蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究.pdf 100页

册ECTl0NCYCLE0F^S!J—ROZ，厶4．50L纠A艺邑ZL疆甚RⅢANDREPLICATl0NSITESIN彳P五yAZEE乙正陋尺4BYLIXIAADISSERTATIONSUBMITTEDT0NANJINGAGRICULTURALUNIVERSITYINPARTICALFUFILM匝NTOFTHEREQUIRMENTSFORTHEMASTERDEGREEOFSCIENCESUPERVISEDBY：ASS0CIATEPROFESS0RYUHANSHOUDEPARTM匠NT0FMICROBl0LOGYCOLLEGEOFLIFESCIENCENANJINGAGRjCULTURALUNIVERSITYNAN儿NG210095，P．R．CHINAⅣ￡AY2012 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本入在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：誊霞如f2年s月和Et学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口，在——年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密g。(请在以上方框内打“4”)学位论文作者(需亲笔)签名：参—恝剔秕需亲笔)獬：ji及疙沁J2年岁月扣日yf矽年，月弓／日 本研究受国家自然科学基金项目资助(编号：30870002)。特此感谢! 目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1ABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．V文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l螺原体及其与宿主关系的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l一、螺原体的基本生物学特性及其与宿主关系的研究概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．螺原体的基本生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l2．螺原体与宿主的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22，1螺原体与昆虫宿主⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22．2螺原体与蜱及蜘蛛宿主⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．32．3螺原体与植物宿主⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．32．4螺原体与高等的无脊椎动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42．5螺原体与脊椎动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．43．螺原体的宿主特异性、多样性及分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯53．1螺原体的宿主特异性及生物多样性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53．2螺原体的分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．6二、蜜蜂螺原体病(spiroplasmosis)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．蜜蜂“爬蜂病”的研究现状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62．蜜蜂螺原体病⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．1蜜蜂螺原体病的症状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．2蜜蜂螺原体病的发生和流行⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．3螺原体病原的检测及防控⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8三、本研究的主要内容、目的及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8参考文献⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19第一节蜜蜂螺原体分子生物学检测方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．19前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．191材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一201．1供试菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．2蜜蜂米源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201_3R2培养基的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．4蜜蜂螺原体对意大利蜜蜂的感染⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．5蜜蜂组织DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．20i．6螺原体特异性16SrDNA序列的扩增及检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯211．7分子生物学快速检测方法的灵敏性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂中肠和胸肌内的定殖研究20121．8分子生物学快速检测方法与常规分离培养法的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一222．1蜜蜂体内螺原体特异性165rDNA的扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2分子生物学快速检测方法的灵敏性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232．3分子生物学快速检测技术与常规分离培养方法的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23第二节蜜蜂螺原体在自然界的分布调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．251材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。261．1定期(包括发病季节与非发病季节)采集蜜蜂螺原体在自然界中可能存在的样本．261．2利用分子生物学方法检测样本中螺原体的存在⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26】．3螺原体的分离及纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯261．4螺原体的保藏⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．1自然界中采集的各类样本及其螺原体含菌率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2不同季节中各类样本的螺原体含菌率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．3不同时期(发病与非发病时期)各类样本的螺原体含菌率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l2．4利用不同方法检测的各类样本⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．5螺原体的分离、纯化及保存⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34第三节螺原体在蜜蜂与植物花间传播途径的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．35l材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一351．1供试菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯351．2螺原体在蜜蜂与植物花上传播途径的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯～⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．362．1蜜蜂体内螺原体在植物花问的传播⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．2植物花上螺原体在蜜蜂与植物花之间的传播⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36第凹节分离自不周宿主中螺原体的基本特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．391材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4l1．1供试菌株的筛选及其宿主的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，，411．2螺原体的形态及运动性观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯421．3螺原体的滤过性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯421．4螺原体生长特性的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯421．5螺原体的生理特性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一431．6螺原体的血清学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯441．7螺原体的系统发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．451．8螺原体的致病性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯472结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．472．1供试菌株的筛选及其宿主的签定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47 目录2．2分离菌株的滤过性、运动性及形态观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯492．3螺原体的生长特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯502．4螺原体的生理特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯522．5螺原体的血清学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯532．6螺原体的系统发育分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯552．7螺原体的致病性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60本章小结与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯641．蜜蜂螺原体的检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．642．蜜蜂螺原体在自然界的分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．643．螺原体在蜜蜂与植物花间的传播⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一664．不同宿主中螺原体的关系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．665．蜜蜂螺原体的侵染循环分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．67参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一69第二章Spiroplasmamellifet。blmCH-1对蜜蜂中肠和胸肌的侵染与定殖⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯73前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．731材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯741．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯741．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．742结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．752．1蜜蜂组织中的螺原体的分子检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯752．2超薄切片中的螺原体的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯762-3螺原体smelliferurnCH—l在蜜蜂体内的分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一762．4感染smelliferumCH一1的蜜蜂的细胞病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．783讨{念．．．．⋯．．⋯⋯，⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．78参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一81全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一83攻读硕士期间发表的学术论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一85致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯87111 摘要蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究捅要蜜蜂螺原体是一种螺旋状、能运动、无细胞壁的原核生物，主要寄生在青壮年蜂的体内，是引起我国蜜蜂“爬蜂病”的主要病原之一。20世纪80年代以来，蜜蜂螺原体病在我国各地养蜂区普遍蔓延，且常与孢子虫病、麻痹病等混合发生，给养蜂业造成了严重的经济损失。据报道，在蜜蜂螺原体病发病时期，蜜蜂、植物花及其它一些膜翅目、双翅目、鳞翅目昆虫内均能检测到螺原体，在养蜂地区的非发病时期，尤其是冬季和炎热的夏季却均未能检测到。根据研究结果，学者们推测出蜜蜂螺原体在自然界的一些可能的侵染循环途径，但一直缺乏系统的研究和直接的证据。本研究针对引起我国蜜蜂“爬蜂病”的螺原体Spiroplasmamelliferum，建立了一种分子生物争}夹速检测方法，系统地对其宿主范围、可能的传播途径进行了研究，并对分离自同一时期不同宿主中螺原体的基本生物学特性及致病性进行了比较。初步研究了Smelliferum在蜜蜂中肠和胸肌内的定殖与侵染特征。针对引起我国蜜蜂螺原体病的病原菌Smelliferum，通过对Chelex一100DNA提取技术的改进，建立了一种分子生物学快速检测方法。该方法可以在2～4小时内检测出植物花、蜜蜂及其生活环境中是否含有螺原体，最低检测浓度为5～6个／mL。与常规分离培养法比较，该方法具有灵敏、快速、高效等优点，这为蜜蜂螺原体病的快速诊断及螺原体资源调查奠定了基础。为了探索蜜蜂螺原体在自然界中可能的传播途径及其侵染循环，本研究采用分子生物学快速检测方法和分离培养技术定期对蜜蜂及自然界中蜜蜂经常活动的场所中的材料、植物花及其它一些相关昆虫进行检测。从2010年3月到2012年1月，共采集了1339只意蜂(Apismeltifera)、131种昆虫、51种植物花和77个从蜂箱内采集的样本，并在其中92个样本中检测到螺原体，分离获得54株螺原体菌株。在一年四季(包括蜜蜂螺原体病发病时期和非发病时期)采集的蜜蜂样本中均检测至4螺原体，以在春季、发病时期病蜂体内检测到螺原体的几率最高。此外，在发病时期采集的蜜蜂幼虫、蛹、植物花、其它昆虫、蜂房、巢门、巢脾等样本中，均检测到螺原体，在非发病时期，则仅在少数蜜蜂体内发现。表明蜜蜂螺原体长期存在于蜜蜂体内，可通过水平传播方式进行传播。为进一步证实蜜蜂螺原体可以通过水平传播方式在蜜蜂和植物花间进行传播，本研究采用人工接种法分别接种螺原体到蜜蜂和植物花上，对其传播途径进行了探 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012索。结果显示：体内含茵的蜜蜂可以通过采食花蜜的方式将螺原体传播到植物花表面，而花表的螺原体又可以通过蜜蜂的采食传播到蜜蜂体内以及其它植物花的表面，传播到蜜蜂体内的致痴}生菌株可以引起蜜蜂“爬蜂病’’的症状，而植物无任何病状。该结果为研究蜜蜂螺原体在自然界的传播途径提供了直接的证据。通过对分离自同一时期相同地点不同宿主(患病蜜蜂、健康蜜蜂、死蜂、打碗花、楝树花、一年蓬、蓼科植物花)中的7株分离菌株的形态学、运动性、基本生物学特性、血清学及分子生物学特·}生的研究及比较，发现7株菌的特性均符合Spiroplasma属的描述。其中，分离菌株MFl006和LKl001的生长速度最快，倍增时间分,-54为1．8h和2．4h；MFl008生长最慢，倍增时间为7．8h。菌株MFl006、YNPl001和LKl001在37。C均不能生长，最适温度比其余4株菌略低。代谢抑制试验、菌体变形试验和ELISA试验的结果均一致表明：螺原体&mellife，．“mCH．1的抗血清对菌株MFl006、YNPl001、LKl001几乎没有抑制作用，对其它4株菌的生长抑制作用却较强；ZHUF0901和MF0905的抗血清则分别与MFl006、YNPl001和LKl001发生较强的反应。根据16srDNA和ITS序列构建的系统发育树显示：MFl006、YNPl001与Spiroplasma印括聚为一类；LKl001-与Spiroplasmaclarkii聚为一类；其它4株菌则都与Smelliferum聚类。以上结果表明同一时期同一地区的蜜蜂和植物花样本中所含的螺原体均不止一种；不同宿主中的螺原体均分别与Sapis和S．mellJferum聚类，进一步证实螺原体在自然界中可通过水平传播方式进行传播。综上，提出了蜜蜂螺原体在自然界中的传播途径：(1)在蜜蜂螺原体病暴发时期(一般为春季4、5月)，蜜蜂螺原体由含茵蜜蜂体内传播到蜂箱内蜜蜂经常活动的场所或蜂箱外界的植物花表面，健康蜜蜂或其它昆虫在含菌的处所和植物花表面活动后可将其携带或感染的螺原体传播到蜂箱内别处或其它的植物花表面，为其它蜜蜂和昆虫的再次感染提供侵柴原；(2)在非发病时期，蜂场几平没有爬蜂，蜜蜂螺原体检测到的几率也极低，推测此时螺原体不易穿过蜜蜂的中肠屏障到达淋巴组织大量繁殖而引起蜜蜂死亡，少量的螺原体在蜜蜂体内可能会长期生存或经消化道排泄在蜂箱内或周围后感染其它健康蜜蜂，当天气变化或其它因素致使蜜蜂抵抗力下降时，螺原体便可穿过蜜蜂中肠屏障导致蜜蜂的死亡，这可能也是在非发病季节蜂场也偶尔出现少量爬蜂的缘故。此外，通过饲喂新鲜菌液的方法对两株与引起蜜蜂“五月病”的sap／s聚类的螺原体MFl006、YNPl001以及一株与引起蜜蜂“螺原体死亡病”的SmelliferuBl聚类的螺原体MFl008的致病性进行研究，发现感染供试螺原体菌株的意蜂(apisme[[ifera)在第5d时均开始出现“爬蜂”症状，但在相同的实验条件下，感染MFl006及YNPl001菌液的蜜蜂的发病速度较快。到第9d时，感染供试螺原体菌液的实验组意蜂的死亡率均明 摘要显高于对照组的意蜂(饲喂新鲜培养基)，与对照组意蜂相比差异均极显著(1％水平)。从实验组及阳性对照组死亡的蜜蜂中均能分离到螺原体，在培养基对照组的死蜂内则未能分出。通过对死蜂内再分离物及饲喂的螺原体菌株的16SrDNA序列作比对，发现再分离菌株均与原菌株同派『生最高，说明螺原体MFl006、MFl008、YNPl001确实是意蜂死亡的病因。菌株MFl006扣YNPl001的发现丰富了对我国蜜蜂“爬蜂病”病原的认识，这是在我国蜜蜂和植物花上首次发现的除smelliferump"A外的另一种对蜜蜂致病的螺原体。最后，利用分子生物学检测方法在患病蜜蜂的中肠、淋巴液和胸部肌肉中均检测到螺原体，健康蜜蜂内则没有。应用透射电子显微镜对SmelliferumCH．1在意蜂的中肠和胸部肌肉中的分布、侵染机制及由其引起的宿主细胞的病理变化进行研究，发现螺原体通常大量地聚集在膜包裹的细胞质囊泡内，分布于中肠上皮细胞顶端和内部的核附近、基底面的质膜与基板之间、基板内部及胸部肌肉细胞内。相对于健康蜜蜂肌肉细胞内整齐排列的纤维束，被螺原体侵染的纤维束表现出明显的断裂、松散排列。这些症状都可能是导致“爬蜂”及蜜蜂死亡的原因。关键词：螺原体；蜜蜂；侵柒循环；快速检测；传播途径；定殖11I ABSTRACTINFECTIONCYCLEOFSP坎D删S嬲■^，EE￡剧嗽硼ZANDREPLICATIONSITESIN爿PjS死陋Z￡臃冠4Spiroplasmasisolatedfromhoneybeesarecharacterizedbyhelical，motileandlackofcellwall．Theyusuallyparasitizeintheyoungbeesandareoneofthemainpathogenswhichcaused“crawlingbeedisease”inChina．Sincethe1980s，spiroplasmosishasspreadwidelyalloverthecountry,andoftenOccursmixedwithsporidiosis，palsydiseaseandSOon．IthascausedsevereeconomicJossestothebeekeeping．ttisreportedthatspiroplasmacouldbedetectedinhoneybees，plantflowersandotherinsectssuchasHymenoptera，Diptera，Lepidopteraintheonsetofspiroplasmosis，butfailtobedetectedinthenonepidemicperiod，especiallyinwinterandhotsummer．Basedonthefindings，researchershavespeculatedseveralinfectioncyclewaysofhoneybeespiroplasmasinnature，butstilllackofsystematicresearchanddirectevidence．Inthisresearch，arapidmoleculardetectingmethodwasdevelopedandusedforthedetectionofSpiroplasmamelliferumwhichcaused“crawlingbeedisease”inourcountry．Itshostrange，possibleroutesoftransmissionwassystematiclystudied．Basicbiologicalcharacteristicsandpathogenicityofspiroplasmasisolatedfromdifferenthostsduringthesameperiodwerecompared．Inaddition，wepreliminarilystudiedthelocmionandinfectioncharacteristicsofSmelliferuminnaidgutandchestmusclesofthehoneybeeApismellifera．Amoleculardetectingapproach，basedontheChelex一100chelatingresinDNAextractionmethodwasdevelopedandusedforthedetectionofspiroplasmainplantflowers，honrybeesandtheirlivingenvironment．ThedetectionWaScarriedoutin2-4hoursanditsminimumdetectableconcentrationwas5-6spiroplasmaspermL．Comparedwithconventionalisolationculture，thismethodwasmoresensitive，rapidandefficient．Thislaidthefoundationfortherapiddiagnosisofspiroplasmosisandtheresourcesurveyofspiroplasmas．Inordertoexplorethepossibleroutesoftransmissionofhoneybeespiroplasmasinnature，wedetectedhoneybees，flowers，otherinsectsandthelivingenvironmentofhoneybeesregularlybyusingmoleculardetectionandisolationculturemethods．Atotalof1339honeybees，131kindsofinsects，51kindsofplantflowersand77samplesfrombeehiveswerecollectedfromMarch2010toJanuary2012，fromwhich92samplesweredetectedtocontainspiroplasmas，and54spiroplasmaisolateswereobtainedtotally．V 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012Spiroplasmascallbedetectedinhoneybeesthroughouttheyear(includingtheepidemicperiodandnonepidemicperiod)．Thedetectionrateofdiseasedhoneybeescollectedinspringandtheepidemicperiodwashighest．Inaddition，spiroplasmasweredetectedinhoneybeelarvae，pupae，plantflowers，otherinsects，hive，nestdoorandhoneycombwhichwerecollectedintheepidemicperiodwhilespiroplasmasonlyfoundinfewhoneybeesinthenonepidemicperiod．ItWaSthoughtthatspiroplasmaspersistedinhoneybeesandweretransmittedbyhorizontaltransmissioninnature．Tofurtherconfirmspiroplasmascouldspreadthroughhorizontaltransmissionbetweenhoneybeesandplantflowers，weexploreditsroutesoftransmissionthoughartificialinoculationofspiroplasmastohoneybeesandplantflowers，respectively．Theresultsshowedthatspiroplasmasinhoneybeescouldspreadfromhoneybeestoflowersurface，andthespiroplasmasinflowersurfaceaslocouldspreadtothehoneybeesandotherplantflowersthoughfeedingofhoneybees，Thehoneybeeinfectedbyspiroplasmashowedsymptomsof“crawlingbeedisease”，andplantflowersdidnotshowanysymptoms．Thisresultprovideddirectevidencetostudytherouteoftransmissionofspiroplasmasinnature．Morphology,motility,basicbiologicalcharacteristics，serologicalandmolecularbiologicalcharacteristicsofsevenspiroplasmaisolatesisolatedfromdifferenthosts(diseasedApismellifera，healthyA．mellifera，deadA．mellifera，Calystegiahederacea，Meliaazedarach，ErigeronaHHRRS，Polygonaceae)forthesameperiodandthesanlelocationwerestudiedandcompared．Theresultshowedthatalltraitsaboveof7spiroplasmaisolatesaccordedcompletelywiththedescriptionsofgenusSpiroplasma．ThegrowthvelocityofisolatesMF1006andLKl001wasthefastest，theirdoublingtimewere1．8hand2．4h，respectively．MFl008WaStheslowest，itsdoublingtimewas7．8h．IsolatesMFl006，YNPl001andLKl001couldnotgrowat37。C，theoptimumtemperaturewassli曲tlylowerthantheremainingfourstrains．Theresultsofmetabolicinhibitiontest，deformationtestandELISAwereconsistent．SmelliferumCH—lantiserumcouldnotinhibitMF1006，YNPI001，LK1001．Butitshowedmuchstrongerreactionwiththeotherfourstrainsandcouldinhibitthegrowthofthestrains．ZHUF0901antiserumandMF0905antiserumshowedstrongreactionwithisolatesMFl006，YNPl001andLKIOOI，respectively．Phylogeneticanalysisbasedonthe16SrDNAandITSrevealedthatMF1006andYNPl001hadacloserelationshipwithSpiroplasmaapis，andLKl001wasclosetoSpiroplasmaclarkii．OtherfourstrainswereallclosetoSmelliferztm．TheseresultssuggestthatthehoneybeesandflowersofthesameareaduringthesameperiodcontainedmoreV【 ABSTI己ACTthanonekindofspiroplasma．Therelationshipofspiroplasmaswasclose，whichfurtherconfirmedthatspiroplasmastransmissioninnature．isolatedfromdifferenthostsspreadthroughhorizontalInsummary，Weproposedtherouteoftransmissionofhoneybeespiroplasmasinnature。First，intheepidemicperiod(usuallyinAprilandMayforthespring)，spiroplasmaswerespreadfromhoneybeestothelivingeviromentorplantflowersurfaceoutsidethebeehives．Healthyhoneybeeorotherinsectswereinfectedbyspiroplasmasduringfeedinginthespiroplasma-infectedplacesorflowers，andthentransportedspiroplasmastootherplaceswithinthebeehivesorotherflowersurface．Thisasloprovidedthepathogensforthere—infectionofotherhoneybeesandinsects．Second，inthenonepidemicperiod，therewasfewcrawlingbeescouldbeseenandthedetectionrateofspiroplasmawasasloverylow．Wespeculatedthatitwasdifficultforspiroplasmastotraversethemidgutbarriertoenterthehemolymph，andthenmultiplyinthehemolymphandresultinthedeathofhoneybeesatthisperiod．Afewspiroplasmasmaybeexistedinhoneybeesforalongtimeorinfectotherhealthyhoneybeesthoughgastrointestinalexcretion．Withtheweatherchangedorotherfactorsresultedinthehoneybeeresistancedecline，spiroplasmaswouldpassthroughthemidgutbarrier，andthencausethedeathofhoneybees．Thismaybethepossiblereasonwhyfewcrawlingbeesoccasionallyappearedintheapiaryduringthenonepidemicperiod．Inaddition，thepathogenicityofisolatesMF1006，Y"NP1001，MF1008toApismelliferawasinvestigatedbyfeedingspiroplasmacultures．Thespiroplasma-infectedhoneybeesshowedsymptomsofspiroplasmosisaround5daysafterfeeding．Atthesameexperimentalconditions，theincidencespeedofhoneybeesinfectedMF1006andYNPI001wasfaster．After9days，themortalityratesofhoneybeesfedbyspiroplasmasweresignificantlyhigherthanthosefedwithfreshmedium．Comparedwiththehoneybeesinthecontrolgroup，thehoneybeesintheexperimentalgroupwereverysignificantatl％significancelevel．Spiroplasmascouldbeisolatedfromdeadbeesintheexperimentalgroupandpositivecontrolgroup，butcouldnotbeinthecontrolgroupwithfleshmedium．16SrDNAsequencescomparisonshowedthatthehomologyofre—isolatesandthefeedingspiroplasmastrainswerethehighest．ItisasloindicatedthatisolatesMF1006，MF1008，YNPl001wereindeedthecauseofhoneybeedeath．ThediscoveryofpathogenicstrainsMF1006andYNPI001enrichedtheunderstandingofthepathogenof“crawlingbeedisease”inChina．ThiswasthesecondpathogenicspiroplasmatohoneybeesdiscoveredinChinaVII 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012Finally，spiroplasmasweredetectedinthemidgut，lymphandchestmusclesofdiseasedhoneybeesbyusingmolecularbiologymethods，butnoonewasdetectedinhealthybees．SmelliferumCH—ldistribution．infectionmechanismsandcytopathologicaleffectsintheintestinesandchestmusclesofApiSmeHiferawereinvestigatedbytransmissionelectronmicroscopy．Spiroplasmasusuallyoccurredinmembrane—boundcytoplasmicvesiclesthatoftenwerelocatednearthenuclearatthetopandinternalofintestinalepithelialcells，betweentheplasmamembraneandbasallaminaatthebasalpart．Inaddtion，spiroplasmasaslofoundinthebasallaminaandaccumulatedathighnumbersinchestmusclecells．Comparedtothetightlyalignedfiberbundlesinhealthymusclecells，bundlesinspiroplasma-containingmusclecellsappearedfragmentedandlooselyarranged．Thesesymptomswerelikelytobethereasonsleadingtothe“crawlingbee"’andthedeathofhoneybees．KEYWORDS：Spiroplasmaspp。；honeybee；infectioncycle；rapiddetection；routeoftransmission；colonizationVIll 文献综述螺原体及其与宿主关系的研究一、螺原体的基本生物学特性及其与宿主关系的研究概况1．螺原体的基本生物学特性螺原体(spiroplasma)是无细胞壁的一类原核生物，基因组非常小，一般在780～2200kbp，直径为100～200nm，长约3～5啪，在某一时期能通过0．22gm的滤膜(Gasparich，20LO)。其基本形态为螺旋形，在一定的生长阶段或条件下，还可呈现圆形、椭圆形、丝状分枝、球状突起及串珠状等多种形态，可能通过二分裂、多分裂、缢缩、出芽等多种方式进行繁殖(Moniqueeta1．，1984；胡冰等，2011)。螺原体没有细胞壁，仅由蛋白质与脂质组成的三层结构的单位膜包裹。细胞膜的内外两层主要是蛋白质，中间层为脂质，在脂质中固醇约占36％(Regassaeta1．，2006；Smitheta1．，1976；Freemaneta1．，1976；Pateleta1．，1978；Muddeta1．，1979；Daviseta1．，1985)。其细胞内部含有可收缩的细胞骨架(Howard，2002)，有数据显示该骨架与其运动性、趋化性等功能密切相关(Trachtenberg，2004；Shaevitzeta1．，2005)。有些螺原体末端还有一特殊的尖端结构，可能与螺原体侵入宿主细胞有关(Ammareta1．，2004；Ozbeketal一2003)。螺原体是兼性厌氧菌，生长温度范围较广(5～41℃)(Konaieta1．，1996)。它们是化能异养型微生物，能够水解葡萄糖而不能利用尿素，对精氨酸的代谢能力则种间差异较大。螺原体的种的划分理论上应基于基因组DNA的同源。I"]i(Wayneeta1．，1987；Johnsoneta1．，1994；ICSB，1995；Rossell6一Moraeta1．，2001；Stackebrandteta1．，2002)，当时因依赖于DNA／DNA杂交的分类方法很难标准化(Boy6eta1．，1979；Christianseneta1．，1979；Leeeta1．，1980；Rahimianeta1．，1980；Liaoeta1．，1981)，Lee等又发现螺原体表而抗原分析结果与杂交结果相一致(Lee，eta1．，1980)，因此长期以来一直应用血清学分析对螺原体进行划分(Williamsoneta1．，1998；Juncaeta1．，1980；Tullyeta1．，1987；Browneta1．，2007)。利用血清学方法划分的血清组中，相同血清组内菌株间同源性极高，小同血清组的菌株间同源性则可以忽略不计，每个血清组至少代表一个种(Whitcombeta1．，1982；Williamsoneta1．，1979)。基于血清学分析结果目前已发现43个血清组 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012(Williamsoneta1．，1998；Whitcombeta1．，2007；Jandhyameta1．，2008)，包括15个血清亚组，其中组I有9个亚组(Juntaeta1．，1980；Saillardeta1．，1987)，组WI(Gasparicheta1．，1993)和组XVI(Abalain．Colloceta1．．1993)各有3个亚组。到1995年，国际细菌分类委员会提出了螺原体的最小分类标准，提出螺原体分类主要依靠表型和基因型，而在2004年召开的国际原核生物分类委员会上提出的多相分类则主要利用表型、基因型和系统发育信息来确定分离物与已鉴定菌株之间的关系。因此，要确立一个螺原体的新种，需要进行大量的表型、基因型、血清学和生物化学的测定(Browneta1．，2007)。到目前为止，已有38个种的螺原体被详细描述并给予拉丁文双名(Regassaeta1．，2006；Oduofieta1．，2005；Koerberela1．，2005；Whitcombeta1．，2007)。2．螺原体与宿主的关系螺原体基于其宿主的微生境，表现出广泛的多样性。尽管有些螺原体呈现出严格的宿主特异性和地理分布区，其它的还是分布广泛。它们能够侵入多种节肢动物的肠腔，其中一些还可以穿过中肠细胞屏障侵入其宿主的淋巴液，从而感染其它的组织和器官。除此之外，在植物、蜱类、高等无脊椎动物中均有发现。螺原体与宿主的关系绝大多数为偏利共栖关系(commensalism)，另有～些则证明是互利共生(mutualism)或寄生(parasitism)的关系(Gasparich，2010)。2．1螺原体与昆虫宿主昆虫是螺原体的主要宿主(Clark，1982)。到目前为止，已经从鳞翅目(Lepidoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、同翅目(Homopmra)、半翅目(Hemiptera)、蜻蜓目(Odonata)7个目中分离到多种螺原体。螺原体与宿t大多为偏利共栖的关系，对宿主不会表现出任何明显的有害作用。昆虫中螺原体的致病性往往与其是否能穿过昆虫的中肠屏障，侵入血淋巴及其它组织有关。Clark和Mouches等报道勋iroplasmamettiferum和Spiroplasmaapis能穿过蜜蜂的中肠细胞到达淋巴组织，并在淋巴组织内大量繁殖从而使蜜蜂死亡(Clarketa1．，1977；Moucheseta1．，1983)；利用免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜也已经揭示Spiroptasmakunkelii存在于叶蝉的中肠、滤腔、马氏管、后肠、脂肪组织、血细胞、肌肉、气管及唾液腺中(Ammareta1．，2005)。此外，螺原体和一些昆虫宿主还表现出互利共’E的关系：如Skunkelli能够增强叶蝉Dalbulusmaidis在寒冬没有可利用的宿主植物时的生存能力(Moya—Raygozaeta1．，2007)；反之，在缺乏玉米的冬天，叶蝉D．maidis能够为Skunkelli提供所需的营养。果蝇Drosophilawillistoni性比失调的特征曾一度认为是基因突变的原因，后经 文献综述Poulson和Sakaguchi证实是由Spiroplasmapoulsonii引起的(Williamsoneta1．，1999)。致性比失调的螺原体在宿主体内经卵巢传播，优先杀死果蝇的雄性后代。此外，在许多种昆虫(如甲虫、蝴蝶等)体内分离到大量其它的螺原体，经鉴定均能导致宿主的性比失调(Hursteta1．，1999；Nakamuraeta1．，2005；Montenegroeta1．，2006；Tinsleyeta1．，2006；Sokolovaeta1．，2002；Mateoseta1．，2006；Pooleta1．，2006)。2．2螺原体与蜱及蜘蛛宿主目前在蜱内也分离到3种螺原体。Spiroplasmamirum和Spiroplasmasp．277F分离自野兔血蜱Haemaphysalis却orispalustris(Tullyeta1．，1982)。Spiroplasmaixodetis贝．1|分离自太平洋硬蜱lxodespacificus(Tullyeta1．，1995)。还没有证据显示这些螺原体会传播到寄生有蜱的脊椎动物身上。应用16SrRNA序列分析对16个蜘蛛家族的内共生体进行了广泛调查，结果显示：Agelenidae、Araneidae、Gnaphosidae、Linyphiidae、Lycosidae和Tetragnathidae6个家族中含有螺原体(Goodacreeta1．，2006)。2．3螺原体与植物宿主已报道的完成Koch’S法则的植物病原性螺原体包括3种：柑桔上的Spiroplasmacirri(Calavaneta1．，1989；Markhameta1．，1974)，玉米上的SkunkeHi(Williamsoneta1．，1975；Cheneta1．，1975；Naulteta1．，1979)以及紫菀上的Spiroplasmaphoeniceum(Saillardeta1．，1987)。它们均能在植物筛管部和昆虫宿主体内生存。这些植物病原性螺原体的大量繁殖一般不会导致其昆虫宿主的病理变化，昆虫只是作为一种传播的媒介。被螺原体侵染的植物则会出现矮化、黄化、不育、果实变小或畸形、花变畸形及节间变短等症状，这些症状大多与那些由植原体(phytoplasma)弓I起的植物病症相似。Scirri的宿主范围较广，它能引起“柑桔僵化病”(Saglioetal．，1973；Fudl—Allaheta1．，1972；1之ajueta1．，1981)，“辣根脆根病”(Fletchereta1．，1981；Daviseta1．，1983)、“胡萝卜紫叶病”(Leeetal．，2006)以及长春花属植物的“黄化病”(Graneaeta1．，1976；Kaloostianeta1．，1975)。为了阐明螺原体对宿主植物致病的分子机制，Scitri已成为目前研究的焦点(Bov6eta1．，2003)。Scirri中的Sc76基因和螺旋蛋白(spiralin)基因已经证实与昆虫的传播性有关。Sc76基因的失活能导致存在于唾液腺中及随后由昆虫通过吸食汁液传播的螺原体数量减少30倍(BoutareaudetaI．，2004)。螺旋蛋白是主要的表面抗原，也是Scitri中含量最为丰富的膜蛋白质，尽管不是螺原体致病的必要因子，但是缺失螺旋蛋白基因的突变株能使昆虫将螺原体传播到宿主植物的能力下降100倍(Dureteta1．，2003)。植物病原性螺原体能够利用植物筛管部的葡萄糖和果糖，进入叶蝉体内后则利用 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012其宿主血淋巴中的海藻糖。因此，螺原体必须能够快速适应不同的能源。Gaurivaud等对Scitri中葡萄糖和果糖的利用对植物致病性的影响进行了探索，结果发现果糖操纵子的失活能降低其致病性(Gaurivaudeta1．，2000；Gaurivaudeta1．，2001)。一个转座子介导的scirri突变株GMT553，它能像野生型菌株一样在长春花属植物中进行复制，但经叶蝉传播到健康植株后，感染螺原体的植株不会产生任何病症(Gaurivaudeta1．，2000；Foissaceta1．，1997)。螺原体对果糖的利用能够损害蔗糖向植物筛管部的运输，导致碳水化合物蓄积在来源的叶片处，使植株下方的组织衰竭(Bov6eta1．，2003)。此外，实验证明不能利用葡萄糖的突变株GIl3．glcl，通过利用葡萄糖磷酸转移通透酶也町以导致被感染的植物产生和那些由野生型菌株引起的植物病症一样的严重症状(Andreeta1．，2005)。葡萄糖的蓄积可以导致拟南芥的发育障碍并阻遏其光合作用基因的表达，这些症状在感染野生型＆cirri的长春花属植物中也可以观察至U(Andreeta1．，2005)。&citri通过叶蝉介体进行传播必须先粘附并侵入昆虫宿主细胞。研究显示&cirri表面蛋白P89可调节螺原体对昆虫介体Circulife厂tenellus细胞的吸附，被指定为saP．P1(螺原体吸附相关蛋白】)(Yueta1．，2000；Bergeta1．，200i)。对叶蝉中肠的电子显微研究证实Skunkelii通过一个类似于尖端的结构连接宿主细胞膜(Ammareta1．，2004)。此外，在DNA水平上从不能传播的skunketii菌株中，未能检测到SARPl的同系物(Daviseta1．，2005；Berhoeta1．，2006)。2．4螺原体与高等的无脊椎动物近来，从淡水和海洋生物等高等的无脊椎动物中也分离到螺原体，改变了我们对其宿主范围的认识。Nunan等在南美洲哥伦比亚的水产养殖池塘中观察到大量死亡的虾后，从太平洋虾Penaeusvannamei的血淋巴中分离到SpiroplasmapenaeiSHRIMP0qunaneta1．，2005)。Wang等从中国患“颤抖病”的中华绒螯蟹中分离到其致病因子，经电镜观察及16SrDNA序列分析等手段已确定其为螺原体(Wangeta1．，2004)，定名为Spiroplasmaeriocheiris(Wangetal，，2011)。同样的微生物在与患病的中华绒螫蟹共同培养在池塘中的Procambarusclarkia(Wangeta1．，2005)及小虾(Bietat．，2008)中也分离到。由于昆虫能够接触到那些被感染的水产养殖体系，因此还可能导致螺原体传播到新的甲壳动物宿主中。近来这些螺原体分离物的发现不仅扩大了螺原体的宿主范围，也可能影响未来包含水生环境在内的生物多样性的研究。2．5螺原体与脊椎动物迄今为止，致病螺原体对脊椎动物细胞及免疫功能受损的脊椎动物的侵染能力还4 文献综述是非常有限的。尽管许多分离自昆虫和植物中的螺原体能在37。C下生长，给螺原体在脊椎动物宿主中的复制提供了可能，但是目前报道的仅有一例，即Spiroplasmamirum能侵染免疫力低下的脊椎动物，如鸡胚、乳鼠等(Tullyetal。，1982；Burgdorferetal。，1975；Tullyeta1．，1976)。此外，Bastian等报道螺原体可能与人和动物的传染性海绵状脑病有关(Bastianeta1．，2001；Bastianeta1．，2004)，但是，在患瘙痒症的仓鼠体内却未扩增出螺原体及其它细菌的16SrDNA(Alexeevaeta1．，2006)。3．螺原体的宿主特异性、多样性及分布3．1螺原体的宿主特异性及生物多样性通过对昆虫家族大量的调查发现，螺原体具有丰富的多样性，大约在每10种检测的昆虫体内能发现一个新的螺原体种(Hacketteta1．，1990)。由此我们可以估计一千万种昆虫中包含的螺原体属微生物将是难以想象的。尽管如此，近来大量的分离物表明，随着螺原体菌株越来越多的被鉴定和描述，分离到新种的几率将会降低。在北美洲，从新斯科舍(NovaScotia)到热带地区的采集调查表明昆虫体内的含菌率由于地理分布区域的不同而有所不同，螺原体的多样性可能在热带地区达到高峰(Wedincampeta1．，1996)。螺原体丰富的多样性趋势在含螺原体的虻科昆虫内也可得到证明。据统计，仅在美国和加拿大的马蝇和鹿蝇体内就分离到1000多株螺原体。在t995和1998年8月，哥斯达黎加高原的14个马蝇Poeciloderasquadripunctatus样本中获得13个螺原体分离物(Whitcombeta1．，2007)，经血清学分析，这些分离物不属于同一个血清组。此外，还发现单个宿主虻中可以感染2种甚至更多的螺原体(Frencheta1．，1997)。这些数据充分说明虻类昆虫是螺原体丰富的资源库。遗憾的是，那些经过实验测定或环境调查确定是螺原体的特异性的宿主，却没再进行更多的研究，仅有一些个别的事例。如Spiroplasmaleptinotarsae具有非常严格的宿主特异性，它只能从美国科罗拉多州马铃薯甲虫中分离得到，将其感染其它甲虫均未成功(Hackereta1．，1989；Hacketteta1．，1996；Kleineta1．，1994)。相反，分离白玉米食根甲虫的Spiroplasmadiabroticaewas也不能侵染美国的科罗拉多州马铃薯甲虫(Hackctteta1．，1989)。一般而言，虻科昆虫内螺原体的宿主特异性不强，它们通过植物表面进行传播，经常被其它昆虫感染，例如，Spiroplasmagladiatoris分离自11种牛虻，常与其它螺原体混合感染(Whitcombeta1．，1997；Whitcombeta1．，1992)。不同昆虫在相同部位的采食可以使螺原体在宿主之间高效的进行水平传播，这也是相同昆虫宿主内可能含有多种螺原体的原因(Hacketteta1．，1989；Wedincarnpeta1．，1997)。植物宿 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012主特异性在很大程度上取决于其昆虫介体。宿主范围较窄的昆虫将限制其可传染的植物范围，它只能在其取食的植物之间进行传播：宿主范围较宽的昆虫则可活动于多种植物表面，感染和传播多种螺原体的几率也较大。3．2螺原体的分布尽管目前已鉴定的螺原体的宿主来自于非洲、亚洲、澳洲、欧洲、南美洲和北美洲，但是研究表明在温和气候地带螺原体的生物多样性刁+是最丰富的(Whitcombeta1．，2007)。螺原体的分布很可能受其宿主地理分布的限制，如一些螺原体的地理分布较离散，另一些则是广泛的分布(Whitcombeta1．，1990)。除此之外，其它因素如宿主特异性和宿主越冬策略等都可能影响到螺原体的分布范围(WhitcombetaI．，2007)。螺原体在世界范围内的虻科昆虫中均有分布(Jandhyameta1．，2008；Whitcombeta1．，1997；Frencheta1．，1997；Leeta1．，1993；Vazeille—Falcozeta1．，1997；Regassaeta1．，2006)。基于大量与螺原体分离物相关的虻分布于北美洲，一些螺原体种的地理分布区也开始显现，如Spiroplasmachrysopicola有一个较广的地理分布区，Sgladiatoris的地理分布范围则相对较窄。此外，还对澳洲、哥斯达黎加和厄瓜多尔的虻科昆虫进行了调查，在这些地区分别发现了4、15和5个血清组的螺原体。其中，哥斯达黎加发现的样本中有4个血清组和在美国发现的相同，分离自澳洲和厄瓜多尔血清组的样本则受其地域的[眼$1](Regassaeta1．，2006)。花和植物表面是螺原体传播到昆虫体内的主要场所(Davis，1978；McCoyela1．，1979；Clark，1978)。1些螺原体仅从植物花上分离得到，另外一些菌株则在昆虫和植物花上均有分布，说明这些花上的螺原体分离物可能是在昆虫采食时留下的(Clark，1982；Hacketteta1．，1990)。二、蜜蜂螺原体病(spiroplasmosis)1．蜜蜂“爬蜂病”的研究现状蜜蜂“爬蜂病”是近年来严重危害我圈养蜂生产的一种成年蜜蜂急性传染病，于上个世纪70年代初由美国、法国研究人员发现，80年代初传入我国南方，在江浙一带十分多见。该病来势凶猛，传播迅速，蜂场染病率可达90％以上，蜜蜂死亡率能达36％以上，轻者群势下降，重者全场覆灭(牛庆生等，2004)。蜜蜂“爬蜂病”不是一个科学名词，它来源于蜜蜂发病后不能飞翔，只能爬行直至死亡，是根据蜜蜂的病态行为命名的。经研究证实，引起蜜蜂“爬蜂”现象的因素很多，包括蜂螨、病毒、孢子虫、螺原体、中毒、气候因素等。这些病原往往呈交叉或混合感染，给蜜蜂的饲养管理及其疾病的有效防治造成很大不便。因此，了解发病6 文献综述蜂群的特征、发病时间及蜜蜂病症对于准确鉴定出蜜蜂发病的病因并采取相应的治疗措施有重大的意义。表l是对各类蜜蜂爬蜂病的病原及其症状的总结，据此可对蜜蜂爬蜂病因做出初步诊断(薛后卫，2006)。表l蜜蜂爬蜂病分类及症状鉴别诊断表(薛后卫，2006)Table1．Theclassificationanddifferentialdiagnosisofsymptomatictableof“crawlingbeedisease”(Xue，2006)病最类塑易发季节解嗣镶检爬蜂形态蜂场周围病蜂外来因素聚集状态2．蜜蜂螺原体病蜜蜂螺原体病(Spiroplasmosis)最早于1976年由Clark等在美国Maryland州发现，经鉴定是由Smelliferum引起的蜜蜂“螺原体死亡病”(Clark，1977)，随后，Mouches等在法国又发现了由另一种螺原体Sap／s引起的“五月病(Maydisease)”(Moucheseta1．，1983；Moucheseta1．，1984)。调查发现蜜蜂螺原体遍布于美国各州、法国、秘鲁、中国台湾、大陆及世界其它地方。20世纪80年代以来，我国华东、华北、中南、西南广大地区普遍发生蜜蜂螺原体病，俗称“爬蜂病”。病害流行的年份，造成蜂业严重的经济损失。后经分离鉴定，证实引起我国蜜蜂“爬蜂病”的螺原体都属于Smelliferum(陈永萱等，1988；董秉义等，1993；阮康勤等，2007)。2．1蜜蜂螺原体病的症状蜜蜂患螺原体病后，即爬出蜂箱，跌落地面，在蜂箱周围地上爬行，其行为呆滞，翅微卷并抖动，后腿卷缩抽动，不能起飞，三五成堆聚集在土凹处或草丛中并逐渐死亡。死蜂双翅展开，喙伸出。由于该病常与其它病混合感染，因此肠道的病变情况不尽相同，有的中肠变白肿胀、有的变黑缩小，后肠有的有积粪，有的积绿水。在发病严重时，成年蜂、青年蜂甚至幼蜂大量爬出蜂箱，蜂箱附近一1片死蜂(董秉义，1996)。2．2蜜蜂螺原体病的发生和流行蜜蜂螺原体是引起我国“爬蜂病”的主要病原之一，在我国有着广泛的地理分布。 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012每年先从我国南部省份开始发生，随着放蜂向北方转移，病害由南向北蔓延。在江浙一带，每年4月油菜丌花期前后是蜜蜂螺原体病的发病高峰，随着油菜花期的结束，病情逐渐减轻。在华北一带的发病高峰在6～7月，此时正值刺槐花和荆条花期，8月以后逐渐好转。发病严重程度在每年问的变化差别很大。这与发病期间的温度高低变化频繁，或气温偏低、雨水偏多等外界环境影响及蜂群的抗病能力有关。我国自1986年从病蜂中分离到首株螺原体以来，至今已从各地蜜蜂和植物花上分离到众多螺原体菌株，它们大多与＆melt诉erzlm的亲缘关系最近，属于螺原体属中第1血清组的第2亚组(陈永萱等，1988；董秉义等，1993；于汉寿等，2008；回丽静等，2010)。此外，蜜蜂螺原体病的暴发时期与蜜源植物开花期相关，这也进一步说明植物花上的螺原体可能是蜜蜂采蜜时留下的。蜂群内部被污染的饲料、蜂具和死蜂尸体都可能成为该病的传染源，内勤蜂通过清巢、饲喂等活动将螺原体在蜂群内扩散传播，蜂群间则可通过盗蜂、迷巢蜂、所采水源和花源等途径进行传播(赵学昭，2001)。2．3螺原体病原的检测及防控避免疾病大肆传染的最好策略就是尽早尽快的检测出病原。蜜蜂螺原体病最初都是通过对螺原体分离培养后进行显微镜检或血清学分析来诊断的。随着分子生物学技术的发展，分子生物学检测已成为一种重要的螺原体检测方法。PCR弓I物的开发更是大大缩短了螺原体检测的时问。2004年Nunan等成功地利用PCR技术对Penaeusvannamei中的螺原体进行了检测(Nunaneta1．，2004)。王文等也于2007年利用螺原体的特异性引物F28和R5对甲壳动物体内及其生活环境样品中的螺原体进行了快速的检测(Dingcta1．，2007)，耗时仅需2～4h。此外，螺原体的两个蛋白：螺旋蛋白和原纤维蛋白也已经用于开发螺原体的特异性引物(Gasparich，2010)。一些基于PCR的商品化的检测试剂盒已经用于支原体(mycoplasma)的检测。对螺原体疾病的防治，目前还没有特效的药物。当前，严格做好冬春季节的消毒工作，加强饲养管理，保证蜂群内有充足的优质饲料，及时处理死蜂尸体切断病原传播并结合药物防治是预防蜂群疾病、减少蜂群损失的主要措施。三、本研究的主要内容、目的及意义蜜蜂是自然界最主要的授粉昆虫，它们除了为人类提供众多营养丰富的蜂产品之外，为农作物授粉，也具有重要的经济价值和社会效益。此外，蜜蜂授粉对于保持生物多样性和维持生态系统的平衡有着极为重要的作用。然而，蜜蜂螺原体作为蜜蜂“爬蜂病”的主要病原之一，常与孢予虫、慢性麻痹病毒等混合感染蜜蜂，给我国养蜂业造成了重大的损失，严重威胁着养蜂牛产的发展。 文献综述许多研究已经证实花上的螺原体多数与蜜蜂螺原体有密切关系。董秉义等也对蜜蜂螺原体病的流行病学做了初步调查(董秉义，1992)，然而，在养蜂地区的非发病季节，特别是冬季和炎热的夏季都未能检测到蜜蜂螺原体，那么到发病季节，这些病原性螺原体究竟来自哪里?是来自蜜蜂、植物花还是其它昆虫?它们的越冬宿主是谁?在自然界中如何传播?这些问题目前还不清楚，缺乏系统深入的研究。本研究基于Chelex一100提取DNA的技术建立了一种快速灵敏的检测蜜蜂螺原体的方法，对自然界中与蜜蜂活动相关的样本(包括蜜蜂、其它相关的昆虫、植物花以及蜂箱内外的材料)进行了定期的检测，初步确定了蜜蜂螺原体的来源及其越冬宿主；通过模拟自然条件卜蜜蜂螺原体可能的传播方式并比较同一时期不同宿主巾的螺原体的基本特征及致病性，提出了螺原体在自然界中可能的传播途径，并在我国蜜蜂和植物花上首次分离到与引起蜜蜂“五月病”的＆ap／s亲缘关系较近的菌株。此外，通过分子生物学检测方法在患病蜜蜂的中肠、淋巴液和胸部肌肉中均检测到螺原体，健康蜜蜂内则没有。利用透射电子显微镜观察到螺原体通常聚集在膜包裹的细胞质囊泡内，分布于患病蜜蜂中肠上皮细胞顶端和内部的核附近、基底面的质膜与基板之间、基板内部及胸部肌肉细胞内。相对于健康蜜蜂肌肉细胞内整齐排列的纤维束，被螺原体侵染的纤维束表现出明显的断裂、松散排列。这些症状都可能是导致“爬蜂”及蜜蜂死亡的原因。本研究为揭示蜜蜂螺原体病的流行规律，探明蜜蜂螺原体的侵入及病理学特性提供依据，同时也进一步加强了我国螺原体的研究。参考文献[1】1Abalain-CollocML，WilliamsonDL，CarleP，eta1．DivisionofgroupXVIspiroplasmasintosubgroups【J]．IntJSystBacteriol，1993，43：342—346[2】AlexeevaI，ElliottEJ，RollinsS，eta1．AbsenceofSpiroplasmaorotherbacterial16srRNAgenesinbraintissueofhamsterswithscrapie[J】．JClinMicmbiol，2006，44：91—97[3】AmmarE，FultonD，BaiXD，eta1．Anattachmenttipandpili—likestructuresininsect—andplant-pathogenicspiroplasmasoftheclassMollicutes[J】．ArchMicrobiol，2004，81：97—105[4]AmmarE，HogenhoutSA．Useofimmunofluorescenceconfocallaserscanningmicroscopytostudydistributionofthebacteriumcomstuntspiroplasmainvectorleafhoppers(Hemiptera：Cicadellidae)andinhostplants[J]．AnnEntomolSocAm，2005，98：820—826[5】Ammarel-D，FultonD，BaiX，eta1．Anattachmenttipandpili—likestructuresininsect-andplant—pathogenicspiroplasmasoftheclassMollicutes[J]．ArchMicrobiol，2004，18：97—105[6]AndreA，MaucourtM，MoingA，eta1．SugarimportandphytopathogenicityofSpiropIasmacirri：9 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012glucoseandfructoseplaydistinctroles[J】．MolPlantMicrobeInteracL2005，18：33—42【7】BastianFO，DashS，GarryRELinkingchronicwastingdiseasetoscrapiebycomparisonofSpiroplasmamirumribosomalDNAsequences【J】．ExpMolPathol，2004，77：49—56[8】BastianFO，FosterJW．Spiroplasmasp．16SrDNAinCreutzfeldt—JakobdiseaseandscrapieasshownbyPCRandDNAsequenceanalysis[J】．JNeuropathExpNeur,2001，60：613—620[9】BergM，MelcherU，FletcherJ．CharacterizationofSpiroplasmacirriadhesionrelatedproteinSARPl，whichcontainsadomainofanovelfamilydesignatedsarpin【J]．Gene，2001，275：57-64[10】BerhoN，DuretD，RenaudinJ．Absenceofplasmidsencodingadhesionrelatedproteinsinnon—insect-transmissiblestrainsofSpiroplasmacitri【J】．Microbiology,2006，152：873-886[11】BiK，HuangH，GuW，eta1．Phylogeneticanalysisofspiroplasmasfromthreefreshwatercrustaceans(Eriocheirsinensis，Procambarusclarla"aandPenaeusvannamei)inChina[J】．JInvertebrPathol，2008，99：57·65[12】BoutareaudA，Danet儿，GamierM，etal，DisruptionofagenepredictedtoencodeasolutebindingproteinofanABCtransporterreducestransmissionofSpiroplasmacirribytheleafhopperCirculiferhaematoceps【J】．ApplEnvironMicrobiol，2004，70：3960—3967[13】BovdJM，RenaudinJ，SaillardC，eta1．Spiroplasmacirri，aplantpmhogenicmollicute：relationshipswithitstwohosts，theplantandtheleafhoppervectorfJ】．AnnuRevPhytopathol，2003，41：483—500[14】BovdJM，SaillardC．Cellbiologyofspiroplasmas[M】．In：Themycoplasmas，Eds：WhitcombRF,TullyJG,AcademicPress，NewYork，1979：83—153[15】BrownDR，WhitcombRF,BradburyJM．RevisedminimalstandardsfordescriptionofnewspeciesoftheclassMollicutes(divisionTenericutes)[J1．IntJSystEvolMicrobiol，2007，57：2703—2719．【16】Burgdorferw，BrintonLP,HughesLE，IsolationandcharacterizationofsymbiotesfromtheRockyMountainwoodtick，Dermacentroandersoni[J]．JInvertebrPathol，1975，22：424-434[17】CalavanEC，Bov6JM．Molecularandcellularbiologyofspiroplasmas[MI．In：Themycoplasmas．Eds：WhitcombRF,TullyJE，AcademicPress，NewYork，1989，5：425—485[18】ChenTA，LiaoCH．Cornstuntspiroplasma：isolation，cultivation，andproofofpathogenicity[J】．Science，1975，188：1015-1017[19】ChristiansenC，AskaaG，FreundtEA，eta1．Nucleic—acidhybridizationexperimentswithSpiroplasmacitriandthecornstuntandsucklingmousecataractspiroplasmas[J】．CurrMicrobiol，1979．2：323—326【20】ClarkTB．Honeybeespiroplasmosis．Anewproblemforbeekeepers[J】．AmBeeJ，1978，118：18[21】ClarkTB．Spiroplasmas：diversityofarthropodreservoirsandhost—parasiterelationships[J】．1() 文献综述Science，1982，217：57-59[22】ClarkTB．Spiroplasmasp．，anewpathogeninhoneybees[J】．JInvertebrPathol，1977，29：112一113【23】DavisPJ，KatznelA，RazinS，eta1．Spiroplasmamembranelipids【J】．JournalofBacteriology，1985，161(1)：118-122[24】DavisRE。Spiroplasmaassociatedwithflowersofthetuliptree(Liriodendronm幼瞻ra厶)01．CanJMicrobiol，1978，24：954—959【25】DavisRE，DallyEL，JomantieneR"eta1．CrypticplasmidpSKUl46fromthewail—lessplantpathogenSpiroplasmakunkeliiencodesanadhesinandcomponentsofatypeIVtranslocation—relatedconjugationsystem【J1．Plasmid，2005，53：179—190[26】DavisRE，FletcherJ．SpiroplcLsmacirriinMaryland：isolationfromfield—grownplantsofhorseradish0rmoraciarusticana)withbrittlerootsymptoms【J】．PlantDis，1983，67：900—903[27】DingZF，BiKR，WuT，eta1．AsamplePCRmethodforthedetectionofpathogenicspiroplasmasincrustaceansandenvironmentsamples【J】．Aquaculture，2007，265：49—54【28】DuretS，BerhoN，Danet儿，eta1．Spiralinisnotessentialforhelicity,motility,orpathogenicitybutisrequiredforefficienttransmissionofSpiroplasmacitribyitsleafhoppervectorCimuliferhaematoceps[J]．ApplEnvironMicrobiol，2003，69：6225—6234【29】FletcherJ，SchultzGA，DavisRE，eta1．Brittlerootdiseaseofhorseradish：evidenceforanetiologicalroleofSpiroplasmacirri【J】．Phytopathology，1981，71：1073-1080【30】FoissacX，Danet儿，SaillardC，eta1．MutagenesisbyinsertionofTn4001intothegenomeofSpiroplasmacitri：characterizationofmutantsaffectedinplantpathogenicityandtransmissiontotheplantbytheleafhoppervectorCirculiferhaematoceps[J1．MolPlant—MicrobeInteract，1997，10：454．461[31】Foissacx，SaillardC，BovdJM．RandominsertionoftransposonTn4001inthegenomeofSpiroplasmacirristrainOil3[J]．Plasmid，l997，37：80—86【32】FreemanBA，SissensteinR，McManusTT，eta1．LipidcompositionandlipidmetabolismofSpiroplasmacitri【J】．JournalofBacteriology，1976，125(3)：946—954[33]FrenchFE，WhitcombRF,TullyJG,eta1．Spiroplasmalinolaesp．nov,，fromthehorseflyTabanuslineola(Diptera：Tabanidae)【J】。IntJSystBacteriol，1997，47：1078—1081【34】FudI-AllahAESA，CalavanEC，lgwegbeECKE．Cultureofamycoplasmalikeorganismassociatedwithstubborndiseaseofcitrus【J】．Phytopathology,1972，62：729—731【35】GasparichGE．Spiroplasmaandphytoplasmas：Microbesassociatedwithplanthosts[J】．Biologicals，2010，38：193-203[36】GasparichGE，SaillardC，ClarkEA，eta1．SerologicandgenomicrelatednessofgroupVIIIand 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012groupXVIIspiroplasmasandsubdivisionofSpiroplasmagroupVIIIintosubgroups[J】_IntJSystBacteriol，1993，43：338-341[37】GaurivaudP，Danet儿，LaigretF，eta1．FructoseutilizationandphytopathogenicityofSpiroplasmacirri[J]．MolPlant—MicrobeInteract，2000，13：1145—1155[38】GaurivaudELaigretF，GamierM，eta1．CharacterizationoffruRasaputativeactivatorofthefructoseoperonofSpiroplasrnacitri[J]．FEMSMicrobiol，2001，198：73-78[39】GaurivaudP，LaigretF，GamierM，eta1．Fructose’utilizationandpathogenicityofSpiroplasmacirri：characterizationofthefructoseoperon【J】．Gene，2000，252：61-69[40]GoodacreSL，MartinOY’ThomasCFGeta1．Wolbachiaandotherendosymbiontinfectionsinspiders[J]．M01Ecol，2006，15：517-527[41]GranettAL，BlueRL，HarjungMK，eta1．OccurrenceofSpiroplasmacitriinperiwinkleinCalifornia．CalifAgric，1976，30：18—19[42]HackettKJ，ClarkTB．Ecologyofspiroplasmas[M】．In：Themycoplasmas．Eds：WhitcombRF,TullyJG,AcademicPress，NewYork，1989，5：l13—200[43】HackettKJ，WhitcombRF,ClarkTB，eta1．Spiroplasmaleptinotarsaesp。nov．，fromtheColaradopotatobeetleLeptinotarsadecemlineata【J]．IntJSystBacteriol，1996，46：906-911[44】HackettKJ，WhitcombRF，HenegarRB，eta1．Mollicutediversityinarthropodhosts[J】．ZentblBakteriolSuppl，1990，20：441—454[45】HowardC．HowSpiroplasmaMightSwim[J】．JournalofBacteriology，2002，184(8)：2063-2064【46】HurstGD，GrafvonderSchulenburgJH，MajerusTM，eta1．Invasionofoneinsectspecies，Adaliabipunctata,bytwodifferentmale-killingbacteria【J】．InsectMolBiol，1999，8：133—139[47】ICSB．RevisedminimumstandardsfordescriptionofnewspeciesoftheclassMollicutes(divisionTenericutes)[J】．IntJSystBacteriol，I995，45：605—612【48]JandhyamH，BatesCR，YoungTE，eta1．GlobalSpiroplasmabiodiversityinasinglehost[C】．Abstractsof17thCongressofInternationalOrganizationforMycoplasmology,China，2008：130[49]JohnsonJL．SimilarityanalysisofDNAs[M】．In：Methodsingeneralandmolecularbacteriology．Eds：GerhardtP，MurrayRGE，WoodWA，eta1．，AmerSocMicrobiol，Washington，1994：656—682[50】KonaiM，ClarkEA，CampM，eta1．Temperatureranges，growthoptima,andgrowthratesofSpiroplasma(Spiroplasmataceae，classMollicutes)species[J]．CurrMicrobiol，1996，32：314—319[51】JuncaP，SaillardC，TullyJ，eta1．Caract6rizationdespiroplasmesisolat6d’insectesetfleursdeFrancecontinentale，deCorseetduMaroc．Propositionpournileclassificationdesspiroplasmes[J】．ComptRendAcadSciParisSer,1980，290：1209一1212[52】KaloostianGH，OldfieldGN，PierceHD，eta1．Leafhopper-naturalcitrusstubborndisease[J]．Calif 文献综述Agric，1975，29：14—15[53】KleinM，HackeaKJ，BravermanY，eta1．Thefateofspiroplasmasfedtono—hostinsects【J】．IOMLett,1994，3：525·526[54】KoerberRT,GasparichGE，FranaMF,eta1．Spiroplasmaatrichopogonissp．nov．，fromacermopogonidbitingmidge【J】．IntJSystEvolMicrobiol，2005，55(1)：289—292[55]LeeIM，BottnerKD，MunyanezaJE，eta1．CarrotpurpleleafianewspiroplasmaldiseaseassociatedwithcarrotsinWashingtonState[J】．PlantDis，2006，90：989—993【56]LeeIM，DavisRE．DNAhomologyamongdiverseSpiroplasmastrainsrepresentingseveralserologicalgroups【J】．CanJMicrobiol，1980，26：1356-1363【57】LeGoffF，MarjoletM，Humphery—SmithI，eta1．TabanidspiroplasmasfromFrance：characterization，ecologyandexperimentalstudy[J】．AnnParasitolHumComp，1993，68：150—153[58]LiaoCH，ChenTA．DeoxyribonucleicacidhybridizationbetweenSpiroplasmacitriandthetomstuntspiroplasma[J】．CurrMicrobiol，1981，5：83—86[59]MarkhamPG,TownsendR，Bar-JosephM，eta1．Spiroplasmasarethecausalagentsofcitruslittle—leafdisease[J】．AnnApplBiol，1974，78：49-57[60】MateosM，CastrezanaSJ，NankivellBJ，eta1．HeritableendosymbiontsofDrosophila[J】．Genetics，2006，174：363—376【61】McCoyRE，WilliamsDS，ThomasDL．Isolationofmycoplasmasfromflowers[C]．In：ProceedingsoftheUS—ROCplantmycoplasmaseminar．NationalScienceCouncil，Taipei，Taiwan，1979：75—81[62】MoniqueG，ClercM，BoveJM．GrowthanddivisionofSpiroplasmacirri：elongationofelementaryhelices【J]．JournalofBacteriology，1984，158(1)：23—28【63】MontenegroH，HatadaniLM，MedeirosHF’eta1．MalekillinginthreespeciesofthetripunctataradiationofDrosophila(Diptera：Drosophilidae)[J】．JZooSystEvolRes，2006，44：130—135【64]MouchesC，Bove，JM，AlbisettiJ．PathogenicityofSpiroplasmaapisandotherspiroplasmasforhoney—beesinsouthwesternFrance【J】．AnnMicrobiol(Paris)，1984，135A(1)：151-155【65】MouchesC，MenaraA，TullyJG,eta1．Spiroplasmaapis，anewspeciesfromthehoneybee(Apismellifera)[J】AnnlnstMicrobiol(Paris)，1983，134A：383·397[66】Moya-Raygoza13lPalomera—AvalosVGalaviz—MejiaC．FieldoverwinteringbiologyofSpiroplasmakunkelii(Mycoplasmatales：Spiroplasmataceae)anditsvectorDalbulusmaidis(Hemiptera：Cicadellidae)[J]．AnnApplBiol，2007，151：373—379【67】MuddJB，LeeIM，LiuHY，eta1．ComparisonofthemembranecompositionofSpiroplasmacitriandthecornstuntspiroplasma[J】．JournalofBacteriology，1979，137(2)：1056—1058[68]NakamuraK，UenoH，MiuraK．Prevalenceofinheritedmale—killingmicroorganismsinJapanese13 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012populationsofladybirdbeetleHarmoniaaxyridis(Coleoptera：Coccinellidae)潮．AnnEntSocAm，2005，98：96—99【69】NaultLR,BradfuteOE．Cornstunt：involvementofacomplexofleafhopper-bornepathogens【M]．In：Leafhoppervectorsandplantdiseaseagents．Eds：MaramoroschK，HarrisKF,AcademicPress，NewYork，1979：561—586[70]NunanLM，LightnerDV,OduoriMA，eta1．Spiroplasmapenaeisp．nov．，associatedwithmortalitiesinPenaeusvannamei，Pacificwhiteshrimp[J]．IntJSystEvolMicrobiol，2005，55：2317．2322[71】NunanLM，PantojaCR，SalazarM，eta1．CharacterizationandmolecularmethodsfordetectionofanovelspiroplasmapathogenictOPenaeusvannamei[J]．DisAquatOrgan，2004，62(3)：255．264[72】OduoriMA，LipaJJ，GasparichGE．Spiroplasmaleucomaesp．nOV．，isolatedinPolandfromwhitesatinmoth(LeucomasalicisL．)1arvae[J】．InternationalJoumalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology,2005，55：2447-2450[73]OzbekE，MillerSA，MeuliaT，eta1．InfectionandreplicationsitesofSpiroplasmakunkelii(Class：Mollicutes)inmidgutandMalpighiantubulesoftheleafhopperDalbulusmaidis[J】。JlnvertebrPathol，2003，82：167—175【74】PatelKR，SmithPF，MarberryWR．ComparisonoflipidsfromSpiroplasmacitriandcornstuntspiroplasma【J】．JournalofBacteriology，1978，136(2)：829～831【75]PoolJE，WongA，AquadroCF．Findingofmale—killingspiroplasmainfectingDrosophilamelanogasterinAfricaimpliestransatlanticmigrationofthisendosymbiont[J】．Heredity,2006，97：27．32[76】RahimianH，GumpfDJ．DeoxyribonucleicacidrelationshipbetweenSpiroplasmacitriandthecomstuntspiroplasma【J】．IntJSystBacteriol，1980，30：605—608[77]RajuBC，NylandGBackusEA，eta1．Associationofaspiroplasmawithbrittlerootofhorseradish【J】．Phytopathology,1981，71：1067-1072[78]RegassaLB，GasparichGE．Spiroplasmas：evolutionaryrelationshipsandbiodiversity[J]．FrontBiosci，2006，1l：2983—3002[79]Rossell6一MoraR，AmannR．Thespeciesconceptforprokaryotes[J】．FEMSMicrobiolRev,2001，25：39—67[80]SaglioP，UhospitalM，LaflrcheD，eta1．Spiroplasmacitrigen．andsp．n．：amycoplasma—likeorganismassociatedwith“stubbom”diseaseofcitrus[J]．IntJSystBacteriol，1973，23：191—204【81]SaillardC，VignaultJC，BovdJM，eta1．Spiroplasmaphoeniceumsp．nov．，anewplant—pathogenic14 文献综述speciesfromSyria[J】．IntJSystBacteriol，1987，37：106·115[82]ShaevitzJM，LeeJY，FletcherDA．Spiroplasmaswimbyprocessivechangeinbodyhelicity[J】．Cell，2005，122：941-945[83】SmithPF，LangworthyTA，MayberryWR．Distributionandcompositionof1ipopolysaccharidesfrommycoplasmas【J】．JournalofBacteriology，1976，125(3)：916—922[84】SokolovaMI，ZinkevichNS，ZakharovIA．BacteriainovariolesoffemalesfrommaMessfamiliesofladybirdbeetlesAdaliabipunctataL．(Coleoptera：Coccinellidae)naturallyinfectedwithRickettsia,Wolbachia,andSpiroplasma[J】．JlnvertebrPathoi，2002，79：72—79[85]StackebrandtE，Frederiksenw，Gm*riWGM，eta1．Reportoftheadhoccommitteeforthere—evaluationofthespeciesdefinitioninbacteriology[J]．IntJSystEvolMicrobiol，2002，52：1043—1047[86】TinsleyMC，MajerusME．Anewmale-killingparasitism：spiroplasmabacteriainfecttheladybirdbeetleAnisostictanovemdecimpunctata(Coleoptera：Coccinellidae)[J】．Parasitology,2006，132：757—765[87]TrachtenbergS．ShapingandmovingaSpiroplasma【J】．JMolMicrobiolBiotechnol，2004，7：78—87【88】TullyJG,RoseDL，ClarkE，eta1．RevisedgroupclassificationofthegenusSpiroplasma(classMollicutes)，withproposednewgroupsXlItoXXIII[J]．IntJSystBacteriol，1987，37：357．364[89】TullyJGRoseDL，YankerCE，eta1．Spiroplasmaixodetissp．nov．，anewspeciesfromlxodespacific乩stickscollectedinOregon[J】．IntJSystBacteriol，1995，45：23—28【90】TullyJG,WhitcombRF,RoseDL，BovgJM．Spiroplasmamirum，anewspeciesfromtherabbittick(Haemaphysalisleporispalustris)[J1．IntJSystBacteriol，1982，32：92—100[91】TullyJG,WhitcombRF,WiliamsonDL，eta1．Sucklingmousecataractagentisahelicalwall—freeprokaryote(Spiroplasma)pathogenicfor,yertebrates[J】．Nature，1976，259：117-120[92】Vazeille—FalcozM，HdliasC，LeGoffF，eta1．ThreespiroplasmasisolatedfromHaematopotasp．(Diptera：Tabanidae)inFrance【J]．JMedEntomol，1997，34：238—24l[93】Wangw，Guw，Dingz，eta1．AnovelSpiroplasmapathogencausingsystemicinfectioninthecrayfishProcambarusclarla"i(Crustacea：Decapod)，inChina【J】．FEMSMicrobiolLett,2005，249：131．137[94】Wangw，GuWjGaspafichGE，eta1．Spiroplasmaeriocheirissp．nov．，associatedwithmortalityintheChinesemittencrab，Erioche扣sinensis【J】．IntJSystEvolMicrobiol，2011，61：703—708[95]WangW，WenB，GasparichGE,eta1．ASpiroplasmaassociatedwithtremordiseaseintheChinesemittencrab(Eriocheirsinensis)【J]．Microbiology,2004，150：3035-304015 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012【96】WayneLG,BrennerDJ，ColwellRR,eta1．Reportoftheadhoccommitteeonreconciliationofapproachestobacterialsystematics[J】-IntJSystBacteriol，1987，37：463-464【97JWedincampJ，FrenchFE，WhitcombRF,eta1．Spiroplasmasandentomoplasmas(Procaryotae：Mollicutes)associatedwithfireflies(Lampyridae：Coleoptera)andtabanids(Diptera：Tabanidae)【J]．JInvertPathol，1996，68：183—186[98】WedincampJrJ，FrenchFE，WhitcombRF,eta1．LaboratoryinfectionandreleaseofSpiroplasmas(Entomoplasmatales：Spiroplasmataceae)fromhorseflies(Diptera：Tabanidae)[J】．JEntomolSci，1997，32：398—402[99]WhitcombRF．EvolutionanddevolutionofminimalstandardsfordescriptionsofspeciesoftheclassMollicutes：analysisoftwoSpiroplasmadescriptions[J】．IntJSystEvolMicrobiol，2007，57(2)：201—206[100]WhitcombRE,FrenchFE，TullyJG,eta1．Spiroplasmaspecies，groupsandsubgroupsfromNorthAmericanTabanidae[J】．CurrMicobiol，1997，35：287-293[101]WhitcombRF,FrenchFE，TullyJG,ela1．Tabanidspiroplasmaserovars【J]．IoMLett，1992，2：115【102]WhitcombRF,HackettKJ，TullyJG,eta1．Tabanidspiroplasmasasamodelformolliculebiogeography【J]．ZblBaktSuppl，1990，20：931-933【103】WhitcombRF,TullyJG,GasparichGE，eta1．SpiroplasmaspeciesintheCostaRieanhighlands：implicationsforbiogeographyandbiodiversity[JJ．BiodiversandConserv,2007，16：3877—3894【104】WhitcombRF,TullyJG,McCawleyP，eta1．Applicationofthegrowthinhibitiontesttospiroplasmataxonomy[J】IntJSystBacteriol，1982，32：387—394[105】WilliamsonDL，TullyJG,WhitcombRF．Serologicalrelationshipsofspiroplasmaasshownbycombineddeformationandmetabolisminhibitiontests[J】．IntJSystBacteriol，1979，29：345—35l[106]WilliamsonDL，SakaguchiB，HackerKJ，eta1．Spiroplasmapoulsoniisp．nov．，anewspeciesassociatedwithmale—lethalityinDrosophilawillistoni，aneotropicalspeciesoffruitfly[J]．IntJSystBacteriol，1999，49：611[107]WilliamsonDL，WhitcombRF．PlantMycoplasmas：acultivableSpiroplasmacausescornstuntdisease【J]．Science，1975，188：1018-1020[108]WilliamsonDL，WhitcombRETullyJG,eta1．RevisedgroupclassificationofthegenusSpiroplasma[J1．IntJSystBacteriol，1998，48：1-】2【109】YuJ，WayadandeAC，FletcherJ．SpiroplasmacirrisurfaceproteinP89implicatedinadhesiontocellsofthevectorCirculifertenellus【J]．Phytopathology,2000，90：716-722【110】陈永萱，薛宝娣，郭永红．蜜蜂螺原体基本性状的研究[J】．中国科学(B辑)，1988，31：16 文献综述815-820【111】董秉义．蜜蜂螺原体病及其防治[J】．蜜蜂杂志，1996，(3)：20—21[112】董秉义，陈永萱，许少玉，等．蜜蜂及植物花螺原体对对蜜蜂的致病性及其血清学关系【J】．南京农业大学学报，1993，16(2)：37．41【113】董秉义，许少玉，祁云巧等．蜜蜂螺原体病的流行病学调查【J]_中国蜂业，1992，(5)：24．26【114】胡冰，贺子义，李霞．螺原体超微形态的电镜研究[J]．电子显微学报，2011，30(6)：547—551【115】回丽静，钟志平，胡冰，等．分离自蜜蜂(Apismellife，日)的三株螺原体的基本特性[J]．微生物学报，2010，50(10)：1366—1372【116]牛庆生，柏建民．蜜蜂爬蜂病及综合防治[J】．养蜂科技，2004，(2)：23．24【117]阮康勤，周秀文，张晶，等．蜜蜂螺原体的分离鉴定及致病性研究【J]．微生物学通报，2007，34(4)：695—699[118]于汉寿，阮康勤，纪燕玲，等．3种植物花螺原体的分离及其基本特性[J]．微生物学报，2008，48(9)：l141—1146[119】赵学昭．蜜蜂螺原体病的危害及防治【J]"养蜂科技，2001，(4)：21．22 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究第一节蜜蜂螺原体分子生物学检测方法的建立摘要：针对引起蜜蜂螺原体病的蜜蜂螺原体Spiroplasmamelliferum，通过对Chelex．100法提取DNA技术的改进，建立了一种PCR快速检测方法，可以在2～4小时内诊断出蜜蜂组织中是否含有螺原体，最低检测浓度为5—6个／mL。该方法与常规分离培养法比较，具有灵敏、快速、高效等优点，可用于检测蜜蜂螺原体可能存在的自然界中的任何样本，为蜜蜂螺原体的检测及资源调查奠定了基础。关键词：Spiroplasmamelliferum；Chelex一100法；特异性扩增；PcR检测日lJ再蜜蜂螺原体病(spiroplasmosis)是由螺原体引起的一种主要危害青壮年蜂的蜜蜂流行病害，患病蜜蜂爬出蜂箱，行动迟缓，失去飞翔能力，三五成群聚集在土洼或草丛中，蜂农一般称之为“爬蜂病”(董秉义，1996)。该病发生于20世纪70年代，在世界各地分布均较为广泛，美国和法国都已证明蜜蜂“螺原体死亡病”和“五月病(Maydisease)”都是由螺原体引起的(Clark，1977；Moucheseta1．，1983；Mouchesetal，，1984)，我国自1986年从患病的意大利蜜蜂(Ap／smellifem)中首次分离到螺原体，至今也己从各地蜜蜂和植物花上分离到多个螺原体菌株，经鉴定它们大多与smelliferum的亲缘关系最近，属于螺原体属(Spiroplasma)d?第1血清组的第2亚组(陈永萱等，1988；董秉义等，1993；于汉寿等，2008；凹丽静等，2010)。该病单独感染蜜蜂发病较为少见，常与孢子虫病、麻痹病等混合发生，病情较重，死亡率较高，蜂群群势下降严重(徐松林，2001)。因此，一套良好的螺原体检测方案对病原体的检测和疾病的防控都非常重要。目前，螺原体检测方法主要有分离培养、显微镜检查、血清学检测以及分子生物学检测4种(钟志平等，2010)。分离培养可用于不同样本及环境中螺原体的分离检测及初步鉴定，但耗时较长，灵敏度低，样本中螺原体较少时不一定能分离到；显微镜检查能观察螺原体的菌体形态、运动情况以及超微结构，但难以检测样本中微量的螺原体，受样本中杂质的影响较大；血清学检测通过抗原抗体特异性反应，能快速、特异地检测螺原体，但是必须有标准菌株的抗体，且制备特异性抗体的方法较为繁琐；应19 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012用分子生物学方法检测螺原体，耗时少，操作简单、灵敏度高且特异性强，是检测螺原体的理想方法。本研究针对蜜蜂螺原体病的主要病原菌Spiroplasmamelliferum，建立了一种基于Chelex．100DNA提取技术的分子生物学快速检测方法，经过多次实验重复，传统检测方法的验证及对其灵敏度的测定，证明该检测方法具有许多其它方法所不具备的优点，可以很好地满足快速检测螺原体的需要。l材料和方法1．1供试菌株蜜蜂螺原体标准菌株SpiroplasmamelliferzgmCH—l(本实验室保存)。1．2蜜蜂来源蜜蜂购自南京市晨光村蜂场，筛选健康的青壮年蜂，人工饲养于实验室。1．3R2培养基的配制液体培养基采用R2培养基(陈永萱等，1988)，配方如下：PPLObroth(Difco公司)2g蔗糖10g酚红(1％)2mL蒸馏水83mL将上述物质准确称取后混合溶解，调节pH到7．3左右，用滤纸过滤，l15。C灭菌30min。待培养基冷却后用孔径为0．22睥l的滤膜过滤加入胎牛血清15mE(预先569C灭活30min)及青霉素钠100mg。固体培养基是在以上配方内加入1．O％(w／v)的琼脂，灭菌，冷却至50"C左右，加入灭活的胎牛血清15mL及100mg青霉素钠。将配好的R2液体培养基分装至无菌的1．5mL离心管中，30"C静置过夜，以检查是否有其它微生物污染。然后4"C保存，备用。1．4蜜蜂螺原体对意大利蜜蜂的感染随机挑取80只健康蜜蜂置于．20℃冷冻2min后，用微量移液器吸取1止(108CCU／mL)已活化的SmelliferumCH—l菌液，迅速从蜜蜂腹部背板第二节间膜注入蜜蜂体内，逐个处理完毕，置室温通风处饲养观察，24h后去除因机械损伤致死的蜜蜂。1．5蜜蜂组织DNA的提取 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究采用Chelex一100法提取蜜蜂组织总DNA，略加改进。(1)样品前处理随机挑取几只感染螺原体菌液致死的蜜蜂，于l％次氯酸钠中表面消毒3min，无菌水洗涤数次；取其腹部分别于2mLR2液体培养基中碾碎，浸泡5．10min后，。用中速定性滤纸过滤于2mL离心管中。按相同方法取健康蜜蜂的腹部，碾碎后过滤于另一离心管，将滤液离心(13000r／min，4。C，30min)，取沉淀。(2)模板DNA提取向装有样品的管中加入50．100gL5％Chelex一100，100rtg／mL蛋白酶K，剧烈震荡数秒后，将混合物置于56。C水浴2h，期问震荡混匀几次；取出剧烈振荡10S，99℃水浴8min(严格控制)；取出后再剧烈振荡10S，13000r／min，4。C，离心15min；将上清夜移至干净离心管中备用(用于PCR反应或一20。C保存)1．6螺原体特异性16SrDNA序列的扩增及检测利用螺原体16SrDNA特异性引物F28(5’．CGCAGACGGTTlAGCAAGTTTGGG-3’)和R5(5’一AGCACCGAACTTAGTCCGACAC．3’)进行扩增(Bastianeta1．，2004；Nunaneta1．，2004；Wangeta1．，2005)。PCR反应体系：DNA模板lgL、10xbuffer2．5肚L、M92+1．5l-tL、dNTP(10mM，2．5mMeach)2p．L、上下游引物各2旺、Taq酶(5U／LtL)O．25gL，)JHddH20至25止。反应程序为：96℃预变性2min，94℃变性1min，65℃退火1rain，72。C延伸1．5rain，共30个循环，最后72。C延伸10min。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检N(85V，30min)(Wangeta1．，2005)。1．7分子生物学快速检测方法的灵敏性测定利用直接计数法在暗视野显微镜下对生长至对数生长期的SpiroplasmamelliferumCH-1菌液进行计数。然后将该茵液依次做10倍稀释，利用Chelex一100法提取不同浓度螺原体菌液的DNA，并进行PCR扩增、电泳检测。(1)螺原体计数取10此菌液于载玻片上，小心盖上20×20rllrn的盖玻片，用暗视野显微镜在1000倍下直接计算螺原体的数目。计数时，若菌体过多或成团，可事先做一定程度的稀释或振荡使菌体散开。每视野内的菌体数取随机5—10个视野内菌体的平均数。(2)样品前处理取lmL对数生长期的螺原体茵液，13000r／min，4。C，离一tj,301TIin。(3)模板DNA提取沉淀中加入50ttL5％Chelex一100，剧烈震荡数秒后，将混合物置于56℃水浴30 李葭蜜蚱蝶原体的幔染衙g世，￡0：蜜蚌件内的定巯研究20L2min，期问震荡混匀几次；取出剧烈振荡10s，99"C水浴8min(严格控制)；取出后再剧烈振荡10s，13000r／min，4"C，离一D15min；将上清液移至干净离心管中备用，-20℃保存，尽快扩增。(4)PCR：J『-增及电泳检测均与上述对蜜蜂组织的处理方法相同。1．8分子生物学快速检测方法与常规分离培养法的比较随机挑选30只感染螺原体菌液致死的蜜蜂，于1％次氯酸钠中表面消毒3min，无菌水洗涤4次：取蜜蜂腹部，用无菌剪刀将其剪开，YRA5mLR2液体培养基中碾碎，浸泡5．10min后，均分两份，一份J{J于分离培养(／I]}L径o45pm的微孔滤膜过滤于含500lLL新鲜培养基的离心管巾，置30"C培养，逐阿观察培养基颜色变化，同时用暗视野显微镜观察验证，持续观察1个月)，一份川建立的分子生物学快速检测方法进行检测。2结果与分析2．1蜜蜂体内螺原体特异性16SrDNA的扩增利用螺原体特异性16SrDNA0]物F28十‘iIR5nJ"以从随机挑选的注射蝶原体苗液致死的蜜蜂体内扩增H{长度蔓J271bpfl‘J特异件片段，而社健康蜜蜂和证常死亡的蜜蜂体内均未扩增龇以Escherichchiacoli和Bacillussubtilis的总DNA为模板也未能扩埔出目标条带(图1一”。图1．1螺原体特异性16SrDNA在蜜蜂组织基因组中的扩增图谱M：MarkerDL2000；I．6：感染蝶原体的，E蜂的腹部：7J『·常北亡的蜜蜂腕部，8：Escherichcldacoli(阴性对}M)；9：BaciUussubglis(驯性对j!【i)，10：PCR空门对煦Fi91-1．Spiroplasma—specificl6SrDNAsequencesamplifiedfromgenomeofhoneybeetissuesMMarkerDL2000；1．6：Theabdomenofhoneybeesinfectedwithspimplasma；7Theabdomenofhoneybeesuninfectedwithspiroplasma；8：Ecoil(negativecontr01)；9：且subtills(negalivecontr01)；10：PCRblankcontrol 第一章蜜蜂螺原体在自然羿的侵染循环qf究2．2分子生物学快速检测方法的灵敏性不同浓度螺原体菌液的DNA经螺原体特异性16SrDNA}l物扩增后，得§U271bp的目标条带，条带的亮度在紫外灯下随浓度变化呈明显的梯度变化，浓度越高其条带越亮，最低检测浓度为5～6个／mL(图1—2)。2．3分子生物学快速检测技术与常规分离培养方法的比较利用分子生物学快速检测技术和常规分离培养法对感染螺原体菌液致死的蜜蜂腹部进行同时检测，结果如袭1—1所示：在供试的30个样本中，利用分离培养法检测出23个样本含菌，利用PcR则在28个样本中检测到蝶原体。图1-2不同稀释度菌液中螺原体特异性的】69rDNA片段MMarkerDL2000；1对数生KJ叭暂液(596×108个Imb)；2-9：将对数生K期菌液依次】0倍稀释(596×107～596个，mL)Figt-2Spiroplasma-specificl6SrDNAsequencesamplifiedfromspiroplasmacultureswithdifferentdilutionsM：MarkerDL2000；】：Spiroplasmainlogarithmicgrowthphase(596×105／mL)：2—9：Thespiroplasmainlogarithmicgrowthphasef01lowedbyl0-foIddi[uted(596X】04～596／mL) 李霞蜜蚌螺腺体的侵染循环厦j‘n蜜蜂体自的定殖目f宄2012表】-l利用分离培养和分子生物学快速植测方法对盛染螺原体菌液致死的蜜蜂的检测Tabiel-1．Thedetectionofhoneybeesinfectedwithspiroplasmausingisolatedcultureandmolecularbiologyforrapiddetectionmethod供试霄翻样本数检出肯雨样本数检测方法TotalnumberofDetectednumberof检山率C¨)Detect[onmethodspiropl罄ma-infectedspiropl雒ma·infectedDetectionrate(％)。．。盏黧‰。30z，，s，⋯盆翟裟“。。3028933图l一3螺原体特异性16SrDNA在接种螺原体菌液的蜜蜂基因组中的扩增图谱MMarkerDL2000；I-15(在、“)：感染螺原体的蜜蜂的腹部Fi91-3．Spimplasma·specificl6SrDNAsequencesamplifiedfromgenomeofhoneybeesinjcotedwithspiroplasmaMMarkerDL2000；】-15(]eft、right)：Theabdomenofhoneybeesinfectedwithspiroplasma 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究第二节蜜蜂螺原体在自然界的分布调查摘要：为了探索蜜蜂螺原体在自然界中可能的传播途径及其侵染循环，本研究采用分子生物学检测方法和分离培养技术定期对蜜蜂及自然界中蜜蜂经常活动的场所中的材料、植物花及其它一些相关昆虫进行检测。从2010年3月到2012年1月，共采集了1339只意大利蜜蜂、131种昆虫、51种植物花和77个从蜂箱内采集的样本，并在其中92个样本中检测到螺原体，分离获得54株螺原体菌株。我们在一年四季(包括蜜蜂螺原体病发病时期和非发病时期)采集的蜜蜂样本中均检测到螺原体，以在春季、发病时期病蜂体内检测到的含菌样本数最高，此外，在发病时期采集的蜜蜂幼虫、蛹、植物花、其它昆虫、蜂房、巢门、巢脾等样本中，均检测到螺原体；在非发病时期，则仅在蜜蜂体内发现螺原体。初步认为蜜蜂螺原体长期存在于蜜蜂体内，主要通过水平传播方式进行传播。本研究为进一步揭示我国螺原体资源多样性、蜜蜂螺原体的侵染循环、蜜蜂螺原体病的流行规律以及该病的防治提供了科学依据。关键词：螺原体；Chelex一100法；分离；培养；分布调查日lJ昂．1976年Clark等在美国Maryland州从蜜蜂体内分离到一种螺原体，它能引起一种新的蜜蜂病害，导致春季蜜蜂大量死q15(Clark，1977)。随后在美国各州及法国、秘鲁、匈牙利、牙买加、摩洛哥、中国台湾及大陆都陆续分离到这种螺原体(Clarketa1．，1985；Moucheseta1．，1982；Rajueta1．，1980；Whitcomb，1980)。1985年，Clark等将其定名为Spiroplasmamelliferum(Clarketa1．，1985)，此外在膜翅日、双翅目、鳞翅目昆虫及植物花表面也分离到同样的螺原体(Rajueta1．，1980；李霞等，2012)，它们都能引起蜜蜂螺原体死亡病(Spiroplasmosis)。另外，在法国还发现一种蜜蜂病害——五月病(Maydisease)，它是由另外一种螺原体——．跏iroplasma印西引起的(Moucheseta1．，1982；Moucheseta1．，1984)，该螺原体与Smelliferum无血清学关系，属于第Ⅳ血清组。我国自1986年首次从患病蜜蜂中分离到蜜蜂螺原体Smelliferum以来，已从各地多种昆虫及植物花上分离到这种螺原体，感染实验证明：该螺原体对蜜蜂有强烈的致病作用(董秉义等，1993；‘阮康勤等，2007)。那么，这种螺原体在自然界的昆虫中、昆虫与植物花间以及蜂群和自然界之问是如何传播的?它们究竟从何而来?是否长期(越冬、越夏)存在于蜜蜂体内?这些螺原体被带入蜂群后，又如何传播而引起蜜蜂病害?它们能否像果蝇螺原体Spiroplasmapoulsonii一样进行垂直传播?本研究从2010年3月到2012年1月，定期对不同生长阶段、健康状况的蜜蜂及25 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012自然界中与蜜蜂活动相关环境中的材料、植物花及其它一些相关昆虫进行检测，为揭示蜜蜂螺原体在自然界中的传播途径、蜜蜂螺原体病的流行规律及防治提供了重要的线索。1材料和方法1．1定期(包括发病季节与非发病季节)采集蜜蜂螺原体在自然界中可能存在的样本从2010年3月到2012年1月，在南京及周边地区定期(包括蜜蜂螺原体病的发病季节与非发病季节)采集一些蜜蜂(健康蜜蜂、病蜂、死蜂)、相关昆虫、植物花、花粉、蜂蜜、卵、幼虫、蛹、幼蜂等样本，并用无菌湿棉球擦拭的方法对巢房、巢脾、巢门、隔板、覆布、沙盖等进行随机采样以检测螺原体的存在情况。1．2利用分子生物学方法检测样本中螺原体的存在利用已建立的分子生物学检测方法对所采集样本进行快速检测，幼虫、幼蜂等样本的前处理方法同蜜蜂，蜂房、花粉以及用无菌湿棉球擦拭的巢门等样本则在4mLR2培养基中浸泡并间歇晃动1h后，将滤液收集于离心管中。之后，模板DNA的提取、PCR扩增及电泳检测均与第一节中对蜜蜂组织的处理方法相同。1．3螺原体的分离及纯化1．3．1蜜蜂等昆虫螺原体的分离将采集到的健康蜜蜂、病蜂、相关昆虫以及蜜蜂的卵、幼虫、蛹等样本先用l％的次氯酸钠表面消毒3min，无菌水洗涤4次；再用无菌的剪刀将蜜蜂等昆虫的腹部剪下，用无菌解剖刀剖开后取其肠道，放入含有5mL的I也液体培养基的研钵里碾碎；浸泡5min后，用孔径0．45gm的微孔滤膜过滤，滤液收集于含500此新鲜培养基的离心管中；于30。C静置培养，逐甘观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜(OlympusBH一2)观察验证，持续观察1个月。1．3．2植物花螺原体的分离将随机采集的植物花，盛放于干净的保鲜袋中，3—5朵花为一个样品，避免用手直接接触样品，扎紧样品袋口后带回实验室立刻分离。用无菌镊子轻轻将样品取出，并将花瓣分离后浸泡于含5mL左右R2液体培养基的无菌平皿中，轻轻转动约2—5min后，将浸泡过的培养基用孔径为0．45gm的微孔滤膜过滤，滤液收集于无菌的1．5mL的离心管中，于30。C静置培养；逐日观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜观察验 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究证，持续观察1个月。1．3．3蜂箱内部样本中的螺原体的分离将在蜂房、巢脾、巢门、隔板、覆布、沙盖上采集的样本于含5mLR2液体培养基的研钵中浸泡l一2h，将浸泡过的培养基用孔径为0．45gm的微孔滤膜过滤，滤液收集于无菌的离心管中，于30。0静置培养；逐日观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜观察验证，持续观察1个月。1．3．4螺原体纯培养物的获得采用梯度稀释法获得螺原体的纯培养物(Regassaeta1．，2006)。将生长至对数生长期的菌液用R2液体培养基作l：10梯度稀释，然后于30。C静置培养，逐日观察培养基颜色变化，至最后变色一管生长至对数生长期，再将该管作梯度稀释培养，如此反复3次，即可获得纯培养。1．4螺原体的保藏1．4．1甘油保存法将对数生长期的供试菌株与30％甘油溶液等体积混合，于．20℃冷冻保存。1．4．2滤纸片保存法将直径为7mm左右的滤纸片灭菌烘干，滴加数滴对数生长期的菌液，于室温无菌条件下晾干后装入无菌的离心管中，．20℃保存。1．4．3冷冻干燥保存法(1)准备安瓿管将购买的安瓿管洗净烘干后，管口塞上棉花，灭菌备用。(2)保护剂的制备用脱脂奶粉配兑成10％的脱脂牛奶，115℃，灭菌10min，备用。(3)菌悬液的制备取2mL稳定生长期的螺原体菌液，13000r／min，离心2min，弃上清后，加入1．5～2mL保护剂，充分振荡混匀，制成菌悬液。(4)样品分装用无菌长滴管将悬浮液分装入安瓿管底部，每管约装0．5mL。(5)预冻将分装好的安瓿管从室温一4℃一．20℃一一70℃逐步降温。(6)真空干燥预冻以后，将安瓿管放入真空器中，启动真空泵抽气直至样品干燥(样品表面出现裂痕，与安瓿管内壁有脱落现象)。(7)封管将上述抽干后的安瓿管装在歧形管上，在真空条件下用火焰熔封安瓿管。27 李霞蜜蜂螺原件的侵染循环及j#n蜜蜂件内的定殖日f兜2012(8)保藏将做好的安瓿管置于低温条件下保藏。2结果与分析21自然界中采集的各类样本及其螺原体含菌率从2010年3月到2012年1月，我们在南京地区共采集了608只健康的意大利蜜蜂、488只瘸蜂(366个样本)、243只死蜂(201个样本)、131种其它昆虫、51种植物花和77个从蜂箱内部采集的样本(图1-5，表1—3)，共计1434个样本(图1—4，表1．2)。通过分离培养和分子!L物学检测，兆从92个样本中检测到了螺原体。各类样本的古菌率分别为健康蜜蜂148％、病蜂1475％、死蜂796％、其它昆虫O76％、植物花784％、卵、幼虫、蜂房等其它样本总含菌率1039％(图1-6)。图1．4自然界中采妻的各类样本Fi91-4Varioussamplescollectedinnature图1．6各类样本的含菌率Fi91-6Spiroplasmacontentrateofvarioussamples圈I．5蜂箱内采集的样本种类及数量FigI一5．Thevarietyandquanti竹ofthesamplescollectedwithinbeehive闩¨¨U喾一““m“％““““≯篡警 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究表1-2蜜蜂、植物花及其它相关昆虫中的螺原体的统计结果Table1-2Thestatisticalresultsofspiroplasmasinhoneybees，flowersandotherinsects注：+：一个样本包含3只蜜蜂；++：一个样本包含一种昆虫或植物花；N：采样时没有发病的蜜蜂：nd：朱检测；分子为含菌的样本数；分母为不同时期采集的各类样本的总数；括号内数字是利用分子生物学方法检测的样本数。Note：}·Threehoneybeesasasample；+}’Onekindofinsectorplantflowerasasample；N：Nodiseasedhoneybeeswhensampling；nd：Notdetected；Numeratorrepresentsthenumberofthebacterialsamples；Thedenominatorrepresentsthetotalnumberofallkindsofsamplescollectedindifferentperiods；Figuresinbracketsarethenumberofsamplesdetectedbyusingmolecularbiologicalmethods．29 李霞蜜蜂螺原箜塑堡鲞堡墅墨茎垄窒堕堡堕堕室堕婴窒丝!!———-●●________——_—————-——————————————————————————————————————————————————————————————————————————一表1．3蜂箱内样本中的螺原体的检测结果Table1-3Thetestresultsofspiroplasmasinsampleswhichcollectedwithinthebeehive巢门Nestd。。ro／6(0／2)1／3沙盖Sandcover隔板Barricade覆布Covercloth巢脾Honeycomb卵Egg幼虫Larva蛹Pupa幼蜂Immaturebee雄蜂Drones蜂王Queenbee花粉Pollen蜂蜜Honey0／2O／5o／5蜂胶Prop0Iiso／1埘注：分了为含菌的样本数；分母为不同时期采集的各类样本的总数；括号内数字是利用分子生物学方法检测的样本数：nd：未检测。Notc：Numeratorrepresentsthenutuberofthebacterialsamples；Thedenominatorrepresentsthetotalnumberofallkindsofs枷DIescollectedindifferentperiods；Figuresinbracketsarethenumberofsamplesdetectedbyusingmolecularbiologicalmethods；nd：Notdetected．2．2不同季节中各类样本的螺原体含菌率我们根据南京一年四季温度的变化，将其划分为春(3—5月)、夏(6—8月)、秋(9一11月)、冬(12—2月)4个季节。如图】一7所示，蜜蜂螺原体一年四季均存在丁蜜蜂体内。3—5月是蜜蜂螺原体最易检测到的季节，含菌率最高(图】一8)，采集的各类样本中均含有螺原体，其中以病蜂体内的含菌率最高，达26．92％；6—8月采集的病蜂、死蜂和植物花样本中也均含有螺原体；9．11月和12—2月份则分别只在病蜂和死蜂体内检测到螺原体。30。3，也4％2q眈q叭叭叭躬叭叫似删毗叭州叭∽们叭眈埘咀叭州 第一章蜜蜂螺蠓体a自然界的侵染循环日}究图1．7各类样本在不同季节的含菌率Fig[一7Spiroplasmacontentrateofallkindsofsamplesindifferent$easoBs图1．8各类舍茁样本在不同季节采集的总样本中所占的比重“8“”“””“””“”““：Z裟蛊萎侧““““““⋯“⋯”““2．3不同时期(发病与非发病时期)各类样本的螺原体含菌率在2010-2011年，南京地区的蜜蜂螺原体病一般于4月底到6门初暴发，如图1—9所示，发病mt,J-l,g]采集的样本的总含苗率远_人HF发病时刺，发病州期采集的各类样本中均含有螺原体，tt；,11病蜂、≯E蜂、植物花和蜂箱内采集的样本的含菌率都比较高，健康蜜蜂次之，昆虫最低；：||!发病时期则只在蜜蜂体内榆测到螺原体(圈1—10)。不同时期所检测到的含菌的样术均-{：要为瘸蜂，死蜂次之，健康蜜蜂体内在不涮时期也均能检测到螺原体(图1—11)。一。触一鸵|香触雅斛黼一口．__a¨一=一一霍曩⋯一■Ⅲ口■■■一Ⅲ慨㈣mⅢ饯啡“啦假 车霞蜜蜂螺艇件的侵染循环胜jl枉蜜蜂件内的定巯”f究2012睡一鼹图1．9各类含菌样本在不同时期采集的总样本中所占的比重Figl一9TheproportionofvarkiusspiroplasmasamplesinthetotalsamplescollectedIndllienntDerloosⅢ梦毒。图l_10各类样本在不同时期的舍茴率Figl·IOSpiroplasmaco,tentratcofallkindsofsamplesindifferentperiods图1．1l各娄舍菌样本在不同时期采集的总含菌样本数中所占的比重“n。1”“⋯”““”“3“””⋯。裟糕：怒盅““““”””“⋯5“⋯6。“””oq悯删黼槭簟■■■■I—I_I∥口扩．伊p匕眵帆洲嗍螂麒皑 第一章蜜蜂螺原件枉自然抖的侵染循环研究2．4利用不同方法检测的各类样本我们利用建立的分子生物学检测方法对所采集的505个样本(包括327个健康蜜蜂样本、108个病蜂样本、57个死蜂样本、13个蜂箱内采集的样本)进行检测，在其中38个样本中检测到螺原体；利用分离培养法在929个样本(281个健康蜜蜂样本、258个病蜂样本、144个死蜂样本、个健康蜜蜂样本、258个病蜂样本、144个死蜂样本、131个昆虫样本、51个植物花样本、64个蜂箱内采集的样本)中检测到54个样本含菌。利用不同方法检测的样本中各类台菌样本所占比重如图1一12所示，利用分子生物学方法检测的样本的台菌率较高，这也可能是分子生物学检测方法更为灵敏的缘赦。图1．13、1-14、1．15分别为利用分子生物学检测方法对发病季节2011年4月、2011年5月及非发病季节病蜂体内螺原体的检测图谱。图I．12利用不同方法检测的各粪含菌样本在总样本数中所占的比重阱12Th。⋯№ofva’i咖ousspdiirmop”lansmtma“samplsesilIt㈨4㈨plesd。tected基图1．13螺原体特异性16SrDNA在患病蜜蜂基困组中的扩增图谱M：100bpDNALadder，I24：2011年4月份采集的病蜂样本FigI一13Spiroplasma-speeificl6SrDNAsequencesamplifiedfromgenomeofdiseasedhoneybeesM：IOObpDNALadder：I一24：DiseasedhoneybeesamplescollectedinApril2011 李霞蜜蜂螺腺体的侵染循环投jE∞蜜蚌件内的定殖口院2012^I12345678910Ill21314151617271bp图I-14螵原体特异性16SrDNA在患病蜜蜂基因组中的扩增图谱M：MarkerDL2000：I-172011年5月份采集的痈蜂样本Figl-14Spiroplasma—specificl6SrDNAsequencesamplifiedfromgenomeordiseasedhoneybeesM：MarkerDL2000；】_17：DiseasedhoneybeesamplescollecledinMay20II^Il234567891011121314151617271bp图I-I5螺原体特异性16SrDNA在患病蜜蜂基因组中的扩增图谱MMarkerDL2000；】-6：2010年】O川采集的忠摘蜜蜂，7．12：2010年II川采集的患病蜜蜂：13-172010年12月采集的忠病蜜蜂Figl-15Spiroplasma-specifiel6SrDNAsequencesamplifiedfromgenomeofdiseasedhoneybeesM：MarberDL2000；I一6DiseasedhoneybeesamplescollectedinOctoher2010．7-】2：DiseasedhoneybeesamplescollectedinNovember2010：13-17：DiseasedhoneybeesamplescollectedmDecember20102．5螺原体的分离、纯化及保存利J；|]分离培养方法对采集的部分样本进行螺原体的分离，结果从健康蜜蜂、病蜂、死蜂、植物花、昆虫、蜂房、巢门、幼虫和蛹l；|】共分离到54株螺原体。聚J{J梯度稀释法对蝶原体分离物纯化3次后得到纯茼株。将纯化后的菌株采用H；同方法进行保存。．20"C下¨油保存方法最为快速、简便，葡株在‘年后活化，仍‘LK良好，是最常儿j的保臧螺原体的方法；滤纸J}保减的菌株在4年后仍有部分可以活化；若要长时问保减菌株，冷冻干燥保减法应是最适合的，该方法是长期保减菌种的主要方法，对大多数微生物的保减效果都较好，保藏的螺原体菌株活化后生命力还较旺盛。 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究第三节螺原体在蜜蜂与植物花问传播途径的研究摘要：本研究模拟蜜蜂螺原体在自然界中可能存在的水平传播方式，采用人工接种螺原体的方法，对螺原体在蜜蜂和植物花间的传播途径进行了研究。结果显示：体内含螺原体的蜜蜂可以通过采食花蜜的方式将螺原体传播到植物花表面，而花表的螺原体又可以通过蜜蜂的采食传播到蜜蜂体内以及其它植物花的表面，传播到蜜蜂体内的致痈}生菌株可以引起蜜蜂的“爬蜂”症状，而植物花未表现出任何病状。该结果为研究蜜蜂螺原体在自然界的传播途径提供了直接的证据。关键词：螺原体；蜜蜂；植物花；传播途径前言目前发现的螺原体绝大多数是从具有咀嚼式口器、舐吸式口器及刺吸式口器的昆虫中分离到的，虽然现在尚没有证实这些分离物是否对植物致病，但是螺原体通过具有刺吸式口器的宿主将它带入植物内部引起病害的可能性是存在的(Regassaeta1．，2006)。已发现的三种植物致病性螺原体就是通过具刺吸式门器的叶蝉传播的(Daniels，1983；Markham，1983)。此外，植物花上的螺原体证实与昆虫之问有密切的联系。I一2亚组中的花螺原体菌系和昆虫中分离到的菌系极其相似，它们在自然界中出现的时间相同，对蜜蜂均有致病性(董秉义等，1993)；与I一6亚组中的花螺原体相似的菌系从几种昆虫中也分离至lJ(Hacketteta1．，1984)；另外，在组Ⅳ中与蜜蜂“五月病”螺原体相似的菌系在花卜也广泛存在(Mouches，1983)。然而，植物花螺原体对植物是否产生影响?它们究竟从何而来?在自然界中是如何传播的?这些问题尚不清楚。目前一般观点认为，花上螺原体可能是携带螺原体的昆虫在取食花蜜或花粉时留下的，花仪是作为定居场所在昆虫传播中起作用(Hackereta1．，1984)。本研究模拟自然环境，采用人工接种螺原体的方法对螺原体在蜜蜂和植物花问可能的传播途径进行了研究，为进一步研究螺原体在自然界中的传播途径提供直接的证据。1材料与方法1．1供试菌株蜜蜂螺原体SpiroplasmamellifeFunCH一1。 李霞蜜蜂螺砸件的侵染循环艟，￡n：蜜蚌休内的定毓qf究20121．2螺原体在蜜蜂与植物花上传播途径的研究12l健康植物花的获得2010年10月种植一批油菜，在次年3月丌花之前，将其移入封闭的大棚中，避免与外界昆虫的接触。l2．2蜜蜂体内螺原体在植物花问的传播(处理一)在油菜丌花之际，采用注射接种法接种螺原体CH一1到健康蜜蜂体内，然后将带菌蜜蜂放入盛有健康植物花的大棚中，每两天放入一批相同处理的带蔺蜜蜂，对照组植物花巾则放入不经任何处理的健康蜜蜂．每组放俺18笳油菜花，隔I～2天采川Chelex．100法检测～次恤物花上蝶原体的存在情况。12．3植物花上螺原体在蜜蜂与植物花之间的传播(处理二)在封闭大棚的左右两边分别放咒18Zi健康油菜花，然后将对数生长期的蜜蜂螺原体CH-l菌液喷洒种：任意一边的ilfI菜花表面，每天l赏2次，再向大棚内放入100只健康的意大利蜜蜂，对照组的植物花表则不喷洒蝶原体菌液，观察记录蜜蜂的症状，并每隔1～2灭采用Chelex—100法检测⋯次患病蜂体内及未喷洒螺原体菌液的植物花J二螺燎体的存在情况。2结果与分析2．1蜜蜂体内螺原体在植物花间的传播以5朵花为一个样本，利用螺原体特异性引物F28和R5，∈对49个植物花样本进行了扩增，其|=|_J有14个样水扩增出了蝶原体16SrDNA片段(图1-16、I—17)，实验组含菌率达到286％：对照组样本中却未能扩增出该片段(图1．18)。nI12j4s6789Io111213141516图I-16螺原体特异性16SrDNA基因在植物花中的扩增条带MMarkerDL2000；1—16处理实转纰中随机挑J0c的植物花样水Fig-l一16Spiroplasma-specificl6SrDNAsequencesamplifiedfromspiroplasmaofflowersM：MarkerDL2000；l-16：Plantflowersamptesrandomlypickedintheexperimentalgroupofthefirstprocessing22植物花上螺原体在蜜蜂与植物花之间的传播 第一章藿蚌螺原休在自然抖的侵染循环qf究实验组中的意大利蜜蜂在第4天时出现症状，患病蜜蜂不能飞翔，只能在地上爬行，翻身后自己较难翻回，很快便抽搐死亡。利用螺原体特异性16SrDNA引物从病死蜜蜂体内扩增出了长度约270bp的特异性片段，并且从未喷洒螺原体菌液的35个植物花样本表面扩增出该片段(图1-19)，含菌率达614％，对照组中『F常死亡的蜜蜂体内及植物花表面却未能扩增出(卜18)。图I-】7螺原体特异性16SrDNA基因在植物花中的扩增条带M：MarkerDL2000；l-15：处理一实验组中随机挑取的的植物花样奉Fi91—17Spiroplasma-specificl6SrDNAsequencesampIifiedfromspiroplasmaofflowersM：MarkerDL2000；I-15：Plantflowersamplesrandomlypickedintheexperimentalgroupoflhefirstprocessing图I—i8螺原体特异性16SrDNA基因在植物花和蜜蜂中的扩增条带MMarkerDL2000；I—10：处理中埘』!({自l巾随机挑墩的植物花样奉；11．19处理一对‘暾自忡随机挑取的植物花样术，20-27：处理_对}暾纽中随机挑舣的正常北l’：的蜜蜂样本Fi91-18Spiroplasma-specificl6SrDNAsequencesamplifiedfronlspiroplasmaofflowersandhoneybeesMMarkerDL2000；I-10：Plantflowersamplesrandomlypickedinthecontrolgroupofthcfirstprocessing；lI·19：Plantflowersamplesrandomlypickedinthecontrolgroupofthesecondprocessing；20—27Honeybeesamplesuninfectedwithspiroplasmarandomlypickedinthecontrolgroupofthesecondprocessing 李霞蛊蝽螺娘体的侵染循环投j￡a蜜蜂体内的定巯目f究2012271bp图I．19螺原体特异性16SrDNA基因在植物花和蜜蜂中的扩增条带M：MarkerDL20flfl；1．2处理一实验自1中随机挑取的植物花样本：3-10：处理．二实验}11中随机挑墩的植物花样本．20-27：处理一实验组中随机挑取的，E蜂样本Fig．1—19Spiroplasma-specificl6SrDNAsequencesamplifiedfromspiroplasmaofflowersandhoneybeesM：MarkerDL2flfl0；I．2：Plantflowersamplesrandomlypickedintheexperimentalgroupofthefirstprocessing；3—10：Plantflowersamplesrandomlypickedintheexperimenlalgroupoflhesecondprocessing；20-27：Dcadhonoybeesamplesrandomlypickedinlheexperimentalgroupofthesecondprocessing； 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究第四节分离自不同宿主中螺原体的基本特性摘要：；k2010年5～6月在蜜蜂和植物花表面分离到的菌株中，选取7株分离自不同宿主(患病蜜蜂、健康蜜蜂、死蜂、打碗花、楝树花、一年蓬、蓼科植物花)的螺原体菌株，对其形态学、运动性、基本生物学特性、血清学及分子生物学特性进行了研究。结果发现：分离菌株均具有典型的螺旋形和运动性，都能通过孔径为0．22gm、0．45gm的微孔滤膜；在含氨苄青霉素钠(2000U／mL)白01R2"；#．4,g$3-养基中均生长良好；它们都能利用葡萄糖、D一果糖作为碳源；都不能利用尿素；代谢精氨酸的能力有所差异。其中，分离菌株MFl006、YNPl001、LKl001的生长速度较快，生长周期较短，它们在37℃下不能生长，最适温度范围比其余4株菌略低，7株螺原体菌株在25～32℃下均能大量增长。代谢抑制试验、菌体变形试验和ELISA试验的结果均一致表明：螺原体菌株SpiroplasmamelliferumCH一1的抗血清对菌株MFl006、YNPl001、LKl001几乎没有抑制作用，与其发生的反应较弱，与其它4株菌发生的反应却比较强，能够抑制菌株的生长；ZHUF0901抗血清和MF0905抗血清则分别与MFl006，YNPl001和LKl001发生较强的反应。根据16SrDNA和ITS序列构建的系统发育树显示：MFl006、YNPl001与sap／s聚为一类；LKl001与＆clarkii聚为一类；其它4株菌则都与＆melliferglm聚类。此外，通过饲喂菌液法接种，发现感染供试螺原体菌株(MFl006、YNPl001、MFl008)的意蜂(Apismellifera)在第5d时均开始出现“爬蜂”症状，但在相同的实验条件下，感染MFl006及Ⅵ岬1001菌液的蜜蜂的发病速度较快。到第9d时，感染供试螺原体菌液的实验组意蜂的死亡率均明显高于对照组的意蜂(饲喂新鲜培养基)，与对照组意蜂在1％显著水平下相比差异均极显著。以上结果表明同一时期同一地区的蜜蜂和植物花样本中所含的螺原体均不止一种；不同宿主中的螺原体均分别与sapis和smelliferum聚类，进一步证实螺原体在自然界中可通过水平传播方式进行传播；分离菌株MFl006、YNPl001及-MFl008对意蜂均具有较强的致病性，其中，菌株MFl006和YNPl001则分别是在我国蜜蜂和植物花上发现的除smelliferumE],外的另一种致病螺原体。关键词：螺原体；生物学特性；血清学特·tg；系统发育分析；蜜蜂；致病性．t．L．—JL目IJ吾螺原体(spiroplasma)是一类螺旋状、能运动、无细胞壁的原核生物，菌体直径通常为100,---250Fim，长度为3"---5pm，基因组大小在780～2220kbp之间(Carleeta1．，1995)，是目前所知原核生物中能独立生活和自我复制的最小微生物之--(Regassaet39 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012a1．，2006)。它属于细菌域(Bacteria)；厚壁菌f-J(Firmicutes)；柔膜菌纲(Mollicutes)；虫原体目(Entomoplasmatales)；螺原体科(Spiroplasmataceae)；螺原体属(Spiroplasma)。国际柔膜菌纲分类委员会规定，确定一个分离物是否属于螺原体属需要从形态学、基本生物学特性、血清学、分子生物学几个方面进行验证(IcSB，1995)。其形态学特征主要包括观察螺原体的运动性、螺旋性及利用透射电子显微镜观察螺原体没有细胞壁而只有单层细胞膜包裹的性质；生物学特性包括：所有螺原体都能通过0．22pm的微孔滤膜，都能利用葡萄糖作为碳源(Edwardeta1．，1975)而抵抗浓度大于500U／mL的氨苄青霉素钠，都不能水解尿素(Razin，1983)，对精氨酸的利用能力螺原体种间差异较大(Baffle，1983)，而螺原体的生长是否需要胆固醇这～特性作为螺原体的分类特征目前已受到置疑(Roseeta1．，1993)，此外，螺原体生长的温度范围、最适生长温度、生长速率也属于螺原体的基本牛物学特性，并与其自然宿主密切相关。螺原体的G+C含量是分子生物学特性中要描述一个螺原体新种必须要测定的一项，一般在24％～31％之间变化，采用溶解温度法进行测定。此外，螺原体基因组大小的测定及16SrDNA的序列分析被推荐使用，螺原体基因组大小在780～2220kbp之间变化，16SrDNA的序列分析则能快速确立分离菌株的分类地位(Gasparicheta1．，2004)。自国际细菌分类学委员会(ICSB)在修订的螺原体分类的最小标准中规定用血清学分析来替代基因组DNA．DNA杂交后，螺原体的血清学分析便成为目前螺原体分类的基础。常用的血清学方法有菌体变形试验(deformationtest)(Williamsoneta1．，1978)、代谢抑制试验(metabolisminhibitiontest)(Williamsoneta1．，1979)、生长抑制试验(growthinhibition)(Whitcombeta1．，I982)、互补固定试验(complementfixationtest)、沉淀环试验(precipitinringtest)、免疫电泳(imrnunoelectrophoresis)和酶联免疫吸附反应(ELISA，enzyme—linkedimmunosorbentassay)(Williamsoneta1．，1983)，其中常用于螺原体分类的是菌体变形试验、代谢抑制试验、生长抑制试验和酶联免疫吸附反应(ELISA)。待测菌株应至少使用2种血清学方法与可疑属内所有种做血清学分析。2004年，Gasparich等基于16SrDNA序列构建了一个包含36个螺原体新种及虫原体目其它成员的进化树，并根据进化树将虫原体曰分成四个进化枝：Mycoides—Entomoplasmataceae进化枝、Ixodetis进化枝、Citri．Chrysopicola．Mirum进化枝、Apis进化枝(Gasparicheta1．，2004)。研究表明16SrDNA序列可以作为一个遗传marker在种水平上进行螺原体的分类鉴定(Gasparicheta1．，2004；Regassaeta1．，2006)，并能区分大多数不同血清组的螺原体，甚至部分不同的血清亚组。因此，在经典的血清学分类法越来越繁琐且不易操作的前提下，国际细菌学分类委员会提出在使用血清学方法之前先用16SrDNA基因进行分类，从而缩小血清学交互反应的数量(ICSB，2000；ICSp,40 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究2001)。尽管如此，基于16SrDNA的系统发育分析并不能取代血清学分类法，因为16SrDNA序列非常保守，它不能区分亲缘关系较近的种和个别进化速度较快的种(Regassa，eta1．，2006)。Regassa等发现利用ITS序列构建的系统发育树能较好的区分不同亚组，而且其结果也与血清学的结果一致(Regassa，eta1．，2004)。此外，随着系统发育分析在螺原体分类鉴定方面的广泛应用，许多实验室又尝试应用一些新的基因marker，实验证明rpoB(RNA聚合酶B亚单位)、parE(DNA拓扑异构酶)、触z(细胞分裂蛋白基因)、矿“R(部分乳糖操纵子)等持家基因也能很好地反映螺原体属内菌株之问的进化关系(Bieta1．，2008；Tamaraeta1．，2009；Hereseta1．，2009)。螺原体和宿主之间的关系可分为互利共生(Mutualism)、偏利共栖(Commensalism)和寄生(Parasitism)三种，其中大多为偏利共栖关系(Gasparich，20LO)。目前发现的致病螺原体主要分布于植物、昆虫及高等的无脊椎动物中。其中，植物病原性螺原体有三种，分别是引起“柑桔僵化病”的Scitri(Saglioeta1．，1973)，“玉米矮化病”的Skunkelii及“紫苑黄化病”的Sphoneiceum(Daviseta1．，1972；Whitombeta1．，1986；Saillardeta1．，1987)。昆虫病原性螺原体则主要包括分别引起蜜蜂“螺原体死亡病”和“五月病”的smelliferum和sap／s(Clark，1977；Moucheseta1．，1983)，此外，研究较多的另一种昆虫病原性螺原体是能够导致果蝇性别失调的Spoulsonii(Williamsoneta1．，1999)。随着近年来王文和Nunan等分别从国内的甲壳纲动物体和患病的太平洋小虾内分离到病原性螺原体(Wangeta1．，2004；Wangeta1．，2005；Nunaneta1．，2005)，螺原体宿主的范围又进一‘步扩大，这些致病菌对农业生产和养殖业的危害也进一步加重。在本研究中，我们从2010年5～6月份分离到的螺原体菌株中，选取了7株分离自不同宿主中的螺原体菌株，对其形态学、运动性、基本生物学特性、血清学、分子生物学及致病性进行了研究和比较，以期初步确定其分类地位及致病性，为进一步研究蜜蜂螺原体的在不同宿主间的传播途径、致病机理及蜜蜂螺原体病的流行规律及有效防治提供线索。1材料和方法1．1供试菌株的筛选及其宿主的鉴定从2010年5～6月蜜蜂“爬蜂病”暴发季节采集的蜜蜂等相关样本中分离到的菌株中选取7株分离自不同宿主中的螺原体菌株，MFl006、MFl007、MFl008、DWl001、LSl001、YNPl001和LKl001作为待测菌株，并对其宿主进行鉴定。用于系统发育分析的植物花螺原体CR．1、CNR．1、CNA一1和昆虫螺原体CH一1、M10、XW0801、WM0801、MF0904、MF0905、ZHUF0901、QYF0901均为实验室保存的菌株，其中4l 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012意蜂螺原体CH一1已确定其分类地位及致病性，作为致病性实验的对照菌株，并与MF0905、ZHUF0901在血清学分析中作对照。1．2螺原体的形态及运动性观察1．2．1透射电子显微镜(TEM)下菌体形态的观察取1．5mL对数生长期的螺原体培养液，8000r／min离心2min，弃上清，用PBS洗涤3次，加入等体积6％戊二醛固定，于4"C静置1．3d；吸一滴固定后悬浮液滴在有支持膜的铜网上，停留片刻后，用滤纸从铜网边缘缓慢地吸去多余的液体，待铜网上的液膜将干未干时，滴上1．5％的磷钨酸钠溶液(pH7．0)，染色40S，再用滤纸吸去多余的染液，自然干燥后用透射电子显微镜(HitachiH7650型)观察并拍照。1．2．2固体菌落形态观察将对数生长期的菌液做适当稀释至10．100CCU／mL后，取150p．L涂布于R2固体培养基表面，30℃静置培养，并逐日观察培养基颜色变化，当培养基由红色变成黄色时，用倒置显微镜(OlympusTokyo)观察螺原体菌落形态，并测量其大小(陈永萱等，1988)。1．2．3分离菌体运动性的观察用暗视野显微镜(OlympusBH．2)观察螺原体的运动性。1．3螺原体的滤过-眭取ImL对数生长期的螺原体菌液分别通过孔径为0．45um、0．22pm的微孔滤膜，用暗视野显微镜检查滤出液中是否有螺原体的存在；同时取50此接种到含450}tLR2液体培养基的离心管中，30。C静置培养，观察有无螺原体生长(Regassaeta1．，2006)。1．4螺原体生长特性的研究1．4．1颜色改变单位(ccu)法螺原体的计数采用颜色改变单位法。将培养至对数生长期的螺原体菌液用R2液体培养基作1：10梯度稀释，于30。CF静置培养，观察培养基颜色变化，以培养基颜色改变的最后一管作为待测菌液的CCU。1．4．2生长曲线的测定取100gL初始浓度为100CCU／mL的对数生长期的螺原体菌液接种于0．9mL的新鲜培养基中，平行3管，30℃下静置培养，采用CCU法计数，同时用暗视野显微镜每6h观察一次活动菌体数及菌体形态变化情况。3次重复。利用公式DT=Tx[192／(19Nt—lgNo)]计算分离菌株在30。C的倍增时问，选取菌株在对数生长期的一段时间为T，N。为对数生长期细胞数初始值，一般在接种24h后进行，Nt为T时问42 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究后的细胞数观察值。1．4．3温度对螺原体生长的影晌-将初始浓度为104～105CCU／mL的对数生长期的螺原体菌液接种于预热(冷)的IU培养基中，每0．5mL接种量为50止，每个处理平行接3管，分别置于4。C、18℃、25。C、28*0、32。C、37。C恒温下培养48h后，镜检活动菌体数，并采用CCU法计数。继续培养1个月，记录各菌株在不同温度下变色需要的天数。将4。C和37。C下培养一周仍未变色或菌体数量无明显增加的菌液转接到R2培养基中于30。C下静置培养，利用暗视野显微镜持续观察2周，根据结果确定高温或低温条件对不同螺原体菌株的生长及其形态的影响。1．5螺原体的生理特性研究1．5．1螺原体对血清的要求取50血对数生长期的螺原体菌液接种于不含胎牛血清的R2培养基中，30℃静置培养，连续转管3次，观察其生长是否需要血清，并用暗视野显微镜观察验证。1．5．2螺原体对碳水化合物的利用(1)基本培养基BSM及R2培养基的配制如表1—4所示：表1．4BSM及R2培养基的配方Table1-4BSMandI也mediumformula(2)对碳水化合物的利用将葡萄糖、D一果糖、D一木糖、D一山梨糖、D一半乳糖和甘露醇等单糖配成10％的母液，将乳糖和蔗糖配成20％的母液，分别用孔径为0．22“m的微孔滤膜过滤灭菌后，加入BSM培养基内，使加入后单糖的浓度为0．5％，双糖的浓度为1％，使总体积为O．5mL。接种50此对数生长期的菌液，30。C静置培养，逐日观察培养基颜色变化，同时用暗视野显微镜检查菌体是否有明显增加，将变黄的培养液移入含糖的BSM培养基中进行转管培养，如此转管3次以上，以避免接种时带入的培养基影响。同时以43 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012接种R2培养基和不加糖的基本培养基作为对照。变黄的处理作为阳性，未变的处理保留观察2—3周。3次重复。1．5．3螺原体对精氨酸和尿素的代谢能力将精氨酸和尿素分别配成20％、10％的母液，过滤灭菌后加入450gLBSM培养基中，使精氨酸的最终浓度为1％，尿素为O．5％；接种50斗L对数生长期的菌液，30℃静置培养，逐日观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜检查菌体量是否增加。将培养基颜色发生改变和菌体量明显增加的培养液在含尿素或精氨酸的BSM培养基中至少转管3次。以培养基颜色变深或菌量明显增加的作为阳性，接种基本培养基和R2培养基作为对照。重复3次。1．5．4螺原体对青霉素的抗性在含有不同单位氨苄青霉素纳(500U／mL、1000U／mL、2000U／mL)的R2液体培养基中，接种生长至对数生长期的菌液50此，30。C静置培养，连续转管3次，逐日观察培养基颜色变化，并用暗视野显微镜检查有无螺原体的存在。1．6螺原体的血清学分析1。6．1抗原的制备(1)取500mL对数生长期的螺原体茵液；(2)在12000r／min下离心30min(4℃下进行)：(3)沉淀用PBS(0，01mol／LpH7．4)充分悬浮；(4)重复(2)、(3)两步3次，将沉淀最后悬浮于5mLO．01mol／LPBS中；(5)用超声波破碎螺原体(处理8．10次，每次10．15s)；(6)粉碎后的悬浮液即作为抗原，在一20。C下贮藏备用。1．6．2抗血清分别与＆apis、S．clarkii、Smellifeyum聚类的螺原体ZHF0901、MF0905、CH．1的多克隆抗体anti—ZHF090t、anti—MF0905、anti—CH—l及阴性血清均于2010年5月由本实验制备并保存。HRP辣根酶标记羊抗兔IgG(H+L)为南京鼎国￡七物技术有限公司产品。1．6．3代谢抑制试验将1mL抗血清在无菌离心管中做2倍稀释至第10管，各取25皿滴入微孔测定板(8×12)1—10孔，第ll、12孔分别以不加抗血清的抗原孔和不加供试菌株的培养基孔作为菌液对照和空白对照，然后向1．1l孔加入50此供试菌株的培养液(100～1000CCU／0．05mL)，用R2培养基将各孔滴加至200gL，密封后于30。C下静置培养，当培养基空白对照颜色未变化而菌液对照颜色变黄时，立即判断结果，即记录能抑制颜色 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究变化的抗血清的最高稀释度，作为该抗血清对供试菌株的代谢抑制效价。3次重复。1．6．4菌体变形试验取1mL抗血清在无菌离心管中做2倍系列稀释到第14管：然后往8x12孔的微孔测定板中，每孔加入50肚对数生长期的培养液，再在各孔依次加入50此上述系列稀释好的抗血清，另取一孔只加50从，R2培养基不加抗血清作为对照，加盖密封并充分混匀后于室温下(25。C)放置30min；每孔取20此，以对照孔菌体形态及运动性为标准，在暗视野显微镜下从高稀释度开始依次检查菌体形态及运动性变化情况，以使50％以上的菌体变形或死亡的稀释度作为该抗血清的效价，并以效价的差别来比较相关螺原体之问的血清学差异。每个处理3次重复。1．6．5间接ELISA参照本实验室已建立的问接ELISA方法，用包被液将抗原作适当稀释，约10¨g／孔，每孔100gL包被96孔反应板，另取一孔只加100IxL包被液作空白对照，37。C温育2h后，洗涤3次，每次5min；加封闭液于37。C封闭2h，洗涤同前；之后用封闭液将被检血清作1：3200稀释，每孑L100IxL，同时设阳、阴性对照，37。C放置45min，洗涤同前；每孔加入100txL己稀释好的酶标羊抗兔IgG(1：3000)，37。C放置lh，洗涤同前；加TMB(四甲基联苯胺)底物溶液，100nL／孔，37。C显色30min；每孔加50止2mot／LH2S04终止反应；在酶标检测仪上读出OD450。每组3个重复，各孔数据取平均值，以OD值大于0．40判为阳性。1．7螺原体的系统发育分析1．7．1基因组DNA的提取采用TIANampBacteriaDNAKit(南京丁贝生物科技有限公司)提取螺原体的基因组DNA。(1)取1．5mL对数生长期的螺原体培养液，13000rtmin离心5min，尽量吸净上清。(2)向菌体沉淀中加入200p．L缓冲液GA，充分振荡至菌体彻底悬浮。(3)向管中加入20此蛋白酶K溶液，混匀。(4)加入220txL缓冲液GB，振荡15S，70。C放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。(5)加220此无水乙醇，充分振荡混匀15S，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠。(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入‘个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)13000r／rain离心30S，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012(7)向吸附柱CB3中加入500gL缓冲液GD,将吸附柱CB3放回收集管中。(8)向吸附柱CB3中加入700“L漂沈液PW，将吸附柱CB3放回收集管中。13000r／min离心30S，倒掉废液，13000r／min离心30S，倒掉废液，(9)向吸附柱CB3中加入500gL漂洗液PW，13000r／min离心30S，倒掉废液。(10)将吸附柱CB3放回收集管中，13000r／min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50—200gL洗脱缓冲液TE，室温放置2．5rain，13000r／min离心2rain，将溶液收集到干净的离心管中备用。1．7．2目的片段的扩增与电泳检测扩增16SrDNA及ITS序列所用引物如表1—5所示，扩增片段为16SrDNA序列全长及ITS序列(包括16SrDNA及23SrDNA的部分序列、16S一23SrDNA间隔区)。表1-5PCR扩增引物(于汉寿等，2008)!垒塾!璺!二量!：竺塞巳!i堡呈塑坠!呈垒i望!塾i!!!坚壁Y!Q尘竺!璺!：，兰壁壁墨)扩增基冈引物编号引物序列垒里卫!i!!曼垒g!堡里堕堡望翌坚堡垒堕￡巫里!!!!g坠!翌堡116SrDNA，淼5M凳思黑并罢器冀并军笋3’ITs黼；’cTA"CCCTCcTTT擞器翟篇GAGC33，"扩增16SrDNA及ITS序列所用的PCR体系相同：10xbuffer2．5此，M酡+1．5肚，dNTP2gL，Primer2laLx2，模板DNA1gL，Taq酶(5u／}tL)O．25gL，ddH2013．75gL，总体系为25此，所用试剂均购自大连宝生物(Takara)公司。16SrDNAPCR反应程序为：96℃预变性2min，94。C变性1rain，5l℃退火1rain，72℃延伸1．5mim，共35个循环，最后72℃延伸10rain。扩增产物立即用l％的琼脂糖电泳检测或4"C保存备用。ITS序列PCR反应程序为：96℃预变性2min，94℃变性lmin，596C退火1rain，72。C延伸1．5mim，共35个循环，最后72。C延伸10min。扩增产物立即用1％的琼脂糖电泳检测或4℃保存备用。1．7．3目的片段的测序经琼脂糖凝胶电泳检测，与Marker亮度相同或更亮的PCR扩增产物送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。1．7．4系统发育分析 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究采用多种生物学软件对测得的序列进行分析，构建系统发育树。本研究中用到的软件及功能主要有：DNAssistversion2．2主要用于序列碱基的二重或多重比对。将双向测序所得的两条序列，通过比对整合获得完整序列，并找出不同序列间的差别碱基。Clustalx1．81基于NJ法基础上的系统发育树的构建工具，主要用于序列格式的整理，比对结果可进行系统发育树的构建。MEGA4．0系统发育树构建软件，可进行多种系统发育分析方法的运算。MEGA4．0通过比较直观的窗口进行操作，并能够对构建的系统发育树进行编辑。将测序所得序列在GenBank中进行BLAST比对。根据比对结果，下载与菌株16SrDNA、ITS同源并经过菌种鉴定的序列，并将其整理成FASTA格式的文件。用ClustalX1．8l进行多重比对后，利用Bioedit对所选序列的长度进行整理，使进行系统发育分析的序列长度基本一致，然后用MEGA4．0采用邻接法(Neighborjoining)构建系统发育树(Tamuraeta1．，2007)，以与Spiroplasma属亲缘关系比较近的MycoplasmahominisATCC27545(M24473)作为外群。1．8螺原体的致病性1．8．1蜜蜂和植物花螺原体对意大利蜜蜂的感染将健康的意蜂置于38．5cmx27cm×30cm的白纱笼中，每笼100只，停食3—4h后，饲u畏含有对数生长期菌液的蔗糖水3d，12h一次，对照组饲喂含有新鲜培养基的蔗糖水，之后各笼均饲喂无菌的蜂蜜水，每组3个重复。室温下通风处饲养15d，逐目观察记录死蜂情况，计算死亡率和校正死亡率，并利用Duncan新复极差法对死亡率进行方差显著性分析。1．8．2螺原体的再分离及分子生物学检测将处理组和对照组的死蜂随机挑取15只，进行螺原体的再分离，并计算再分离率。为完成Koch7S法则，对再分离的螺原体进行纯化培养，利用暗视野显微镜观察验证，同时选取感染MFl006致死蜜蜂中的再分离物，采用Chelex—100树脂法提取螺原体的总DNA(方法同第一章第一节1．7)，并以27F／1492R通用引物(于汉寿等，2008)扩增其16SrDNA序列，扩增产物经测序后，在GenBank中进一步比对验证。2结果与分析2．1供试菌株的筛选及其宿主的鉴定从2010年5-6月份分离到的螺原体菌株中，选出7株分离自不同宿主的螺原体菌 李矗蜜蚱螺朦体的侵染循环胜Jta蜜蜂伴自的定稍研究2012醑蕊团圆墨豳图1．20分离到螺原体的宿主A．B：意人利蜜蚌．C：打碗花：D：楝树花；E一年蓬：P：錾科植物Fi91-20HostswithspiroplasmainthisstudyA-B：Apismellifera；c：Ca蛔tegiahederaceaWall；D：Meliaazedarach；E：Erigeron㈣淞；FPolygonaceae表1．6不同宿主中的螺原体菌株I莉株采集时问采集地点宿主StrainsSamplingdateSamplinglocationHOSt 瓠一章蜜蜂蝶原体n自然抖的侵染循环研究22分离菌株的滤过性、运动性及形态观察分离菌株MFl006、MFl007、MFl008、DWl001、LSl001、YNPl001、LKl00I在R2液体培养基中均生长照好，30℃静氍培养卜2d，培养基就山红变黄。上述菌株均能通过孔径0．45gm、0．22“m的微孔滤膜，在暗视野显微镜下可见大量螺旋细丝状螺原体，它们在液体培养基中呈翻滚式运动。在透射电予显微镜下采用负染法对分离菌株的显微形态进行观察，发现分离菌株在生长的某一阶段均可呈典型的螺旋形(图1．21)，长约2-7岬，各菌株的螺旋数差异较大，--N十儿个不等，且在较高的放大倍数下可见单层膜。’．／’图I-21分离菌株的负染电镜照片F8‘21j2181。ctrol：nmicrLoKgraphsAM1006；BYNPl00C100I。‘S“ca。12e4b‘1a”r。s：“A：“42000‘n8m。1；4‘。B5，c㈣500：Fl：LK：，c⋯图1．22螺原体分离菌株的菌落形态(30℃，R2培养韭)Fi91-22ColoniesofspiroplasmaisolatesOO℃，R2mediunl)AMFl006；B：MFl007；C：MFl008；DDWl001：E：LSl001；F：YNPl001；G：LKl00Scalebars：A，D：40um，B：30pm；C，E25pm；F359m；G：45pm7株分离菌株在固体培养据l二的生长速度有所差异，菌株MFl006在固体培养基L30"CF培养2-3d可使培养基⋯红色变为黄色，菌株MFl008、DWl001、YNPl001 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012需要4—5d，MFl007、LSl001、LKl001则需要6．7d。在倒置显微镜下，分离菌株MFl007、MFl008、DWlool、LSl001、YNPl001、LKl001均呈圆形或颗粒状菌落，形态没有明显差异，菌落直径在35—110pm之问变化；菌株MFl006则由于生长速度较快其菌落较大且不规则，直径约70—140gm(图1—22)。2．3螺原体的生长特性2．3．1螺原体生长曲线的测定由图1．23可知，7株螺原体菌株的生长速度有明显差异。分离菌株MFl006、MFl007、MFl008、DWl001、LSl001和YNPl001在接种12h内，菌量均无明显增加，LKl001的延缓期则稍长，需要48h；进入对数期后，菌量均呈直线上升，暗视野显微镜下呈单个螺旋菌体，菌丝缠绕较少，菌株MFl006和LKl001的生长速度最快，其倍增时间分别为1．8h和2．4h，DWl001、YNPl001、MFl007和LSl001次之，MFl008生长最慢，倍增时间为7．8h(表1—7)；螺原体MFl006、YNPl001和LKl001由于其稳定生长期持续时间较短，仅12—24h，致使它们生长周期较短，MFl006生长到66h，YNPl001和LKl001生长到108h就开始衰亡，MFl007、MFl008、DWl001和LSl001在稳定生长期持续时间则相对较长，生长到144h时，仍未大量衰亡，致使其生长周期也较长。图l一23螺原体分离菌株在R2培养基中的生长啦线(30。C)Fig1-23ThegrowthcurveofspiroplasmastrainsinR2medium(30"C)表I．7螺原体分离菌株在30。C的倍增时间Table1-7Doublingtimesofspiroplasmastrainsat30℃醢擎MFl006MFl007MFl008DWl001LSl001YNPl001LKl001华粤!于问jh)1．83．67．82．94．23．62．4QouDllngum!一——一一——Note：R2medium50 第一帝蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究2．32温度对螺原体生长的影响图l-24表示7株分离菌株在不同温度下培养48h后增长的菌体数。MFl006、YNPl001和LKl001在37’C培养48h后，菌体数均有所下降，它们在37℃下茁液均不能发生变色(圈1．25)，转接入新鲜培养基后在30℃下培养仍不能复活(表1-8)，说明这3株苗在37。C下不能生长；除菌株YNPl001外，所有菌株在4"C下均有少量增长(图1-24)，它们在培养l周后转接入新鲜R．2培养基·1·，在30"(2下菌液均能变黄(表I．8)：7株螺原体苗株在25～32"CF菏体数均有夫量增长(图l一24)，菌液均能在较短时削内变色，此外，菌株MFl006、YNPl00l和LKl001在18℃下培养10～12d后，也能变色，MFl007、MFl008、DWl001和LSl001则不能，但是它们在37℃可以变色(图1．25)：7株菌株最适温度及温度范围如表1-9所示，菌株MFl006、YNpl001和LKl001的摄适温度范围比其余4株螺原体菌株的要略低一些。___——图I-24不同温度对螺原体生长的效应Fi91-24TheeffectofdifferenttemperaturesONthegrowthofspiroplasmastrains芦≯扩矿穸，梦图l一25螺原体培养液在不同温度下变色的时间Fi91-25Thediscolorationtimeofspiroplasmaculturemediumatdifferenttemperatures州蚶“啪咄埘■■l■■■I■■●●■■-42086420 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012表1-8不同温度对螺原体生长的影晌(接种l周后)Table1-8Theimpactofdifferenttemperaturesonthegrowthofspiroplasmastrains4℃+37℃一+2+3．5+2+2注：数字表示螺原体菌液变色的天数；“+”：未变色菌液转接后在30"(2下可以变色：“一”未变色菌液转接后在30℃下仍不可以变色。Note：Numberindicatethediscolorationtimeofspiroplasmastrains；“+’’：Thespiroplasmastrainscarlchangecolouraftertransferat30。C；“一”：。nlespiroplasmastrainsstillcannotchangecolouraftertransferat30"(2．表1-9螺原体分离菌株的最适生长温度!垒垒!!!：竺!塾!竺巳!!坐坚坐g竺!!堕．!!翌巳!!!垒堡垒!!巳i竺P!垒!坐兰!!!璺!墅菌株StrainsMFl006MFl007MFl008DWl001LSl00lYNPl001LKl001o盖鬻星ge25~32℃28~37℃28~32℃25~32℃最适温度Optimal28～32℃32℃32"(232℃28℃!!巴P曼!型坚堡一一一一．．．一一一．．一——2．4螺原体的生理特性在不含胎牛血清的R2培养基中，供试菌株都不能生长，说明上述分离菌株均需依赖血清中的甾醇生长。在含不同浓度氨苄青霉素钠(500、1000、1500、2000U／mL)的R2液体培养基中，所有供试菌株均生长良好。不同宿主中的螺原体菌株对各种碳水化合物的代谢能力有所不同。由表1．10可以看出，所有分离菌株都可以利用D．葡萄糖、D一果糖作为碳源，不能利用D一半乳糖、L一山梨糖、D一木糖、乳糖；菌株MFl007、MFl008、DWl001和LSl001均不HL匕E,利用蔗糖和甘露醇，而菌株MFl006、YNPl001都能利用蔗糖和甘露醇，但YNPl001对甘露醇的利用能力较弱，呈弱阳性反应，LKl001能利用蔗糖，不能利用甘露醇。分离菌株对精氨酸的代i』3|能力也存在差异：菌株MFl007、MFl008、DWl001和LSl001可以强烈代谢精氨酸，使培养基变为紫色，在瞎视野显微镜下可见大量螺旋状菌体做剧烈的翻滚运动：菌株MFl006、YNPl001和LKl001则不能代谢精氨酸，接种7d后培养基仍为红色，镜检视野内菌体极少，运动缓慢。所有分离菌株都不能代谢尿素。 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究表1．10供试菌株对几种物质的代谢特性里!垒堕!：!壁垒!垒丝!i璺!坠!!!垫-A垡垒望壁!!卫i望!卫堕!坐垒i!壁!垒!竺!单糖双糖其它物质菌株MonosaccharideDisaccharidOthcrmaterialsStrainsD一果糖山梨糖n木糖甘露醇葡萄糖D．半乳糖蔗糖乳糖精氨酸尿素D·fructoseSorboseD-xyloseMannitolGlucoseD-galactoseSucroseLactoseArginineUreaMFl006+MFl007+MFl008+DWl00lLSl00lYNPlOOlLKl001注：“十”为阳性反应，表示能利用；“．”为阴性反应，表示不能利用；“M”为弱阳性反应，表示利用能力较弱。Note：“+’’：positivereaction，representscallusethesematerials；“-’‘：negativereaction，representscarlnotusethesematerials；‘⋯M：weaklypositivereaction，representsthemetaboliccapabilityofthesematerialsrelativelyweak．2．5螺原体的血清学分析2．5．1代谢抑制试验在代谢抑制试验中，CH—l、ZHUF0901、MF0905抗血清同源反应的效价分别为256、512和256。CH一1抗帆清对菌株MFl007、MFl008、DWl001和LSl001的代谢有明显的抑制作用，表现为较高效价，而对菌株MFl006、YNPl001和LKl001几乎没有抑制作用；ZHUF0901抗血清则只对菌株MFl006、YNPl001有明显的抑制作用；MF0905抗血清除了强烈抑制菌株LKl001的代谓十外，对其它所有菌株的反应均较微弱或无反应(如表l—11)。这说明菌株MFl007、MFl008、DWl001和LSl001与标准菌株SmelliferumCH—l的血清学关系较近，MFl006、YNPl001和LKl001则与SmellifeFb!mCH—l的亲缘关系较远，不属于Smelliferum；MFl006和YNPl001与同Spiroplasmaapis聚类的ZHUF0901亲缘关系较近，可能为类似于Sapis的菌株；LKl001则与同Spiroplasmaclarkii聚类的MF0905的亲缘关系较近，可能属于Scla，幻f。53_+-+_-+-一_一M一-_一_一_一 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012注：表中数据表示代谢抑制效价，即能抑制菌液颜色变化的抗血清的最高稀释度：“．”表示未检测。Note：Daminthetabledenotesthemetabolicinhibitiontiter,thehighestdilutionofantiserumthatcallinhibitthecolourchangeofspiroplasmaculturemedium；“一’’：Notdetected．2．5．2菌体变形试验菌体变形试验的测定结果与代谓f抑制试验测定结果基本‘一致(表l一12)。CH一1抗血清对同源抗原的测定效价为2048；对异源抗原MFl007、MFl008、DWlool、LSl001的测定效价分别为1024、2048、512和1024，说明它们之问有一定的血清学关系，并且CH—l与MFl008的关系虽近；而对异源抗原MFl006、YNPl001、LKl001的测定效价均小于等于4，说明它们之问血清学关系较远。ZHUF0901和MF0905抗血清与同源抗原的测定效价分别为256和2048，ZHUF0901抗血清对异源抗原MFl006、MFl007、MFl008、DWl001、LSl001、YNPl00I和LKl00l的测定效价分别为128、8、8、O、4、64和8，MF0905抗血清则除了对LKl001的测定效价较高外，对其它供试菌株的测定效价都较低，说明ZHUF0901与MFl006、YNPl001之间有较近的血清学关系；MF0905则与LKl001的血清学关系更为接近。表1．12菌体变形试验结果Table1-12TheresultsofdeformationtestCH一1ZHUFl001MF0905O1024204851210242128O8484042648512256一2048注：表中数据表示50％螺原体变形或死亡的相应抗体的稀释倍数，即效价，“．”表示未检测。Note：DatainthetabledenotesthetiteLdilutionmultipleofantibodywhichleadtOthedeformationordeathof50％spiroplasma；“一”：Notdetected．2．5．3间接ELISA检测结果利用问接ELISA对待测菌株的检测结果与传统的血清学方法表现出一1致的结果54 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究(表l-13，l一14)。SpiroplasmamelliferumCH．1抗血清与自身抗原反应的平均OD值为O．779；与异源抗原MFl007、MFl008、DWl001、LSl001反应的OD值均大于O．4，而与异源抗原MFl006、YNPl001、LKl001却发生较弱反应，其OD值均接近阴性对照，说明菌株MFl007、MFl008、DWl001、LSl001与SpiroplasmamelliferumCH．1的亲缘关系较近，属于Spiroplasmametliferum，但根据间接ELISA的检测结果可知，它们之间也存在着差异，其中MFl008与SpiroplasmamelliferumCH．1的亲缘关系最近；MFl006、YNPl001和LKl001则不属于Spiroplasmamelliferbtm。ZHUF0901抗血清与自身抗原反应的平均OD值为1．176；与异源抗原MFl006、YNPl001反应的平均OD值分别为O．618和0．599，与其余待测异源抗原反应的OD值则均小于O．4，说明MFl006、YNPl001与ZH-UF0901的亲缘关系较近，但它们之间差异也比较大。MF0905抗血清则除了与自身抗原及异源抗原LKl001有较高、OD值外，与其它异源抗原的反应都比较弱，表现出较低的OD值，说明菌株LKl001与MF0905的亲缘关系比较近。表1．13CH．1抗体对各菌株的检测．———、—．————————Table1-13Detectionofdifferentspiroplasnaisolat—e—suse—da—ntiser—um—of——C———H———-——1———byEL—IS—A．——．．．．—。．．，．——o域5。CH—l≮：器翁eB。n仃lan。kllMooF61M007FlMooF8lD∞WllLooSlYloNoPl1LooKl鼍黜器注：表中数据为ELISA测定的O瓯50Note：DatainthetabledenotestheOD4sobyELISA表I一14ZHUF090i抗体和MF0905抗体对螺原体菌株的检测Table1-14Detectionofdifferentspiroplasnaisolatesusedantiserumof注；表中数据为ELISA测定的OD4soNote：DatainthetabledenotestheOD450byELISA2．6螺原体的系统发育分析2．6．1螺原体基因组DNA的提取 李霞蜜蜂蝶原体的侵染循环及JE∞-蜜蜂体自的定毓研究2012采用TIANampBacteriaDNAKit提取螺原体的基因组DNA，获得了MFl006、MFl007、MFl008、DWl001、LSl001、YNPl001、LKl00l七株菌的总DNA。2．62目的片段的扩增、检测及测序利用引物27F／1492R和ITS．FATS—R成功地扩增出7株螺原体菌株的16SrDNA和ITS序列。扩增出的电泳条带均明亮而清晰，16SrDNA序列的扩增片段长度在1470bp左右，ITS序列的扩增片段长度约为1450bp(图1—26)。PCR扩增产物直接送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序，获得了所有分离菌株的16SrDNA和ITS序列。据测序所得信号峰图显示：除了开头和结尾两部分各=i!『20个左右的碱基的信号峰较杂乱外，其余位点没有出现双峰或杂峰。图l一26螺原体菌株16srDNA扩增图谱(左)、ITS(右)扩增图谱Fig．1-26ElectrophoreticpatternofPCRamplificationofspiroplasmal6SrDNA(1eR)，16S-23SrBNAintergenictranscribedspacerfITs)(righOM：MarkerDL2000；IMF]006；2：MFl007；3：MFl008；4Dwl00l5LSj00I：6：YNPl00I：7LKl0012．63目的基因片段的比对将所测序列在GenBank数据库-扣进行Blast搜索，结果表明茼株MFl006和YNPl001的16SrDNA及ITS序列均‘jsapis棚似度较高，达99％：菌株LKl001的16SrDNA序列与sclarkii相似度最高，其ITS序列与sdiabroticae的相似度最高；其余4株菌的16SrDNA和ITSJT-90，则都与smelq／erum_}|；I关序列的相似度昂商。同时对待测菌株之问的序列进行比较，发现7株螺原体蔺株问序列差异较人，相比之F，ITS序列比16SrDNA序列问的变异更大。进一步比较发现，MFl006和YNPl00l的16SrDNA驶ITS序列之闯的差异均较小，仪5-6个碱基；MFl007、MFl008、DWl00l、LSl001的16SrDNA及ITS序列之间也仪有一I-JL个碱基的差异；LKl001 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究的16SrDNA、ITS则明显区别与其它菌株，差异较大。对从GenBank中下载的序列进行初步分析后选择不同血清组和不同血清亚组的标准菌株用于系统发育分析。经整理用于系统发育分析的16SrDNA序列长度为1411bp，ITS序列长度为1034bp。2．6．4系统发育分析基于16SrDNA序列构建的邻接树(NJ)树显示：菌株LKl001与标准菌株中Sclarkii聚为一类，自展值为73；菌株MFl006、YNPl001则与&apis聚为一类，自展支持率达95％；其余4株菌(MFl007、MFl008、DWl001、LSl001)均与Smelliferum聚为一类(图1．27)。根据ITS序列构建的系统发育树的拓扑结构与16SrDNA的相似，7株螺原体菌株被分为3大类，菌株LKl001与sclarMi以95％的较高的自展支持率聚为一1类：菌株MFl006、Ⅵ岬1001与菌株MFl007、MFl008、DWl001、LSl001则分别与sapis和Smelliferum聚类(图1．28)。57 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012}—————叫0．02图l一27根据16SrDNA基因构建的螺原体发育树(NJ法，1500次)Fig1-27Phylogenetictreesof16SrDNAshowingthepositionof7spiroplasmaisolatesamongthegeneraSpiroplasmaandMycoplasmabasedonneighbor-joining(NJ)with1500bootstrapreplications． 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究卜—1On，图1·28根据ITS序列构建的螺原体发育树(NJ法，1500次)Fig1-28PhylogenetietreesofITSsequenceshowingthepositionof7spiroplasmaisolatesbasedOilneighbor-joining州奶with1500bootstrapreplication．59 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究20122．7螺原体的致病性研究2．7．1蜜蜂和植物花螺原体对意大利蜜蜂的感染通过饲喂新鲜菌液法对螺原体进行致病性研究，发现感染供试螺原体菌液的意大利蜜蜂(Apismellifera)在第5天时均开始出现症状：意蜂表现为骚动不安，在笼中乱飞乱撞，随后便不能飞起，慢慢爬行，直至抽搐而死，发病症状与自然状态下患“爬蜂病”的蜜蜂症状相同。但在相同的实验条件下，感染MFl006及YNPl001菌液的蜜蜂的发病速度较快，到第6天时，已有超过55％的蜜蜂死亡。到第9天时，所有感染螺原体菌液的实验组意蜂的死亡率均明显高于对照组的意蜂(饲喂新鲜培养基)，与对照组意蜂在1％显著水平下相比差异均极显著(表l一15)。以上结果表明，分离菌株MFl006、YNPl001及MFl008对意蜂均具有较强的致病性。表l一15螺原体对意蜂的致病性Table1-15PathogenicityofspiroplasmaisolatestoApismeUifera饲喂处理出现症状的时死亡率校正死亡率l％显著水平再分离率Feeding间TimeofonsetMortalityCorrected1％significanceRateoftreatmentofsymptoms(d)rate(％)mortality(％)levelre—isolation(％)MFl006561．424．9A86．7YNPl001560．924．4A60．0MFl008561．625．1A73．3CH．1555．018．5A66．7R2medium．36．5一BO2．7．2螺原体的再分离及检测本研究在感染螺原体菌液致死的意蜂腹部中，均能不同程度的分离到螺原体，在正常死亡的意蜂体内却未分离出(表1—15)。再分离菌株在暗视野显微镜下均能呈现出螺原体菌株典型的螺旋状，做翻滚式运动。说明螺原体是引起蜜蜂死亡的病因。利用27F／1492R通用引物以感染螺原体菌液致死的蜜蜂体内再分离到的螺原体的DNA为模板，扩增得到其16SrDNA序列，经测序、比对后，再分离菌株与原菌株的16SrDNA序列仅在头尾部分存在10个碱基的差异(图1—29)，它们在GenBank中经Blast比对后，均与原菌株相同(图1—30、1—31、1-32)，二者为同一种螺原体，说明螺原体分离菌株确实是意蜂死亡的病因。 |I||I|垂嚣!鬻篓鬟ii篓蠹篓垂囊篓囊囊i鬟黧囊iii篓囊ii蠹秦嚣i嚣i震鬟i篓黧蕊l簿鬟i囊篓}||cuS 李霞蜜蜂蠕鲰仆的侵染循环驶j￡a蜜蜂体内的定藕研究2012。S⋯equ⋯enc。e：，1。0：2。1篙嚣：：：；；；：：嚣：：：嚣：嚣；；；；：；：；：；：：：：；：：：：；；：：；：：：：：慧：：；；凳。1。0efl。0S⋯⋯e01081GCCCATTGTG—TTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTC11日0s⋯⋯e11081GCCCATTGTG—ATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGYC1140Sequence21081GCCCATTGTGAA鱼AATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTC11{0sequence。1l41⋯TGTGGccGAT㈨TcTcAGTTcGGcTAcGTATcATTGccTAG㈣6ccATTAcl2。120Sequ⋯⋯⋯1⋯GTGGCccAT㈨CTCTcAGTTcGGCTAcGTATCATT6ccTAG㈨GCCATTAc1200Sequence21⋯1⋯GT6GccGA⋯ccTcTcAGTTc6G⋯GTATcATTGccTAG⋯GccATTAcl200Sequence0⋯20TTAccTAcTAG⋯T^cGccGcATccTcAT—TAGcGAc㈨cGGGTcTT㈣1260s⋯⋯e11201cTTAccT删⋯础ccGcATccTcATcTTcTAGcGAcccmcGGGTcTT㈨1260Seque⋯21201cTTAccT㈣cT触懈ccGcATccTcATcTTcTA6cGAc⋯GGGTcTT册1260Seque⋯01261cAccTTTTGATG㈨T6GTGTcGTATGcGGT^TTAccAGTcGTTT㈣cTGTTATcc1320Seq”enGe11261cAccTTTTGATG⋯TGGTGTc6TATGcGGTATT^GcAGTc6TTT㈣cTGTTATccl320s⋯一e21261cAccTTTTGATG⋯TGcTGTcGTATGcG⋯TAGc^GTc6TTt㈣cTGTTATccl320sequence0粼321c^㈣GGT⋯蚴TAcGTGTtAc丁cAcccGTTcGcCActG6GT⋯GcAccl380Sequence11321CccAc删G⋯T^㈣GTGTTACTcACCCGTTCGCCACTG6GT⋯GCAccl380Sequence21321c32CCA㈣GGT⋯⋯嘣tGTTACTcAcccGTTCGCCACT6GGT⋯GcAccl380illil篓；嚣}l||垂蒜I嚣篓；囊iI垂lll燮i图1．29再分离菌株与螺原体MFl00616SrDNA序列的比对结果Fi91-29TheresultofAlignmentusel6SrDNAsequenceofreisolatesandspiroplasmaMFl006I；I⋯⋯⋯*5ha日^Tccl3e¨l⋯⋯⋯enPDj_bⅢ：一‘⋯，{；’c0""％§一^⋯÷{⋯ontjnen⋯m⋯⋯m⋯⋯pjm日jt‘，f2521{}-c⋯一⋯⋯¨，⋯85aI⋯o⋯⋯⋯9drtⅢse自uen⋯}一，e々÷％0⋯⋯⋯一‘口⋯5091⋯O；⋯⋯⋯pirt，“t0⋯0⋯‘’!’，、0口‘，、⋯⋯¨，口⋯E”l⋯"；p1"⋯"tD0‘h“～⋯·”R：‘：s’’。O0{’、■_⋯⋯∞⋯，16⋯s0⋯⋯口⋯⋯en⋯·#E；．-OO"1’～．。p■⋯w∞a‘n-⋯⋯scens}t7州⋯f。b⋯～part“，tjt："""．．o’’‘一s⋯一ato⋯⋯cc_3⋯6⋯⋯⋯⋯口jm^o：：{；5{、0j7％±L⋯⋯∞w11516⋯"⋯⋯0jtI口I⋯●n⋯j3{3，々‘-0O‘、～一⋯⋯¨nen⋯⋯c⋯6s”bo⋯⋯pj’⋯q⋯i’’、：’：，’’‘0O{7、‘￡iⅡ。⋯⋯m^jb⋯j●0●。11⋯⋯⋯p¨Ir⋯s¨1⋯⋯{’；{"～c日々，％囤1．30菌株MFl00616SrDNA序列的BlasI搜索结果(截图)Fi91-30TheresultofBlastusel6SrDNAsequenceofisolateMFl006(partial) 第一章蜜蛛蝶原体枉自然界的侵染循环研究s¨ucnce⋯q‘。“⋯lR●¨I●lo■o·me“"g一～盟盛盟一山嚣0jt⋯■o一⋯⋯cc，3Bj{16⋯⋯Ⅲ¨⋯e⋯⋯"*"P·Dc⋯Em⋯mⅣ⋯⋯⋯⋯0sl16snbo—lm^口N0Ⅲ⋯；5吼O口0{～■■⋯⋯⋯p∞u；e；e16snb口∞⋯⋯*■Ⅲ{equt“⋯3{，⋯口⋯0=⋯ro～⋯65u550e165“b0∞⋯^⋯⋯l}÷日uen⋯2‘}⋯0口々#·■￡⋯¨d⋯‘口(su5579155T_bo⋯⋯⋯⋯lEtquen⋯：c6-"}"0ej“⋯⋯∞oⅢ⋯as口6sul6。，16snbo一⋯⋯⋯IIequen⋯‘-‘5‘一⋯口；。o·!Ⅱ⋯-o■一aE●⋯nst一．‘】：O⋯nb一⋯qtne口●⋯。‘：口#‘Oc"”·■⋯⋯⋯tbc·．f⋯55l⋯M0‘16snbD一“RmP*b■"⋯1‘，j‘’0’1％“⋯⋯一s口wll⋯“b⋯⋯ene口ar0■sequence?，一^：c，"I‰0々，7’·ⅡJ⋯批m⋯br《d⋯jnLEsIl⋯一⋯jo“m⋯_．-^j：-，⋯ao，-’·⋯⋯⋯⋯⋯a—H16⋯‘o⋯～Pa『⋯⋯一，i±：：⋯，0，。～图1．31感染MFl006致死的蜜蜂再分离物的16SrDNA序列的Blast搜索结果(截图)Fi91-31ThemsultofBlastUSel6SrDNAsequenceofreisolatesfromhoneybeeirifeetedwithspiroplasmaMFl006(partial)⋯⋯n二=i怒。i：盛：一。缸盛．5ucB‘，nldrn01lacr’⋯hdH、csl】6sJ‘c，o}R～-Pa‘H，-w-}‘t：‘，’‘5：；Oa"n1⋯B。us$”16sb。ron,一≈，‘q㈦}0a，【一"fqf●c--·--‘”：{：+‘～一口0pa；maj?u5J)50SL65nb01⋯日^：。1e0at“"自一t^c“⋯，c。91：∞0∞‘⋯0csu5)”16sb0，⋯⋯f1⋯o【“5。qo_n(t·，，-‘。：，一‘E0c口a；naf055u’60]16s’b；々一1⋯^“n÷fa【“fEq。‘nct-，，“-i，5Do【d‘F⋯一a—f1‘’^Tfc‘3j0’16E’bo}na～c‘10fr}-’‘。，‘；、-p∞jcljr‘0c二。。5[。n；‘t13nh0{-6‘ti050n1“R～⋯0r【N‘1。-Y‘“。。，⋯‘口c，ar_t：；⋯‘lb5n：otcm“Ⅺ一h口n￡∞rL⋯；equ⋯：。：{’’’{¨00j{nafL_：(m5’⋯osl：5Eb050n1⋯"=0jr【“s。“÷-。。‘、，t·}：p0J-rdt1e1‘d}E‘“Lc“e5o。⋯R『|up。【a，eqJt·J‘‘‘{“图1．32感染MFl006致死的蜜蜂再分离物的16SrDNA序列的Blast搜索结果(截图)Fi91-32TheresultofBlastusel6SrDNAsequenceofreisolatesfromhoneybeein＆ckdwithspiroplasmaMFl006(partial) 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012本章小结与讨论蜜蜂螺原体Spiroplasmamelliferum最早于1976年由Clark等在美国Maryland州发现，它能引起蜜蜂的“螺原体死亡病”(Spiroplasmosis)(Clark，1977)；随后，Mouthes等在法国又发现另外一种螺原体——Spiroplasma印括能引起蜜蜂的“五月病(Maydisease)”fMoutheseta1．，1983)。20世纪80年代，蜜蜂螺原体病传入我国，在华东、华北、中南、西南等广大地区普遍暴发，俗称“爬蜂病”。该病来势凶猛，传播迅速，轻则削弱蜂群，重则使蜜蜂全部死亡，严重威胁着养蜂业的发展。我国自1986年从病蜂中首次分离到螺原体以来，至今已从蜜蜂螺原体病流行季节的蜜蜂和植物花上分离到多个螺原体，它们大多与＆melliferum的亲缘关系最近，属于第1血清组的第2亚组(陈永萱等，1988；董秉义等，1993；于汉寿等，2008；回丽静等，2010)。在养蜂地区的非发病季节，特别是冬季和炎热的夏季却都未能分离到。由于蜜蜂的自然寿命很短，而且螺原体本身是一种无细胞壁的微生物，对营养和渗透压的要求比较严格，因此，这种微生物在自然界中是如何延续存在的?非发病时期的螺原体会存在哪里?它们真的不在蜜蜂体内，还是由于检测样本数量有限，检测方法不够灵敏而未能检测到?这些问题仍需进一步系统深入的研究。1．蜜蜂螺原体的检测方法王文等基于Chelex一100DNA提取技术，建立了一种检测中华绒螯蟹颤抖病螺原体病原菌的分子生物学方法，该方法快速、灵敏，可广泛用于甲壳动物体内及其生活环境样品中的螺原体的检N1J(Dingetal．，2007)。本研究在其基础上，通过对Chelex．100DNA提取技术的改进，针对引起我国蜜蜂螺原体病的主要病原菌Smelliferum，建立了一种快速的检测方法。该方法简单快速、清洁无毒，检测过程仅需2～4h；DNA提取阶段只需用到5％Chelex一100和100I．tg／mL蛋白酶K两种试剂；灵敏度高、适用范围广，最低检测浓度为5～6个螺原体／mL(图1．2)，可用于检测蜜蜂螺原体可能存在于自然界中的任何样本。此外，该方法比商品化的DNA提取试剂盒的价格要便宜得多。Chelex．100法DNA提取技术也有其局限性：如模板保存时问不宜过长，现提现用较好；提取的模板DNA为单股，与琼脂糖凝胶电泳中使用的溴化乙锭(ethidiumbromieEB)的亲和力较小，不易检测到，但这不影响特异性DNA的检测，提取的模板经PCR扩增，即可获得满意的扩增产物。该方法的建立为蜜蜂螺原体的检测、资源调查及蜜蜂螺原体病的诊断及防控奠定了基础。2．蜜蜂螺原体在自然界的分布采用分子生物学检测方法和分离培养技术在一年四季(包括蜜蜂螺原体病发病时 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究期和非发病时期)采集的蜜蜂样本中均能不同程度地检测到螺原体(图1—7、l-8)，以在春季、发病时期(4、5月)病蜂体内检测到的几率最高，3、6、11、12月份次之，其余几个月则未检测到(表1．2)。这可能是由于以下几方面的原因：首先，春季是蜜蜂丌始活动的季节，是其生理状态发生变化的时期，也是容易花粉中毒，感染孢子虫病、病毒病等其它病害的时期，此时的蜜蜂抵抗力较差，体内的螺原体可能比较容易穿过蜜蜂的中肠屏障到达淋巴组织，并在淋巴组织内大量繁殖，这给螺原体在蜂群及自然界的传播提供了大量病原，也是我们在蜂箱内采集的蜂房、巢脾、幼虫等样本及近几年来在4～5月采集的植物花和其它昆虫中均能检测到螺原体的原因。其次，有些月份未能检测到螺原体，很可能是检测样本数量有限；或在7、8月份时温度较高，螺原体在自然界存活时间较短，如分离自蜜蜂和植物花的菌株MFl006、YNPl001、LKl001在37℃下不能生长，降低了传播的几率；1、2月采集的蜜蜂又大多为越冬后新繁殖的蜜蜂，此时温度较低，不适于螺原体的大量繁殖，蜜蜂也只在蜂箱内及周围较小的范围内活动，与外界其它病原的接触较少，少量螺原体的侵入可能较难穿透蜜蜂的中肠屏障也不易被检测到。此外，也不排除随着季节的变化，感染螺原体的野生蜂群和迁养蜂群会在秋冬季南移，到春夏季温度适宜之际再北移回来的可能。这样就减少了南京地区的秋冬季节在蜜蜂、植物花及其它昆虫上检测到螺原体的几率，也可以解释华北地区蜜蜂螺原体病的暴发季节一般在6、7月，要比江浙地区晚一些。最后，自1974年Cole等首次用电镜在scitri细胞内观察到杆状病毒SPVl后，至今已在螺原体内发现多种不同的病毒(Dickinsoneta1．，1985；Dickinsoneta1．，1984；RazinS，1985；Renaudineta1．，1984)；研究证实某些病毒对螺原体的侵染可能对寄主本身的致病性有影响，Alivizatos发现将感染ai病毒的Scirri转移到长春花上能抑制病症的出现并减少植株中的螺原体菌量(Alivizatos，1984)，类似的情况在感染SPVl的Scitri中也观察至[](Townsend，1983)，在昆虫螺原体中，发现SRO(sex—ratioorganism)螺原体感染SPV3病毒后不久即裂解，因此SRO侵染果蝇引起的病害也可能会得到控制(Maniloffeta1．，1977)；最近，Alexeev等在SmelliferumKC3的基因组序列中发现大量序列与病毒SpVl一R8A2B，SpVl一C74，SVTS2的序列是同源的(Alexeeveta1．，2012)；巴屠也夫也在蜜蜂螺原体内观察到大量噬菌体，有的在血淋巴中呈游离态，有的则吸附在螺原体上(巴屠也夫，1994)；因此推测被螺原体感染的蜂群受害时间可能很长，这与我们在3、6、11、12月份均能从蜜蜂体内检测到螺原体相符合，而蜜蜂螺原体病的发生则需要一定的条件，大多数时间内，噬菌体与螺原体可能处于一种平衡状态，春季是蜜蜂越冬后开始繁忙的季节，是其生理状态发生变化的时期，当这种平衡遭到破坏时，螺原体病就会发生，完全没有噬菌体时病情可能会更严重。 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究20123．螺原体在蜜蜂与植物花间的传播在蜜蜂螺原体病发病时期采集的蜜蜂、植物花、其它昆虫、蜂房、巢门、巢脾等样本中，均检测到螺原体(图1．10)；人工接种螺原体到蜜蜂和植物花表，发现体内含菌的蜜蜂可以通过采食花蜜的方式将螺原体传播到植物花表，而花表面的螺原体又可以通过蜜蜂的采食或携带传播到蜜蜂体内以及其它植物花的表面(图1—16、1．17、1—19)，说明螺原体在自然界中可通过水平传播的方式进行传播。此外，在蜜蜂螺原体病发病时期采集的蜜蜂幼虫及蛹中均检测到螺原体，但在蜜蜂的卵、蜂王胎盘等样本中未检测到(表1．3)，因此，蜜蜂螺原体是否能经卵巢传播，仍需进一步的研究。4．不同宿主中螺原体的关系我们从2010年3月到2012年1月分离获得的54株螺原体菌株中，选取了分离自同一时期相同地点不同宿主(患病蜜蜂、健康蜜蜂、死蜂、打碗花、楝树花、一年蓬、蓼科植物花)中的7株分离菌株，对其形态学、运动性、基本生物学特性、血清学及分子生物学特性进行了研究及比较。发现于2010年5～6月(蜜蜂螺原体病发病时期)采集自南京市晨光村蜂场附近的蜜蜂和植物花上都不止包含SmellifeFum一种螺原体，它们分别包含2种(MFl006与Sapis聚类，MFl007、MFl008与smellife，“m聚类)和3种螺原体(DWl001、LSl001与Smelliferum聚类，YNPl001与sapis聚类，LKl001与sclarkii聚类)(图1．27、1—28)。据报道，这几种螺原体在蜜蜂、植物花和其它昆虫上均有分布(李霞等，2012；回丽静等，2010；Moucheseta1．，1984)，这也进一步证实了螺原体在自然界可通过水平传播方式进行传播。2009年，回丽静等在我国蜜蜂体内分离到一株与sclarkii亲缘关系较近的菌株(回丽静等，2010)，本研究在蜜蜂体内又分离到2种螺原体菌株，目前发现植物花上存在多种不同的螺原体，分别属于I一2、I．6、I一8、III、Ⅳ、XXI、XXⅣ、XXX血清组或Ⅱ组qb(Regassaeta1．，2006)，推测蜜蜂体内可能含有更多种类的螺原体。同时，植物花表面螺原体的多样性及同种螺原体在亲缘关系较远的植物花表而分布的』’1泛性，如本实验在油菜花、紫云英、打碗花、楝树花等花表均分离到Smelliferum，说明植物花上的螺原体与植物花宿主的特异性并不强，植物花表应该只是螺原体传播途径中的媒介，这与Clark等的观点(Clarketa1．，1982)也相一致。意大利蜜蜂(Apismellifera)在接种螺原体|S：melliferumCH．1的植物花表采食而感染螺原体4～5d后，表现为乱飞乱撞，后行为呆滞，在地上爬行，不久后便抽搐死亡。此外，通过饲喂新鲜菌液的方法又对两株与引起蜜蜂“五月病”的Sapis聚类的螺原体MFl006、YNPl001以及一株与引起蜜蜂“螺原体死亡病”的SmeHife，．“Ⅲ聚类的螺原体MFl008的致病性进行研究。由于发病蜜蜂数量较难统计，如有些蜜蜂感 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究染菌液后病情较轻，我们在致病性试验中采用记录每天的死蜂数来观察螺原体对蜜蜂的致病力强弱，结果发现感染供试螺原体菌株的意蜂在第5d时均开始出现“爬蜂”症状，在相同的实验条件下，感染MFl006及YNPl001菌液的蜜蜂的发病速度较快。到第9天时，感染供试螺原体菌液的实验组及阳性对照组(饲喂SmetliferumCH-1菌液)意蜂的死亡率均明显高于对照组的意蜂(饲喂新鲜培养基)，与对照组意蜂在1％显著水平下相比差异均极显著。随机挑选死亡的蜜蜂，在实验组及阳性对照组中均能不同程度地分离到螺原体，而培养基对照组中的死蜂内未能分出(表1．15)。经过迸一步分子生物学特性的研究，发现死蜂内再分离物与饲喂的螺原体菌株的16SrDNA序列同源性极高，都仅在序列头尾端存在几个碱基的差异(图l一29)，可能为测序本身的误差，这也从Koch’S法则角度充分证明了螺原体MFl006、MFl008、YNPl001是蜜蜂死亡的病因。菌株MFl006和YNPl001的发现丰富了对我国蜜蜂“爬蜂病”病原的认识，这是在我国蜜蜂和植物花上首次发现的除Smelliferum以外的另一种致病螺原体。5．蜜蜂螺原体的侵染循环分析综上，提出蜜蜂螺原体在自然界中的传播途径：非发病时期发病时期}Nonepidemicperiod{；epidemicperiodl图1．33蜜蜂螺原体在自然界中可能的传播途径Fig1-33Possibleroutesoftransmissionofhoneybeespiroplasmasinnature蜜蜂螺原体在蜜蜂螺原体病暴发时期(一般为春季4、5月)，由含菌蜜蜂体内传播到蜂箱内蜜蜂经常活动的场所或蜂箱外界的植物花表面，健康蜜蜂或其它昆虫在含菌的处所和植物花表面活动后可将其携带或感染的螺原体传播到蜂箱内别处或其它67 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012的植物花表面，为其它蜜蜂和昆虫的再次感染与传播螺原体提供病原；在非发病时期，螺原体不易穿过蜜蜂的中肠屏障到达淋巴组织，少量的螺原体在蜜蜂体内可能会长期生存或经消化道排泄在蜂箱内或周围后感染其它健康蜜蜂，当天气变化或其它因素致使蜜蜂抵抗力下降时，螺原体便可穿过蜜蜂中肠屏障，引起蜜蜂的死亡，这可能也是在非发病季节蜂场也偶尔出现少量爬蜂的缘故。目前发现的病原性螺原体中，植物病原性螺原体scitri、Skunkelii和昆虫病原性螺原体＆poulsonii的传播途径早已确定。Scitri、＆kunkelii主要寄生于植物筛管部和吸食植物汁液的昆虫(半翅目)体内，通过叶蝉吸食汁液的方式在不同株植物问进行传播(Saglioeta1．，1973；Daviseta1．，1972)，果蝇Drosophilawillisloni中的螺原体Spoulsonii则能在宿主体内经卵巢传播，并杀死所有被感染的雌性果蝇的雄性后代(Williamsoneta1．，1999)。Smelliferum作为另一种对昆虫致病的螺原体，Clark和Davis等对它在自然界中可能的传播途径进行了推钡JJ(Clark，1982；Davis，1978)，董秉义等对＆mellifeyzlm的流行病学也做了初步调查(董秉义等，1992)，但一直缺乏系统的研究和直接的证据。本研究首次对引起我国蜜蜂螺原体病的病原菌进行了较为详细的调查研究，得出了一些初步的结论；然而，蜜蜂螺原体能否像＆poulsonii一样垂直传播给后代等问题仍需进一步的研究。此外，新的致病菌株MFl006、YNPl001的发现，也为我国蜜蜂螺原体病的研究提供了重要信息。弄清楚这些致病菌株对宿主蜜蜂的致病机理对于蜜蜂疾病的有效防治有着重要的意义，相信这些都将成为今后研究的重点和热点。 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究参考文献[1】AlexeevD，KostrjukovaE，AliperA，eta1．ApplicationofSpiroplasmamelliferumproteogenomicprofilingforthediscoveryofvirulencefactorsandpathogenicitymechanismsinhost—associatedspiroplasmas[J】．JProteomeRes，2012，1l(1)：224—236[2】AlivizatosAS．Cornstuntspiroplasmaindicotyledonousplants【J】．JournalofPhytopathology,1984，110(2)：148-155【3】BaffleM．Argininehydrolysis[MI．In：Methodsinmycoplasmology．Eds．RazinS，TullyJG，AcademicPress，NY，1983，1【4】BastianFO，DashS，GarryRF．LinkingchronicwastingdiseasetoscrapiebycomparisonofSpiroplasmamirumribosomalDNAsequences[J]．ExpMolPathol，2004，77：49—56[5】BiKr,HuangH，GuW，eta1．PhylogeneticanalysisofSpiroplasmasfromthreefreshwatercrustaceans(Eriocheirsinens西，ProcambarusclarkiaandPenaeusvannamei)inChina【J]．1nvertebrPathol，2008，6：1-9[6]CarleP，LaigretF，TullyJG，eta1．HeterogeneityofgenomesizeswithinthegenusSpiroplasma[J】．IntJSystBacteriol，1995，45：178—181[7】ClarkTB．Spiroplasmasp．，anewpathogeninhoneybees【J]．JlnvertebrPathol，1977，29：l12—113【8】8ClarkTB．Spiroplasmas：diversityofarthropodreservoirsandhost—parasiterelationships(J】Science，1982，217：57—59【9】ClarkTB，WhitocombRF,TullyJG．Spiroplasmafromcoleopterousinsects：newecologicaldimensions【J]．MicrobialEcology,1982，8：401—409[10】ClarkTB，WhitcombRE,TullyJG,eta1．Spiroplasmamelliferum，anewspeciesfromthehoneybee(Apismellifera)[J1．IntJSystBacteriol，1985，36：296—308[11]DanielsMJ．Mechanismsofspiroplasmapathogenicity[J】．AnnRevPhytopathol,1983，21：29—43[12]DavisRE．Spiroplasmaassociatedwithflowersofthetuliptree∞iriodendrontu；ipiferaL．)【J]．CanJMicrobiol，1978，24：954—959【13]DavisRE，WorleyJF，WhitcombRF，eta1．Helicalfilamentsproducedbyamycoplasmalikeorganismassociatedwithcornstuntdisease[J】．Science，1972，176：521—523【14】DickinsonMJ，TownsendR．CharacterizationofthegenomeofrodshapedvirusinfectingSpiroplasmacirri【J】．JGenMicrobiol，1984，65：1607—1610[15]DickinsonMJ，TownsendR．LysogenisationofSpiroplasmacitribyatype3spiroplasmavirus[J】．Virology,1985，146(1)：102—110[16】DingZF，BiKR，WuT，eta1．AsamplePCRmethodforthedetectionofpathogenic69 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012spiroplasmasincrustaceansandenvironmentsamples[J】．Aquaculture，2007，265：49—54[17】EdwardDG,MooreWB．Amethodfordeterminingtheutilizationofglucosebymycoplasmas[J]．JMedMicrobiol，1975，8：451—454[18】GasparichGE．Spiroplasmaandphytoplasmas：Microbesassociatedwithplanthosts【J】．Biologicals，2010，38：193_203．[19】GasparichGE，WhitcombRF，DodgeD，eta1．ThegenusSpiroplasmaanditsnonhelicaldescendent：phylogeneticclassification，correlationwithphenotypeandrootsoftheMycoplasmamycoidesclade[J】．IntJSystEvolMicrobiol，2004，54：893—918[20】HackettKJ，ClarkTB．OccurrenceandfrequencyofsubgroupI一6spiroplasmainarthropodsassociatedwitholdfiledsinMarylandandVirginia【J】．IsrJMedSci，1984，20：1006-1008[21】HeresA，LighmerDV．PhylogeneticanalysisofthepmhogenicbacteriaSpiroplasmapenaeibasedonmultilocussequencesanalysis【J]．InvertebrPathol，2009，103：30—35[22】InternationalCommitteeonSystematicBacteriologySubcommitteeonthetaxonomyofMollicutes[J】．IntJSystEvolMicrobiol，2000，50：1393—1397[23】InternationalCommitteeonSystematicBacteriologySubcommitteeonthetaxonomyofMollicutes：RevisedminimalstandardsfordescriptionsofnewspeciesoftheclassMollicutes(DivisionTenericutes)[J]．IntJSystBacteriol，1995，45：605—612[24】InternationalCommitteeonSystematicProkaryotesSubcommitteeonthetaxonomyofMollicutes[J】．IntJSystEvolMicrobiol，200l，51：2227—2230[25】ManiloffJ，DasJ，ChristensenJR．Virusesofmycoplasmasandspiroplasmas【J】．AdvVirusRes，1977，21：343-380[26】MarkhanPG．Spiroplasmasinleafhopper：areview[J】．JBiolMed．1983，56：745—751[27]MouchesC，Bov6JM，AlbisettiJ，eta1．AspiroplasmaofserogroupⅣcausesaMay-diseaselike．disorderofhoneybeesinsouthwesternFrance[J】．MicrobEcol，1982，8：387—399[28]MouchesC，BoveJM，AlbisettiJ．PathogenicityofSpiroplasmaapisandotherspiroplasmasforhoney·beesinsouthwesternFrance【J]_AnnMicrobiol(Paris)，1984，135A(1)：151-155[29】MouchesC，MenaraA，TullyJG，eta1．Spiroplasmaapis，anewspeciesfromthehoneybee(Ap／smell(fera)【J】．AnnlnstMicrobiol(Paris)，1983，134A：383-397[30】NunanLM，LightnerDV，OduoriM，eta1．Spiroplaz"mapenaeisp．nov．associatedwithmortalitiesinPenaeusvannamei，Pacificwhiteshrimp【J】．JSystEvolMicrobiol，2005，55：2317·2322[31]NunanLM，PantojaCR，SalazarM，eta1．CharacterizationandmolecularmethodsfordetectionofanovelspiroplasmapathogenictoPenaeusvannamei[J】．DisAquatOrg，2004，62：255-264[32]RajuBC，NylandGMeikle1、，eta1．Helical，motilemycoplasmasassociatedwithflowersand70 第一章蜜蜂螺原体在自然界的侵染循环研究honeybeesinCalifomia【J】．CanJMicrobiol，1980，27：249—253【33】RazinS．Molecularbiologyandgeneticsofmycoplasma(Mollicutes)【J】．MicrobiolRev,1985，49(4)：419-455【34】RazinS．UreaHydrolysis[MI．In：MethodsinMycoplasmology．Eds：RazinS，TullyJG，AcademicPress，NY，1983，1【35]RegassaLB，StewartKM，MurphyAC，eta1．DifferentiationofgroupVIIISpiroplasmastrainswithsequencesofthe16S-23SrDNAintergeniespacerregion[J1．CanJMicrobiol，2004，50：1061-1067[36】RegassaLB，GasparichGE．Spiroplasmas：evolutionaryrelationshipsandbiodiversity【J】．FrontBiosci，2006，11：2983-3002[37】RenaudinJ，PascarelMC，GamierM，eta1．Spy4，anewspiroplasmaviruswithCircular,single—strandedDNA【J】．Annvirol，1984，135(4)：343—361[38】RoseDL，TullyJG，Bo诟JM，eta1．Atestformeasuringgrowthresponsesofmollicutestoserumandpolyoxyethylenesorbitan[J】．IntJSystBacteriol，1993，43：527—532【39】SaglioP，HospitalML，LaflicheD，eta1．Spiroplasmacitrigen．andsp．N．：Amycoplasma—likeorganismassociatedwith“stubborn”diseaseofcitrus[J】．IntJSystBiol，1973，23：191-204[40】SaillardC，VignaultJC，BovdJM，eta1．Spiroplasmaphoeniceumsp．nov．，anewplant-pathogenicspeciesfromSyria【J】．IntJSystBacteriol，1987，37：106—115【41】TamuraK，DudleyJ，NetM，eta1．MEGA4：Molecularevolutionarygeneticsanalysis(MEGA)softwareversion4．0[J】。MolecularBiologyandEvolution，2007，24(8)：1596-1599[42]TamaraSH，ThereseAM，NancyAM．MultipleintroductionsoftheSpiroplasmabacterialendosymbiontintoDrosophila【j】．MolEcol，2009，18(6)：1294—1305[43]TownsendR．VirusofSpiroplasmacitriandtheirpossibleeffectsonpathogenicity【J】．YaleJBiolMed，1983，56：771—776【44]WangW，GuW，DingZ，eta1．AnovelSpiroplasmapathogencausingsystemicinfectioninthecrayfishProcambarusclarla"i(Crustacea：Decapod)，inChina[J】．FEMSMicrobiolLett，2005，249：131．137【45】WangW，WenB，GasparichGE，eta1．人spiroplasmaassociatedwithtremordiseaseintheChinesemittencrab(Eriocheirsinensis)[J]．Microbiol，2004，150：3035．3040【46】WhitcombRF，ChanTA，WilliamsonDL，eta1．SpiroptasmakunkeHisp．Nov．：Characterizationoftheetiologicalagentofcomstuntdisease【j】．ImjSystBacteriol，1986，36：170—178[47]WhitcombRF．ThegenusSpiroplasma[J】．AnnRevMicrobiol，1980，34：677．709[48]WhitcombRF，TullyJG，McCawleyP，eta1．ApplicationofthegrowthinhibitiontesttoSpiroplasmataxonomy[J]．IntJSystBacteriol，1982，32：387．3947l 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012【49】WilliamsonDL，SakaguchiB，HackegKJ，eta1．Spiroplasmapoulsoniisp．nov．，anewspeciesassociatedwithmale-lethalityinDrosophilawillistoni,aneotropicalspeciesoffruitfly【J】．IntJSystBacteriol，1999，49：611—618[50】WilliamsonDL，TullyJG，WhitcombRF．Serologicalrelationshipsofspiroplasmasasshownbycombineddeformmionandmetabolisminhibitiontests[J】．IntJSystBactedol，1979，29：345-351[51】WilliamsonDL，WhitcombRF．Specialserologicaltestsforspiroplasmaidentification[J】．MethMycoplasmol，1983，2：249—259[52]WilliamsonDL，WhitcombRF，TullyJG．TheSpiroplasmadeformationtest，anewserologicalmethod[J]．CurrMicrobiol，1978，1：203—207[53】巴屠也夫IOM．春季蜜蜂的疾病【J】．中国养蜂，1994，(120)：35—36[54]陈永萱，薛宝娣，郭永红．蜜蜂螺原体基本性状的研究[J】．中国科学(B辑)，1988，31：815—820【55]董秉义．蜜蜂螺原体病及其防治[J】．蜜蜂杂志，1996，(3)：20—21【56]董秉义，陈永萱，许少玉，等．蜜蜂及植物花螺原体对对蜜蜂的致病性及其血清学关系[J】南京农业大学学报，1993，16(2)：37—4l[57]董秉义，许少玉，祁云巧等．蜜蜂螺原体病的流行病学调查[J】．中国蜂业，1992，(5)：24—26[58】郭永红，叶旭东，陈永萱等．一种新的植物花螺原体(Spiroplasma)的研究[J】．中国科学(B辑)，1989，(8)：815—820【59】回丽静，钟志平，胡冰，等．分离自蜜蜂(Apis研e啦居阳)的三株螺原体的基本特性【J]．微牛物学报，2010，50(10)：1366—1372[60】李霞，于汉寿，回丽静等．南京及周边地区螺原体菌株的系统发育及遗传多样性分析[J]-南京农业大学学报，2012，35(2)：45—50[611阮康勤，周秀文，张品，等．蜜蜂螺原体的分离鉴定及致病性研究[J】．微生物学通报，2007，34(4)：695—699[62]徐松林．蜜蜂螺原体病的诱因及对策[J]．蜜蜂杂志，2001，(4)：11-12[63]于汉寿，阮康勤，纪燕玲，等．3种植物花螺原体的分离及其基本特性【J】．微生物学报，2008，48(9)：1141一l146[64】钟志平，回丽静，仇小妹等．螺原体检测方法概论[J]_安徽农学通报，2010，16(13)：44—4672 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012检测，并利用透射电子显微镜对Smelliferum在蜜蜂中肠及胸部肌肉细胞中的分布、侵入方式及由其引起的宿主细胞的病理变化进行了研究，为进一步阐明＆melliferum对宿主蜜蜂的致病机理提供线索。1材料和方法1．1材料1．1．1供试菌株蜜蜂螺原体菌株Smellife?21mCH一1于1984年分离白扬州采集的意大利蜜蜂，由本实验室保存，并经饲喂接种侵染健康蜜蜂致病后再分离出，方法同第一章第四节的1．8．1和1．8．2。1．1．2蜜蜂来源蜜蜂(ApismellifeFa)购自南京市晨光村蜂场，筛选健康的青壮年蜂，人工饲养于实验室。1．1．3主要试剂1)磷酸缓冲液(0．2MPBS,pH7．4)：A液：Na2HP04-12H2071．6g，加蒸馏水至1000mLB液：Nail2P04"2H2031．2g，加蒸馏水至1000mL用时取81mLA液和19mLB液混匀即可。2)2．5％戊二醛固定液的配制：2mL25％戊二醛原液+双蒸水至10mL，混匀，再加10mLPBS，混匀，即得2．5％戊二醛同定液。一般现配现用，效果较好。1．2方法1．2．1螺原体对意大利蜜蜂的感染为了研究螺原体在蜜蜂体内的定殖部位及侵染特征，我们采用饲喂接种法将螺原体接种到健康的蜜蜂体内。具体方法参照第二章第三节1．2。1．2．2解剖和取材在超净工作台的解剖镜下对接种5d后发病或刚死亡的蜜蜂以及健康蜜蜂分别进行取材。先用毛细管吸取蜜蜂的淋巴液于灭菌的1．5mL离心管中，然后打开蜜蜂腹腔和胸腔，迅速解剖出蜜蜂的中肠和胸肌，‘部分放入灭菌的1．5mL离心管中用于74 塑=!坚竺!竺!!』丝!!!：!!!!!!!!!【!!塑!!分子检测，另一部分立即置于25％的戊二醛溶液中4"c固定。12．3蜜蜂组织样品中的螺原体的检测将蜜蜂的组织样品直接剪碎后，加入50—100p．L5％Chelex一100，100p．g／mL蛋白酶K，具体方法参照第一章第一节I5和1．6。12．4蜜蜂组织电镜样品的制作和观察超薄切片按透射电镜常规制样方法进行制备。1)将所取组织样品在4"C下，25％的戊二醛中固定2h后，用磷酸缓冲液进行清沈，每20min一次，重复3次。2)用四氧化锇固定2h后，用PBS清沈3次，以沈去多余的锇酸。3)梯度脱水，即用逐渐增加浓度的乙醇脱水，其浓度分别为：30％、50％、70％、80％、90％、100％，每个浓度脱水时问在5—15min，为了确保脱水充分，在100％L醇脱水时反复操作3-4次。4)环氧丙烷与乙醇置换一浸渍一用EpOil812包埋一聚合(60"C，48h)。5)修块一超薄切片一醋酸双氧铀一柠檬酸铅双染色。6)同立H7650型透射电子显微镜观察并拍照。2结果与分析21蜜蜂组织中的螺原体的分子检测利用螺原体特异性16SrDNA引物F28和R5我们从感染螺原体菌液的意大利蜜蜂的淋巴液、胸肌和中肠内均扩增出长度为271bp的特异性片段，在健康蜜蜂的各组Ml2j45678910ll12lj14图2-I螺原体特异性16SrDNA在蜜蜂组织DNA中的扩增图谱MDL2000；1．3病蜂的淋巴液，4-7：病蜂的胸肌；8一lO痈蜂的中肠；II：健康蜜蜂淋巴液；12健康蜜蜂脚肌；13健康蜜蜂中肠：14：PCR空门对J{I}Fig2—1Spiroplasma-specificl6SrDNAsequencesamplifiedfromDNAofhoneybeetissuesM：MarkerDL2000；1．3：Thelymphfluidofdiseasedhoneybees；4-7：Thepectoralmusclesofdiseasedhoneybees；8—10Themidgutofdiseasedhoneybees；lIThelymphfluidofhealthyhoneybees；12：Thepectoralmusclesofhealthyhoneybees；13：Themidgutofhealthyhoneybees；14PCRblankcontrol 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环煦其n蜜蜂体内的定殖研究2012织样品中却均未扩增出该片段，说明螺原体经蜜蜂的口食入进入其中肠后，可能入侵了蜜蜂的淋巴组织和脚肌。2．2超薄切片中的螺原体的鉴定被感染的蜜蜂组织超薄切片中的螺原体可以根据其形态、大小、网状内部结构的存在与否以及仅由单层膜包裹的特性来鉴定。在昆虫宿主细胞内，螺原体常呈球状或棒状(图2-2B，2-3C，2-4B，2-5z)，直径大小约为70—130rtrn，偶尔可见到单个的螺旋，在高倍放大的显微照片中可见其由典型的山蛋白质与脂质组成的三层结构的单位膜包裹，没有细胞壁，也没有她型的细胞核，只有DNA丝形成的“拟核”(图2-2A，2—4C)。图2-2蜜蜂中肠上皮细胞中螺原体的超微形态A：螺原体典掣的螺旋状、单忙膜(一)及细胞目架结构，B：细胞山螺原体晕球状或榨状(一)标尺：A．B-100rimFig2-2UltramorphologyofsplmpbsmainthemidgutepithelialcellsofSpiroplasmamelliferum·infectedAr／smelliferaA：bpicalhelicalstrudum，elementarymembmne(arrow)andcytoskeletalSIFUCIHre5ofspiropl器ma；BGlobularorelavateshapedfⅢ、spiroplasmasinthecellScalebars：AB=】OOnm23螺原体smelliferumCH一1在蜜蜂体内的分布在感染旦mellifer州CH．1的蜜蜂的tp肠上皮细胞顶端、中部、j女底【H1及其胸腔的肌肉细胞内均检测到螺原体，在健康蜜蜂的各类细胞内却均米检测到。螵原体常大量聚集在I扫膜包裹的细胞质囊泡内，个，几个(图2-4A)到数十个不等(图2—3c，D)，偶尔能看到在细胞质rlj单个的米被膜包裹的蝶原体(罔2—3c)。这些囊泡常Ⅱ}现在细胞核附近(图2_3A和2．4A)和巾JJjj上皮细胞边缘的基底丽质膜与基板之问(图2-3B)。 塑三垦塑业垫竺!竺坐竺!!!：!翌里墅!些竺型!!竺堡堂皇塞塾——由图2．3D还观察到一些螺原体即将侵入或已侵入基扳内部形成了山膜包裹的囊泡(图2-3D)。在胸部的肌肉细胞内，也有大量螺原体入侵，常位于肌原纤维附近(图2—5c，D)。图2-3感染印h”plasmamelliferumCH，l的蜜蜂中肠上皮细胞A：蝶原体枉细胞棱附近『“膜乜班的细胞质囊泡内：B蝶僚体枉细胞越底面的质艘与毖扳2问j￡巾Ⅱ目即将证入或已1=：}八基扳内部(一)，C，D分别为A干¨B的埘部放人。卧基扳，ER：内质嗣；Gc：中肠细胞；H：』h脏，My：微绒毛：Mi：线粒体。I／u：细胞拨：s：螺原体。标尺：A=5lsm；B-251am；CD=S00nm。Fig2-3Midgutepithelialcellsof&meUiferumcH一1．infeetedAmelliferaA㈣ADeaPthenucleusshowingspiroplasmasinmembrane-bouadcytopl辞micvesicles；BSpiroplasmaswefeinIhespaccsbetweenthebasalpiasmalemmaandbasallaininaofgutcellsSOlllCwereabouttoinvadeorhadinvadedthebasallaminar+1CandDwerethehighmagnificationofAandB．respectively．BI：basallamina；ER：endoplasmicreticulum；Gc：midgutcell；Hhaemocoel；Mv：microvil|iMi：mgochondrion；Nunucleus；S：spiroplasmaScalebaB：A=51am；B-25p．m；CD-500nm 李霞蜜蜂螺腻体的侵染循环＆JCn蜜蜂伴内的定蒴研究2012图2-4感染跏iroplasmamelliferumCH．1的蜜蜂中肠上皮细胞A：细胞顶端的核附近存在单个、儿个(一)到数十个不昝的螺原体：B：A的Jj部放^，显示出人越蝶原体存在丁由膜包裹的细胞质囊泡内，c：B的局部放人，可见皿掣的螺旋状(一)。My：微绒毛：Nu：细胞核：s：螺原体，标尺：A-Ipm；B=250nm；C=100nm。Fig2-4Midgutepithelialcellsof￡mell扣rumcH-I—infeetedA．melliferaASingleafeWordozensofspiroplasmasappearedtheareaNearthenucleusofcellapicalBHighmagnificationofAshowingmassivespiropl赫masinmembrane-boundcytoplasmicvesicles；C：Hi曲magnificationofBshowing：typicalhelical$IructuteMvmicrovilI⋯N：nucleus；S：spiroplasmaScaleba⋯AIpmB-250nm；C-100rim2．4感染smelliferumCH一1的蜜蜂的细胞病理变化感染smellifer啪CH．I的蜜蜂的中肠上皮细胞未表现出诸如细胞收缩、肿胀、变形、细胞器消失、细胞核捌f：、微绒毛及基底而的质膜内折异常等明显的细胞病瑚!症状，但其肌肉细胞则发生了较大的病理变化。在健康蜜蜂的胸内，肌细胞呈纤维状，肌原纤维沿细胞长轴平行排列，其横切而呈点状，由肌内膜包裹，聚集为一个个的小区(图2—5B)。每一肌原纤维都有相同排列的明带(I带)和暗带(A带)(图2-5A)。大量的线粒体充斥在肌原纤维之问(图2-5A，B)。在被螺原体侵染的肌肉细胞中，肌原纤维则发生了断裂，明带逐渐消失，仅剩z线(图2—5D，E)，线粒体的双层膜破裂，剩余的未见被螺原体侵染的纤维也是松散排列，4i如健康细胞·"排列紧密、整齐(图2．5C)。3讨论蜜蜂螺原体作为一种昆虫病原性细菌，对蜜蜂养稍业和农业q二产都有重大危害，们其对宿主蜜蜂的致病机制至今仍小清楚。本文利_|_『J螺原体特异性引物对健康蜜蜂和患病蜜蜂中肠、淋巴液及胸部肌肉中的螺原体进行了检测，并利jljf乜子显微照片对蝶原体在忠病蜜蜂的中肠及胸部肌肉的定殖分布提供了卟概貌，揭示出些之前术报道的侵染机制。 塑兰翌生兰塑!竺生!!竺!!：!堕堕些!堕塑塑!!盟堡墨：!塞塾隧参．黪掣图2．5意蜂的胸部肌肉细胞A：健康蜜蜂脚音|f肌肉细JJ6}的纵切面，明、瞎带明显．B：健康蜜蜂胸部肌肉细胞的横切面，c螺原体存在。】：肌原纤维附近由膜包裹的细胞质囊泡内，线粒体膜破裂(一)；D：邻近螺原体的肌原纤维断裂，明带逐渐消火，E：D的局部放火，可见l蜩显断裂的肌原纤维(一)。A噼带，Mi：线粒体，Mfi肌原纤维，I．明带，s：螺原体，z：z线。标尺A—C=500rim；D=1pro；E=250nm。Fi92-5Pectoralmusclecellsof4口／smelliferaA：LongitudinalsectionofpectoralmuscleeelIsofhealllayAmelliferaIightbandanddarkband一∞parentBTransverscsectionofpectoralmusclecellsofhealthyAmell瓣ra；C：Afcaucafthemyofibrilshowingspiroplasmasinmembrane—boundcytoplasmicvesiclesmitochondrlalmembranedisrupted(_÷)；DSplittingofmyofibrilsadioinedspiroplasmasandthelossoflightband；E：HighmagnificationofDshowingapparentspliaedmyofibrilsA：darkband；Mi：mitochondrion；MfimyofibrilI：Iightband；S：spiropl拈ma；ZZlineScalebars：A-C-500nm：D=Ipm；E-250nml如于螺原体侵入宿主组织后大多会失去螺旋形，f舡呈现球状、棒状或多形状，使得我们难以辨认，所以，柚早期的有关研究-h常利用免疫标电来确认昆虫组纵叫_】的蝶原体并了解7Eqf]的形状特征(Kwonetal，1999；Ozbeketal，2003)。随厉，便可依批这些报道的螺原体的形态特征，通过螺蟓体的大小、山单层膜包裹的特性及细胞质内存在DNA丝形成的嘲状结构米进行鉴别。Clark等报道smell塘M能穿过蜜蜂的中肠屏障到达淋巴组织，并在淋巴组织内大量繁殖从而导致蜜蜂死]Y：(Clark，1977)。但是，螺原体如何穿透其中肠屏障，它们划宿主细胞的侵染机制仍未定沦。Mowry研究了scirri和其实验传播介体Macrosteles衄c咖瑚的细胞问的关系，认为且cirri是通过受体介导的胞吞作用进入其昆虫介体的 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012细胞内(Mowry,1986)。Lui报道Scitri是通过内质网来穿透昆虫细胞的细胞膜进入细胞质，然后到达细胞基底部的质膜(Lui，1981)，然而，我们却未看到相关的显微照片。Alivizatos和Markham发现螺原体只存在于唾液腺细胞边缘的质膜和基板之间，细胞质中则不存在(Alivizatorseta1．，1986)。Markham提出螺原体是通过在细胞间的转移而不是穿过细胞来侵染Ctenellus的唾液腺的(Markham，1983)。在本研究中，我们利用分子生物学方法检测到螺原体分布于患病蜜蜂的中肠、淋巴液和胸部肌肉(图2．1)。通过迸一步对蜜蜂组织超薄切片的观察，在蜜蜂中肠上皮细胞的细胞质中看到大量螺原体，在细胞问隙却没有看到。此外，定殖于中肠细胞的顶端，内部、细胞末梢的质膜与基板间甚至基板内和胸部肌肉细胞中的螺原体大多都聚集在用膜包裹的小囊泡内(图2．3C、D，图2—4B，图2-5C)。据此，我们推断smelliferumCH—l是通过胞吞作用从蜜蜂中肠肠腔穿入上皮细胞顶端的细胞质内，再从细胞基底面通过基膜进入血腔，侵染淋巴液及其它组织。在感染螺原体的蜜蜂中肠细胞内没有看到明显的病理变化，如细胞收缩、肿胀、变形、细胞器消失、细胞核凋亡、微绒毛及基底面的质膜内折异常等。但被螺原体侵染的肌细胞却呈现出明显的不良反应：由于螺原体的侵染，肌原纤维发生断裂(图2-5E)：Phillips等报道Z线的消失先于肌原纤维的断裂和溶解(Phillipseta1．，1995)，我们看到在膜包裹的含有大量螺原体的小囊泡附近的肌原纤维的明带也正逐渐消失，仅剩其中问的z线(图2．5D)，这说明由螺原体形成的囊泡附近的肌原纤维也开始病变；线粒体膜破裂、内部嵴暴露等(图2—5C)。＆melliferum能引起蜜蜂的螺原体病，导致蜜蜂大量死亡。这些有害作用可能由多种原因引起，包括宿主细胞与病原体对营养物质的争夺，微生物代谢物的毒性等。本研究中观察到的蜜蜂组织中的一些病变及螺原体在蜜蜂体内的大量增殖也可能是其重要因素之一，如胸部肌细胞内发生的一些病理变化可能是导致蜜蜂失去飞翔能力，只能在地上爬行的原因。此外，Phillips等在感染Spiroplasmalaiwanense的Anophelesstephensi的脑和胸神经节刷围的末梢神经胶质细胞中，观察到大量螺原体，由已感染螺原体的神经胶质细胞包围的神经脊髓轴突由于线粒体的肿胀而变得膨大(Phillipseta1．，1995)；王文等在患“颤抖病”的中华绒鳌蟹的神经组织巾，观察到其病原菌广泛存在于胸神经节的神经胶质细胞、结缔组织及细胞间隙中(王文等，2001)，将该病原菌接种入小龙虾(crayfish)、小鼠和鸡胚中，仅在鸡胚的脑组织中检测到该病原菌(Wangeta1．，2003)，认为该致病因子具有嗜神经的特征(Wangeta1．，2002；王文等，2001)，通过入侵宿主的神经系统来引发宿主的疾病，后经证实该病原为螺原体的一个新种，已命名为Spiroplasmaeriocheiris(Wangeta1．，2011)。近来，Alexeev等在Smellife厂zlmKC3的基因组中发现了编码几丁质酶和几丁质脱乙酰酶的基因，这些基 第二章SpiroplasmamelliferumCH一1对蜜蜂中肠和胸肌的侵染与定殖因在植物病原性螺原体&citri中并没有发现(Alexeeveta1．，2012；Carleeta1．，2010)，由于大多数昆虫消化道都含有一个围食膜的基质，由整齐排列的几丁质微纤维和嵌入的种特异性蛋白组成，用于使肠道上皮细胞与摄入的食物相分离(MoskalykLA，1996；Petereta1．，1979)，Alexeev等认为Js：melliferumKC3的几丁质酶与其穿透蜜蜂的中肠屏障有关，其几丁质脱乙酰酶的发现则为smelliferumKC3高度的昆虫宿主专化性提供了依据(Alexeeveta1．，2012)。然而，Smelliferum究竟如何穿透宿主的中肠屏障，是否会侵入宿主的神经系统，要弄清楚它对宿主蜜蜂的侵染机制还有待观察到更为详细、连贯的显微照片及分子生物学方面更为详尽的实验证据。参考文献[1】AlexeevD，KostrjukovaE，AliperA，eta1．ApplicationofSpiroplasmameltiferumproteogenomicprofilingforthediscoveryofvirulencefactorsandpathogenicitymechanismsinhost-associatedspiroplasmas[J】．JProteomeRes，2012，11(1)：224—236[2】AlivizatosAS，MarkhanlPG．Acquisitionandtransmissionofcornstuntspiroplasmabyitsleafhoppervector,Dalbulusmaidis[J]．AnnApplBiol，1986，108：535：544[3】Carle只SaillardC，Carr6reN，eta1．PartialchromosomesequenceofSpiroplasmacirrirevealsextensiveviralinvasionandimportantgenedecay[J】．ApplEnvironMicrobiol，2010，76(11)：3420—3426[4】4ClarkTB．Diversityofspiroplasmahost—parasiterelationships[J】．IsrJMedSci，1984，20：995—997[5】ClarkTB．Spiroplasmasp．，anewpathogeninhoneybees[J】．JournalofInvertebratePathology,1977，29(1)：112—113[6]GranadosRR．Electronmicroscopyofplantsandinsectvectorsinfectedwiththecornstuntdiseaseagent[J】．ContribBoyceThompsonInst，1969，24：173-187[7]KwonM，WayadandeAC，FletcherJ．Spiroplasmacitrimovementintotheintestinesandsalivaryglandsofitsleafhoppervector,Circulifertenellus【J1．Phytopathology,1999，89：11441151【8】LuiH．Thetransmission，multiplicationandelectronmicroscopicexaminationofSpiroplasmacitriinitsvector,C姚“龙细tenellus【DI．1981，PhD．dissertation．UniversityofCalifornia,Riverside．【9]MarkhamPG．Spiroplasmasinleafhoppers：Areview["7】．YaleJBiolMed，1983，56：745—751[10]MarkhamPG,AlivizatosAS．Thetransmissionofcornstuntspiroplasmabynaturalandexperimentalvectors[J]．InGordonDT,KnokeJK，NaultLKRitterRM(Eds．)，ProceedingsoftheInternationalMaizeVirusDiseaseColloquiumandWorkshop．OhioStateUniversity,Wooster,OH，1983．56．6181 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012【11]MoskalykLA，OoMM，Jacobs-LorenaM．PeritrophicmatrixproteinsofAntlphelesgambiaeandAedesaegypti【J】．InsectMolBiol，1996，5：261-268【12】MowryT．MechanismsofandbarrierstoSpiroplasmacirriinfectionofMaerostelesfascifrons(Stal)[D】．1986,PhD．dissertation．MichiganStateUniversity,EastLansing【13]OzbekE，MillerSA，MeuliaT，eta1．InfectionandreplicationsitesofSpiroplasmakunkelii(class：Mollicutes)inmigutandMalpighiantubulesoftheleafhopperDalbulusmaidis[J]．JournalofInvertebratePathology,2003，82：167-175【14】PetersW，HeitmannS，D’HaeseJ．Formationandfinestructureofperitrophicmembranesintheearwig，Forficulaauricularia[J]．EntomolGen，1979，3：241·254[15】PhillipsRN，Humphery—SmithI．ThehistopathologyofexperimentallyinducedinfectionsofSpiroplasmataiwanense(class：Mollicutes)inAnophelesstephensimosquitoes[J]．JlnvertebrPathol，1995，66：185-195【16】RegassaLB，GasparichGE．Spiroplasmas：evolutionaryrelationshipsandbiodiversity[J]．FrontiersinBioscience，2006，11：2983—3002【17]Wangw：Guw，GasparichGE，eta1．Spiroplasmaeriocheirissp．nov．，associatedwithmortalityintheChinesemittencrab。Eriocheirsinensis[J]．IntJSystEvolMicrobiol，2011，61：703—708【18]WangW，GuZERickettsia-likeorganismassociatedwithtremordiseaseandmortalityoftheChinesemittencrab，Eriocheirsinensis[J]．Inter-ResDisAquatOrg,2002，48：149—153【19]WangWRongL，DuK，eta1．StudyonexperimentalinfectionsofspiroplasmafromtheChinesemittencrabincrayfish，miceandembryonatedchickens[J]．ResMicrobiol，2003，154：677—680【20]王文，朱宁宁，李正荣，等．类立克次体侵染中华绒鳌蟹神经组织的光镜和电镜观察[J】．动物学研究，2001，22(6)：467-471 全文总结第一，针对引起我国蜜蜂螺原体病的病原菌Spiroplasmamelliferum，建立了一种基于Chelex一100DNA提取技术的分子生物学快速检测方法。该方法可以在2～4小时内诊断出植物花、蜜蜂及其生活环境是否被螺原体感染，最低检测浓度为5～6个／mL。第二，从2010年3月到2012年1月，对南京地区蜜蜂螺原体的分布进行了调查。在采集的蜜蜂、植物花、其它昆虫、蜜蜂卵、幼虫、蛹、蜂房等1434个样本中，共检测到92个样本中含有螺原体，分离获得54株螺原体菌株。调查表明蜜蜂螺原体一年四季都可以存在于蜜蜂体内，尤以在春季、发病时期病蜂体内检测到的几率最高：此外，在发病时期采集的蜜蜂幼虫、蛹、植物花、其它昆虫、蜂房、巢门、巢脾等样本中，均检测到螺原体，说明螺原体在自然界中可通过水平传播方式进行传播。第三，采用将螺原体分别人工接种到蜜蜂和植物花的方法，对蜜蜂螺原体在蜜蜂和植物花问的传播方式进行探索。结果显示：体内含菌的蜜蜂可以通过采食花蜜的方式将螺原体传播到植物花表面，而花表的螺原体又可以通过蜜蜂的采食或携带传播到蜜蜂体内以及其它植物花的表面，传播到蜜蜂体内的致病性菌株可以引起蜜蜂“爬蜂病”的症状，而植物花未表现出任何病状。第四，对分离自同一时期相同地点不同宿主(患病蜜蜂、健康蜜蜂、死蜂、打碗花、楝树花、一年蓬、蓼科植物花)中的7株分离菌株的形态学、运动性、基本生物学特性、血清学及分子生物学特性进行研究及比较。发现同一时期同一地区的蜜蜂和植物花样本中分别含有2种和3种螺原体；不同宿主中的螺原体均分别与Spiroplasm口apis和Smelliferum聚类，迸一步证实嫘原体在自然界中可通过水平传播方式进行传播。综上，提出了蜜蜂螺原体在自然界中的传播途径：(1)蜜蜂螺原体在蜜蜂螺原体病暴发时期(一般为春季4、5月)，由含菌蜜蜂体内传播到蜂箱内蜜蜂经常活动的场所或蜂箱外界的植物花表面，健康蜜蜂或其它昆虫在含菌的处所和植物花表面活动后町将其携带或感染的螺原体传播到蜂箱内别处或其它的植物花表面，为其它蜜蜂和昆虫的再次感染与传播螺原体提供病原；(2)在非发病时期，蜂场几乎没有爬蜂，蜜蜂螺原体检测到的几率也极低，推测此时的蜜蜂螺原体不易穿过蜜蜂的中肠屏障到达淋巴组织，从而大量繁殖引起蜜蜂死亡，少量的螺原体在蜜蜂体内可能会长期生存或经消化道排泄在蜂箱内或周围后感染其它健康蜜蜂，当天气变化或其它因素致使蜜蜂抵抗力下降时，螺原体在蜜蜂体内繁殖并可穿过蜜蜂中肠屏障，引起蜜蜂的死亡，这可能也是在非发病季节蜂场也偶尔m现少量爬蜂的缘故。 李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及其在蜜蜂体内的定殖研究2012第五，通过饲喂新鲜菌液的方法对两株与引起蜜蜂“五月病”的Sapis聚类的螺原体MFl006、YNPl001以及一株与引起蜜蜂“螺原体死亡病”的＆melliferum聚类的螺原体MFl008的致病性进行研究，发现分离菌株MFl006、YNPl001及MFl008对意蜂均具有较强的致病性，菌株MFl006和YNPl001则分别是在我国蜜蜂和植物花上首次发现的除Smelliferum以外的另一种致病螺原体。第六，利用分子生物学检测方法在患病蜜蜂的中肠、淋巴液和胸部肌肉中均检测到螺原体，健康蜜蜂内则没有。应用透射电子显微镜对&melliferumCH一1在意蜂(ApismeHifera)的中肠和胸部肌肉中的分布、侵染机制及由其引起的宿主细胞的病理变化进行研究，发现螺原体通常大量地聚集在膜包裹的细胞质囊泡内，分布于中肠上皮细胞顶端和内部的核附近、基底面的质膜与基板之间、基板内部及胸部肌肉细胞内。相对于健康蜜蜂肌肉细胞，内整齐排列的纤维束，被螺原体侵染的纤维束表现出明显的断裂、松散排列。这些症状都可能是导致“爬蜂”及蜜蜂死亡的原因。 攻读硕士期间发表的学术论文李霞，张杰，马云龙，等．分离自我国蜜蜂的一株新的致病螺原体及其基本特性[J】．微生物学通报，2012，39@)：273—281李霞，于汉寿，回丽静等．南京及周边地区螺原体菌株的系统发育及遗传多样性分析[J]．南京农业大学学报，2012，35(2)：45—50胡冰，贺子义，李霞．螺原体超微形态的电镜研究【J】．电子显微学报，2011，30(6)：547．551 致谢三年的研究生历程随着论文撰写工作的完成，也即将落下帷幕，然而，这一路走来却受到了太多的恩惠!首先，要感谢我的导师于汉寿副教授!从选题之初，课题进程到论文的撰写，无不倾注了导师的心血。于老师严谨求实的治学态度、循循善诱的教学方法，使我终身受益。他不仪教我如何去做研究，更教我做人的道理、为人处事的方式和对待人生的态度。在此，谨向恩师致以深深的敬意和由衷的感谢!感谢王志伟教授为我的课题和论文撰写提供许多宝贵建议以及在思想上给予我的指导!感谢纪燕玲老师，三年来在学习、生活和思想上给予我的无私关怀、鼓励、开导和帮助!特别感谢生命科学实验中心胡冰、贺子义老师在电镜观察方面给予我的无私指导和帮助!感谢本实验室的师姐亢燕、刘淑园、陈蒙、张晨炜、回丽静，师兄韩魁、崔荣凯、陈达在工作上给予我的无私帮助；感谢同窗好友杜文珍、孙茜、俞英豪、郭英鹏、刘宝虎、王永、高龙、何迎周、周宝魁在工作、生活中对我的关怀和帮助；感谢师弟俞徐斌、史明乐、韦祥银、张光亮，师妹张红侠、王晗、任向荣、冯彦霞、周丹霞、张向向、邢转青、张春燕对我工作的支持、理解及宽容。特别感谢SRT小组(张杰、马云龙、李睿、周惠民、李晶晶同学)及许志祥和王之溪同学的全力支持和帮助!感谢植保院华休德师兄，生科院师亮、任昂、朱文军等师兄在实验上的热心帮助!最后感谓十我的父母对我默默地支持、关怀与理解!是他们的疼爱与奉献，让我拥有更多选择的权力，让我更加勇敢地去面对人生，面对挑战!李霞二O一二年五月