崇义野生桔与栽培种——南丰蜜桔抗逆生理的比对研究 11页

崇义野生桔与栽培种——南丰蜜桔抗逆生理的比对研究内容摘要：通过对崇义野生桔和南丰蜜桔果实的可溶性固形物、维生素C、可溶性总糖、可滴定酸等一系列的生理指标进行了测定,另外分析比较了两个品种之间超氧化物歧化酶的活性、丙二醛和游离脯氨酸等抗逆生理指标的差异，发现南丰蜜桔超氧化物歧化酶的活性比崇义野生桔强，而崇义野生桔的脯氨酸、膜脂过氧化程度较强于南丰蜜桔，这些结果表明崇义野生桔比南丰蜜桔更耐旱。此次试验的开展既有助于对崇义野生桔的研究开发，对发掘柑桔品种和改良新型材料也有重要意义。关键词：崇义野生桔南丰蜜桔抗逆生理CitruswildandcultivatedaphysiologicalcontrastAbstract:AseriesofphysiologicalcharacteristicsofbothChongyiwildcitrusandNanfengorange,includingcitrusfruitsolublesolids,vitaminCcontent,totalsolublesugarcontentandtitratableacidweredetermined.Comparingthedifferenceofsuperoxidedismutaseactivities,MDA(malondialdehyde)andprolinephysiologicalindexesbetweenthetwovarieties,theresultsshowedthatthesuperoxidedismutaseactivitiesofNanfengorangearestrongerthanthoseoftheChongyiwildcitrus,andthebioactivitiesofprolineandlipidperoxidationofChongyiwildcitrusaremorethanthoseofNanfengcitrusindicatingthatthedroughtresistanceofChongyiwildcitrusarepossiblyhigherthanthoseofNanfengorange.TheresearchwillbebenefitedthedevelopmentofChongyiwildcitrusandshowsomeusefulmeaningforcitrusvarietyimprovementinuncoveringsignificantnewmaterials.Keywords:ChongyiwildcitrusNanfengorangeanti-physiology崇义野生桔是20世纪70年代末在赣南的崇义原始林中发现的[1] ，这是目前世界上发现的第三片野生柑橘林，对我国柑橘生产品种的改良和柑橘种植业的发展提供了重要的优势种质资源。截止到目前，对于柑桔野生种的研究还停留在分类和育种两方面，对于其生理特性的具体研究没有见诸报道。刘庚峰等对道县野橘和莽山野橘进行了植物学性状特征鉴定[2]、同工酶分析[3]；陈梦龙等进行了花粉粒电镜扫描等工作[4]；廖振坤等采用AFLP技术，对湖南省宽皮柑橘类野生资源莽山野橘、道县野橘、江永野橘及印度野橘、立花野橘等23个材料进行鉴定，根据聚类结果和亲缘关系分析，结果表明莽山野橘、道县野橘等是较印度野橘和立花野橘更古老的野生种[5]。在柑橘近缘野生种的利用方面，据统计，利用PEG或电融合己经创造出了60多种有性亲和或有性不亲和的柑橘及其各种近缘野生种属间的体细胞杂种[6]。南丰蜜桔属芸香科柑桔属植物，是我国优良的宽皮柑桔良种之一，原产于江西省南丰县，已有1300多年的栽培历史。南丰蜜桔是江西的传统地方特色品种，享有“桔中之王”美称[7]。本实验通过对崇义野生桔和南丰蜜桔果实的生理特性进行了研究,为简化植物果实品质的评价指标，采用主要成分分析方法。测定了可溶性固形物、维生素C、可溶性总糖、可滴定酸的含量，再对这4项指标进行分析，初步比较这两个品种的品质差异。然后通过测定它们的SOD活性、丙二醛和脯氨酸等，比较二者的抗逆生理指标，以期为今后崇义野生桔的开发利用提供理论依据。1．1材料与处理南丰蜜桔的果实和叶片采自江西省南丰县，崇义野生桔的果实和叶片采自江西省崇义县。挑选大小均匀,无病虫害,成熟度一致的果实以及新鲜的叶片，放在—25℃低温条件下冰柜贮藏,测定生理生化指标。以果实为材料，测定可溶性总糖含量、可滴定酸的含量、维生素C的含量和可溶性固形物的含量，以叶片为材料，测定丙二醛含量、SOD活性和游离脯氨酸的含量。两个品种的每项指标的测定都做3组样品，南丰蜜桔标记为南丰1、南丰2、南丰3，崇义野生桔标记为崇义1、崇义2、崇义3。1．2测试指标及方法1.2．1可溶性固形物(SSC)的测定。取样品去核，放入匀浆机进行匀浆后用纱布过滤取滤液，采用手持折光仪(WYF--4型)进行测定。[8] 1.2．2费林试剂比色法测定可溶性总糖（1）取已经去核的样品放入匀浆机进行匀浆后用纱布过滤，用干燥小烧杯准确称量5.00g样品，将称好的样品转移至250ml容量瓶中，加水稀释至200ml左右，逐渐滴加5ml乙酸锌溶液及5ml亚铁氰化钾溶液，加水定容，混匀，静置30min后用棉花过滤，弃去初滤液，收集滤液。（2）用50ml量筒量取50.00ml滤液于100.0ml容量瓶中，加入5ml盐酸（6mol/L）于68～70℃水浴锅中水解15min，立即取出迅速冷却至室温。加两滴甲基红指示剂（0.1%），用200g/L氢氧化钠溶液中和至溶液刚好褪去粉红色后定容，混匀。（3）吸取碱性酒石酸甲液和乙液各5.00ml于250ml锥形瓶中，加水10ml，加几粒玻璃珠，控制在2min内加热至沸，从滴定管中快速滴加试样溶液，并保持溶液沸腾状态，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗试样水解液的体积（V）。（4）结果计算：总糖（以转化糖计，%）=式中，F——10ml碱性酒石酸铜溶液相当的转化糖质量，mg；m——样品质量，g；V——测定时平均消耗样品溶液的体积，ml；250——样品溶液的体积，ml。[8]1．2．3中和滴定法测定可滴定酸(1)取待测样品，去皮取果肉，匀浆处理后，称取20g与无CO2蒸馏水移入250ml容量瓶，定容，静置30分钟，用干燥滤纸过滤，弃去初始滤液25ml，准确吸取滤液50ml,加入酚酞指示剂3－4滴，用0.1mol/LNaOH标准溶液定至微红色30秒不褪，记录NaOH标准溶液消耗的ml数。(2)计算：总酸度（％）＝CVkV0×100/(m×V1)。式中：C---标准NaOH溶液的浓度,mol/l；V---滴定消耗标准标准NaOH溶液体积,ml；m---样品的质量,g；V0---样品的稀释液总体积,ml；V1---滴定时吸取的样液体积,ml；k---换算为主要酸的系数,即1毫摩尔氢氧化钠相当于主要酸的系数[9]。1．2．4　2,6-二氯靛酚滴定法维生素的测定（1）用分析天平精确称取待测样品2.5g，放入研钵中，加约10ml1%HCl溶液研磨，静置后，将提取液过滤入50ml容量瓶中，如此反复提取3次，最后用1%HCl定容至刻度，混摇均匀。（2）每次量取10ml提取液放入50ml三角瓶中，用微量滴定管，以2,6- 二氯酚靛酚钠溶液滴定至提取液呈现淡粉红色，并保持15-30s内不褪色，取其平均值。（3）取5ml1%HCl作空白对照滴定，所得的滴定值应从滴定提取液的结果中减去。根据实际消耗的2,6-二氯酚靛酚钠溶液的量来计算样品中的维生素C的含量[10]。1．2．5邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性（1）取1g待测样叶研磨,加入适量磷酸缓冲液，在0℃温度下，10000g冰冻离心，30min，两次，如此取上清液为酶提取液。取4.5mlTris-Hcl-EDTA缓冲液于25℃保温10min，再加入25℃预热过的0.1mmol/L邻苯三酚溶液20uL，混匀后于1cm石英比色杯325nm波长测光密度值，每隔30s测一次光密度值共4min，求出邻苯三酚的自氧化速率。如上步骤再加入25℃恒温的酶提取液，求出光密度值变化率OD/min。（2）酶活力计算：单位活力（U·ml-1）=；总活力=单位活力（U·ml-1）V；式中，X1为邻苯三酚自氧化速率；X2为加酶液后邻苯三酚自氧化速率；A为反应液总体积，ml；为酶液用量，ml；V为酶提取液总体积，ml。[11]1．2．6双组分光光度法测定丙二醛（1）称取剪碎的待测样叶1g，加入2ml质量分数为10%的TCA和少量的石英砂，研磨至匀浆，再加入8mlTCA进一步研磨，匀浆以4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。（2）吸取离心的上清液2ml，加入2ml质量分数为0.6%的TBA溶液，混匀，将混合物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定450、532和600nm波长下的消光度。（3）计算c1=11.71A450；c2=6.45(A532-A600)-0.56A450；式中，c1——可溶性糖的浓度（mmol·L-1）；c2——MDA的浓度（μmol·L-1）；A532、A600、A450分别代表450、532和600nm波长下的消光值。从求得MDA的浓度，根据植物组织的质量计算测定样品中MDA的质量摩尔浓度。MDA质量摩尔浓度/（μmol·g-1）=c·N·W-1；式中c——MDA的浓度（μmol·L-1）；N——提取液体积（ml）；W——植物组织鲜重（g）。[12]1．2．7快速测定法测定脯氨酸（1）脯氨酸的提取：准确称取待测样叶各0.5g，分别置试管中，然后向各管分别加入12ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取30min。（2）分别吸取2ml提取液2份于另一干净的试管中，同时，吸取2ml 3%磺基水杨酸于另一干净的试管中作为对照，5支试管中均加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以仅加磺基水杨酸做空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。（4）结果计算:脯氨酸（μg/g)=(C×V)/(A×W)；式中式中C是提取液中脯氨酸浓度(μg)；V是提取液总体积(ml)；A是测定时所吸取的体积(ml)；W是样品重(g)[13]。2.结果与分析2．1可溶性固形物(SSC)。表1：崇义野生桔与南丰蜜桔的可溶性固形物含量南丰1南丰2南丰3崇义1崇义2崇义3可溶性固形物11.34%12.46%13.57%6.68%10.16%7.83%由表1可知，崇义野生桔果实中的可溶性固形物含量平均为8.22%，比南丰蜜桔果实中的可溶性固形物含量12.47%要少。2．2可滴定总糖。表2：崇义野生桔与南丰蜜桔的可滴定总糖含量南丰1南丰2南丰3崇义1崇义2崇义3总糖10.13%10.23%9.13%6.05%6.98%6.43% 由表2可知，崇义野生桔果实中的可滴定总糖含量平均为6.49%，比南丰蜜桔果实中的可滴定总糖含量9.83%要更少。2．3可滴定酸。表3：崇义野生桔与南丰蜜桔的可滴定酸含量南丰1南丰2南丰3崇义1崇义2崇义3可滴定酸（mg/100g）0.66740.54630.73892.69872.04522.3447由表3可知，崇义野生桔果实中的可滴定酸含量平均为2.3629，远多于南丰蜜桔果实中的可滴定酸含量0.6509。2．4维生素。表4：崇义野生桔与南丰蜜桔的维生素含量南丰1南丰2南丰3崇义1崇义2崇义313.483212.378114.421329.82527.277518.2058 维生素（mg/100g）由表4可知，崇义野生桔果实中的维生素含量平均为25.1028，多于南丰蜜桔果实中的维生素含量含量13.4275。2．5超氧化物歧化酶(SOD)活性。表5:崇义野生桔与南丰蜜桔的超氧化物歧化酶活性南丰1南丰2南丰3崇义1崇义2崇义3超氧化物歧化酶活性360295315127144108 实验中难以控制SOD酶的加入量，在同时加入南丰叶片和崇义叶片的酶提取液0.1ml时，只有前者吸光度变化，而对于后者，对其酶提取液的用量一次一次的减小，直到0.05ml时，吸光度值才变化。可由图5可知，南丰蜜桔氧化物歧化酶比崇义野生桔强。许多逆境能影响植物体内活性氧代谢系统的平衡，即增加活性氧的产量，破坏活性氧清除剂的结构、降低活性氧含量水平，并进一步启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作用从而破坏膜结构，加深伤害。超氧化物歧化酶是自然界唯一的以氧自由基为底物的酶，在活性氧代谢中处于重要的地位[4]。2．6丙二醛表6：崇义野生桔与南丰蜜桔的丙二醛含量南丰1南丰2南丰3崇义1崇义2崇义3丙二醛的含量0.0220.1450.3281.7191.4561.128丙二醛是常用的膜脂过氧化指标，它的含量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度。植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害[6]。由表6可知，南丰蜜桔叶片中的丙二醛远少于崇义野生桔叶片中的丙二醛的含量，由此说明崇义野生桔膜脂过氧化程度比南丰蜜桔更强。2．7游离脯氨酸通常情况下植物体内游离脯氨酸的含量很低, 但在逆境（旱、热、冷、冻）条件下,脯氨酸含量可猛增数十倍至百倍。植株体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植株体内水份状况,在同样逆境条件下,不同品种反应不同,抗旱性强的品种比不耐旱品种所积累的脯氨酸高出数倍。因此脯氨酸含量的测定可作为抗早品种选育的参考性生理指标[16]。2.7.1标准曲线的绘制表一脯氨酸含量测定标准曲线的绘制编 号012345脯氨酸浓度013456A52000.0560.210.3660.4770.5842.7.2样品的测定表二样品脯氨酸含量的测定记录项目空白对照南丰崇义称重00.50020.5004A52000.2140.23500.2180.242A520平均值00.2160.23852.7.3样品脯氨酸含量计算：南丰：c=7.2μg，7.2×10×10/（3×0.5）=240(μg/g)崇义：c=7.8μg，7.8×10×10/(3×0.5)=260(μg/g)由计算结果可知，崇义野生桔中的脯氨酸的含量均比南丰蜜桔中的脯氨酸的含量多，因为脯氨酸的含量是抗旱品种的参考性指标，因此得出，崇义野生桔的抗旱性比南丰蜜桔强，更能耐受干旱环境。3小结与讨论通过对崇义蜜桔和南丰蜜桔的叶片中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛和脯氨酸的测定，得出南丰蜜桔抗旱性和超氧化物歧化酶的活性比崇义野生桔强，而崇义野生桔膜脂过氧化程度南丰蜜桔更强。首先通过对江西省崇义蜜桔和南丰蜜桔果实样品的品质观测与综合分析，它们的果实的可溶性固形物、维生素C含量、可滴定总糖含量、可滴定酸等方面存在较大的差异，崇义野生桔的可溶性固形物和可滴定总糖含量比南丰蜜桔的少，而崇义野生桔的维生素C含量和可滴定酸比南丰蜜桔多。 可知，在植物抗逆性方面,南丰蜜桔因人工栽培在抗性方面不及野生的崇义蜜桔，但口感和营养又很大改善，在育种时应该注重结合崇义野生桔和南丰蜜桔各自的优势，集口感、营养和抗性，开发更好的品种。参考文献：[1]聂纯清,胡俊.江西崇义的野生桔[J].园艺学报,1987,14（3）:174-177.[2]刘庚峰,贺善文,李文斌.莽山野橘—我国南岭山脉又一柑橘野生新种[J].湖南园艺,1987,(2):l-4.[3]李文斌,贺善文,刘庚峰.湖南野生相橘类种质过氧化物酶同功酶分析[J].园艺学报,1987,14(3):151-160.[4]陈梦龙,李文斌.湖南几种野生宽皮柑橘的亲缘关系研究[J].全国果树种质资源学术讨论会论文集,1987:26-29.[5]廖振坤,张秋明,刘卫国,丁伟平,张玲.南岭山脉宽皮柑橘近缘野生种亲缘关系鉴定[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2006,32(4):385-388.[6]GuoWW,DengXX.WidesomatichybridsofCitruswithitsrelatedgeneraandtheirpotentialingeneticimprovement[J].Euphyrica.2001,118(2):175-183.[7]傅火生,王泽义.葛斌南丰蜜桔优良株系--"杨小2-6"的选育[J].中国南方果树,1999(6):6-7.[8]许安邦,林维宣.食品分析[M],北京:中国轻工业出版社,1994:45-47[9]郝建军,康宗利,于洋.植物生理学实验技术[M],北京:化学工业出版社,2006:145-146.[10]郝建军,康宗利,于洋.植物生理学实验技术[M],北京:化学工业出版社，2006：183-185.[11]郝建军,康宗利,于洋.植物生理学实验技术[M],北京:化学工业出版社,2006:158-159.[12]郝建军,康宗利,于洋.植物生理学实验技术[M],北京:化学工业出版社，2006:159-160.[13]郝建军,康宗利,于洋.植物生理学实验技术[M],北京:化学工业出版社,2006:175-177. 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