温州(0．61g／100m1)，最高为清"ZE(1．04g／lOOm])和大津4号(1．04g／100m1)。晚熟温州蜜柑品种中伊木力(0．6l997100m1)和林温州(0．6lg／100m1)的可滴定酸含量与早熟温州蜜柑品种中的隆园早温州(0．79g，100m1)和宫本(O．6lg／100m1)相差很近。然而，伊木力(色差Aa、Ab值分别为一13．93、11．20)、林温州(色差△a、Ab值分别为．5．03、32．30)与隆园早温州(色差△a、Ab值分别为10．30、53．13)、宫本(色差Aa、△b值分别为9。63、48．57)颜色差异较大，从其色差值可以看出隆园早温州和宫本较红和黄，而伊木力和林温州较绿和蓝。对早熟温州蜜柑和晚熟温州蜜柑品种的各理化性状进行了独立样本t检验，结果表明早熟温州蜜柑品种的可滴定酸含量极显著小于晚熟温州蜜柑品种的可滴定酸含量(p<0．01)；早熟温,Jq、I蜜柑品种的维生素c含量极显著大于晚熟温州蜜柑品种的维生素C含量(p’曲离心Imin，倒掉收集管叶|的废液，将吸附枉重新放同收集管中。(平衡好的柱f必须当大使Ⅲ)：(2)将单一的目的DNA条带从20％的琼脂糖凝胶中切F(尽蜒切除多余的部分)放入干净的离心管中，称取出腔的重鲑：(3)向腔块中加入等体积溶液PC(例如，凝胶重为oIg，其体积可视为100ul，Ⅲ9加入lOOulPC溶液：在本实验中称取得胶块重鸯}都在120ng左右，为了保证充分的溶解，,N／k的是150ulPC}存液)，50℃水浴放置10rain左右，期问不断温和地上卜I目转离心管，以确保胶块充分溶解。(若胶块的体积过火．可事先将胶块切成碎块)注意：对1‘问收小于150bp的小片段可将溶液Pc的体积增加到3倍咀提高同收率：腔块完全溶解厉最好将溶液温度降至室温f％上柱，因为吸附拄在室温时结台DNA的能力较强。凝腔完全溶解后应早现黄色．即可进行后续操作。如果胶完全溶解后溶液的颜色为桔红色或紫色．可使J；lJ10ul3M乙酸钠(PH50)将浒渡的颜色啕为黄色后再进行后续操作。溶液Pc中含有PH指示荆．当PH小于或等于7．5时溶液的颜色为黄色．此时DNA才能够有效的与膜结合，当PH值偏高时溶液的颜色变为桔红色和紫色．需要进行调帮。(4)将J．一步所得剑柑溶液加入～个平衡过的吸跗朴CB2中(吸附枉放入收集管中)，12000rpllI(～13400x90离心Imin,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放八收集管中。(5)向吸附枉CB2中加入600ul溧洗液PW(使H{前要先检卉是否E．NA．无水乙醇1，12000rpm(～13400xg)搿心lmin，倒掉收巢管l}-的废液．将吸跗柱CB2放入收集管中。注意：如果【亓|收的DNA是圳丁盐敏感的实验．例如平末端连接实验或者直接测序，PW 西南大学硕士学位论文最好加入后静置2-5min再离心。(6)重复操作步骤5(7)将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm(～13400×g)离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。(8)将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40ul的洗脱缓冲液EB，(如果回收的目的片段大于4kb，则洗脱缓冲液EB应置于65．70℃水浴预热)，窒温放置2min，12000rpm(～13400x曲离心2min，收集DNA溶液。注意：洗脱液的体积不应少于30ul，体积过少会影响回收的效率。洗脱液的PH值对于洗脱液效率有较大影u向。若后续做直接测序，需使用ddH20做洗脱液，并保证其PH值在7．0-8．5范嗣内，PH值低于7．0会降低洗脱率；且DNA产物应保存在．20"C，以防止DNA降解。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回收离心吸附柱中，室温放置2rain，12000rpm(～13400×g)离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。用1．2％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段回收的量和质量。3．2．4．2TA克隆测序通过胶纯化与回收试剂盒获得的差异性片段，用来进行TA克隆测序，所采用的是北京全式金生物技术有限公司的pEASY-TI单克隆试剂盒(pEASY-T1SimpleCloningKit)，具体步骤如下：1克隆反虑体系的建立在微型离心管中依次加入溶液：①PCR产物4ul(根据PCR产物量可适当增减，最多不超过4ul，最少不低于0．5u1)：②pEASY-TISimpleCloningVectorlul。将二者轻轻混匀，金属浴20一37℃，5min，反应结束以后，将离心管置于冰上。注意：(1)最佳插入片段DNA量载体与片段摩尔LL=I：7，可以粗略的按照IKb20ng的比例计算。例如1KbaN．z．20ng、1．5Kb加入30ng。(2)最佳载体使用量：lul。(3)最佳反应体系：3-5ul，体积不足可以补充无菌水：本实验中用的5ul的体系。(4)最佳反应时间①片段大小为0．1．1kb：5．10rain：②片段大小为1-2kb：10．15rain；③片段人小为2-3kb：15—20mira如果片段为胶回收产物，反应时间应取最大值。(5)最佳反应温度：25℃。2转化(1)加连接产物于50ulTransI．TI感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻轻混匀，冰浴20．30rain。42 第三章青岛温州和大分1号两个温州蜜柑品种不同时期的MSAP分析(2)42℃热激30see，立即置于冰上2rain。(3)加250ul平衡至室温的SOC／LB，200转，37"C放置30min。(4)取8ul，500mMIPTG，40ul，20mg／mlX．gal混合，均匀地涂于准备好的平板上，在37"C放置30rain。(5)待IPTG，X．gal被吸收后，取200ul菌液铺板，培养过夜(为得到较多克隆，4000rpm离心lmin，弃掉部分上清，保留100—150ul，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)。3阳性重组子的鉴定和测序(1)选取六个1．5ml的离心管，每个离心管中装lml的SOC／LB培养液。用10ul的移液枪从每个平板挑选6个白色克隆，连枪头分别打入准备好的离心管中，200转，37"C放置4h，完成对细菌的扩大培养。(2)培养完成以后，每个离心管中取5ul茵液进行PCR扩增。反应体系如下：10×Taq聚合酶buffer2ulTaqDNA聚合酶0．4uldNTPs0．4ulM13正向引物lul(10umol／u1)M13反向引物lul(10umol／u1)预扩增产物10倍稀释液5ul双蒸水补至20m扩增程序为：195℃5m_in295℃30see356℃30sec472℃lmin5got0230times672℃10min扩增完成后，取5ul扩增产物通过1．2％的琼脂糖凝胶电泳检测TA克隆是否成功，如图17箭头所示，表明TA克隆已经将序列转入载体成功。43 堑窒奎茎塑，：：当詈圣图17阳性重组于的鉴定(3)测序对】：已经将目的序列转入进拽体的菌液，抽取200131。送英俊公司测序，所儿|引物为M13，对谢l序结果进行序列分析。33结果与分析31青岛温州、大分1号的MSAP分析对青岛、大分I号两个温州蜜柑在七个不同时J甜的叶片和果实进行了MSAP分析，引物对E03／H+M+TCC的扩增结果显示出一条明显的甲基化差异性条带(见凹18)．在人分I号聚宴所采样的第5个时期(2013年8月17日)开始山现甲基化条带．而在叫片中没有出现甲基化条带，而青岛温州蜜槲f|勺果皮和叶片在所采样的7个时期都没有出现甲基化条带。经过TA克隆测序(见采9)．ⅫI序片段大小为151bp；在柑橘数据库中进行比对，该序列与编码组氧酸三联体家族的锌结合蛋门基因(Zinc-bindingprotein盯fhehistidinetriad(HIDfafairy)匹配一致。组氨酸三联体家旌的锌结台蛋白基冈人小为4226bp。枉引物对E05／H+M+TAA的扩增结果中，也显示出一条甲基化著异性条带(见嘲19)，人分1号叫片仅在第5个时期(2013年8月17日)，其甲基化模式发生了政变，M、H都出现带，而其它e,．q0J都只有H有带，而M没有带。在人分1号果实、青岛果实、青岛rfl片中均没有变化。经过TA克隆测序(见表I3)，测序片段人小为109bp．在NCBI上序州比对发现其序列与柑橘EST序列CX0711351匹配一致。CX0711351人小为775bp，见表10。表9引物对E03／H+B+TCC扩增结果中的差异性片段序列表10引物对E05／H+M+TAA扩增结果中的差异性片段序列TablelODifferentialsequenceobtainedbypam自E05m+Mf【AA 。j品品品赢品孟焉品船船艨船黧托撬鬣抬船热船篇：。3。24。2。5。。2。6。2。7。2：0■0围18MSAP分析青岛、大分1号两个品种得到的部分电泳图(E03／H+M+TCC)Figl8PartofelectrophoretieprofilesobtainedusingMSAPin20citrusunshius(E03斛M+1℃C)lo为人分1号果实的7个时期；8～14为青岛温州蜜柑果实的7个时期：15-21为人分I号11l片的7个时期；22-28为青岛温州蛮柑IIl片的7个时期。l～7s协ndfor7stagesofOoitaH口3"efroit；8—14standfor7stagesofAoshimaUnshiufruit；15—21standfor7stagesofOoita㈣leaves；2228standfor7stagesofAoshimaUnshiuleaves矗矗矗矗赢虑品鼎品珊M11HMlH2M13⋯14¨15。M16H¨17HMl8HMl9⋯20M2H1M2H2M2H3M24HM2⋯526M2H7M2H8／图19MSAP分析青岛、大分1号两个品种得到的部分电泳图(E05／H+II“"TAA)Fi919Panofdec盯0曲c_reticprofilesobminedwingMSAPin20citrusunshius(E05／H+M+TAA)l～7为人分I号果实的7个时期；8～14为青岛粜实的7个时明；15—21为人分1号叫片的7个时埘；22—28为青岛IIl片的7个时期。I-"7standfor7stagesofOoitawasefruit；8-14snndfor7stagesofAoshimaUnshiufruit；15—之1standfor7stagesofOoitawas@leave；22—28standfor7stagesofAoshimaUnshiuleaves 西南大学硕士学位论文 第四章讨论4．1MSAP分析植物DNA甲基化的可行性及温州蜜柑的基因组DNA甲基化水平目前，植物中的基因组DNA甲基化，已经被广泛的研究。检测DNA甲基化的方法有很多，而MSAP是非常普遍的一种检测方法。在植物中，基因组DNA甲基化通常绝大部分发生在CG或者CHG序列中的胞嘧啶，而MSAP利用的两种同裂酶tIpaII和MapI识别的位点就是CCGG序列，这对于检测植物中DNA甲基化水平具有很强的代表性。MSAP是从AFLP的改进而来，通过酶切，进行选择性PCR扩增，操作简单；从理论上来说，所有酶切位点经过酶切后都能够被扩增出条带来，就检测效率而言，通过MSAP检测基因组DNA甲基化，就目前而言算得上相当高的。对油菜的研究表明，MSAP方法检测甲基化水平和HPLC方法检测甲基化水平的结果是一致的，但整体甲基化水平偏低一些【l⋯7。。在拟南芥中，通过比较测序和MSAP分析基因组DNA甲基化，再次证明了MSAP检测基因组DNA甲基化的可靠性和准确性‘1581。至今，MSAP已经被广泛用于水稻‘1591、小型1601、香蕉【1611、苹果u621、马铃薯‘1631、棉花【164]、油棕‘1651、西瓜【166]等的基因组DNA甲基化的研究。MSAP方法的最大优点就是操作简便、成本低、效率高。通过MSAP分析，对差异性条带测序，得到差异性条带序列，从而将基因表达与甲基化调控直接联系起来。MSAP技术是一种研究植物基因组DNA甲基化的非常有效的方法，但其也有局限性。首先，MSAP分析要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测条带，一般用的6％的聚丙烯酰胺胶；而经研究表明，这只能检测分子量大小为50-1500bp的片段[167]。其次，在植物中，基因组DNA甲基化位点以三种模式存在：CG、CHG和CttH，其中H代表A、c或T，而同裂酶HpMI和Mspl只能识别CCGG位点的甲基化，不能够识别其它位点的甲基化【168】。第三，MSAP是利用的一对同裂酶枷Ⅳ和MspI,识别相同的CCGG位点，切割不同的位置，产生差异条带，从而在聚丙烯酰胺胶上显示出甲基化模式；对于CCGG位点，当双链都有甲基化发生的时候，HpaII不能对其进行识别并切割，只能识别并切割一条链上的胞嘧啶甲基化(单链甲基化)；而YspI对双链或单链的内部胞嘧啶甲基化都能识别并切割，但不能对外部胞嘧啶甲基化进行识别并切割。这就造成了单就CCGG位点的甲基化也不能够统计完全，例如，CCGG位点的双链外侧胞嘧啶都甲基化，HpaII和施p』两种酶都不能对其进行识别并切割，在通过聚丙烯酰胺电泳后，聚丙烯酰胺胶上此甲基化位点不能够呈现出甲基化条带。又如，CCGG位点只有在单链内侧胞嘧啶甲基化的情况下，HpaIf和MspI两种酶都能对其进行识别并切割，聚丙烯酰胺电泳之后的聚丙烯酰胺胶上呈现的条带是一样的，并不能看出此位点有胞嘧啶甲基化的存在。综合上述原因，通过MSAP方法统计到的基因组DNA甲基化水平是一个相对的水平，比其自身的甲基化水平略低1169J。目前，在柑橘中的果实发育与成熟的分子机制尚不清楚。本文首次运用MSAP技术对早晚熟温州蜜柑品种进行了DNA甲基化分析。在本实验中，20个早熟和晚熟温州蜜柑品种，从10月6日果实理化性状的分析结果来看，晚熟温州蜜柑品种与早熟温州蜜柑品种之间可滴定酸含量、VC含量、果皮色差都具有极显著差异。由于本文对早晚熟温州蜜柑品种的甲基化进行分析。力图找到与成熟相关联的标记，因此，此时是分析早晚熟温州蜜柑品种之间甲基化差异的最佳时期。利用MSAP技术，检测到20个温州蜜柑品种中，基因组CCGG位点47 西南大学硕士学位论文总的甲基化发生率为33．73％，总的外部甲基化率为7．62％、内部甲基化率为26．1l％。这只是对温州蜜柑品种基因组的一小部分胞嘧啶进行的甲基化检测，由此可以看出，甲基化在温州蜜柑品种中的发生频率是非常高的。在早熟温州蜜柑品种中，CCGG位点的外部平均甲基化率(8．47％)高于晚熟温州蜜柑品种的外部平均甲基化率(6．74％)，而温州蜜柑早熟品种CCGG位点中的内部平均甲基化率(24．98％)明显低于晚熟温州蜜柑品种的内部平均甲基化率(27．27％)。这表明温州蜜柑品种在成熟的过程中，CCGG位点甲基化的模式发生了较大的变化，并且呈现出外部甲基化在成熟过程中增多，而内部甲基化减少的趋势。本次检测的20个早晚熟温州蜜柑品种中，lo个早熟温州蜜柑品种总的DNA甲基化水平(33。45％)略低于晚熟温州蜜柑品种总的DNA甲基化水平(34．01％)。本次所采样品中，10个早熟温州蜜柑品种的果实已经开始成熟，果皮呈现出黄色；而此时的10个晚熟温州蜜柑品种的果皮颜色绝大部分都是绿色，其成熟度与早熟品种相差很大。这有可能是某些与成熟相关的基因发生脱甲基化，使其能够表达，从而启动了温州蜜柑果实的成熟过程。在番茄的研究发现，CNR、NOR、RIN等与成熟相关的基因发生甲基化，可以抑制其表达，从而阻碍果实的成熟：而这些基因的脱甲基化将会启动果实的正常成熟过程[170]。本次试验中，在20个早晚熟温州蜜柑品种中的CCGG位点上，外部胞嘧啶甲基化均远少于其内部甲基化，与洪柳掣17u对脐橙的研究结果一致，这可能与柑橘的一些特有的性状有重要联系。4．220个早晚熟温州蜜柑品种间的甲基化特异性及差异性序列柑橘是热带和亚热带地区最重要的水果之一。温州蜜柑是我国乃至东亚地区栽培面积最大的宽皮柑橘品种，具有重要的经济价值。由于温州蜜柑芽变材料多，基因遗传背景较为一致，因此，温州蜜柑是研究果实发育与成熟的理想材料，通过表观遗传学研究早晚熟温州蜜柑品种问的差异，对揭开柑橘的成熟机制，深入理解柑橘的成熟过程具有重要的作用。温州蜜柑品种类型众多，生产上主要根据成熟期差异而将其分为特早熟、早熟、中晚熟等类型，由于绝大多数温州蜜柑品种来源于芽变选系，因此在DNA水平上的差异很小‘172-1731，即使在成熟期上存在显著差异的温州蜜柑品种，用一般的分子标记技术往往也难于区分。基因组DNA甲基化在植物中普遍存在，在不同的物种之间、同一物种的不同组织之间以及同一组织的不同发育时期之间的DNA甲基化都存在差异；然而，甲基化的模式却是可以稳定的从亲代遗传到子代，并且符合孟德尔遗传分离定律11741。也就是说在没有内部因素和外部环境刺激其甲基化突变的情况下，同一物种的同一发育时期的DNA甲基化模式应该是一样的。因此，通过取同一时期的材料，鉴定其同一位点的DNA甲基化差异，就可以鉴别出肉眼难以区分的品种。洪柳和邓秀新通过对24个脐橙的MSAP分析发现，24个脐橙品种中有12个被鉴别出来Il75J。在本实验中，20个温州蜜柑品种中有13个表现出了甲基化特异，I生。事实表明，MSAP不单单是一种分析基因组DNA甲基化的技术，更是一种鉴别品种的有效途径。本实验用了18对MSAP扩增引物，显示出沮州蜜柑品种之间甲基化多态性非常高，说明利用MSAP检测温州蜜柑甲基化多态性非常有效，今后可以考虑通过MSAP技术来鉴别温州蜜柑品种。DNA甲基化是表观遗传调控的一种形式，在植物中普遍存在。它涉及到转录组调节、胁迫应答等，此外它在保护基因组的完整性，不被转录原件和其它重复序列活动干扰方面扮演48 第四章讨论着重要作用邮¨771。最近研究表明，番茄中CNR位点突变，其等位基因启动子区上游区域发生高度甲基化，致使其表达量急剧下降，从而导致果实不能成熟，果实对外部乙烯处理缺乏应答效应‘178_179]。由此可以看出，甲基化是调控果实发育与成熟的重要因素。然而，在柑橘当中甲基化对其成熟的影响还未见报道。本实验中，扩增引物E03m+M+TAA的扩增结果，有一条差异性条带在10个早熟温州蜜柑品种中有7个都表现出甲基化，而10个晚熟温州蜜柑品种中7个没有表现出甲基化，这说明此位点的甲基化与温州蜜柑果实的成熟密切相关。测序结果表明此基因编码的是G．蛋白Ⅱ亚单位。在植物中，G蛋白是细胞内信号传导途径中起着重要作用的GTP结合蛋白，由Ⅱ，D，^，三个不同亚基组成，在信号转导过程中起着分子开关的作用l】弘州¨。G-蛋白d亚基上具有GTP和GDP结合位点，且G．蛋白旺亚基具有GTP水解酶活性，可以将GTP水解为GDP：G．蛋白a亚基与GDP结合时，G蛋白为非活性状态，三体G蛋白以三聚体形式存在；G-蛋白u亚基与GTP结合时，G蛋白为活性状态，三体G蛋白a亚基与B、Y二聚体分开：G-蛋白旺亚基的GTP水解酶活性影响GTP的水解，因此决定了G蛋白的存在状态【l犯‘1酆J。已有研究表明，G-蛋白信号调节蛋白在植物种子萌发过程当中，对糖和脱落酸变化的信号调节起着重要的作用【184】。温州蜜柑果实接近成熟时，可溶性糖的含量在逐步增加。脱落酸(ABA)可以促进糖的积累，在调节跃变型果实和非跃变型果实成熟的过程中发挥着重要的作用u船J。因此，编码G．蛋白d亚单位的基因对温州蜜柑品种果实的成熟与发育可能发挥着重要的作用，而甲基化是影响基因表达调控的一个重要因子。引物对E04／H+M+TAA的扩增结果中显示的在早晚熟温州中出现一条差异性条带，经过测序比对得出的结果是与柑橘EST序列中的Cx052976．1完全匹配，目前该基因功能尚不清楚，但可能与果实的成熟有一定联系，并且该基因也可能受到甲基化调控。4．3青岛温州和大分1号的甲基化差异序列青岛温州和大分I号两个温州蜜柑品种是成熟时间差异很大的两个品种，再加上他们的遗传背景相对来说比较近，所以有利于他们成熟过程中基因组DNA甲基化调控的研究。在对青岛温州和大分1号7个时期的基因组DNA进行甲基化分析时，引物对E03／H+M+TCC的扩增结果显示出一条带在大分l号果实的第5个时期(2013年8月17日)开始发生了甲基化，而青岛温州叶片、果实和大分1号叶片中此带都没有出现甲基化。大分l号是早熟温州蜜柑品种，青岛是晚熟温卅f蜜柑品种。大分I号先于青岛成熟可能是由于大分l号第5个时期该片段所对应的基因发生了甲基化从而启动了果实的成熟。换言之，温州蜜柑果实成熟的早晚很可能是由于甲基化改变造成的。TA克隆测序结果表明，此基因为编码组氨酸三联体家族的锌结合蛋白基因(Zinc-bindingproteinofthehistidinetriad(HIT)family)。在人和动物中研究发现，组氨酸三联体(HIT)基因家族的一员脆性组氨酸三联体基因(FHIT)编码的FHIT蛋白是一种典型的二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，能将Ap3A等底物水解成ADP和AMP，Zn2+可以抑制其活性：FHIT基因突变将影响Ap3A水解酶活性，使Ap3A水平升高：而Ap3A是ATP类似物，可以抑制蛋白激酶活性，其水平升高可以增强生长信号传导途径，阻碍抑制途径或凋亡通道；此外，FHllr蛋白还可以修饰mRNA，影响一些重要基因mRNA的翻译¨陆懈“。在温州蜜柑果实发育过程中，组氨酸三联体家族的锌结合蛋白基因可能经过类似于49 西南大学硕士学位论文阴I，r基因的途径，其在受到甲基化抑制之后的表达量下降，Ap3A水解酶活性减少，Ap3A水平升高，生长信号传导途径增强，从而调节果实的发育过程：也可能通过修饰mRNA，直接影响mRNA的翻译，从而调控果实的发育与成熟。E05／H+M+TAA的扩增结果显示有一条带在大分1号叶片第5个时期，开始发生甲基化的改变，然后第6个时期又恢复到原来的甲基化模式，而大分1号果实、青岛果实、青岛叶片均没有此变化。这有可能是大分1号早熟温州蜜柑品种在成熟的过程中，其成熟信号促使了其甲基化模式的改变，从而使其他一些与成熟相关的信号转导物质得以表达。TA克隆测比对发现该序列与柑橘中的EST序列CX071135．1匹配一致；该基因的功能目前尚不清楚，可能在果实成熟过程中受到甲基化的调控，进而影响果实的成熟。4，4两种不同提取DNA方法的MSAP分析及聚丙烯酰胺凝胶电泳MSAP是一项对于DNA纯度和浓度的控制要求都比较高的技术。在整个实验当中，用了两种不同的DNA提取方法。对于20个温州蜜柑品种的MSAP分析，用的CTAB提取法提取的DNA：而对于青岛温州、大分1号两个品种不同时期的MSAP分析，提取DNA用的是DNA提取试剂盒。根据本实验的观察，所用两种提取DNA的方法进行的MSAP分析，效果上表现出了一些差异。用CTAB法提取的DNA量大，而用DNA提取试剂盒提取的DNA量要小的多；但是用DNA提取试剂盒过柱提取的DNA一般没有RNA或者RNA片段，但用CTAB法提取的DNA一般情况下，即使用RNA酶去除了RNA也会残留有些RNA片段在DNA溶液中(1，2％琼脂糖凝胶电泳可以检测到)。这样看来用DNA提取试剂盒，通过过柱的DNA纯度，要比用CTAB法提取的未过柱的DNA要高；似乎用试剂盒提取的DNA更适合用于做MSAP分析。然而，在本实验中观察到的结果并非如此。用CTAB法提取的DNA用于MSAP分析，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳以后，呈现出的条带，要比试剂盒过柱提取的DNA做出的MSAP聚丙烯酰胺电泳条带，要粗得多。这并不仅仅是由于CTAB提取的DNA浓度比试剂盒提取的高很多的原因。经过对比发现，即使将二者提取的DNA量调整到一样用于MSAP分析，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出来的带，结果也是通过试剂盒过柱法提取的DNA的聚丙烯酰胺胶上条带要细很多。出现这种情况的原因，有可能是DNA提取试剂盒里面加的一些物质影响了MSAP的酶切，从而影响了后面的PCR扩增，进而使后面扩增出的条带浓度减低，聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现出的条带较细或弱。由于通过DNA提取试剂盒提取的DNA用于MSAP分析，最终呈现的条带要细很多，因此在后面的跑聚丙烯酰胺的过程中，要注意更多的细节，如果不控制好，就很容易使聚丙烯酰胺胶上显示的电泳图模糊，不容易辨别条带。在银染过后的显色过程当中，所用的显色液一般要冷却，这是为了降低显色速度，更好的把控显色终点：但仅仅如此，只能使显色速度放馒，不能够使显色均匀，换言之，显色的过程中有可能出现左右或者是上下显色不均匀，一边颜色已经很深，另一边的颜色却很浅或者还没显出来，这就容易使带模糊不清，不利于后面的分析。为了解决此问题，本实验中发现只是通过振荡器振荡的效果并不明显。在显色的时候，将玻璃板放在显色槽中间，显色槽置于振荡器上，需一边震荡一边用带手套的双手将显色液往玻璃板中间赶，这样才能使玻璃板的上胶条带显色均匀，得到清晰的条带。进行50 第四章讨论银染之前，必须要通过10％的醋酸固定。在振荡器上振荡，固定时间至少要30rain，这个时候的二甲苯青条带已经消失。在本实验中发现，固定30min、lh、2h、3h、4h，对后面的显示出来的条带将没有影响。在固定过后的银染过程，时间的把控非常重要，银染的时间不够，后面显色出来的条带将显得非常淡，如果银染时间太久，条带将会模糊不清；本实验通过比较发现银染32min，可以得到清晰的条带。在银染过程与显色过程之间，有一个5—10see的漂洗过程；这个过程的时间非常短，却也非常关键，时间稍微长一点将会使胶上刚染上的银离子被漂洗掉，致使后面显出来的条带很淡。为了便于操作，可以直接用两只手端着玻璃板在装着去离子水的漂洗槽中晃荡，直接数5sec。4．5论文的创新点及不足4．5。1论文的创新点(1)本文应用MSAP技术对温州蜜柑品种的基因组DNA胞嘧啶甲基化进行分析，研究温州蜜柑品种在成熟过程当中DNA甲基化模式的改变。得到了初步进展，发现在成熟的过程当中，CCGG位点胞嘧啶甲基化的模式发生了较大的变化，并且呈现出J"t-部甲基化在成熟过程中增多，而内部甲基化减少的趋势。(2)本文将温州基因组中一些基因甲基化模式的改变与成熟性状相联系起来。研究发现，组氦酸三联体家族的锌结合蛋白基因(Zinc．bindingproteinofthehistidinetriad(HIT)family)、G．蛋白a亚单位基因(G-proteinalphasubunit)以及两个EST序列CX052976．1和CX071135．1的甲基化模式的改变可能与温州蜜柑果实的成熟有密切联系。这可为今后研究柑橘果实成熟的分子机理提供一定的理论依据。(3)本文将MSAP用于研究温州蜜柑品种之间的甲基化特异性。研究表明，MSAP是研究温州蜜柑品种之间甲基化特异性的一种非常有效的方法，20个温州蜜柑品种中有13个品种表现出甲基化特异性。4．5．2论文的不足之处(1)本文中通过对温州蜜柑基因的DNA胞嘧啶甲基化分析，找到的两个与成熟相关的基因以及两个EST序列，没有对其功能进行验证，今后可以通过基因克隆技术来进一步验证其功能。(2)DNA甲基化是表观遗传很重要的一个研究内容。本文采用的MSAP方法分析早晚熟温州蜜柑品种的甲基化差异，简单适用，但也有一些弊端。例如，其不能统计非CCGG位点的甲基化位点，而且CCGG位点的甲基化也不能统计完全。今后可以通过重亚硫酸盐测序的方法来分析温州蜜柑早晚熟品种的甲基化差异，其可靠性和精确度都更高。51 西南大学硕士学位论文52 第五章结论本实验是以早熟温州蜜柑品种和晚熟温州蜜柑品种为试验材料，采用MSAP方法结合测序技术对其进行研究。一方面，分析了温州蜜柑品种整体的基因组DNA胞嘧啶甲基化水平以及早熟和晚熟温州蜜柑品种间的DNA甲基化差异：另一方面，分析了早熟温州蜜柑品种和晚熟温州蜜柑品种在成熟过程中DNA甲基化模式存在差异的基因。通过本实验的研究分析，得到以下主要结论：(1)在本实验中，共使用18对引物对酶切产物进行扩增，18对引物都显示出品种之间有差异，大分l号、岩崎早生、日南l号、温州8—76、隆园早温州、温州03—02、桥本、温州03—05、宫本、大浦、寿太郎、尾张、清江、大津4号、宁红73—19、伊木力、青岛、杉山、林温州、石川20温州蜜柑品种中，温州8—76、隆园早温州、桥本、清江、大津4号、伊木力、石川、青岛、岩崎早生、温州03—02、桥本、宁红73一19、杉山13个品种表现出了甲基化特异性。这表明MSAP技术对于检测温州蜜柑品种的基因组DNA胞嘧啶甲基化非常有效，而温州蜜柑品种从形态学或者一般的分子标记都难以鉴别，今后可考虑将MSAP技术用于温州蜜柑品种的鉴别。(2)对20个同一时期的早晚熟温州蜜柑品种的MSAP分析表明，早熟温州蜜柑品种和晚熟温州蜜柑品种之间的DNA甲基化模式和甲基化程度差异都很大。早熟温州蜜柑品种的CCGG位点胞嘧啶外部平均甲基化(8．47％)明显多于晚熟温州蜜柑品种的外部平均甲基化(6．74％)；而早熟温卅I蜜柑品种的CCGG位点胞嘧啶内部平均甲基化(24．98％)却明显少于晚熟温州蜜柑品种的内部平均甲基化(27．27％)；在20个早晚熟温州蜜柑品种中的CCGG位点上，位点的外部甲基化均远少于其内部甲基化，检测到的外部平均甲基化率为7．62％，而内部平均甲基化率为26．11％：早熟品种温州2003-02温州和桥本两个品种在CCGG位点检测到的胞嘧啶外部甲基化最高，分别为15．28％、15．46％，晚熟品种中的大津4号的CCGG位点检测到的胞嘧啶外部甲基化也高达13．77％，而其他品种均远低于这个水平。在晚熟品种伊木力中检测到CCGG位点胞嘧啶内部甲基化高达44．37％，远高丁其他品种的内部甲基化水平。早熟温州蜜柑品种总的甲基化水平(33．45％)略低于晚熟温州蜜柑品种总的甲基化水平(34．01％)。这表明温州蜜柑在成熟的过程中总的甲基化水平在降低。(3)对20个同一时期的早晚熟温州蜜柑品种以及青岛温州和大分1号两个温州蜜柑品种不同时期的MSAP分析，标记到两个与成熟相关的基因编码G．蛋白伐亚单位基因(G-proteinalphasubunit)和编码组氨酸三联体家族的锌结合蛋白基因(Zinc—bindingproteinofthehistidinetriad(HIT)，以及两个与成熟相关的EST序列CX052976．1和CX071135．1；它们的甲基化模式在早熟温州蜜柑品种和晚熟温州蜜柑品种之间，或者是在同一品种的不同生长时期，存在着显著差异，说明其在温州蜜柑品种的成熟过程中扮演着重要的作用，并且受到甲基化的调控。(4)为了比较早晚熟温卅l蜜柑品种理化性状之间的差异，对20个温州蜜柑品种进行了果实理化性质分析。结果表明，此时，早熟温州蜜柑品种和晚熟温州蜜柑品种之间的可滴定酸含量、VC含量以及色差值都存在着显著差异；温州蜜柑果实转色成熟的过程中，可滴定酸含量逐渐的减少，而VC含量逐渐的增DD"而固形物、单果重与色差、可滴定酸的相关性并不显著。53 西南大学硕士学位论文 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西南大学硕士学位论文曼曼曼曼曼曼皇昌鼍皇鼍詈鼍皇曼皇曼曼曼曼皇曼曼皇曼曼曼I——I—邑量量量皇曼量曼曼曼皇曼曼皇曼曼兽曼曼曼鲁——曼邑罾皇量蔓皇曼曼pressurization[J]．Biochem。Bioph。Res。Co．，2006，340：369．376。【l19】“E，JaenischR．DNAmethylafionandmethyltransferases．／n：DNAAlterationsinCancer：GeneticandEpigeneticChanges(Ehrlich，M，ed)，EatonPublishing，Natick，MA．2000，351-365．[120】Mart／enssenRA，ColotV=DNAmethylationandepigeneticinheritanceinplantsandfilamentousfungi[J]．Science,2001，293：1070—1074。【121]特怀曼RM著，陈淳，徐沁，等译．高级分子生物学要义[M]．北京：科学出版社，2001：85．94．【122]BestorT，LaudanoA，MattalianoR，Ingrainv．Cloningandsequncingofmousecells．Thecarboxyl—terminaldomainofthemammalianenzymesisrelatedtobacterialrestrictionmethytransferases[J]．dMoIBiol，1988，203：971-983．[123】BirdAECpG-richislandsandthefunctionofDNAmethylation[J]．Nature，1986，321：209．213．[124】BestorT’LaudanoA，MattalianoR，IngramV．Cloningandsequncingofmousecells．Thecarboxyl．terminaldomainofthemammalianenzymesisrelatedtobacterialrestrictionmethytransferases[J]．JMolBiol，1988，203：971-983．[125]BirdAP．CpG-richislandsandthefunctionofDNAmethylat[on[J]．Nature，1986，321：209—213．I126]JonesPA，TakaiD．TheRoleofDNAMethylationinMammalianEpigenetics[J]．Science，2001，293：1068—1070．【127】JonesPA，LairdPW．Cancerepigeneticscomesofage[J]．NatGenet，1999，2l(2)：163．167．【128】JonesPA，BaylinSB．Thefundamentalroleofepigeneticeventsincancer[J]．NatureRevGenet，2002，3：415-428．[129JCurradiM，ZzoA，BadaraccoGcta1．MolecularmechanismsofgenesilencingmediatedbyDNAmethylation[J]．IdolCeltBiol，2002，22：3157—3173．[130】MonkM，BoubelikM，LehnertS．TemporalandregionalchangesinDNAmethylat[onintheembryonic，extraembryonicandgermcelllineagesdunngmouseembryodevelopment[J]．Development,1987，99：371-382．【131]WasseneggerM．RNA-directedDNAmethylation[J]．PlantMolBiol,2000，43(2—3)：203—207．【132]侯雷平，李梅兰．DNA甲基化与植物的生长发育【J】．植物生理学通讯，2001，37(6)：584．587．【133]ShermanJD，TalbertLE．VernalitioninducedchangesoftheDNAmethylationpaReminwinterwheat[J]．Genome，2002，45：253—260．【134】BastowR，MylneJS，ListerC，eta1．VemalitionrequiresepigeneticsilencingofFLCbyhistonemethylat[on[J]．Nature，2004，427：164—167．[135】TsaflarisAS，KafkaM．Mechanismsofheterosisincropplants[J]．JCropProduction，1998．1：95-111．[136】XiongLZ，XuCGSaghaiMaroofMA，eta1．Patternsofcytosinemethylationinanelitericehybridanditsparentallinesdetectedbyamethylat[on-sensitiveamplificationpolymorphismtechnique[J]．M01．Gen．Genet．，1999，261：439-446．[137]仪治本，孙毅，牛天堂．高粱基因组DNA胞嘧啶甲基化在杂交种和亲本间差异研 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西南大学硕士学位论文 附录附录缩略词表ACC：aminocyclopropano-I—carboxylicacidCNR：colorlessnon-ripeningERF3：ethyleneresponsefactor3GF：greenfleshGR：green-ripeHPl：highpigment1HP2：highpigment2MADs．box：MCMlAGAMOUSDEFIC正NSSRFMSAP：methylafiortsensitiveamplificationpolymorphismNCED1：9-cis-epoxycarotenoiddioxygenaseNOR：non-ripeningNR：never-ripeRIN：ripening-inhibitorSBP：SQUAMOSApromoterbmdmg1_氨基环丙烷一1一羧酸无色不成熟基因乙烯响应因子3浅绿色基因成熟绿色基因高色素l基因高色素2基因～类重要的转录调控因子甲基化敏感扩增多态性9-J顿式．环氧类胡萝卜素双加氧酶不成熟基因永不成熟基因迟熟基因SQUAMOSA启动子结合蛋白67 珏南大学硕士学位论文 参加科研项目和发表文章本研究主要得到以下项目资助：[11国家自然科学基金资助项目：柑橘高密度遗传图谱构建与单条染色体识别研究(项目编号：31272138)[2】国家十二五计划：主要常绿果树新品种选育：柑桔新品种选育研究(项目编号：2013BAD02802)，2013．2017[3】中央高校基本科研业务费项目：甜橙高密度分子遗传图谱构建与染色体特异标记发掘(项目编号：XDJK20128019>发表文章：【1】陈志友，赵樱，江东．夕h源NO缓解果树胁迫的作用机理和研究进展．中国南方果树，2013，42(2)：44．47．[2】陈志，陈志友，龙治坚，韩国辉，党江波，王莹，汪卫星，李晓林，孙海燕，梁国鲁，向素琼．67份枇杷属种质资源遗传多样性的SSR分析．西南大学学报(自然科学版)，已接收。69 西南大学硕士学位论文70 致谢时间如流水，三年弹指一瞬间!转眼，美好而愉快的研究生生涯即将结束!回顾这三年时光，我在学业、科研和生活上得到了众多老师、同学和朋友们的热心帮助和一如既往的支持。在此，向他们表示感谢!一日为师，终生为师!首先，我要感谢我的两位恩师一江东副研究员和向素琼研究员!我能够成为二位的弟子，深感荣幸!从毕业论文从选题、实验设计、试验方案的确定、试验的实施到完成、以及论文的撰写无不凝聚着江老师和向老师的心血和智慧。二位恩师渊博精湛的学识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，孜孜不倦、持之以恒的师表风范永远是我学习的榜样；高度的责任心和不倦的教诲，宽厚待人的品格，对学生平易近人的态度，令我深深感动，永远敬仰。当我在学习中遇到难题时，向老师和江老师不厌其烦的耐心教导我：当我做错事情时，您们以一颗宽大包容的心去宽容我。向老师和江老师不仅在学习中给了我大力的指导，也以自己的言行教会了我许多做人、做事的道理。同时，我也要衷心的感谢江老师和向老师这三年来在生活中给予我的鼓励、关心和帮助，您们的关怀让我觉得无比的温暖。在此，谨向江老师和向老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。感谢研究生期间在学业上给予我指导和帮助的老师们：梁国鲁研究员、郭启高副研究员、汪卫星副研究员、孙海燕老师，赵晓春研究员等等。老师们的言传身教，让我受益颇丰，在此，谨向各位老师表示诚挚的敬意和谢忱。感谢在各个方面给予我帮助的龙治坚师兄!感谢在实验和生活中给我帮助的马岩岩师姐和张军师兄夫妇，张旭辉、陈志、高恒锦师弟，王莹和陈娇师妹以及王福生师兄和曹明浩师兄!感谢陪我一起度过研究生生涯的同学：唐佳佳、姜婉、徐波、刘超、吴天娇、刘琦琦、于宝奎、褚福堂等等!感谢赵樱对我的实验和生活的帮助!一路上有你陪伴，我～直感觉很幸福!最后，感谢我的爷爷奶奶、父母、姐姐和哥哥!多年来是你们的支持让我在求学的道路上义无反顾勇往直前。谢谢你们无怨无悔的付出，让我没有后顾之忧专心学习，您们是我坚强的后盾。感谢亲友这么多年对我生活和学习的关一Ii,和支持，真心的谢谢你们。春风飒爽，橘花飘香!在这毕业之际，感激之情无以言表，唯有志当存高远，立于世，报以行!陈志友2014年6月2曰7l 强南大学硕士学位论文