《蜂蜜中丙三醇含量的测定方法》编制说明 13页

《蜂蜜中丙三醇含量的测定方法》编制说明一、标准制定的任务来源及意义1、任务来源本标准是根据中华全国供销合作总社供销厅函科字[2013]9号文下达的任务，由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局负责，名称为《蜂蜜中丙三醇含量的测定方法》，计划编号为2013GH-1-016。2、制定标准的意义蜂蜜是一种高度复杂的糖类饱和溶液，其中约75%是糖分，约24%是水分。文献[1-3]报道蜂蜜中某些适高渗压的酵母菌可将葡萄糖转化成多羟基化合物，如丙三醇、D-阿糖醇和赤藓醇等。蜂蜜中丙三醇的含量与蜂蜜中存在的微生物数量之间有一定的关系。因此丙三醇含量可以作为衡量蜂蜜品质的一个指标，建立蜂蜜中丙三醇含量测定方法的标准就很有必要。二、编制依据本标准按照《GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分标准的结构和编写》的要求进行编写。三、研究背景及内容1研究对象丙三醇，glycerol，俗称甘油，是一种无色、透明、无臭、粘稠液体。化学式C3H8O3，分子量92.09，CAS登录号56-81-5。丙三醇能与水和乙醇互溶，能溶于乙酸乙酯，不溶于苯、氯仿、四氯化碳和石油醚等。2蜂蜜中的丙三醇分析方法现状食品中丙三醇的分析方法有容量法、比色法、荧光光谱法、液相色谱法、气相色谱法[4]和酶分析法[5,6],上述方法中，适用于蜂蜜样品的有液相色谱法、酶分析法，衍生化-气相色谱-质谱联用法[7]。胡小钟等人[7]采用N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA ）作为衍生试剂，对蜂蜜中的丙三醇进行硅烷化衍生反应，对衍生产物进行气质联用分析。丙三醇的硅烷化衍生产物在气质联用仪上的响应高，且能与其他的多羟基化合物有效分离，抗干扰能力强。本标准对提取方法、硅烷化反应的条件、仪器条件进行了考察优化，并引入内标物1,2,4-丁三醇，对提取过程、衍生反应和离子化过程进行校正，采用内标法定量，进一步提高了定量的准确性。3提取方式考察3.1提取溶剂的选择提取溶剂应对蜂蜜样品和丙三醇有较好的溶解性，能最大限度的提取蜂蜜样品中的丙三醇。同时，提取溶剂应不与衍生试剂BSTFA发生反应。因此，排除极性较小的正己烷、石油醚、苯、四氯化碳等溶剂，以及水、甲醇、乙醇等含羟基溶剂。3.1.1提取溶剂的溶解能力根据上述原则，本标准选择了N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亚砜（DMSO）、吡啶和四氢呋喃四种溶剂进行考察。结果发现四氢呋喃不能溶解蜂蜜，其他三种溶剂能够完全溶解蜂蜜。因此，在后续研究中只考察DMF、DMSO和吡啶三种溶剂。3.1.2提取溶剂对衍生的影响在同等的加标水平下，分别考察蜂蜜加标样品在上述三种溶剂提取后的衍生效果。将阴性蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1.0g于50mL干燥离心管中，加入内标物10mg/mL的1,2,4-丁三醇50μL，添加10mg/mL丙三醇50μL，涡旋混匀，用量筒准确加入25mL不同衍生试剂（N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亚砜（DMSO）、吡啶，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05mL溶液，加入衍生试剂N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）0.05mL，涡旋1min，室温下静置10min后，加正已烷0.9mL，定容至1.0mL，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。衍生后色谱图见图1-图3。 图1以吡啶为提取溶剂的衍生图谱图2以DMSO为提取溶剂的衍生图谱 图3以DMF为提取溶剂的衍生图谱由图1-3可见，三种提取溶剂下，丙三醇的衍生产物峰面积相当，以DMF为提取溶剂时，丙三醇衍生产物峰面积略高一点；丁三醇的衍生产物峰面积：DMF>DMSO>吡啶。且吡啶和DMSO做提取溶剂时，衍生副产物较多，色谱图上杂峰较多。最终确定DMF作为提取溶剂。3.2提取方式为了尽量完全的提取蜂蜜中的丙三醇，需要使蜂蜜完全溶解在溶剂中，常用的提取方式有：涡旋、超声、振荡等。蜂蜜样品的粘稠度各不相同，对于比较稀的蜂蜜样品，涡旋和超声可以使之充分溶解；对于比较粘稠的样品，仅靠涡旋和超声不足以使其溶解，这时候需要用手猛烈振摇。为了保证溶剂对蜂蜜中丙三醇的提取效率，最终确定涡旋、振摇和超声结合的方式，来确保蜂蜜充分溶解于溶剂。3.3试剂和容器的除水由于水会消耗硅烷化试剂BSTFA，而DMF溶剂自身会含有少量水分，且放置过程中可能会吸收空气中的水分，因此DMF在使用前要加入适量无水硫酸镁做除水处理。同理，实验过程中用到的所有容器都应干燥。 经考察确定的提取方法如下：将蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1.0g于50mL干燥离心管中，加入内标物10mg/mL的1,2,4-丁三醇50μL，涡旋混匀，用量筒准确加入25mLN,N-二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。4衍生化条件优化BSTFA的硅烷化反应迅速、衍生产物稳定性好、在气质联用仪器上响应高，非常适合用于气相的衍生化。但同时，BSTFA非常活跃，考虑到蜂蜜样品中存在的其他多羟基化合物，可能与丙三醇竞争衍生反应，因此BSTFA要大大过量，以免影响丙三醇的衍生；在满足灵敏度要求的情况下，用于衍生的样品量要尽量少，以减少其他衍生产物对丙三醇测定的干扰。衍生后，以正己烷涡旋提取衍生产物，离心后取正己烷层分析。4.1衍生试剂用量考察将蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1.0g于50mL干燥离心管中，添加10mg/mL丙三醇20μL，加入10mg/mL的1,2,4-丁三醇50μL，涡旋混匀，用量筒准确加入25mLN,N-二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05mL溶液，加入不同量的衍生试剂N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）（0.025mL,0.05mL和0.10mL，各两个平行样），涡旋1min，室温下静置10min后，加正已烷定容至1.0mL，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。结果发现：丙三醇和内标丁三醇在三种衍生试剂用量条件下，衍生产物峰面积没有显著性差异（见表）。最终，确定BSTFA的用量为0.05mL。表1不同衍生试剂用量条件下的衍生产物峰面积衍生试剂体积（mL）丙三醇衍生产物1,2,4-丁三醇衍生产物0.0251620572242371622352268390.051659432284951637512296820.1170656235668 1713482349744.2衍生时间考察确定了衍生试剂用量后，对反应时间进行考察（30s，1min，2min和5min）。将蜂蜜样品充分搅拌均匀，称取1.0g于50mL干燥离心管中，添加10mg/mL丙三醇50μL，加入10mg/mL的1,2,4-丁三醇50μL，涡旋混匀，用量筒准确加入25mLN,N-二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05mL溶液，加入衍生试剂N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）0.05mL，涡旋不同时间（30s，1min，2min和5min），室温下静置10min后，加正已烷0.9mL，定容至1.0mL，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。结果发现：丙三醇和内标丁三醇在四种衍生时间条件下，衍生产物峰面积没有显著性差异（见表2）。最终，确定衍生时间为1min。表2不同衍生时间下的衍生产物峰面积衍生时间（min）丙三醇衍生产物1,2,4-丁三醇衍生产物0.5364539192269378874223558136762520926736973522798923800622300763820022344545372745210173372583213541考察后确定的衍生条件：取待衍生溶液0.05mL于1.5mL塑料离心管中，加入0.05mLN,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA），液体混匀器上快速混匀1min，室温下静置10min后，加正已烷0.9mL，定容至1.0mL，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。5内标物的选择胡小钟[7] 等人采用外标法测定蜂蜜中的丙三醇，本研究考虑到引入内标可以校正衍生化反应进行的程度以及离子化过程可能存在的差异，因此考虑选择一种与丙三醇结构相似，能够被BSTFA衍生，在气质联用仪器上保留行为和响应都比较接近的化合物作为内标。1,2,4-丁三醇是与丙三醇在结构和性质上最为接近的化合物，同样都含有三个羟基，因此选择1,2,4-丁三醇作为内标。经实际衍生考察，发现1,2,4-丁三醇与丙三醇有比较接近的衍生效率，且二者的衍生产物在气相上可以实现基线分离。6仪器条件6.1气相色谱条件色谱柱：J&W122-5532,30m×0.25mmi.d×0.25μm，或相当者；载气：高纯氦气（≥99.999%），流速：1.0mL/min；升温程序：60℃保持1min，以30℃/min升至240℃保持2min，再以50℃/min升至280℃；进样口温度：250℃；进样量：1µL；进样方式：脉冲不分流进样；接口温度：280℃。该条件下，丙三醇衍生物和1,2,4-丁三醇衍生物的保留时间分别为4.8和5.2min。6.2质谱参考条件离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；电离模式：EI；溶剂延迟时间：4.5min；数据采集模式：选择离子监测方式（SIM），监测离子见表3。表3选择离子表待测物保留时间Retentiontime(min)定性离子IdentificationIons(m/z)定量离子Quantitativeions(m/z) 丙三醇衍生物4.8117.0,205.0147.01,2,4-丁三醇衍生物5.2219.1103.1对丙三醇的衍生产物进行质谱全扫描，发现主要有73.1,103.1,117.0,147.0和205.0五个特征离子。对1,2,4-丁三醇衍生产物进行质谱全扫描，发现主要有73.1,103.1,147.0和219.1四个特征离子。由于二者结构相近，所以有可能产生相同的碎片离子，如73.1,103.1和147.0。由于二者在色谱上可以完全分离，所以即使同样的特征离子也不会干扰测定。选择丰度较高的147.0和103.1分别作为二者的定量离子。丙三醇衍生物的定量离子m/z147.0应为单硅烷化产物（m/z164）丢失一个羟基（m/z17）产生；定性离子m/z117.0应为定量离子m/z147丢失两个甲基（m/z15）产生；定性离子m/z205.0可能为双硅烷化产物（m/z236）丢失一个羟甲基（m/z31）产生。1,2,4-丁三醇衍生物的定量离子m/z103.1应为单硅烷化产物（m/z194）丢失三甲基硅烷基（m/z73）和一分子水（m/z18）产生；定性离子m/z219.1应为双硅烷化产物（m/z266）丢失两个甲基（m/z15）和一个羟基（m/z17）产生。7空白试验空白试验即除了不加样品，其他操作与样品衍生一样。用量筒准确加入25mLN,N-二甲基甲酰胺（dimethylformamide,DMF，需提前加入无水硫酸镁除水），加盖涡旋使其充分溶解（如有必要需用手猛烈振摇），超声15min。准确量取0.05mL溶液，加入衍生试剂N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA）0.05mL，涡旋不同时间（30s，1min，2min和5min），室温下静置10min后，加正已烷0.9mL，定容至1.0mL，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。8标准衍生为了保证标准衍生与样品衍生步骤操作的一致性，需要把丙三醇和内标1,2,4-丁三醇配在一起，丙三醇浓度分别为0.8mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L，内标1,2,4-丁三醇浓度都为20.0mg/L 。对应蜂蜜样品中的丙三醇含量为20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg。取0.05mL系列混合标准溶液于1.5mL塑料离心管中，加入0.05mLN,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（BSTFA），液体混匀器上快速混匀1min，室温下静置10min后，加正已烷0.9mL，定容至1.0mL，加盖涡旋，高速离心，上层清液用吸管吸出，供气质联用仪测定。四、方法学验证1标准曲线和定量限丙三醇检测限为5mg/kg，定量限20mg/kg，线性范围（linearrange）0.8-100μg/mL。图4为阴性蜂蜜样品衍生后图谱。图5为10µg/mL丙三醇标准溶液衍生图谱。图6为阴性蜂蜜样品中添加了500mg/kg丙三醇后的衍生图谱。图7为丙三醇衍生产物的质谱图。图8为内标1,2,4-丁三醇衍生产物的质谱图。图4阴性蜂蜜样品衍生图谱 图5标准样品衍生图谱（10µg/mL，1丙三醇，21,2,4-丁三醇）图6阴性蜂蜜样品添加丙三醇衍生图谱（500mg/kg，1丙三醇，21,2,4-丁三醇） 图7丙三醇衍生产物质谱图图81,2,4-丁三醇衍生产物质谱图2回收率和精密度选取阴性蜂蜜样品，添加水平20,100,500mg/kg，每个添加水平6个平行样，回收率94.6-105.8%，精密度2.9-13.5%。回收率数据见表4. 表4阴性蜂蜜添加回收率和精密度（n=6）加标（mg/kg)20100500第一批19.5121.4477.6　20.6115.6491.7　22.9106.8486.7　18.495.9471.3　15.5101.3495.8　22.193.6511.2平均值19.8105.8489.1回收率%99.2105.897.8RSD%13.510.42.9第二批22.496.1491.3　21.488.7487.6　18.7106.7475.3　16.2111.2512.8　17.993.5520.7　16.998.3527.6平均值18.999.1502.6回收率%94.699.1100.5RSD%13.18.54.1第三批23.1105.7497.2　18.491.6481.3　17.287.6486.5　22.4116.4477.6　20.5112.4516.8　23.7108.8508.5平均值20.9103.8494.7回收率%104.4103.898.9RSD%12.711.23.2五、实际样品检测情况本实验室开展蜂蜜中丙三醇含量检测工作已有两年多，绝大多数蜂蜜样品中都含有丙三醇，含量在100-1000mg/kg范围，含量低于定量限20mg/kg的样品极少。六、征求意见情况汇总 参考文献[1]　SpencerJFT,SallansHR.Can.J.Microbiol.[J],1956,2:72.[2]　PetersonWH,HendershotWF.Appl.Microbiol.[J],1958,6:349.[3]　LaubE,MarxR.Lebensmittelchem.Gerichtl.Chem.[J],1987,41:110.[4]　AvelliniP,DamianiP,BuriniG.J.AOAC[J],1977,60(3):536.[5]　HuidobroJF,ReaME,deAndradePCBetal.J.Agric.FoodChem.[J],1993,41:557.[6]　Fernandez2MuinoMA,SanchoMT,MuniateguiSetal.J.Sci.FoodAgric.[J],1996,71:141.[7]胡小钟，余建新，林雁飞，吴涛，童维平，气相色谱-质谱联用法测定蜂蜜中丙三醇的三甲基硅烷化衍生物，分析科学学报，20（2）：154-156。