中华蜜蜂头部cdna芯片研制及基于芯片的抗螨性研究 58页

浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝婆盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：]嘲字日期：7一号年∥月r日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解溢鎏盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位敝储签名：袖命一咚，签字日期：纠K年伽歹日III导师躲陋乞孚签字眺硼年多月厂日 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究第一章文献综述1．1中蜂抗螨行为学研究进展1．1．1前言养蜂业在我国具有很重要的经济地位，作为我国传统养殖业，已有3000年以上的悠久历史，在中华民族发展史上具有非常重要的地位和作用。我国是世界养蜂大国，目前全国养蜂量在700多万群以上，占全球蜂群总数的1／7左右，养蜂人数高达20余万人。2006年蜂蜜产量达33．3万吨，蜂王浆约3000吨，蜂产品产量和出口量均居世界第一(中国统计年鉴，2007)。但与此同时，一些长期困扰我国养蜂业健康发展的问题，在日趋激烈的国际贸易竞争中也日益突出，特别是生产过程中防治蜂病所造成的农药残留问题，直接影响蜂产品质量，经常遭遇国际贸易绿色壁垒。大蜂螨是对世界养蜂业威胁最大的蜜蜂病虫害。长期以来，由于意蜂治螨过度依赖化学杀虫剂，导致螨虫抗药性提高，蜂产品中农药残留问题日趋严重，促使蜂种抗螨性，特别是中华蜜蜂(中蜂，和括ceranacerana)等东方蜜蜂(彳．cerana)的抗螨行为和机制受到重视(李旭涛，2001)。利用中蜂抗螨行为相关基因，通过遗传工程培育和改良意蜂品种受到国际上的高度关注(黄文诚，1995)。利用基因芯片，在分子水平上研究中蜂的抗螨机理，对加快养蜂业品种的选育，寻找新基因、疾病诊断、药物筛选等均具有重要的价值。1．1．2中蜂抗螨行为学概述大蜂螨(狄斯瓦螨，VarroadestructorAnderson&Trueman)是对世界养蜂业威胁最大的蜜蜂病虫害，现在，世界上除了澳洲之外，各地西方蜜蜂(A．mellifera)几乎都有蜂螨寄生，不只如此，澳洲新西兰的蜜蜂近年来也遭到蜂螨的侵害(宋延明，2007)。大蜂螨于1953年在前苏联发现危害，我国予1955年在浙江发生，随后大蜂螨在亚洲及东欧传播，上世纪70年代先后传入中、西欧，80年代后期先后传播到美国、加拿大等国家(周婷等，2007)。大蜂螨是严重危害引进西方蜜蜂，包括意大利蜜蜂(意蜂，A．melliferalingustica)的蜂5 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究螨。大蜂螨若寄生在封盖内，则使蜂蛹发育不良，对西方蜜蜂蜂群的危害是毁灭性的、一般蜂群一每年要用药物防治4-6次，否则会遭到毁灭性损失(王强等，2004)。但大蜂螨对亚洲土著蜜蜂东方蜜蜂包括其亚种，原产于我国的中蜂则没有明显的危害。虽然我国在1956年就发现中蜂有大蜂螨寄生，但长期以来大蜂螨对中蜂一直未造成明显危害，其原因是中蜂为土著大蜂螨的原始寄主，在长期的协同进化的过程中，大蜂螨已经与寄主形成近似共生的相互适应关系，中蜂已经形成了很强的防卫机制和行为(张春善译，1990)：首先是中蜂工蜂幼虫封盖期较短，不能满足大蜂螨的发育要求，且大蜂螨主要在封盖期的雄蜂幼虫上繁育：更重要的是工蜂对大蜂螨和被感染的蜜蜂幼虫有很强的行为反应和清除行为，包括自身清理、蜂伴间相互清理、群体清理和清理舞(黄文诚，1995)。而意蜂是19-20世纪引进的外来蜂种，对蜂螨缺少防卫能力，自意蜂在亚洲接触到大蜂螨以来，大蜂螨就成为意蜂的寄生虫，并蔓延到世界各地。意蜂一旦发生大蜂螨，雄蜂和工蜂都会100％感染，蜂螨数量增长很快。相关研究发现，中蜂工蜂复眼能发现大蜂螨，触角能接受大蜂螨的气味物质，从而一起咬蜂螨行为(杨冠煌和林桂莲，2002)。当工蜂被蜂螨附着后，会立即引起尾部摆动，发出高频率声波，招呼其他工蜂前来梳理，寻找蜂螨，并将蜂螨叼走。当在中蜂蜂群中人为引入受蜂螨感染的西方蜜蜂子脾后，中蜂工蜂便表现出很强的行为反应，会咬开有蜂螨的房盖，拖出被蜂螨感染的幼虫。而当西方蜜蜂蜂群中人为的引入受大蜂螨感染的中蜂子脾后，72小时以后，从封盖房里的幼虫和刚出房的幼蜂提上均发现又蜂螨，再把这些子脾放回原中蜂蜂群里，工蜂会咬开有蜂螨的房盖，清除出被蜂螨感染的幼虫，5．6天后基本可以清除引入的子脾上的所有蜂螨(谭垦等，2002)。西方蜜蜂也具有不同程度的抗螨性，但不同亚种、类型和蜂群的抗螨性的差别很大。如意蜂对受蜂病感染的幼虫也有清洁行为，其清洁遗传行为已作为重要的抗病机制受到重视，并作为抗病育种的指标应用(Harbo&Harris，1999)，当意蜂幼群染病后，抗病性强的蜂群中工蜂也会咬开房盖，拖出被感染的幼虫(Gilliarnetal，1983)，意蜂清洁行为早在20世纪60年代就已作为重要的抗螨行为受到关注(Anderson&Trueman，2000)。Spivak&Downey(1998)将工蜂对人为插入封盖子脾冻死幼虫的清巢反应作为判断依据，进行了抗病蜂群筛选。Arathi等(2001)进一步结合杂交方法，进行育种研究，观察发现所选蜂群中，壮年工蜂对冻死幼虫具有稳定的清洁行为。进一步实验发现，蜂群中放入25％的抗病蜂群工蜂的清洁效果最优，平均19日龄内的工蜂具有清洁行为，而普通蜂群具有清洁行为的平均日龄在17日内。经实验证实，蜂群的清洁行为具有遗传性，将清洁行为明显的蜂群的蜂王与随机选择的，无亲缘关系的雄蜂杂交，所产生的后代蜂群中的螨虫数量明显少于其他普通蜂群。但意蜂的清洁能力总的不及东方蜜蜂(Spivak&6 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究Downey，1998)。荷兰入Boot等(1999)曾与越南学者合作研究了东方蜜蜂和硒方蜜蜂蜂群的抗p螨性差别，分别在两种蜂群中接入蜂螨，2-6天内东方蜜蜂能将84％的已感染蜂螨的封盖幼虫清除，而西方蜜蜂只能清除4％。更为重要的是西方蜜蜂工蜂咬杀蜂螨的能力远不及中蜂有效。据美国学者观察，同时把螨接入到蜂群中，东方蜜蜂工蜂可用上颚咬螨，并将螨的肢体扔到箱底，积极的把螨清除，而西方蜜蜂对螨的清除率只有0．3％(权立宏译，1994)。长期以来，意蜂治螨过多依赖化学杀虫剂，导致螨虫抗药性的提高，蜂产品中农药残留问题日趋严重，促使蜂种抗螨性受到重视(李旭涛，2001)。中蜂等东方蜜蜂的抗螨遗传行为和机制，所具有抗蜂螨行为和相关的遗传基因，通过遗传工程，对生产蜂产品的当家种意蜂品种的培育和改良具有重要价值，早受到国际上的高度关注(黄文诚，1995)。但由于蜜蜂生产性能和生物学特性表现为数量遗传，抗病力、抗逆性、抗螨力等表型值大多是由多个基因与环境相互作用的综合表现，在选种和育种，种质评价方面，采用传统方法易造成较大误差，从而造成进展缓慢(陈盛禄，2001)。而此前广泛应用的分子标记虽然数量性状基因定位方面的优势，但很难对相关的基因表达差异和机理作出判断。1．1．3基因芯片技术概述随着人类基因组学计划(HGP)的完成，基因组学研究的重心从结构基因组学转向功能基因组学，了解基因的功能，发现基因间的相互关系及其表达调控方式，成为后基因组时代的重要研究目标。由于Southern印迹、Northern印迹等传统生物技术，操作复杂、自动化程度低，已难以满足后基因组时代的研究需要，因而迫切要求建立一种高速度、高通量的测定核酸序列、检验基因表达的技术。正是在这种背景下，基因芯片(genechip)技术应运而生。(1)基因芯片原理基因芯片(Genechips)，又称DNA芯片(DNAchips)或DNA微阵列(DNAmicroarray)，属于生物芯片(Biochip)的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量基冈探针或基因片段按照特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵。因其固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片(Chertetal，1998)。基因芯片可广泛应用于DNA测序；检测基因表达和表达差异；检测基因突变和基因组的多态性；病原分析；基因诊断和疾病预后分析；病理学、毒理学、药理学、疫苗研究和肿瘤研究等多个方面。(2)基因芯片分类7 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究基因芯片按其功能可分为衾逸谱基因芯片和检测芯片；根据芯片点样方式的不同，可分为原p位合成芯片、点样法合成芯片；根据芯片所用探针的不同可分为寡核苷酸芯片和eDNA芯片。表1-1基因芯片分类Tablel-1Genechipclassification基因芯片分类特点按其用途不同，基因芯片主要分为两种类型：～种是用于对待测样品的基因结构及组成进行检测的寡核苷酸芯片，另一种用于检测基因差异表达的表达谱芯片。寡核苷酸芯片的核酸片段可与待测样品中的标记DNA配对，当芯片上的寡核苷酸与待测样品中的标记DNA有小至1个碱基的差异时，荧光信号会发生变化，从而可判断待测得DNA序列中特定位点的碱基特征(李瑶，2004)。表达谱芯片的探针序列一般来自于已知基因cDNA或EST文库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合，使最终数据更为可靠(Dugganelal，1999)。这类芯片～般通过检测某一目的基因产生的mRNA量或频率的变化来确定基因的表达程度。根据芯片制备方法的不同，分为原位合成芯片和点样法合成芯片[详见本章(3)]。按制作方法和探针种类的不同，基因芯片分为两种类型：一种是寡聚核苷酸点阵芯片(ONA)，主要用于测序、基因多态性研究和药物筛选等；另一种是cDNA点阵芯片(CDA)，主要用于功能基因组研究和表达检测等。(3)基因芯片的制备方法通常比较典型的DNA芯片制备方法分为2种：(1)点样法：首先是探针库的制备，根据基因芯片的分析目标，从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列(Prpndnikovelal，1998)，然后通过计算机控制的三坐标工作平台用特殊的针头和微喷头分别把不同的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙以及其它固相基片表面的不同位点上，通过物理和化学的方法使之固定。该方法各技术环节均较成熟，且灵活性大，适合于研究单位根据需要自行制备点阵规模适中的基因芯片。(2)原位合成法：该法是在玻璃等硬质表面上直接合成寡核苷酸阵列，目前应用的主要有光去保护并行合成法，压电打印合成法等，其关键是高空间分辨率的R 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究模板楚位技术和高合成产率的DNA化学合成技术，适合制作大规模DNA芯片，实现高密度芯片，的标准化和规模化生产。基因芯片的技术流程主要包括DNA探针的制备、固定、检测样品的制备及杂交分析这4个关键环节，其中尤以DNA样品的固定和杂交的检测最为重要。a)DNA探针的制备：DNA探针一般在96孔板中制备，纯化后冷冻干燥将其稀释到一定浓度；b)DNA探针的固定：主要采用表面经过化学处理同相基质如玻璃片或硅片作为芯片片基，然后使DNA片段按特定顺序固定排列在片基上：c)检测样品的制备：主要来源是从生物细胞中提取的RNA后经反转录成eDNA，通常采用常规的基因分离、反转录、扩增的标记等。为了获得杂交信号，在扩增过中通常加入同位素或化学荧光进行标记；d)杂交检N-目前最常用的芯片信息检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过采集各反应点的荧光强弱和荧光位置，经相关软件分析图象，即可以获得有关生物信息。(4)基因芯片在差异表达研究中的应用基因差异表达分析主要是采用ONA芯片分析两组来源不同mRNA的转录差异，是生物芯片技术最广一泛最常见的应用(Heishietal，2002)。采用DNA微阵列模式，将两组mRNA(正常对照和待测样本)分别反转录成cDNA，并分别掺入可分辨的不同荧光素标记(如Cy3和Cy5)，然后将二者同比例混合，同时与DNA微阵列杂交(Adeletal，2000)。最后通过计算机进行数据分析，计算两组样本杂交信号的比值，并通过设立域值来确定己知基因在不同来源样本中的表达差异，寻找不同样本的差异表达基因，甚至新基因。利用cDNA文库制备cDNA微阵列芯片。一种基因在不同时间、不同组织结构、不同发育阶段及不同生物模式中的表达方式也不同。如果将不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗阶段)条件下的细胞内RNA，或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片杂交，可以对检测样本基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析和判断，为探明基因的生物学功能和作用机制提供线索，并能迅速将某个或某几个基因与表型联系起来，从而加快了对基因功能以及基因之间相互作用的解析(Pandaetal，2003；Ryanetal，2004；Robinetal，2003)。Ding等(2007)从六种昆虫中筛选了646个昆虫抗药性相关基因，制备成基因芯片，并利用芯片对家蝇品系及其敏感品系的抗药性相关基因差异表达进行了研究，筛选出17个表达上调基因，结果表明CYP4和CYP6两个家族的P450基因，在家蝇的抗药性中起到重要的作用，通过实时荧光定量PCR验证证明芯片杂交结果可靠。Schena等(1996)采用拟南芥基因组中45个基因的9 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究cDNA微阵列(其中14个为完全序列，31个为EST)检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平。用不同颜色的荧光素标记样本的逆转录产物后，分别与该微阵列杂交，发现该植物根和叶组织中存在2个基因表达的差异，而参与叶绿素合成的CABl基因在叶组织较根组织高达500倍表达，表明基因芯片的检测效率很高。(5)基因芯片在农业、林业和畜牧业上的应用对高产品种的选育和保持、用生物技术改良畜群的生产性能及应用转基因、克隆技术生产生物工程产品等，都可以用生物芯片技术取得大量重要信息。将之应用于基因再测序，将大大加快DNA多态型的鉴定，有利于推动分子水平的育种工作。同时，通过平行检测基因表达谱，有助于更好地了解动植物生长和发育的机理，以及基因间的相互作用。在林木育种上，基因芯片技术有潜在的用途。木质素低的树木有很大的经济价值，如生产纸浆造纸。Sederff用反义技术对合成木质素的相关基因进行反义寡核昔酸抑制，以期获得低木质素含量的品种。用基因芯片技术可以检测木质素相关基因的表达，提高筛选效率(李尉民和岳宁，2000)。目前，国内已有多家生物高科技公司制备了各类cDNA表达谱芯片，诸如癌基因和抗癌基因芯片、信号转导芯片、细胞周期检测芯片、细胞凋亡检测芯片、细胞因子、生长因子及生长因子受体检测芯片等，为基因表达的整体研究提供方便。1．1．4基因芯片的研究开发及在蜜蜂行为学上的研究应用蜜蜂是一类重要的经济昆虫，对人类社会、自然生态系统和生物多样性的研究都具有重要的意义。近年来作为研究生命科学的模式生物，蜜蜂正受到国内外前所未有的关注。(1)西方蜜蜂基因组的测序与发布2003年初美国人类基因组研究所与美国农业部联合出资750万美元，开始大规模的开展蜜蜂基因组测序工作，在建立覆盖蜜蜂基因组7．8倍规模的蜜蜂BAC文库(BacterialArtificialChromosomelibrary)。在此之前，国内外有关蜜蜂基因组的研究工作已有很多积累，为蜜蜂基因组测序奠定了基础。如Hunt和Page(1995)基于RAPD标记已构建了蜜蜂的遗传连锁图谱，一些主要的经济性状如采集行为、蜜蜂的螫刺行为和个体大小、报警外激素也已进行了QTL分析。2002年，Kucharski和Maleszka等完成了20000个蜜蜂基因表达序列标签(ExpressedSequenceTags，EST)的序列分析，研究结果在NCBI数据库进行了登录，并建立了蜜蜂基因数据库，这些研究基础有力地促进10 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究了美国2003年初启动的蜜蜂基因组测序工作的顺利进展。2004年初，蜜蜂基因组序列草图1．0版完成，并于2005年5月发布于NCBI、EMBL、DDBJ三大数据库，成为免费的共享资源。蜜蜂基因组共有32条染色体，3亿个DNA碱基对(大约占人类碱基对数量的1／10)，由于蜜蜂基因组相对较小，基因更易被定位。2006年10月26日，期待已久的蜜蜂的基因组序列在英国杂志{Nature))发表，标志着蜜蜂研究“后基因组时代”的开始。蜜蜂是继果蝇(Drosophilamelanogaster)及蚊子(Anophelesgambiae)后第3种基因组被测序完成的昆虫。因此可以将蜜蜂与这两种已测序的昆虫在基因组水平上进行基因数量和基因含量的比较。通过蜜蜂基因组分析与比较，得出以下启示：l-蜜蜂的A和T比别的昆虫基因组要高得多，为67％，而黑尾果蝇Drosophilamelanogaster为58％，库蚊为56％。与脊椎动物相反，在蜜蜂基因组中AT丰富区中基因分布反而较多。2．蜜蜂基因数为10157个基因，比果蝇和库蚊少25％左右。蜜蜂中的转座子基因(可用在寄主染色体上跳跃；引起突变的基因)比别的昆虫少。3．蜜蜂的基因组较果蝇和蚊子的基因组进化慢的多。4．蜜蜂的气味受体基因比别的昆虫多，与果蝇(62)和库蚊(79)相比，蜜蜂有163个气味受体基因。5．蜜蜂拥有较少的免疫和抗病有关的基因。库蚊有209个，果蝇有196个，而蜜蜂只有71个与免疫和抗病的基因。通过对蜜蜂基因组的研究，使人类对蜜蜂的起源、免疫反应和疾病防御机制、发育等很多方面的认识取得很大收获。预期，随着研究不断深入，通过昆虫学、遗传结构分析、数量性状位点(QTL)连锁分析、转基因技术及分子遗传学技术的广泛应用，蜜蜂基因组研究将会取得更大突破。目前值得进一步研究探讨的有趣问题很多，例如蜜蜂个体变温而群体恒温是受什么基因控制的，为何东方蜜蜂蜂具有抗螨性，而西方蜜蜂难以抵御螨害等。(2)西方蜜蜂基因芯片的研究开发西方蜜蜂基因组测序的完成，标志着蜂学研究已进入后基因组时代，基因功能和调控机制的研究将成为新的热点。近年来，伴随人类基因组测序工作而兴起的基因芯片技术在美国已开始应用于蜜蜂研究。2002年以来，伊利诺斯大学Robinson团队在开展西方蜜蜂基因组研究的同时，已开发成功蜂脑高密度基因芯片。他们构建了含20000个工蜂脑eDNA克隆的文库EST测序，获得了15311个代表8912个特异序列的EST，在此基础上构建了含有7000个EST的高密度基因芯片(Robinsonetal，2002；Whiffieldetal，2002)。蜜蜂基因组序列公布后，他们用原位合成的 浙江大学硕七学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究方法，在2007年根据果蝇基因芯片技术，研制出了含有13440个寡核苷酸序列的全基因组芯片，(http：／／www．beespace．UIUC．edu／BeeArray)。这两种蜜蜂基因芯片可广泛的应用于蜜蜂行为学研究、功能基因的注释等实验研究，为开展蜂学研究提供了一种前所未有的全新技术手段。(3)西方蜜蜂基因芯片的应用Robinson(2004)通过总结发现，基因可以影响动物行为，环境影响行为并体现为基因表达的差异，且具有遗传性。近年来作为生命科学研究的模式生物，蜜蜂正受到前所未有的关注。高通量、集成化和自动化基因芯片的开发和应用，提供了以基因群体模式对蜜蜂生物学性状作基因水平解析，阐明分子作用机理的强有力工具，对加快养蜂业品种的优育和优选，寻找新基因、疾病诊断、药物筛选均具有重要价值。Robinson等(2003)为确定大脑基因与工蜂职能还是日龄的关系，在大量eDNA信息分析基础上，选择72个ESTs制成芯片，对5-9日龄和28．32日龄工蜂头部的个体行为基因表达谱进行了分析，结果二者表达谱有39％的显著差异；对内勤蜂、提早外勤蜂、准外勤蜂、老内勤蜂的个体脑基因表达谱分析结果表明，与工蜂职能行为变化相关的基因有cGMP蛋白激酶编码、细胞分裂蛋白激酶、细胞转录因子和RAS相关基因等，工蜂的行为变化主要受编码cGMP蛋白激酶基因的调控，外勤蜂的cGMP蛋白激酶基因水平表达高于内勤蜂，工蜂行为是遗传与环境共同作用的产物，此研究结果于2003年10月在((Science))发表(Whitfield酣al，2003)，ChristinaM等(2003)利用含有9000个eDNA的基因芯片及实时荧光定量PCR技术对QMP对成年蜜蜂头部基因的表达进行了研究，结果证实QMP调控着数百个基因的表达，并且长期影响19个基因的表达。在野生蜂群中有一些基因也受到QMP的调控。通过对比QMP对觅食工蜂和内勤蜂中的相关表达差异基因的影响，表明QMP可能通过调控导致行为状态的基因延迟成熟。Cash等(2005)利用基因芯片技术对蜜蜂脑行为基因及基因可塑性的局限进行研究分析，发现在不同的发育期，蜜蜂头脑基因的表达具有显著的差异。内勤蜂与外勤蜂相比有近四分之一的基因具有显著性差异(5563个检测基因中有1208个)，相反在内勤蜂到外勤蜂的过渡期无明显的差异。然而与内勤蜂或外勤蜂头部基因表达具有显著性差异(大于500个eDNA)。Bloch等(2004)通过研究蜜蜂头部mRNA的表达发现，蜜蜂的生理行为变化与年龄有关，并不随着光照，飞行经验，分工及环境的不同而改变。通过基因芯片技术在分子生物学水平上研究蜜蜂行为学具有开创性意义，并为其他模式生物提供研究方法。1．2存在问题与展望12 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究(1)西方蜜蜂螨病问题一大蜂螨是严重危害引进西方蜜蜂(Apismellifera)，包括意大利蜜蜂(意蜂，A．melliferalingustica)的蜂螨。大蜂螨寄生在封盖内，可使蜂蛹发育不良，对西方蜜蜂蜂群的危害是毁灭性的。其防治方法归纳起来有以下3种：(1)物理机械法，如蜂群的热处理；(2)化学防治法，如使用杀螨剂杀螨；(3)生物技术防治法，也包括蜜蜂饲养管理技术。目前应用最为广泛的仍是化学防治法。一般蜂群每年要用药物防治4．6次，否则会遭到毁灭性损失(王强等，2004)。但是，化学药物用于蜂群中螨害的防治，或多或少都会给蜂群带来一定的毒副作用，并且造成蜂产品不同程度的污染。这些副作用在～定的范围内和较长的时期仍然存在，并影响着蜜蜂的健康发育和蜂产品的质量。(2)研究开发具有我国基因自主知识产权的中蜂芯片与抗螨基因的挖掘中蜂抗螨行为是一个复杂的生命现象，受到多种基因的协调作用。利用基因芯片技术可同时检测大量抗螨基因在不同样本中的表达差异，将对基因的表达变化有一个全面系统的了解。目前，我国蜜蜂基因芯片研究完全空白，而国际上由于蜜蜂基因芯片研究起步不久，尚未见应用于抗螨机理研究和基因筛选相关研究报道。本项目是首先在国际上研究构建中华蜜蜂基因芯片，也属国内首次涉及蜜蜂基因芯片的研究，具有自主知识产权。在国际上首先将基因芯片用于蜜蜂抗螨特性分析，从分子水平进行中蜂的抗螨特性及相关行为的分子机理解析探索。将筛选和鉴定一些新的功能基因。利用基因芯片技术研究中蜂抗螨行为并筛选出相关基因，有助于为蜜蜂抗蜂螨种质评价提供基因表达谱依据。1．3研究目标在前人大量的研究基础上，以中蜂为主要对象，辅以现有意蜂品种，基于已测序中蜂头部eDNA文库和所获得的8569条高质量ESTs，利用点样法合成具有自主知识产权的中蜂头部eDNA芯片。在分子水平上同时高通量平行检测分析在蜂螨胁迫条件下中蜂、意蜂的基因表达谱差异，实现以基因群体模式对中蜂抗蜂螨特性及相关特性的基因水平解析，分子机理分析；筛选获得一些有重要价值的功能基因，为蜜蜂抗蜂螨种质评价提供基因表达谱依据。13 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究套二章研究内容和技术路线本课题根据我国原产中蜂所具有的不同于意蜂的优良抗蜂螨性状，以浙江本地抗螨中蜂种质资源为研究对象，辅以意蜂种质资源，基于已测序中蜂头部cDNA文库和所获得的8569条高质量的ESTs，以及生物信息分析基础，开展具有自主知识产权的中蜂头部基因芯片的研制及应用。2．1本研究内容(1)EST数据库的构建：对现有的8569条高质量的ESTs进行分析，筛选出用于芯片的EST探针，并对其进行功能注释，建立中蜂头部cDNA芯片支持性数据库。(2)‘芯片的制备：对筛选的EST探针进行PCR扩增和纯化，根据探针数目设计基因芯片点阵列，然后点带IJcDNA基因芯片。(3)基因芯片质量检验：利用不同处理样品RNA胄,J备待检测荧光样品，与中蜂头部cDNA芯片进行杂交，对基因芯片质量进行检测。(4)抗螨特性相关基因的筛选：提取经蜂螨胁迫处理的蜜蜂头部总RNA，逆转录标记为荧光探针，与己制各的中蜂头部cDNA芯片杂交，扫描分析数据，筛选出蜂螨胁迫试验前后蜜蜂基因表达谱的差异，分析中蜂抗螨特性的机理，筛选出相关基因，初步分析中蜂抗螨特性的分子机理。14 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究＼2．2总技术路线图2-1总技术路线Fig．2—1Thegeneraltechnicalroute15 浙江大学硕十学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究第三章中华蜜蜂头部cDNA芯片EST数据库的构建芯片EST数据库是基因芯片制备的前提，如何选择组成芯片矩阵的EST片段是芯片设计的第一个关键。通过特异性EST筛选，整合制备成专用芯片，可使基因芯片杂交检测的目的性更强，并简化杂交后结果处理和分析，降低芯片构件的成本(Reymond，2001；Taoeta1．2004)。本研究目标在于构建一个中蜂头部cDNA芯片的支持性EST数据库。因此，我们基于已测序中蜂头部cDNA文库和所获得的8569条ESTs，进行了代表性ESTs序列筛选，用于建立基因芯片数据库，为进行下一步制备ESTs探针奠定基础。3．1材料与方法3．1．1中蜂头部EST数据库根据中蜂头部eDNA文库EST测序结果，共获得13392条ESTs序列，通过phrap软件作有效性处理，共得到平均长度大于500bp的高质量ESTs共8569条；通过CAP3软件处理，共拼接出217条Contigs、788条singlets(表3·1)。表3-1中蜂头部EST序列分析Table3—1ESTsequenceanalysisofApisceranabrain高质量EST数8569Contigs数>40ESl’S>100ESTs>500ESl’S>1000ESTs217116213．1．2分析软件和网站所采用的生物信息软件包括phrap(SPS公司，美国)、CAP3(hap：／／genome．CS．mtu．edu／sas．btml)，DNAstar(DNASTAR公司，美国)、Blasts(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST)、GeneOntology(http：／／amigo．geneontology．org)。16 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究3．1．3方法采用DNAstar软件进行序列同源性分析，筛选出与Contig、Singlet序列相匹配的EST序列，然后通过GenBank进行BLAST(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／，美国国家生物信息技术中心)同源性搜索，功能注释。在此基础上，用EXCEL建立基于芯片的EST数据库。(1)EST序列筛选根据Singlet(单个EST)序列和编号，找出相匹配的EST编号和序列；根据Contig(由2个以上ESTs拼接而成的EST重叠群)序列和编号，找出相应的EST编号和序列，通过DNAstar软件进行EST序列群比对，根据匹配程度，每个Contig选出2—3个相匹配的，可拼接成Contig全长的代表性EST序列。所选ESTs作为基因芯片的EST基本数据库。(2)EST序列功能注释登陆GeneBank，逐条提交入选基本数据库的EST序列，用BLAST(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLASW，美国国家生物信息技术中心)进行同源性搜索，根据最大相似性原则，将所得最高同源性的生物信息，对提交的EST序列进行功能注释。(3)EST序列分类登陆http：／／amigo．geneontology．org网站，将注释好的功能名称录入系统，系统根据GO分类方法，将所有注释的ESTs按照细胞功能(Molecularfunction)，生物过程(Biologicalprocess)以及细胞组分(Cellularcomponent)分成三类，并统计每大类下小类的分布情况。3，2结果与分析3．2．1EST数据分析根据Singlet和Contig序列分析结果，从8569条高质量EST序列中选出了1025条与Singlets和Contigs相匹配的ESTs序列，其中singlets中的ESTs为639条，217个Congtigs中ESTs为386条。低表达Congtigs172个包含278条ESTs，高表达Congtigs45个包含108条ESTs。3．2．2EST序列功能注释17 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究(1)Singlet功能与ESTs数统计I由表3·1可见，58个singlets包括了31个功能，其中以王浆蛋白(6种Mrjp)最磊．共22个ESTs，占37．93％；假定蛋白其次，共有16个ESTs，占27．59％；其他功能的ESTs有20个，占34．48％。在王浆蛋白中，以王浆蛋白Mrjp1最多，有12条ESTs，占所有ESTs数的20．69％。表3-2singlets功能分类和EST数Table3-2FunctioncategoriesofsingletsandESTnumber功能ESTs数HypotheticalproteinMRJPlMR伊5MR『P3ApisiminprecursorMR伊6TroponinCtypeIIaVenomprotein2precursorMILl。P4ProfilinTroponinCtypeIRh—likeproteinBlue—sensitiveopsinAbaecinprecursorVitellogeninOdorantbindingproteinASPlADP／ATPtranslocaseElongationfactorl·alphaNeuronalnicotinicacetylcholinereceptoralpha-2Alpha-glucosidaseGlucoseoxidaseTransferrinGuanylatecyclase，soluble，beta1未注释合计639(2)低表达Contigs功能与ESTs数统计由表3．2可见，45条ESTs包括了17个功能，其中以王浆蛋白Mrjp的ESTs最多，有14条，占31．11％；假定蛋白其次，共有13个ESTs，占28．89％；其他功能的ESTs共18个，18蛉他4322。。。。。，。。。，，，。。。跚 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究占40．00％。在王浆蛋白中，以王浆蛋白Mrjpl最多，有8条ESTs，占占所有ESTs数的17．78％。表3-3低表达Contigs功能分类和ESTs数Table3-3FunctioncategoriesoflowexpressioncontigsandESTsnumber功能ESTsHypotheticalproteinⅣ唧lApisiminprecursorMR伊4Alpha-glucosidaseGlucoseoxidaseVitellogeninDefensinpreproproteinAlpha-amylaseMRJP3MRJP5MRJP6OdorantbindingproteinASP2Antermal—specificprotein3cprecursor未注释1384321233合计278(3)高表达Contig功能与ESTs数统计由表3-4可见，95条ESTs包括了32个功能，其中以王浆蛋白Mrjp的ESTs最多，有20条，占21．05％；葡萄糖氧化酶其次，共有9个ESTs，占9．47％；其他功能的ESTs共13个，占13．68％。在上述基础上，对筛选的1025条ESTs经PCR扩增，共有717条ESTs获得高质量PCR产物，所有ESTs按芯片阵列要求，编辑成EXCEL中蜂头部eDNA芯片数据库。其主要信息见表3．5。19 表3—4高表达Contig功能分类和ESTs数ITable3-4FunctioncateggriesofhighlyexpressioncontigsandESTsnumber一一一---_●_-__-●-_-_--_●-__●●●_●_●____功能ESTs———————_——————————————————————————_—_——_——————_—_——————————————————————一一一G1Hcoseoxidase9MRJP3ENSANGP0000001889lAlpha-amylaseDefensin／royalisinprecursorMRJPlMR『P2MRJP2’MIUP7MRJPlprecursorADP／『ATPtranslocaseLong—wavelengthrhodopsinHeatshockcognate70proteinTransferrinRibosomalproteinL8ArrestinhomologMR伊5MRJP4precursorApisiminGlucosedehydrogenaseAlpha-glucosidaseCarboxylesteraseGlucosylceramidaseprecursorAntermal-specificprotein3cprecursorVenomprotein260SacidicribosomaproteinP260SacidicribosomaiproteinP1Elongationfactor-1alphaF2CG4720-PAENS声渊GP00000013101ENSANGP00000022830C04696．PAApisiminprecursor未注释～一!!．．一一___————_-——-__--___●——_—__●_—’_———___—__—__-—●—__——_——————一一。。垒l!11一．．．．．．．．．．．．．．旦旦邑．．．．．．．一____-___I---____l_l一-l__l_●-__l●_l__-●--。_--ll-1●————’———一一一64321 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究表3-5中蜂头部cDNA芯片EST探针组成Table3-5ClassificationofESTprobesspottedontheeDNAchipofApisceranabrain1分类ESTsA．melliferagenomiccontig58A．melliferalinkagegroupIgenoml+ccontig51A．melliferalinkagegroup2genomm’contig47A．melliferalinkagegroup3genomiccontig21A．melliferalinkagegroup4genomiccontig22A．melliferalinkagegroup5genomiccontig51A．melliferalinkagegroup6genomiccontig32A．melliferalinkagegroup7genomiccontig25A．melliferalinkagegroup8genoml‘ceontig32A．melliferalinkagegroup9genomm’eontig12A．mellifemlinkagegroup10genomiccontig31A．melliferalinkagegroup1genomiccontig83A．melliferalinkagegroup12genoml‘ccontig19A．melliferalinkagegroup13genoml’ccontig19A．melliferalinkagegroup14genom’lccontig26A．melliferalinkagegroup15genoml‘ccontig48A．melliferalinkagegroup16genomiccontig1Apisimin3Apisiminprecursor1凇|KTPtranslocase2Alpha-amylase3Alpha-glucosidase3Antennal·specificprotein3cprecursor1CG4696-PA2CG4720-PA2Carboxylesterase2Defensin／royalisinprecursor3ENSANGP00000013101lENSANGP000000l889l4ENSANGP000000228302Elongationfactor一1alphaF21Glucosedehydrogenase1Giucosylceramidaseprecursor1Glucoseoxidase7Heatshockcognate70protein1Long-wavelengthrhodopsin2Mrjps23RibosomalproteinL82Transferring2Venomprotein2垒Q璺竺!璺!!曼!旦12堡垒旦翌!曼i翌!!!——21 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究60SacidicribosomalproteinP260SribosomalproteinL15阴性对照空白对照其他l160合计7193．2．3EST序列分类将所有注释的中蜂头部ESTs的序列进行GeneOntology分类(见表3-6)，按照细胞功能(Molecularfunction)，生物过程(Biologicalprocess)以及细胞组分(Cellularcomponent)分成三类，统计每大类下小类的分布情况，中蜂头部ESTs序列可分为14个小项。表3-6中蜂头部ESTs的G0分类结果玑lble3．6G0classificationofA．ceranaceranaannotatedESl’S注：不包含无Go分类的差异表达。3．3讨论 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究芯片数据库是基因芯片制备的前提，如何选择组成芯片矩阵的EST探针是芯片设计中第一步。构建中蜂头部eDNA芯片EST数据库的目的是尽可能涵盖所有中蜂头部EST信息。本研究利用生物信息软件，从8569条高质量中蜂头部EST序列中筛选出了1025条ESTs序列，其中属于Singlets的ESTs为639条，属于Congtigs的ESTs为386条，几乎覆盖了所有Singlets和Congtigs序列。通过PCR扩增，最终获得了717条高质量ESTs目的片段，占总数的70％以上(见第四章)。通过BLAST对ESTs序列功能进行了注释，并对注释ESTs进行GO分类，完善了中蜂头部cDNA芯片EST数据库的信息，为后续与芯片与样本才eDNA杂交后的数据分析奠定了基础。由于受目前GeneBank信息量的限制，其中大部分ESTs序列的功能尚未确定，数据分析存在尚很大难度。今后我们将根据新蜜蜂基因组信息，对数据库及时进行更新和完善。 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究第四章中蜂头部cDNA芯片制备及质量检测芯片制备是基因芯片技术的核心，其中芯片的质量及特性决定了杂交反应的可靠、真实性(邹宗亮等，2000)。因研究目的不同、期望制作芯片类型的不同，制备芯片的方法也不尽相同。点样法是目前基因芯片制备工作中常用的方法，该法是将预先通过液相化学大量合成的探针、PCR技术扩增的eDNA或基因组DNA，经纯化和定量分析后，通过由阵列复制器或阵列点样机及电脑控制的机器人，准确、快速地定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等支持物的相应位置上(支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷)，再由紫外线交联同定后即得到DNA微阵列或基因芯片。这～过程的许多环节都影响着基因芯片的性能，如探针的密度、纯度、稳定性、固定方法、点样仪器、点样环境等(邹宗亮等，2000；Dufva，2005)。阵列排布的整齐度、所点探针形状的规则度是衡量点样质量好坏的两个重要指标(Duvfa，2005)。在此，我们将探讨如何利用所选取的目的EST片段，进行中蜂头部eDNA芯片的制备，并对制备得的芯片的质量进行检测确认。4．1材料与方法4．1．1材料(1)中蜂头部eDNA文库和EST序列数据库已测序的中蜂头部eDNA文库96孔大肠杆菌菌板，96孔质粒板，由本实验室与浙江大学沃森基因组研究院等合作完成，生物大分子实验室保存。EST序列数据库：由浙江大学沃森基因组研究院完成eDNA文库测序后提供13392条ESTs序列，由浙江大学生物信息学研究所完成分析，提供8569条高质量ESTs和数据库。(2)试剂引物(M13：5’端引物GTAAAACGACGGCCAGl’G，3’端引物GGAAACAGCTATGAcCATGA)、dNTP、Taq酶购白上海泽衡生物技术公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，RNA逆转录荧光标记试剂盒购自TaKaRa公司，Cy3一dCTP／Cy5-dCTP购自Amersham公司(美国)，氨基修饰玻璃片基(25mm×75ram)购自Coming公司(美国)，其他试剂均为国产分析纯．(3)仪器24 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究移液器(Eppendorf公司，德国)、DNAEngineTetrad温度梯度PCR仪(MJResearch公司，美国)、Centrifuge5804R离心机(Eppendorf公^德国)、HM—I型多功能水平电泳槽(大连竞迈生物科技有限公司)、JS．380A自动凝胶成像仪(上海培清科技有限公司)，ND-1000紫外分光光度计(NanoDropTechnologies公司，美国)，Omnigrid接触式芯片点样仪(GeneMachines公司，美国)、HB一1D杂交箱(Techne公司，英国)、华利达LNGT-83冷冻干燥仪(太仓科教器材厂)、GenePix4100A芯片扫描仪(AxonInstruments公司，美国)、GenePixPro6．0(AxonInstruments公司，美国)等。．4．1．2方法4．1．2．1EST片段PCR扩增根据目标EST序列编号，从EST数据库查找出相应的文库编号(即96孔板号和孔号)。测定目标模板质粒DNA浓度；将质粒稀释至最佳DNA浓度，进行目的DNA片段PCR扩增，PCR产物凝胶电泳检测。(1)菌株培养吸取lmL含Amp的LB培养液，加入到96孔培养板，接种5江菌液，在150rpm、37。C下培养16．18h；(2)质粒提取a)菌液离心4000rpm，5min，弃上清；b)加入预冷的溶液I100此，剧烈震荡悬浮；c)加入溶液11200此，颠倒混匀，冰浴5mirad)加入预冷的溶液Ⅲ150止，倒置后，温和震荡10s，冰浴5rain；e)4"C，4000rpm，离心15min；f)转移400rtL上清至深孔板，4"C，4000rpm，离心15rain；曲转移300旺上清至深孑L板，加等体积的异丙醇混匀，4"C，4000rpm，离心40min，弃上清；h)用70％乙醇洗涤，4"C，4000rpm，离心15mirai)去上清，超净台干燥，至无异味；j)加入50止的去离子水，溶解沉淀。取1止用紫外分光光度计测定质粒浓度，然后取3皿进行琼脂糖凝胶电泳检测。质粒 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究板．20℃保存备用。(3)EST片段PCR扩增及啦泳检测a)模板浓度优化如用作模板的质粒浓度过高，PCR扩增容易产生非特异性片段；而质粒浓度过低，又会导致PCR产物偏少，影响芯片质量。因此，必须确定一个合适的质粒浓度，并根据此浓度对所有的质粒模板进行稀释。方法如下：随机选取4个质粒作为模板，稀释成不同浓度梯度(100×，200×，500×，1000×)，以M13正、反向测序引物进行PCR扩增。PCR反应体系(20止)：10×ReactionBuffer2此25mMMgCl21．4皿2．5mMdNTP1．6灿M13正向引物O．4此M13反向引物0．49L质粒模板0．5此5U／此TaqDNApolymerase0．2止巫蒸丞13。5坫L总体积20此PCR反应程序：循环重复次数时间温度￡X￡垃1l垒min壁垒箜Cycle230s94"C40s56℃】min22∑CXel￡3】Qmin22立Cycle4保持4"Cb)凝胶电泳检测PCR反应完毕，每样品取3皿作0．8％琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰无拖尾现象者为26 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究最佳模板。一c)96孔板EST片段PCR扩增，PCR反应和凝胶电泳条件同上。4．1．2．2PCR扩增产物的纯化(根据SambrookJetal，1989，修改)(1)将扩增产物转移到O．5mLeppendorf管中；(2)向eppendoff管中加入2×体积(200止)无水乙醇，然后加入PCR产物，混匀；(3)用铝箔纸封口，轻微离心，置于．20℃放置过夜，充分沉淀；(4)4"C，12000rpm，离心20mini(5)弃上清，eppendorf管倒置于吸水纸上，去除残余乙醇；(6)加入2×体积70％乙醇洗涤；(7)4"C，12000rpm，离心5mini(8)去上清，超净台干燥；(9)将沉淀溶于适量去离子H20，移入96孔板相应孔内，．20"C保存备用。4．1．2．3目的片段扩增产物的定量和稀释(1)纯化产物浓度的测定用ND．1000紫外分光光度计对所有纯化产物的浓度进行测定，并根据其体积，计算出相应的核酸含量。(2)纯化产物的真空抽干将保存于．20*(2冰箱的纯化产物放入AlphaI．5真空冷冻干燥机中，进行真空干燥。待样品完全干燥后，小心取出样品，封上铝箔纸，轻微离心，将核酸粉末甩至管低。(3)纯化产物再溶解将真空干燥的纯化产物重新溶解，并将其浓度调整至最佳点样浓度，即500．1000ng／肛L。先根据步骤(1)中测得的核酸含量，计算出各个样品应加入的缓冲液量，然后将相应体积的点样缓冲液50％DimethylSulfoxide(DMSO)加入冻干样品中，轻微离心后，封上铝箔纸，室温下置于脱色摇床上充分振荡溶解。4．1．2．4芯片的设计和点制每张基因芯片上设定三个矩阵，每个矩阵设定四个亚矩阵(杂交区)，杂交区间距为12．5mm，每个亚矩阵中包含20×20个探针。每一列从上到下计为1、2、3、4⋯⋯其中1和3，2和4互为重复，每个点直径为100grn，点间距200岬。每个矩阵除去阴性对照和空白点(清水对照)，实有探针点717个，三个矩阵互为重复。27 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究融臻臻獗强ii；：：：：=：茹：茹睡量黧羹黧；E：：：：：：嚣：：：：：：：：至∞一日mn一图4-1芯片点阵设计Fig．4-1Designofgenechip使用Omnigrid接触式芯片点样仪进行基因芯片制备，玻璃片基为25mmx75mm的氨基修饰片基。点样前首先用氮气吹净玻片表面，然后根据编制好的程序，将制各好的目的基因纯化产物点制玻片上。点样在室温下进行，湿度为55％。4．1．2．5基因芯片的后处理芯片点制完毕后，放置在紫外交联仪中进行交联，使固定在氨基玻片上的核酸片段与之牢固结合，紫外交联完毕，用吸耳球吹净玻片表面，室温放置30rain晾干，放干燥处避光备用。4．1．2．6基因芯片质量检测中蜂头部基因芯片点制完成后，随机抽取1张基因芯片用GenePix4100A芯片扫描仪进行扫描检测，检查芯片制备的质量。扫描设定的仪器参数为：扫描波长532nm，PMTGain为800，像素大小为lO岬。4．2结果与分析4．2．1模板浓度优化从电泳图4．2可见，四种稀释倍数的质粒浓度均有清晰的电泳条带出现，考虑到模板浓度过大可能会出现非特异性扩增，因此将质粒模板浓度的稀释倍数确定为1000×。 浙江大学硕士学位论文中华密蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究厂——]j4⋯一一j一⋯。一j【．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．J圈4-2不同浓度质粒檀板PcR产物电泳围Fi94—2AgaroseelectrophoresisofthePCRproductswithplasmidtemplatesindifferentconcentT"ations注：妹道I、2，3和4#Ⅲ∞横扳质粒mdcb_COG30lvlscf※度]OOX、200x、500)<Ⅻ1000XT的PCRP物，泳道5、6、7自8#Ⅲ为模板质#mdcb_005942yl∞r浓度t00x、200x、500×Ⅻ1000xT∞PCR产物．42Es"r片段PCR扩增与纯化为获得制备高质量基周苍片所需大量PCR产物，以候选ESTs质粒为模扳，进行了大规模PCR扩增。经电泳检测，PCR产物片段大小一般在20¨1500bp，来州乙醇沉淀法纯化后目的条带清晰，无明显拖尾现象；紫外分光光度计检测结果．260／280比值得均在I7-20之间，证明DNA纯度较高(代表性电泳结果见阳4-2．瞰4-3)，符台芯片点制要求。23●5‘T8●IOlll2M13l{幅IB”1819拍2l髓臼2●图4-3EST片段嗽扩增产物硫脂糖凝腔电泳结果Fig4—308％ag哪”gclclecU-aphoresisresultofPCRmnplificationproducts29 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究图4-4纯化后琼膳糖疆胶电泳图Fig4408％agarosegelelecl70phoresisresultofESTPCRproductspurifiedwitheth蚰o]423芯片质量检测结果(”芯片矩阵排列中蜂头部基冈芯片点制完成后，对随机抽取的芯片川芯片扫描仪进行扫描．检查点样情况。从芯片扫描图上可以看出(图4-5)．各个矩阵及其靶标点形状规划．荧光背景低．每个矩阵包括4个Ⅱ矩阵，三个矩阵为重复的三次点祥．从扫描幽像上可以看出．矩阵间的重复性较好。田4-5芯片实样Fi94-5Genechbsample(2)探针点的质量为了检测基因芯片上探针点的质量，我Wj利用GenePixPr050软件对芯片上探针点进行扫描检测．图4击为芯片上4个亚矩阵中的一／卜!iE矩阵扫插图像．由圈可见，芯片探针点形状规则．直径为9063±1587岬．荧光背景低．无连点，2个重复点大小形状基本上一致，信号的差异系数大于033的低于30％，点样成功率超过97％，以上结果表明，本研究所研制的基|珂芯片探针点大小均一，点剖重复性好， 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA苍片研制及基于芯片的抗蝻性检测研究[：：；鬟÷j；：。孝冀；≥：：二：：霜l_’■毋t’t_蕾舻；．．F；_·{窿鏊i囊囊i；糕翱雠j毒嚣：￡‘：嚣：譬：：：：翻p¨’『，■*t■，．■“#一●’’刚⋯*⋯一■n一0’．～tf⋯1}瓣器※袋鎏繁戮b皇生二生=二量垒止!兰-三二二』』≥立删图4_6芯片点样情况扫描围Fig．4_6Thescannmgimageofme"cchipbeforehybridization注：图为蕃片中1个亚矩阵的扫描圈。亚矩阵密度为20列×18行，每行相邻的两个点互为重复43讨论由于苗片的制备涉及到大规探针制备、纯化和点样工作．稍有不慎即致大量人力、财力和物力的浪费，并影响后续实验进程。本研究对影响芯片制备诸多参数，包括PCR产物的扩增和纯化，芯片片基、芯片点样条件及后处理等，这些均参考他人的实验经验(毛伟华，2006：丁矛，2006)，通过选择和优化，克服了很多技术困难。因此中蜂头部eDNA芯片制各工作不仅工作量大．技术上也积累了很多宝贵经验。目的片段PcR扩增及纯化是芯片制作的第一步，其结果将直接影响到eDNA芯片片基上探针的固定效率和杂交信号的强度，以及芯片杂交的背景。对PCR扩增产物进行纯化的主要目的是除去未反应的引物、dNTP以及盐类等物质(李长绿等，21105)。结果表明，通过对质粒模扳加量的优化得到特异性的PCR扩增产物，井采用乙醇沉淀法作为大规模探针制备的纯化方法，所得PCR扩增产物条带单一、清晰、明亮；紫外分光光度计检测结果．A260／280值为L8-2．0．每个点样体系的DNA平均含量达到10站。因此PCR产物的纯度和含量都能满足芯片的制备。目前常见修饰的片基种类有氨基修饰玻片、异硫氟基修饰玻片、醛基修饰玻片、巯基修饰玻片和环氧塑酯修饰玻片等。氮基修饰玻片带有正电荷，可以与带负电荷的DNA形成离子键，从而固定探针，探针长度越长．固定效率越高，因此它可以直接用于固定DNA或长的寡核苷酸，但对短寡核苷酸的固定效率太低(李瑶，2004)。本研究的探针长度在200—1500 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究bp，因此选用氨基修饰玻片作为芯片片基。最近，Dufva(200s)在综合分析基因芯片制备影响因素的基础上，提出衡量芯片点制质量的好坏的两个重要指标：～是阵列的排布是否整齐规则，即基因芯片上的各点其所组成的矩阵，排布情况是否整齐规则；二是芯片上的各点探针点的形状是否均一。这两点将直接影响后续基因芯片杂交的数据分析。因为矩阵排布混乱的基因芯片，在进行图像扫描时，将难以利用软件对探针正确定位，从而带来操作上的极大不便；如果芯片上的探针点的外形及大小差异很大的话，则软件在计算各点的荧光密度时容易出现偏差，从而影响杂交数据的准确性。通过扫描和分析软件分析表明，本研究所制各eDNA芯片，矩阵排布整齐，各探针点外形规则，重复点大小均一，从而为后续实验打下了良好基础。32 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究第五章基于基因芯片的中蜂抗螨性相关差异基因筛选蜂螨是蜜蜂重要的体外寄生虫之一，主要有大蜂螨和小蜂螨。蜂螨危害蜂群使之生产力大减，幼蜂发育不良，群势衰弱，危害严重时甚至全部死亡，是蜜蜂养殖中最主要的病虫害，其占所有因病虫害等造成损失的30％(王强等，2004)。每年因蜂螨防治不力而直接导致蜂场绝收甚至破产的事例屡见不鲜。大蜂螨(即：狄氏瓦螨Varroadestructor)是严重危害引进西方蜜蜂(Amellifera)，包括意大利蜜蜂(意蜂，A．melliferalingustica)的蜂螨。目前应用最广泛的防治方法仍是化学防治。但是化学药物用于蜂群中螨害的防治，或多或少都会给蜂群带来一定的毒副作用，并且造成蜂产品不同程度的污染。这些副作用在一定的范围内和较长的时期仍然存在，并影响着蜜蜂的健康发育和蜂产品的质量。中蜂似．ceranacerana)大蜂螨的原始寄主，在长期的协同进化的过程中，大蜂螨已经与寄主形成近似共生的相互适应关系，中蜂已经形成了很强的防卫机制和行为。中蜂等东方蜜蜂的抗螨遗传行为和机制，所具有抗蜂螨行为和相关的遗传基因对生产蜂产品的当家种意蜂品种的培育和改良具有重要价值，受到国际上的高度关注(黄文诚，1995)。但由于蜜蜂生产性能和生物学特性表现为数量遗传，抗病力、抗逆性、抗螨力等表型值大多是由多个基因与环境相互作用的综合表现，在选种和育种，种质评价方面，采用传统方法易造成较大误差，从而造成进展缓慢(陈盛禄，2001)。而此前广泛应用的分子标记虽然数量性状基因定位方面的优势，但很难对相关的基因表达差异和机理作出判断。中蜂头部cDNA芯片的研制成功，为在基因表达水平上研究中蜂和西方蜜蜂的抗螨特性差异提供了一种强有力的工具。本研究的目标是，通过芯片杂交，筛选出中蜂和西方蜜蜂抗螨相关的基因，为解析中蜂抗螨性的分子机理提供科学依据。5．1材料与方法5．1．1材料(1)大蜂螨和蜜蜂大蜂螨：4．5月在浙江大学养蜂场采集。接螨胁迫前1．2小时，选择有大蜂螨寄生的意蜂巢脾，用镊子刺破雄蜂蛹封盖，拉出被寄生的雄蜂蛹连同蜂螨轻放于玻璃皿中，随后仔细33 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究观察，用镊子逐个捕捉落在封盖内的大蜂螨，轻放于雄蜂蛹体表备用。蜜蜂：中蜂由杭州市郊留下镇一蜂农提供，意蜂由浙江大学养蜂场提供，在本校蜂场饲养备用。大蜂螨胁迫实验前，分别选择封盖较多的中蜂、意蜂巢脾，用蜂刷刷去脾上的工蜂后，将巢脾放入多用器内，置人工气候箱(25℃．26℃)内，新蜂大量出房后，逐日用不同颜色的油漆笔标记工蜂背部，将标记的工蜂放入经除螨处理，配有带蜜巢脾的专用蜂箱中饲养。以后在不同日龄(13-21)期分批进行回捕。将回捕工蜂放入三角瓶中，盖上通过胶管和缓冲瓶与二氧化碳钢瓶相连的橡皮塞，依次打开钢瓶阀门和减压阀阀门，将C02气体通入三角瓶，对蜜蜂实施麻醉。用镊子将活蜂螨逐个轻轻移接于被麻醉的蜜蜂体表，每蜂接1头蜂螨后放入纱笼，笼内放一块放有蜜糖水的巢脾，进行笼养胁迫处理。对照不接螨，其它处理措施同样。三日后回捕胁迫和对照蜜蜂，投入液氮冻存，随后保藏于．75℃的超低温冰箱备用。各组蜜蜂材料见表5．1。表5-1供试蜜蜂(13-21日龄)头部样品杂交分组Table5—1Groupsoftestedhoneybee(13-21days)headsamples样品第一组第二组第三组第四组大蜂螨胁迫处理中蜂正常中蜂对照样品大蜂螨胁迫处理意蜂正常对照意蜂样品大蜂螨胁迫处理中蜂大蜂螨胁迫处理意蜂正常对照中蜂样品正常对照意蜂样品(2)试剂Trizol试剂购自Invitrogen公司，RNA逆转录荧光标记试剂盒购自TaKaRa公司，Cy3．dCTP／Cy5一dCTP购自Amersham公司(美国)，牛血清白蛋白(BSA)，二硫苏糖醇(DTT)，柠檬酸钠，去离子甲酰胺，DEPC水等。(3)仪器 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究GenePix4100A芯片扫描仪(AxonInstruments公司，美国)，liB．ID杂交箱(Techne公司，英国)，Centrifuge5804R离心机(Eppendorf公，德国)，ND．1000紫外分光光度计(NanoDropTechnologies公司，美国)等。芯片杂交数据利用GenePixPro6．0(AxonInstruments公司，美国)，菩萨蛮生物信息加工分析系统(浙江大学)进行分析。5．1．2方法5．1．2．1蜜蜂头部总RNA提取(1)在用DEPC处理的无RNA酶的离心管中加入1mL的Trizol试剂；(2)取蜜蜂头部放入液氮中进行研磨，将样品磨碎。待液氮蒸发后，将全部样品放入加有Trizol试剂的离心管中，混匀，室温放置5rain；(3)4℃，12000rpm，离心15rain，将上清转移到新的离心管中，弃沉淀；(4)向上清中加入200皿氯仿，震荡混匀，室温放置15rain；(5)4℃，12000rpm，离心15rain，取上清到新离心管中，加入500皿的异丙醇和200rtL5M的NaCI(除去多糖)，混匀，室温放置10．30min；(6)4"C，12000rpm，离心15min，小心弃去上清，RNA沉于管底；(7)加入1mL75％无RNA酶的乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；(8)4"C，7500rpm，离心5rain，弃上清；(9)室温晾干，用适量DEPC-H20溶解沉淀；(10)用紫外分光光度计测定RNA样品浓度，并用甲醛变性凝胶电泳对RNA质量进行检验。(11)总RNA样品放置．80℃保存。5．1．2．2总RNA的甲醛交性凝胶电泳检测(1)将制胶用具用70％乙醇冲洗一遍，晾干备用。(2)配制琼脂糖凝胶：称取1．2g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入72mL灭菌DEPC水，置微波炉内加热溶化。(3)待胶凉至55℃．65℃时，依次加入18mL甲醛、10mL10xMOPS缓冲液，混合均匀后立即灌胶(注意避免产生气泡)。(注：凝胶凝固较慢，应该放在4℃，约需要l小时，拔起梳子时，应该垂直、快速拔起，防止粘连，使底部暴露。)(4)样品制备：取DEPC处理过的500此小离心管，依次加入35 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究RNA样品(最多20斗g)2灶10xMOPS缓冲液2此甲醛4此甲酰胺(去离子)10止混合均匀，将离心管置于65℃水浴中保温15min．，再置于冰上10min，短暂离心5S使管内所有液体集中于管底部，向每管中加入溴化乙锭(200lag／mL)1此(RNA专用)，2灿10xloadingbuffer染料，混匀，然后放在冰上加样，以消除RNA的二级结构。(5)上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中(上样孔一侧靠近阴极)，加入电泳缓冲液(1xMOPS缓冲液)，液面高出胶面l～2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔，每孔上样20～40岫。(6)电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于5V／mL的电压下电泳2h左右，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。至溴酚兰离点样孔约3．54cm(凝胶在紫外灯下可看到28S和18S刚好分开即可)电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。5．1．2．3样品逆转录荧光标记以总RNA为模板进行反转录反应，制各含有Cy3．dCTP或Cy5．dCTP荧光标记cDNA探针。由于Cy3和Cy5见光容易褪色，反应需在避光下进行。(1)在微型离心管中配制下列反应液，并轻轻搅拌，总RNA10鹏OligodT(18)Primer(300pmol／gL)1此DEPC-treatedwaterupto10此(2)70℃加热5min后，冰中冷却；(3)加入以下试剂，轻轻搅拌(不要出现气泡)：5×ReactionBuffer4．0灿10×dNTPMixtureforCy3labeling(Cy3标准Cy5对照)或Cy5labeling2．0皿1mMCy3或Cy5一dCTP1．0rtLRNaseInhibitor(40U／此)1．0皿M—MLVReverseTranscriptase(200U／此)2．0旺(4)42℃保温1h；(5)70℃保温10min使反转录酶失活；36 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究(6)加入1皿的RNaseH，37"C保温20rain。5⋯124标记eDNA纯化(1)打开精制树脂柱的上盖，加入800此的100mMNaCl，再盖紧上盖，轻轻振荡，在室温下使树脂膨润30rain以上；(2)除去膨润后树脂柱中的气泡；(3)先打开树脂柱的上盖，再打开树脂柱下盖；(4)将树脂柱放在2mLMicrotube管上，使树脂柱内多余的灭菌水滴落在Microtube管里；(5)倒掉Microtube管里的溶液，再将树脂柱放在同一Microtube管上；(6)750Xg离心2rain；(以下操作，为防止树脂干燥，应尽快进行。)(7)将树脂柱放在1．5mLMicrotube管上：(8)将标记反应后的样品(Final20rtL)逐滴全部滴入树脂柱中央；(9)750Xg离心2min，回收纯化后的cDNA。5．1．2．5标记样品乙醇沉淀和溶解于杂交缓冲液(1)把上述精制后的Cy3、Cy5标记溶液一起混合；(2)把溶液用灭菌水加至100此左右，然后加入等量的氯仿／异戊醇(24：1)，10S震荡后，15，000rpm4。C离心1mira(3)取水层移至另一Tube管中，加入1／10量的3MCH3COONa(pH5．2)和2．5倍量的100％乙醇，在室温下静置10min；(4)15．000rpm4"C离心10rain；(5)确认沉淀后，小心除去上清液，然后加入浓度为70％的乙醇；(6)15．000rpm4"C离心2rain；(7)确认沉淀，小心除去上清液；(8)再离心，尽量除净上清液；(9)沉淀溶解于适量的杂交缓冲液中；(10)紫外分光光度计检测浓度。5．1．2．6待测样品与基因芯片杂交(本部分实验的操作均在避光环境下进行)(1)将芯片放置于预杂交液中，42℃，1h；(2)立即转移至ddH20中2rain；37 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究‘3之将玻片转至异丙醇中"取出800rpm离心2mln，甩干；(4)配制新鱼专的2×F-Hybbuffer(50％formamide，10×SSC，o．2％SDS)；(5)将待测样品(浓度10pmol／gL)取出，98℃变性2rain，置于冰上冷却；(6)向荧光标记样品中加入等体积2×F．Hybbuffer，吸打混匀勿起泡；(7)吸取混合液小心滴于点样区域，盖上盖玻片；(8)将杂交芯片放置杂交箱中，42℃水浴过夜(1昏18h)。5．1．2．7杂交芯片的洗涤(本部分实验的操作均在避光环境下进行)(1)预先配制洗液I、洗液II和洗液Ⅲ，方法如下：20XSSC10％SDS洗液I2．5mLlmL洗液II洗液Ⅲ0．25mL0．25mLlmL——ddH2Q4壹：5mL垒墨。25mL墨窆：25mLTotal50mL50mL50mL洗液I和洗液II需在55℃预热。(2)待芯片杂交结束后，用镊子取出芯片，将其浸入预热的洗液I中，上下抽动，使盖玻片从芯片上自然脱落；(3)将芯片放入新的洗液I中，上下抽动洗涤10rnin；(4)从洗液I中取出芯片，浸入洗液II中，洗涤10mira(5)将芯片放入新的洗液II中，洗涤10mira(6)从洗液II中取出芯片，室温下浸入洗液ⅡI中，洗涤3．5min(7)将芯片放入新的洗液Ⅲ中，洗涤3．5rain；(8)从洗液ⅡI中取出芯片，浸入去离子水中，洗涤1．2min；(9)将芯片从去离子水中取出，放入一千狰的离心管中，1500rpm，离心lmira(10)将芯片放入芯片盒中，避光保存于干燥器中。5．10．8芯片扫描和数据输出芯片扫描采用双波长，分别在635nlll和532nln两种波长下对芯片进行扫描，得到两种荧光的扫描复合图。扫描参数的设定：像素值：5岬；PMT值：600(532PMT550，635PMT650)。扫描图像保存为16．bitTIFF格式文件。利用GenePixPro5．0软件对获得的数据进行分析处理。首先经过自动和人工定位与排38 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究列，圈定每个杂交点的范围，去掉坏点，信号弱和无信号点，然后用该软件读出荧光信号强度，最后以列表形式输出数据包括信号点强度中值、均值、方差、背景信号中值、平均值、方差及两种荧光信号比中值、均值等。5．1．2．9数据的归一化处理由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需要对输出结果进行标准化处理，以消除由于两种荧光强度不均引起的误差。本研究采用全局归～化对每张芯片进行独立的归一化处理。全局归一化建立在一定的假设基础上：红绿偏移在整个序列上是常数，即红绿荧光强度是通过常数因子相关联，R=kG。全局归一化的目标就是估计次常数因子C，通过减去c对比值进行校正，使得非差异表达基因的强度比为1，即把对数的重心移到0。l092(R／G)匕冷l092(R／G)一c=l092(R／kG)位置参数c=l092k，一般计算方法为取芯片上所有点对数比值的均数或中位数。5．1．2．10聚类分析利用菩萨蛮生物信息加工分析系统对芯片杂交结果进行聚类分析，通过聚类分析图可以直观地了解蜜蜂样品之间的基因表达差异。5．1．2．11显著差异表达基因筛选将GenePixPro6．0软件准化后的Cy5与Cy3两种荧光信号强度相比，’得到荧光信号强度比值(Ratio值)。差异表达基因判断标准：Ratio值大于2和小于O．5设定作为基因点有明显上调表达和明显下调表达的指标；0．5￡趸至n口．∞oo．一卜∞凸oo．nI．ot7nnn型oo≥Z一．价口参一n一一oo≥Zou∞．一≯．口n寸昏I)o【Iu可l__．Ij3∞．一本19西一10Du口uJN山』．匣苫一l_皇．IoJo∞一．dC．口寸卜寸oUN．o∞苫c—o_loJ厶一∞u=。工_o厶，(}{∞N=QLIols一}{Q∞霄屯一)(oD∞ou=l_o—3(1．乱n—noUN．Ip芑oa∞l_IBJl口13爵。篁IIIl时斗_o瓷=u×∞D∞矗一≯lll甜。日二Q一《N叮∞0_o．nno_I．山oo．∞h西．山oo“00+∞oo．o崞n一击oo．寸罱一．山oo．寸∞寸∞oo．一一．寸△小N”N—oo_，事Zl-nNt，nnNIoo≥Z一．8nnnn200≥Z一试一Nn旨一oo≥Z一．寸∞nnn一一oo≥ZI．8ncc冷Ioo≥ZI．19禽NIoo≥Zku∞．一≯．寸寸nN—oou弓I_cou∞．一h．n寸N卜ooou口II．1ou∞．一h．小n∞”一oDu口PlJI}u∞．一h．∞卜N卜ooou口l_cJ3∞．一A．160n10声u口LLlou∞．一x．nN寸寸ooou可I_cou∞．一h．—9寸n—ooo口口l_IJ∞o．o刊Nc．o卜o．0卅n一．0oo．o州nqo寸o．o刊nn．ono．o州N寸，o卜o．o州N一．ooo．o—：8N．oNo．0州卜一．ono．o州寸￡‘o10．o州∞qo—o．o州卜N．oN乙．o千Iqooo．o圳口n．oc1．0书8I．ooo．o州nc．oo一．∞∞∞o卜。一．9∞口。卜u#coJo∞一．u山．寸昏卜一noUc—II艺(B山《uI．10j。∞一．vd．口岔口t70UoN=奄10．I盈u13∞j至《星oJ。∞一．．dC．n寸一寸oU一．10_。g∞=一∞口IJDlJ—Q_o．I厶=一；芝ndr匣芝ndr匣至寸dr匣苫寸dl’匣苫寸dr匣乏寸dr配苫寸drg至ndf匣荟nLIr匣芝ndr岛芝寸n．衄oo．寸∞∞．∞oo．一；I-∞oo．寸口6-∞oo．寸西!．叫ool8心崞．∞oo．寸寸叩∞oo“∞2。∞oo．N00+叫oo．o—6_∞8．一心∞一．∞oo．一oNI-∞oo．9”NI．叫oo．n一西击oo．寸口叩∞00．寸一．一n—nnN—oo≥＼IZ一．on∞No登ooL芋Z一．n∞cc冷100≥Z一．Ic—nn200≥Z一．一西葛旨一oo≥Z一．t，A△NnN—oo每，Z一．基西N冷一oo≥ZI．寸昏岔NnN一6Io惫＼．Z一．寸昏西NnN—oo≥Z一．苫全一n—100事Z一．寸吼ANnN—oo、事Z一寻西∞一n—100事Z一．tr—”小Hn一一oo麓rZ一．t，小小NnN—ook芋Z一．寸岔口NnN—oo≥Zku∞．一x．nn口N—oou勺—工Jou的．一^．n卜no—ooo勺l_I】％∞．i．19口noo丑u勺EJ3∞．一套nc8Nooou口E’}3s．暑．9Scoo03puJoo∞．一函．小一∞∞ooDu勺—IJJ3∞．I^．o一心nooou口E-o∞．一x．n卜n6一o(1u弓—lJou∞．一^．1昏卜口ooou可l_cku∞．一h．口寸卜口ooou弓l_IJou∞．一x．nn∞n60ou≈—￡-o∞．1斗．一口。一ooou々—IJ-o∞．一x．N寸∞n—oDo弓l_LI．Iu∞．=．o嚣一90ou勺IuJ3∞．暑．西nSooou口=．I妖富暴鞋≤警遥gt杓’上瑚赵器基趣摇n∞-丑oo“罱．∞oo．N3JII．IoJ一霄==o∞∞o—N一一时工_Q—c—u_12山n一一．∞oo．N．1013∞-．Io∞oTlu2Qll芒foJ咖锄c一口二一o．II一．I爵△ul{一小．∞oo．一《厶．6口n∞oUn=．∞oo．N一．寸nI)nn一一oo—乒Z一．一卜NnnN—oo≥Z一．Ic—nnN—oo事Z一．一心nn”N一()o≥Z1．￡10冀N—oo≥Z一．葛ccnN—oo≥Z一．葛n禽N—oo≥ZI．0葛nnN—oo≥Z一．∞oN器200_／手Z一．∞一Nnn竺oo≥Z一．卜n—nnN—oo≈＼-Z-o∞．一^．一∞寸∞010^乞口=．1ku∞．～h．n余∞o—oou勺uJ．I3s．；．爨豁ooq3口暑ku∞．一x．△oNN^Io函u勺I_工J03s．景．∞n口一ooku∞．一x．”n△o—口6c13p基Du口暑J3∞．一习c￡一nloou口￡k¨IS．一x．卜n寸”ooou≈t_c．Iu自．一h．o崞一岔ooou弓Eku∞．一x．a口乱一一oou≈E’Iu∞．一x．N々Nnooou勺uJ譬U‘≯瞄)I．)oN主≯≈乏N2UI≯≈乏≯)IU-N≈芝Nl__o=uII：一uTl一时>．正oI_Il砖Z毽≈≈k舢o≈§．，～～皇≈飞koo=LII．一#一对￡=^f、．它。一对一uo∞∞时∞D^：∞LL一_霄LI一们}∽∞o一≈它一它LI母ooLI卜一一。no一(I_I芦∞上S山墨状罂型I睾{；颦撂馨导胛猛』邑ll-9僻豫害器裂趟，餐辖星七鞫’上辋嗡罨器武均<乙o。埋警襁斟岳钗秘≤扑二卜匿舻≮曩是 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究5．2．3中蜂头部可能与其抗螨特性相关的基因(1)以正常中蜂和意蜂和经大蜂螨胁迫处理的中蜂和意蜂头部差异表达基因为基础，综合各个基因杂交信号进行对比分析，筛选出可能与中蜂抗螨特性相关的基因。从图5．12对比结果可见，除末注释功能ESTs外，获得正常中蜂和意蜂头部差异表达基因共45个，其中经大蜂螨胁迫处理的中蜂和意蜂头部差异表达基因共21个，二者有16个差异表达基因的表达趋势相同。其中Alpha-amylase(mdcb_001540．y1．scf)是正常中蜂和意蜂纽表达显著上调的差异基因。但受大蜂螨胁迫后，中蜂和意蜂的Alpha-amylase基因均比对照组显著下调，因此该基因可能是蜜蜂头部受大蜂螨胁迫而表达显著下调的基因。对其杂交信号作进一步分析表明，中蜂的Alpha-amylase杂交信号较高，而意蜂的Alpha-amylase杂交信号较低，该基因作为中蜂和意蜂的差异表达基因，在大蜂螨胁迫后虽然下降趋势一致，表达量仍有区别，因此认为它可能与中蜂的抗螨特异性相关很高。Alpha-amylase在糖代谢中有重要作用，具有催化活性并能与阳离子结合。综合对比分析各个基因的杂交信号，发现29个正常中蜂和意蜂显著差异表达基因在受大蜂螨胁迫中蜂和意蜂头部的表达多数也具有相同趋势，但除Alpha-(1，3)一fucosyltransferaseC外，多数不显著。Alpha．(1，3)一fucosyltransferaseC是中蜂和意蜂之间差异表达基因，与对照中蜂相比，该基因在受大蜂螨胁迫中蜂头部的表达显著上调，因此该基因也可能与中蜂的抗螨特性有关。据陈继华(1997)报道，Alphaffl，3)-fucosyltransferaseC(mdcb．_009768．y1．scf)具有岩藻糖基转移酶活性，是岩藻糖或糖链生成物合成的关键酶，在组织损伤和炎症发生过程中起重要作用。中蜂在受到大蜂螨胁迫后，可能通过提高其表达量来修复组织损伤和相关症状。正常中意蜂差异表达基因图5-12对比示意图Fig5-12Sketchofcomparison52大蜂螨胁迫处理中意蜂表达差异表达基因 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究对5个大蜂螨胁迫中蜂和意蜂表达差异基因分析发现：CG3153．PB／isoformB(mdcb一006247．y1．scf)和MPOP4(mdcb008838．y1．scf)大蜂螨胁迫中蜂头部表达出现了显著上调，CG4998一PA(mdcb_002039．y1．scf)和Glucoseoxidase(mdcb_008488．y1．scf)出现了显著下调。对除去背景后杂交信号分析发现，与受大蜂螨胁迫意蜂相比，这四个基因在受大蜂螨胁迫中蜂头部的表达均出现下调或上调，而在其它组则无显著差异。这表明4个基因可能与中蜂的抗螨特性有关。其中CG3153一PB。isoformB具有参与蛋白结合功能；CG4998．PA功能目前还不明确；MILIP4在工蜂头部的表达量最低，关于其功能目前还不是很明确；Glucoseoxidase与细胞外膜和内质网相关，具有催化活性并在糖类代谢过程中具有重要作用。CGl0960．PB／isoformB(mdcb009846．y1．scf)在大蜂螨胁迫处理中蜂头部表达显著下调，而大蜂螨处理前后意蜂头部则无显著差异，因此该基因可能与中蜂的抗螨特性有关。CGl0960．PB，isoformB是细胞膜的组成部分，具有氢转运活性和碳水化合物的转运功能。(2)以大蜂螨胁迫处理后的中蜂头部差异表达基因为基础，参照此类基冈在其他三组中表达差异，综合各个基因杂交信号进行对比分析，确定了可能与中蜂抗螨特性相关的基因。与对照中蜂相比，确定有11个基因在大蜂螨胁迫处理中蜂头部表达出现显著差异，其中上调4个，下调7个，而在其他杂交组中则无显著差异。这表明大蜂螨对中蜂胁迫后，这些基因在中蜂头部表达出现差异可能跟中蜂抗螨特性有关。其中CG8369．PA(mdcb__005242．y1．scf)的功能还不明确；Heparin·bindinggrowthfactor1precursor(mdcb011969．y1．scf)具有生长因子活性，对信号传导和多细胞发育过程中有重要作用；Proteinlethal(2)essentialforlife(mdcb_009160．y1．scf)为一种蛋白致死因子。据文献报道，Vitellogenin(mdcb_005437．y1．scf)通过影响工蜂的劳动分工和觅食倾向控制着蜜蜂社会的组织结构，它控制着蜜蜂开始外出觅食的时间、寿命和觅食的种类(Robinson，2007)；60SribosomalproteinL15(mdcb_013133．y1．scf)与核仁核糖体的形成相关；Antennal-specificprotein3cprecursor(mdcb_．000955．y1．scf)是一种化学感受蛋白，ASP3在工蜂幼年时期，可能作为一种化学信息受体，对蜂巢内的化学物质，包括主要由脂肪烃组成的蜜蜂外壳表皮脂类物质产生识别作用(Dani，eta1．2005)。CG32843．PA(mdcb001658．y1．scf)功能尚不明确；EasterCG4920．PA(mdcb002209．y1．scf)与胞外区组成和Toll信号途径相关，并且具有蛋白水解、胰蛋白酶和酶原活性；T06E6．10(rndcb008552．y1．scf)与生殖发育系统相关，在促进生长调节和配子生成中有重要作用；TrpCG5996．PA，isoformAisoform153 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究(mdcb．_010895．y1．sef)与视觉感知相关，并具有钙离子转运活性，该基因可能与中蜂工蜂复眼能够发现大蜂螨有关。Tubulinalpha-Ichain(mdcb_008告82．y1．scf)参与蛋白结合。根据以上综合分析，筛选确定可能与中蜂头部可能与抗螨特性相关的18个(见表5．11)。5．3讨论5．3．1RNA质量评价在变性条件下，除蚜虫外的大多数昆虫中，28SrRNA会分解成两个同样大小的亚单位。这两个亚基间以氢键在靠近切割位点区域连接，这个切割位点位于28SrRNA分子的一半之处，这种特异的断裂被称之为隐裂(hiddenbreak)(OginoK，1990)。因此，昆虫RNA在变性电泳时，虽然28SrRNA与18SrRNA在比例上不呈关系，但仍可认为总RNA质量良好。5．3．2数据归一化处理数据的归一化处理是为了消除系统产生的误差。用于cDNA微阵列的荧光标记物有多种，其中最常用的为Cy3和Cy5，它们一般要满足一定的标准：在光学上能较好分开，与酶具有高度特异的结合活性，干燥时具有较强的荧光活性。由双色荧光标记法所引起的系统变异包括以下几个方面：①荧光物质的物理和化学属性；②扫描仪等硬件的设计；③标记的方法。理论上，在自身对照实验中所有基因的Cy3／Cy5应为1。由双色荧光标记所产生的系统偏倚导致在Cy3和Cy5标记物具有相同的量时，它们的荧光强度并不相等。因此，在进行统计分析前，如何鉴别差异表达基因和基因表达模式的聚类等，应鉴别系统误差并对系统误差进行校正。全部基因归一化是建立在以下假设条件下的：①芯片上的绝大多数基因都是非差异表达的，仅有非常小的基因在两个mRNA样品中的表达有差异。②上调和下调的表达水平具有对称性。本试验基于以上两点对芯片扫描数据采取全局归～化处理，但其有以下缺点：由于不同的生物样品的表达图谱通常具有较大的差异，因此使用全部基因或绝大多数基因进行归一化将导致不同样品的归一化的基础存在差异，建立在全部基因基础上的归～化方法在准确性方面受到一定的限制。5．3．3差异基因的筛选 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究基因芯片实验的主要目的之一是发现两个样本件差异表达基因，多数情况下，～个样本为实验组，另一个样本为对照组，绑观察某一待测样本(实验组)与对照组样本相比的表达改变情况。通常采用基因在实验组和对照组中信号的比值来衡量基因在两种状态下基因的表达差异。差异表达基因的筛选主要有两种方法：Z值法和倍数法。Z值法假设表达的比值满足正态分布，在计算中对比值取其Z值，及所有基因比值的平均值为u，方差为。则每条基因的z值为Z=(X．“)／o，其中X表示这条基因的表达比值。把±2作为Z值的判别标准时，这种方法会筛选出5％的差异表达基因。这种方法的缺点是即使实验体系中没有一条差异表达基因或者有大量的基因发生改变Z值法还是会挑选出5％的差异表达基因。而倍数法是筛选差异表达基因最简单最直接的一个筛选方法，是以实验组和对照组荧光的比值倍数作为筛选的标准，一般来说在单张芯片中比值(ratio=实验组的基因荧光强度值，对照组基因荧光强度值)大于2或者小于0．5即认为是表达有差异。大于2的是上调表达基因，小于O，5是下调表达基因。(O．5，2)这一标准最早由表达谱芯片的鼻祖斯坦福大学经过大量数据验证提出，国际上各个实验室都把它作为常规标准使用(李瑶，2006)。虽然倍数法也有其缺点，为了简单直接筛选差异表达基因，本文采用了倍数法。5．3．4筛选基因分析在筛选获得的18个可能与中蜂抗螨特性相关的差异表达基因中，目前以卵黄蛋白原(Vitellogenin)、化学感受态蛋白(ASP3)和a．1，3岩藻糖基转移酶(Alpha-(1，3)-fucosyltransferaseC)的研究较为深入，因此，依据相关报道对这三种基因与中蜂的抗螨性分子机理的关系作一讨论分析。在一项最新的研究中，MindyNelson及其同事发现有卵黄蛋白原基因(Vitellogenin)基因与蜜蜂的许多社交活动密切相关，他们认为该基因决定了与蜜蜂社交能力相关的许多生物特征。由于这一基因最初是在卵细胞的产生过程中发现，因而得名。近年来，社会性昆虫不同级型产卵力的研究主要集中于卵黄蛋白原的合成和吸收，以及激素调节上。研究表明，卵黄蛋白原除了作为卵黄蛋白的主要前体之外，它还是工蜂咽下腺分泌的幼虫食物蛋白的前体(郑火青，2005)。蜜蜂卵黄蛋白原的eDNA测序已完成，并已被用于RNA干涉实验。RNA干涉实验结果表明，卵黄蛋白原在工蜂的职能分化和行为发育方面起到了重要的作用，也就是说，卵黄蛋白原功能已经从卵黄前体向社会性蛋白发生了转变(Nelson，55 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究2007)。Robinson等(2007)也发现，卵黄蛋白原ViteUogenin通过影响工蜂的劳动分工和觅食倾旭控制着蜜蜂社会的组织结构，它控制着蜜蜂开始外出觅食的时间、寿命和觅食的种类。一般把蜂螨一放到中蜂身上，中蜂就抖动得很厉害，抖动很长时间以后，即引起了周围其它工蜂的注意，别的工蜂就爬到它身边，不久就把蜂螨叼走了。通过深入研究和观察，研究人员发现，只有中蜂有只有中蜂有这样个体之间利用声波来传递不同信号求伙伴来帮忙的这种特性。卵黄蛋白原决定了与蜜蜂社交能力相关的许多生物特征，因此在大蜂螨胁迫下，中蜂这种行为可能会通过卵黄蛋白原表达差异体现。Antermal—specificprotein3cprecursor(mdcb_000955．y1．scf)是～种化学感受蛋白，ASP3在工蜂幼年时期可能作为一种化学信息受体，对蜂巢内的化学物质，包括主要由脂肪烃组成的蜜蜂外壳表皮脂类物质产生识别作用(Dani，etal．2005)。李红亮等(2007)认为Ac—ASP3在获得花蜜、花粉以及其他一般的气味分子的过程中不发挥重要的作用，而在区别蜂巢内蜜蜂的表皮化学物质的活动中具有重要关联。相关研究发现，中蜂触角能接受大蜂螨的气味物质，从而引起咬蜂螨行为(杨冠煌和林桂莲，2002)。大蜂螨胁迫处理后的中蜂头部的ASP3基因表达上调，表明中蜂可通过提高ASP3的表达来影响自身抗螨行为。Yang等(2005)分析了蜂螨对蜜蜂免疫系统的影响。他们将heat-killed大肠杆菌注射受病毒感染的蜜蜂，用这种灭活细菌来引发蜜蜂的一种免疫应答。研究人员测量了每个米等中的病毒量后，惊奇地发现，当蜜蜂接触细菌时，滋生螨的蜜蜂体内病毒快速度增加到非常高的水平。没有螨的蜜蜂中的病毒水平在注射细菌后没有变化。Alpha-(1，3)一fucosyltransferaseC具有岩藻糖基转移酶活性，它是岩藻糖或糖链生成物合成的关键酶，在组织损伤和炎症发生过程中起重要作用(陈继华，1997)。Alpha．(1，3)．fucosyltransferaseC在大蜂螨胁迫中蜂头部表达显著上调，表明该基因可能在中蜂受到大蜂螨胁迫后，可通过提高其表达量来修复组织损伤和相关症状。正常中蜂和正常意蜂头部有19．8％的基因表达有显著差异。这是因为中蜂和意蜂分别属于不同的蜜蜂种类，中蜂是东方蜜蜂的一个亚种，而意蜂则属西方蜜蜂的亚种，由于不同蜂种的生物学特性不尽相同，因此不同种间蜜蜂的基因表达差异也较大。通过基因功能分类发现，表达差异显著改变的基因覆盖了中蜂和意蜂生理生化过程的各个方面，诸如分子结合(binding)、催化活性(catalyticactivity)、真菌抵御(defenseresponsetofungus)、细胞等(cell)等。例如在真菌抵御中，就有编码4个王浆蛋白亚基(MRJPI、MILIP3、MPOP4和MtLIP5)的基因表达发生下调，覆盖范围广泛。这可能是由于中蜂的分蜂性较强，不易养成大群，并且工蜂饲喂的王浆是按虫龄而递增的，王浆只能满足幼虫的需要，没有多少剩余。加上大流56 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑eDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究蜜期，工蜂抢巢房贮蜜，容易产生蜜压脾，没有空房让蜂王产卵，迫使蜂王产卵量下降，为了集中力量采蜜，工蜂的王浆分泌量会减少，致使中蜂产浆能力远远比不上意蜂。因此，本次芯片杂交结果也从在分子水平揭示了蜜蜂产浆能力差别的有力证据。同时结果显示，编码MRJP2和MRJP7基因表达显著上调，这两个基因可能与中蜂和意蜂的其他生物学差异有关。GMPsynthase【glutamine-hydrolyzing](mdcb_011876．y1．sef)是中蜂和意蜂间的差异表达基因(表达显著下调)，但两种蜜蜂的GMPsynthase基因在大蜂螨胁迫后均比对照表达显著上调，因此该基因可能是蜜蜂头部受大蜂螨胁迫表达显著上调的基因。GMPsynthase【glutamine-hydrolyzing](rndcb_01876．y1．scf)与胞浆有关。alpha-glucosidase(mdcb_005482．y1．set",rndcb一011031．y1．scf)在中蜂和意蜂中表达无明显差异，在受大蜂螨胁迫的中蜂和意蜂中均出现显著性上调，这表明alpha-glucosidase在这两种蜜蜂中受大蜂螨胁迫影响均发生了相同改变。alpha-glucosidase在分子功能中具有催化活性，并且他是蜜蜂知道消毒蜂蜜的化合物。本章中对未注释基因没进行相关分析，这些探针信息将在今后条件具备时进行更新补充，进而分析它们与中蜂抗螨特性的相关性。此外还需对筛选出的差异表达基因进一步作荧光定量PCR鉴定，以检验筛选结果的正确性。5．4本章小结本章通过不同蜜蜂处理样本与中蜂头部eDNA芯片的杂交，筛选获得了不同处理蜜蜂样本头部的差异表达基因。杂交结果显示，在正常中蜂和正常意蜂头部ESTs中，有142个，占总数的19．8％有表达差异：在大蜂螨螨胁迫的中蜂／正常中蜂头部ESTs中，有48个，占总数的6．7％出现表达差异；在大蜂螨螨胁迫意蜂／正常意蜂头部ESTs中，有22个，占总数的3．1％出现表达差异；在大蜂螨胁迫中蜂／大蜂螨胁意蜂头部ESTs中，有48个，占总数的6．7％出现表达差异。经综合分析，筛选获得了18个可能与中蜂抗螨特性相关的ESTs，并对其中的卵黄蛋白原Vitellogenin、化学感受态蛋白ASP．3和a．1，3岩藻糖基转移酶Alpha-(1，3)-fucosyltransferaseC的分子机理进行了初步分析。57 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究第六章总结与展望大蜂螨是危害严重养蜂业的高发蜂病，本研究根据我国原产中华蜜蜂所具有的不同于意大利蜜蜂的优良抗蜂螨性状，基于以测序的中蜂头部cDNA文库和获得的8569条EST序列，以及生物信息分析基础，开展具有自主知识产权的中蜂头部cDNA芯片的研制，并建立相应的芯片支持数据库；基于此cDNA芯片，分别对正常中蜂和意蜂、中蜂和意蜂在大蜂螨胁迫条件下的基因表达差异进行检测分析，在此基础上进行了中蜂的抗螨特性及其相关特性分子机理的综合分析。6．1结论I利用已构建和完成ESTs测序的中蜂头部cDNA文库，从8569条ESTs序列中挑选筛选出了1025条ESTs序列，其中属于Singlets的ESTs为639条，属于Congtigs的ESTs为386条，几乎覆盖了所有序列片段。通过PCR扩增，最终获得717条高质量ESTs片段，占总数的70％以上。通过BLAST对ESTs序列功能进行了注释，并对注释ESTs进行了GO分类，构建了较为完善的中蜂头部cDNA芯片支持数据库。Ⅱ对筛选ESTs进行PCR扩增和纯化，采用点样法制备中蜂头部cDNA芯片，该芯片分为三个矩阵，每个矩阵又分为4个亚矩阵，每个矩阵含有717×2个中蜂头部ESTs探针。对芯片的扫描检测结果表明，该芯片矩阵排布整齐，各探针点外形规则，重复点大小均一，质量较好。m通过不同处理荧光标记蜜蜂样本eDNA与中蜂头部eDNA芯片杂交和杂交结果的数据分析，初步筛选出了螨胁迫蜜蜂及相关对照样本的差异表达ESTs。在综合分析四组杂交数据的此基础上，筛选出可能与抗螨特性相关的18个中蜂头部基因，并对其中的卵黄蛋白原Vitellogenin、化学感受态蛋白ASP3和a-1，3岩藻糖基转移酶Alpha-(1，3)一fucosyltransferaseC与中蜂抗螨分子机理的关系进行了初步分析。此外，还发现编码王浆主蛋白系列基因在中蜂和意蜂间表达差异显著。6．2本研究创新点目前，我国蜜蜂基因芯片研究完全空白，国际上蜜蜂基因芯片的研究也起步不久，主要 浙江大学硕士学位论文中华蜜蜂脑cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性检测研究有西方蜜蜂cDNA芯片和寡核苷酸芯片，尚无应用于蜜蜂抗螨机制研究和基因筛选相关研究报道。I本研究首先构建了具有自主知识产权的中华蜜蜂头部cDNA芯片，该芯片包含了中华蜜蜂头部主要基因信息，为在分子水平上研究蜜蜂行为学提供了一个灵敏、高效的技术平台；II本研究首先将基因芯片用于蜜蜂抗螨特性分析，从分子水平进行了中蜂抗螨特性及相关特性的分子机理解析探索；Ⅲ本研究筛选出了与可能与中蜂抗螨特性相关的18个基因，并发现了蜜蜂主蛋白基因表达谱变化与抗螨性相关性的一般规律。6．3展望I本研究所构建的cDNA芯片虽然已包含了中蜂头部的cDNA基本信息，但由于各种因素的限制，仍有一些ESTs未涵盖。因此今后应作进一步补充完善。Ⅱ由于蜜蜂样本材料的限制，本文选取的蜜蜂材料包含了多个日龄(13．21日龄)、四种样品组合，进行了芯片杂交检测，大体上对不同蜜蜂处理样本的基因表达进行了研究。但对不同日龄间蜜蜂相关基因的表达差异尚未进行深入研究。今后可以针对单一日龄的蜜蜂样本作进一步研究分析，以完善研究。ⅡI对本研究中所发现的主要差异表达基因，因时间所限，尚未能作进一步的差异表达验证。计划继续利用荧光定量PCR方法，对这些基因在不同蜜蜂处理样本中的表达水平进行检测，并与芯片检测结果进行比较，以确定这些差异表达基因的可靠性。Ⅳ本研究所构建的中蜂头部cDNA芯片支持数据库中还有相当一部分基因的功能注释及分类还不完善，今后需继续进行更新补充，增强芯片的信息功能。59 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