从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取β-1，3-葡聚糖的分析 91页

p．1，3．葡聚糖的制备工艺，实现p—l，3一葡聚糖与酵母抽提物的联产。利用单因素实验和正交实验确定了影响多糖纯度最重要的影响因素，然后利用响应面分析法得出酶添加量A、碱溶温度B、碱溶浓度C三个因素与多糖纯度(Y)之间的回归方程为：Y=．1174．3175+0．1755xA+27．3212xB+59．3075xC．6．75x104xAB．4．5x10一×AC．0．253xBC．1．1267x104xA2．0．1606xB2-5．6467xC2确定了最佳工艺条件为：酶添加量为470U／g，碱溶浓度3．2％，碱溶温度81．5*0。在最佳工艺条件下，酵母抽提物得率达69．92％，多糖得率达15．02％，p．1，．3．葡聚糖含量76．21％、蛋白质含量1．52％。4．以啤酒酵母、活性干酵母为原料与酒精酵母比较进行多糖提取实验，通过比较产品的组分得知：本研究的提取工艺也适用于啤酒酵母和活性干酵母；酒精酵母中p．1，3．葡聚糖的总量高于啤酒酵母和活性干酵母，证明了酒精酵母提取p．1，3．葡聚糖具有较大的开发潜力。5．对酵母多糖样品进行了理化性质分析、初步纯度鉴定、单糖组分分析和分子结构分析，研究结果表明：酵母多糖样品难溶于水及多种有机溶剂，能在二甲基亚砜中形成稳定的悬浮液，产品由单一组分葡萄糖组成，13．葡聚糖分枝度约为21％，表明本实验制备的p．1，3．葡聚糖具有较高的生物活性。关键词：酒精成熟醪回用率酵母抽提物D—l，3．葡聚糖Ⅱ STUDYONEXTRACTIONOFp-1，3-GLUCANFROMALCOHOLYEASTINⅣ丛TUREFERⅣ匝NTEDMOLASSESⅣ【ASHABSTRACTThe21stcenturyisresourcesandtheenvironmenttime，Usingtheresources，protectingtheenvironmentisinevitablerequestofthenationaleconomysustaineddevelopment．Thistopictaketheutilizationastheguidingprinciple，proposedthetechnicalchangesduringalcoholproductionforthefirsttime，recycledthealcoholyeastfromfermentedmashinordertoachievetheco-productionofhi曲additionalvalueproducts，suchasalcoholandtheyeast，recycledwastealcoholyeasttoincreasetheeconomiceffficiency．Thisexperimentaimstoincreasereuserateofwasteliquid，reducethepollutionloadofwastewater,andcutdowntheexpensesofpollutiontreatment，developanewefficientpathfortheproductionstructureadjustmentofsugarmanufacturingindustryandcomprehensiveutilizationofby—products，andprovidethepracticalandfeasiblebasisfortheindustrializationproduction．TheprojecthasstudiedtheIg basictheoryandtechnologicalconditionsofvariousaspects，inducesbrieflyasbelow：1．Determinedthecentrifugalconditionsofmaturefermentedmashandtechnicalconditionsofyeastputtychemicalwashing：thevolumeofwashwateris30％，thenumberofwashtimeis3,thecentrifugalrotationis3000r／min，centrifugaltimeislOm；Theyeastputtychemicalwashinguses1．75％tartaricacidtowash30minfirst，thenusesO．1％sodiumbicarbonatetowa．sh．Underthisconditions，Theyieldofdistilleryyeastreaches1．5％，thematurefermentedmashalcoholloses3％，thetotalsugarcontentofobtaineddistilleryyeastishigherthanfreshydast．2．Theexaminationhascomparedthetechnicalindexdifferencesbetweenconventionalcraftandthenewcraftwasteliquid，andexperimentedthereuserateofusingwasteliquidtoreplaceclearwater．ThestudyshowthattheSSofnewcraftalcoholwasteliquiddropped53．3％，CODdecreased34％，BODdropped56．9％，thisaddedtoreducethedifficultyofwasteliquidtreatmentgreatly．Thereuserateofusingwasteliquidtoreplaceclearwaterhasreachedto20％，enhancedfourtimescomparedtotheconventionalcraft，andthereuserateofyeastwashingwasteliquidreached70％．3．Thestudytalcedthedistilleryyeastasrawmaterial，hasdeterminedtheautolysis—ultrasonic-enzymolysis·-alkalidissolved-oxidationprocesstooptimizethepreparationcraftofp一1，3一glucan，andachievedtheCO．productionofp-l，3-glucanandyeastextracts．TheexperimenthasusedthesinglefactorIV experimentandtheorthogonaltodeterminethemostinfluencingfactorsofpolysaccharidepurity,andhasusedthesurfaceanalyticmethodtoobtaintheregressionequationbetweenthreefactorsoftheadditionofenzymeA，thealkalidissolutiontemperatureB，thealkalidissolutionconcentrationC，andthepolysaccharidepurity∽is：Y=一l174．3175+0．1755xA+27．3212xB+59．3075xC．6．75x10r4×AB．4．5x10一xAC．0．253xBC．1．1267×104×A2．0．1606xB2-5．6467xC2‘Thisstudyhasdeterminedthebesttechnologicalconditionsare：theadditionofenzymeis470U／g，thealkalidissolutionconcentrationis3．2％，the。alkalidissolutiontemperatureis81．5"C．Underthebesttechnologicalconditions，theyieldofyeastextractsandpolysaccharidereached69．92％，15．02％，respectively；thecontento邱-1，3一glucanandproteinare76．21％，1．52％．一4．Thestudyhastakenthebeeryeast、theactivedryyeastasrawmaterialonthepolysaccharideextractiontocomparewiththedistilleryyeast．Throughthecomponentcomparison，wehasacquired：theextractionprocessofthisresearchisalsosuitableforthebeeryeastandtheactivedryyeast；thedistilleryyeastcontainmore8-1，3一glucanthanbeeryeastandactivedryyeast，thishasproventheextractionofp一1，3一glucanfromdistilleryyeasthasthebigdevelopmentpotential．5．ThisstudyhascalTyonthechemicalpropertyanalysisoftheyeastpolysaccharidesample，thepreliminary‘purityappraisal，the"monosaccharideV proximateanalysisandthemolecularstructureanalysis．Thefindingsindicated：Theyeastpolysaecharidesampledifficulttodissolveinthewaterandmanykindsoforganicsolvents，canformthestablesuspendingliquidinthedimethylsulfoxide．Theproductiscomposedofglucoseasthesolecomponent，thebranchingdegreeof[3-glucanis21％，theresultsshowsthatthep一1，3一glucanpreparedintheexperimentprovedtohavethehi曲biologicalactivity．KEYWORDS：alcohol；maturefermentedmash；reuserate；yeastextract；D一1，3-glucanVI 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。论文作者签名：学位论文使用授权说明朋年多月，君日本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：哦口时发布口解密后发布(保密论文需注明，并在解密后遵守此规定)论文作者签名一名：多f敬彩年二月 从蕾l酒精成|b睁醇母中提取卢一1，3一葡聚糖的研究1．1论文的选题背景第一章文献综述制糖工业是广西的支柱产业之一，甘蔗糖蜜是制糖过程的副产品，用其生产酒精的成本低，可获取较好的经济效益。但酒精生产过程中所产生的酒精废液，是难降解的高浓度有机废水，具有高COD和BOD，pH在3．8"-4．5之间，颜色深，难处理等特点。每生产1吨酒精会产生12～15吨废液，酒精废液中COD约为80000"-160000mg／L，该废液的直接排放已经对我区四江流域的水环境造成了严重的污染，极大的影响了人民的生活，制约了制糖工业的发展【I】。广西已经有数十家糖厂因为酒精废液的污染问题而被迫停掉酒精的生产。因此，解决酒精废液污染问题已成为酒精工业是否可持续发展的问题。’当前，可持续发展和环境污染的治理已被提到核心的地位，糖蜜酒精废液治理技术虽然经多年研究，但还没有找到投资省、运行费用低、达标可靠的技术。目前的治理思维大多是从治理废液污染入手，而很少见有从源头上改善酒精生产工艺来减轻废液治理难度的报道。从经济角度考虑，废弃物综合利用，进行高附加值产品研究开发是改善环境、提高经济效益、促进国民经济可持续发展的重大举措。因此，有必要进一步改善酒精生产工艺，将糖蜜酒精成熟醪预处理回收酒精废酵母，上清液蒸酒而减轻废液治理难度，提高废液回用率，减少废液排放量；并将酒精废酵母作为资源加以开发利用，变废为宝，增加经济效益，对当前面临生死存亡的甘蔗糖蜜酒精车间来说具有非常重大的意义，并为实现甘蔗糖业的清洁生产与循环经济作出贡献。1．1．1用糖蜜生产酒精的工艺流程广西是我国的重要的产糖区，广西生产了全国糖总产量的60％左右。制糖过程中大概会产生3％～4％的废糖蜜，因此每年产生的糖蜜数量非常巨大，甘蔗糖蜜常作为酒精发酵的碳源被利用。酒精是目前世界上历史最悠久、产量最大的发酵工业产品之一，在 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取最一1．3一前聚糖的研究饮料工业、化学工业、医药工业应用广泛。甘蔗糖蜜是白糖生产的过程中得到的最终糖蜜，为棕黄色至深褐色均匀浓稠液体，粘度很大，含有50％左右的蔗糖和还原糖，绝大部分为可发酵性糖。糖蜜中的其他成分大多可以作为微生物的养料。糖蜜一般只需要经过适当的稀释，有时需补充少量的氮、磷等营养物质，就可利用酵母将之发酵获得酒精。用糖蜜生产酒精，具有生产周期短，设备简单等特点，与淀粉生产酒精相比，可省去粉碎、蒸煮、糖化、制曲等工序，缩短周期，节省能源。因此糖蜜是酒精生产中成本较低、工艺操作简便的优质原料。用糖蜜生产酒精现有工艺的生产流程如图1．1所示【2】：图I-I糖蜜生产酒精现有工艺的生产流程Fig．1-1Theexistencetechnologicalprocessofproducingalcoholbymolasses1．1．2糖蜜酒精废液的危害和治理技术酒精是一种重要的工业原料，具有十分广泛的应用和发展前景。但同时，酒精工业又是一个污染十分严重的行业。甘蔗糖蜜酒精废液是利用糖厂制糖副产物糖蜜，经发酵后醪液在初馏塔蒸馏出酒精后所排放的废液。此废液COD8～12x104mg／L，BOD54～6x104mg／L，pH3．5---，4．5，糖分1．9％～2．8％，固形物含量10％--一12％。固形物中，有机质约占70％，灰分约占30％。还含有S042’、C1‘、有机酸等，是高色度、高浓度的酸性有机废水【3l。以甘蔗糖蜜为原料，每生产It酒精排放的高浓度有机废水约12--一15t，含总有机物O．7～1t，是我国排放的有机污染物浓度最高、造成水环境污染最严重的第二大轻工业【4】。糖蜜酒精废液治理技术虽然经多年研究，但还没有找到投资省、运行费用低、达标可靠的技术，使糖蜜酒精废液治理问题成为我国环境保护工作中老大难问题之一。目前，各糖蜜酒精生产厂对酒精废液的治理，主要采用的方法由图卜2所示；2 从蘑蜜酒精成藏聪母中提取口一1．3一葡粟糖的研兜图1．2糖蜜酒精废液主要治理方法Fig．1-2Them融ntreatmentmethodonsugarmolassesalcoholH馏鼬eliquid由于糖蜜酒精废液中含有大量的色素类生物难降解的物质，因此仅从生化处理，或者经生产单细胞蛋白劣质消减COD后再生化处理，废液仍很难达标排放。将酒精废液蒸．发浓缩、干燥，制备肥料、饲料，是一种解决污染的常用方法，但由于蒸发浓缩需要消耗大量的能量，浓缩后生产复合肥料，需要解决从废液中降低钾盐的技术，用化学法除钾，技术上是可行的，但经济上难以接受，而且复合肥料价格不高。堆肥、浓缩后堆肥或生产复合肥，因肥料使用季节性，周转的资金大，生产占地大，特别是酒精废液中含有大量的硫酸钙，直接灌溉农田或生产肥料后，在非酸性土壤中长期使用，有可能造成“土壤板结，使土壤产生根本性的破坏。各单纯的物化处理均存在一定的不足或缺点，处理效果也很难达到废水排放标准。浓缩焚烧法用日处理400立方米酒精废液的系统，每天的处理费用高达0．7～1．2万元151，企业为保护环境付出的代价太大。。在执行环保高标准的今天，酒精废液处理作为酒精生产不可缺少的环节，使酒精生产成本大大提高，目前的治理思维大多是从治理废液污染入手，而很少见有从源头上改变酒精生产工艺来减轻废液治理难度的报道。1．1．3酒精成熟醪回收废酵母新工艺在糖蜜发酵过程中，各厂家都比较注重生产的正常维持和获得良好经济效益等问题，但对酒精成熟醪中于物质的影响重视不够，以致蒸馏塔结垢严重和酒精废液处理难度居高不下等问题。酒精成熟醪是一种成分复杂的混合液体，其中水分约为80"--"90％，酒精含量约为10％，干物质含量约10％，干物质中主要包括酵母菌体、胶体、无机盐等。 从并蜜酒精成熟醪醇母中提取母一1．3一萄聚糖的研完其中酵母成份经蒸酒后残留在废醪液中成为废液中BOD的主要来源，且酵母菌体是酒精废液中最难降解的物质，胶体、钙盐容易造成蒸馏塔结垢塞塔。目前酒精车间直接将发酵成熟醪送入蒸馏塔，结果造成初馏塔经常结垢塞塔现象，且排放的废液中含有大量的酵母残体，不仅为后期废液处理带来极大困难，而且浪费了酒精酵母资源。如果对发酵成熟醪进行预处理，这样类似的问题是可以解决的。酒精发酵完毕时，在1立方米发酵成熟醪中，含有约15～18kg含水量为75％且具有酶活的酒精酵母，每生产十吨酒精将产生一吨含水量为75％酒精酵母泥【4】，通过离心分离的方法实现成熟醪固液分离，其中大部分不溶性悬浮物质如酵母菌体、胶体、无机盐等被分离出来，离心分离后的上清醪液进入蒸馏塔，此时醪液中无机盐含量、酵母菌体、胶体物质大大减少，从而减轻了蒸馏塔结垢程度，同时酒精蒸馏后排放出的釜液COD，BOD大大降低，进而减轻了糖蜜酒精废液治理的难度，降低废液处理成本，提高废液的回用率，能够以一定的比例在发酵系统中直接循环使用，合理利用废液中的各种营养物质，减少废液排放量，节约生产用水，有利于实现清洁生产。而从成熟醪中分离出酵母泥，进一步除去杂质得到纯净的酒精酵母泥，并将酒精废酵母作为资源进行高附加值产品研究可发，变废为宝，增加经济效益。酒精成熟醪回收废酵母新工艺不仅是糖厂酒精车间可综合利用的途径之一，更可以达到减轻蒸馏塔结垢、降低废液处理难度和提高附加产值三赢的效果。1．1．4酒精废酵母高附加值产品研究开发2006年广西关于进一步加强蔗糖业管理工作的通知中明确指出：大力推进综合利用，促进循环经济发展，鼓励制糖企业对制糖生产过程中糖蜜，蔗渣，滤泥以及其他废弃物进行综合利用，以提高产品附加值。重点支持废糖蜜生产酵母，酵母抽提物和味精等生物化工产品项目及多糖功能食品等新产品。乐祖【6】等2003年就呼吁广西糖蜜应在本地生产酵母高附加值产品。目前，包括欧、美、日本在内的世界各国，啤酒酵母泥的综合利用获得高度重视。近年来有许多科研单位和企业在啤酒酵母泥高附加值产品的研究开发方面进行了大量的工作。研究表明，啤酒废酵母可以用于生产酵母浸膏、天然调味品、营养蛋白粉、胞壁多糖等营养食品及葡聚糖等生物活性物质。酵母胞壁多糖其主要成分是葡聚糖(glucan)和甘露聚糖(mannan)。它们在人的消化道中难以被消化，可以作为膳食纤维发挥作用，并具有增强免疫力、提高巨噬细胞活性、抗病毒等功效，故广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料等行业。酵4 从糟蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3—葡聚糖的研究母细胞壁的第三层结构主要是p．1，3．D．葡聚糖组成，p．1，3．D．葡聚糖是至今为止科学家发现的最优秀的活性免疫多糖，它在生物体内通过激活免疫能力而去抵抗细菌、病毒、肿瘤和真菌、寄生虫的入侵远远大于香菇多糖和燕麦多糖[71。我国酵母资源丰富，对其进行高附加值产品研究开发，具有良好的社会与经济效益。关于从啤酒废酵母，活性干酵母，葡萄酒酵母等原料中提取酵母抽提物和酵母胞壁多糖的研究已有诸多报道，而以糖蜜酒精酵母为原料提取p．1，3．葡聚糖尚无人报道。本研究以酒精废酵母为原料，制备高附加值产品p．1，3．葡聚糖，并实现酵母抽提物的联产，避免了以传统方法中单纯生产其中某一种产品而排放另一副液对环境造成的污染，提高酵母资源的利用率。1．2国内外的研究现状·1．2．1成熟醪固液分离工艺研究综述淀粉酒精醪液固液分离技术早在1989年就有专利报道，徐以撒等【8】提出淀粉质蒸煮醪滤清液发酵制造酒精的方法，常用方法是把淀粉质原料粉碎后加热蒸煮，含渣滓的蒸煮醪糖化发酵、蒸煮提取酒精。由于渣滓存在于整个生产过程中，降低了质量、动量、热量的传递效率，使得物料输送不易，发酵周期长，废醪液处理困难。用离心过滤的方法除去淀粉质蒸煮醪中的固体渣滓，降低醪液的黏度和稠度，废醪液直接回用于原料调浆。固液分离技术应用于成熟醪预处理工艺，也有专利报道，石贵阳等【9】提出浓醪发酵酒精漕液固液分离方法，酒糟经膜过滤一次性预处理，上清醪液直接蒸馏产酒，这样大大减轻蒸馏塔结垢情况，而且酒精废液直接回用到稀释糖蜜的工艺中去，并循环多次使用，力求废液的全回用，节省工业用水量，截流的物质直接作为饲料处理。国外也已经研究了一种新的工艺设备，分离成熟醪液中的酒精酵母加工生产面包酵母。目前，澳大利亚、印度已采用先进的发酵工艺【101，系由瑞典阿伐拉伐公司发明，将发酵醪液经过滤去除纤维渣，再经分离机分离酵母和醪液，酵母经酸化处理后回到发酵罐，从成熟醪中分离酒精酵母，可以回流到发酵中去做种子，采用大种量发酵，醪液进入蒸馏工序，可减少酵母培养，缩短发酵周期，提高产量，减少废液排放。5 从糖蜜酒精成熟醪醇母中提取口一1．3一葡聚糖的研究1．2．2酒精废液回用技术研究综述废液回用到生产中去是近年来提出的一种说法，即将废液(或者经处理后)代替清水用来稀释糖蜜，达到减少废液排放的目的，不仅降低了废液处理成本，同时合理利用废液中的各种营养物质。1．2．2．1玉米、薯千酒精糟液的回用技术研究德国克虏佰公司是最早研制出将薯类酒糟滤液全部回流用于酒精发酵的公司，该工艺【2】称为“LBW”，实质是将玉米酒糟液固液分离所得滤液一部分回用于酒精生产，另一部分蒸发浓缩后与固形物混合干燥制DDGS。随后该技术在欧洲国家，如德国、法国、挪威等也被广泛采用。国内对这方面的研究也日渐增多，邹东恢等【¨】提出玉米酒糟离心液全回用生产技术，实现了连续化、正常化生产。张世军等【12】提出用絮凝剂处理地瓜淀粉质原料酒精糟液，处理的糟水全部回用拌料(由于糟渣带走一部分水，回用水约占70％)用于生产，可连续处理十次以上而不影响酒精的正常生产：王晓【13]通过薯干类酒精废液的回用，降低了废液排放量到原来的10％左右，回用剩余的废水进行厌氧．好氧处理，经稀释预曝后进入好氧生物处理，经沉淀过滤后即可达标排放；马赞华【14】采用玉米酒精糟处理液回用技术，去除酒精糟液中对酒精生产有害的物质，得到能回用于糖蜜稀释的处理液，使酒精糟液不再向外排放；李东侠等【15J提出了自絮凝颗粒酵母酒精连续发酵过程精馏废液循环回用工艺，说明废液循环利用对发酵工艺有抑制作用。1．2．2．1糖蜜酒精废液的回用技术研究吴代林、张逸庭【161提出酒精废醪液静置冷却直接回用于酒精生产，但回用率仅为20％；无锡轻工业大学金其荣教授为福建等糖厂设计的回用系统【17J：废水用于酵母生产后，经活性碳除钾回用于糖蜜稀释，其废水经多次回用后排放一次，废水总排放量大大降低，排放的废水经固定细菌厌氧处理后可达标；黄敏【18】报道了从酒精车间排出来的酒精废醪液(其中10％为不溶物，90％为可溶物)经渣水分离器分离出不溶物，分离清液15,--．．20％经冷却后回流到酒精车间稀释糖蜜，可减少废醪液的最终排放量，每吨酒精产生的废醪液从原来的14"-"15吨降到11"-"12吨，节约稀释糖蜜耗用的清水。肖冬光【19】、李东侠‘15】等通过对酒精废液回用的理论分析，建立了酒精废液回用数学模型。王进等【20】介绍了糖蜜酒精废液回用技术的应用实例，通过高级氧化法处理酒精废液，结合批加糖工艺废液回用率达80％。刘继栋等f21J介绍了废水回用技术作为处理甘蔗糖蜜高浓发酵废液的方法，通过长期驯化菌株，提高其耐废液能力，并确定了其最高回用率为40％。目前全6 从糖蜜酒精成熟睁酵母中提取口一1，3—葡聚糖的研究回用技术研究还尚在实验室阶段，尚无应用于工业化生产的报道。1．2．3酵母抽提物的研究综述1．2．3．1酵母抽提取物的简介酵母抽提物(YeastExtract或Y．E．)，又称酵母精、酵母味素，是通过自溶、加酶水解等方法将酵母细胞内的蛋白质降解成氨基酸、核酸降解成核苷酸，并将它们和其他有效成分，如B族维生素、谷胱甘肽、微量元素等一起从酵母细胞中抽提出来，所制得的一种兼具调味、营养和保健三大功能于一体的天然复合调味品。它含有18种以上的氨基酸和多肤，还含有核苷酸、维生素、有机酸和矿物质等多种有效成分。其氨基酸平衡良好，味道鲜美浓郁，具有肉香味。酵母抽提物采用现代生化技术精制而成，所以不含动物蛋白水解液(弛心)、植物蛋白水解液(HVP)、有害的氯丙醇，是目前认为最安全的鲜味剂圈，因此在食品工业中具有广泛的应用前景。欧洲用以生产酵母抽提物的主要原料是含有高蛋白的啤酒酵母，这种酵母菌株是以糖蜜培养的。在英国和美国，也采用一些除去苦味的啤酒酵母和葡萄酒酵母等作为原料。国内生产的酵母抽提物也有以新鲜面包酵母作为原料的，如广东东莞一品鲜的酵母抽提物，但是现在越来越多的研究学者把目光放在了啤酒废酵母的综合利用上。1．2．3．2酵母抽提物的生产方法目前生产酵母抽提物的方法主要有：自溶法、酶分解法和酸分解法等三种幽】。一(1)自溶法自溶法是以存在酶活性的新鲜活酵母为原料，利用酵母细胞本身的酶系，添加一定量的自溶促进剂，在一定条件下，将酵母体内的糖类物质、蛋白质和核酸分解为还原糖、氨基酸、肽类、核苷酸等小分子物质并从酵母细胞内抽提出来的一种方法。利用自溶法生产的酵母抽提物，蛋自质分解率高，游离氨基酸含量高，风味好，成本较低，但呈味核苷酸含量低。目前，欧美及我国所生产的酵母抽提物绝大部分都是采用这种方法。(2)酶分解法·酶分解法是以菌体内酶失活的酵母菌为原料，通过控制一定的酵母浓度、温度和PH值，干燥的酵母原料在细胞壁分解酶、蛋白酶、肽酶、5。．磷酸二酯酶和5’．腺苷酸脱氨酶共同作用下，分解成为小分子的糖类、氨基酸、肽类及5。．核苷酸等呈味物质，离心分离后将上清液减压浓缩或喷雾干燥即得酵母抽提物的一种方法。利用酶分解法生产的酵母抽提物质量较好，但成本较高，日本大部分酵母抽提物都是采用酶分解法生产的。7 从糟蜜酒精成熟醪酵墨中提取墨一1．3一莆聚糖的研究(3)酸分解法酸分解法是以干燥酵母为原料，主要用盐酸或硫酸进行分解。酸分解法生产的酵母抽提物相当于HAP和HVP，其基本的生产工艺是将酵母液在一定的酸浓度、压力、温度、PH条件下水解～定时间，然后进行过滤，脱色、脱臭、碱中和后进行减压浓缩或喷雾干燥即得酵母抽提物。利用酸分解法生产的酵母抽提物游离氨基酸含量大，但适口性较差，一般不采用此法生产酵母抽提物。1．2．3．3酵母抽提物的制备及研究现状目前，国内外酵母抽提物研究工艺都已经非常成熟。大量的文献资料主要是有关于破壁处理、添加自溶促进剂、外加酶或几种方法的联合等手段来提高得率和缩短自溶过程的研究工作。(1)破壁处理技术’陈洁等阱1研究发现均质破壁能显著提高自溶速率及酵母抽提物中蛋白质和核苷酸的含量。吴润娇等口51提出了酵母自溶、温差破壁、高压均浆三者相结合的方法来促进酵母内容物溶出提高抽提率。Yoshinoriohsumi等陶研究发现，用lO,、,50wm的铜离子处理酵母水悬液，能够加速胞内分子量不超过500低分子物质的溶出速率。(2)自溶促进剂的添加’汤务霞等[271探讨了采用自溶法生产酵母抽提物的条件。结果表明：以食盐为啤酒酵母自溶促进剂的最佳作用条件是10％的啤酒酵母悬浮液在pH5．0、温度50。C、食盐浓度3％下，自溶40h，所得酵母抽提液的氨基氮含量为0．4989／100mL，产品得率47．50％，风味非常醇厚；蒋雪薇等【231研究几种单一促溶剂及复合促溶剂的促溶效果，优化了复合促溶剂配比，得出其最佳值为NaCI2％(W／W)、乙醇1％(v／v)、葡萄糖1％(W／W)，以此促溶啤酒废酵母，其抽提液氨基氮含量比传统促溶剂(NaCl)提高了9．6％，收率提高了8％，而自溶时间则缩短了12h。(3)外加酶的添加Ishida等1291曾在专利中提议采用将酵母失活后外加酶的方法。Chao等口01的专利则采用添加蛋白酶(木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶)于活的酵母中。Knorr的实验【31】使用溶菌酶和蛋白酶混合作用于活的酵母。李艳等【3刁给酵母悬液中加入一定量的蜗牛酶，发现细胞的破壁率大大增加。彭小平123]等以溶壁酶水解工艺提取酵母抽提物，蛋白抽取率达80％。为提高酵母抽提物的呈味物质，陈洁等【25】加入麦芽根核酸酶有效地提高了酵母抽提物中5t．核苷酸含量。陶兴无等【331研究了外加中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和p．8 广西大摩硕士掌位论文从蟹蜜酒精成熟酶砖蕾中撮取厣一1，3一霄曩鲁的研兜葡聚糖酶对酵母自溶的影响。结果表明：在最适条件下，啤酒酵母和面包酵母的自溶干物质得率、蛋白质得率、氨基酸态氮得率分别提高52．2％、55．1％、14．6％和26．O％、32．8％、11．6％。(4)几种手段的联合技术晏志云等洲以新鲜面包酵母为原料，采用高压均质，外加蛋白酶及酵母抽提物，产品最终得率为75．9％，氨基氮含量为4．75％。曾凡坤等【35】研究了影响酵母抽提物得率的因素和提高酵母抽提物得率的方法，证明二次高压均质法破碎效果好，工艺条件为10％酵母悬浮液于35MPa_T．次均质，均质后在55"{2、pH5．5下自溶4h，添加O．_；8％木瓜蛋白酶(以酵母干重计)自溶28h，酵母抽提液中氨基酸态氮含量达7．149／L，得率69．47％。黄恩等06)采用自溶结合外加酶法制备酵母抽提物，外加蛋白酶、溶壁酶LywaUzyme和木瓜蛋白酶处理，上清液氨基氮含量达4．5SOmg／L，固形物得率达60％。陈学武等【371采用纳米对撞机破碎技术结合传统的自溶、酶解法确定最佳生产工艺，破碎率提高到75．80％，抽提物得率为76％。C．Verduyn等【38】采用高压均质和外加木瓜蛋白酶的方法制得的酵母抽提物得率高达81％。李科德等【3刃证明自溶．酶联技术是制备啤酒酵母抽提物的理想方法，其抽提率和蛋白质利用率分别达68．6％和87．3％，经Maillard反应后，啤酒酵母抽提物，其整．体风味得到了明显改善。1．2．4酵母B．1，3．葡聚糖及研究综述1．2．4．1酵母p1，3-葡聚糖的简介及应用前景酵母是一种重要的食品和工业微生物，在其细胞壁中存在p。(1．6)分枝的碱不溶性p-l，3-D一葡聚糖、P-0-6)分枝的碱溶性B—l，3．D一苞聚糖、中间插有13-0-3)键的无定性的酸溶性肛1，6．D．葡聚糖、连接有蛋白质的无定性的碱溶性甘露聚糖等，其中p．1，3．葡聚糖占绝大多数嗍。酵母细胞壁的第三层结构主要就是p．1，3．D．葡聚糖组成，他在生物体内通过激活免疫能力而去抵抗细菌、病毒、肿瘤和真菌、寄生虫的入侵远远大于香菇多糖和燕麦多糖。p．1，3．D．葡聚糖是至今为止科学家发现的最优秀的活性免疫多糖。‘酵母p．1，3．葡聚糖能增强哺乳动物的免疫活力、抗癌、抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、降低胆固醇和血脂、促进伤口愈合、加速重金属的排泄、改善某些老年型疾病症状等作用，是一种良好的生物效应调节剂(BRMs)【4¨。酵母D．1，3．葡聚糖在人体消化器官中难以被消化，作为膳食纤维，酵母葡聚糖促进肠内有益菌的活化，吸收肠内有害物质，从而改善因肠胃虚弱引起的消化不良和便秘，并刺激肠道蠕动，促进9 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1，3一葡聚糖的研究肠内有害物的排泄，达到润肠通便、调节胃肠的功效。另外，酵母B．1，3．葡聚糖有高度的粘性、保湿、成膜、无刺激性和热稳定性的优点，并且制备工艺简单，因此，．酵母p．1，3．葡聚糖在医药、化妆品、保健品、食品、饲料、造纸和建筑材料等行业广泛应用【42】。美国早已将其批准为膳食营养补充剂。欧美等国已将其列为取代饲料中的抗生素，提高禽畜的抗病能力，提高饲料的转化率，提高禽畜的生长性能，为减少和消除滥用抗生素而发挥巨大的作用【431。由于p．1，3．D．葡聚糖的用量是饲料的万分之一，却可以大大提高水产禽畜的成活率和生长性能，效果显著，其价格每公斤高达1000元，每吨100万元。另外，由于酵母细胞壁中含有20"-"25％的p．1，3-D．葡聚糖M，所以日本、美国等啤酒厂都纷纷推出酵母细胞壁片剂，作为人们的健康食品。每瓶60粒(每粒0．59)，价格高达100元。而且欧美还利用酵母细胞壁开发了很多婴幼儿、老年和孕妇的营养食品。在美国早已用p．1，3．D．葡聚糖开发成药品和化妆品了，用于治疗肿瘤、慢性病、修复伤口和美容，每公斤高达5000"-"10000元。1．2．4．28-1，3-葡聚糖(p-1，3-Glucan)结构的研究B．1，3．葡聚糖指的是一类由肛1，3．糖苷键连接而构成主链的均一葡萄糖聚合物，通常因来源不同而含有不同比例和大小的由p．1，2、p．1，4和B．1，6糖酱键连接的支链【451。这类多糖广泛存在于微生物、植物和动物体内，特别是在真菌的细胞壁中。在自然界中p．1，3．葡聚糖种类繁多，如：香菇多糖(Lentinan)、裂殖茵多糖(Schizophyllan)、昆布多糖(Laminarin)、茯苓多糖(P咖an)以及酵母细胞壁中的p-1，3-葡聚糖等嗣。p一1，3一葡聚糖的研究在国外己有近百年的历史，但对酵母p．1，3．葡聚糖的研究始于1941年}k峪sid等叼开展的关于一种不溶性酵母多糖的分子组成的研究。1950年，Bell&Northcote报道【48】酵母13一葡聚糖是一种高度分支的，由p．1，3糖苷键连接的葡萄糖基链通过约10％1拘13．1，2糖苷键相互连接起来的多糖，而1958年Peat等【48I使用部分酸水解的方法得到的结论是酵母葡聚糖是线性结构，．含有13．1，3和13．1，6．D葡萄糖苷键。1973年Manners等[491经过十多年的研究，详细阐明了酵母葡聚糖的结构：酵母葡聚糖是一种13．葡聚糖，含有两种组分为13．1，3．葡聚糖和13．1，6．葡聚糖。p．1，3．葡聚糖具有13．1，6．糖苷键连接的支链分支(见图1．3)，分子量约在24万左右，在酵母p．葡聚糖中约占85％，形成一长而扭曲的链，链-@J为亲水基团，另一侧为疏水基团，两条这样的葡聚糖链就能以疏水侧面相对而形成一个双螺旋结构，并以这样的结构平行排列于细胞壁中，p．1，6．葡聚糖具有13．1，3．糖苷键连接的支链分支，在酵母p．葡聚糖中约占15％，具有高度分支因而在细胞壁中成一网状结构，并与细胞壁中的甘露糖蛋白、几丁质层相互作用共同维系细胞壁的形态与功能。p—l，3一葡聚糖不溶10 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1，3一葡曩糖的研竞于水、酸、碱，以及醇、醚等有机溶剂，而p。1，6．葡聚糖则能溶于稀酸和稀碱。o---(I"-轳吼一‘卜3卜lfI(I—D．』O一(卜3卜一‰一(1__Io一《I一势一lok--‘I一3)一o1．O一毋l“一(1q卜一6一(I_3卜G一图1．3p．1，3．葡聚糖的结构示意图【49】Fig．1-3Thestructureofpl，3-glucarl1．2．4．3p1，3一葡聚糖的生物活性研究p．1，3．葡聚糖作为活性多糖在于它不仅具有免疫促进作用，而且还具有抗肿瘤、抗感染等活性，也是当前研究的最多的一类活性多糖。1957年，Benacerrat鄱Sebstyn[481发现来自酵母细胞壁的酵母聚糖(Zymosan)对吞噬细胞的活性有显著影响：1961年Riggi[50】最终确证其中的活性成分为p．葡聚糖，这是第一个被发现具有免疫活性的p．葡聚糖；1979_。年Diluzio等【51】比较了可溶性葡聚糖与颗粒状葡聚糖的抗肿瘤、抗细菌活性；进A．so年代以来，我国学者对多种p．1，3．葡聚糖的生物活性进行比较研究表明，酵母p．葡聚糖同其它一类p．葡聚糖一样都是低毒性的、具有强免疫调节活性的，但酵母p．葡聚糖其水溶性差，直接使用效果不理想，利用率低，特别是以注射方式做辅助治疗时会产生一定的毒副作用，因而使其在实际利用时受到很大的限制。‘具有分支的p．1，3．葡聚糖是活性最强的多糖，可作为免疫调节剂，在药物学上则属于生物应答效应物(BRMs)[44{。所有的活性p．1，3．葡聚糖都具有共同的结构：主链由p．1，3．糖苷键连接的葡萄糖基组成，随主链随机分布着由p．1，6．糖苷键连接的葡萄糖基，·呈梳状结构。生物活性的大小随多糖的精细梳状结构和构象不同而变化。分支度、分子量大小、主链连接方式、侧链基团的性质和糖苷键的构型等对其生物活性的发挥都有着极其重要的作用【451。具有生物活性的p．1，3．葡聚糖分支度一般均在0．04～0．75之间变化，相对而言分支度在0．2"-0．33间的p．1，3．葡聚糖生物活性要更强f52J。分支度大于0．75或低于0．04的p．1，3．葡聚糖其生物活性均呈不同程度的下降，甚至无生物活性。原因可能在于分支度越大越有利于形成复合螺旋，且多糖的热稳定性、线性质量密度和粘度也随之增大，但溶解性却随着分支度的增高而下降，相对而言溶解性好的多糖活性要强于溶解性差的多糖【531。 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡聚糖的研究分子量的大小是决定p．1，3．葡聚糖生物活性的另一个非常重要的因素。分子量为100"、一200KD的高分子多糖大都呈现较强的生物活性但这些高分子量多糖水溶性均比较差，而能基本保留大分子生物活性的可溶性多糖分子量多介于10"-"50KD。此外，分子量的大小对于p．1，3．D．葡聚糖形成特殊的三股螺旋结构也有着直接的影响。只有分子量大于90KD的分子才能形成三股螺旋结构，这种高度有序的三股螺旋结构对于免疫调节活性至关重要【541。1．2．4．4酵母p1，3-葡聚糖的制备及研究综述．酵母细胞壁中含葡聚糖50％、甘露糖20％、蛋白质10％----15％、脂类8％～9％及少量几丁质p51。制备酵母p．葡聚糖即提取碱不溶性的p．1，3．葡聚糖，制备的关键是除去蛋白质、甘露聚糖和脂质等杂质。目前国内外制备酵母p．1，3．葡聚糖的方法主要有酸法、碱法、酸碱综合法及酶．碱法提取法等。(1)酸法提取酸法提取是最早采用的酵母p．1，3．葡聚糖提取方法。一般用不同浓度的醋酸在50,--,●90℃温度条件下处理3"-"6h，然后离心，沉淀用无水乙醇脱水，干燥即得成品。早期国内外学者对此法进行了较多的研究。黄丹、黄刚良等t56j对此提取方法进行了研究，并探讨了其提取机理。研究结果表明，此法虽然产品得率高，但纯度低，产品中蛋白质和甘露聚糖含量高，需要进一步纯化。由于用此方法提取的成品纯度低，其应用受到一定程度的限制。近年来国外对此提取方法的报道很少。但若对成品D．1，3一葡聚糖的纯度要求不高，如作为饲料添加剂使用，其不失为一种经济有效的提取方法。．(2)碱法提取李卫旗等【57】比较了Sevage法、酸法、碱法制备(1，3)⋯13D葡聚糖后认为，Sevage"法不能充分提取B．1，3．葡聚糖；酸法浸提多糖得率高但含有大量甘露糖蛋白以及蛋白质，仍需要进一步纯化，工艺复杂；碱法浸提工艺为取59啤酒干酵母，加1mol／LNaOH溶液lOOmL，在90"C保温3h，离心，沉淀物水洗3次，离心，乙醇洗涤脱水，干燥即得葡聚糖产品。龚炎杰等【58】分别采用酸法、碱法来提取酵母细胞壁中的p．1，3-D。葡聚糖，指出碱法提取是提取D．1，3．葡聚糖的高效方法。廖鲜艳等【59】对此法进行了改进，采用二步碱处理方法进行提取，降低了碱处理时NaOH溶液浓度，并提高了产品的纯度。方法是：第一次碱处理作用条件，NaOH浓度3％，料液比6(v／w)，75"C保温3h，离心收集沉淀物；第二次碱处理作用条件，NaOH浓度3％，料液L匕4(v／w)，100*C保温2h，离心，水洗，脱水，干燥。吴小刚等【60J研究在碱法的基12 从J暗蜜酒j晴成熟醪酵母中提取口一1．3一葡莱糟的研究础上设计了新工艺路线为：酵母溶解_冻融一超声波破碎_碱溶_中和_÷沉淀_洗涤一烘干。最后多糖得率为19．4％，多糖含量为51．9％。“⋯万婕等f61避一步改进提取工艺，碱法浸提提取条件为：碱处理温度75℃，碱处理时间15rain，碱液浓度0．75mol／L，在碱处理后离心卜沉淀用蒸馏水悬浮，再用盐酸调节●pH至4，5，离心，水洗，脱水，干燥。由于采用了酸性溶液洗涤，除去了部分酸溶性的糖原及p-1，3。葡聚糖，因而纯度又有所提高。碱法提取所得的产品得率稍低，纯度较高一但产品中还含有少量酸溶性糖原及p-1，3-葡聚糖。此法较适于对提取物纯度要求较高的产品；如食品和医药用途。碱法提取物纯度虽然较高，但该法工艺复杂，产生废液多∥容易造成环境污染。．(3)酸碱结合法提取酸碱结合提取工艺在国外已经非常成熟，并已申请了美国专利。Masler等【62】报道了酸碱处理制备S．eerevisiael3．1，3．葡聚糖的方法。Williams等(1992)作了一些修改。后来Kogan(1995)，Machova(1999)等许多国外学者对此法进行了改进【4叼。CHUNG等【63】研究。的改进二步碱处理工艺为：取809酵母细胞壁悬浮于1000mL4％NaOH溶液中，95"12保温1h，1离心，不溶物悬浮于2000mL3％NaOH溶液中，于75℃保温3h，离心，不溶物再悬浮于蒸馏水中，加蒸馏水至2000mL，用盐酸调节pH至4．5，75℃保温1h。离心，水洗，脱水，干燥。但酸碱结合法制备p．1，3．葡聚糖，酸碱用量大，对环境污染严重，工艺繁琐，劳动强度大，而且B．葡聚糖纯度和收率都不太理想，得率均在9％以下。．近年来，许多国内学者亦对此法进行较深入的研究，胡晓忠等【删以新鲜酵母为原料，NaOH浓度4％，100℃下剧烈搅拌1h，离心，不溶物用1000mL3％NaOH溶液重新悬浮，加热到100℃维持15mill，离心(此碱处理过程重复一次)，不溶物力n500mL0．5mol／L乙酸，100℃下剧烈搅拌3h，离心，水洗，脱水，干燥。在酸处理过程中，酸的选择对p．1，3．葡聚糖的得率有很大的影响。酸性过弱，酸溶性的糖原及p．1，3．葡聚糖除去不完全，酸性过强会使碱不溶性葡聚糖降解，得率降低，故选择0．5mol／L左右的乙酸为适。刘浪新●等【65】用酸．碱法制备水肛l，3．葡聚糖，0．75mol／LNaOH在100℃下作用2h能有效地去除甘露糖蛋白。冯万祥嘲等通过沸水条件下酸碱处理新鲜酵母，所得的碱不溶性葡聚糖中有效得去除了甘露糖蛋白成分，p．1，3．葡聚糖含量为87％。张开诚等【6刀改进了提取工艺，采用一步碱处理，再用4％乙酸在室温下处理沉淀物2h，离心，水洗，脱水，干燥。此法提取的酵母p．1，3．葡聚糖中不含酸溶性的糖原及13．1，3．葡聚糖，纯度高，产品经改性后可应用于医学领域。 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取母一l，3—葡聚糖的研究以上3种提取方法的特点是快速、高效。但提取条件较剧烈，酸碱试剂易腐蚀设备、污染环境严重，尤其是在提取过程中会造成部分13．1，3．葡聚糖的降解，使产品得率与生物活性降低。(4)酶一碱法提取为了克服上述3种提取方法的不足，Freimund等【68】报道了酶．碱法提取酵母葡聚糖的方法：取1．3蚝酵母细胞壁。加蒸馏水8．8L，用NaOH调节pH至7．0，在125。C保温搅拌5h，冷却至室温，离心，水洗2次，不溶物加蒸馏水至总体积IOL，用NaOH调节pH至10．5，力llSavinases酶(一种碱性蛋白酶)7．5mL，在45"C保温搅拌5h，离心，不溶物水洗2次，乙醇脱水，不溶物喷雾干燥。‘国内学者对此提取方法进行了深入研究，赵光远等【69】用废酵母前处理后自溶，离心，沉淀物用蛋白酵母酶57℃处理24h，离心，沉淀物再用2％NaOH在60℃处理3．5h，离心，水洗，去脂，干燥。李花霞掣7川对此法进行了改进，结合自溶、酶解和碱溶等方法优化碱不溶性葡聚糖的制备条件，酵母泥自溶分离后沉淀溶于水中，再经超声粉碎，结果表明采用1．0mol／L的NaOH碱溶处理7．5h效果最好，成品不含甘露聚糖，碱不溶性葡聚糖得率为9．59％，葡聚糖含量为91．91％。徐希柱等【7l】以啤酒酵母粉为原料，采用碱．酶法提取p-1，3．葡聚糖，原料在NaOH溶液浓度3‰80‘C水浴条件下水解2h，调整pH至8．5～9．0，再力I／k600U／g碱性蛋白酶，在55℃下水解24h，离心，沉淀，干燥得到成品。提取率为13．8％，多糖含量85．2％。王战勇等【倒以啤酒废酵母为原料，采用酶．碱法提取酵母碱不溶性葡聚糖，加入木瓜蛋白酶溶液，NaOH溶液浓度1．0mol／L，45。C处理3h。此条件下多糖得率为10．1％，多糖纯度达到92．6％，其中不含甘露聚糖。黄国宏等【731采用酶．碱法从酵母自溶残渣中提取p-l，3-葡聚糖，酶处理工艺条件为：酶添加量为1600IU／g，酶解3h，pH8，温度60℃。碱处理工艺条件为：用60mL2％NaOH溶液在75"C处理酶解后的沉淀物6h。冷冻干燥后得到成品葡聚糖，成品得率21．38％，其中多糖含量为92．17％。唐治玉等[74崃用自溶．酶．碱法对提取废啤酒酵母中p．1，3．葡聚糖，最佳工艺条件为：啤酒酵母于50℃自溶6h后，添力11100U／g湿酵母木瓜蛋白酶，继续自溶18h后离心，沉淀用2％的NaOH溶液分散，于80℃水浴处理3h后离心，沉淀用蒸馏水清洗3"-4次后进行真空冷冻干燥，粉碎得成品。成品得率10．80％，其中多糖含量87．70％、蛋白质含量0．45％。(5)其他方法提取Ohno等【751提出诱导自溶酵母细胞制备p．1，3．葡聚糖。壬亚军等嗣根据p．1，3．D葡聚糖较甘露糖蛋白、几丁质、蛋白质、核酸、脂类等大分子物质抗氧化能力强的特点，采用14 从糟蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡聚糖的研究诱导自溶结合次氯酸钠氧化法提高了p．1，3．葡聚糖收率。李科德，曾庆孝等【明研究了利用啤酒废酵母泥制备酵母抽提物和p．葡聚糖的相关工艺条件。结果表明自溶．酶联法是制各啤酒酵母抽提物的理想方法，将自溶后的酵母残渣进一步制备成B．1，3．葡聚糖，工艺条件为：酵母浓度10％、碱浓度2％、反应温度80℃、反应时间4h、碱处理次数4次。在优化的工艺条件下，13-1，3．葡聚糖得率达26．8％。实现了啤酒废酵母泥的综合利用和高值化。1．2．5酒精酵母的综合利用研究综述酒精酵母含有大量生物活性物质，如海藻糖、多肽、核酸、酵母多糖等，具有较高的综合开发利用价值。1．2．5．1废糖蜜发酵醪中回收酵母作面包酵母酒精发酵完毕时，在1立方米发酵成熟醪中，含有约12"-"18公斤含水量为75％且具有酶活的酒精酵母。这些酵母分离出来，具有面包发酵离力为50"-"--70分钟，它的贮藏性也符合要求。因此回收醪液中的酵母作面包酵母用是综合利用的途径之一。食品酵母和药用酵母主要以蛋白质和B族维生素含量为标准。饲料酵母主要以蛋白质含量为分级标准。。1．2．，5．2利用酒精酵母生产核糖核酸核糖核酸是现代生物化学科学研究上的重要物料，也是生产核苷酸的原料，在医药、食品工业和农业等部门均有着重要的用途。从酵母中提取核糖核酸的方法很多。工业生产上常用的方法主要有稀碱法和浓盐法两种【78】。(1)稀碱法核糖核酸包含在酵母细胞内，’菌体外面有一层坚韧的细胞壁，需先用1％氢氧化钠使之变性，核糖核酸才能从细胞内释放出来，然后用盐酸中和，除去菌体，核糖核酸溶于水中。利用核酸在等电点时溶解度最小的性质，调节到pH2．5，使其从溶液中沉淀出来，离心分离便可得到核糖核酸。碱法抽提核酸，得率为4～5％(按干酵母重量计算)，提取一公斤核糖核酸约需湿酵母167公斤，工业氢氧化钠2．5公斤，工业盐酸13公斤。此法的优点是抽提时间短，成本低，不易产生末端的3。．磷酸的酸溶性小分子多核苷酸，适于5’．磷酸二酯酶的降解。(2)浓盐法 从糖蜜酒精戚藏醪酵母中提取口一1．3一葡聚糖的研究此法是用高浓度的盐改变酵母细胞壁的渗透压，加热使核酸从菌体内释放出来。实际生产常用食盐水将酵母孛的核糖核酸抽出，在冷冻情况下调整pH2-～2．5，使核糖核酸沉淀，用酒精洗涤后低温干燥而制得核糖核酸。成品是白色粉末，能溶于水，不溶于酒精，纯度80％以上，水分8％以下。1．2．5．3利用酒精酵母生产混合核苷酸此法是用稀碱法抽提酵母中的核糖核酸并进一步降解成2’，3’一核苷酸。降解作用在真空蒸发罐中进行，同时蒸出部分水分，约8,---,10小时，即得含2’，3’．核苷酸1～1．2％的液体混合核苷酸产品，或进一步干燥成粉末状产品。液体混合苷酸为黑色液体，呈碱性，含2’，3’．核苷苦酸1～1．2％。固体混合核苷酸为深黄色粉末状物，混合核苷酸在我国农业上试验应用，已广泛在多种作物上取得了良好的增产效果。1．2．5．4利用酒精酵母生产单核苷酸‘从酵母中提取核糖核酸，以核糖核酸为原料，借5’．磷酸二酯酶水解可得四种单核苷酸，然后用离子交换树脂分别提取而得。以上四种核苷酸均为粉末状，其中5’．腺嘌吟核苷酸(5"-AMP)和5’．胞嘧啶核苷酸(5’．Ch口)为白色粉末，味带酸；St_尿嘧啶核苷酸(5’．啪)为白色粉末，味带咸；5。．鸟嘌呤核苷酸(5’一GMP)为白色粉末，具有味精鲜味。四种核苷酸都能溶于水，不溶于酒精中。核苷酸是各种生物化学反应能量转变的关键中间体，在生物体内起着重要的作用，用途较广。越来越广泛应用于国防、医学、卫生、工业及农业各部门。1．3课题的研究意义和研究内容1．3．1课题研究的目的和意义本课题从源头上改变酒精生产工艺，针对酒精成熟醪的特点，利用离心分离技术实现固液分离回收酒精废酵母，上清液蒸酒而减轻废液治理难度，提高废液回用率，减少废液排放量；并将酒精废酵母作为原料，制备高附加值产品D．1，3-葡聚糖，利用响应面分析优化工艺条件，实现D．1，3．葡聚糖和酵母抽提物的联产，提高酵母资源的利用率。广西是我国的蔗糖主产区，有丰富的糖蜜酒精成熟醪，离心回收废酵母新工艺不仅是糖厂酒精车间可综合利用的途径之一，更可以达到减轻蒸馏塔结垢、降低废液处理难度和提高附加产值三赢的效果。并为实现甘蔗糖业的清洁生产与循环经济作出贡献。酒精废酵母的高附加值产品研究开发，提高糖蜜酒精车间的经济效益，并为糖蜜酒精酵母16 从糖蜜酒精成，＆誓獬母中提取口一1．3—葡秉糖的研究的进一步开发研究提供参考。1．3．2课题的工艺流程1．3．3课题的研究内容图1．4本课题的工艺流程Fig．1-4Theprocessofthistask(1)糖蜜酒精成熟醪回收废酵母新工艺研究。确定离心分离过程的工艺条件以及酵母泥化学洗涤的工艺条件，并对酒精废酵母的成分进行检测和比较。(2)新工艺酒精废液成分检测，并比较新1日工艺酒精废液的回用率，以及酵母洗涤液回用实验。(3)自溶．超声波．酶解法处理酒精酵母，上清液制备酵母抽提物；沉淀细胞壁再经碱溶-次氯酸钠氧化法制备p．1，3．葡聚糖。利用正交实验找出对两个工序影响最大的几个因素，利用响应面分析优化试验，确定自溶．超声波．酶解．碱溶氧化法实现B．1，3．葡聚糖和酵母抽提物联产的最佳工艺条件。(4)D．葡聚糖产品分析鉴定。17 从糖蜜酒精成熟醪醇母中提取口一1．3一葡聚糖的研究第二章糖蜜酒精成熟醪回收废酵母新工艺研究2．1引言我国酵母资源丰富，对其进行高附加值产品研究开发，具有良好的社会与经济效益。广西是我国的蔗糖主产区，有丰富的糖蜜酒精成熟醪，发酵成熟醪中大约有10％左右的干物质，其中含有大量的酵母菌，具有很大的利用价值。目前酒精车间直接将发酵成熟醪送入蒸馏塔，酵母菌体经蒸酒后残留在废醪液中成为废液中BOD的主要成份，并且造成初馏塔经常结垢塞塔现象，不仅浪费了酒精酵母资源，而且为后期废液处理带来极大困难。在酒精成熟醪中一般酒精的含量为8"-"11％，醪液中酵母的增值过程伴随着新酵母的产生，部分酵母的老化、死亡和自溶。酵母的粒径约为8""12urn，我们用絮凝分离、离心分离、膜分离等多种分离手段，对酒精成熟醪做了反复试验研究，得到如下结论：(1)采用有机或无机的絮凝材料，可从酒精成熟醪中回收非溶解性固形物，但絮凝剂用量大(铝盐和铁盐的用量在100mg／L以上，聚丙烯酰胺的用量在15mg／L)，得到酵母受到絮凝剂材料的污染，蛋白质含量下降。(2)由于醪液成分复杂，固形物含量较高(O．3"0．8％)，用膜系统直接进行固液分离，膜系统容易堵塞，影响膜的使用寿命。(3)用离心机分离酒精成熟醪中的固形物，工作稳定，处理量大，适合于工业化生产。综上所述，我们采用离心机在成熟醪蒸馏前，通过离心方法回收废酵母，离心分离后的上清醪液进入蒸馏塔，而成熟醪回收的固溶物，进一步除去杂质得到纯净的酵母泥，实现酒精与酵母联产，再以酒精酵母为研究对象，测定酵母的成分并与鲜酵母作比较，为糖蜜酒精酵母的进■步研究开发提供参考。本研究对推进甘蔗糖业综合利用的技术进步有积极的意义。2．2材料和方法2．2．1原料糖蜜酒精成熟醪(蒲庙造纸厂酒精车间)； 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3—葡聚着的研究鲜酵母(市售)2．2．2试剂盐酸；酒石酸；草酸；氢氧化钠；碳酸氢钠；苯酚；浓硫酸；葡萄糖；硫酸铜(CuS04．5H20)；硫酸钾；硼酸；苯酚：甲基红．溴甲酚绿混合指示剂均为分析纯。2．2．3仪器飞鸽牌TDL．80．2B台式离心机；箱式电阻炉(马弗炉)；电子分析天平，AL204型；万用电炉；电热鼓风干燥箱；紫外可见分光光度计；显微镜；血球计数板，XB．K-25；索氏提取器；微量凯氏定氮装置；蒸酒装置；其他实验室常用玻璃仪器。2．2．4实验方法2．2．4．1技术路线用离心机对成熟醪进行固液分离，离心后的沉淀物进行多次洗涤，酵母泥水洗涤工序采用多级循环洗涤，洗涤废液①由于营养物质丰富而回用，洗涤后的酵母泥经过化学洗涤后得到干净的酵母泥，经干燥后进行检测；离心后的上清液进行蒸馏，测定酒度。工艺流程如图2．1。上清液_蒸馏_酒度测定脯醪热瓢离毒＆一毒篡脯珏⋯黼心离心洗涤④k离，嗲洗涤蛾一母心洗涤③_酵母泥一化学洗涤一离心洗涤水①回用干净酵母泥‘检测Fig．2-1Thetechnologicalprocessofrecoverywasteyeastfrommaturefermentedmash’成熟醪离心回收废酵母试验按离心转速、离心时间、洗涤水量(％)、洗涤次数，四个条件进行单因素实验，其中洗涤水量是指占成熟醪量得体积比，加醪液量为150ral，以洗涤水量30％，洗涤次数3次，离心转速3000转，离心时间5分钟为基准，按表2．1的方案进行试验。19 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取卢一l，3一葡聚糖的研究表2．1成熟醪液离心及酵母泥洗涤试验方案Tab．2-1Theexperimentalschemeofwashingyeastandmashcentrifugation亟目选送盔量选瀣达邀宣：坠整运宣：坠吐闻．135％330005230％330005325％330005420％33000530％230005630％330005730％430005830％530005930％325005lO30％3300051130％3350051230％3400051330％3300031430％3300051530％33000101630％33000152．2．4．3酵母泥化学洗涤试验成熟醪经离心机离心和酵母泥水洗涤后，参照啤酒废酵母的处理方法先对酵母泥进行酸洗在进行碱洗。酸洗和碱洗的结合可以除去酵母泥中大部分胶体、无机盐、色素、灰分等，得到较纯净的酵母泥。2．2．4．3．1酵母泥化学洗涤探索试验根据所查文献资料，酸洗酵母的化学药品包括盐酸、酒石酸、草酸；碱洗酵母化学药品包括氢氧化钠和碳酸氢钠。按技术路线方法，三次洗涤后的酵母泥依次经过五种化学药品溶液洗涤，然后再经蒸馏水洗涤两次烘干后进行灰分和蛋白质检测，找出最适宜的化学药品和洗涤规律。2．2．4．3．2酒石酸酸洗条件的确定酒石酸洗涤按酒石酸浓度，洗涤时间进行单因素实验，经洗涤后的酵母，再经蒸馏水洗涤两次后烘干进行灰分和蛋白质的检测，找出洗涤效果最佳酒石酸浓度，和洗涤时间。． 从糖蜜省精成熟醪醇母中提取口一l，3一葡聚糖的研究表2-2酵母泥酒石酸洗涤试验方案Tab．2-2Theexperimentalschemeofwashingyeastbytartaricacid2．2·4·3·3先酸后碱洗涤条件的确定先用不同浓度的酒石酸对酵母进行洗涤，再用碳酸氢钠进行碱洗，然后再经蒸馏水洗涤两次后烘干进行灰分和蛋白质的检测，确定酒石酸和碳酸氢钠的浓度。’2．2．4．4酵母质量检测称取一定量的经化学试剂洗涤的酵母对其进行蛋白质含量、灰分含量、总糖含量、细胞死亡率的检测。2．2．4．5分析方法(1)酒度【79】：取lOOml成熟醪离心上清液于蒸馏瓶中加入100Illl蒸镏水后常温蒸酒，承接lOOml馏出液，用比重式酒度计测定其酒精度及温度，查表更正成20℃酒度。(2)酵母泥得率：取一定量的成熟醪液经离心机离心后倾去上层清液，测所得的酵母泥占成熟醪液的重量百分数。(3)蛋白质含量【80】：微量凯氏定氮法。(4)灰分含量【80】：重量法。(5)总糖含量【81l：苯酚．硫酸法。(6)细胞死亡率【82】：血球计数板法。2．3结果与讨论2．3．1成熟醪回收废酵母工艺条件的确定2．3．1．1离心机离心转速单因素实验结果离心转速单因素实验结果见图2．2和图2．3。21 广葛n弋掌硕士掌位论文从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取声一1。3啸聚糖的研究3．60％3．40％‘j器2．60％oh2．40％2．20％2．00％8．858．8≥8．75C∞苫8．7o．8．65or-c)08．6∞8．558．520002500300035004000centrifugalspeed／min图2-2离心转速与酵母得率的关系Fig．2—2Therelationbetweencentrifugalspeedandalcoholcontent20002500．300035004000centrifugalspeed／min图2-3离心转速与酒度的关系Fig．2-3Therelationbetweencentrifugalspeedandalcoh01．content由图2-2、图2．3可知：离心的最佳转速为3000r／min。转数低，虽酒度下降不明显，但由于离心不够充分，成熟醪液酵母不能充分离心出来，酵母得率低。转数高，酵母的得率较大，但酒度下降较为明显，不符合本实验的目的。2．3．1．2离心机离心时间单因素实验结果离心时间单因素实验结果见图2．4。％O0O20832誊＼≈Ho州h 从糟蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1，3一葡曩蕾的研究3．15％3．10％3．05％3．Oo％2．95％2．90j62．85％2．80％2．75％05lO15centrifugaltime／sin图2．4离心时间与酵母得率的关系Fig·2-4Therelationbetweencentrifugaltimeandyeastyield．由图2_4可知：最佳离心时间10rain。随着离心时间的增加，酒度保持不变，说明酒度的变化与离心时间不相关；离心时间增加，酵母的得率成逐步上升趋势，但随着离心时间的增加得率基本保持恒定。2．3．1．3洗涤水量单因素实验洗涤水量单因素实验结果见图2．5。4．00％3．80％3．60％3．40％3．20％3．00％ZO％25％30％35％washingwateraddition／％图2．5洗涤水量与酵母得率和酒度的关系Fig．2-5Effectofwashingwateradditionwithyeastyieldandalcoholcontent由图2．5可知：随着洗涤水量的加大，酵母的得率(％)会变小，但变小的趋势会交慢。由图的数据知：最佳洗涤水量为30％；洗涤水量小；虽其得率大但洗涤不干净，影响酵母泥的质量。洗涤水量大于30％，酵母的得率基本无太大变化，说明30％的洗涤水量能充分洗去酵母泥中的杂质，再加大水量只是浪费水资源，有悖于节约生产的目的。2．3．1．4洗涤次数单因素实验结果洗涤次数单因素实验的结果见图2-6。 g-西大学硕士掌位论文从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1，3一葡聚糖的研究4．50％2．OO％Z345。washingtimes图2-6洗涤次数与酵母得率的关系Fig．2-6Effectofwashingtimeswithyeastyieldandalcoholcontent由图2-6可知；最佳洗涤次数3次。随着洗涤次数的增多，酵母的得率(％)会变小，但变小的趋势会变慢。洗涤2次酵母的得率最大但含有较多杂质，因此洗涤的三次时，酵母的得率明显下降，而当洗第四、第五次时，酵母的得率基本无大变化，说明酵母基本已洗涤干净。．综上所述成熟醪回收废酵母工艺条件为：离心转数3000r／rain，离心时间10min洗涤水量30％，洗涤次数3次。此条件下酵母泥得率3．1％，酒精损失3％。2．3．2酵母泥化学洗涤工艺条件的确定2．3．2。1酵母泥化学洗涤探索试验结果对酵母泥进行化学洗涤探索试验，其结果见表2．3和图2．7。表2．3洗涤剂与酵母灰分和蛋白质Tab．2—3Effectofdetergentwithproteinandashcontent塞坠垡曼选塑型壅坌(墅!璧自重f塑15％盐酸10．640．71％盐酸0．1％盐酸5％酒石酸1％酒石酸0．1％酒石酸5％草酸l％草酸0．1％草酸1％氢氧化钠0。1％氢氧化钠1％碳酸氢钠O．1％碳酸氢钠1％酒石酸O．1％氢氧化钠8．418．29．17．317．410．28．515．438．536．132．928．98．943．925．141．8．46．726．142．445．938．215．418．120．424．946．2％O0dO5O5432水＼它．【o州hp∞∞oh23456789mU屹BH 广西大掌硕士掌位论文从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口～1．3—葡聚糟的研究150．1％氢氧化钠1％酒石酸24．2亚了—一16l％酒石酸0．1％碳酸氢钠8．446．117O．1％碳酸氢钠1％酒石酸26．728．318未经化学处理直接洗涤21．133．1123456789101112131415161718experimentalcode图2-7洗涤剂与酵母灰分和蛋白质关系Fig．2—7Effectofdetergentwithproteinandashcontent如图所示，蛋白质含量高且灰分含量低的一组为第5组，即经l％酒石酸洗涤的效果最好，同时从第14、15、16、17、18中的数据可以看出先酸洗后碱洗的优势，并且酒石酸的浓度和洗涤时间需要进一步的选择。2．3．2．2酒石酸洗涤条件的确定2．3．2．2．1酒石酸浓度单因素实验结果6050300．50％1％3％4％concentrationoftartaricacidL％图2-8酒石酸浓度与酵母灰分和蛋白质的关系Fig．2．8Effectofconcentrationoftartaricacidwithashandproteincontent25¨i"睦嚣匿嘲龋圈啊—■—■一订嘲尉豳阿髓图日—■一目暖图圈瞄嗣圜■——■一列嗣酣附图砑日圈l——I蜀圈—■——●■■陶谢潮隧日■■—一【：三：蚓吲龋磷I膳豳凰匿曩■■■置-．．．，．．．．，．．．．1T．．．．．．fL鼹甚瞄阻嘎叠■——一r．．．．．，，，．．，L日豳疆圈薯■■■■■-．．．．．．．．．．．，．．．L豳捌瞄嗣日■IP．．，．．。．．．．．．．。．，．．．．．L融罾譬臣■■置—■■喇嗣张圈叠叠——■一—．．．．．．。．．．．。L翻弼埘瞄掰融强目—叠一厂，．．。．．．．．．．．．I．．一强圄罾瞄■——■■一—．．．．。．．L曙强蹰菌曩鼍■—■■的∞加O还董菩ooIll32A勺磊II是阑圈翳雷翮豳雷圈省图豳豳豳冒厂J}一目嘈加120还_矗甚oo置旦2cl勺磊景西乏§ 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡聚塘的研究由图2．8可知：洗涤效果最佳的酒石酸浓度为2％。如图所示，用浓度小于2％酒石酸洗涤时，可以有效的降低灰分好提高蛋白质含量，但当浓度大于2％时，酵母的灰分却有所提高，蛋白质有所下降，这说明过高的酒石酸浓度不仅能增加酵母的灰分还能洗去部分蛋白质从而降低蛋白质的含量。2．3．2．2．I酒石酸酸洗时间单因素实验结果60504030washingtimeoftartaricacid／rnh图2-9酒石酸酸洗时间与酵母灰分和蛋白质的关系Fig．2—9Effectofwashingtimeoftartaricacidwithashandproteincontent由图2-9可知：在酒石酸浓度为2％时，最佳洗涤时间为30min。2．3．2．3先酸后碱洗涤条件的确定按2．2．4．3中方法对酵母进行洗涤后进行灰分，蛋白质含量的测定，结果见图2—10。1．50％1．75％2％2．50％concentrationoftartaricacid舭图2．10酸碱液浓度与酵母灰分和蛋白质Fig．2-10Effectoftheconcentrationofacidorlyewithashandproteincontent如图所示，先酸洗后碱洗的最佳工艺为，酒石酸浓度1．75％。先酸后碱洗会使酵母26一6幽隧雷。一3黼豳豳滔。一1l溺豳雷5{5莶>113IIoo葺磐2Q口口博工∞时一圈溺溺幽盟一㈥阌矧翻邈|I_1：㈡浏㈡浏嘲豳鼷盟0O654321蓬甚罢o。眉38A爱rB鼋 从糖蝴精成熟醪酵母中提取口一I．3—葡聚糖的研究的灰分增加，但可以降低胶体含量，提高蛋白质和含量。2．3．3酵母质量检测结果‘按2．2．4．5中的检测方法对本次试验得到的酒精酵母进行蛋白质含量、灰分含量、总糖含量、脂肪含量、细胞死亡率、检测并与鲜酵母进行比较，结果见表2-4。表2-4酒精酵母成分比较结果Tab．2-4Thecomparisonofdifferentyeastcomposition从表中的数据可以看出，本次试验得到的酒精酵母的灰分含量，蛋白质含量，细胞死亡率，色泽比鲜酵母的质量稍逊色，但总糖含量却高于鲜酵母，且几项重要指标达到食品级。酵母的衍生物很多，可以作为原料制造多种高附加值的产品。本实验针对酒精酵母总糖高的特点进行酵母胞壁多糖的提取，为废酒精酵母的进一步开发研究提供参考。2．4本章小节通过对成熟醪离心分离试验、酵母泥化学洗涤试验、酵母质量检测实验，得出如下结论：(1)成熟醪离心分离实验条件为：洗涤水量30％，洗涤次数3，离心转数3000r／min，离心时间10min。在次条件下能最有效的把酒精酵母从成熟醪中分离出来，并把对成熟醪酒度的影响降到最低。(2)酵母泥化学洗涤方案为：先经过1．75％酒石酸洗涤30min，再用0．1％的碳酸氢钠洗涤。所得酒精酵母的总糖含量高于鲜酵母，．针对酒精酵母糖含量高的特点可进行酵母胞壁多糖的提取。 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1。3一葡聚糖的研究3．1引言第三章新工艺废液回用实验目前我国南方省区的甘蔗糖蜜酒精生产厂家在实际生产中，为了有效地提高生产设备的利用率，各厂家均采用双流程双流加的连续发酵工艺。基本采用低浓发酵÷其主要优点是基质抑制和产物抑制对发酵基本没有影响。酒精废液富含有机物，若不经处理直接排放，不仅污染环境，而且浪费了其中丰富的可供利用的营养物质。由于酒精废液中含量最多的还是水，太多数综合利用的工艺中都是将一部分废液返回生产中用于拌料的回用路线。在节约生产用水的同时，废液中残存的某些营养物质可被酵母所利用，这是回用发酵初期醪液中酒精含量有所增高的重要因素。所谓废液回用工艺是一种资源化利用的手段，就是用废液代替一部分水，不经处理或经简单处理直接用来稀释糖蜜进行酒精发酵。成熟醪经过回收废酵母新工艺，离心后上清醪液进入蒸馏塔，酒精蒸馏后排放出的釜液COD、BOD、胶体、色素等含量大大降低。本章的内容是以不同浓度比例的新工艺废液代替清水稀释糖蜜，通过观察发酵过程酵母的生长情况以及测定发酵72h后的产酒率，确定新工艺废液代替稀释糖蜜清水的量，得到最佳回用率，减少废液排放量。3．2材料和方法3．2．1原料试验菌种、糖蜜：广西金光糖厂提供；主要培养基：(1)液体完全培养基吖PAD)：1．O％酵母膏，2．0％葡萄糖，2．0％蛋白胨，pH6．0。(2)固体完全培养基：液体完全培养基(YPAD)+2％琼脂。 从疆蜜疆精成熟醪酵母中提取卢一1．3—葡秉糖的研兜3．2．2试剂重铬酸钾标准溶液[(1／6K2Cr20T)--0．0500tool／L],硫酸亚铁铵标准溶液[(NH4)2Fe(S04)2·6H20=0．025mol／L]；消化液(用于测定CODcr为50-looomga水样，CODcr>1000mg／L的水样需稀释测定)；催化剂(称取8．809硫酸银溶于1L浓硫酸中)；掩蔽剂(称取30．009硫酸汞溶解于100roll0％的硫酸中)；CODc，1000mg／1的邻苯二甲酸氢钾标准溶液；10000mg／1的氯化钠标准溶液；硫酸铝钾、钼酸铵、硫酸银、Na2HP04，KH2P04，尿素，磷酸，青霉素，次甲基蓝，亚铁氰化钾均为分析纯。3．2．3仪器Ⅺ一I型COD消解装置及消解管；广东省环境保护仪器设备厂电子天平，AL204型，梅特勒．托利多仪器(上海)公司分光光度计，721型，上海第三分析仪器厂台式离心机，TDL．80．2B型，上海安亭科学仪器厂冰箱，KG21V41TI型，西门子中国博西家电销售有限公司磁力加热搅拌器，78．1型，北京精之杰实验仪器有限公司生化恒温培养箱，北京精之杰实验仪器有限公司酸度计，Delta320型，梅特勒．托利多上海有限公司阿贝折射仪，上海光学仪器厂电热恒温干燥箱，GZX．DH-26x30．TBs，上海跃进医疗器械厂箱式电阻炉(马福炉)，SX2-4．10，上海跃进医疗器械厂高温灭菌锅；生物显微镜；血球计数器；往复式摇床；YJ．875医用净化工作台；酒度计；蒸馏装置等。3．2．4实验方法3．2．4．1新工艺酒精废液与原工艺酒精废液的检测·将成熟醪直接蒸馏产生酒精废液和上清醪液蒸馏后的酒精废液进行COD，BOD，’ 从耱蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1。3一葡聚糖的研究SS的检测分析。3．2．4．2新工艺废液回用试验3．2．4．2．1废液回用技术路线废液_配比稀释糖蜜_÷添加营养盐(o．15"--0．20％糖蜜量的尿素+0．003"-"0．005％糖蜜量的磷酸)_调节至pH4．O一加入酒母一静置发酵_蒸酒--,"N定酒度3．2．4．2．2酵母菌的纯粹培养将经过纯种分离的优良酵母，用接种针接入到新鲜斜面试管进行活化，采用固体Ct"PAD)培养基，以原菌种接种后，置于30"C左右下培养，待斜面长出白色菌苔，即可放入冰箱保存备用。将成熟新鲜固体斜面做菌种，接入称有10ml培养基的液体试管，摇匀后置于30℃左右下培养24小时，待液体冒出大量的二氧化碳即可。3．2．4．2．3酵母菌的扩大培养。将液体试管菌种全部接入盛120ml培养基的三角瓶中，在30"C左右下培养24h，待液体冒出大量的二氧化碳即可。●3．2．4．2．4废液回用发酵产酒按照所列的技术路线，将各种废液与水以不同的配比稀释糖蜜250Bx，取206ml于500ml三角瓶中，用移液管接种量8％酵母菌液于三角瓶中，后置于恒温培养箱静置发酵，发酵温度30"-"-"30．5"C，每24h摇瓶一次，发酵72小时后蒸酒测定酒度。以蒸馏水为空白得出最佳回用率。3．2．4．3分析方法．(1)酒度测定【791。(2)糖蜜锤度：折光法1831，采用阿贝折光仪(3)发酵液PH值：电位法嗍，采用pHS型酸度计(4)COD的测定：重铬酸盐法(GBll914—89)。(5)BOD的测定：五日生化培养法【85】(DSS含量的测定：重量法【80】3．3结果与讨论3．3．1新工艺酒精废液成分测定与比较用3．2．4．3的方法对样液进行COD含量、BOD含量、固形物含量SS测定，结果见表3．1。30 广西大掣晡炙士掌位论文从糟蜜酒精成熟晦醇母中提取口一1．3一葡聚鲁的习|_究表3．1成熟醪离心处理前后废液成分比较Tab．3·lThecomparisonofmaturefermentedmashcompositionbeforeandafterecntrifugation壁婆璺墨盒量型匹竺塑鱼量翌匹堡Q里鱼量咝直接蒸馏废液6349214359068520离心后蒸馏废液2965894783‘29520由表3-l中数据可知：经过离心后蒸馏的废液比直接蒸馏的废液SS下降了53．3"／0，COD下降了34％，BOD下降了56．9％，说明醪液经离心处理后，可以减轻蒸馏塔结垢的程度，同时可使酒精废液COD，BOD大大降低，进而减轻了糖蜜酒精废液治理的难度。3．3．2新工艺废液回用试验结果3．3．2．1新工艺酒精废液回用实验结果．新工艺酒精废液的回用试验方案和结果如表3-2所示，空白样是指全部用蒸馏水稀释糖蜜。●，表3-2废液回用率与酒度“Tab．3—2Therelationbel【、)煳thereuserateofwasteliquidandalcoholcontent实验代号废液回用率失重(曲酒度l空白12．758．30‘25％直接蒸馏废液13．258．70310％直接蒸馏废液12．908．2020％直接蒸馏废液10％离心后蒸馏废液15％离心后蒸馏废液20％离心后蒸馏废液25％离心后蒸馏废液30％离心后蒸馏废液11．2513．9514．1513．0512．1510．157．408．808．408．107．509。8．8薯8．6尝8．488．2育8暑7．8名7．67．47．20l2345678910experimentalcode图3．1废液回用率与酒度Fi93-1Therelationbetweenthereuserateofwasteliquidandalcoholcontent如图所示，直接蒸馏废液的最佳回用率为5％，离心后蒸馏废液的最佳回用率为3l 从糟蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1，3一葡聚糟的研究15％，回用率为20％时不影响产酒率。废液的回用会使酒度升高，但回用率太高，酒度下降比较严重，这是因为酒精废液的周用使发酵醪中的固形物含量和代谢抑制物质积累，最终影响酵母的正常生长与发酵。通过控制酒精废液的回流比率，使发酵醪中固形物含量和代谢抑制物质的浓度控制在不影响正常发酵的范围之内，即可实现酒精废液回用的无限次循环。3．3．3酵母泥洗涤废液①回用试验结果用酵母洗涤废液①进行回用试验，发酵72小时后测定醪液酒度，其结果见表3．3和图3-2。表3-3洗涤液①回用率与酒度Tab．3-3Therelationbetweenthereuserateofwashingliquid①andalcoholcontent9。8．8≥堇8．6口。三8．4ol88．2勺87．8‘reuserateofwashing】iquid①／％图3-2洗涤液①回用率与酒度的关系Fig．3-2Therelationbetweenthereuserateofwashingliquid①andalcoholcontent由图3．2可知，酵母洗涤废液①的最佳回用率为50％，酒度可达·8．90，酵母洗涤废液①最大回用率达70％，酒度为8．30，但回用率超过70％后，酒度开始低于空白时的酒度，说明新工艺酵母洗涤废液①回用率70％时不影响产酒率。32 从糖蜜酒精成菇醪酵母中提取口一1．3—葡聚糖的研究本章小节本章探索了利用回用技术处理新工艺废液的方法，通过将废液代替清水回用到前期发酵中去，达到减少废水排放的目的。(1)通过对新旧两个工艺的酒精废液的成分比较，证明新工艺酒精废液SS下降了53．3％，COD下降了34％，BOD下降了56．9％，减轻了废液治理的难度。(2)直接蒸馏废液的最佳回用率为5％，新工艺酒精废液的回用率可达20％，比旧工艺废液回用率提高了4倍，酵母洗涤废液①的回用率达70％。 从糖蜜酒精成熟醪酵母中攫取口一l，3—葡粟蕾的研究第四章从酒精酵母中提取p一1，3．葡聚糖工艺的研究4．1引言p一1，3．葡聚糖广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料等行业，是至今为止科学家发现的最优秀的活性免疫多糖，又是一种活性强、无毒副作用的高效生物应答物(Biologicalresponsemodifiers，BRMs)，具有抗癌、抗肿瘤、抗菌抗病毒、增强机体免疫力、降低胆固醇、促进伤口愈合、加速重金属的排泄、改善某些老年型疾病症状等功能。近年来，国内外开始认识到啤酒废酵母宝贵价值，并加以综合利用。啤酒酵母是啤酒工业的主要副产品之一，由于其独特的营养特性，目前对啤酒废酵母的综合利用，大多集中在蛋白质、维生素、核酸、微量元素和酶等方面。研究最多的是利用酵母自溶，回收蛋白质和可溶性营养物，作为营养源和调味品添加剂。然而，酵母自溶提取蛋白质等可溶性物质后，仍有大量残渣存在，酵母自溶残渣即酵母细胞壁，酵母细胞壁主要由葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质、脂类和几丁质组成。其中，葡聚糖约占50％，甘露聚糖约占20％，蛋白质约占10"-15％，脂类约占8-"-9％，几丁质约占10％或更少。酵母葡聚糖在化学成分上是不均一的，在物理结构上也是各向异性的。葡聚糖可用碱溶液处理加以分离，碱不溶性葡聚糖通常位于酵母细胞壁内表层的微纤维中，以’B．1，3．糖苷键结合成的葡聚糖为主链，含有3～6％以p．1，6．糖苷键结合成的葡聚糖侧链【451。从废酵母自溶残渣中提取碱不溶性酵母p．1，3．葡聚糖作为药用、药食联产，既解决了环境污染的问题，又可给企业带来可观的经济效益。近年来，人们己对酵母p．1,3．葡聚糖的提取做了许多探索，但是由于其提取的目的不同，其提取工艺和相应的要求也各不相同。因此，本研究依据提取酵母p．1，3．葡聚糖’●的基本原理，在前人的研究基础上，提出了自溶．超声波．酶解．碱溶氧化法提取工艺，探讨了以甘蔗糖蜜成熟醪废酵母为原料制备p．1，3．葡聚糖，旨在为糖蜜酒精废酵母的综合利用寻求一种新的方法，实现B．1，3．葡聚糖和酵母抽提物的联产，并为工业化生产提供理论基础和实践指导。’． 广西大掌硬士攀位论文从糖蜜灌精成藏醪酵母中提取口一I．3啸聚糖的研究4．2材料和方法’4．2．1原料酒精废酵母：蒲庙造纸厂酒精车间成熟醪回收所得；活性干酵母、啤酒酵母(市售)碱性蛋白酶：购自南宁中诺生物工程有限公司，8万U／g。4．2．2试剂苯酚：广东西陇化工厂；硫酸铜：广东汕头市红卫化工厂硫酸钾：西安化学试剂厂；碳酸钡：天津市天河试剂厂无水乙醚：上海马陆制药厂；无水乙醇：上海振兴化工一厂邻苯二甲酸：上海振兴化工一厂；硼酸：武汉市中南化学试剂厂磷酸：上海联合化工；丙酮：国药集团化学试剂有限公司高碘酸钠：上海化学试剂采购供应站经销；硝酸：上海达菲工贸有限公司次氯酸钠：上海试剂一厂；乙酸：上海达菲供贸有限公司硫酸：武汉市亚泰化工试剂有限公司次甲基蓝、甲基红、印三酮、氯化钠试剂均为分析纯，所用水均为蒸馏水。4．2．3仪器752紫外光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司超声波细胞粉碎机，JY92．II型，上海新芝生物技术研究所双列八孔恒温水浴锅，HH型，南汇电讯器材厂旋转蒸发器，RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂真空泵，zXZ．2型，上海真空泵厂’数字酸度计，pHS一3C型，成都方舟科技开发公司微量凯氏定氮仪，湖北恒康化玻仪器公司4．2．4实验原理与方法4．2．4．1提取技术路线的探索试验根据所查文献资料，以及试验室的配置，我们进行了如表4．1所示的提取技术路线探索试验，并对得到的产品酵母抽提上清液和碱不溶性葡聚糖进行检测，以确定最佳提35 从糖蜜酒精成熟醪醇母中提取口一1．3一葡聚糖的研究取技术路线。表4-1提取技术路线探索方案Tab．4-1Theprobingschemeofextractiontechnique实验代号试验方案直接碱溶自溶+碱溶’自溶+酶解+碱溶自溶+碱溶+酶解超声波+自溶+酶解+碱溶自溶+超声波+碱溶自溶+NaCIO氧化自溶+超声波+酶解+碱溶+NaCl0氧化4．2．4．2自溶．超声波．酶解法制备酵母抽提物4．2．4．2．1‘试验原理(1)自溶酵母的自溶原理是利用酵母菌体内的内源酶(蛋白酶、核酸酶、碳水化合物水解酶等)将酵母细胞内的大分子物质水解成氨基酸、肽，以及其它的风味化合物。制取酵母抽提物的关键是细胞壁的破碎和蛋白质、核酸等大分子的降解，从而使细胞组分快速释放。酵母在适当热处理，自溶与质壁分离过程中，细胞内酶(主要为糖化酶与蛋白酶)分解细胞质成分。当加热至储藏的碳水化合物(糖类)开始自动发酵温度时(40。C"60"C)，酵母细胞中的反应就开始了。当其它胞内酶(如蛋白酶、核酸酶)的活力增加，邻近细胞壁的细胞膜渐渐失去它的选择性，可溶性化合物就渗透出来。随着细胞膜与细胞壁渗透性的增加，在细胞外也出现了蛋白质分解。酵母自溶程度主要取决于温度、pH、提取的时间和加水量。自溶作用是一个复杂的过程，只有选出最适宜的条件，才能得到满意的结果。酵母自身酶活性较弱，自溶得到的产品氨基氮含量及抽提物收率低，自溶时间长，产品会略带氨味，自溶过程易发生腐败变质。自溶促进剂不但可以诱导酵母自溶，改变●细胞渗透性，加速酵母的自溶，缩短自溶时间，同时可以抑制细胞腐败作用。自溶促进剂的主要作用是激活酵母体内的各种酶如蛋白酶、糖酶、核酸酶等的催化活力，促进这些酶对酵母体内生物大分子物质的水解作用，生成更多的降解产物，从而提高得率及产品氨基氮含量。自溶促进剂包含有：食盐、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、硫胺素、脂肪酸及其甘油脂、氨基乙醇、EDTA等，其中研究得最早且最多的是食盐和乙醇。36 从糖蜜酒精成熟醪蓐母中提取口一1．3—葡曩疆的研究(2)超声波破碎细胞破碎酵母细胞壁的方法一般有化学法、酶法和机械法。化学法主要是通过将自溶液的PH值调至碱性条件，采用热冲击的方法破壁，通过此方法可使得率提高3％左右。酶法主要是采用细胞壁破壁酶，可使得率提高5％左右。机械法主要采用高压均质法或超声波法，将酵母悬浮液调至浓度为10"--15％，其破壁率为60％以上，能同时提高得率和蛋白质水解率，缩短自溶时间。利用超声波破壁处理酵母细胞，产生的强烈振动、高加速度及强烈的空化效应，不但可以提高酵母细胞壁的破碎程度，促进胞内物质的扩散从而提高得率，而且还可以诱导和促进酵母自溶，增强各类水解酶的作用，缩短自溶时间。(3)酶解在酵母自溶过程中，随着自溶的进行，介质条件越来越不适合于酶特别是蛋白酶的水解作用，影响了蛋白质的水解程度，使产品游离氨基氮含量偏低，同时也影响了得率．因此，一般都在自溶前或自溶过程中加入蛋白酶，控制一定的水解条件进行作用，以加速蛋白质的降解。这样可以提高水解率，可缩短自溶时间。外加酶主要有木瓜蛋白酶、磐“一菠萝蛋白酶、中型蛋白酶、碱性蛋白酶以及复合蛋白酶等。由于酒精酵母在糖蜜成熟醪的高酸环境生存，而且在自溶过程中起主导作用的水解酶属于酸性水解酶。所以结合比．较各种蛋白酶的特性和成本，在酶解工序我们采用碱性蛋白酶作为外加酶。4．2．4．2．2试验步骤(1)酵母自溶取酒精酵母两份(每份209)，以一定的料液比加入蒸馏水制成酵母悬浮液，然后分别加入一定质量分数的乙醇和食盐，调节起始pH值，在一定的温度下自溶一定的时间后，离心取上清液测定其氨基酸含量及酵母失重率，确定自溶工序最佳工艺条件。(2)超声波破碎酵母细胞’酒精酵母自溶一定时间后离心，沉淀物用蒸馏水以一定的料液比稀释成酵母悬浮液，混匀后置于超声波破碎仪破壁，在一定工作条件下处理一定的时间，离心后测定酵母失重率，确定超声波破碎工序最佳工艺条件。(3)酶解酒精酵母经自溶和超声波破碎以后，加入一定浓度的碱性蛋白酶(以酵母干重计)，在一定温度和最适pH值下酶解一定的时间后，测定酵母抽提液氨基氮含量及酵母失重率，确定酶解工序最佳工艺条件。(4)正交实验优化自溶．超声波。酶解法制备酵母抽提物的过程37 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一I，3一葡聚糖的研究采用自溶．超声波．酶解法提取酵母抽提物，其氨基氮含量和酵母抽提得率受多种因素的交叉影响，通过单因素实验，初步选定了乙醇浓度、自溶温度、超声波功率、酶添加量为主要因素，采mLg(34)进行正交实验。为考察影响氨基氮含量和酵母抽提得率的主次因素，确定酵母抽提物提取工艺最佳参数，按表4-2设计实验。表4-2酵母抽提物提取工序因素水平表Tab．4—2Thefactor=levelstableofyeastextractextractionprocess水平——————————————————』塑生——————————二-———一一垒!圣蔓盗廑!业!星!鱼渣婆鏖!羔!曼!塑壅垫皇f塑望!夔鋈垫量世垡l2．5％5040030023％5345040033．5％。565004．2．4．3碱溶一次氯酸钠氧化法处理酵母细胞壁制备p-1，3．葡聚糖4．2．4．3．1试验原理可溶性SSG、SPG、GRN等多糖摄入后，会逐渐从血液中消失，沉积在体内，尤其是在肝脏和脾脏中，该过程需要相对较长的时间。p．1，3．葡聚糖在数月内均无明显变化，而其他的蛋白质、核酸、脂类大分子物质的代谢和排泄在24,J,时内完成。说明p．1，3．葡聚糖较甘露糖蛋白、几丁质、蛋白质、核酸、脂类等大分子物质抗氧化能力强阳，因此提出碱溶结合次氯酸钠氧化法提取p一1，3．葡聚糖新工艺。酒精酵母泥经过自溶一超声波．酶解法处理后，细胞骨架基本保持完整，沉淀细胞壁先经碱溶处理，充分破坏酵母细胞壁结构使多糖与蛋白等物质分离，同时也尽可多地溶解一些碱溶性物质，可以有效地除去蛋白质、核酸、甘露聚糖以及其他碱溶性物质；碱处理后再经次氯酸钠氧化处理能较彻底的去除脂类大分子、甘露聚糖蛋白和其他杂质，从而提高产品碱不溶性13．1，3．葡聚糖纯度。4．2．4．3．2实验步骤·(1)碱溶处理沉淀细胞壁酒精酵母经自溶．超声波．酶解法处理后，‘离心得到沉淀细胞壁，用一定浓度碱液(NaoH)以一定的料液比稀释沉淀细胞壁成悬浮液，充分混匀，在一定温度的水浴中加热处理一定时间，冷却后离心沉淀分离，弃去碱液。沉淀用蒸馏水多次洗涤，于沸水浴中加热处理后离心沉淀分离，弃水液，再用无水乙醇对其洗涤多次，离心沉淀分离，弃溶剂，最后再用无水乙醚洗涤沉淀，并离心沉淀分离，于沸水浴中挥发残余无水乙醚，再置于37℃下真空烘干。计算多糖得率并测定多糖含量，确定碱溶工序最佳工艺条件。 ．从蕾蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡粟糖的研究．(2)次氯酸钠氧化处理沉淀细胞壁经碱溶处理后，用低浓度碱液(NaOI-I)以一定的料液比稀释沉淀细胞壁成悬浮液，添加适量次氯酸钠溶液(以最终有效氯浓度为衡量标准)，充分混匀，在一定温度的水浴中反应一定时间结束后，离,tl,lOmin收集沉淀，沉淀用蒸馏水充分洗涤，于沸水浴中加热处理后离心沉淀分离，弃水液，再用无水乙醇对其洗涤多次，离心沉淀分离，弃溶剂，最后再用无水乙醚洗涤沉淀，并离心沉淀分离，于沸水浴中挥发残余无水乙醚，再置于37℃下真空烘干。计算多糖得率并测定多糖含量，确定次氯酸钠氧化工序最佳工艺条件。．(3)正交实验优化碱溶．次氯酸钠氧化法处理酵母细胞壁制备pl，3．葡聚糖的过程采用碱溶结合次氯酸钠氧化法提取p．1，3．葡聚糖，其得率和纯度受多种因素影响。通过单因素试验，初步选定了碱溶浓度、碱溶温度、氧化碱液浓度、有效氯浓度为主要因素进行正交实验。为考察各因素的影响大小并选择最佳工艺条件，按表4．3设计实验。表4-3肛1，3．葡聚糖提取工序因素水平表～．Tab．4-3Thefactor-levdstableofpl，3-glucanextractionprocess水平i_磊丽再赢矿酉百藏薮可d弩}丽蕊百两—i雨两丽l2．5％750．2％0．6％23％800．3％0．8％33．5％850．4％1％4．2．4．4响应面法优化工艺条件提高pl·3一葡聚糖的纯度4．2．4．4．1试验原理计算结构可靠度，如果功能函数已知，即为显示功能函数，可采用一次二阶矩法。在实际工程中的结构构造非常复杂，既使对其进行确定性分析，都需要借助于有限元等数值分析工具。在这种情况下进行结构可靠度分析时，常不能给出功能函数的明确表达式。这一类问题，可采用响应面法(ResponseSurfaceMethodology，简称RSM)进行求解。响应面法是选用一个适当的、可以明确表达的函数来近似代替不能明确表达的函数，即通过一系列有限元数值计算拟合一个响应面以代替未知的、真实的极限状态曲面。在多因素数量处理试验的分析中，可以分析试验指标(依变量)与多个试验因素(自变量)间的回归关系，这种回归由于是曲线或曲面的关系，因而称为响应面分析。响应面分析法系采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，将多因子实验中因素与指标的相互关系用多项式近似拟合，依此可对函数的响应面和等高线进行分析，研究因子与响应39 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3—葡聚糖的研究面之间、因子与因子之间的相互关系。它与过去广为使用的正交实验设计法不同，它以最经济的方式，以较少的实验次数和较短的时间对所选的实验参数进行全面研究，求得的回归方程精度高，并能能研究几种因素间的交互作用。4．2．4．4．2试验设计在两个正交实验的基础上，我们选取对制备酵母抽提物和p．1，3．葡聚糖过程影响最大的酶添加量、碱溶温度、碱溶浓度三个因素进行中心组合试验设计，利用响应面分析，优化B．1，3。葡聚糖提取最佳工艺条件。表4-4中心组合试验因素水平表Tab．4-4Thefactor-levelstableofcentergrouptest4．2．4．5分析方法4．2．4．5．1多糖含量测定：苯酚—硫酸法【81】(1)样品预处理称取样样品5．Omg左右，先J}lIA．5ml10mol／L的H2S04，水解10min后加水，稀释至1．5mol／L的H2S04浓度，I00。C下封管水解24h，BaC03中和，离心，过滤并定容至100ml，取lml按苯酚．硫酸法测定多糖含量。(2)标准曲线的绘制分别吸取401．tg／mL的葡萄糖溶液0．2、0．4、0．6、0．8、1．b、1．2、1．4、1．6、1．8、2．0mL，加水补足2mL。然后加入6％的苯酚溶液1．OraL及浓H2S045mL，静止10rain，摇匀，室温放置20min后于490nm下测定吸光度。以2．OmL水按同样显色操作为空白，横坐标为标准葡萄糖的质量(旧，纵坐标为吸光度值，绘制标准曲线见图4-l。 0．80．6们是0．40．2020406080100weighofgly／Itgj图4．1多糖测定标准曲线Fig．4·1Thestandardcurveofpolysac圮haridemeasurement由公式Y=0．0068x+0．032可得出：多糖含量(mg)=100x(y-0．032)／0．．00684．2．4．5．2酵母失重率测定酵母失重率=【(处理前酵母泥湿重-处理离心后酵母泥湿重)／处理前酵母泥湿重】×100％4．2．4．5．3多糖得率的计算多糖得率=(粗多糖质量／酵母泥干量)x100％4．2．4．5．4多糖纯度计算多糖纯度=(测得的多糖含量／粗多糖重量)×100％4．2．4．5．5酵母抽提得率酵母抽提得率=【(酵母泥干重-沉淀酵母渣干重)／酵母泥干重】×1QO％4．2．4．5．6氨基氮含量测定．甲醛滴定法嗍。4．2．4．5．7酵母千重测定100‘C烘箱中干燥至恒重【姗。4．2．4．5．8pH值的测定pHS．3C型酸度计法f83】4．2．4．5．9碱性蛋白酶活力的测定紫外分光光度法【82】4．2．4．5．10蛋白质含量测定‘微量凯氏定氮法【30】4．2．4．5．11水分测定41 广西大学硕士掌位论文从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1，3一葡聚糖的研究105。C干燥恒重法【8014．2．4．5．12灰分测定马福炉挥发恒重法【80】4．3结果与讨论4．3．1提取工艺路线的确定探索试验结果如表4．5和图4-2所示：表4—5提取技术路线探索试验结果Tab．4-5Theresultoftheprobeextractiontechnologyprocess实验代号多糖得率(％)多糖纯度惭)．氨基氮含量(g几)23．75％19．25％17．03％17．15％16．65％17．25％38．96％48．89％59．76％67．20％66．85％68．07％68．13％29．12％O．001．753．57t．694．052．631．73815．59％72．81％6．0980．OO％70．00％≮三"专60．00％A勺蠹50．00％勺U’又40．00％∞勺基30．00％o譬兰20．00％o厶10．00％0．00％2345678experhaaentalcode图4-2提取技术路线探索试验结果Fig．4-2Theresultoftheprobeextractiontechnologyprocess从图4-2可知，第八组试验方案的酵母抽提物的氨基氮含量最大，碱不溶葡聚糖的纯度最高，所以我们选择第八组试验方案，即自溶．超声波．酶解一碱溶氧化法提取工艺，42西毳∞765_▲r 从糟蜜簿精成熟睁酵母中提取口一1．3—葡鬃糖的研究其工艺路线如下：酒精酵母泥_自溶-÷离心一超声波粉碎-÷酶解_灭活_‘离心一清液l·l无水乙醇洗涤-离心÷-次氯酸钠氧化卜离心卜碱溶卜细胞壁真空浓缩上．1无水乙醚脱水_÷干燥_多糖成品抽提物自溶．超声波．酶解法进行酵母抽提物的提取，充分利用酵母自身的酶系进行自溶，并添加乙醇作为自溶促进剂，乙醇既是自溶促进剂，也可以抑制细菌的腐败，在后序过程中，乙醇经过加热浓缩可以完全去除，其产品为纯酵母抽提物，解决了类似工艺添加食盐所得产品含盐量高，适用范围有很大局限性的问题；自溶后进行离心，避免上清液在继续酶解的过程中生成苦味肽和苦味氨基酸，影响产品质量；细胞自溶后，其细胞壁形态仍然保持完整，超声波处理可破坏细胞结构，增加细胞的通透性，有利于提高酵母抽提得率和成品多糖含量，降低成品蛋白质含量；超声波破碎后，考虑酶的成本和使用效果，我们选择了碱性蛋白酶进行酶解，极大地促进了细胞表面蛋白的降解，从而提高了酵母抽提得率。酒精酵母泥经过自溶．超声波．酶解法处理后，沉淀细胞壁先经碱溶处理，可以有效地除去蛋白质、核酸、甘露聚糖及其它碱溶性物质；碱处理后再经次氯酸钠氧化处理能较彻底的去除脂类大分子和其他杂质，从而提高产品纯度。4．3．2制备酵母抽提物工艺条件优化4．3．2．1自溶工序单因素实验结果4．3．2．1．1自溶促进剂的选择取酒精酵母泥二份(每份干重lOg)，分别选用乙醇、食盐作为促进剂，加水量为料液比I／4，第一组中加入质量分数3％的食盐，第二组加入质量分数1吮的乙醇，调节起始pH为6．5，温度为50℃，自溶24小时，分别测定各自的氨基氮含量、酵母抽提得率、酵母失重率、灰分含量等来比较自溶的效果，其结果如表4．6所示。-．表4_6自溶促进剂选择实验结果Tab．4-6Theresultofautolysispromoterchoiceexperiment由表4-6可知，以质量分数l％的乙醇作为自溶促进剂和以质量分数3％的食盐作为自溶促进剂相比，两组上清液氨基氮含量和抽提物得率相差不大，而第二组中灰分含量43 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3—葡聚措的研究明显低于第一组，因此我们选择乙醇作为自溶促进剂，解决了添加食盐所得产品高灰分、高含盐量引起的抽提物适用范围受很大局限性的问题。乙醇是酵母自溶的质壁分离剂，即是自溶促进剂，也可以抑制细菌的腐败，在后续过程中，若需制成相应的成品，乙醇经过加热浓缩可以完全去除，其产品为纯酵母抽提物。4．3．2．1．2料液比对自溶工序的影响取酒精酵母泥5份(每份干重lOg)，分别按料液比1／3、1／4、l／5、1／6、1／7加入蒸馏水制成悬浮液，加入质量分数1％的乙醇，调节起始pH6，在50。C自溶24小时，离心取上清液测定其氨基氮含量及酵母失重率，结果如表4．7所示。表4．7料液比选择单因素实验结果Tab．4-7Theresultofsinglefactorchosenbysolid-liquidratio自溶之前，将酒精酵母泥加入一定量的水制成悬浮液。其作用主要有两个方面，第一，将离心所得的致密的酵母泥分散开，有利于酵母细胞的胞内酶的作用，有利于自溶的进行：第二，也可以溶解，由于自溶产生的可溶性化合物和细胞外物质的溶解，同时加水量还直接影响氨基酸的含量和收得率。由表4．7可知，料液比较小时，自溶用水量较少，上清抽提液氨基氮含量较高，但酵母失重率很低，这是因为酵母自溶残渣上滞留有酵母抽提物，用水量越少，滞留量越大，由此损失的抽提物就越多。料液比增大后，自溶用水较多，抽提液氨基氮含量低，但有利于提高酵母失重率。另一方面，由于用水量较大，后序过程中浓缩的工作量就较大，能耗增加，且乙醇的用量也增加。所以从经济、节能的角度考虑，结合多数参考资料的数据，我们选择料液比1／5为最佳。，4．3．2．1．3乙醇添加量对自溶工序的影响·取酒精酵母泥5份(每份干重10曲，按料液比l／5加入蒸馏水制成悬浮液，分别加入乙醇量为质量分数O．5％、l％、2％、3％、4％，调节起始pH6，在50℃自溶24小时，离心取上清液测定其氨基氮含量及酵母失重率，结果如表4．8所示。 从糖蜜酒精成熟晦酵母中提取口一1．3—葡聚糖的研究表4-8乙醇浓度选择单因素实验结果Tab．4-8TheresultofsinglefactorchosenbYethanolconcentration由表4．8可知，随着乙醇浓度的增加，酵母失重率是在不断增加的，但酵母浓度从2．％至4．O％，酵母失重率的增幅变小；当乙醇浓度在3．0％时抽提液氨基氮含量达到最大，而当乙醇浓度再增加时，氨基氮含量有所降低，说明乙醇浓度过高不利于反应的进行，而且回收分离时增加了成本，因此我们选择乙醇浓度3．O％为最佳，并选择此因素进行正交试验进一步分析它对制备酵母抽提物过程的影响。‘4．3．2．1．4自溶时间对自溶工序的影响‘取酒精酵母泥5份(每份干重lOg)，按料液比1／5加入蒸馏水制成悬浮液，加入乙醇量为质量分数3％，调节起始pH6，自溶温度50℃，分别在自溶12、18、24、30、36小时后，离心取上清液测定其氨基氮含量及酵母失重率，结果如表4-9所示。表4．9自溶时间选择单因素实验结果Tab．4-9Theresultofsinglefactorchosenbyautolysistime．由表3可知，随着酵母自溶时间的增加，酵母失重率和上清液氨基氮含量都在增加，但当自溶24小时之后，酵母失重率和氨基氮含量的增幅明显变小，甚至不再增加，说明酵母在自溶24小时自溶已经比较充分，而在自溶30小时以后，自溶液略带氨味，说明白溶过度。综合考虑酵母失重率、氨基氮含量及经济省时等因素，自溶时间控制在24小时比较合适。4．3．2．1．5自溶温度对自溶工序的影响·取酒精酵母泥5份(每份干重log)，按料液比1／5加入蒸馏水制成悬浮液，加入乙醇量为质量分数3％，调节起始pH6，分别在自溶温度47℃、50℃、53℃、56℃、60℃下，自溶24小时后，离心取上清液测定其氨基氮含量及酵母失重率，结果如表4．10所示。 广西大掌磺士掌位论文从糟蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1。3一葡聚诗的研究表4．10自溶温度选择单因素实验结果Tab．4—10TheresultofsinglefactorchosenbYautolysistemperature酵母细胞的胞内酶主要是蛋白酶，它们可以将蛋白质分解成多肽和氨基酸。所以，控制适宜的温度，有利于提高这些酶的活力，使得酵母抽提物的收得率相应的提高。从表4．10克明显看出，随着自溶温度的上升，酵母失重率和氨基氮含量不断增加，在自溶温度53"(2时，酵母失重率和氨基氮含量都达到极值，自溶温度再继续上升，酵母失重率和氨基氮含量会迅速降低，这可能是由于过高的温度引起酶活力下降?因此我们选择自溶温度53℃为最佳，并选择此因素进行正交试验进一步分析它对制备酵母抽提物过程的影响。4．3．2．1．6自溶pH值对自溶工序的影响取酒精酵母泥5’份(每份干重lOg)，按料液比1／5加入蒸馏水制成悬浮液，加入乙醇量为质量分数3％，分别调节起始pH4．5、5．0、5．5、6．0、6．5、7．0，在自溶温度53‘C自溶24小时后，离心取上清液测定其氨基氮含量及酵母失重率，结果如表4．1l所示。表4-11’自溶pH选择单因素实验结果Tab．4—11TheresultofsinglefactorchosenbyautolysispH酵母细胞中的多种蛋白酶的最适pH多数在3,--,7之间，在几种酶的共同作用下蛋白质发生降解。中性和弱酸性环境不利于细胞自溶，酵母自溶过程中起主导作用的水解酶属于酸性水解酶。因为在自溶过程中pH值会自然下降，所以起始pH多为中性或微酸性。由表4．11可知，随着起始pH值得升高，酵母失重率和氨基氮含量也相应提高，而且在起始pH6时达到极值，起始pH值再继续上升，酵母失重率和氨基氮含量会迅速降低，．说明自溶起始pH6时，酵母的自溶环境有利于提高多种酶的活力，使得氨基氮含量得到相应的提高。综上所述，通过对酒精酵母自溶工序的单因素实验，我们初步确定自溶最佳工艺条件为：加水料液比1／5、乙醇添加浓度3％、自溶温度53"C、自溶起始pH6、自溶时间24小时。 从糖蜜酒精成l＆醪酵母中提取口一I．3—葡聚糖的研究4．3．2．2超声波工序单因素实验结果．酒精酵母自溶后离心，沉淀物按料液比1／5加入蒸馏水制成悬浮液，混匀后置于超声波破碎仪破壁，工作条件：声波频率20KHz，变幅杆直径为lena，占空比5／5(作用时间5s，间歇时间5s)，在功率250W、350W、450W、550W、650W条件下，分别进行超声次数20、40、60、80、100次，然后用离心机在4000r／min下离,D15min，对沉淀物称重，计算酵母失重率，结果如图4．2所示。×12％薹蹬甥9％o口·譬6％≥甾蔓3％20406080100ultrasonic血鹭s图4-3超声次数、超声功率与酵母失重率的关系Fig．4-3Effectoftimesandpowerofultrasonicwithyeastweightlossrate由图4．3可知，随着超声波破碎次数的增加，酵母失重率逐渐增加，而超声80次以后酵母失重率增幅缓慢，从经济省时方面考虑我们选择超声次数80次；随着超声功率的增加，酵母失重率也逐渐增加，而当超声功率在450W、550W、650W时酵母失重率几乎没有变化，说明酵母在超声功率450W，超声80次已经达到最好的破碎效果。4．3．2．3酶解工序单因素卖验结果4．3．2．3．1酶添加量对酶解工序的影响酒精酵母自溶后离心，沉淀物超声波破碎后，分别添力n50U／g、lOOU／g、200U／g、300U／g、400U／g、800U／g、1600U／g的碱性蛋白酶(以自溶后残渣湿重计)，调节起始pH值为碱性蛋白酶的最适pH8．0，在温度为60"C下自溶12小时，然后用离心机在4000r／rain下离,t),15min，测定上清液中氨基氮含量，对残渣称重，计算酵母失重率，结果如表4．12所示。’47 从糟蜜酒精成熟醪酵母中提取口一I．3啸聚糖的研究表4．12酶添加量选择单因素实验结果Tab．4—12TheresuRofsinglefactorchosenbyadditionofenzyme从表4．12可知，酵母失重率和上清液氨基氮含量随着酶添加量的增加而增大，当酶添加量从50U／g增加到200U／g时，酵母失重率和氨基氮含量都有大幅度提高；当酶添加量大于200U／g时，酵母失重率和氨基氮含量的增加趋于平缓，而超过400U／g后，氨基氮含量基本没有变化，因此我们选择酶添加量200U／g、300U／g、400U／g作为正交试验的三个水平进一步分析它对制备酵母抽提物过程的影响。4．3．2．3．2温度对酶解工序的影响酒精酵母自溶后离心，沉淀物超声波破碎后，添力[1400U／g的碱性蛋白酶，调节起始pH8．0，分别在温度为45℃、50"C、55。C、65"C、60。C下自溶12d"时，‘离心分离，测定上清液中氨基氮含量j残渣称重，计算酵母失重率，结果如表4．13所示。表4．13酶解温度选择单因素实验结果Tab．4-13Theresultofsinglefactorchosenbyenzymatichydrolysistemperature‘在酶解工序，当温度较低时，抽提液在酶解过程中容易腐败变质；酶解温度高于最适温度后会抑制酶的作用活性，不利于酵母的酶解，导致氨基氮含量降低。由表4．13可知，当酶解温度在45"C升至55。C范围内时，酵母失重率和氨基氮含量都有大幅度提高，在55"C达到极值，而超过55"C时，酵母失重率和氨基氮含量都有显著下降。因此酶解温度选择在55℃。．。4．3．2．3．3时间对酶解工序的影响酒精酵母自溶后离心，沉淀物超声波破碎后，添力[1400U／g的碱性蛋白酶，调节起始‘pH8．0，在温度55。C下分别酶解6、8、10、12、14d"时，离心分离，测定上清液中氨基氮含量，残渣称重，计算酵母失重率，结果如表4．14所示。 从糟蜜疆精成熟睁酵母中提取口一1，3—葡聚糖的研兜表4-14酶解时间选择单因素实验结果Tab．4—14Theresultofsinglefactorchosenbyenzymatichydrolysistime由表4．14可知，随着酵母酶解时间的延长，酵母失重率不断提高，但超过lOdx时后，酵母失重率增加趋势逐渐平缓。而氨基氮含量随着酵母酶解时间的延长，氨基氮含量先增大后减小，略带氨味，说明当酶解时间超过10小时，1有机氮可能变成无机氮，以氨的形式挥发出来。因此，酵母酶解时间控制在10小时最佳。综上所述，通过自溶。超声波．酶解法的各工序单因素实验，我们初步确定此法最佳工艺条件为：加水料液比1／5、乙醇添加浓度3％、自溶温度53‘C、自溶起始pH6、自溶时间24d,时；离心后沉淀物按料液比1／5力H入蒸馏水制成悬浮液，混匀后在超声功率450W，占空比5／5条件下，超声80次破壁；然后添互IIl400U／g的碱性蛋白酶，调节起始pH8．0，●在温度55"C下分别酶解lOd,时，灭酶，离心分离，测定上清液中氨基氮含量，残渣用于制备13．1，3．葡聚糖。4．3．2．4自溶．超声波．酶解法工艺条件优化通过正交实验，确定了自溶．超声波．酶解法提取酵母抽提物的最佳工艺条件。正交实验结果见表4-15，方差分析结果见表4-16。表4-15酵母抽提物提取过程正交试验结果Tab．4-15Theorthogonalresultofyeastextractextractionprocess49 从糖蜜洱靖成熟醪酵母中提取口一l。3一葡聚钳的研究表4．16酵母抽提物提取过程正交试验．方差分析表Tab．4—16Orthogonaltest-analysisofvarianceofy℃astextractextractionprocess由表4．15可以看出，A、B、C、D各因素对氨基氮含量和酵母抽提得率均有不同程度的影响，影响氨基氮含量的各因素的主次顺序为D>B>A>C，最优水平为AlB2C2D3；影响酵母抽提得率的各因素的主次顺序为D>B>C>A，最优水平为A,B2C2D2。从表2极差分析表中可看出酶添加量500U／g比400u蝌氨基氮含量和酵母抽提得率的提高并不明显，又从成本和经济的角度考虑，确定最佳工艺为AIB2C2D2，即乙醇浓度2．5％、自溶温度53"C、超声功率450W、酶添加量400U／g，通过进一步实验证实在此工艺条件下，与实际情况相符。利用方差分析进一步分析评价各因素影响指标的权重，由表4．16中方差分析可知超声功率对酵母抽提得率的影响不显著；自溶温度对酵母抽提得率的影响较显著；而酶添加量对氨基氮含量和酵母抽提得率的影响都显著；因此我们选取酶添加量作为一个因素进行响应面分析。‘4．3．3制备13-1，3-葡聚糖最佳工艺条件优化4．3．3．1碱溶工序单因素实验结果4．3．3．1．1料液比对碱溶工序的影响取酵母酶解离心后残渣，蒸馏水洗涤两次，离心后分别按料液比1／3、1／4、1／5、1／6、l／7加入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度3％，搅拌均匀，在70"C下处理5 从-鲁酒精成熟I}酵母中提取口一1．3一葡聚糖的研究小时，离心按步骤4．2．4．3．2得到粗多糖，测定多糖得率和多糖纯度，结果如表4．17所示。表4．17碱溶料液比选择单因素实验结果．Tab．4·17Theresultofsinglefactorchosenbyalkalidissolutionsolid-liquidratio由表4—17可知，料液比较小时，用水量较少，粗多糖得率较高，但多糖纯度很低，这是因为酵母粗多糖上滞留有可能性杂质，用水量越少，滞留量越大，由此导致粗多糖纯度较低。料液比增大后，用水量较多，粗多糖得率降低，纯度提高。当料液比超过1／5后，多糖纯度基本不再增加，因此我们选择料液比1／5为最佳。4．3．3．1．2碱溶浓度对碱溶工序的影响．取酵母酶解离心后残渣，蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比1／5力n入蒸馏水制成悬浮液，分别加入氢氧化钠至碱溶浓度l％、2％、3％、4％、5％，搅拌均匀，在70。C下处理5小时，离心按步骤4．2．4．3．2得到粗多糖，测定多糖得率和多糖纯度，结果如表4．7所示。表4．18碱溶浓度选择单因素实验结果Tab．4-18Theresultofsinglefactorchosenbyalkalidissolutionconcentration由表4．18可知，碱溶浓度从l％增加至3％的范围之间，粗多糖得率不断降低，而粗多糖纯度显著提高，说明增加碱溶浓度可以有效的去除碱溶性的杂质；在碱溶浓度为3％时得到的多糖含量最高；随着碱溶浓度的再升高，粗多糖得率开始下降，纯度也略有下降，可能随着碱溶浓度的提高，在杂质和蛋白质不断被溶解的过程中多糖也被降解，而且碱溶浓度越大对多糖的破坏越厉害，多糖的损失也越大。因此为减少粗多糖的损失和兼顾多糖纯度，我们选择碱溶浓度3％为最佳，并选择碱溶浓度2．5％、‘3％、3．5％作为正●交试验的三个水平进一步分析它对制备p．1，3．葡聚糖过程的影响。4．3．3．1．3温度对碱溶工序的影响取酵母酶解离心后残渣，蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比1／5加入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度3％，搅拌均匀，分别在60℃、70℃、80"C、90℃、100"C下处理5小时，离心按步骤4．2．4．3．2得到粗多糖，测定多糖得率和多糖纯度一结果如表4．19 从橹蜜酒精成熟醪醇量中提取口一1．3一葡聚将的研究所示。表4．19碱溶温度选择单因素实验结果Tab．4-19Theresultofsinglefactorchosenbyalkalidissolutiontemperature由表4．19可知，碱溶温度从60℃增加至70"C的范围之间，粗多糖得率不断降低，而粗多糖纯度显著提高，说明碱溶温度升高可以有效的去除碱溶性的杂质；在温度为80℃时得到的多糖含量最高；随着温度的再升高，粗多糖得率开始下降，纯度也略有下降，因为杂质和蛋白质、核酸等在不断被溶解的过程中多糖也被降解，而且温度越高对多糖的破坏越厉害，多糖的损失也越大。因此我们选择碱溶温度80℃为最佳，并选择碱溶温度75"C、80。C、85。C作为正交试验的三个水平进一步分析它对制备13．1，3．葡聚糖过程的影响。4．3．3．1．4时间对碱溶工序的影响取酵母酶解离心后残渣，蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比1／SJJIl入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度3％，搅拌均匀，在80℃下分别处理2、3、4、5、6小时，离心按步骤4．2．4．3．2得到粗多糖，测定多糖得率和多糖纯度，结果如表4．20所示。表4．20碱溶时间选择单因素实验结果Tab．4-20Theresultofsinglefactorchosenbyalkalidissolutiontime由表4．20可知，随着碱溶时间的延长，粗多糖得率不断降低，纯度不断提高，但超过4小时后，粗多糖纯度增加趋势逐渐平缓，在6小时后甚至开始下降。说明蛋白质、核酸和其他杂质在不断被溶解的过程中多糖也被降解，而且时间越长，多糖的损失也越大。因此我们选择碱溶时间4小时为最佳。4．3．3．2次氯酸钠氧化工序单因素实验结果4．3．3．2．1碱液浓度对氧化工序的影响·取酵母残渣碱溶处理离心后沉淀物，蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比1／53n入蒸馏水制成悬浮液，分别加入氢氧化钠至碱溶浓度0．1％、0．3％、O．5％、0．7％、1．O％，然后 从糖蜜酒精成熟醪醇母中提取口一1．3一葡秉糖的习院添加次氯酸钠至有效氯浓度为0．6％，搅拌均匀，在40"12下处理6d,时，离心按步骤4．2．4．3．3得到粗多糖产品，测定多糖得率和多糖纯度，结果如表4-21所示。．表4-21碱液浓度选择单因素实验结果Tab．4-2lTheresultofsinglefactorchosenbythealkalidissolutionconcentration由表4．21可知，随着碱液浓度的增加，多糖得率不断降低，而多糖纯度先升高后降低，在碱液浓度为0．3％时多糖纯度开始降低，可能是因为碱液中加入了次氯酸钠，增加了碱液对多糖的降解能力，随着碱溶浓度的提高，多糖的损失也越大。因此我们选择碱液浓度0．3％为最佳，并选择碱液浓度O．2％、O．3％、0．4％作为正交试验的三个水平进一步分析它对制备B．1，3．葡聚糖过程的影响：4．3．3．2．2有效氯浓度对氧化工序的影响取酵母残渣碱溶处理离心后沉淀物，蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比1／5力11入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度0．3％，然后分别添加次氯酸钠至有效氯浓度为O．4％、O．6％、O．8％、1．0％、1．2％，搅拌均匀，在40℃下处理6小时，离心按步骤4．2．4．3．3得到多糖产品，测定多糖得率和多糖纯度，结果如表4．22所示。表4-22有效氯浓度选择单因素实验结果Tab．4-22Theresultofsinglefactorchosenbytheconcentrationofavailablechlorine由表4-22可知，随着有效氯浓度的增加，多糖得率不断降低，而多糖纯度先升高后降低，+因为次氯酸钠的强氧化作用和B．1，3。葡聚糖的强抗氧化的特点，脂类大分子物质和共价结合的蛋白质等杂质在不断被溶解，在有效氯浓度为0．8％时多糖纯度开始降低，可能是因为有效氯浓度的增加，增强了碱液对多糖的降解能力，随着有效氯浓度的提高，多糖的损失也越大。因此我们选择有效氯浓度0．8％为最佳，并选择有效氯浓度0．6％、0．8％、1．0％作为正交试验的三个水平进一步分析它对制备B．1，3．葡聚糖过程的影响。4．3．3．2．3温度对氧化工序的影晌 从糖蜜酒精成熟醪醇母中提取口一1，3一葡聚糖的研究沉淀物经蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比1／5力n入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度0．3％，然后添加次氯酸钠至有效氯浓度为0．8％，搅拌均匀，分别在30℃、35"C、40’C、45。C、50"C下处理6d,时，离心按步骤4．2．4．3．3得到多糖产品，测定多糖得率和多糖纯度，结果如表4．23所示。表4．23氧化温度选择单因素实验结果Tab．4-23Theresultofsinglefactorchosenbyoxidationtemperature由表4．23可知，氧化温度从30℃增加至50"C的范围之间，多糖得率不断降低，而多糖纯度县增高后降低，在35℃的时候，多糖得率达最大值，超过35℃，多糖得率开始显著下降而纯度也缓慢下降，因此我们选择氧化温度35℃为最佳。4．3．3．2．4时间对氧化工序的影响取碱溶后沉淀物用蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比l／5加入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度0．3％，然后添加次氯酸钠至有效氯浓度为0．8％，搅拌均匀，在40℃下分别处理2、4、6、8、lOd,时，离心按步骤4．2．4．3．3得到多糖产品，测定多糖得率和多糖纯度，结果如表4．24所示。表4-24氧化时间选择单因素实验结果Tab．4—24Theresultofsinglefactorchosenbyoxidationtime由表4．24可知，随着氧化时间的延长，多糖得率不断降低，纯度先提高后降低，但超过6d,时后，多糖纯度增加趋势逐渐平缓，甚至开始下降。说明多糖也被降解，因此我们选择氧化时间6小时为最佳。●综上所述，通过碱溶．氧化法的各工序单因素实验，我们初步确定此法最佳工艺条件为：取酵母酶解离心后残渣，蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比1／5力n入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度3％，搅拌均匀，在80℃下处理4小时；离心后沉淀物，蒸馏水洗涤两次，离心粗多糖按料液比1／5力11入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度0．3％，添加次氯酸钠至有效氯浓度为0．8％，搅拌均匀，在35。C下处理6小时；沉淀 从糟蜜酒精成熟I琳母中提取口一1，3一葡聚糟的研究用蒸馏水充分洗涤，于沸水浴中加热处理后离心沉淀分离，弃水液，再用无水乙醇对其洗涤多次，离心沉淀分离，弃溶剂，最后再用无水乙醚洗涤沉淀，并离心沉淀分离，于沸水浴中挥发残余无水乙醚，再置于37"C下真空烘干得到p．1，3．葡聚糖产品。4．3．3．3碱溶．次氯酸钠氧化法工艺条件优化通过正交实验，确定了碱溶．次氯酸钠氧化法提取p．1，3．葡聚糖的最佳工艺条件。正交实验结果见表4．25，方差分析结果见表4．26。表4-25p-s，3一葡聚糖提取过程正交实验结果Tab．4—25TheOrthogonaltestresulto邛-l，3-glucanextractionprocess表4-26}l，3-葡聚糖提取过程正交试验-方差分析表Tab．4-26Orthogonaltest-analysisofvarianceofpl；3-g[UCS,11extractionprocess由表4．25可以看出，A、B、C、D各因素对多糖纯度均有不同程度的影响，影响氨基氮含量的各因素的主次顺序为D>B>A>C，综合正交实验的极差分析和方差分析，优选出最佳工艺条件为A282C2D2，即碱溶浓度3％、碱溶温度80"0、氧化碱液浓度0．3％、有效氯浓度0．8％，通过进一步实验证实在此工艺条件下，提取得成品得率15．22％，多糖纯度75．31％。，55 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡聚糖的研究利用方差分析进一步评价各因素影响指标的权重，由表4。26中方差分析显示碱溶浓度和碱溶温度对多糖纯度的影响都是显著的。因此我们选取这两个因素和前边的酶添加量三个因素进行响应面分析，希望能在不降低酵母抽提得率的基础上提高13．1，3-葡聚糖的纯度。4．3．4响应面分析优化工艺条件提高B．1，3．葡聚糖的纯度4．3．4．IBox—Behnken实验设计方案及结果根据Box--Behnken中心组合设计原理，以A酶添加量、B碱溶温度、C碱溶浓度为自变量，多糖纯度为响应值，设计了三因素三水平共15个实验点的响应面分析限SA)试验，为使拟合方程具有旋转性和通用性，中心点重复3次，用以估计实验误差。试验设计方案及响应值结果见表4．27。表4-27Box-Behnken设计方案及结果Tab．4-27Box-Behnkendesignschemeandresults实验号ABC多糖纯度(％)4．3．4．2响应面分析回归方程根据表4-27的试验数据，采用Design-Expert7．1．3软件程序进行响应面分析，回归分析结果见表4．28。56 从蕾蜜蕾精成熟醪醇母中提取口一1．3—莆曩糖的研究表4-28回归分析结果．+Tab．4-28Theresultofregressionanalysis对响应值与各因素进行回归拟合后，可得出酶添加量A、碱溶温度B、碱溶浓度C三个因素与多糖纯度(Y)之间的回归方程为：．Y=一1174．3175+0．1755xA+27．3212xB+59．3075xC．6．75x104xAB-4．5x10"axAc．0．253xBC’．1．1267x104×A2．0．1606×B2．5．6467．×C2回归方程中各自变量对指标(响应值)影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。从表4．27可知，A，B，C，B2为显著性影响因素，回归方程也是显著的。在各影响因素中，碱溶温度对多糖纯度的影响最大，其次是酶添加量和碱溶浓度。在总的作用因素中，一次项和平方项的影响较大，而交互项的影响不显著。回归方程的相关系数R2=189．0767／196．0036=96．47％，表明此模型能解释响应值(多糖纯度)的变化有96．47％来源于所选自变量，回归方程拟合程度良好，可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。回归方程二次项系数为负数，说明其表征的抛物面开口向下，方程有极大值，回归●‘方程分别对A、B、C求一阶偏导，整理得如下三元一次方程组：0．1755．6．75x104×B．4．5x10-axc．2x1．1267×10"4xA=0(1)27．3212—6．75x104×A．0．253xC-2×0．1606xB=0(2)59．3075-4．5x10‘3×A．0．253×B．2x5．6467xC=0(3)(1)、(2)、(3)式联立方程组，利用MATLAB软件解逆矩阵，解得：57 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1。3一葡聚糖的研究A=469．8037．B_-81．5372C--3．2377响应面法提高p．1，3-葡聚糖纯度的最佳工艺条件为：酶添加量469．8037U／g，碱溶温度81．53721℃，碱溶浓度3．2377％，由回归方程预测在此条件下D．1，3．葡聚糖纯度达76．76％。4．3．4．3响应面直观分析图为更直观的表现三个因素同时对p．1，3．葡聚糖纯度的影响，可以令其中一个因素水平值为零，仅考虑另外两个因素对p一1，3-葡聚糖纯度的影响，利用DesignExpert7．1．3软件对表4．27数据进行回归拟合，得到二次回归方程的响应面及其等高线见图4．4至图4．6。警’墓，{；。：曩{．吾or注：alkalidissolutiontemperatureB=80"C图44多糖纯度与碱溶浓度和酶添加量的关系Fig．4-4Effectofalkalidissolutionc彻cen似ionandadditionofenzymewithpolysaeeharidepurity 从籍蜜酒精成熟醪醇母中提取口一1．3一葡鬃糖的研究注：alkalidissolutionconcentrationC--3％图4-5多糖纯度与碱溶温度和酶添加量的关系Fig．4-5Effectofalkalidissolutiontemperatureandadditionofenzymewithpolysaccharidepurity注：additionofenzymeA=400U／g图4-6多糖纯度与碱溶浓度和碱溶温度关系．Fig．4-6Effectofalkalidissolutionconcentrationandtemperaturewithpolysaccharidepurity图4-4至图4．6可直观地反映了各因素对响应值的影响，比较三组图可知，响应面开口都是向下，随着每个因素的增大，响应值都是增大，当响应值增大到极值后，随着因．甜警口臀基。瑚看营营协晷4一建警耋{鼍嚼等_龠鳓馁 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡聚糖的研究素的增大，响应值逐渐减小。这说明该模型有稳定点，且稳定点是最大值。碱溶温度对多糖纯度的影响最为显著表现为曲线最为陡峭；而酶添加量和碱溶浓度次之，表现为曲线较平滑，且随其数值的增加或减小，响应值变化较小。4．3．4．4验证性实验为检验响应面分析系统的可靠性，证实预测值和真实值之间的拟合程度，采用上述最优工艺条件进行多糖的提取试验，考虑到实际操作的便利，将最佳条件修正为酶添加量470U／g，碱溶温度81．5℃，碱溶浓度3．2％，重复3次实际测得多糖得率平均值15．02％，p．1，3．葡聚糖纯度平均值为76．21％，与理论预测值相比相对误差在1％内，预测值和实验值之间有较好的拟合性，说明中心组合设计和响应面分析法在D．1，3．葡聚糖提取优化方面的应用具有实际指导作用。●4．3．5产品成分检测与比较分别以酒精酵母、啤酒酵母、活性干酵母为原料，按照上述确定的最佳工艺条件进行试验，分别对所得到的产品进行常规成分检测并进行比较，其结果如表4．29所示。表4-29最佳工艺比较三种原料制备pl，3-葡聚糖的效果Tab．4-29ComparisonofdifferentB-l，3-glueanmadebythreerawmaterialinthebesteratt从表4．29得数据可知，三种原料经过本研究的最佳工艺，都实现了p．1，3．葡聚糖与酵母抽提物的联产，说明本研究的最佳工艺条件也适用于以啤酒酵母和活性干酵母，尤其是以活性干酵母为原料是可实现酵母抽提得率71．12％，多糖得率13．23％，p．1，3．葡聚糖纯度84．36％。从灰分含量看，以酒精酵母为原料的多糖产品，灰分含量达8．09％，明显高于以啤酒酵母和活性干酵母为原料的多糖产品，这是由于很难从成熟醪回收酒精酵母工序将硫酸钙等无机盐彻底洗脱的缘故，导致酒精酵母原料本身灰分含量就比较高。所以如何将多糖产品中的灰分有效去除还有待进一步的研究。但从D．1，3．葡聚糖总量看，我们可以明显看到酒精酵母中D．1，3．葡聚糖的总量高于啤酒酵母和活性干酵母，证明了酒精酵母提取p．1，3．葡聚糖开发潜力。 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡聚糖的研竞4．4本章小节(1)本章以糖蜜酒精醪液废酵母为原料，利用自溶。超声波．酶解结合碱溶．氧化法优化p．1，3．葡聚糖的制备工艺，实现B．1，3．葡聚糖与酵母抽提物的联产。利用单因素实验、正交实验和响应面分析确定提取的最佳工艺条件为：酒精酵母首先按料液比1／5力I入蒸馏水制成悬浮液，在乙醇添加浓度3％、自溶温度53"(3、自溶起始pH6条件下自溶24tJ,时；离心后沉淀物按料液比1／SJJl：l入蒸馏水制成悬浮液，混匀后在超声功率450W，占空比5／5条件下，超声80次破壁；然后添211470U／g的碱性蛋白酶，调节起始pH8．0，在温度55。(3下酶解lOzJ,时，灭酶，离心分离，上清液与前边的自溶上清液一起浓缩而得到酵母抽提物；取酵母酶解离心后残渣，蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比1／5力I入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度3．2％，搅拌均匀，在81．5℃下处理4小时；离心后沉淀物，蒸馏水洗涤两次，离心粗多糖按料液比1／5力I入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶●浓度0．3％，添加次氯酸钠至有效氯浓度为0．8％，搅拌均匀，在35℃下处理6小时；沉淀用蒸馏水充分洗涤，于沸水浴中加热处理后离心沉淀分离，弃水液，再用无水乙醇对其洗涤多次，离心沉淀分离，弃溶剂，最后再用无水乙醚洗涤沉淀，并离心沉淀分离，于沸水浴中挥发残余无水乙醚，再置于37"(3下真空烘干得到p．1，3．葡聚糖产品。(2)在最佳工艺条件下，酵母抽提物得率达69．92％，多糖得率达15．02％，肛l，3．葡聚糖含量76．21％、蛋白质含量1．52％。此法充分利用酒精废酵母资源，大大降低酒精废液的BOD量，减少对环境造成的污染，且可实现酵母抽提物与p．1，3．葡聚糖的联产，是一种理想的酵母p．1，3．葡聚糖的制备方法。(31在最佳工艺条件下，以啤酒酵母、活性干酵母为原料进行提取实验，通过比较产品的组分得知：本研究的最佳工艺条件也适用于以啤酒酵母和活性干酵母，尤其适用于活性干酵母；以酒精酵母为原料的多糖产品中灰分含量较高，如何将灰分有效去除还有待进一步的研究；酒精酵母中p．1，3．葡聚糖的总量高于啤酒酵母和活性干酵母，证明了酒精酵母提取p．1，3．葡聚糖开发潜力。6l 从糖警酒精成熟醪醇母中摄取口一l，3一葡聚糖的研究第五章酵母多糖产品分析鉴定5．1材料与方法5．1．1试剂标准13-1，3一葡聚糖SigmaCo．U．S．A甘露糖AR上海化学试剂总站分装盐酸AR上海达菲供贸有限公司；’乙酸AR上海达菲供贸有限公司丙酮AR上海达菲工贸有限公司；苯酚AR上海试剂四厂茚三酮AR上海化学试剂站分装厂；苯胺AR远航化工厂高碘酸钠上海化学试剂采购供应站；碘AR上海试剂八厂碘化钾AR上海化学试剂采购供应站；．乙二醇AR上海试剂总厂第三分厂邻苯二甲酸AR上海试剂一厂：正丁酵上海试剂五厂碳酸钡AR上海化学试剂采购供应站；硫代硫酸钠AR上海硫酸厂二甲基亚砜(DMSO)中国医药(集团)上海化学试剂公司5．1．2仪器电子天平，AL204型，梅特勒一托利多仪器(上海)公司冰箱，KG21V41TI型，西门子中国博西家电销售有限公司磁力加热搅拌器，78．1型，北京精之杰实验仪器有限公司箱式电阻炉(马福炉)，SX2410，上海跃进医疗器械厂酸度计，Delta320型，梅特勒．托利多上海有限公司双列八孔恒温水浴锅，HI-I型，南汇电讯器材厂721型分光光度计：上海第三分析仪器厂．·紫外可见光谱仪，Uv160型，Shimadzu,Japan红外光谱仪，NicoletFT-IR,U．S．A层析缸、喷雾器、研钵、玻璃板等。 从糟蜜酒精成．酸I}酵母中提取口一1．3—葡曩糟的研究5．1．3实验方法5．1．3．1理化性质分析(1)溶解性的测定取多糖粉末适量，分别置于多个烧杯中，分别加入丙酮、二甲基亚砜、三氯甲烷、硫酸、浓盐酸和3％氢氧化钠，在室温和加热条件下观察其溶解性，并记录结果。(2)感官特性观察观察酵母多糖的颜色和气味，并尝试口感。(3)颜色反应【80l多糖定性：苯酚．硫酸反应；蛋白定性：茚三酮反应；还原糖定性：费林试剂检测；糖原定性：碘液进行颜色反应；‘5．1．3．2初步纯度鉴定将多糖产品配成DMSO溶液，采用UVl60A型紫外可见光谱仪在200nm"--400nm范围内进行扫描分析，观察在260hm、280hm处是否有吸收峰出现。’5．1．3．3单糖组分分析称取多糖样品lOmg，先用5mLlOmol／L的硫酸水解5mtn钟后，加水将硫酸浓度稀释至2mol／L，封管后置于100℃烘箱中水解6h，使水解完全，水解产物用碳酸钡中和，过滤，将滤液浓缩至适当浓度，水解产物与标准葡萄糖、甘露糖对照进行纸层析。展开剂为正丁醇：无水乙酸：水=4：l：sly／v)，以苯胺一邻苯二甲酸为显色剂。裁制33×10cm新华一号滤纸，在一端3cm处用铅笔划一直线，在线上标明点样位置；点样分多次进行，每次用冷风机吹干；将点好样的纸置放有展层剂的容器中，点样点不接触溶剂，高于展层剂液面饱和4．5小时，层析完毕后取出滤纸，吹干溶剂；喷洒显色剂显色，置105℃烘箱内烘20分钟。5．1．3．4分子结构分析5．1．3．4．1红外扫描(1)实验原理【48】红外光谱主要指中红外区，波数范围在400．4000cma，它反映的是分子内原子间的化学键伸缩或弯曲振动的能级跃迁。这种能级的跃迁，正反映了有机分子中化学键的特 从籽蜜酒精成熟醪醇母中提取口一I。3一葡聚糖的研究性，即分子中的官能团的表现形式。所以，红外光谱技术常用来检测有机分子中的官能团结构。在红外光谱中，各类不同结构的有机化合物的特征吸收峰可以大致分为两个区域，即特征吸收光谱带区和指纹区。红外吸收波数在4000．1500cm"1之间的特征吸收谱带区(也称为官能团区)主要分布的是伸缩振动产生的吸收峰。由于折合质量小的化学键振动吸收率高，所以和氢原子结合使折合质量小的基团，如．OH，-Ⅻ2等都会在这一区域的高波段区出现吸收峰。结构中常数大的三键(C-C，C三蚤D或双键(C=C，C=N，C=O)的吸收峰在这～区域的低波数出现。红外吸收波数在1500．400cmq区域称为指纹区。在这个区域内既有常见的伸缩振动，弯曲振动吸收，也有整个分子的振动等吸收峰，所以也可以认为它反映了整个分子的特征。即使两个相近的化合物在这个区域的吸收峰也有差别，如同两个人的指纹不可能完全相同～样，因此一般把该区域称为“指纹区”。表5．1是文献资料中有关p二1，3．葡聚糖红外扫描特征吸收峰。表5一Ip-1，3-葡聚糖具有的特征吸收峰Table5-IThecharacteristicabsorptionofp-1，3-Glucan(2)实验步骤取微量多糖样品和标准p．1，3．葡聚糖，分别按1：6左右的比例与KBr研磨压片，用NicoletFT-IR红外光谱仪进行测定，以KBr为参照物。5．1．3．4．2高碘酸氧化法(1)实验原理【481‘高碘酸可以选择性地氧化断裂分子中连=羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛、甲酸。反应定量地进行，每开裂一个C．C键，消耗一分子高碘酸钠，通过测定高碘酸钠的消耗量及甲酸的生成量，可以判断糖苷建的位置、．直链多糖的聚合度、枝链多糖的分枝数目。以葡聚糖为例，以1．2或14位键合的糖基，经高碘酸氧化，平均每个糖基仅消耗一分子高碘酸，并无甲酸产生；以1．3位键合的糖基不被高碘酸氧化；以1·6位 从糟蜜酒精成熟终醇母中攫取口一1．3—葡粟糖的研究键合的糖基或非还原端，经高碘酸氧化，消耗两分子的高碘酸钠，同时释放一分子甲酸。用碱滴定法计算生成甲酸的量，剩余的高碘酸钠以及反应生成的碘酸钠在强酸溶液中与碘化钾作用析出碘，用碘量法滴定碘的生成量，计算出每个葡萄糖残基消耗高碘酸的量及产生甲酸的量，可推知多糖键的构型。高碘酸钠氧化酵母葡聚糖生成碘酸钠Nal04+7KI+7HCl-÷412H【Cl钾妇Cl“{20Nal03+5Ⅺ+5HCl_3h+KCI+NaCl+H2012+2Na2S203---*Na2S406+2NaI由上述化学反应方程式可知，一分子的Nal04比一分子的Nal03，多生成一分子的12，(一分子的12消耗二分子的Na2S203)，即多消耗二分子的Na2S203，根据Na2S203的消耗量可求出Nal04的消耗量，按以下公式计算出每个葡萄糖残基消耗的Nal04的分子数。消耗Nal04的量=帆属-V样品)／2XNal04的当量浓度生成甲酸的量=V样品XNaOH的当量浓度葡萄糖残基的摩尔数=碱不溶葡聚糖样品重／172(2)实验步骤‘精确称取40rag的酵母多糖样品，加入0．05mol／L的高碘酸钠溶液50mL，置暗她O℃下氧化，6天氧化完全，用2mL乙二醇终止反应，取10mL反应液放入碘量瓶，加入6N的HCI5mL，再加10％的Ⅺ溶液5mL，加10ML蒸馏水，用0．1N的Na2S203滴定，颜色由红棕色变成淡黄色，加2％淀粉指示剂，继续滴定至无色为终点，计算高碘酸钠的消耗量；取反应液10mL，加一滴溴甲酚蓝作指示剂，用0．01N的氢氧化钠溶液滴定，计算甲酸的生成量。5．2结果与讨论5．2．1理化性质分析5．2．1．1表观特性本实验所得多糖产品色泽为乳白色，无味无臭。5．2．1．2溶解性溶解性观察结果表明，本试验所得多糖产品不溶于水、’无水乙醇、无水乙醚、丙酮和三氯甲烷等有机溶剂，也不溶于硫酸和碱液中，但能在二甲基亚砜中形成稳定的悬浮65 从橹蜜酒精成熟醪酵母中提取卢一1。3一葡聚糖的研究液，且溶于浓盐酸。5．2．1．3颜色反应(1)苯酚．硫酸反应阳性，表明制品为多糖类碳水化合物。(2)茚三酮反应呈阴性，说明产品中不含肽键。(3)费林试剂检测呈阴性，表明不含还原糖。(4)碘反应呈阴性，表明制品中不含糖原。5．2．2初步纯度测定取多糖产品作紫外光谱分析，其中溶剂为二甲亚砜，以二甲亚砜为参比。扫描结果如图9所示：样品在210rim附近有强吸收峰，在260rim、280nm处均无吸收峰出现，说明本实验方案制备的多糖产品不含蛋白质、核酸类成分。5．2．3单糖组分分析图5．I多糖样品紫外扫描图Fig．5-1UVSpectrumoftheProduct纸层析的结果如图5．2所示，多糖产品降解产物只有一个斑点，其迁移率为Rf=-0．35，而对照组葡萄糖Rf=0．36，甘露糖Rf=o．58，多糖降解产物的斑点对应葡萄糖的层析斑点，说明多糖样品降解产物为葡萄糖，不含甘露糖。证明了酵母泥通过自溶、超声波处理、酶解和碱溶．氧化相结合的方法提取碱不溶性葡聚糖，’能较彻底的将所含的甘露聚．糖去除。●嗣O●爨口～肌～ 广西大爿晴炙士学位论文从糟蜜洱靖成熟I}酵母中提取口一1．3一钳聚糖的研宠A：glucoseB：glucanC：mannose图5．2多糖样品完全降解纸层析示意图Fig．5-2Sketchmapofpolysaccharide髭mplecompletenessdegradationpaper5．2．4分子结构分析5．2．4．1红外光谱分析．用NicolctFT-IR红外光谱仪对标准p-1，3一葡聚糖和多糖样品进行扫描，红外光谱图见图5．3和图5-4。图5-3标准p_l，3-葡聚糖红外光谱图．Fig．5-3IRSpectrumofthestandardpl，3二glucan町刀印∞帕∞加∞3u∞拦E∞c巴．L零 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡聚疆的研究8C量辱C罡卜寥W狮numbers(cm-1)图5-4多糖样品红外光谱图Fig．5-4IRSpectrumofthe酉uoansample由图5．3和图5-4可知，多糖样品与标准D．1，3．葡聚糖的红外谱图基本相同，通过比较看出，在3415cm"1处均出现一宽而强的吸收峰，这是糖类分子内或分子间O-H氢键的伸缩振动，为缔合态的O．H键；在2921eml均出现相同吸收峰，是C．H伸缩振动；1639cm"l处的吸收峰是．CHO的C=O造成的；在1413、1408、1374、1255、1203cm。1处出现的不太尖的吸收峰是C．H的变角振动；1157em"1以及1077emd的吸收峰属于C．O．C和C．O．H的振动引起，说明制备的多糖样品有C．O．H和C．O．C官能团特征；889cm。1和890cm"1的吸收峰是p．端基．D．吡喃糖差向异构C-H变角振动的特征吸收峰，表明该组分含有13-D．吡喃葡萄糖环分子且以p．糖苷键连接，从图可看出多糖样品在890cm"1处有明显的p．糖苷键吸收峰，可证明其糖苷键为p构型，而在810cml和870cm"I，处均无吸收峰，表明无甘露糖苷的存在；在2921eml1374cmd处的特征吸收峰表明多糖样品为p．1，3．糖苷键所连接；1255cml有特征吸收峰说明p．1，3．葡聚糖的单糖之间靠C．O．C相连。多糖样品红外光谱图与标准p．1，3．葡聚糖红外光谱图相比，除相同的多处特征吸收峰外，还有1902cml，1832cra"1，1699cml等吸收峰，在1650cm附近的吸收峰是由于葡．聚糖中还有没除尽的蛋白质所引起一CO．的特征吸收峰，其他的可能是是由酵母多糖中没除尽的脂肪或几丁质所引起，但这些物质含量都很少。因此，可以认为所得产品是p．1，3一葡聚糖。无其它杂多糖的存在。‘5．2．4．2高碘酸氧化分析具有生物活性的p．1，3．葡聚糖分支度一般均在4％---,75％之间变化，相对而言分支度在20％～33％间的13．1，3．葡聚糖生物活性要更强。分支度大于75％或低于4％的13．1，3-葡聚糖其生物活性均呈不同程度的下降，甚至无生物活性。最适条件下制备得到的葡聚糖样品的高碘酸氧化结果见表5．2。6R 从籍蜜酒精成藏睁酵母中提取口一1．3—葡聚糖的研究表5-2多糖样品的高碘酸氧化结果Tab．5-2Theresultofpolyosespecimenoxidatedbyperiodato如图所示，平均每分子葡萄糖残基消耗0．4213分子的高碘酸钠，生成0．21分子的甲酸，高碘酸钠的消耗量与产物甲酸的生成量的比值约为2，可排除p．1，2．糖苷键存在的可能性。因此，可知葡聚糖样品中p．1，6．葡聚糖约为21％，3-1，3．葡聚糖含量约为79％，表明本试验制备的13．1，3．葡聚糖具有较高的生物活性。5．3本章小结本章对酵母多糖样品进行了理化性质分析、初步纯度鉴定、单糖组分分析和分子结麓k，构分析，研究结果表明：酵母多糖样品为乳白色，无味无臭，难溶于水及多种有机溶剂，但能在二甲基亚砜中形成稳定的悬浮液；产品由单一组分葡萄糖组成，不含还原糖、蛋白质、核酸和甘露聚糖；样品中p．1，6．葡聚糖含量约为21％，--l，3．葡聚糖含量约为79％，表明本试验制备的p．1，3．葡聚糖具有较高的生物活性。证明了酒精酵母通过自溶．超声波．酶解结合碱溶．氧化法提取碱不溶性葡聚糖，能较彻底的去除酵母中蛋白质、核酸?‘甘+露聚糖等杂质，是一种理想的酵母p．1，3．葡聚糖的制备方法。 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1。3一葡聚糖的研究第六章酒精酵母深加工经济效益分析21世纪是资源与环境的时代，合理利用资源，保护环境是国民经济持续发展的必然要求。在环境治理力度日趋加强的情况下，有必要进一步改善酒精生产工艺。本课题以综合利用为指导思想，回收醪液中的酒精酵母实现酒精和酵母高附加值产品的联产，不仅减少废水污染负荷，保护环境，减少排污治理费用，降低酒精成本，而且将酒精废酵母变废为宝，增加经济效益，为制糖行业产品结构调整和副产物综合利用提供新的有效途径。6．1新工艺对现有工艺的影响效应分析6．1．1正面效应(1)降低废液处理成本成熟醪经离心回收废酵母后，经蒸馏塔蒸酒排放的酒精废液SS下降了53．3％，COD下降了34％，BOD下降Y56．9％，废液回用率达20％，节省了废液治理成本，并减轻了蒸馏塔结垢，减少人工除垢成本。(2)产出高附加值产品·成熟醪回收酒精酵母得率1．5％，酒精酵母水分含量70％；以此酒精酵母为原料，制备酵母抽提物得率约为69．5％，酵母p．1，3．葡聚糖得率约为15％。(3)节约工业用水量新工艺酒精废液回用率达20％，酵母洗涤水量为30％，酵母洗涤废液回用率达50％，节约了酒精生产过程稀释糖蜜的用水量和加酸量。6．1．2负面效应(1)成熟醪酒度的损失成熟醪离心分离固形物后，必然造成酒度损失，在本工艺条件下酒度损失约3％，在酵母洗涤废液回用的过程中可以弥补部分酒度损失。(2)新废液的产生70 广西大掌硕士掌位论文从糖蜜曩精成熟醪醇母中提取口一1．3一葡粟糖的研究在酒精酵母化学洗涤，以及制备酵母抽提物和p．1，3．葡聚糖的过程中会产生新的废液，但大多为碱废液，可以回收。6．2经济效益分析6．2．1计算基准(1)以年产1万吨的糖蜜酒精厂为依据，每生产1吨酒精需要5吨糖蜜计，工艺用水量约10吨，经稀释后发酵得到约15吨酒精成熟醪。(2)水费：0．3元JM3；(3)废液处理成本：按常规采用焚烧消减COD的治理技术路线，35元／吨；(4)电费：0．5元／度；．(5)工人平均工资：1200Yrff月；(6)销售费用：以销售价的5％；∽税率：以销售价的8％；(8)销售价格：酒精按50007r／吨计；酵母抽提物按2万／吨计：酵母p．1，3．葡聚糖按50万／吨计；(9)设备折旧：设备投资费的5％；6．2．2增加年产值(1)酵母抽提物产值酵母抽提物产量：10000x15x1．5％x30％x69．5％=-470吨酵母抽提物产值：470×2=940万元(2)酵母p．1，3-葡聚糖产值酵母13．1，3-葡聚糖产量：10000×15x1．5％x30％×15％=101．25吨．酵母p．1，3．葡聚糖产值：101．25x50=5062．5万元(3)节约废水治理成本节约废水治理成本：10000xlOx20％xO．0035=70万元(4)节约生产用水成本节约生产用水成本：10000xlOx20％xO．3x10"4=0．6万元7I 从糖蜜酒精成熟醪醇母中提取口一I．3一葡聚疆的研究10000x15x30％xO．3x104=1．35万元综上计算，增加总产值：940--I--5062．5+70+O．6+1．35,≈6075万元6．2．3年总成本(1)酒精损失总成本酒精损失总成本：10000x3％xO．5=150万元(2)原辅料总成本假设原工艺将酒精废液离心回收非溶解性固形物蛋白质作饲料，按照非溶解性固形物蛋白质含量1％，蛋白质饲料价格2000元／吨，计算原料总成本如下：酒精酵母原料总成本：t0000x14x1％xO．2=280万元酵母化学洗涤和酵母高附加值产品生产过程需要的辅料包括：酒石酸、碳酸氢钠、自溶促进剂乙醇、碱性蛋白酶(按质量比计算添加量0．5％)、氢氧化钠、次氯酸钠等。自溶促进剂乙醇总成本：10000x15x1．5％x30％x3％xO．5=10．i25万元碱性蛋白酶总成本：10000x15x1．5％x30％xO．5％x20=67．5万元其他辅料估算总成本：50万元(3)能耗总成本能耗总成本估算为100万元(4)工资成本操作工人6人，按照每年工作5个月计算：工资总成本：O．12x5x6=3．6万元(5)设备折旧费用设备折旧费用：1000x5％=50万元．(6)新废液处理总成本新工艺废液大多为碱废液，可以回收，估计处理总费用为50万元．∽销售费用’销售费用：(940+5062．5)x5％=300．125万元(8)其他总费用其他费用包括产品检测消耗、突发事件等费用，估计总费用30万元综上计算，年总成本=1091．35万元 ．从糖蜜酒精成熟醪醇母中提取口一1．3—葡襄糟的研究6．2．4工程投资估算(1)主要设备投资估算新工艺需要添加的设备包括碟片离心机两台，DP500型离心机6台，大型可变恒温反应器两台，加热器多个，由于超声波破碎和乙醚脱水干燥不太适合工业化生产，我们改用中型均质机破碎酵母细胞，喷雾干燥设备进行干燥得到产品。设备总投资估算为1000万元。(2)工程投资估算安装费按设备购置费的10％，-I-具费按设备购置费的3％，工程投资估算见表6．1。表6．1工程投资估算表(单位：万元)Tab．6-lProjectinvestmentestimationtable6．2．5经济效益分析图新工艺经济效益分析见图6．1所示，工新工艺，年生产利润达4503．45万元，3323．45万元，经济效益非常可观。从分析图可知，施行成熟醪回收酒精酵母深加当年可回收工程投资成本1180万元，净利润达新增产值6075万．Il1年总成本1091-35万税金480．2万利润4503．45万图6．1经济效益分析图F毽。6·leconomicbenefitanalysischart 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1。3一葡聚精的研究6．3本章小结本章详细论述了新工艺对现有工艺影响效应，并根据初步试验数据，以年产1万吨的糖蜜酒精厂为依据进行了经济效益分析，证明了成熟醪回收酒精酵母深加工新技术是可行的，而且可以给制糖和酒精企业带来直接的经济效益，预计当年可回收工程投资成本，净利润达3323．45万元，经济效益非常可观。74 从糖蜜酒精成熟睁醇母中提取卢一1，3—葡聚糟的研究7．1结论第七章结论与展望(1)确定成熟醪离心的工艺条件以及酵母泥化学洗涤的工艺条件，并对酒精废酵母的成分进行检测和比较。成熟醪离心分离工艺条件为：洗涤水量30％，洗涤次数3，离心转数3000r／min，离心时间10rain。在此条件下酒精酵母得率达1．5％，成熟醪酒度损失3％。酵母泥化学洗涤方案为：先经过1．75％酒石酸洗涤30min，再用0．1％的碳酸氢钠洗涤。所得酒精酵母的总糖含量高于鲜酵母，针对酒精酵母糖含量高的特点可进行酵母胞壁多糖的提取。(2)通过对新1日两个工艺的酒精废液的成分比较，证明新工艺酒精废液SS下降了53．3％，COD下降了34％，BOD下降了56．9％，减轻了废液治理的难度。新工艺酒精废液的回用率可达20％，比1日工艺废液回用率提高了4倍，酵母洗涤废液①的回用率达70％。(3)以糖蜜酒精醪液废酵母为原料，利用自溶．超声波．酶解．碱溶氧化法优化p-1，3．葡聚糖的制备工艺，实现B．1，3．葡聚糖与酵母抽提物的联产。利用单因素实验、正交实验和响应面分析确定提取的最佳工艺条件为：酒精酵母首先按料液比1／5加入蒸馏水制成悬浮液，在乙醇添加浓度3％、自溶温度53℃、自溶起始pH6条件下自溶24小时；离心后沉淀物按料液比1／5加入蒸馏水制成悬浮液，混匀后在超声功率450W，占空比5／5条件下，超声80次破壁；然后添加470U／g的碱性蛋白酶，调节起始pH8．0，在温度55℃下酶解10小时，灭酶，离心分离，上清液与前边的自溶上清液一起浓缩而得到酵母抽提物；取酵母酶解离心后残渣，蒸馏水洗涤两次，离心后按料液比·1／5加入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度3．2％，搅拌均匀，在81．5℃下处理4小时；离心后沉淀物，蒸馏水洗涤两次，离心粗多糖按料液比1／5加入蒸馏水制成悬浮液，加入氢氧化钠至碱溶浓度0．3％，添加次氯酸钠至有效氯浓度为O．8％，搅拌均匀，在35℃下处理6小时；沉淀用蒸馏水充分洗涤，于沸水浴中加热处理后离心沉淀分离，弃水液，再用无水乙醇对其洗涤多次，离心沉淀分离，弃溶剂，最后再用无水乙醚洗涤沉淀，并75 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1。3一葡聚糖的研究离心沉淀分离，于沸水浴中挥发残余无水乙醚，再置于37℃下真空烘干得到p．1，3．葡聚糖产品。在最佳工艺条件下，酵母抽提物得率达69．92％，多糖得率达15．02％，B．1，3．葡聚糖含量76．21％、蛋白质含量1．52％。此法充分利用酒精废酵母资源，大大降低酒精废液的BOD量，减少对环境造成的污染，且可实现酵母抽提物与p．1，3．葡聚糖的联产，是一种理想的酵母p?l，3．葡聚糖的制备方法。(4)以啤酒酵母、活性干酵母为原料进行提取实验，通过比较产品的组分得知：本研究的最佳工艺条件也适用于以啤酒酵母和活性干酵母；以酒精酵母为原料的多糖产品中灰分含量较高，如何将灰分有效去除还有待进一步的研究；酒精酵母中p．1，3，葡聚糖的总量高于啤酒酵母和活性干酵母，证明了酒精酵母提取p．1，3．葡聚糖开发潜力。(5)酵母多糖样品难溶于水及多种有机溶剂，但能在二甲基亚砜中形成稳定的悬浮液；产品由单一组分葡萄糖组成；样品中p．1，6．葡聚糖含量约为21％，表明本试验制备的B一1，3-葡聚糖具有较高的生物活性。证明了酒精酵母通过自溶．超声波．酶解．碱溶氧化法提取碱不溶性葡聚糖，能较彻底的去除酵母中蛋白质、核酸、甘露聚糖等杂质。7．2创新点(1)从成熟醪离心分离出酒精酵母，实现酒精和酵母的联产，不仅产生了一种新的高附加值产品原料，而且减轻了蒸馏塔结垢程度，同时酒精废液COD，BOD大大降低，进而减轻了糖蜜酒精废液治理的难度，为废液的全回用提供可能性。(2)以酒精酵母为原料，提出自溶．超声波．酶解．碱溶氧化法提取p．1，3．葡聚糖，充分利用酵母资源，实现酵母抽提物和IB-1，3．葡聚糖的联产。不仅推进糖厂酒精车间的综合利用，带来一定的经济效益和社会效益，也为甘蔗糖蜜酒精酵母的开发提供参考。(3)应用响应面分析法优化提取工艺，得出了酶添加量、碱溶温度和碱溶浓度三个因素与多糖纯度之间的回归方程，确定了最佳提取工艺条件。7．3展望由于研究时间有限，本课题尚存在不足，以及大量工作有待深入研究。建议今后进一步开展以下工作：76 从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一l，3一葡聚糖的研究(1)迸一步研究酒精酵母化学洗涤方法，降低原料的灰分，提高酵母p．1，3．葡聚糖的质量。(2)研究快速测定水不溶性多糖含量测定方法。(3)酵母p—l，3一葡聚糖水溶性差，限制了其在医药保健上的广泛应用。对p．1，3．葡聚糖进行改性试验，使之具有水溶性而又不失活性，以更加适应于人类吸收系统的吸收，并进一步研究酵母13．1，3．葡聚糖免疫活性，以扩大其在医药保健上的广泛应用。 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从糖蜜酒精成熟醪酵母中提取口一1．3一葡聚糖的研究致谢时光飞逝，很快就要告别生活了三年的广西大学，告别曾经关怀和鼓励过我的朋友和老师，心中充满了依依不舍。感谢西大，感谢她的自由，这使我能够轻松而快乐地成长；感谢朋友和老师，感谢她们的博大精深，这使我可以充实而自信地生活。我将永远记住在广西大学这美好的三年时光!师恩永难忘。在这里特别感谢我的导师刘慧霞教授。三年来她教会了我许多，从做研究到做人做事。恩师渊博的知识、敏锐的思维、风趣幽默的谈吐、坚毅豁达的处世原则、民主而严谨的治学态度使我终生受益，激励着我在今后的人生道路上勇敢地面对人生挑战、实实在在做人、踏踏实实做事。本文的研究从选题、写作、修改直至全部完成，凝结了导师很多心血，尤其是在论文内容及结构方面等提出的许多宝贵意见，临毕业之际，谨向导师致以最诚挚的谢意，祝愿恩师身体健康、工作顺利、家庭幸福!三年的实验过程中，还得到了许多老师的指导和帮助。感谢黄悦刚教授、卢家炯教授、林莹老师、李坚斌老师、周文红老师对论文提出的许多宝贵建议，并在实验过程中给予很多指导和帮助；感谢实验室刘曼萍、宋延珍、李红、詹磊等老师提供了良好的实验场所和试验器材。感谢张晋博、姚晓麦、崔师泰、樊婧、曹绍俊等在实验过程中给予的大力帮助和指点；感谢师兄刘继栋、师姐岳君荣、赵春玲、吴飒丽、甘亮，感谢师弟庞芝剑、李振华，师妹何思莲等在学业及生活中给予的支持。感谢同窗左俊、李洪文、冯斌超、付全意、梁剑锋、曾文谨、王利军、黄涛、王嵬、武金良、秦菊霞等同学在学习和生活上给予的帮助和协作。是他们陪伴我度过了三年愉快的时光，使我意识到团队精神的可贵。特别感谢我远在他乡的父母和女朋友左昕，她们的关心，鼓励和支持时刻陪伴着我，正是她们那份无私的爱使我坚持到今天，使我有信心和毅力顺利完成学业。最后，感谢评阅、评审论文和出席论文答辩会的各位专家在百忙中给予的精心指导。魏涛2008年6月 广叠n～掌硕士掌位论文从糖蜜酒精成募醪酵母中提取口一1．3—葡曩糖的研究攻读学位期间发表的学术论文及参与的科研项目【1】魏涛，刘慧霞，黄嵩，等．二压汁稀释糖蜜生产酒精的新工艺探索[J】．甘蔗糖业，2007，(1)：30·33．’【2】TAOWEI，刖I-XIALIU，SONGHUANG．TILIZATION．OFSECONGDPI冱SSEDJ1L珏cEFOREⅡ{ANOLPRoDUCTIoN．IS．2∞6，F24：696—699．【3】JI-DONGLIU，}IUI-XIALIU，TAOWEI．INSTALLMENT-BATCHTECHNIQUEFORHIGHCONCE】NTRATIONALCOHOLFERM匝NTf蛆’IONINSUGARCANEMOLASSES．IS-2006，F87：738-740．【4】魏涛，刘慧霞，樊婧．糖蜜酒精成熟醪回收酵母产品的可行性研究(投稿中)[5】周文红，魏涛，刘慧霞．糖蜜酒精成熟醪回收酵母产品新工艺的探索(投稿中)【6】6魏涛，刘慧霞，曹绍俊．糖蜜酒精醪液废酵母中提取肛l，3．葡聚糖的研究(投稿中)【7】TAOWEI，HUI-XIALIU，JⅨGFAN．AFEASIBILITYSTUDYREPOI汀ONn也RECOVERY0FYEASTPRODUCTFROMMAn瓜EFE刚ⅥENTEDMOLASSESMASH．(已投稿IS．2008国际糖业会议论文)【8】TAOWEI，HUI-XIALIU，SHAO—JUNCAO．OPTIMAZATIONOFp-1，3一GLUCANEXTRACTIONCONDITIONSWITHRESPONSESURFACEANALYSIS．(已投稿IS-2008国际糖业会议论文)【9l糖蜜酒精酵母高附加值产品研究开发_2007年广西研究生教育创新计划项目(No．2007105930822M64)