从糖蜜酒废水中提取抗氧化和清除自由基的活性颜料.doc 8页

从糖蜜酒精废水中提取抗氧化和清除自由基的活性颜料摘要用大孔树脂吸附法从糖蜜酒精废液提取色素。并且对颜料的抗氧化和清除自由基的活性进行了研究。大孔树脂吸附的五个特性，包括HPD-600,HPD-500,D301-R,NKA-IIandD296-R进行了研究表明HPD-600是最适当从糖蜜酒精废液中提取的色素。用硝酸，羟基自由基，超氧阴离子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）在外部环境进行模型系统，从而对从酒精废液中提取的色素的抗氧化和清除自由基的活性进行评估。色素提取物浓度依赖于自由基所在系统的清除活性。同时，DPPH体系中色素的提取物的活性被发现(P<0.05)高于其他系统，其50％抑制浓度（IC50值）为0.07毫克/毫升。色素提取物的IC50值大于10毫克/毫升时清除超氧阴离子自由基的作用是非常微弱。关键词：糖蜜酒精废水;颜料;自由基，抗氧化活性1前言糖蜜是发酵工业最重要的原料之一在于于其低廉的成本和广泛可用性。甘蔗糖厂的糖蜜是一个丰富的资源，因为它是生产酒精的发酵过程的主要原材料。甘蔗糖蜜含有2％深褐色的色素名为黑精，影响酒精废水的颜色。黑精是Maillard反应的最终产品之一是由低和高的分子量聚合物组成，这是一个非酶褐变反应之间的反应产生的还原糖和氨基化合物。同时，从上述产业的糖蜜酒精废水中除了其他着色剂，如酚，饴糖和黑色素仍含有类黑精色素。甘蔗糖蜜废水中含有丰富的酚类化合物。甘蔗糖蜜酒精生产可能会导致大量废水，引起严重的环境关注。其废水特点具有极其高化学需氧量（COD），生化需氧量（BOD）和深褐色。运用活性污泥系统，曝气法和厌氧池的正常的生物处理很难使这些颜料脱色。对各种物化方法进行了探讨，如活性炭吸附，膜处理和氧化处理，但成本高，使得这些方法很难被采用。因此，找到一种去除这种色素的方法是很重要的。根据许多研究报告说，甘蔗提取物具有良好的抗氧化活性。虽然据报道，黑精和酚类化合物具有强的抗氧化剂，但从糖蜜酒精废液色素的抗氧化活性来说这一点信息基本是不可用的。因此，本研究的目的是从糖蜜酒精废液色素的提取和纯化，并评估其抗氧化和自由基的活性。2材料的和方法2.1颜料浓缩浆的制备糖蜜酒精废水是从以甘蔗糖蜜为原材料的金广糖甘蔗厂(中国广西）采集的。然后过程是进行离心预处理（8000克10分钟）以去除不溶性物质。颜料通过膜过滤进一步得到浓缩浆分子量达30000。2.2大孔树脂对色素的吸附大孔树脂HPD-600，HPD-500，D301-R，NKA-IIandD296-R被用来作为吸附剂。其物理性能列于表1。大孔树脂及丰富的蒸馏水用来除去盐和杂质。吸附实验前，吸附剂用乙醇洗涤，然后用蒸馏水取代乙醇进行最后的洗涤。 大孔树脂从糖蜜酒精废液色素的吸附试验进行如下：颜料浓缩浆用蒸馏水稀释20倍与碱液混合，分别在250毫升锥形瓶中加入五个不同的大孔树脂（2.0克），盖上盖子。再加入稀释色素溶液（100毫升）。然后瓶被放置在太赫兹-82A型号摇床摇匀了（130转），2小时后在25°C下用紫外/可见分光光度计在560nm的波长使用蒸馏水作为空白测定溶液的吸光度。根据下面计算吸附率的公式：（2—1）其中Ar是测试样品（％）的吸附率，A0是色素吸附前溶液的吸光度，A1是色素吸附后溶液的吸光度。2.3解吸试验解吸过程进行了如下：HPD-600大孔树脂吸附2.0g用蒸馏水清洗，然后加入100毫升乙醇水溶液（分别为20％，40％，60％）在250毫升锥形瓶中进行解析。瓶被放置在太赫兹-82A模型摇床和摇匀（130转），2小时后在25°C下用紫外/可见分光光度计测定吸光度。按照下列式子计算解吸率：（2—2）其中Dr是解吸率（％），A0是色素吸附前溶液的吸光度，A1是色素吸附后溶液的吸光度。A2是解吸后色素乙醇溶液的吸光度。2.4色素的提取制备大孔树脂吸附颜料进行浓缩处理，然后污水被集中在一个旋转真空蒸发）在45℃解吸后。冷冻干燥得到的粉状色素进行提取。2.5抗氧化活性的测定2.5.1亚硝酸盐的去除Saha,Lajis,andIsraf(2004)andZhang,NieTao,andYe(2002)对此方法进行了一些修改。对色素的提取与蒸馏水稀释到合适的浓度进行分析。三毫升的颜料加入到样品管（10毫升），然后加入2毫升柠檬酸缓冲液（pH值3.0）和分别加入0.1毫升200微克/毫升亚硝酸钠，最后加水至十毫升。混合物立即水浴在37°C保温60分钟。Griess试剂等体积（磺胺1％，0.1％的N-（1- 萘基）乙二胺盐酸，2.5％磷酸）的加入上述混合物。吸光度在10分钟后用紫外/可见分光光度计（Dojin，日本）在538nm处测定。在同一时间对照溶液（不含亚硝酸钠）和标准（没有NaNO2无色素样本）进行了测定。Vc和丁基羟基茴香醚（BHA）被作为阳性对照化合物。亚硝酸钠的去除使用下列公式计算：（2—3）其中SA是测试样品的亚硝酸钠清除率（％），ODS是标准的OD值，ODP是OD值在测试样品存在，ODC是OD值的对照值。2.5.2羟基自由基（OHA）的的清除作用羟基自由基清除活性测定用脱氧核糖法。反应在10mM磷酸盐缓冲液（pH7.4），含过氧化氢2.8毫摩尔，2.8毫摩尔脱氧核糖，25uMFeCl3，100uMEDTA和不同浓度的提取样品。加入抗坏血酸浓度100微摩尔，反应混合物在37°C保温1小时，在水浴反应被激活。培养后，加入1％的硫代巴比妥酸和冰冷的2.8％三氯乙酸，在沸水浴20分钟（100℃）加热。样品冷却后在532纳米处测定吸光度。控制反应混合物中不包含提取样品。Vc和丁基羟基茴香醚（BHA）被用来作为阳性对照化合物。清除作用的活性使用下列公式计算（2—4）其中SA是清除活性测试样品（％），ASI是在被测样品的吸光度，ABI是对照吸光度。2.5.3测定超氧阴离子自由基去除活性超氧阴离子自由基清除活性是测定邻苯三酚做了一些修改。Tris-HCl缓冲液为50毫摩尔（5.6毫升）（pH8.2）和0.2毫升测试样品混合。然后将混合物在水中25°C保温10分钟同时，0.2毫升0.95毫摩尔的邻苯三酚在25°C预热后被添加。吸光度用紫外/可见分光光度计在325nm处测定，每30秒测定样品和对照。曲线根据吸光度值绘制。VC被用作阳性对照化合物。去除活性使用下列公式计算：（2—5）其中SA是测试样品的抑制率（％），AS是测试样品的吸光度，Ab是对照样品的吸光度。2.5.4DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基去除作用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的自由基的去除根据西格玛分析法测定，（2毫升）乙醇（2104mol/L）和2毫升不同浓度测试样品混合。然后将混合液在黑暗中保温60分钟，使用紫外/可见分光光度计在25°C下517nm处测定吸光度下降值，甲醇作为空白。 VC和二丁基羟基茴香醚（BHA）被用来作为阳性对照化合物。色素对DPPH的清除活性根据下列公式计算：（2—6）其中SA是测试样品（％）的清除活性，Ai是DPPH自由基溶液2毫升和2毫升样品混合液的吸光度，Aj是2毫升样品溶液的吸光度和2毫升乙醇混合液的吸光度，A0是2毫升DPPH溶液和2毫升样品溶剂混合液的吸光度。2.6总酚类化合物的测定色素的提取用景观水，以稀释合适的浓度进行分析。通过约福林Ciocalteau酚试剂法对总酚含量色素的提取物进行了评估。样品提取液（200毫升）被添加到1.0毫升的福林，Ciocalteau试剂碳酸钠和0.8毫升（7.5％W/V）然后混合，并允许停留30分钟。用紫外可见分光光度计在765nm处测定吸光度。总酚含量用五倍子酸表示相当于（GAE）表示每克样品，用五倍子酸生成标准曲线。2.7统计分析所有实验进行一式三份，数据是标准值±标准差。最显着性差异（LSD）的试验与置信区间95％间隔是用来比较的方法。抑菌浓度50％（IC50）用来计算浓度/效果回归线。3结果与讨论3.1大孔树脂对色素吸附作用五种大孔树脂对糖蜜酒精废液色素的吸附影响列于表2。HPD-600和D301-R树脂的吸附能力明显（P<0.01）高于其他树脂和他们的吸附率分别为82.66±0.22％和87.18±0.13％。NKA-II的吸附能力最低，这与吸附色素的树脂的化学特性有关。极性吸附剂之间的匹配吸附是影响吸附的重要因素。大孔树脂吸附能力取决于其疏水性。因此，大孔树脂HDP-600具有高吸附效果和更低的成本被选中做了以下实验。从糖蜜酒精废液提取色素吸附是一个很好的方法。活性炭是从废水中去除有机污染物的广泛使用的吸附剂，另一个吸附剂是天然的碳水化合物的聚合物壳聚糖。Lalov,Guerginov,Krysteva,andFartsov用壳聚糖作为阴离子交换去 研究酒厂废水的处理。但成本相对较高限制其使用。在这些效果比较好的吸附剂中，大孔树脂是更具吸引力的替代品，因为其广泛的孔隙结构和良好的理化特性。本次实验中使用是因为其高化学稳定性，优良的选择性和更低的成本。3.2乙醇溶液浓度对解吸的影响大孔树脂的解吸溶剂一般是用不同浓度的乙醇溶液，因为它可以很容易地回收和具有成本低，并没有对样品的毒性。用不同浓度的乙醇溶液进行脱附测试，以找到最合适浓度的解吸液。图1所示是用不同浓度的乙醇（分别为20％，40％和60％）解吸大孔树脂的解吸率。起初，解吸率随时间的增加。但解吸率后的30分钟时间后基本不增加。乙醇浓度从20％到40％解吸率明显升高（P<0.05）。乙醇溶液（40％）显示具有最高解吸率（>98％）。极性溶剂解吸和吸附之间的匹配是一个影响解吸的重要因素。因此，40％的乙醇溶液作为解吸溶剂选择。3.3亚硝酸盐对色素提取物清除作用正如图2所示，色素提取物通过抑制亚硝酸盐的浓度依赖性来影响抗自由基的活性。亚硝酸盐的清除色素的提取活性随浓度的增加，但低于在相同浓度下的阳性对照化合物VC和BHA。VC和BHA只有在浓度的不断增加下（>0.5毫克/毫升）略有增加。亚硝酸盐对色素的50％浓度提取液抑制作用所需量（约0.75毫克/毫升，而BHA和VC的约0.16毫克/毫升和0.18毫克/毫升分别。据悉，某些物质可以清除亚硝酸盐，因为他们的还原能力。它可以指出由下面的公式：NO2-+16H++12e-=2NH4++4H2O。糖蜜酒精废水酚类色素有还原能力，这可能是它可以清除亚硝酸盐原因。 3.4提取色素的羟自由基的清除效果羟基自由基是最活性自由基，可在有金属离子如铁或铜的存在条件下通过超氧化物阴离子和过氧化氢反应得到。羟基自由基可与血脂，多肽，蛋白质和DNA反应，尤其是与硫胺素和鸟苷反应好。当羟基自由基与芳香族化合物发生反应，它可以添加横跨双键，生成六溴二羟基环己烯自由基。所产生的自由基可以进行进一步的反应，如与氧气反应，给过氧自由基，或分解水消除苯氧型自由基。清除色素提取物对羟自由基的抑制能力如图3。色素提取物对羟基自由基清除活性剂量依赖性为0.25-1.25毫克/毫升，这可能是由于还原力，氢原子的提供和活性氧的去除作用的综合影响。然而，在相同的浓度色素提取物对羟自由基清除活性显着（P<0.01）低于对照，VC和BHA。色素提取物的IC50值高于1毫克/毫升，而VC和BHA的分别约0.75毫克/毫升和0.62毫克/毫升。色素的提取酚类化合物可能是影响羟自由基清除活性。 3.5提取色素中超氧阴离子自由基的清除作用超氧阴离子自由基是氧分子接受一个电子，这也是最初的自由基从电子传递所形成创建的简化形式系统。超氧阴离子自由基被称为是一个非常有害的种类为多数活性氧物种的先驱细胞成分。在内部环境产生的超氧阴离子自由基通过歧化反应可能会导致形成过氧化氢。Vc去除超氧阴离子自由基活性高于提取的色素（见表3）。为了同时得到相同吸光度值，颜料提取所需的浓度较高。提取的色素以剂量依赖性方式清除超氧离子（清除活动率为42.9％在10毫克/毫升）（见表3）。动力学表明存在不同浓度具有相同清除机制（数据未显示）。提取的色素50％抑制浓度（IC50值）高于10毫克/毫升，但其VcIC50值低于0.6毫克/毫升，这表明色素的提取不是很强的超氧自由基清除剂。3.6DPPH自由基对提取色素的清除效果DPPH自由基是具有一种质子的特征吸收自由基化合物，能明显降低暴露质子的自由清除剂。它被广泛接受，抗氧化剂对DPPH自由基清除，是由于他们 贡献氢的能力。该测试系统可用于表明清除化合物潜在的主要特征，从糖蜜酒精废液色素的提取自由基清除的活性决定于光在517纳米由于清除稳定DPPH自由基的吸收削减量。阳性DPPH试验表明，该提取的色素是一个很好的自由基清除剂。图4表明提取的色素与标准VC相比有较好的DPPH自由基活性，伴随浓度的增加并具有较高DPPH自由基活性。提取的色素的DPPH自由基清除活性在相同浓度下低于VC和BHA，但其DPPH自由基清除能力活动几乎相同在一定浓度（约0.2毫克/毫升）相对于VC和BHA。颜料样本的50％抑制浓度（IC50值）为0.07毫克/毫升。IC50值较高，下DPPH自由基清除能力活性越低。4结论总之，在本研究中所取得的成果表明，大孔树脂吸附是对从糖蜜酒精废液提取的色素能有效地清除DPPH自由基和硝酸盐一种潜在方法。然而，提取的色素是不是良好超氧阴离子自由基清除剂。通过监测抗氧化活性的方法可能不足以使一个有效的和彻底判断。所以色素提取在体内抗活性方面各组成进一步具体研究是必要的。