中华蜜蜂谷胱甘肽s-转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析 118页

ShandongAgriculturalUniversityPh．D·DISSERTATIONBiologicalanalysisofglutathioneS-transferaseandsmallheatshockproteingenesinAp／sceranaDepartment：LifescienceMajor：BiochemistryandMolecularBiologyPh．D．Candidate：YuanyingZhangSupervisor：Prof．XingqiGuo一一一May,2014 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：招越导师签名日 符号说明Amp：Ampicillin，氨苄青霉素Acr：Acrylamide，丙烯酰胺ANS：8-Amlino-1一naphthalene-sulfonicacid，8．苯胺基．1．萘磺酸Bis：N，N’Methylenebisacrylamide，亚甲基丙烯酰胺BSA：Bovineserumalbumin，牛血清白蛋白CDNB：1-Chloro-2，4-dinitrobenzene，1．氯．2，4．二硝基苯DEPC：Diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯dNTP：Deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸dsRNA：Double-strandedRNA，双链RNAE．coli：Escherichiacoli，大肠杆菌EB：Ethidiumbromide，溴化乙锭EDTA：Ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸ELISA：Enzymelinkedimmunosorbentassay,酶联免疫吸附试验I-PCR：Inversepolymerasechainreaction，反向PCRIPTG：Isopropyl-p-D-thiogalactoside，异丙基-B—D一硫代半乳糖苷Kan：Kanamycin，卡那霉素‰：Michaelisconstant，米氏常数LB：Luria-Bertanimedium，LB培养基PBS：Phosphatebuffer,磷酸盐缓冲液PVDF：Polyvinylidenefluoride，聚偏二氟乙烯qRT-PCR：Quantitativereal—timePCR，定量实时PCRRNAi：RNAinterference，RNA干扰rpm：Revolutionperminute，转／分钟SDS：Sodiumdodecylsulfate，十二烷基硫酸钠SDS-PAGE：SDS—Polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳TE：Tris．EDTAbuffer,Tris．EDTA缓冲液Tris：Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷WT：Wildtype，野生型 目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。101．1谷胱甘肽S．转移酶研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．1．1谷胱甘肽S．转移酶的分类与进化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．1．2细胞质谷胱甘肽S．转移酶的结构特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111．1．3谷胱甘肽S．转移酶的功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．1．3．1谷胱甘肽S．转移酶的功能概述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．121．1．3．2Omega族谷胱甘肽S-转移酶的功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．1．3．3昆虫谷胱甘肽S．转移酶的作用机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．2小分子热激蛋白研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯141．2．1热激蛋白的发现与分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．2．2小分子热激蛋白的结构特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．151．2．3小分子热激蛋白的生物学功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．171．2．3．1小分子热激蛋白的分子伴侣功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．171．2．3．2小分子热激蛋白的抗氧化作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．181．2．3．3小分子热激蛋白的抗低温作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．191．2．3．4小分子热激蛋白的免疫作用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．201．3本研究的目的及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．1．1供试蜂种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1．2菌株、质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．1．3酶与各种生化试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．222．1．4PCR引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．2实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2．1中华蜜蜂的饲养及处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．2．2中华蜜蜂总RNA的提取、纯化及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．26 2．2．2．1利用TRIZOLKit提取总RNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。262．2．2．2总RNA的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．2．2．3总RNA的电泳鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．2．3cDNA第一链的合成及纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．272．2．4cDNA5味端的加尾反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2．5目的DNA片段的回收、连接及转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．282．2．5．1目的DNA片段的回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2．5．2目的DNA片段与克隆载体的连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯292．2．5．3大肠杆菌感受态细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．292．2．5．4大肠杆菌感受态细胞的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。292．2．6大肠杆菌质粒DNA的提取及酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。302．2．6．1质粒DNA的提取(试剂盒微量法)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．2．6．2重组质粒DNA的酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．2．7DNA序列的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯312．2．8中华蜜蜂目的基因cDNA序列的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯312．2．8．1目的基因中间片段的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。312．2．8．25味端序列的获得(RACE法)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．2．8．33味端序列的获得(RACE法)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．2．8．4cDNA全长序列的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．2．9中华蜜蜂基因组DNA的提取(试剂盒小量法)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．342．2．10中华蜜蜂目的基因基因组全长序列的获得⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯352．2．11中华蜜蜂目的基因启动子序列的获得(反向PCR)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．352．2．12实时荧光定量PCR分析基因的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．362．2．12．1内参引物、反应体系及反应条件的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯362．2．12．2实时荧光定量PCR分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．372．2．12．3数据处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372．2．13双链RNA(dsRNA)的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．382．2．13．1dsRNA模板的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．2．13．2dsRNA的合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．2．13．3dsRNA的注射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39 2．2．13．4dsRNA的饲喂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．2．14目的基因的原核表达及纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．2．14．1原核表达载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392。2．14．2重组基因原核表达的诱导⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．2．14．3重组蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402．2．14．4SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402．2．15抗体的制备及检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯412．2．15．1抗体的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l2．2．15．2ELISA检测抗体效价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．422．2．15．3Westemblot分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯422．2．16免疫组织化学技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯432．2．16．1组织的分离处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯432．2．16．2组织石蜡切片的制作⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯432．2．16．3免疫组织酶化学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯442．2．17AccGST02的定点突变⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯442．2．18AccGST02的酶学性质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯452．2．18．1酶活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯452．2．18．2动力学常数的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯452．2．18．3最适温度的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯452．2．18．4最适pH的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．452．2．19AccGST02突变体荧光发射光谱的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯452．2．20抗氧化功能分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯462．2．20．1DNA保护功能的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一462．2．20．2氧化应激下的纸盘扩散分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯462．2．21AccsHSP22．6的耐温性分析和体外分子伴侣活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯462．2．21．1耐温性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯462．2．21．2体外分子伴侣活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯462．2．22生物信息学分析工具⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯473结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483．1中华蜜蜂AccGST02基因的分子特性和在氧化应激中的保护效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48 3．1．1中华蜜蜂AccGST02基因cDNA全长的获得及序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483．1．2中华蜜蜂AccGST02蛋白一级结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯493．1．3AccGST02基因组结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．513．1．4AccGST02启动子序列的分离及顺式作用元件的预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．523．1．5AccGST02的表达特性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．533．1．5．1AccGST02基因表达的时间和空间特异性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯533．1．5．2AccGST02在不同非生物应激中的表达特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯543．1。5．34cc四咒)2在不同生物应激中的表达特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯563．1．5．4中华蜜蜂在CdCl2和病原微生物应激中体内的氧化状态⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．573．1．6AccGST02重组蛋白的原核表达及酶学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．593．1．6．1AccGST02重组蛋白诱导表达条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．593．1．6．2AccGST02重组蛋白的酶学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．613．1．6．3重组AccGST02蛋白在氧化应激中的保护效应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．613．1．7RNAi介导的AccGST02基因沉默⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．633．1．7．1AccGST02基因最佳沉默时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯633．1．7．2AccGST02基因沉默对蜜蜂的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯663．1．8AccGST02的定点突变⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．673．1．8．1AccGST02突变体的构建、表达纯化及动力学分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．673．1．8．2AccGST02突变体的抗氧化功能分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．683．1．8．3AccGST02突变体的荧光光谱分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。703．1．8．4AccGST02突变体的空间结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．703．2中华蜜蜂AccsHsp22．6基因的分子特性及功能分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．733．2．1中华蜜蜂AccsHsp22．6基因cDNA全长的获得及序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．733．2．2中华蜜蜂AccsHSP22．6蛋白一级结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．743．2．3AccsHsp22．6基因组结构分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯773．2．4AccsHsp22．6启动子序列的分离及顺式作用元件的预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯773．2．5AccsHsp22．6的表达特性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯793．2．5．1AccsHsp22．6基因表达的时间和空间特异性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯793．2．5．2AccsHsp22．6在不同非生物应激下的表达特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯803．2．5．3AccsHsp22．6在不同生物应激下的表达特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81 3．2．6AccsHSP22．6重组蛋白的原核表达及功能分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。833．2．6．1AccsHSP22．6重组蛋白诱导表达条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯833．2．6．2AccsHSP22．6重组蛋白的耐温性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯853．2．6．3过表达AccsHsp22．6大肠杆菌的纸盘扩散分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯853．2．6．4重组蛋白AccsHSP22．6的体外分子伴侣功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．863．2．7RNAi介导的AccsHsp22．6基因沉默⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯873．2．7．1AccsHsp22．6基因最佳沉默时间的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯873．2．7．2AccsHsp22．6基因沉默对蜜蜂耐温能力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯884讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯905小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯97参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯98致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．109攻读学位期间发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯110 山东农业大学博士学位论文中文摘要自然生态环境的变化使得蜜蜂种群面临日益严峻的生存和延续考验。提高蜜蜂自身防御能力是保持蜂群健康发展的重要前提。中华蜜蜂(Apisceranacerana)是我国特有的蜜蜂种质资源，对于维护与其有关的植物共生生态系统的平衡，具有重要的经济价值和社会效益。本研究基于已经证实的谷胱甘肽S．转移酶(glutathioneS-transferases，GSTs)参与调控生物体的抗氧化功能和小分子热激蛋白(smallheatshockproteins，sHSPs)在细胞损伤防御及生物保护中执行的特殊作用，以中华蜜蜂为实验材料，开展了GST02和sHsp22．6基因的功能研究，从分子水平上探讨了中华蜜蜂自身防御能力与其GST02和sHsp22．6基因的联系。具体研究结果与主要结论如下：(1)中华蜜蜂am∞基因的分子特性和功能分析根据西方蜜蜂(ApismelliferaLinnaeus)的同源序列，利用RT-PCR和RACE．PCR的方法，从中华蜜蜂中克隆到一个新的Omega族GST基因，命名为AccGST02。序列分析表明：该基因eDNA全长为1365bp，包括321bp的57非翻译区、324bp的3’非翻译区和720bp的开放阅读框，编码一个包含239个氨基酸残基的多肽，预测分子量和等电点分别为27．785kDa和6．21。中华蜜蜂AccGST02的氨基酸序列与其他昆虫GSTOs有较高的同源性，并具有细胞质GST超家族保守的功能区域。用TFSEARCH在线软件程序对分离的AccGST02基因启动子区域进行了分析，不仅预测到CF2．II、BR-C、NIT2等若干与早期组织发育和生长相关的转录因子结合位点，两个与调节环境应激有关的转录因子(HSF和AP．1)以及基因表达调控元件(CREB和C／EBP)的结合位点也被发现。这些结果表明，AccGST02基因可能参与蜜蜂的发育和环境应激响应。采用qRT-PCR和Westernblot的方法研究了中华蜜蜂不同发育时期和组织中的AccGST02基因的表达特性。结果表明，在3日龄幼虫时期和脑组织中AccGST02表达量最高，表明AccGST02可能与幼虫早期发育及维持蜜蜂脑组织的正常功能相关。应用qRT-PCR的方法探究了AccGST02基因在不同生物及非生物应激中的表达特性。结果表明，AccGST02基因的转录水平受到蜂球囊菌、黄曲霉菌、20羟基蜕皮激素(20E)等生物因素及温度、紫外线、H202、农药、CdCl2等非生物因素的应激而诱导提高，但HgCl2处理后则出现基因转录的抑制现象。Westernblot结果在蛋白水平上进一步证实了CdCh和黄曲霉菌等处理对基因表达的诱导作用，蜜蜂体内氧化状态的测定 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析表明这种诱导是氧化应激的结果。综上结果表明，AccGST02基因可能在中华蜜蜂的氧化应激和组织发育中发挥重要作用。利用RNA干扰(I斟Amtefference，RN加)的方法进一步研究了AccGST02基因的生物学功能。将合成的dsAccGST02注射到新出房的成年蜜蜂胸部或饲喂3日龄幼虫，qRT-PCR结果显示，成年蜜蜂注射后第3天和幼虫饲喂1天后，AccGST02的表达量降低最为显著。免疫组织化学的结果也发现成年蜜蜂的头部、肌肉和中肠，幼虫的中肠、马氏管和脂肪体细胞的表达量相比对照组明显减少。上述处理组蜜蜂的抗氧化基因，除Accp450的转录增强外，AccGSTD，AccGSTs4，AccSOD，AccCAT的转录水平都出现不同程度的降低。与对照组蜜蜂相比，dsAccGST02处理组蜜蜂的H202，丙二醛(MDA)含量明显升高，存活率显著降低。以上结果一方面表明了dsAccGST02处理成功抑制了蜜蜂AccGST02基因的表达，同时也表明AccGST02基因的敲除破坏了蜜蜂抗氧化体系的平衡，降低了蜜蜂的生存率。采用原核表达载体pET．30a(+)并优化诱导表达条件成功获得了可溶性的AccGST02重组蛋白，迸一步通过亲和层析的方法进行分离纯化，纯化的重组蛋白的浓度达到1．89m#mL。酶学特性的分析表明，重组AccGST02不仅具有对通用底物CDNB的谷胱甘肽(GSH)结合活性和以异丙苯．过氧化氢、叔丁基过氧化氢为底物的GSH过氧化物酶活性，还有较高的脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性。重组AccGST02的最适温度是25℃、最适pH为7．0。利用混合功能氧化(mixed．functionoxidmion，MFO)系统和纸盘扩散分析的方法研究了重组AccGST02蛋白的抗氧化功能。在MFO实验中，重组AccGST02蛋白以浓度依赖的方式保护质粒DNA免遭系统中产生的羟自由基的剪切，并且发现这种保护作用与分子中半胱氨酸的巯基有关。纸盘扩散试验的结果为重组AccGST02蛋白在氧化条件下的保护作用提供了迸一步的证据。通过定点突变的方法获得了3个AccGST02的突变体：C28A、C124A和C217A。酶动力学和内外荧光光谱学研究的结果发现，突变体C28A和C124A有明显的酶活性丧失和最大发射波长的偏移。MFO系统和纸盘扩散分析的结果为这两个位点半胱氨酸在AccGST02抗氧化功能方面的关键作用提供了一个直接证据。3个突变体的三维同源结构模型也提供了一个直观的证据，突变体的表面电荷分布、疏水性斑块及空间结构的改变可能是引起其部分功能丧失的重要因素。突变体C217A则与野生型AccGST02的功能特性基本相似。以上结果表明Cys28和Cysl24在维持AccGST02的结构和功能方面" 山东农业大学博士学位论文发挥重要作用。(2)中华蜜蜂sHsp22．6基因的分子特性和功能分析利用上述的方法，从中华蜜蜂中克隆到一个新的小分子热激蛋白基因，命名为AccsHsp22．6。该基因eDNA全长904bp，其中5’非翻译区115bp、3’非翻译区204bp和开放阅读框720bp，编码一个包含194个氨基酸残基的多肽，预测分子量22．605kDa，等电点5．88。中华蜜蜂sHSP22．6的氨基酸序列与其他昆虫sHSPs有较高的同源性，并具有sHSP超家族典型的结构特征。通过Matlnspeetor在线软件程序，在分离的AccsHsp22．6基因启动子区域预测到参与早期组织发育的转录因子结合位点(CF2．II、BR-C、CdxA和NIT2)。几个与环境应激及免疫响应有关的转录因子结合位点(HSF、AP．1、Nrf2、NFr,B和p53等)也被发现。以上结果表明，AccsHsp22．6基因可能参与蜜蜂的早期发育和应激保护机制。利用qRT-PCR和Westernblot的方法研究了AccsHsp22．6基因在不同发育时期和组织中的表达特性。结果发现，该基因总是在蜜蜂不同发育时期的转型期高水平表达，尤其在新出房的成虫和中肠组织中表达量最高，表明AccsHsp22．6可能参与蜜蜂发育时期的转换及维持中肠组织的正常功能。应用qRT-PCR的方法研究了AccsHsp22．6基因在不同实验条件下的表达特性。结果表明，AccsHsp22．6基因的转录水平在大多数处理中诱导上调，包括热、冷、紫外线、H202、三氟氯氰菊酯、CdCl2等非生物因素和蜂球囊菌、黄曲霉菌、20羟基蜕皮激素(20E)等生物因素。但是该基因在25。C、辛硫磷、百草枯、HgCl2处理后其转录没有明显的诱导，有时甚至出现抑制的现象。以上结果表明，AccsHsp22．6基因可能在中华蜜蜂应对大多数不利因素的应激保护中发挥重要作用。利用RNAi的方法进一步研究了AccsHsp22．6基因的生物学功能。将合成的dsAccsHsp22．6注射到新出房的成年蜜蜂胸部，qRT-PCR结果显示，成年蜜蜂注射后第1．3天，AccsHsp22．6的表达量降低较为显著。免疫组织化学的结果也发现，成年蜜蜂的中肠、马氏管、肌肉和脂肪体细胞的表达量均比对照组明显减少。在40C和50℃条件下，dsAccsHsp22．6注射3天后的蜜蜂其存活率与对照组蜜蜂相比显著降低。以上结果不仅说明AccsHsp22．6基因的表达被有效抑制，而且表明该基因的敲除降低了蜜蜂对极端温度的耐受能力。采用原核表达载体pET030a(+)，优化诱导表达条件，通过亲和层析的方法成功表达并纯化了可溶性的AccsHSP22．6重组蛋白，纯化蛋白的浓度达到1．67mg／mL。体外分子 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析伴侣活性的分析表明，AccsHSP22．6纯化蛋白能有效保护苹果酸脱氢酶免遭热变性。过表达AccsHsp22．6的重组细菌在4"C和50。C条件下有更高的存活率，表明AccsHsp22．6的表达增强了大肠杆菌的温度耐受性。纸盘扩散分析的实验也提供了重组AccsHSP22．6蛋白具有抗氧化功能的直接证据。关键词：中华蜜蜂；GSTs；sHsps；基因；功能分析4 山东农业大学博士学位论文BiologicalanalysisofglutathioneS-transferaseandsmallheatshockproteingenesinAbstractStressresistanceisconsideredtobeacrucialfactorforhoneybeepopulationsurvivalandcontinuitywiththenaturalenvironmentchanges．TheAsianhoneybee(apuceranacerana)isanimportantindigenousspeciesthatplaysanindispensableroleinthebalanceofregionalecologiesandagriculturaleconomicdevelopment．ExtensivestudieshaveelucidatedthatGSTsareinvolvedinre刚atingtheantioxidantfunctioninorganismandsHSPsplaykeyrolesinthecellulardefenceagainstdamages．Inthisstudy,weselectedA．ceranaceranaastheexperimentmaterial，andexploredthebiologicalfunctionsaboutGST02andsHsp22．6genesandtheirrelationshipswiththecellulardefence．Themainresultsandconclusionspresentedinthisthesisareasfollows：(1)MolecularcharacterizationandfunctionalanalysisofGST02geneinA．ceranaceranaAnovelOmegaclassGSTsgeneinA．ceranaceranaWasclonedbasedontheconservedregionsofGSTOfrom卸ismelliferaLinnaeusbyRT-PCRandRACE-PCR,andwenamedtheputativegeneAccGST02．Thesequenceanalysisindicatedthatthefull-lengtheDNAofAccGST02(JX434029)Was1365basepair帅)，includinga321bp5"untranslatedregion(UTR)，a324bp3"UTRanda720bpcompleteORETheORFencodedapolypeptideof239arRinoacidswithapredictedmolecularmass∞)of27．785kDaandatheoreticalisoelectricpoint①I)of6．21．AccGST02shareshighersequencesimilaritywithotherinsectspeciesandcontainstheconservedfeaturesofthecytosolicGSTsuperfamily．UsingtheTFSEARCHdatabase，severaltranscriptionfactorbindingsitesinvolvedintissuedevelopmentandgrowthinearlystageswereidentifiedinthe5"-flankingregionofAccGST02，suchasCF2．II，BR-CandNIT2．Severalimportanttranscriptionfactorsrequiredforregulatingvariousenvironmentalstresses(HSFandAP-1)andgeneexpression(CREBandC／EBP)werealsofoundinAccGST02promoterregion．TheseresultssuggestthatAccGST02maybeinvolvedinorganismaldevelopmentandenvironmentalstressresponses·TheqRT-PCRandWesternblotwereperformedtoexaminethedevelopmental5 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析regulationandtissuedistributionofAccGST02．Thehi曲estexpressionlevelw弱detectedinday-3larvaeandinthebrain，implyingthatAccGST02mayplayaprotectiveroleinthebraintissueandearlydevelopment．111erelativeexpressionsofAccGST02undervariousbioticandabioticstimulisweredetectedbyqRTPCR．111eresultsshowedthatthetranscriptlevelsofAccGST02caIlbemarkedlyaccumulatedbytreatment、析t11variousbioticstimulissuchasAscosphaera印西，Aspergillusflavusand20-hydroxyecdysone(20E)andabioticstimulissuchastemperature，WH202，pesticidesandCdCl2．WhereasthetranscriptionofthisgeneWasgraduallyinhibitedbyHgCl2treatment．WesternblotprovidedfurtherevidencefortheinducedexpressionofAccGST02underCdCl2andmicrobestressorsatproteinlevel，andtheassayofoxidationstatusesindicatedthatthisinducedexpressionofAccGST02maybedirectlyrelatedtotheaccumulationsofH202andMDA．Takingintoaccounttheseresults，wespeculatethatAccGST02maybeessentialinprotectionagainstoxidativedamageandtissuedevelopment．RNAiwasemployedtofurtherstudythebiologicalfunctionsofAccGST02gene．One—daypost-eme唱enceadultswereinjected、vitllds4ccGS力9口orthethirdinstarlarvaewerefed嘶油additionaldsAccGST02．刀配qRT-PCRdisplayedthatlowertranscriptlevelswereobservedinthedsAccGST02··injectedadultsat3daypost——injectionorintheds4ccGSZ℃2·fedlarvaeat1daypost—fed．ImmunohistochemicallocalizationshowedthatthesectionsfromdsAccGST02-treatmentbeesweremoreslightlystainedthanthesefromthecontrols，especiallyinthebrain，muscleandmidgutofadultandmidgut，malpighianmbuleandfatbodyoflarvae．Inaddition，theknockdown武AccGsT02causedaslight-increasedAccP450mRNAlevelandmarkedreductionoftranscriptionallevelsof么cc傩ZD，AccGSTs4，AccSODandAccCAT．Moreover,comparedtothecontrolgroup，theAccGST02-RNAJbeeshada11increasedH202andMDAaccumulations，whichrevealedthattheknockdownofAccGST02geneledtooxidativestressinvivoandtherebyaffectedsurvival．111erecombinantAccGST02proteinWasexpressedusingprokaryoticexpressionplasmidpET-30a(+)andtheoptimizationexpressioncondition．111esolubleAccGST02proteinWasfurtherpurifiedbyaffinitychromatographytoafinalconcentration1．89megmL．ThepurifiedenzymeshowedGSH-conjugatingactivitytowardsCDNBandGSH6 山东农业大学博士学位论文peroxidaseactivitytowardscumenehydroperoxideandt-butylhydroperoxide．Furthermore，therecombinantAccGST02showedamaximumDHARactivityatpH7．0andalloptimumtemperatureof25"C．Themixed-functionoxidation(MFO)systemanddiscdiffusionassaywerechosentostudytheantioxidantfunctionofAccGST02．IntheMFOsystem，AccGST02protectsgraduallyDNAfromhydroxylradicaldamagewithitsincreasingconcentrations，andthesulfhydrylmoietiesofcysteineresiduesinAccGST02mayplayimportantrolesinDNAprotection．Discdiffusionassayprovidesafurtherevidenceforitsprotectiveeffectsinoxidativestress．ThreeAccGST02mutantswereconstructedbysite-directedmutagenesisandnamedC28A，C124A，andC217A．ThemutantsC28AandC124Ashoweddifferentlossofenzymeactivityandshiftoftheemissionmaximuminkineticsandfluorescencespectraanalyses。TheMFOsystemanddiscdiffusionassayfurtherdemonstratedthatCys28andCysl24wereresponsibleforimplementingantioxidantactivity．Homologymodelingrevealedthatthemutantimpactsmaybecausedbythechangesofsurfaceelectropotentialdistributions，hydrophobicpatchesandspatialstructureofproteins．WefoundthatthepropertiesofWT-AccGST02andthemutantC217Awereroughlythesame，indicatingthatCys28andCysl24mayplayimportantrolesinmaintainingenzymestructureandactivity．(2)MolecularcharacterizationandfunctionalanalysisofsHsp22．6geneinA．ceranaceranaAsmallHspgenemA．ceranaceranawasisolatedbasedontheabove-mentionedmethodandWasnamedAccsHsp22．6．Thefull-length904bpeDNAsequenceofAccsHsp22．6(KF150016)includedartl5bp5"UTR，a204bp3"UTRanda585bpcompleteOREThepredictedORFencodeda194一RtRinoacidproteinwithacomputedtheoreticalpIof5．88andaMrof22．605kDa．MultiplesequencealignmentsrevealedhighersequenceidentitybetweenAccsHSP22．6andotherinsectsHSPs．Moreover,thededucedAccsHSP22．6sharestypicalfeaturesofthesHSPfamily．Inthe5"-flankingregionofAccsHsp22．6,exceptforsomesequencesinvoNedinemb巧oortissuedevelopment，includingCF2-II，BR-C，NIT2，andCdxA，severalimportanttranscriptionfactorsassociatedwithenvironmentalstressandimlllRneresponse，suchasHSF，AP-1，Nrf2，NFr,Bandp53，werealsofoundusingtheMatInspectordatabase．Theseputative7 中华蜜蜂谷胱甘肽S-转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析transcriptionfactorbmdingsitesimplythatAccsHsp22．6maybeinvolvediIlnotonlyenvironmentalstressresponsesbutalsodevelopmentalregulation．TheqRT-PCRandWesternblotwereperformedtodeterminetemporalandspatialexpressionprofilesofAccsHsp22．6．WenoticedthatasignificantincreaseofAccsHsp22．6expressionalwayscorrelatedwiththetransitionofdifferentdevelopmentstages．Thehighestexpressionlevelwasdetectedinthenewlyemergedadultsandinthemidgut．TheseresultsindicatethatAccsHsp22．6mightbeinvolvedinthecontrolofhoneybeedevelopmentandprotectingagainstthedamageofxenobiotics．TheexpressionsprofilesofAccsHsp22．6undervariousexperimentconditionsweredetectedbyqRTPCR．WefoundthatthetranscriptlevelsofAccsHsp22．6Canbemarkedlyup-regulatedbytreatment谢mvariousabioticstressessuchasheat，cold，UVH202，cyhalothrinandCdCl2andbioticstressessuchasAscosphaera印括，Aspergillusflavusand20E．However，thetranscriptionofthisgeneshowedfluctuatingandsuppressedpatternduring25"C，phoxim，paraquat，andHgCl2stress．TheseobservationsprovidecluesforthepossibleprotectiveroleofAccsHsp22．6inthephysiologicaldysfunctionsevokedbythemajoradversefactors．ThebiologicalfunctionsofAccsHsp22．6geneWasfurtherstudiedbyRNAi．Afterone-daypost-emergenceadultswereinjectedwithdsAccsHsp22．瓯qRT-PCRdisplayedthatsignificanttranscriptionalsuppressioncouldbeobservediIlthedsAccsHsp22．垂injectedgroup，especiallyat1-3daysafterinjection．ThesectionsfromdsAccsHsp22．6-treatedhoneybeesweremoreslightlystainedthanthoseofthecontrols，especiallyinthemidgutandfatbodyespeciallyinthemidgut，malpiglliantubules，muscleandfatbodyofadult，althoughwithoutvisiblemorphologicalteration．Additionally，wefoundthattheAccsHsp22．6-RNAihoneybeesafterRNAitreatmentfor3dayshadlowersurvivalratethanthatofthecontrolhoneybeesduring4"Cor50。Ctreatment．ThesefindingsuggestthattheinhibitionmediatedbydsAccsHsp22．6iseffective，andtheknockdownofAccsHsp22．6mayweakencellularthermotolerance洫extremetemperaturestress．TherecombmantAccsHSP22．6proteinWasexpressedbyprokaryoticexpressionplasmidpET-30a(+)andtheoptimizationexpressioncondition．ThesolublerecombinantproteinWasfurtherpurifiedusingtheaffinitychromatographycolumns，theconcentrationof8 山东农业大学博士学位论文thepurifiedAccsHSP22．6wasapproximately1．67mg／n=1L．ThemolecularchaperoneactivityanalysisshowedthatthepurifiedAccsHSP22．6effectivelyprotectedmalatedehydrogenase(MDH)fromheat-induceddenaturationinvitro．EscherzchiacolioverexpressingAccsHsp22．6displayedahighersurvivalrateto4"Cand50。CstressesthancellscontainingonlythepET-30a(+)vector，indicatedthatAccsHsp22．6expressioninEcolicellsenhancedcellularthermotolerance．AdiscdiffusionassayalsoprovidedevidenceinvivoforAccsHSP22．6’Sprotectiverolesinoxidativestress．Keywords：却豇ceranacerana；GSTs；sHsps；Gene；functionanalysis9 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析l刖吾蜜蜂在其一生中不可避免会遭受到各种不利因素的影响，比如气候的变化、生态环境的恶化、病原微生物的入侵等，而蜜蜂的应激保护能力是决定其种群能否在特定生态环境下得以生存及延续的一个必要条件。目前中华蜜蜂的基因组并未测序，借助分子生物学手段，研究中华蜜蜂重要功能基因的基因结构、表达模式及功能分析，揭示其特征行为的分子机理已成为该领域的热点之一。谷胱甘肽S．转移酶(glutathioneS-transferases，GSTs)和小分子热激蛋白(smallheatshockproteins，sHSPs)是参与调控生物体的应激保护能力并在细胞损伤的防御中发挥重要作用的功能基因。1．1谷胱甘肽S．转移酶研究进展作为需氧代谢中产生的正常代谢产物，活性氧族(reactiveoxygenspecies，ROS)对于生物体是一把双刃剑(Valkoeta1．，2004)。当胞内ROS浓度较低时，它作为细胞信号转导途径的第二信使，调节细胞的生长；但是高的胞内ROS浓度，会引发机体的氧化应激，从而产生胞内蛋白质变性、DNA链断裂、生物膜脂质过氧化等一系列氧化损伤，最终导致细胞死亡或凋亡、组织损伤乃至疾病发生(Polieta1．，2004)。正常条件下，生物体内ROS的产生与清除处于动态平衡，从而维持胞内ROS在较低的水平。然而，内源性或外源性不利因素会打破这个平衡，导致ROS过度产生和积累。为了防御ROS产生的氧化损伤，生物体已进化出复杂的抗氧化防御系统，维持细胞正常的结构与功能。谷胱甘肽S．转移酶家族(GSTs，EC2．5．1．18)就是抗氧化防御系统的一员，在调节胞内ROS平衡方面发挥重要作用。1．1．1谷胱甘肽S．转移酶的分类与进化GSTs是一类重要的同工酶超家族，广泛分布于原核和真核生物中。依据其细胞定位，GSTs被分为细胞质(cytosolic)、微粒体(microsomal)及线粒体(mitochondrial，也称Kappa)三大类型。关于昆虫GSTs的分类已基本明确，根据其氨基酸序列同源性、染色体定位及免疫学特性，昆虫细胞质GSTs又被分为Delta(GSTD)、Epsilon(GSTE)、Omega(GSTO)、Sigma(GSTS)、Theta(GSTT)及Zeta(GSTZ)六大类；微粒体中的为GSTmic，还有一种分布未知的GSTu类(Dingeta1．，2003)。昆虫不含有线粒体GSTs，细胞质GSTs最为丰富，其中GSTD和GSTE属昆虫特异的家族，仅存在于昆虫中(Enayatietal．，2005)。 山东农业大学博士学位论文三类GSTs可能起源于同一祖先，但在进化中微粒体GSTs发生了较大分歧(Frova,2006)。如图1．1a所示，细胞质GSTs与线粒体(Kappa)GSTs来源于同一个硫氧还蛋白(thioredoxin)／谷氧还蛋白(glutaredoxin，GRX)序列，由于一个螺旋状结构域插入不同的位点而逐渐演变出这两类GSTs。图1．1b是细胞质GSTs进一步的演变历程，其中有3个值得注意的进化事件。GRX2为大肠杆菌谷氧还蛋白，其谷胱甘肽结合位点，简称G．位点(GSHbindingsite，G．site)氨基酸残基为半胱氨酸(Cys)，并以单体形式行使功能。当其出现二聚化的功能形式时，进化产生Omega和Beta族GSTs；接着G．位点Cys演变为丝氨酸(Ser)残基，又进化出Theta、Zeta、Delta等GSTs；最后G．位点Ser演变为酪氨酸(Tyr)残基，进化产生Sigma、Alpha(哺乳类动物)等GSTs。B0t130‘1313a◆●—●●_●—粗_oGRX2<◆—●<=>_◆◆_回一一圈一一圆图1-1基于结构与功能数据的TRX蛋白进化模式图(Frova,2006)(a)最为古老的进化历程图。(b)细胞质GSTs的分化。Fig．1-1ModelofTRXproteinsevolutionbasedonstructuralandfunctionaldata(Frova,2006)(a)Themostancientstepsareillustrated．(b)DifferentiationofcytosolicGSTs．1．1．2细胞质谷胱甘肽S．转移酶的结构特征细胞质GSTs种类最为丰富，结构研究也相对深入。活性的细胞质GSTs一般以同琶r 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析源或异源二聚体形式存在。其亚基由200．250个氨基酸残基组成，平均分子量为23．30kDa。尽管不同家族细胞质GSTs的氨基酸序列已高度分化，但是其空间结构却十分相似(图1．2)。除具有保守的硫氧还蛋白折叠基序(p0【p0【pp0【)外，每个亚基均含有G．位点和疏水性底物结合位点(Hydrophobicsubstratebindingsite，H．site)。其中Omega家族成员G．位点Cys直接与必需底物GSH以混合二硫键形式结合，此位点氨基酸残基如果发生突变将严重影响GSTs的功能(Burmeisteretal．，2008；Yamamotoetal．，2011)。图1-2小麦Tau族TaGSTU4结构模式图(Frova,2006)(a)TaGSTU4．4单体。(b)TaGSTU4．4二聚体。Fig．1-2AribbondiagramofthewheatTauclassGSTTaGSTU4(Frova,2006)(a)TaGSTU4-4monomer．(b)zbGSTIJ4-4dimer．1．1．3谷胱甘肽S．转移酶的功能1．1．3．1谷胱甘肽S．转移酶的功能概述GSTs可以催化还原型GSH的巯基(-SH)与一些亲脂性毒物的电子中心结合，产生水溶性强、无毒的代谢产物而排出胞外。因此，GSTs在对内源性和外源性毒物(如ROS、药物、杀虫剂等)的解毒中发挥重要作用(Huangeta1．，2011)。近年来的研究发 山东农业大学博士学位论文现，特异的GSTs具有一些与解毒作用无关但影响细胞生存的功能特性，包括：调节丝裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)的活性、促进GSH中Cys添加到某些蛋白质上(S．谷胱甘肽化)、作为新的人乳头状瘤病毒．16E7癌蛋白的细胞组分抑制人感染细胞的死亡、促有丝分裂影响骨髓及外骨髓增殖途径、参与可卡因的上瘾过程以及在细胞信号转导和细胞死亡途径中调节细胞的命运(TewandTownsend，2012)。图1．3是迄今已确定受制于S．谷胱甘肽化的蛋白质簇的总结，涉及氧化还原、蛋白质折叠、细胞骨架、钙稳态、信号通路以及能量代谢过程。hProteinFoldingMetabolism图l一3受制于S-谷胱甘肽化的蛋白质(TewandTownsend，2012)本图总结了迄今为止已被确定对S．谷胱甘肽化敏感的蛋白质集群。Fig．1-3PmtemssubjecttoS-glutathionylation(TewandTownsend,2012)ThisfiguresummarizestheclustersofproteinsthathaveSOfarbeenidentifiedassusceptibletoS-glutathionylation．1．1．3．2Omega族谷胱甘肽S-转移酶的功能Omega族谷胱甘肽S．转移酶(GSTOs)最初是通过分析人基因表达序列标签(EST)数据库中序列相似性而被鉴定的(Boardeta1．，2000)。现已发现，GSTOs广泛存在于各种物种中，包括植物、酵母、昆虫、细菌及其他哺乳动物。GSTOs具有独特的结构和功能特性。除了与其他家族成员一样催化还原反应外，因其G．位点含有Cys而不是Ser或Zyr，故还能催化一系列的巯基转移反应(Boardeta1．，2000)。研究发现，GSTOs能够调节AsA的还原和再利用，间接清除自由基和ROS(Rice，2000；Bttrmeistereta1．。2008)。它还参与体内无机砷的生物转化过程，保护生物体防止发生急慢性砷中毒(Chowdhuryeta1．，2006)。GSTOs还涉及了许多临床疾病的发生和治疗过程。例如，抗药性(恤甜a1．，2005)、阿尔茨海默病(Lieta1．，2003)、抗炎药的作用(Laliberteeta1．， 中华蜜蜂谷胱甘肽S-转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析2003)及慢性阻塞性肺病(Dulhuntyet讲．，2001)等。在患帕金森病的果蝇模型中，发现DmGST01能够调节线粒体ATP合酶活性发挥保护性作用(Kimeta1．，2012)。但是关于昆虫GSTOs的研究十分有限，有待于进一步的探究。1．1．3．3昆虫谷胱甘肽S．转移酶的作用机制昆虫GSTs的研究主要集中在杀虫剂的抗性(Enayatieta1．，2005)和氧化应激响应方面(CoronaandRobinson，2006；Lieta1．，2008)。不同昆虫GSTs通过不同机制发挥保护性作用。昆虫特异的GSTDs和GSTEs主要参与解毒作用和杀虫剂的抗性(Ketterman甜a1．，2011)，如蚊子GSTEs具有过氧化物酶活性，对防御氧化应激损伤非常重要(Lumjuaneta1．，2005；Ortellieta1．，2003)。昆虫GSTSs和GSTTs参与脂质过氧化物的还原，也具有抗氧化作用(Singheta1．，2001；Yamamotoeta1．，2005)。GSTZs在酪氨酸降解途径中具有管家基因的功能，此途径涉及保护细胞防御氧化损伤(Claudianoseta1．，2006)。在氧化应激中，GSTOs通过脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和巯基转移酶活性发挥保护性作用(Yamamotoeta1．，2011)，而其他家族GSTs不具有这两种酶活性。目前，由于对内源性昆虫GSTs底物的认识十分匮乏，很难阐明不同昆虫GSTs家族的明确作用，但并非所有的昆虫GSTs都参与解毒和氧化应激过程(Huangetal．，2011)。总之，中华蜜蜂的应激保护能力与GSTs的抗氧化作用密切相关，对GSTs的抗氧化功能与分子机理的探索是一项重要的基础研究工作。1．2小分子热激蛋白研究进展活细胞一生中难免会受到许多不利因素的攻击，如极端的温度变化、氧化应激、毒性物质或病原菌侵染等，由此而引起的细胞内蛋白质聚集严重威胁着细胞的生存(Basha甜a1．．2012)。为了维持细胞内蛋白质内稳态，机体已经进化出一个“蛋白质质量控制”网，主要由细胞自噬、蛋白酶体和热激蛋白(heatshockproteins，HSPs)组成(Libereketa1．，2008)。1．2．1热激蛋白的发现与分类热激反应是生物体自我保护的重要机制之一，首次发现于黑腹果蝇的短暂热应激过程(Ritossa,1962)。在热激反应中，生物体能够产生一类新的蛋白质——热激蛋白(sHSPs)又称热休克蛋白或者热应激蛋白(heatstessproteins)，它作为一种自然机制在细胞损伤防御及生物保护中执行着重要的作用。14 山东农业大学博士学位论文目前，按照蛋白质分子量大小及其序列相似性，将HSP分为5个家族(Gm"ridoeta1．，2012)：HSPl00，HSP90，HSP70，HSP60和小分子热激蛋白家族(smallheatshockproteins，sHSPs)。其中，sHSPs是极富多样性的家族，分子量介于12．43kDa之间，广泛分布于细菌、单细胞藻类及高等生物等几乎所有的物种中(Bashaeta1．，2012)。不同生物中sHSPs基因的数目不同，氨基酸序列也缺乏明显的相似性。人类共发现了10个sHSPs成员(HSPBl．HSPBl0)，依据它们的结构和表达特性被分为2个亚族(Kappdeta1．，2003)：I类亚族和II类亚族。HSPBl、HSPB5、HSPB6及HSPB8属于I类亚族，其余属II类亚族。依据核苷酸序列、免疫学特性及亚细胞定位，植物sHSPs又可分为6类(Waters．2013)：胞质／胞核(CI．CVI)、内质网(ER)、过氧化物酶体(PX)、叶绿体(CP)、及线粒体(MTI和MTII两种)。在已研究的昆虫物种中，家蚕具有最多的sHSPs成员数(16个)，依据它们的染色体定位和内含子数目，又被分为2类(Lieta1．，2009)：直系同源簇和种属特异簇。前者一般分布于不同染色体上，至少含有1个内含子，主要参与基本代谢过程；后者一般以串联的方式位于相同的染色体上，没有内含子，主要涉及环境应激的响应。1．2．2小分子热激蛋白的结构特征sHSPs家族成员具有共同的结构特征(图1．4)：N端区域在长度和序列上一般不具保守性，但也存在一些保守位点(如磷酸化位点)；C端区域包含一个高度保守的0【晶状体结构域(a．crystMlindomain，ACD)，一般由80．100个氨基酸残基组成，在空间上形成两个反向平行的p片层结构，也称之为p折叠三明治结构；C端延伸区灵活、易变，含有IXI模序结构。研究表明，N端区域参与调节大寡聚体的装配以及分子伴侣活性；保守的ACD与小寡聚体(由2．4个亚基组成)的形成、sHSPs．底物复合物的可溶性以及蛋白质四级结构的稳定有关；C端延伸区可以调节疏水性sHSPs的溶解性，IXI模序能够驱动大寡聚体的装配(KostenkoandMoens，2009；Bagndfiseta1．，2009；SunandMacRae，2005)。在机体处于应激状态时，sHSPs可形成分子量200．800kDa的寡聚体而发挥作用。不同sHSPs行使分子伴侣功能的寡聚体状态不同，磷酸化／去磷酸化修饰可以调节不同寡聚体状态的转换。磷酸化有利于小寡聚体形成，去磷酸化则促进形成大寡聚体(Parcelliereta1．，2005)。寡聚体状态的转换对于sHSPs的分子伴侣活性非常重要，因为sHSPs结合的底物蛋白无序列或结构特异性，这就需要sHSPs形成亚基数目不同的同源或异源寡聚体以提供不同特征的底物结合位点(Garridoeta1．，2006)。尽管各种 中华蜜蜂谷胱甘肽S-转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析sHSPs多聚体的直径和亚基数目各不相同，但都是形成一个中空的近似球体的空间构象(图1．5)。A榔NB神删翮N重1圈圈曩【67王三亟三二1p6I175ll啦6舅翮。燮要；；NM+j；a黼蚰弱4"3图1-4不同sHsps结构域示意图的比较(Haslbeck,2002)(A)一般结构域的结构。(B)不同sHsps的比较。灰色表示可变区；指示的为同源区；黑色表示苯丙氨酸．脯氨酸富集区；数字取决于氨基酸组成。Fig．1-4ComparisonofschematicdomainstructureofdifferentsHsps(Haslbeck,2002)(A)Generaldomainstructure．(B)ComparisonofdifferentsHsps．Gray,variableregions；pointed,homologueregions；black：Phe-Prorichregion；numbers，accordingtoaminoacidcomposition．图1-5小麦Hspl6．9的晶体结构(Waters，2013)(A)小麦Hspl6．9的单体结构。黄色标示折叠链，红色标示螺旋链，灰色标示环状区域。(B)Hspl6．9的寡聚体结构。颜色标示与单体相同。Fig．1-5CrystalstructureofHspl6．9fromTriticumaestivum(Waters，2013)(A)ThestructureofHspl6．9fromtheZaesn"vummonomer．Thestrandsareinyellowandthehelicesareinred．Theloopsaregrey．∞)nleoligomericstructureofHspl6．9．Thecolourschemeisthesameasforthemonomer．16 山东农业大学博士学位论文1．2．3小分子热激蛋白的生物学功能1．2．3．1小分子热激蛋白的分子伴侣功能在生物体内，sHSPs通过分子伴侣活性防止其它细胞蛋白变性聚集来增强生物体的抗应激能力。研究表明，sHSPs一般以ATP．非依赖的方式发挥作用。当细胞受到不利因素的威胁发生应激反应时，会导致细胞蛋白发生部分或完全变性。完全变性的蛋白将进入蛋白质降解途径降解，部分变性的蛋白则以一种不稳定的“熔融小球”状态结合到sHSPs寡聚体上，形成sHSPs．底物复合物，以避免其发生不可逆的变性聚集(KampingaandCraig，2010)。当条件恢复正常后，部分变性的蛋白从sHSPs上解离下来，在依赖ATP的HSP70作用下重新折叠为正确的空间构象，行使正常的功能(图1．6)。NativeproteinsPartiallyunfoldedHSP27(HSPBI)dimer-脚饕AAggregatedproteinsHSP27(HSPBI)aggregate：misfoldedproteinreservoir◇)@图1·6HSPs分子伴侣网络(KampingaandCraig，2010)小分子HSP的抗聚集功能(以HSPBl／HSP27为例)被认为是与有促折叠功能的HSP70家族成员联合完成的。·表示一个最小的HSP70装置。它被认为是由一个HSP70成员，一个DNAJ家族成员和一个来自其他HSPH家族或Bag家族或HSPBP家族的核苷酸交换因子(NEF)组成。Fig．1-6HSPschaperonenetwork(KampingaandCraig，2010)SmallHSPanti-aggregationfunction(hereillustratedforHSPB1／HSP27)isbelievedtoworkinassociationwithamemberofanHSP70familywithfoldingactivity．+AminimalHSP70machineryisthoughttoconsistofanHSP70member,amemberoftheDNAJfamily,andanucleotideexchangefactor(NEE)fromeithertheHSPHfamily,theBagfamilyortheHSPBPfamily． 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析大肠杆菌细胞在一般胁迫条件下，依赖ATP的DnaK／DnaJ／GrpE和GroEL／GroES复合体被认为比sHSPs在蛋白折叠过程中起着更为重要的作用(Narberhaus，2002)。但在强烈的胁迫条件下，sHSPs就会与部分变性蛋白结合，防止其因聚集而发生不可逆变性，然后这些sHSPs与HSPl00(ClpB)和／或DnaK／DnaJ／GrpE分子伴侣系统共同促进蛋白质解聚(图1．7)。●糟●／＼■一学＼／燃-GroEL／ES，●■■_麓OnaK／DnaJIGrpESTRESSLEVEL—sHspIICIpB图1．7在复杂的多分子伴侣网络中大肠杆菌Hsps的协同作用(Narberhaus，2002)GroEL／ES复合体主要参与热应激后蛋白质的再折叠。DnaK／DnaJ／GrpE复合体也参与蛋白质再折叠，但主要与CIpB协作。在严重胁迫条件下，sHsps可稳定变性蛋白并与Ibps发生共聚集。Fig．1-7CooperationbetweenHspsinthecomplexmultichaperonenetworkinEcoli(Narberhaus，2002)TheGroEL／EScomplexisprincipallyinvolvedinproteinrefoldingafterheatshock．TheDnaK／DnaJ／GrpEcomplexalsoparticipatesinproteinrefolding,butisprincipallyinvolvedinthesolubilizationofIbpswithClpB．ThesHspsstabilizedenaturedproteinsandcoaggregatewithIbpsinconditionsofseverestress．1．2．3．2小分子热激蛋白的抗氧化作用氧化还原代谢主要包括两个生物化学反应：(1)ROS的产生，其过量会导致氧化应激；(2)ROS的清除，如果过度也会引起还原压力。因此，氧化还原代谢需要不断调整来维持氧化还原平衡、防止氧化应激或细胞组分氧化而导致细胞损伤。过量产生的ROS，首先被互补的氧化还原对(NAD(P)H／NAD(P)+，GSH／GSSG)清除，分子伴侣作 山东农业大学博士学位论文为第二道防线，能够保护对抗氧化应激导致的蛋白毒性作用。Arrigo的实验室首次报道HSPBl和HSPB5过表达可以减轻由细胞因子、n盯Q和H202诱导的氧化应激，避免了细胞死亡(Mehleneta1．，1995)。由于sHSPs不是ROS直接的清除剂，而细胞保护作用通常又需要较高的GSH水平和GSH／GSSG比值。为了进一步理解sHSPs的抗氧化特性，他们研究了对GSH的影响。研究发现，HSPBl和HSPB5的过表达成比例地增加了GSH水平，这种效应需要维持sHSPs的保护作用(Mehleneta1．，1996)。当HSPBl过表达时，葡萄糖6．磷酸脱氢酶(G6PD)活性和蛋白含量均增加，但G6PD的mRNA含量没有改变，谷胱甘肽还原酶(GR)和GST活性也增加(图1．8)。因此，他们推断，sHSPs的抗氧化作用可能是通过增加G6PD、GR和GST的活性而实现(Pr6villeetal．，1999)。OxidativestressH202弋图1．8HSPBl和HSPB5在氧化还原代谢中的作用(Pr6villeetal．，1999)两种sHSPs通过维持G6PD的高活性有助于升高还原型GSH的水平。与HSPBl相比，HSPB5也提高了过氧化氢酶活性。Fig．1-8RoleofHSPBlandHSPB5inredoxmodulation(Pr6villeeta1．，1999)BothsHSPsmaintainhighactivityofG6PDcontributingtohighlevelofreducedglutathioneGSH．IncontrasttOHSPBl，HSPB5alsoprotectscatalaseactivity．1．2．3．3小分子热激蛋白的抗低温作用近年来，低温成为制约昆虫种群发展的重要逆境因素之一。蜜蜂和其他昆虫一样，都是变温动物，环境温度直接决定着其体温的高低变化和生命过程的特点。sHSPs是最 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析近发现的昆虫抵御低温损伤的新成员。Rineharteta1．(2007)采用RNAi抑制滞育期果蝇蛹sHSP23的表达后发现，果蝇在低温下的生存率明显下降，表明sHsps基因表达的上调是提高越冬昆虫抵御寒冷所必需的，他们认为sHsps是为确保滞育期间发育停止而提供支持。Li甜a1．(2007a)通过双向电泳技术，比较滞育和非滞育期果蝇蛹脑组织蛋白组的差异时，发现6种sHSPs的含量在滞育期明显增高，证明sHSPs与其抗低温胁迫有关。Gkouvitsaseta1．(2008)分离了鳞翅目夜蛾科Snohspl9．5和Snohsp20．8，转录水平表达分析发现Snohsp20．8在滞育期表达下调，滞育期结束表达上调，而Snohspl9．5呈组成型表达，表明这两个基因在其抗低温胁迫中发挥不同的作用。Huangeta1．(2009)分离了美洲斑潜蝇Is。hspl9．5、ls—hsp20．8和Is—hsp21．7，发现它们都是其抗寒必需成员，但是响应低温胁迫的强度不同，ls—hsp20．8更加敏感。可见，不同昆虫中响应低温胁迫的sHsps成员不同，同一昆虫并非所有sHsps成员都参与低温胁迫响应，且响应的敏感程度也不同。1．2．3．4小分子热激蛋白的免疫作用近年来，sHSPs具有的抵御病原微生物的免疫防御功能也引起人们的高度关注。Altinciceketa1．(2008)用脂多糖(LPS，一种内毒素)感染拟谷盗属后，通过抑制消减杂交法鉴定出75个免疫应答基因中存在shsp22，证明其参与机体抵御病原微生物的免疫应答过程。Baoetal．(2011)发现，当泥蚶感染副溶血性弧菌和脂多糖后，其血细胞中Tg-sHSP基因表达上调，证明Tg-sHSP与泥蚶抗菌的免疫应答有关。Vaneta1．(2010)研究发现，番茄中sHSPs20能与其抗病性蛋白相互作用，这是维持抗病性蛋白I．2功能和稳定性所必需的。Sagisakaeta1．(2010)研究被家蚕核多角体病毒属侵染的家蚕细胞时发现，HSP20．1与感染早期细胞的免疫应答相关。Huangetal．(2008)也报告了HSP21在感染白斑综合征病毒的河虾体内的表达量减少，可能参与其早期免疫应答。总之，sHSPs家族成员广泛的生物学功能使其成为当今的研究热点。除了作为分子伴侣保护昆虫在不利环境条件(如极端温度、氧化、紫外线和重金属，甚至病原微生物)下免受组织细胞损伤以外，它们还参与保护生物膜的完整性、稳定细胞骨架、细胞核的重建、细胞凋亡的抑制以及生物体的生长发育、衰老过程。因此，sHSPs对正常细胞和受胁迫细胞的生存有着极其重要的意义。1．3本研究的目的及意义中华蜜蜂(彳．ceranacerarla)为东方蜜蜂(彳．ceranaFabricius)的指名亚种，是我20 山东农业大学博士学位论文国特有的蜜蜂种质资源。与西方蜜蜂(4．melliferaLinnaeus)相比，中华蜜蜂嗅觉敏锐，抗螨能力强，抗寒耐热，善于利用零星蜜源，作为特殊的经济动物，近年来备受人们的关注。但是，由于中华蜜蜂抗逆性差，其种群不断减少，目前是国家级畜禽遗传资源保护品种。因此，开展中华蜜蜂抗逆功能及分子机理的研究，对于提高蜜蜂的抗逆性，保持种群进化上的稳定性，以及维护与其有关的植物共生生态系统的平衡都具有重要经济价值和社会效益。谷胱甘肽S．转移酶(GSTs)和小分子热激蛋白(sHSPs)参与调控昆虫的抗逆功能是近年来的新发现。由于目前中华蜜蜂基因组并未测序完成，其GSTs和sHsps基因家族成员是否都参与中华蜜蜂抗逆功能的调控仍不清楚。本研究以中华蜜蜂为实验材料，开展了GST02基因和sHsp22．6基因的鉴定和抗逆功能研究，首次从分子水平上探讨了中华蜜蜂抗逆功能的调控与其GST02基因和sHsp22．6基因的联系。研究结果不仅可以丰富昆虫GSTOs和sHSPs的理论体系，对于蜜蜂的抗逆改良也具有一定的指导意义和实践价值。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析2材料与方法2．1实验材料2．1．1供试蜂种中华蜜蜂(简称中蜂，A．ceranacerana)，饲养于山东农业大学实验研究基地。2．1．2菌株、质粒菌株：大肠杆菌(Ecold菌株DH5a和BL21(DE)由本实验室提供。质粒：克隆载体pEasy-T3购于TransGen公司。原核表达载体pET-30a(+)本实验室提供。微生物侵染所用菌种Ascosphaera印括、Aspergillusflavus、Bacillusthuringiensis、Beauveriabassiana和Bacillusbombysepticus为本实验室制备并保存。2．1．3酶与各种生化试剂TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、dNTP、DNAMarker、SYBRPrimeScriptTMRT．PCRKit、各种限制性内切酶购于TaKaRa公司；辣根过氧化物酶酶标羊抗鼠血清购于大连宝生物；反转录试剂盒EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix和动物基因组DNA提取试剂盒EasyPureTMGenomicDNA瞄t购于TransGen公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于Solarbio公司；eDNA纯化试剂盒WizardDNAClean-upSystem和dsRNA合成试剂盒RiboMaxTMT7LargeScaleRNAProductionSystems购于Promega公司；质粒提取试剂盒PlasmidMiniKit购于OMEGA公司；TRIZOLKit购于Invitrogen公司；HisTrapHP蛋白纯化柱购于GE公司；SuperSignal@WestPicoTrial陆购于ThermoScientificPierce公司；基因定点突变试剂盒EasyMutagenesisSystem购于TransGen公司；所用农药(三氟氯氰菊酯、辛硫磷、哒螨灵和百草枯)购于山东华阳科技有限公司，甲酰胺、L-精氨酸、伊巯基乙醇等其它化学试剂购于Sigma公司。2．1．4PCR引物PCR引物由上海生物工程公司合成。 山东农业大学博士学位论文表2．1研究所用AceGST02基因引物Table．2-ITheAccGST02primersusedinthisstudyAbbreviationPrimersequence(5"-33DescriptionGOFATGAGTAACTTACATCTTGGACCcDNAsequencepdmerofAccGST02，forwardGOR5P05PI3PO3PIAAP戳姆B26B25QPFQPRGPF(狰RPSOPXOPSIPXIQSFQSRp-actin-Sp-actin-xEPFEPRRPFRPRGDFGDRGSFGSRPFPRSFSRCFCRGⅢG【RG28FGTAACATACCAGGTT(汀GTTCC1TrACCCTCTGGATGAAmCGAGAATCAGGTCCAAGATGTAAGGG百啪G§&氏‘疆氏GACc§0匹c§ⅨtGGAGGAACACAACCTGGTATGITAGG(配CAC(℃GTCGACTAGI：AC(G)14GGCCACGCGTCGACTA(订-ACGACTCTA(}ACGACATCGA(T)Is(认CTCTAGACGACArCGAATGAGTAACrrACATCTrGGACCCACAGCACj^TCTCACAAGGCATGA(订’AACrI：lACATCTTGGACCCACA(配ACATCTCACAAGGCCAGCAAAATCAl3CAATTACCGTCATAATCArCATCCCAACAACATCAGCa兀’GTCG』钢陀1=AGATTCACrrGGGTAGAI]rAGCAGrrllTCTCGGAAATCGA觚AGAATCTGCGCGTr几陀CCATCl-ATCGTCGGTr丌CTCCA工ATCATCCCAGG叽ACCATGAGl：八AC兀ACATCTTGGACCGGATCCAAGTTTATCAAAATC从CA：IvrTCCTGCCAGAAGTAAAAGGACAAGTTCGTCCA丌AACATCAACAAGTGCTGGTCGAAGGAGAAAAClⅪGTGGCAGCG己钆虹℃CACCACCTCB叮CGCTrCrI．AGTD^TGGAGGTGTTGGCCArCTGAAATCGTAAAGAGCGCAAAGAGAATGGGAAGGCr兀TGTGlIAC(斑A(}GTGC1vrGCCArrCAAG(订TCTGGTTGCATa兀℃CCAAACATCA触rACCGTCTTGGCCC(认ACAA兀TGCATTCTCTAGGCCCACCAAA删Z4C鳓CZj翻CZ}蔓Z4GGGC6省TCTCAAAAACCACCAGAAT删以0例C删C以黝G(删ATCT』诅C√吼～CCAGGTTGTGTATGGTATGAAATATGCTCCITrTACACATCGeDNAsequenceprimerofAccGST02，reverse5’RACEreverseprimerofAccGST02，outer5’RACEreverseprimerofAccGST02，inner3’RACEforwardprimerofAccGST02，outer3’RACEforwardprimerofAccGST02，innerAbridgedAnchorPrimerAbridgeduniversalamplificationprimer3’RACEuniversaladaptorprimer3’RACEuniversalprimerFull-lengthcDNAprimer,forwardFull-lengthcDNAprimer,reverseGenomicsequenceprimerofAccGST02，forwardGenomicsequenceprimerofAccGST02，reverseInversePCRforwardprimer,outerInversePCRrcverseprimer，outerInversePCRforwardprimer，innerInversePCRreverseprimer,innerPromoterspecialprimer，forwardPromoterspecialprimer,reverseStandardcontrolprimer,forwardStandardcon仃olprimer,reverseProteinexpressionprimer,forwardProteinexpressionprimer,reverseqRT-PCRprimerofAccGST02,forwardqRT-PCRprimerofAccGST02,reverseqRT-PCRprimerofAccGSTD,forwardqRT-PCRprimerofAccGSTD,reverseqRT-PCRprimerofAccGSTs4,forwardqRT-PCRprimerofAccGSTs4,reverseqRT-PCRprimerofAccP450,forwardqRT-PCRprimerofAccP450,reverseqRT-PCRprimerofAccSOD,forwardqRT-PCRprimerofAccSOD,reverseqRT-PCRprimerofAccCAT,forwardqRT-PCRprimerofAccCAT,reverseRNAiprimerofAccGST02，forwardRNAiprimerofAccGST02，reverseC28AmutationprimerofAccGST02，forward 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析表2-2研究所用AccsHsp22．6基因引物Table．2-2TheAccsHsp22．6primersusedinthisstudyAbbreviationPrimersequence(5’-33DescriptionmlHP25Pl5P23P13P2AAP黼心B26B25QPlQP2GPlGP2PSlPS2PS3PS4QSlQS2I强lI己P2fl-actin—Sfl-actin-XEPlEP2ⅢlGTCGCAAAA：rGTCJ姗GGGGAAArrrC／蛆’AApLTGGCAGGrr(认ACTGCCTCTGTCACCA_岍GTTCCGGALAAAGGCC(认ACCTCArGAAATC(酗LTGTTCGAAGTn、TCATCTGACGGCGGGCCACGCGTC@蛇TAG．IAC(G)14G(℃CAC(℃GTCGACl．AGl’ACGACTCTAGACGACAI℃GA(D18GACTCl’AGACGACATCGAGTCGCAAAATGTCATTGGrITCTTCTCTrCGT兀_rCTTCGTCGCAAATGTCATTGGr兀℃TTCTCrrCGr兀丁CTTCCTG√钢广CTAACTGAAL蛔硝mCCAGGTToCTAArrGAATGTTC(℃(祀(℃GAAC』^TTCAAn认(祀AACl=AGCTGGAAAI：f蛔"A：ITCAGll’AGArCAGGCTTGl：f^rrGTAGATGlTCCACTGGGGTACCAArGACAn广IT(配GACGCGATGA(℃ACGGTTGGA兀_rCACGGlTCTGCT(挖TGr丌GGGTGGTrITCCC√吼1．ATCGTCGGTI]盯℃TCCAⅨrC√蛆℃CCAGGGATCCATGTCATTGGlACCr兀’AAGCrI]眦rrCTCTTCGl_兀1CrrC2扎4翻aG■C兀×C朔尉GGGcI钏GGTACCTTroCl：f^TTCTCTGcDNAsequenceprimerofAccsHsp226,forwardcDNAsequenceprimerofAccsHsp22．噍reverse5’RACEreverseprimerofAccsHsp22．6,outer5’RACEreverseprimerofAccsHsp22．瓯inner3’RACEforwardprimerofAccsHsp22．反outer3’RACEforwardprimerofAccsHsp22．瓯innerAbridgedAnchorPrimerAbridgeduniversalamplificationprimer3’RACEuniversaladaptorprimer3’RACEuniversalprimerFull-lengtheDNAprimer,forwardFull-lengthcDNAprimer,reverseGenomicsequenceprimerofAccsHsp22．瓯forwardGenomicsequenceprimerofAccsHsp22．瓯reverseInversePCRforwardprimer,outerInversePCRreverseprimer,outerInversePCRforwardprimer,innerInversePCRreverseprimer，innerPromoterspecialprimer,forwardPromoterspecialprimer,reverseqRT-PCRprimerofAccsHsp22．反forwardqRT-PCRprimerofAccsHsp22．反reverseStandardcontrolprimer,forwardStandardcontrolprimer,reverseProteinexpressionprimer,forwardProteinexpressionprimer，reverseRNAiprimerofAccsHsp22，6forwardm2弛4刚c!竺c砑黝GGGcG们GCTGTTRNAiprimer。f彳傩脚22_6revc塔e⋯⋯⋯⋯⋯～JJ⋯⋯TGGGToGrITC‘24 山东农业大学博士学位论文2．2实验方法2．2．1中华蜜蜂的饲养及处理(1)根据MicheletteandSoares(1993)所述的方法，分别采集卵、1．5日龄幼虫、蛹前期、不同蛹期及不同日龄的成虫。参照Silva等幼虫饲养方法(Silvaeta1．，2008)和Alaux等成虫饲喂方法(Alauxeta1．，2010)，将采集样品置于34"C，相对湿度70％的恒温培养箱中饲养。(2)中华蜜蜂不同组织的分离：将活的成虫置于冰上进行解剖，迅速分离脑组织(brain)、中肠(midgut)、表皮(epidermis)和肌肉(muscle)，用生理盐水冲洗后立即放入液氮中冷冻，．80℃保存。(3)不同发育时期中华蜜蜂的获得：在山东农业大学实验研究基地分别采集卵、1．5日龄幼虫(L1．L5)、蛹前期(PP)、不同蛹期(Pw，Pp，Pb，Pd)及不同日龄的成虫(A1，A10，A15，A30)，立即放入液氮冷冻，于．80℃保存。(4)温度和紫外线处理：用不同温度(4℃，16*C，25。C，42。C)和紫外线(30mj／cm2)对成虫进行适当时间刺激后收集，液氮冷冻并置于．80℃保存。(5)重金属处理：待试成虫分为对照组和实验组，前者饲喂由30％蜂蜜和70％糖粉以及无菌水组成的基础日粮(BAD)；后者分别添加CdCl2(0．5、5、101xg／mL)和HgCl2(3mg／mL)至BAD中。待处理适当时间后收集样品，液氮冷冻后．80。C保存。(6)农药处理：将浓度为20“g／L三氟氯氰菊酯(Cyhalothrin)、llxg／mL辛硫磷(phoxim，)、100M哒螨灵(pyridaben)、10州百草枯(paraquat)各0．51xL分别涂抹待试成虫的胸背板处，涂抹无菌水的成虫作为对照。待处理适当时间后，收集样品并液氮冷冻，．80℃保存。(7)I-I：．02处理：用无菌微量注射器注射20此(50¨M)H202于待试成虫的第一、二腹节处，同样方法注射PBS的成虫作为对照。待处理适当时间后，收集样品并液氮冷冻，．80℃保存。(8)20E处理：将不同浓度20E(1、0．1、O．01、O．001pg／mL)分别添加到待试3日龄幼虫的BAD中，对照组添加O．1mg／mL乙醇(20E的溶剂)，待处理96h后，收集样品并液氮冷冻，．80℃保存。(9)微生物侵染：将五种病原微生物黄曲霉菌(Aspergillusflatus)，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)，白僵菌(Beauveriabassiana)，黑胸败血菌(Bacillus25 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析bombysepticus)和蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)分别接种于3日龄幼虫体表，室内人工培养至6日龄后收集，液氮冷冻，．80℃保存。以上所有实验处理均设3个重复。2．2．2中华蜜蜂总RNA的提取、纯化及鉴定2．2．2．1利用TRIZOLKit提取总RNA(1)加入lmL4"C预冷的TRIZOL提取试剂于1．SmL离心管中；(2)称取0．05一O．19液氮研磨材料，立即转移至上述提取试剂中，震荡混匀，室温静置5rain，4"C，12000rpm，离心10min；(3)转移上清至新的离心管中，加入0．2mL氯仿，剧烈振摇15sec后，室温静置2-3min，4℃，12000rpm，离心15min；(4)转移上层水相至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置lOmin，4"C，12000rpm，离心10min；(5)弃上清，用75％冷乙醇洗涤沉淀，4"C，7500rpm，离心5min；(6)弃上清，待沉淀略干燥后，用50btLDEPC．ddH20溶解RNA，．20"C短期保存，．80℃长期保存。2．2．2．2总RNA的纯化(1)总RNA中基因组DNA的去除，反应体系如下：RNA1OxDNaselbufferDNaseI(re、『asefree)DNaseIRNaseinhibitor5此21xL0．51xLO．5pL0．5btLDEPC—ddH20upto20I_tL(2)上述反应物混匀后先于37℃，反应30min；再置于80℃，10min后终止反应。2．2．2．3总RNA的电泳鉴定(1)1．2％琼脂糖甲醛变性胶的配制(50mL)： 山东农业大学博士学位论文琼脂糖5×RNAbufferDEPC-ddH20O．6910mL3lmL上述物质加热熔化后冷却至60℃左右，加9mL37％甲醛溶液，并于通风橱内灌制凝胶，室温放置30min以上使胶凝固。(2)RNA样品准备：首先测定纯化后总RNA的含量，然后用DEPC．ddH20调整样品的RNA浓度至20鹇／6此，按下表混合所示溶液。65。C，水浴15min，冰上冷却后加入4肛5x砌悄上样缓冲液和0．51xL溴化乙锭(1mg／mL)后上样，40V，电泳2．3h。总RNA5×I姒bufferDEPC—ddH206．0lxL4．01xL15．01xL(3)电泳结束后，将凝胶置于紫外透射仪上观察并照相。2．2．3eDNA第一链的合成及纯化(1)RNA反转录反应体系如下：mRNAoligod∞引物ESMix2xESMixbuffer5btL1ktLlpL5pLDEPC-ddH20upto20}xL(2)轻轻吸打混匀上述反应物，42℃，水浴50rain，冰上冷却5min后，短暂离心后．20℃保存。(3)eDNA的纯化。取1．5mL离心管，加入lmLv＼IrmarrdResin，再加入样品并颠倒混匀；将混匀后样品加入试剂盒中的大管内，小管连入大管，对混合液抽真空过小管；加入2mL80％异丙醇于大管中，抽真空过小管；抽过小管后，再抽真空30see以干燥Resin；然后弃大 中华蜜蜂谷胱甘肽S-转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析管，将小管置入新的1．5mL离心管中，12000rpm，离心2min，去除残留的异丙醇；再将小管置入新的1．5mL离心管中，加入50btL70。C预热的ddH20，室温静置lmin，12000rpm，离心20sec，洗脱eDNA，于-20。C保存。2．2．4cDNA5’末端的加尾反应(1)反应体系为：cDNA5xTdTBufferO．1％BSA100mMdCTPTdT20I-tL10J_tL5此1pLddH20upto509L(2)上述反应物混匀后于37℃保温30min；(3)再加入100I，tL无水乙醇，置于．20℃沉淀30mira(4)12000rpm，室温离,&,5min。弃上清，室温干燥后用适量ddH20回溶。2．2．5目的DNA片段的回收、连接及转化2．2．5．1目的DNA片段的回收(1)紫外灯下小心切取含有目的DNA的琼脂糖凝胶条带并置于1．5mL离心管中，尽量切去不含目的片段的凝胶，提高DNA回收率；(2)用天平称量所切胶块的重量，以lmg=lktL估算胶块的体积，并加入3倍于胶块体积的胶块融化液；(3)55℃水浴加热10min融化胶块，其间振荡混匀以使胶块充分融化；(4)将试剂盒中的吸附柱安置于收集管上，并将冷却至室温的溶胶液转入吸附柱中，13000rpm，离心60sec；(5)弃滤液，加入700I．tL的漂洗液于吸附柱中，13000rpm，离心60sec；(6)弃滤液，加入500I．tL的漂洗液于吸附柱中，13000rpm，离心60sec；(7)弃滤液后，13000rpm，离心2min，以弃去残余液体；(8)将收集管放置于新的1．5mL离心管上，加入20．309L的ddH20或ElutionBuffer 山东农业大学博士学位论文于收集膜的中央处，室温静置2min；(9)13000rpm，离心60sec，洗脱液于-20。C保存。2．2．5．2目的DNA片段与克隆载体的连接连接载体为pEasy-T3克隆载体，连接反应体系如下：pEasy-T3vector目的DNA片段llaL41xLTotal5lxL混匀后，25℃，连接10min后进行转化。2．2．5．3大肠杆菌感受态细胞的制备(1)取出冻存于．80"C的大肠杆菌DH5a细胞，待其稍微融化后，吸取1此加至3mL新鲜LB液体培养基中，37"C，200rpm，振荡培养过夜；(2)次日，吸取2mL培养液加至50mL新鲜LB中，37"C，200rpm，振荡培养2．4h，期间吸取培养液测定其OD600_O．4．0．6后，停止振荡培养；(3)4。C，4600rpm，离心5min，轻轻弃上清，加入10mL(1／5体积)预冷的0．1M的MgCl2溶液悬浮细胞；(4)4。C，4600rpm，离心5min，轻轻弃上清，加入25mL(1／2体积)预冷的O．1M的CaCl2溶液悬浮细胞，冰浴中静置20min；(5)4。C，4600rpm，离心5min，轻轻弃上清，加入5mL预冷的0．1M的CaCl2溶液(含15．20％甘油)悬浮细胞，混匀后分装，每管501xL，．80℃冻存。2．2．5．4大肠杆菌感受态细胞的转化(1)取出冻存于．80"C的感受态细胞(50}tL)，冰浴融化；(2)加入59L连接产物至感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴静置30min；(3)42℃水浴，热激90sec后，立即冰浴2min；(4)加入9501aLLB液体培养基，37。C，200rpm，振荡培养1．5．2h；(5)室温，10000rpm，离心lmin，沉淀用100pLLB液体培养基回溶；(6)取100肛L悬浮细胞，涂布在含有合适抗生素的LB固体培养基上，37。C，倒置培养12．20h。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析2．2．6大肠杆菌质粒DNA的提取及酶切鉴定2．2．6．1质粒DNA的提取(试剂盒微量法)(1)取5mL菌液加入离心管中，10000rpm，室温离心lmin；(2)弃上清，加入250rtL的SolutionI／RNaseA混合液于菌体沉淀中，漩涡振荡2min，使细胞完全重新悬浮；(3)加入250pLSolutionII，轻轻翻转4-6次使其混匀，以得到澄清的裂解液；(4)再加入350I_tLSolutionIII于上述混合液中，温和地上下颠倒混匀数次，直至形成白色的絮状沉淀后，10000rpm，室温离心10min；(5)小心将吸取的上清转入吸附柱内，lOOOOrpm，室温离心lmin；(6)弃滤液，向吸附柱内加入500pLBufferHB，10000rpm，室温离心lmin；(7)弃滤液，向吸附柱内加入700}tLDNAWashingBuffer，10000rpm，室温离心lmin；(8)重复步骤7；(9)弃滤液，10000rpm，室温离心1min，以去除残存液体；(10)将吸附柱放置在新的1．5mL离心管中，直接加入50．100}tL无菌双蒸水于收集膜中央处，10000rpm，室温离心lmin以洗脱质粒DNA，于．20。C保存。2．2．6．2重组质粒DNA的酶切鉴定(1)酶切的反应体系如下：质粒限制性内切酶1限制性内切酶210xHbuffer10f-tL1“L2pLddH20upto209L(2)将上述各组分混匀后，37"C，酶切10min。琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果，根据所切目的DNA片段的位置和大小，以判断所鉴定的质粒是否有外源片段的插入及插入片段的大小。 山东农业大学博士学位论文2．2．7DNA序列的测定测序样品为新鲜菌液，由上海博尚生物技术有限公司和上海生工生物技术有限公司进行DNA序列的测定。2．2．8中华蜜蜂目的基因cDNA序列的获得2．2．8．1目的基因中间片段的获得(1)AccGST022L4ccsHsp22．馑因同源克隆的方法相似，用上述反转录产物进行PCR，反应体系如下：10xPCRbufferdNTPmixture(10mM)引物1(10pM)引物2(109M)CDNATaqE2．5pLlgLllaL0．259LddH20upto259L(2)两个基因的引物序列分别见表2．1和表2．1，反应程序分别见表2．3和表2．4；(3)PCR完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳以检测结果；(4)回收获得的目的片段，与pEasy—T3载体连接，酶切鉴定后进行序列测定。 表2-3AccGST02基因PCR扩增反应条件Table2-3PCRamplificationconditionsofAccGST02PHmenpairAmplificationconditionsGOF／GOR5minat94．12；35cyclesof40secat94"C，40seeat52。C，andlminat72"C；and10rainat72"(25PI／AI7AP3PoB263PMj25QPF／QPRGPI沿PRPSOPXOPSIPXIQSF／QSREPR四RGOF，GOR5P0馈AP5minat94℃；28cyclesof40secat94℃，40seeat53℃，and30seeat72℃：and5minat72"125minat94℃；35cyclesof40sccat94℃，40seeat58℃，and30seeat72℃：and5minat72"125minat94℃；28cyclesof40secat94℃，40seeat49℃，and40seeat72℃：and5rninat72℃5minat94℃；35cyclesof40secat94℃，40seeat55℃，and40seeat72℃：and5minat72℃5minat94℃；35cyclesof40secat94℃，40seeat52℃，andlminat72℃：andlOminat72℃5minat94℃；35cyclesof40secat94℃，40seeat52℃，and1．5rainat72℃：and10minat72℃5minat94℃；30cyclesof50secat94℃，50seeat50℃，and2minat72℃：and5minat72℃5minat94℃；30cyclesof50secat94℃，50seeat50℃，and2minat72℃：and5minat72"125minat94℃；35cyclesof40secat94℃，40seeat52℃，and2minat72℃：and10minat72℃5minat94℃；28cyclesof40secat94℃，40seeat53℃，and1．5minat72℃：and10minat72℃5minat94℃；35cyclesof40secat94℃，40seeat52℃，andlminat72℃：and10minat72℃5minat94℃；28cyclesof40secat94℃，40seeat53℃，and30seeat72℃：and5minat72℃5PVAUAP5minat94"C；35cyclesof40secat94"C，40seeat58℃，and30seeat72"12；and5minat72"(2表2．4AccsHsp22．6基因PCR扩增反应条件Table2-4PCRamplificationconditionsofAccsHsp226PrimerspairAmplificationconditions肿l／耻2lOminat94℃；40seeat94℃，40seeat43℃，and50seeat72℃for35cycles；10minat72℃5P1伪AP10rninat94℃；40seeat94℃，40seeat50℃，and30seeat72℃for28cycles；10minat72℃5P2丘如AP10minat94℃；40seeat94℃，40seeat48℃，and30seeat72℃for35cycles；10minat72℃3P协2610minat94℃；40seeat94"C，40seeat46℃，and40seeat72℃for28cycles；10minat72℃3P擒2510minat94℃；40seeat94℃，40seeat51℃，and40seeat72℃for35cycles；10minat72℃QPl／QP210minat94℃；40seeat94℃，40seeat44℃，andlminat72℃for35cycles；10minat72℃GP协Pl10minat94℃；40seeat94℃，40seeat44℃，and2minat72℃for35cycles；lOminat72℃PSI／PS210minat94℃；40seeat94"12，40seeat45℃，and2minat72℃for30cycles；lOminat72℃PS3／PS410minat94℃；40seeat94℃，40seeat45℃，and2minat72℃for30cycles；10minat72℃QSl／QS210minat94℃；40seeat94℃，40seeat5l℃，and2minat72℃for35cycles；10minat72℃EPl／EP210minat94℃；40seeat94℃，40seeat5l℃，andlminat72℃for30cycles；lOminat72℃册1／肿2lOminat94℃；40seeat94℃，40seeat43℃，and50seeat72℃for35cycles；10minat72℃5PVAAP10minat94℃；40seeat94℃，40seeat50℃，and30seeat72℃for28cycles；lOminat72℃5P2／AUAP10minat94℃；40seeat94℃，40seeat48℃，and30seeat72℃for35cycles；10minat72℃3P协2610minat94℃；40seeat94℃，40seeat46℃，and40seeat72℃for28cycles；10minat72℃3P2432510minat94℃；40seeat94℃，40seeat51℃，and40seeat72℃for35cycles；10rainat72℃QPl／QP210minat94℃；40seeat94℃，40seeat44℃。andlminat72℃for35cycles；10minat72℃GPlA3P110minat94℃；40seeat94℃，40seeat44℃，and2minat72℃for35cycles；10minat72℃PSl／PS210minat94℃；40seeat94℃，40seeat45℃，and2minat72℃for30cycles；10minat72℃PS3／PS410minat94℃；40seeat94℃，40seeat45℃，and2minat72℃for30cycles；10minat72℃32 山东农业大学博士学位论文2．2．8．25味端序列的获得(RACE法)(1)用上述5·加尾的反转录产物进行第一次PCR，反应体系如下：10xPCRbufferdNTPmixture(10raM)AAP(10I．tM)外侧引物(10pM)cDNATaqE2．59LllaLlgL0．259LddH20upto259L(2)两个基因的引物序列分别见表2．1和表2．1，反应程序分别见表2-3和表2-4；(3)以同样的反应体系和反应程序，以第一次PCR产物为模板做第二次PCR，引物为AU廿和相应的内侧引物；(4)回收获得的目的片段，与pEasy．T3载体连接，酶切鉴定后进行序列测定。2．2．8．33’末端序列的获得(RACE法)(1)用上述反转录产物进行第一次PCR，反应体系如下：10xPCRbufferdNTPmixture(10mM)B26(10I_tM)外侧引物(10pM)cDNATaqE2．59LlgL1“LlgL0．259LddH20upto259L(2)两个基因的引物序列分别见表2．1和表2．1，反应程序分别见表2．3和表2．4；(3)以同样的反应体系和反应程序，以第一次PCR产物为模板做第二次PCR，引物为B25和相应的内侧引物；(4)回收获得的目的片段，与pEasy．T3载体连接，酶切鉴定后进行序列测定。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析2．2．8．4eDNA全长序列的获得根据上述已测序序列(中间片段、5’末端和3’末端)，拼接出目的基因eDNA全长序列，设计扩增全长的引物，用上述反转录产物进行PCR，进一步验证eDNA全长序列。(1)反应体系如下：10xPCRbun-erdNTPmixture(10mM)引物1(109M)引物2(109M)cDNATaqE2．59LlgL19LlgL0．259LddH20upto259L(2)两个基因的引物序列分别见表2．1和表2．1，反应程序分别见表2．3和表2．4；(3)回收获得的目的片段，与pEasy-T3载体连接，酶切鉴定后进行序列测定。2．2．9中华蜜蜂基因组DNA的提取(试剂盒小量法)(1)取_<25mg(脾S10mg)液氮快速研磨后的蜜蜂组织，置于1．5mL离心管中；(2)加入180pLLB2和209LProteinaseK，漩涡振荡混匀，55。C水浴，孵育2．3h直至完全裂解；(3)加入20LlLRNaseA，混匀，室温孵育2min，以去除RNA；(4)12000rpm，室温离41,5min，将上清转至新的1．5mL离心管中；(5)再加入109L10％SDS，立即涡旋混匀5see；(6)力H,K2009LBB2，立即涡旋混匀5sec，70。C水浴，孵育10min；(7)j7ILN．2009L无水乙醇，涡旋混匀5sec；(8)将全部混合液加入吸附柱中，12000rpm，室温离-t],30sec；(9)弃滤液，向吸附柱内加入5009L溶液CB2，12000rpm，室温离心30sec；(10)重复步骤9一次：(11)弃滤液，向吸附柱内加入5009L溶液WB2(使用前先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm，室温离心30sec；(12)重复步骤11一次；34 山东农业大学博士学位论文(13)12000rpm，室温离,l=‘,2min，彻底去除残留液体；(14)将吸附柱置于新的1．5mL离心管中，加入2009L预热EB(60"C)或去离子水(pH>7．0)于收集膜中央处，室温静置lmin，12000rpm，离,l",,lmin，洗脱DNA；(15)重复步骤14一次，以洗脱得到更多DNA，置于．20℃保存。2．2．10中华蜜蜂目的基因基因组全长序列的获得(1)根据已得到的目的基因eDNA全长序列，设计相应引物，以上述提取的蜜蜂基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应体系如下：l0×PCRbufferdNTPmixture(10mM)引物1(109M)引物2(10“M)DNATaqE2．59LlbtLlgL0．25I_tLddH20upto259L(2)两个基因的引物序列分别见表2—1和表2．1，反应程序分别见表2．3和表2．4；(3)回收获得的目的片段，与pEasy-T3载体连接，酶切鉴定后进行序列测定。(4)将测序后序列与其eDNA序列进行比对，分析并确定内含子序列，得到目的基因基因组全长序列。2．2．11中华蜜蜂目的基因启动子序列的获得(反向PCR)(1)用限制性内切酶EcoRI酶切中华蜜蜂基因组DNA，37。C，反应18．24h；(2)反应结束后，用等体积的氯仿／异戊醇(24：1)进行抽提，然后加入1／10体积的NaAe和2倍体积的无水乙醇，以沉淀DNA；(3)用309LddH20溶解沉淀ffODNA，并将浓度调整NSpg／mL,(4)取59L上述DNA溶液，在T4连接酶的催化下，164C，反应2h，使其自连成环；(5)以上述连接产物为模板，根据基因组DNA序列分别设计相应引物进行第一次PCR扩增；(6)以稀释50倍的第一次PCR产物为模板，用相应引物(表2．1和表2．2)进行第二 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析次PCR，反应体系如下：l0xPCRbufferdNTPmixture(10mM)引物1(109M)引物2(109M)稀释50倍一次PCR产物TaqE2．59L1¨L1LLLlgL0．259LddH20upto251aL(7)两个基因的引物序列分别见表2．1和表2．1，反应程序分别见表2．3和表2-4；(8)回收获得的目的片段，与pEasy-T3载体连接，酶切鉴定后进行序列测定；(9)根据测序结果，设计相应引物，以基因组DNA为模板，进行PCR验证，反应体系如下：10xPCRbuH．erdNTPmixture(10mM)引物1(109M)引物2(109M)DNATaqE2．59LlgL19LlktL0．259LddH20upto25／lL(10)两个基因的引物序列分别见表2．1和表2．1，反应程序分别见表2．3和表2．4；(11)回收获得的目的片段，与pEasy．T3载体连接，酶切鉴定后进行序列测定。2．2．12实时荧光定量PCR分析基因的表达2．2．12．1内参引物、反应体系及反应条件的确定(1)以中华蜜蜂中的肌动蛋白基因(fl-actin，GenBank注册号：HM640276)作为内参基因，内参引物fl-actin-s和fl-actin-x及相关基因定量引物见(表2．1和表2-2)； 山东农业大学博士学位论文(2)以反转录产物为模板，SYBR哂PrimeScriptTMRT-PCRKit反应体系如下：SYBRPremixExTaqTMII(2x)PCRForwardPrimer(101xM)PCRInversePrimer(101xM)cDNA12．51xLllxL2ktLddH20upto25此(3)实时荧光定量PCR反应程序如下：95℃30see95。C5secl55。C15see}40个循环72℃15secJ扫描65℃t095℃0．5℃／seeEnd(4)按10x浓度依次将模板稀释成5个梯度，构建荧光定量PCR反应的相对标准曲线，验证所用基因引物的扩增效率以及目的片段在此浓度范围内是否呈线性扩增的关系，并通过融解曲线检测引物扩增的特异性进而确定引物扩增的条件。实验所用仪器为Bio．radCFX96实时荧光定量PCR仪。2．2．12．2实时荧光定量PCR分析(1)不同处理样品总RNA的提取方法见(2．2．2．1)；(2)按照上述反应体系和反应程序，进行不同处理样品实时荧光定量PCR分析，目的基因与内参基因同时扩增，默认条件下读取各Ct值；2．2．12．3数据处理(1)采用双标准曲线法分析数据，利用2‘△△cT计算基因的相对表达量，同时计算平均表达量和相对偏差，用Excel作图；(2)用SAS9．1统计软件(SASInst．，Ine．，Cary,NC，USA)ANOVA法进行单因子方差分析，用Duncan检验进行数据的多重比较。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析2．2．13双链RNA(dsRNA)的合成2．2．13．1dsRNA模板的制备(1)分别对两个基因进行同源性分析，选择基因同源性较低的区域设计相应引物(表2．1和表2．2)，并在引物的5’端添力N23bp的T7启动子序列，以包含目的基因的重组质粒为模板，进行PCR扩增；(2)回收并纯化PCRW物。2．2．13．2dsRNA的合成按照砒boMaxTMT7LargeScaleRNAProductionSystems试剂盒的说明，将上述回收的DNA产物转录为RNA。(1)按照试剂盒所示的转录反应体系，将反应混合物摇匀，37"C水浴，孵育2．4h。转录体系如下：rNTPs(25raMATP，CTP，69LGTP，UTP)EnzymeMix(T7)29L模板DNA(5-lOgg)lgLNuclease-FreeWater79L5xReactionBuffer49LTotal209L(2)加入lgL的DNaseI于反应液中，混匀，37"C水浴，孵育15min；(3)加入等体积酚／氯仿／异戊醇混和液(125：24：1)抽提；4"C，150009，离,t],15min，转移上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿／异戊醇混和液(24：1)；4"C，150009，离4l,15min，转移上清至新的离心管中，加入1／10体积的3M醋酸钠溶液；4"C，150009，离,心15min，转移上清至新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，．20℃过夜沉淀RNA；第二天，4℃，150009，离,l二,15min，加入70％乙醇洗涤沉淀，4"C，150009，再次离心15min，弃上清；将沉淀干燥后，加入适量Nuclease．freeWater溶解，得到纯化的dsRNA；，(4)测定纯化后dsRNA的浓度，并将其调整为1299／gLi(5)绿色荧光蛋白GFP作为阴性对照，其dsRNA的合成步骤同上。 山东农业大学博士学位论文2．2．13．3dsRNA的注射(1)将新出房的蜜蜂放置于冰上5min，降低其体压，以防注射后dsRNA泄露；(2)用微量注射器注射约0．59L于蜜蜂胸部肌肉中；(3)注射等量的dsGFP与Nuclease．freeWater做为对照；(4)将注射后的蜜蜂置于34℃，70％相对湿度恒温培养箱中饲养。2．2．13．4dsRNA的饲喂将10I．tgdsRNA添加到待试3日龄幼虫的基础日粮中，对照组添加等量的dsGFP与Nuclease．freeWater做为对照，然后置于34。C，相对湿度70％的恒温培养箱中饲养。2．2．14目的基因的原核表达及纯化2．2．14．1原核表达载体的构建(1)用分别带有BamHI和KpnI或BamHI和HindIII酶切位点的引物(表2．1和表2．2)，以eDNA为模板，进行PCR扩增；(2)分别用BamHI和KpnI或BamHI和HindIII双酶切回收的目的片段和原核表达载体pET-30a(+)，琼脂糖凝胶电泳分离并回收酶切后的目的片段和载体片段；(3)连接回收的目的片段与载体片段，转化大肠杆菌DH5a，酶切鉴定后，筛选出阳性克隆。2．2．14．2重组基因原核表达的诱导(1)将含重组基因的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞；(2)挑取单菌落并接种到10mLLB液体培养基中(含卡那霉素)，37℃，振荡培养过夜；(3)次日，取适量菌液加入新的10mLLB液体培养基中(含卡那霉素)，37。C，振荡培养2．3h；(4)至OD600=0．2．0．5后，再加入IPTG至终浓度0．2mM，37℃，继续振荡培养3．4h；(5)取lmL诱导后菌液，12000rpm，室温离,6,1min；(6)弃上清，jJll／X．509L2x]2样缓冲液混匀，沸水浴5-10min，12000rpm，室温离,&,30see；冷至室温后，取上清直接进行SDS．PAGE或于．20℃保存样品备用。39 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析2．2．14．3重组蛋白的纯化(1)取过夜诱导培养的菌液400mL，6000rpm，4。C，离,t),5rnin；(2)弃上清，加入20mL4"C预冷的PBS溶液，重悬菌体，6000rpm，4"C，离心5mill；(3)弃上清，加入20mL4。C预冷的PBS溶液，重悬菌体，超声波破碎细胞30min，至菌液呈半透明状，12000rpm，4。C，离&,15min；(4)弃上清，加入2mL裂解液，重悬菌体，加入40此溶菌酶，混匀，37"C消化1．2h：(5)12000rpm，4。C，离,l二,15min，取上清(可溶性蛋白)；(6)上清液经O．459m滤膜过滤后加至HisTrapHP蛋白纯化柱中，4"C静置30mira(7)按照HisTrapHP蛋白纯化柱说明书操作，利用咪唑梯度进行重组蛋白的洗脱；(8)将含有重组蛋白的洗脱液分装到离心管中，．20"C保存，另取209L洗脱液进行SDS．PAGE检测其纯度。2．2．14．4SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)(1)安装好电泳槽；(2)按下表制备分离胶(12．5％)：Total15mL30％Acr．Bis1．0MTris-HCl(pH8．8)10％SDS10％APSTEMEDddH207．5mL5．6mL0．3mL0．2mL209L1．85mL将混匀后的分离胶溶液倒入两块玻璃板之间，凝胶高度距样品模板梳齿下缘约lcm，并马上在凝胶面覆盖一层ddH20，保持胶面平整，静置30min至胶完全聚合； 山东农业大学博士学位论文(3)弃去上层ddH20，并用吸水纸吸干，按下表制备浓缩胶(5％)：Total10mL30％Acr．Bis1．0MTris-HCl(pH6．8)10％SDS10％APSTEM匣DddH201．67mL1．25mL0．1mL10此7．03mL将混匀后的浓缩胶溶液倒入两块玻璃板之间，立即插上样品梳，静置20min至胶完全聚合；(4)取20此样品上样，开始时电压为70V，待样品进入分离胶后，将电压调至120V，当溴酚蓝染料刚好跑出分离胶，停止电泳；(5)卸下胶板，将凝胶置于50mL固定液中，室温固定1h；(6)弃去固定液，加入染色液，室温染色过夜；(7)将凝胶取出放入脱色液中脱色，每2．3h更换一次脱色液，至蛋白条带清晰后，用凝胶成像系统扫描或数码相机拍照。2．2．15抗体的制备及检测2．2．15．1抗体的制备(1)将适量纯化蛋白(抗原)与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀，腹部皮下注射小白鼠；(2)待免疫1周后，将抗原与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀，腹部皮下注射小白鼠；(3)重复步骤2两次；(4)第四次免疫后第4天，从小鼠尾部采血，分离血清，检测抗体效价是否合格；(5)从小鼠尾部大量采血，37"C，静置lh；(6)3000rpm，室温离一gq5min，小心吸取抗血清并分装(20I-tL／管)，于-80"C保存。 中华蜜蜂谷胱甘肽s．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析2．2．15．2ELISA检测抗体效价(1)按l：20的比例用碳酸缓冲液(pH9．6)稀释抗原，每F[,2009L包被微量反应板，4℃放置过夜；(2)次日，用PBST洗涤液(pH7．4)洗板4次，每孔JJI]A．2509L封闭液(含5％牛血清白蛋白)，37"C放置2h；(3)洗板4次，按适当比例用封闭液稀释一抗，每孑LjJI]／X200pL，37"C放置2h；(4)洗板4次，加入适当浓度辣根过氧化物酶标记的二抗(GoatAnti-MouseIgG，HRP)，每孔JJI／X．2009L，37℃放置2h；(5)洗板4次，加入邻苯二胺底物缓冲液进行显色，每孑[,2009L，室温避光放置20min；(6)每孔加入100pL2MH2S04终止反应，在酶联免疫检测仪上测定各孑LOD492，检测抗体效价。2．2．15．3Westernblot分析(1)目的蛋白进行SDS．PAGE后小心取下凝胶，并去除所有浓缩胶；(2)在阴极缓冲液中浸泡凝胶至少15min；(3)在阳极缓冲液I中浸泡两张滤纸、阳极缓冲液II中浸泡一张滤纸、阴极缓冲液中浸泡三张滤纸至少30see；(4)在甲醇中浸湿PVDF膜15sec后，小心转入ddH20中再浸泡2min，最后置于阳极缓冲液II中平衡至少5min；(5)转移叠层的装配：两张浸透阳极缓冲液I的滤纸置于电极阳极板中央，浸透阳极缓冲液II的滤纸放在前两张滤纸上，将凝胶放在膜上，浸透阴极缓冲液的三张滤纸放在凝胶上，轻轻用玻璃棒赶尽气泡，将电极阴极板压在叠层上，接通电源，以0．8mA／cm2，50V，转膜2h；(6)将膜取下，放在滤纸上晾干，用ddH20冲洗10sec，在甲醇中振摇5min，使膜彻底润湿；(7)PBST漂洗后，将印迹膜放入封闭液(5％脱脂奶粉)中振摇lh；(8)将印迹膜放入封闭液稀释的一抗溶液中，4℃振摇过夜；(9)PBST漂洗后，将印迹膜放入封闭液稀释的二抗(GoatAnti-MouseIgG，HRP)溶液中振摇1h；(10)PBST"．黼，I驭SuperSignal@WestPico碱al陆中化学发光底物A和B两种试42 山东农业大学博士学位论文剂，在保鲜膜上等体积混合；(11)将印迹膜面朝下与此液充分接触lmin，用滤纸吸干残液，放入暗盒(含增感屏)中：(12)在暗室中，于红灯下取出X．光片并裁剪至比膜略大约1cm后，打开暗盒放于膜上，关上暗盒，曝光1．5mira(13)打开暗盒，取出X．光片，迅速浸入显影液中1-2min，出现明显条带后，立即终止显影；(14)取出X．光片浸入定影液中5．10min，待胶片透明后，用自来水冲掉残留的定影液，待室温下晾干后扫描或拍照。2．2．16免疫组织化学技术2．2．16．1组织的分离处理迅速分离注射dsRNA和对照组中华蜜蜂成虫的脑部、胸部、腹部与幼虫，PBS冲洗后，立即浸入4％多聚甲醛中固定，4。C过夜。2．2．16．2组织石蜡切片的制作(1)将固定好的组织材料放入铜盒内，流水冲洗24．48h；(2)将冲洗后的组织材料进行梯度脱水，具体步骤为：50％、70％、80％、90％、95％、100％无水乙醇分别脱水1h后，再在另一100％无水乙醇中脱水O．5h；(3)将脱水后的组织材料进行透明处理，具体步骤为：将组织材料放入无水乙醇+二甲苯(1：1)5min，二甲苯(I)5min，最后放入二甲苯(II)中，根据组织的透明程度确定浸泡的时间；(4)将透明后的组织材料进行浸蜡处理，具体步骤为：从二甲苯(II)中取出组织材料，分别浸入蜡杯(I)lh、蜡杯(II)lh和蜡杯(III)lh；(5)将浸蜡后的组织材料放入包埋框内，使其浸入蜡中，将包埋好的蜡块室温下过夜，使其充分凝固；(6)次日，根据组织材料的位置修块并标记，然后用切片机对蜡块进行切片、展片，切片厚度为109m，随后进行烤片，42℃，烤片48h。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析2．2．16．3免疫组织酶化学分析(1)将烤好的组织切片进行梯度脱蜡，具体步骤为：二甲苯、无水乙醇+二甲苯(1：1)、100％、90％、80％、70％、50％无水乙醇分别脱蜡5min后，置于ddH20中；(2)用PBS冲洗组织切片3次(3min／次)，用3％H202室温封闭30min；(3)用PBS冲洗组织切片3次(3min／次)，将切片浸入0．01M柠檬酸盐缓冲液(pH6．O)中，微波加热至沸腾后断电，间隔5．10min，重复1．2次，进行热抗原修复；(4)待组织切片冷却至室温，PBS冲洗组织切片3次(3miIl／次)，然后用5％山羊血清室温封闭30min；(5)将封闭液稀释的一抗(1：50．1：100)小心地滴加到组织上，4"C孵育过夜；(6)次日，PBS冲洗组织切片3次(3min／次)，将封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1：150．1：200)小心地滴加到组织上，37"C孵育lh；(7)PBS冲洗组织切片3次(3min／次)，将封闭液稀释的三抗(1：150．1：200)小心地滴加到组织上，37。C孵育40．60min；(8)PBS冲洗组织切片3次(3min／次)，小心地滴加DAB显色底物缓冲液到组织上，根据颜色变化确定反应时间，用自来水终止反应：(9)将组织切片浸入苏木精溶液中，反应10—20sec，用盐酸酒精分色后立即用清水冲去；(10)将组织切片进行脱水、透明，最后用中性树脂封片，镜检照相(LSM510META；ZEISS，Germany)。2．2．17AccGST02的定点突变(1)采用部分重叠引物设计法分别设计AccGST02定点突变引物G28F／G28R，G124F／G124R，G217F／G217R(表2．1)；(2)以重组质粒pET．30a(+)-AccGST02作为模板，按照EasyMutagenesisSystem(TransGen)说明书所示方法进行操作，将28、124、217位的半胱氨酸突变成丙氨酸；(3)对所得突变体进行序列测定，鉴定正确的突变体质粒转入E．coliBL21(DE3)细胞，突变体蛋白的表达和纯化如上所述。 山东农业大学博士学位论文2．2．18AccGST02的酶学性质2．2．18．1酶活性测定纯化的AccGST02重组蛋白用100mMI妊12P04(pH7．5)溶液透析后用于酶活力分析。1．氯．2，4．二硝基苯(CDNB)结合活性的测定参照Habig等的方法(Habigetal．，1974)；谷胱甘肽过氧化物酶活性的测定采用Boldyrev等的方法(Boldyreveta1．，2001)；脱氢抗坏血酸还原酶(D也娘)活性的测定采用Wells等的方法(WellsPfal．，1995)。2．2．18．2动力学常数的测定在酶浓度和一种底物浓度不变时，测定另一种底物在一系列浓度梯度下的反应速率，用Lineweaver．Burk双倒数作图法求得娲lG8H，‰cDNB，俨和‰戤。对于DH状的表观动力学常数测定时，当脱氢抗坏血酸(DHA)浓度固定为lmM，GSH浓度范围在0．25．4．0mM；当GSH浓度固定为2．25rnM，DHA浓度范围在0．1．2．0mM。对于CDNB结合活性的表观动力学参数的测定，GSH或CDNB浓度固定为lmM，CDNB或GSH浓度范围在0．1．4．0mM。2．2．18．3最适温度的测定DHAR活性测定的反应体系(1mL)包括：200raMPBS缓冲液(pH6．85)，lmMEDTA，2．25mMGSH和lmMDHA，此反应液分别在5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55"C保温30min，加入酶液后反应2min，记录不同温度下OD265值，以温度与酶的相对活性作图，最大酶活性所对应的温度即为最适温度。2．2．18．4最适pH的测定将上述DHAR活性测定反应体系中的缓冲液换成：柠檬酸盐缓冲液(50ram，pH4．0．5．O)、或磷酸盐缓冲液(50mM，pH6．0-7．0)、或Tris-HCl缓冲液(50raM，pH8．0—9．O)，其他溶液不变，加入酶液后反应2min，25"C下测定不同pH时的0D265值，以pH与酶的相对活性作图，最大酶活性所对应的pH即为最适pH。2．2．19AccGST02突变体荧光发射光谱的测定荧光光谱的测定使用F．4500(Hitachi)荧光光度计，酶液浓度为3．61．tM，内源荧光发射光谱的激发波长为280nm，记录300．400rim的荧光发射光谱。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析25。C下，加入ANS使其终浓度10倍于酶液浓度(3．69M)，置于暗处30min，pA380nm为激发波长，记录样品在400．600nm的外源荧光光谱。2．2．20抗氧化功能分析2．2．20．1DNA保护功能的测定259L反应液包括：100mMHEPES缓冲液，3mMFeCl3，10mMDTT以及10．15099／mL的纯化重组蛋白。将上述反应液置于37"C保温30min后，]H,入300ngpUCl9超螺旋DNA，混匀后再置于37"C温育2．5h，最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的剪切程度。2．2．20．2氧化应激下的纸盘扩散分析此分析采用Burmeister等的方法(Burmeistereta1．，2008)略作改动。将诱导培养的阳性菌液和空载体对照菌液，按5×108个细胞／板涂布到含卡那霉素抗性的固体LB琼脂板上，37"C倒置培养1h后，将浸有159L不同浓度氧化剂的滤纸片(直径6ram)小心放置于琼脂表面，37"C倒置培养24h后，测量每个纸盘的抑菌圈大小。2．2．21AccsHSP22．6的耐温性分析和体外分子伴侣活性测定2．2．21．1耐温性分析此分析采用Crack等(Cracketa1．，2002)的方法略有改动。将0．2mMIPTG诱导的pET一30a(+)-AccsHsp22。值液置于30"C温育8h后，立即置于4"C分别温育0、12、24、36、48h、或者置于50"C分别温育0、15、30、45、60min，然后分别将菌液稀释至5×106个细胞／mL，取509L菌液均匀涂布到含卡那霉素抗性的固体LB琼脂板上，37"C倒置培养过夜，计算细胞生存率(处理样品与未处理样品每板活细胞数目之比)。新出房蜜蜂注射dsAccsHsp22．6一天后，分别置于4"C或50℃、相对湿度75％的培养箱中饲养1．5h，每小时记录一次生存率。2．2．21．2体外分子伴侣活性测定此分析采用P6rez．Morales等(P6rez．Moraleseta1．，2009)的方法。通过检测AccsHSP22．6重组蛋白对猪心苹果酸脱氢酶(mitochondrialmalatedehydrogenase，MDH)(EC1．1．1．37；Amresco)热聚集的抑制能力，分析其体外分子伴侣活性。含69MMDH的样品置于45℃孵育(A组为MDH：B组为MDH+AccsHsp22．6；C组为MDH+BSA：D 山东农业大学博士学位论文组为MDH+AccGST02)，牛血清白蛋白(BSA，bovineserumalbumin)用来消除非特异蛋白分子伴侣活性的影响，AccGST02作为非Hsp重组蛋白对照。每隔10n曲测量光密度OD360值，连续钡tJ60min。2．2．22生物信息学分析工具本研究所用生物信息学分析数据库和软件如下：(1)保守区域检测工具：NCBI；美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)；网址：http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／；(2)三级结构预测工具：SWISS-MODEL网址：http：／／swissmodelexpasy．org／I-TASSER网址：http：／／zhanglab．comb．reed．umich．edu／I-TASSER(3)等电点及分子量预测工具：网址：http：／／us．expasy．org／tools／peptidemass．html；(4)启动子元件预测工具：TFSEARCH数据库网址：http：llwww．cbrc．jp／resear龇／TFSE_6戚H．htmlMatlnspeetor数据库网址：http：／／www．genomatix．de／matinspector．html(5)蛋白质功能位点预测工具：PROSITE数据库网址：http：／／cn．expasy．org／prosite(6)DNAman5．5．2软件：用于氨基酸或者核苷酸的多序列比对；(7)MEGA5．2软件：用于系统进化树构建及分析；(8)Photoshop10软件：用于图像处理；(9)Swiss．PdbViewer4．1．0软件：用于Pdb文件编辑。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析3结果与分析3．1中华蜜蜂AccGST02基因的分子特性和在氧化应激中的保护效应3．1．1中华蜜蜂AccGST02基因eDNA全长的获得及序列分析根据GenBank上已公布的不同昆虫物种GST02基因的核苷酸序列，设计同源性引物GOF／GOR(表2．1)，以反转录产物为模板，进行RT-PCR扩增AccGST02中间片段；再根据中间片段设计特异引物5PO／5PI和3PO／3PI，分别与5"RACE公共引物AAP／AUAP和YRACE公共引物B26／B25组合，以反转录产物为模板进行RACE．PCR；最后根据已获得的三段序列拼接得到AccGST02的eDNA全长序列，再设计全长特异引物QPF和QPR，验证所得的eDNA全长序列是否正确。序列分析表明：AccGST02基因(GenBank注册号：JX434029)eDNA全长1365bp，包括一个321bp的5’非编码区、324bp的3lj}编码区及720bp的开放阅读框。开放阅读框编码了一个由239个氨基酸残基组成的多肽，其预测分子量约为27．785kDa，等电点约为6．21(图3-1)。 山东农业大学博士学位论文ACCTA骶AATTTCTTTGAAAA21AGAAATACATTAGAAAGAAACTAToCGTCTATGAAATTGTTATTGGTACCATAATATCATTATGGCTTATTTTTG96AAAATGTGAAAATTGAGAAATTOCTTCTATTAATTTTTTAGAATTTCAATCACGCATCATTTACAAAAACATTlUk171重ATATA蟹ATATATATATACATACATAA2ACGTTACAAATAATCATTGAZATTTtATTAATTAATTAAA矗尘ACAAT2柏ATCATTTCAAACATTTCGAAATATATTGTTTA!TTTTCTTGT髓蟾ACACA舀GTCT_ACTAAAGAAATACTAACtATT驼1矗j呤AGTAACTTACATCTTGG跹CTGATTCTCA矗矗矗ACCACCAGAAGTAAAAGGACAAGTTCGTTTA2ATGGTATG396MSNLHLGPDSQKPEVKGQVRLYGM25AAATATTGTCCTTTTACACATCGAATTCGATTAATACTTTCTTATAAAAAAATTCCTC舀罡GA翟AATGTTAATATT471KYCPFTERIRL工LSYK工PHDNVN工卯AATAjKAAAAACAAACCAA量A2∞TATTTAGAAATTCATCCAGAGGI：理AAAl5；TACCAGCACTTGTTGATG譬TAAT548N工KNKPKWYLE工HPEGKVPALVDVN75GGTA强GT怂TTGTTGATTCAGTAGTAATAGCAAATTATTTAGATGAAAAATATGGTGAGCCTTCTTTATATCAT621GKV工VDSV工ANYLDEKYGEPSLYHf∞A般GAAACAAAAGTTcGTGATA卫AGAACTTTTAGATCATTATTCCAAGCTT_ATtAa明蛆噔TTTTCAAACTGTATT6∞NETKVRDIELDHYSKL工S工FSNC工f25CATGGTAATGATAGTAGACCAA∞CAATGAAATTATTGCTGAAATTTCATCTCTATTAGtAGAATTTGAGGAAGAA771EGNDSRP工NE工AE工SLVEFEf5DTTAAAAACTCGTGG酗K强GTT咖TTTGGAGG酿CACAACCT∞TATGTTAGmTATTGATGTGGCCATGGGTT8柏LKTRGTVYFGTQPGMLD工LMWPWVf75GAACGACGGAAATCTTTATCTTTAATT重ATGAAGAACCCACTCATTTTAATGATGGAAⅪTTTTCTCATTTAATG921ERKSLSz_工YEPTEFNDGNFS珏LM2∞AAATGGATGCAAGAAA_TGAAAACACAACCATTTAT烈CAAGAA瑚GA晶．TGTTCAC甬TG囊a商AGTTTGCTCAaTTA9∞KWMQEMKTQPF工QENEcSHEKFAQL225GTCAAAGATTTGAA矗ACAGGAAATGTTGATTTTGATAAACTTTAAATTTTTCATTATATGTACTTATGTGCATAT1071VKDLKTGNVDFDKL★239GTTGATATATAATAATTTAAGTCTCGAATATAATTACAAGTTTAGAGTATTAGAATAATCATTGATAATAA萏TGA1146AATT咖TATGAT嗽TCTTAAAA髓U臻．TCTGATG副玎埋雹U坦lTTG．撄选ATA锚AA骶GT瞰CTA嬲惦ATAATC1恐1GTAAAACTTTGAGCTTTATAACTCATGcCTTCTGTTATGACAATATACATTAATAAGTCTGTTTAAAATATTATT1296图3．1AccGST02基因的全长cDNA亭列及蛋白质序列氨基酸残基以单个字母表示，起始密码子ATG和终止密码子TAA用下划线标出，星号(·)指示讹～，多聚腺苷酸化信号序列以方框内标出。Fig．3-lThefull-lengtheDNAandproteinsequencesofAccGST02geneTheaminoacidresiduesareindicatedbyasinglelettercode．Apotentialtranslationstartcodon(ATG)andastopcodon(T从)areshaded．Thestopcodon吖溘wasdenotedbyasterisk．TheputativepolyadenylationsignalsiteWasboxed．3．1．2中华蜜蜂AccGST02蛋白一级结构分析利用DNAman软件比对了来自不同昆虫的GSTO蛋白的一级结构，结果发现AccGST02与已知小蜜蜂GST01(Apisflorae，AfGST01)、大黄蜂GST01(Bombusimpatiens，BiGST01)、欧洲熊蜂GST01(Bombusterrestris，BtGST01)、意大利蜜蜂GST02(彳．mellifera，AmGST02)、丽蝇蛹集金小蜂GST02(Nasoniavitripennis，NvGST02)、印度跳蚁GST01(Harpegnathossaltator，HsGST01)、顶端切叶蚁GST01(Acromyrmexechinatior，AeGST01)及佛罗里达弓背蚁GST01(Camponotusfloridanus，CfGST01)具有99．16．46．67％的序列同源性。此外，AccGST02具有细胞质GST超家族的保守特征：一个N-末端硫氧化蛋白样结构域(H5．D90，p0【pappa拓扑结构)和一个C．末端a．螺旋结构域(E10：^225)；利用NCBI服务器的生物信息学工具还预测了GSH．49 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析结合位点(G．位点)和疏水性底物结合位点(H．位点)(图3-2A)。这些分析表明AccGST02属于典型的GSTO家族(Boardeta1．，2000)。为进一步研究AccGST02与其他昆虫GST间的亲缘进化关系，本研究利用来自不同昆虫的40种GST构建了同源进化树。如图3．2B所示，进化树分成六个分支，分别为Omega、Zeta、Epsilon、Delta、Theta和Sigma家族。AccGST02属于Omega家族分支，紧邻意大利蜜蜂AmGST02，因此被命名为AccGST02。本研究利用SWISS．MODEL还预测了AccGST02的三维结构。所用模板是人GST02-2(PDB3qagA)，它是目前第二个被鉴定结构的Omega族GST。这两个蛋白之间拥有30．67％序列同源性。如图3-2C所示，AccGST02蛋白的N．末端和C．末端均位于三级结构的表面，因此，位于两端的部分pET-30a(+)载体序列并未影响到AccGST02蛋白的折叠。 山东农业大学博士学位论文A卫——生一旦—-卫㈣黢蓊HvGsT02“rl鼽S×^甜lD7斡鼬甜gT6t¨LvxDLKTGmF抓^“t0"^Ⅺ-M1、m茧sⅦm^fB耵01t。LvKⅡLK％NvDF徘^nGST01B6耵01螽。1w～nI哪m糟KBt8ST01¨vKnLm"nMKc蛤sT01HmS"r01瓤Ⅳ艘w嘴K雕懈?CBEp“on图3．2AccGST02的分子特性(A)AccGST02与其他昆虫GSTOs的氨基酸序列比对。预测的二级结构已标示。相同的氨基酸序列用黑色表示。保守的功能域用黑框标出，G．位点、H．位点和二聚化位点分别用(．．．)，(V)和(每)标出。(B)不同昆虫物种GSTs的进化关系。六个基本家族已标示，AccGST02用黑框标出。(C)AccGST02的三级结构预测。保守的G．位点残基(Y27、C28、P29和F30)，H．位点残基(S115、1118、S119、P173和E176)，N-末端和C-末端已标示。Fig．3-2MolecularpropertiesofAccGST02(A)TheaminoacidsequencealignmentofAccGST02andotherGSTOs．TheputativesecondarystructureofAccGST02isshown．Identicalaminoacidsareshadedinblack．Theconservedfunctionaldomainsareboxed．TheputativeG-site，H-siteanddimerinterfaceofAccGST02aredenotedby(．．．)，(V)and($)，respectively．(B)Phylogeneticrelationshipsbetweenglutathionetransferases(GSTs)fromdifferentinsectspecies．Thesixprimaryclassesareshown,andAccGST02isboxed．(C)ThetertiarystructureofAccGST02．TheconservedG-siteresidues(Y27，C28，P29，andF30)，H—siteresidues(S115，1118，S119，P173，andE176)，N-terminal，andC-terminalareshown．3．1．3AccGST02基因组结构分析为进一步分析AccGST02基因的特性，通过PCR扩增，得到了AccGST02基因组DNA全长序列。AccGST02基因组(JX456219)全长为2147bp，包括6个外显子和5个内含子，其中内含子富含AT且具有典型的5"-GT剪切供体和AG．37剪切受体位点。在检测的四个组织中(脑、肌肉、中肠和表皮)均未发现AccGST02基因有选择性剪切现象。将AccGST02的基因组与已知基因组序列的小蜜蜂GST01(彳．加rae，AfGST01)、51 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析大黄蜂GST01(丑impatiens，BiGST01)、欧洲熊蜂GST01(丑terrestris，BtGST01)和丽蝇蛹集金小蜂GST02(Ⅳvitripennis，NvGST02)进行比对后发现：AccGST02、AfGST01、BiGST01和BtGST01均包含5个内含子且序列长度非常相似，而NvGST02有6个内含子且第一个内含子位于5’非编码区内，基因组全长也是其中最长的(图3．3)。BtGST01一豢NvGST02压i丽11IntronIV泰BiGS阳f22=2■——●—■=曩—墨=—■曩墨—=，-A，GS了．D，-‘AccGS聊==22，■■●—巴=■巴Z■●：，C墨●====丫寮0500100015002000250030003500(bp)图3．3Omega族谷胱甘肽转移酶基因的基因组结构中华蜜蜂、小蜜蜂、大黄蜂、欧洲熊蜂和丽蝇蛹集金小蜂基因组DNA中外显子和内含子长度根据下面比例尺确定。外显子和内含子分别用浅灰色和灰色框标出。起始密码子(ATG)和终止密码子(瞄A)分别用(▲)和(木)表示。Fig．3-3GenemicsnlJctureoftheOmega-classglutathionetransferasegenes(GSTOs)ThelengthsofthecxonsandintronsofgenomicDNAfromA．ceranacerana，A．florea，B．impatiens，B．terrestris，andⅣ‘vitripennisarcshownaccordingtothescalebelow．Lightgreyandgreyarcusedtohighlighttheexonsandintronsseparately．Thetranslationalinitiationcodons(ATG)andterminationcodons(TAA)aremarkedby(V)and(宰)，respectively．3．1．4彳cc删2启动子序列的分离及顺式作用元件的预测为进一步明确AccGST02基因调控区域的组成，本研究分离出一段位于转录起始点上游、长度为1591bp的启动子序列(JX456219)。利用TFSEARCH及其数据库，预测到许多顺式作用元件(图3．4)。其中，涉及早期组织生长和发育的元件有细胞因子2．II(CF2．II)、Hb、Dfd、NIT2、BR．C、Pbxl及CdxA(Ericssoneta1．，2006；Rorth，1994；Stanojevi6eta1．，1989；Yueta1．，2011)。此外，几个重要的、与调节不同环境应激有关的转录因子结合位点也被发现(Dingeta1．，2005)。例如，热激因子(HSF)和激活蛋白．1(AP．1)。在细胞分化、增殖和凋亡过程中起作用的cAMP．响应元件结合蛋白(CI冱B)和CCAAT／增强子结合蛋白(C／EBP)也被预测(Ishidaeta1．，2007；Carlezoneta1．，2005)。据此我们推测AccGST02基因可能涉及组织发育和环境应激响应。52 山东农业大学博士学位论文GTAG^TTAGCAGTrrrrCTCGTAGGA从TAAGGCA^^GTTGCTGTCAAAATAATGGCA(_rGCCACCrrGTAA^GCGTGGT从TGT从一1505CREBTAGGTTI"TCGAGTAATl"TTACCATGTAACTGTCATAAGCATGAACTTCGTCTAATATCAGTAATTTA匡巫亟巫蛋CCTAATAAACGT-1417AACGATTGATGT丌GAAAGGCATAATI"GCCATTAACGCTTGATCTAATGTGCCAACTCCTACTTCAGCTAATAACGATrrrrrrCGAG-1329NIT2}rATCA^JcAAAccATTcATTACGTTcTccACTCACTGATTGTTCAcT(jITCGGGTAr¨H-rGCTGGCTAAlTTCATcGTGATlTAAAAT·1241AP．1NIT2CREBTG咂亘巫垂囵cTGCGATGTACATAAATAGTTAATAAGT^匦重巫|丌^CATG叵亟遁巫永1rrAT丌AAGTGTACAAATACATAT。1154CdxACF2．IJHSFATAGAcA从A订cTATGTGTAGTAAT从1-丌盯rr吼耍圃A1’rrcGAA从cT从AcTGAGc从T从T匡亘亘巫矿呕亟囵^-1066CdxAAGTrA"I’rCAAAATATTGlAl’I．rATAjTACAAT"ITAAAATCTATTCAAAAATAATCAAAATTAGTAAACGAAATrTTTrTTAGATATTAAAA-9丌HSFAAAAATAT"FrTCATTrCA"I"FATATAA_AGAAA|GCAAAAGATTAGCAAATFACAAATAATGTATAAAATAATAATATTTAGGAT"[T丌AG一889BR-CATa^^^^TAAAT^A^A|GTTAGTATA丸uATGTCAGTrAAAGCACGATAcAcATGAGCGAr兀T11rATl℃CGCAATATCACrATATATT-801r兀T几厂rGT兀TrCTCAATTAAAAAAACGAAAACAGATATAmTCATAGTGATATCGTAAGGAAA从TGTTGlTCATGAGCATAAAGC一713HbDfdTAAAAGCAT^AA骥匦翳溪霹亟亟亟盈}兀ATA从TAATTGAAGT]"TGTGTrAGATAAAGTAAAAAAAAGTTATTTTACCTAAATT-625TA从TAATn"G1’ITACCGATAAl-I-rAATATTGTCACTGATAATACTGATAA"ITGAl-丌TrATATAl丌AArI’rTAGTATn’GAr兀℃从G-536HSFCdxAAT"11GATA|AG^L“扭cAAATcAcTAAAl．AcAlATATTAATATccTGTAl恤TTTATAhTA从1TrGAl’兀lcATAATATAA从ATATTATT一4柏NIT2GTATTC爿TATCAA|ATGAGT从从TGA^T从AATATTATrrGTATTGATArrrAAT_rrrrGl．rrcTAT丌cATTGATTATATAl"rrcTcTG·359CdxANIT2cGcAGATTcTATTcGATTTcTAcc几TrAAr兀"Gc从TT埏1TTAT封rGAATAAAAlTTGGTATAl-r丌-rGl恒ATc^AmcrATTAcTA从T·270C，EBPATAATAGAATATAAcAGATcrrArrrcAAArrrAATcr九TrGATGATAAATAr兀℃cAAcAIAAArrITGA^^^AAl时ATrI’rc从GT-182TATAboxTTGACTAAGA汪AT^^^I^TAl-兀TrAAAAcAATAlT几ATTGAAcGAmArrA田c1T从TrATAcATArnT丌_rrATAAr丌c兀TrAT一92PbxlTATTTAAAAAAATAAAATATTTAAATATCATAAAATAACGCTATTTCTAAGTTCAACTC㈣A"VrTGATCATGCGCAGAT-4二‘transcriptionstartsiteTTGACCTATrAATI，rCTTTGA^AAAGAAATACATTAGA从GAAACTATCCGTCTATGAAATTGTTATTGGTACCATAATATCATTATG+85GCrrAGrmGAAAATGTGAAAATTGAGAAArrGCltrCTArrAAT兀TrrAGAAlTrCAATCACGCATCAmACA虬UACATTAATA+173TATATAT^MTATATACATACATAATACGl瓢CA从T从TCATTGATAT丌TArr从TT从TTAAAATACAATATCATITCAAACATTr+262CGAAATATATTGTTTATITTCTTG"]"TAGACACAAGTCTACTAAAGAAATACTAACTATTi露鬟^GT从cTTAcATcTTGGAcc’I’GG+547L——·translationstartsite图3-4AccGST02调控区域的核苷酸序列及预测的顺式作用元件翻译起始位点和转录起始位点用箭头标记。除Hb用黑色阴影标示外，其余顺式作用元件均用黑框标出。Fig．3-4Thenucleotidesequenceandputativec妇-actingelementsoftheAccGST02regulatoryregionThetranslationandtranscriptionstartsitesaremarkedwitharrows．Thecis·actingelementsarcboxed,withtheexceptionofHb，whichisshadedinblack．3．1．5AccGST02的表达特性分析3．1．5．1AccGST02基因表达的时间和空间特异性本研究利用qRT-PCR检测了AccGST02基因在中华蜜蜂不同发育时期的表达特性。如图3-5A所示，在检测的3日龄幼虫一直到1日龄成虫阶段，AccGST02基因的表达水平逐步降低；在10日龄成虫中基因表达的水平又快速上升，AccGST02基因的最高表达水平出现在3日龄幼虫期，而整个蛹期AccGST02基因的表达水平都没有显著差异。在检测的成虫组织中，AccGST02基因在脑中的表达量最高，而在表皮、肌肉和中肠组织中的表达量是逐步减少的(图3-5B)。脑组织是一个对外源性毒物和过氧化损伤高度敏感的组织，AccGST02基因的高水平表达暗示着其可能对脑组织具有保护作用。53 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析A型墅型趔型!d111掣LarvaePupaeAdultsDevelopmentalstagesBEpidermisMuscleBrainMidgutTissuesdistribution图3．5爿cc∞兀)2在不同发育时期及组织中的表达特性Fig．3-5ExpressionprofileofAccGST02atdifferentdevelopmentalstages(A)andindifferenttissues(B)为进一步检测AccGST02基因在翻译水平上的时间和空间表达特异性，本研究提取了四种组织(表皮、肌肉、脑和中肠)和三个发育时期(3日龄幼虫、6日龄蛹和10日龄成虫)蜜蜂的总蛋白，用抗AccGST02血清作为探针进行Westernblot(图3．6)。结果显示AccGST02在蛋白水平上的表达特异性与其转录水平上的基本一致。AB12341，3——黟嘲黔、嘲黛Developmentalstages图3-6AccGST02在不同发育时期及组织中的Westernblot分析(A)泳道1．4用等量的的蛋白上样：泳道1为表皮，泳道为肌肉，泳道3为脑，泳道4为中肠。(B)泳道1．3用等量的蛋白上样：泳道1是3日龄幼虫，泳道2是6日龄蛹，泳道3是10日龄成虫。Fig．3-6WesternblotanalysisofAccGST02indifferenttissuesanddevelopmentalstages(A)Lanes1-4wereloadedwithanequivalentamountofprotein：Lane1：epidermis，Lane2：muscle，Lane3：brain，Lane4：rnidgut．(B)Lanes1-3wereloadedwithanequivalentamountofprotein：Lane1：day-3larvae，Lane2：day-6pupae，andLane3：day-lOadults．3．1．5．2AccGST02在不同非生物应激中的表达特性研究环境应激下AccGST02的表达特性有助于更好地理解它的生物学功能。前人的研究表明，GSTO的表达能够被某些非生物应激诱导。例如热、重金属和引起内分泌紊乱的化学物质可诱导鲍鱼GSTO的表达(WnPra1．，2009)；农药和紫外线可诱导家蚕GSTO的表达(Yamamotoeta1．，2011)。为了确定AccGST02是否涉及不同的非生物应激响应，本研究利用qRT-PCR检测了AccGST02在不同温度(4℃、16℃、25℃和42℃)、紫外线、H202、农药(三氟氯氰菊酯、辛硫磷、哒螨灵和百草枯)和重金属(CdCl2和∞筋加仔∞5oco一价∞—∞‘△×o∞>嚣∞一m芷 山东农业大学博士学位论文HgCl2)影响下的表达特性。如图3-7所示，除了HgCl2处理抑制了AccGST02的表达外，温度、紫外线、H202、农药和CdCl2处理均能诱导AccGST02的表达，尽管它们的表达模式和诱导程度不尽相同。以上结果表明，AccGST02能够响应多种非生物不利因素的应激，这对于蜜蜂的生存可能十分重要。D3c2．5旦誉2&：1．5∞2羔1《0．50～f。～1dⅫ3d“W“∞3h∞M1n24hCdCl2HgCIz图3．7AccGST02在不同非生物应激条件下的表达特性这些条件包括：4"C(A)、16"C(B)、25"C(C)、42"(2(D)、紫外线(30mj／cm2)(E)、H202(2raM)(F)、三氟氯氰菊酯(20“g／L)(G)、辛硫磷(1p咖L))(H)、哒螨灵(109M)(I)、百草枯(10laM))(J)、CdCl2(0．5、5、IOI．tg／mL)(K)和HgCl2(3mg／mL)(L)。未处理的成年工蜂(泳道O)作为对照，注射PBS后5h的成年工蜂为注射处理的对照。Fig．3-7ExpressionprofileofAccGST02underdifferentabioticstressconditionsTheseconditionsincluded4℃㈥，16"C(B)，25"(2(C)，42"12(D)，UV(30mj／cm2)(E)，H202(2mM)(F)，Cyhalothrin(20pg／L)(G)’Phoxim(1I．tg／mL)(H)，P蜘daben(10帅(I)，Paraquat(IOuM)(J)，CdCl2(O．5，5，10vg／mL)岱)andHgCl2(3mg／mL)(L)．Untreatedadultworkerbees(Lane0)wgreusedaScontrols，andadultworkerbees蝎ectedwithPBSfor5hwereusedaSinjectioncontrols．55。■J。一崔直。。由目且。毒磊竺。盥。直。。且．。内__。。m。^嘴N量。㈣；料丝。"；曲l¨州。ku。h揣蛘⋯Ⅱ赫幽#粤。乱盟直。÷也盟。；●眺H≈叫H斟吖孔1叫叫——l1Y⋯¨㈡_．¨¨IH“l¨址点0睾；；趸。亘；蚤；焉夏。；。；暑呈亘；。：扣F菩暑。。拍．¨，拍：仙，¨。¨惶∞。：。¨¨他，¨：宝¨舱。coi∞∞Jd×oD^!苗le芷；co葫∞e△誉∞兰苗i芷col口∞罢dx∞o>雷Ie伫 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析3．1．5．3彳cca，孔)2在不同生物应激中的表达特性不同生物因素(如激素和病原微生物)应激也能改变相关基因的表达水平。为了了解AccGST02的表达是否也受到不同生物因素应激的调节，本研究检测了AccGST02在20E和病原微生物(黄曲霉菌(Afla’"uS)，苏云金芽孢杆菌(B．thuringiensis)，白僵菌(丑bassiana)，黑胸败血菌(丑bombysepticus)和蜂球囊菌(彳．apis))处理条件下的表达特性。结果表明，AccGST02的表达能够被20E诱导，处理浓度为0．1肛g／mL时表达量最高，这表明其可能与蜜蜂的发育有关(图3-8A)。黄曲霉菌、苏云金芽孢杆菌、白僵菌和黑胸败血菌的侵染也诱导了AccGST02的表达，其中以黑胸败血菌的诱导作用最强(图3-8B)。蜂球囊菌是一种广泛存在的真菌病原体，可以引发蜜蜂白垩病，严重影响了蜜蜂幼虫乃至整个蜂群的健康。对中华蜜蜂和意大利蜜蜂幼虫感染蜂球囊菌后GST02表达的检测表明，意大利蜜蜂AmGST02的表达被上调，而中华蜜蜂AccGST02的表达却被抑制，并且感染时间越长抑制越显著。此外还发现中华蜜蜂和意大利蜜蜂GST02的表达水平存在差异，AccGST02的相对表达量明显高于AmGST02的表达量(图3-8C)。病原体侵染的实验表明AccGST02参与多种病原体侵染的应激响应。 山东农业大学博士学位论文}·豳一_一。』5一g6『。一詈}_‘_是z}__囊：[豳曹一一一．00．∞10．010．t1CKAfBtBbaBbo20E(pg／m1)MicrobialinfectionC柚35Ci30&2s宝∞i15比105OApestnlglitl蚰apes0冒a∞ce忸舱Ascosphaeraap虑infection图3．8AccGST02在不同生物应激条件下的表达特性这些条件包括：(A)20E(20羟基蜕皮激素)，(B)病原微生物侵染，A工表示黄曲霉菌、Bt表示苏云金芽孢杆菌、Bba表示白僵菌、Bbo表示黑胸败血菌，(C)蜂球囊菌侵染。未处理蜜蜂幼虫作为对照(CK)。Fig．3-8ExpressionprofileofAccGST02underdifferentbioticstressconditionsTheseconditionsincluded：(A)20E，①)Microbialinfection．A￡A．flavus；Bt,B．thuringiensis；Bba,丑bassiana；Bbo，且bombysepticus，(C)A．口p担infection．Untreatedlarvaewereusedascontrol(CK)．3．1．5．4中华蜜蜂在CdCl2和病原微生物应激中体内的氧化状态为了确定CdCl2和病原微生物对中华蜜蜂体内氧化状态的影响，本研究测定上述应激过程中蜜蜂体内过氧化氢酶(CAT)活性及H202和丙二醛(MDA)的水平。结果显示：与对照组相比，CdCl2及病原微生物处理后蜜蜂的CAT活性降低，而H202和MDA含量增加(图3．9)，且CAT活性与H202和MDA含量呈现负相关关系。根据前述H202可以诱导AccGST02转录，因此我们推测，CdCl2和病原微生物对AccGST02表达的诱导作用可能直接与H202和MDA的积累相关。2O8642OA八uoI窖§dxmm^n罢芷 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析ABCa；圈jj心豳圈自0rag&0．5mg&5mg『L10mg／LCdCktreabnent0mon-0．5mgn．5m9，L10mg／LcdCktreatment0mg／L0．5mglL5mg／L10mg／LcdcbtreatmentDEFo2AE专E三言董芒S舌U《o=CKAf融曲II曲oMIcrobiaIInfectlonCKAfBtBbaBboMIcrobkIInfectionCKAfBtBbaEboMicroblaI|nfection图3-9CdCl2与病原微生物应激下中华蜜蜂体内氧化状态的测定(A、B、C)分别为不同浓度CdCl2饲喂1日后，成虫体内CAT活性、H202浓度、丙二醛(MDA)浓度的测定；(D、E、F)分别为不同病原微生物侵染后，蜜蜂幼虫体内CAT活性、H202浓度、MDA浓度的测定。CK表示未侵染、A_f表示黄曲霉菌、Bt表示苏云金芽孢杆菌、Bba表示白僵菌、Bbo表示黑胸败血茵侵染。Fig．3-9ThedetectionofoxidantstatusinvivounderCdCl2andmicrobestressors∽B，C)TheeffectofCdCl2stressonCATactivity,H202concentration，andMDAconcentrationintheadults。respectively．TheCdCl2treatmentWaSindifferentconcentrationafter1day．(D，E，F)TheeffectofmicrobestressonCATactivity,H202concentration，andMDAconcentrationinthelarvae，respectively．CKnoinfection；At；A．flavus；Bt,丑thuringiensis；Bba,B．bassiana；andBbo．B．bombysepticusinfection。58¨住伸8642O一_2t口E，n一蚤兰芍日J．《u柏”仆¨住"86●2O一董I口EJn一誊^I召-卜v。∞∞柚∞∞∞∞∞∞O一_2A6，IoEE—co；e芒。ucouFf∞∞∞柏∞∞∞撕幻伸0∞∞∞"∞∞∞∞∞"O口eI口c圭oE5co；e芒8c8l 山东农业大学博士学位论文3．1．6AccGST02重组蛋白的原核表达及酶学特征3．1．6．1AccGST02重组蛋白诱导表达条件的优化为进一步探究AccGST02的酶学特性，本研究构建了原核表达载体pET．30a(+)“ccGST02并成功诱导表达出His．融合蛋白。为了得到更多可溶性蛋白，又进行了不同时间、IPTG浓度和温度条件的诱导表达(图3．10A，B和C)，最后确定AccGST02最佳诱导条件是：8h，0．2raMIPTG和30℃。SDS．PAGE结果显示，此重组蛋白是可溶的且分子量约为34kDa，这与预测分子量34。804kDa基本一致。可溶的重组蛋白利用HisTrapTMFF柱进一步纯化，最后得到浓度为1．89mg／mL的AccGST02蛋白(图3．10D)。纯化蛋白经佐剂处理后免疫小白鼠，制取了AccGST02的多克隆抗体。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析(kDa)116．066．245．035．025．0(kDa)‘116．0蛳66．2’簟辨45．035．025．0馘糍赫AC霉笺辫?二。二旺≤678(kDa)116．066．245．035．025．0瓣籀麓蘩鬟，辫鉴攀鬻D一0’黼嘲_雌辅馘图3．10AccGST02的表达和纯化这些SDS·PAGE分析是用来分离在大肠杆菌BL21细胞中表达的重组蛋白AccGST02。(A)不同诱导时间。泳道l是低分子量蛋白标志物；泳道2为未诱导的过表达重组蛋白；泳道3．8分别为诱导2、4、6、8、10、12h的重组蛋白。(B)不同IPTG浓度。泳道5是低分子量蛋白标志物；泳道4为未诱导的过表达重组蛋白；泳道1．3，6．8分别用O．2、O．4、0．6、0．8、1．0、1．2raMIPTG诱导的过表达重组蛋白。(c)不同诱导温度。泳道6是低分子量蛋白标志物；泳道5和7为过表达的空载体对照：泳道l和ll为未诱导的过表达重组蛋白；泳道4和8、3和9、2和10分别是诱导的过表达重组蛋白超声破碎后的全液、上清和沉淀；泳道1．5是30。C下诱导，7．11为37。C下诱导。(D)AccGST02的纯化。泳道1是低分子量蛋白标志物；泳道2为过表达的空载体对照；泳道3和4分别是未诱导和诱导的过表达重组蛋白；泳道5和6分别是超声破碎后的上清和沉淀；泳道7是纯化的重组蛋白。重组蛋白的位置用箭头标示。Fig．3-10ExpressionandpurificationofAccGST02TheseSDS·PAGEanalyseswereusedtoseparaterecombinantAccGST02expressedinEcoliBL21cells．CA)Differentinductivetimes．Lane1，low-molecule-weightproteinmarker；Lane2，non-inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccGST02inBL21；Lanes3-8，inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccGST02inBL21for2，4，6，8，10，and12h,respectively．(B)DifferentIPTGconcentrations．Lane5，low·molecule—weightproteinmarker；Lane4，non—inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccGST02inBL21；Lanes1-3and6-8，inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccGST02inBL21by0．2，0．4，0．6，O．8，1．0，and1．2mMIPTGrespectively．(C)Differentinductivetemperatures．Lane6，low-molecule-weightproteinmarker；Lane5and7，inducedoverexpressionofpET-30a(+)inBL21；Lane1and11，non·inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccGST02inBL21；Lanes4and8，3and9，2and10，inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccGST02inBL21，suspensionandpelletofsonicatedrecombinantAccGST02，respectively；Lanes1-5and7-11，overexpressionat30"12and37"C，respectively．(D)PurificationofAccGST02．Lanel，low-molecule-weightproteinmarker；Lane2，inducedoverexpressionofpET-30a(+)inBL21．Lanes3and4，non·inducedandinducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccGST02inBL21，respectively；Lanes5and6，suspensionandpelletofsonicatedrecombinantAccGS，ID2，respectively；Lane7，purifiedrecombinantAccGST02．TherecombinantAccGST02ismarked谢廿1arrow．60蠹一一，．黪攀。紫攀．||警．；磐勉|!i|三叫锄旺锄如¨¨“㈣m{昌牾∞筋伯¨、L 山东农业大学博士学位论文3．1．6．2AceGST02重组蛋白的酶学特征通过检测重组AccGST02蛋白对几种典型GST底物的特异性，进一步研究了它的催化特性及其生物学功能。纯化的AecGST02具有依赖CDNB的GSH．结合活性(其‰cDNB和‰分别是2．32士0．25mM和8．21-4-1．67p,moVminpermgprotein，‰G8H和％默分别是1．14+0．16raM和9．77+0．11lmaol／minpermgprotein)及依赖异丙苯．过氧化氢(‰舣=3．24士0．231maol／minpermgprotein)和叔丁基过氧化氢(‰a】【=1．17士0．281maol／minpermgprotein)的GSH过氧化物酶活性。AccGST02还能以GSH作为电子供体还原脱氢抗坏血酸(DHA)(其时HA和％觚分别是0．46+0．09mM和8．11士1．561amoVminpermgprotein，‰GsH和％驭分别是3．55+0．73mM和6．35士1．371maol／minpermgprotein)，对DHA有高度的亲和力和特异性。此外，重组AccGST02蛋白具有的DHAR活性，其最适pH为7．0，最适温度为25℃(图3．11)。AR图3-11温度(A)和pH(B)对AccGST02催化活性的影响在不同温度(5-55"C)和pH(4．0—9．0)条件下，重组AccGST02蛋白DHAR活性的测定。Fig．3-11Temperature(舢andpH(B)e疵ctSonthecatalyticactivityofAccGST02TheDHARactivitiesofrecombinantAccGST02weretestedatdifferenttemperatures(5-55"(2)andpHvalues(4．0·9．0)．3．1．6．3重组AccGST02蛋白在氧化应激中的保护效应为了提供AccGST02具有抗氧化功能的直接证据，本研究利用可产生羟自由基的混合功能氧化(MFO)系统来检验AccGST02是否能保护DNA免遭活性氧族(ROS)的损伤(Yu甜a1．，2011)。如图3．12所示，随着重组AccGST02浓度的增加，带切口的质粒数量逐步减少。当AceGST02浓度达到150p,g／mL时，切口形式的质粒几乎完全消失。N．乙基马来酰亚胺(NEM)具有还原性双键能够修饰半胱氨酸(Cys)残基，当其加入MFO系统后，能够抑制AccGST02对DNA的保护作用。因此，我们推断AccGST02分子中的Cys巯基(-SH)在DNA保护方面具有重要作用。61 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析NF———}SF叶23456789图3．12在混合功能氧化系统中AccGST02保护DNA免受氧化损伤泳道1．4：pUCl9质粒DNA+FeCl3+D盯卜纯化AccGST02(分别为150、100、50和lOpg／mL)；泳道5：pUCl9质粒DN√懈eCl3+DTr：泳道6：pUCl9质粒DNA+FeCl3+Drr+纯化AccGST02(50}IUmL)+NEM(5raM)；泳道7：pUCl9质粒DNA+FeCl3+DTT+BSA(1501ag／mL)；泳道8：pUCl9质粒DNA+FeCl3；泳道9：pUCl9质粒DNA。SF表示超螺旋形式；NF表示带切口形式。Fig．3-12AccGST02protectedDNAfromoxidativedamageinthemixed·functionoxidationsystemLanes1-4，pUCl9plasmidDNA+FeCl3+DTT+purifiedAccGST02(150，100，50andlOgg／mL，respectively)；Lane5，pUCl9plasmidDNA+FeCl3+DTr；Lane6，pUCl9plasmidDNA+FeCl3+DTT+purifiedAccGST02(5099／mL)+NEM(SmM)；Lane7，pUCl9plasmidDNA+FeCl3+DTT+BSA(15099／mL)；Lane8，pUCl9plasmidDNA+FeCl3；Lane9，pUCl9plasmidDNAonly．SF,supereoiledform；NF,nickedform．纸盘扩散分析实验也为AccGST02在氧化应激中的保护效应提供了直接证据。当过表达AccGST02的大肠杆菌在不同应激源中过夜处理后，在浸有药物的滤纸片周围其抑菌圈明显小于对照菌板(过表达空载体的大肠杆菌)中的抑菌圈。异丙苯．过氧化氢处理的减少了21％，叔丁基过氧化氢处理的减少了31％，百草枯处理的减少了31％(图3．13)。异丙苯．过氧化氢和叔丁基过氧化氢是外源性的模式促氧化剂，在本实验条件下较H202更加稳定。百草枯具有氧化还原活性，能穿过细胞膜，作为胞内ROS诱导剂在代谢中诱导产生超氧阴离子(Burmeistereta1．，2008)。62 山东农业大学博士学位论文ADCumenehydroperoxideCumenehydroperoxide雷CcontroIACCGST02f-ButyJhydroperOxideACCGST02EF3舌z．s奄2n)E1．5∞口1o垩0．50255080100Contentration(mM)f-ButyIhydroperOxide25810Contentration(mM)1050100200Contentration(mM)图3．13过表达AccGST02大肠杆菌的纸盘扩散分析LB琼脂板用含5x108个细胞的菌液涂板，AccGST02表示过表达AccGST02的大肠杆菌，阴性对照为只转化pET-30a(+)的大肠杆菌。浸有不同浓度异丙苯．过氧化氢(A，D)、叔丁基过氧化氢(B，E)或百草枯(C，F)的滤纸片放在琼脂板中。过夜处理后，测量滤纸片周围的抑菌圈大小。Fig．3-13DiscdiffusionassaysusingEcolioverexpressingAccGST02LBagarplateswereinoculatedwith5x105cells．AceGST02wasoverexpressedinEcoliandbacteriatransfcctedwithpET-30a(+)wereusedasnegativecontrols．Filterdiscssoakedwithdifferentconcentrationsofcumenehydroperoxide(AD)，t-butylhydroperoxide03，E)orparaquat(C，F)wereplacedontheagarplates．Afterallovernightexposure，thekillingzonesaroundthedrug-soakedfiltersweremeasured．3．1．7RNAi介导的AccGST02基因沉默3．1．7．1AccGST02基因最佳沉默时间的确定由dsRNA介导的基因沉默是研究基因功能的又一策略。为进一步探究AccGST0263一墨●—■誓■噩t垂l鞋垂K|t匿|雕畦譬E|E重E型＆垒‘■曩隧垦tlI_●Itll●_ItEIlI-ttEE量，。汹溷溷溷婆《tIl-gt《#Ktt￡嚣毪羹t至．江狙沮霜一；；』匮!盟，．．．．．．。．．．．．．．，．．．．．．．，．．．．．．．，。．．．．．．L3525150210一Eo—L01aE仍lpoIe工墨●■—■■Lqj—j；gil镧jj一￡Ett蟹《t垂FE_EEt蟹t_《t娶墼工圈圈■■■■圈叠碧鱼汹噩It__●--Il-●-II--_IllI墨，。。袖溷溷潮狙tt垂量l噩ltlIItEEElE呈狃jJrE鼍《釜互一雹l溘 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析基因的功能，本研究在中华蜜蜂体内进行了RNAJ实验。新出房成虫采取注射dsAccGST02处理，而3日龄幼虫进行饲喂dsAccGST02处理，每天记录它们的生存率，并用qRT-PCR检测每天AccGST02基因的转录水平以确定其最佳沉默时间。结果表明：与未注射对照组成虫相比，水和dsGFP注射对照组成虫AccGST02基因转录水平先显著升高(考虑可能与注射损伤有关)，注射后第3天才回归到正常水平；而dsAccGST02注射组成虫AccGST02基因转录水平却被显著抑制，尤其是注射后第1天(图3．14A)。与成虫相似，dsAccGST02饲喂组幼虫AccGST02基因转录水平也被明显抑制(图3．14B)。为了明确AccGST02基因沉默在蛋白水平上的影响，本研究还选择注射后第3天成虫和饲喂后第1天幼虫进行免疫组化分析。如图3．15所示，不论成虫还是幼虫，相比于对照组，dsAccGST02处理组石蜡切片的染色更浅，尤其是蜜蜂的中肠和脂肪体细胞。但是，并未发现组织细胞发生明显的形态改变。以上结果说明由dsAccGST02介导的基因沉默是成功的，最后确定注射后第3天成虫和饲喂后第1天幼虫作进一步研究。41614c12暑墨伯△瑟8o宝6暑芷l2Oab罴f妻古羹々纛旦随傀胤薹攀雾b霪b厂羹三广圄图3．14注射dsRNA成虫(A)和饲喂dsRNA幼虫(B)的AccGST02基因转录分析Fig．3-14TranscriptionanalysesofAccGST02geneindsRNA-injectedadults㈥anddsRNA-fedlarvae(B) 山东农业大学博士学位论文(I)CKdsGFPdsAccGS7．02(II)ControIACCGST02ControIAceGST02ControIAceGST02ControlACCGST02戳一黼勰黧瓣燃鳓黛鳞霞■黼翟湖d@。；；缫i漤鬃_国!爨陵疑馘参键豳麓辫图3-15幼虫(I)和成虫(II)AccGST02基因沉默的免疫组化分析(a-1)分别是CA-L)的阴性对照。图I中(a-e)和(A-C)是中肠组织，(d．f)和(D．F)是马氏管；图Ⅱ中(a-d)和(A-D)是头部，(e-h)和(E-H)是中肠组织。Fig．3-15ImmunohistochemistryanalysesforeffectsofAccGST02silenceinlarvae(I)andadults(II)(a-1)alenegativecontrolsfor(A-L)，respectively．(D(a-C)and(A-C)：midgut；(d-Oand∞-F)：tubamalpighii．(Ⅱ)(a-d)and(A．D)：head；(e-h)and正-I-I)：midgut．65 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析3．1．7．2AccGST02基因沉默对蜜蜂的影响在RNAi实验中，我们发现dsAccGST02处理组成虫和幼虫的每日存活率显著低于相应对照组蜜蜂(图3．16A，B)。为了弄清楚其中原因，我们检测了d鲥cc傩砒处理组成虫和幼虫中五个抗氧化基因的转录水平(图3．17)。与对照组相比，AccGST02基因沉默后，只有AccP450(KC243984)转录水平出现轻微上调，而彳ccG．Sm(JF798572)、Acc珊乃4(JN008721)、AccSOD2(JN637476)和AccCAT(KF765424)的转录水平都是下降的。另外，本研究还测定了蜜蜂体内H202和MDA浓度(图3．16C．F)。相比于对照组，dsAccGST02处理组成虫和幼虫体内都有H202和MDA的积累。这些结果表明，AccGST02基因沉默后蜜蜂的生存率下降可能与体内的氧化损伤有关。ABCE0"2345TIr脯(da捧)】卜～叮l≥尊∑事柏jl_’·’一"2345Tmm{aays}]j卜吣{{，jE丰罩基睾三警一一DF100∞邑●60；：；．乏40曲∞O1"§．--dlCSP2Timefdays}"2345123"Tm)eldaYSlTimefdays)图3．16么ccGI妨p2基因沉默幼虫和成虫的影响注射dsRNA的成虫(A，C，E)和饲喂dsRNA的幼虫(B，D，F)的生存率分析及H202、MI)A浓度的测定。Fig．3-16EffectsofAccGST02silenceinlarvaeandadultsTheanalysesofsurvivalrate，H202andMDAconcentrationsindsRNA-injectedadults(丸C，E)anddsRNA-fcdlarvae(B，D，F)．66∞跚∞蚰∞0一’‘一。等=∞，；与∞O。。。&和1)lI驴乏m氨善f∞帅如柏伯0一_o-厶罐，Io车￡一coo毒-c-ucoudH工j一、一一～一b#一＼≈一＼慧一＼f|咐一＼=，㈣一1．。．．．．，■，，●，，。。。1。。●。●。。1．．．．．．．■。．，。，l∞的柏曲0口2△口#墨oEu)co秀；暮口oouta：∞阳∞Ⅺ：宅伯0#oJdo毫，105ulco口芒芑-ucoo《o苫 山东农业大学博士学位论文A1‘8，．6c1·4告"2器&1蔷耋o·8翌0,6世O4O·20圄AccGSTDAccGST．s,I^ccP稻OAccSODAccCATAccGSTDAccGST．．￡4AccP,f-50AccSODAccCAT图3-17RNAj处理后五个抗氧化基因表达的qRT-PCR分析AccGSTD，AccGSTs4，AccP450，AccSOD及AccCAT基因在dsRNA注射后第3天成虫(A)和dsRNA饲喂1天后幼虫中的表达情况。Fig．3-17qRT-PCRanalysesoftheexpressionoffiveantioxidationgenesinRNAitestsExpressionpatternsofAccGSTD,AccGSTs4，AccP450,AccSOD，andAccCATgenesindsRNA-injected3-dayadults㈧anddsRNA-fedl·daylarvae(B)。3．1．8AccGST02的定点突变3．1．8．1AccGST02突变体的构建、表达纯化及动力学分析Cys分子中的巯基对于维持蛋白质结构与功能的稳定至关重要。AccGST02氨基酸序列中仅包含3个Cys残基(Cys28、Cysl24和Cys217)，且这3个位点的Cys在不同昆虫物种中具有很高的保守性(图3．2)。为了研究它们是否与AccGST02活性相关，本研究利用定点突变的方法将Cys突变成丙氨酸(Ala)，成功获得3个单突变体：C28A、C124A和C217A。利用已确定的AccGST02最佳诱导条件(0．2mMIPTG，30℃和8h)和HisTrapTMFF柱，表达并纯化了突变体蛋白。突变体AccGST02的DHAR活性被测定，并确定了它们的动力学常数‰和％腿，结果如表3，1所示。突变体C28A的动力学常数不能确定，可能与Cys28是一个G．位点残基有关，因而它的取代显著影响了酶与GSH的结合(野生型AccGST02结合时Cys28可与GSH形成混合二硫键)。与野生型中的动力学常数相比，突变体C124A和C217A的‰觚下降了4．7．41．9％；C124A的‰DHA明显升高而‰≯HA和‰砒G8H是降低的；C217A的动力学常数却表现出很少的差异。¨住伯8642OcoIsn奄_14x∞口^l_旦。叱 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析表3．1野生型与突变体AccGST02的动力学参数比较Table3．1ComparisonofkineticpararnaersfortherecombinantwildtypeandmutantofAccGST02铲‰咖WTorMutants(岬olproductK?卧(mM)k毗DHA(s-1)(“molproductK≯8H(m岣k吐GsH(S_1)rnin-1mg-1)min-1mg-1)WT-AccGST028．11士1．56’0．46士0．09’5．41士1．036．354-1．37’3．554-0．73‘4．234-0．91C28AC：124AND4．7l士0．940．754-0．063．144-0．864．704-0．893．634-0．783．134-0．61C217A7．564-1．030．474-0．055。044-0．976．054-0。833。614-0．664。034-0。96拄蠢彖带·号数据引自Zhangetal．(2013)。第一行中‰、‰和最哪的上标“DHA”或“GSH”分别表示测定中“GSH”或“DHA”浓度是相对饱和的。ND表示不能确定。Note：’Data舶mZhangeta1．(2013)。Thesuperscripting‰∞如andkwith“DHA"’and“GSIT’inthefastlinemeanwhat也erelevant“saturating"’GSHandDHAconcentrationsused妣respectively．ND：notdetermined。3．1．8．2AccGST02突变体的抗氧化功能分析为了进一步明确3个Cys对AccGST02功能的影响，本研究利用MFO系统和纸盘扩散分析的方法检测了3个突变体的抗氧化功能。如图3．18A．F所示，当用CdCl2、异丙苯．过氧化氢和百草枯过夜处理后，过表达重组体(野生型和突变体)大肠杆菌的抑菌圈比仅表达空载体大肠杆菌的抑菌圈都有不同程度的缩小。这说明，这些Cys-ma的取代并没有导致AccGST02保护活性全部丧失。另外，野生型AccGST02与突变体C217A有相似的抑菌圈大小，突变体C28A和C124A的抑菌圈大小基本一致。在MFO系统中，与野生型AccGST02相比，Cys217的取代几乎没有影响对DNA的保护，而突变体C28A和C124A却明显丧失了部分保护功能，尤其是突变体C28A(图3．18G)。这些观察表明Cys28和Cysl24对于维持AccGST02的生物学功能更为重要。 山东农业大学博士学位论文ABCGNF—SF—DEFT；奠羹廖图霞|l翥耋I渤洫0．010．1Concentration(mollL)哥75100t25Concen仃aUon(mmol／L)100200Concentration(mmol／L)图3．18突变对AccGST02抗氧化功能的影响(A．F)纸盘扩散分析。浸有不同浓度CdCl2(A，D)、异丙苯．过氧化氢(B，E)或百草枯(C，F)的滤纸片放在琼脂板中。过夜处理后，测量滤纸片周围的抑菌圈大小。(G)混合功能氧化(MF0)系统。泳道1：pUCl9质粒DNA；泳道2：pUCl9质粒DNA+FeCl3；泳道3：pUCl9质粒DNA+FeCl3+DTT；泳道4-7：pUCl9质粒DNA+FeCl，+DTT+150I．tg／mL纯化AccGST02(分别为野生型AccGST02、突变体C28A、C124A和C217A)。SF表示超螺旋形式；NF表示带切口形式。Fig．3·18EffectsofmutationsonantioxidantdefenseofAccGST02(A-F)Discdiffusionassays．Filterdiscs，immersedindifferentconcentrationsofCdCl2(AD)，Cumenehydroperoxide(B，E)orParaquat(C，F)werepositionedontheplates．Thekillingzonesaroundthedrug-immersedfiltersweremeasuredafteranovernightexposure．(G)Themixed-functionoxidationsystem．Lane1，pUCl9plasmidDNAonly；Lane2，pUCl9plasmidDNA+FeCl3；Lane3，pUCl9plasmidDNA+FeCl3+DTT；Lanes4-7，pUCl9plasmidDNA+FeCl3+DTT+1501_Lg／mlpurifiedproteins(wt-Ac圮GST02，C28A,C124A,andC217丸respectively)．SFsupercoiledform；NFnickedform．352515O21O—EoIJ∞苗EeI口。一垩．拈。拈：¨，¨o一暑3-暑oE日Ipo—PH‘■■●●●■I}I曩■曩■■■圜到麻翻髓强髓疆措瞄捌疆释瓣瓣鹈秘秘整●■■■■I‘圈—糟■糟羹阂画鼹豳髓髓鞠溷；l■扩蘩量誊重垂鬣薹●■■■■I函曩曩瞄暖暖圈嚼髓毯聪醚翻函¨秘瓣誓正。。，，。。；；；；，，，：】■■■■]引引则豳强啊阐w麓嚣一蠢艇嚣馘1§№=l|睫雕懿毯，l¨一．吲；唯雌●睦352515O2，O一∈。}L暑oEeI口oi工 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析3．1．8．3AccGST02突变体的荧光光谱分析为了进一步明确3个Cys对AccGST02结构的影响，本研究测量了野生型和3个突变体的荧光光谱。图3．19A是所测样品内源荧光的发射光谱图，与野生型AccGST02最大发射波长335nm相比，突变体最大发射波长为C28A(340nm)、C124A(338nm)、C217A(336nm)，都存在不同程度的红移现象。这表明突变体中色氨酸(Trp)残基更加暴露于溶剂环境，即其结构更加松弛。图3．19B是所测样品外源荧光(ANS)的测定，突变体C28A、C124A和C217A的ANS荧光强度比野生型AccGST02的分别高了43．6％、35．9％和22．9％，最大发射波长也发生蓝移。这表明突变体中疏水性残基的暴露程度更大，有利于ANS探针的结合。A訇图3．19突变对AccGST02三级结构影响的光谱分析(A)内源荧光光谱。(B)ANS荧光光谱分析。Fig．3-19EffectsofmutationsonAccGST02tertiarys劬cturesinspectraassay㈥Intrinsicfluorescencespectraanalysis．(B)ANSfluorescencespectraanalysis．3．1．8．4AccGST02突变体的空间结构分析本研究利用生物信息学工具I-TASSER(KelleyandSteinberg，2009)，预测了野生型AccGST02及3个突变体的三维结构，以期为荧光光谱实验结果提供更多支持。人GST01(PDBleemA)X．线晶体结构用作模板，因为在己知模板中它与AccGST02的氨基酸序列相似度最高(32％)。图3．20是4个蛋白丝带形式的三级结构预测图，有趣的是，野生型AccGST02与突变体蛋白的空间结构存在明显差异。最突出的改变表现在q7和D4肽段。在突变体C28A和C124A中，a7肽段被分成两段，Pher73，一个H．位点残基正好位于它们之间。B4肽段结构只出现在突变体C124A和C217A结构中，野70 山东农业大学博士学位论文生型和突变体C28A中没有发现。而且，这些蛋白质表面的疏水性斑块差异也很大，突变体C124A几乎看不到任何斑块出现。另外，在图3．21中，4个蛋白的结构以主链．侧链形式表示，根据其氨基酸残基与溶剂分子的接近程度分别用不同颜色(红．蓝)表示该残基。结果发现，在蛋白质表面有些氨基酸残基的分布发生变化。例如，突变体C28A和C124A的Trp58以及C217A的Trpl。74都比其在野生型中更加接近蛋白质表面。图3．22是蛋白表面电荷分布图，突变体中Cys28(或ma28)周围负电荷区域变小，而Phel。73周围的正电荷区域却变大。这些结构分析表明，CysAla的取代不同程度地改变了AccGST02的空间构象，这可能就是其功能改变的基础。AccGST02C124AJ。袅缓l胪图3．20AccGSlD2及其突变体结构模型和表面疏水斑块的比较Cys和突变的Ala用球体标示；m螺旋、B折叠、Phel73、N．末端及C．末端已标示；用灰色区域标示疏水性斑块；不同二级结构肽段用不同颜色区分；用Swiss．PdbViewer软件编辑图像。Fig．3-20ComparisonofstructuremodelsandsurfacehydrophobicpatchesinAccGST02anditsmutantsTheCysresiduesandmutagemcAlaresidueswereshowninballform．Thea-helices，13-sheets，Phel73，N．terminal，andC—terminalaremarked．Thegreyisusedtohighlightthehydrophobicpatches．TheseimageswerecoloredbysecondarystructuresuccessionandusingSwiss-PdbViewersottwareprogram,version4．1．0． 中华蜜蜂谷胱甘肽s．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析AccGST02C124AC28AAsp9C217A图3-21AccGST02及其突变体结构模型中氨基酸分布的比较每个残基的颜色由其接近溶剂分子的程度来确定。蓝色表示处于分子内部的氨基酸残基，其很少能接触到溶剂分子。红色表示处于分子表面的氨基酸残基，其能完全与溶剂分子接触。其他中间色表示介于二者之间。此图像用Swiss-PdbViewer软件编辑。Fig．3-21ComparisonofthedistributionofsomeresiduesinAeeGST02anditsmutantsThecolorofeveryresidueisdecidedbyaccessibilitytosolventsmolecule．Bluerepresentedtheinsideaminoacidsthatweretheleastintouchwithsolventsmolecule．redrepresentedtllesuperficialaminoacidsthatwerecompletelycontactwithsolventsmolecule，andtherestwereshownbycolorbetweenthetwo．TheseimageswereplottedusingtheSwiss．PdbViewer 山东农业大学博士学位论文AccGST02C124AC28A◇鼢C217A图3．22AccGST02及其突变体结构模型中表面电荷分布的比较负性和正性电荷分别用蓝色和红色表示。此图像颜色根据二级结构顺序确定，用Swiss-PdbViewer软件编辑。Fig．3-22ComparisonofthesurfaceelectrostaticpotentialdistributionsinAccGST02anditsmutantsNegativeandpositivechargesarerepresentedinblueandred,respectively．TheseimageswerecoloredbysecondarystructuresuccessionandusingSwiss·PdbViewer．3．2中华蜜蜂AccsHsp22．6基因的分子特性及功能分析3．2．1中华蜜蜂AccsHsp22．6基因cDNA全长的获得及序列分析利用前述AccGST02基因克隆的方法，获得AccsHsp22．6基因cDNA全长。序列分析表明：AccsHsp22．6基因(GenBank注册号：KFl50016)cDNA全长904bp，包括一个115bp的5’非编码区、585bp的开放阅读框及204bp的3’非编码区。该开放阅读框编码一个由194个氨基酸残基组成的多肽，其估算等电点为5．88，预测分子量为22．605kDa。另外，AccsHSP22．6组成中包括35个谷氨酰胺(Gin)和谷氨酸(Gin)残73 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析基，它们能够提供额外的静电引力维持蛋白质在高温下的稳定性(图3．23)(JacobsenandShaw，1989)。CAG哩"ATTTTGT到艮GCAACCAAACAGTGA燃TcGCAAGTTTGAGTGAATTTCACTCAATTTCACTAAATAAAAGCATTAGACATTAA芏ACATTTGTtAAATTAAATCGTCGa雌ATGTCATTGGTAcCTTTGC尘ATTCTCTGATTGGTGGGAGACTCTGGATCGTCCGCACCGTCTCTTGGAOCAGAAT——一％*㈣MSLVPLFSDW纛TLDRPHRLD簦NTTCGGATTAGGCCTTT!ATCCGGAACAATTGTTATCACCGAGCCGATTGGAGTTATGTTTACAAOCACGAAGAGGAFGLGLYP鬟蘩LsPsRL鬟LcL黧PRGAACGTTTACATCTCCAGACCGAATTG∞CTGAACTGTTTCGT_AGTGACAGAGGCAGTTCAACTGTTCAAGCAGATNVYISRPNWA鼙LFRSDRGSTV羹ADAAAGATAAATTTCAAGTTGTACTTGACGTTCAACAATTlTGAACCTCATGAA矗TCGATGTTAAAGTCGTTGATAAAKDKF臻VLDV蘩蹙F鬟P珏藕工DVKVDKT职GTTGTTGT仇CGGCAAAGCATGAGGAA矗AACGCGATGAGCACGGTTGGATTTCACGTCAGTTCGTCAGAAAAFVTAKH嚣耩KRD莲HGW工SR谨FVRKTATCTGATTCCAGAGCAATa曩；ATCTTG氏ACAAGTCTCATCGAAGTTATCATCTGACGGCGTTCTTACTATCACTYL工P甏鬟cDL甏建VsKLsDGVLTzTGCTCCAAGGAAGGATCAAGGAAATA!TAGAGAATGAACGAGlT!AATCAAAATCGAGCAAACCGGTAAACCAGC从TCAPRKD蘩GN工鬟N鬟RV工K工囊骥TGKPAICAGACGAAAccACCC曩五Ac^矗《鼬CAGAACC圆AAATGAAG国圆圆粥GAAGAGAAGAAATAAAAATTTC从：陌AGA：T蘩TKPK囊羹N粪N蹇囊N黧骥K★ATTTCTGCC刭TTTATGAAATTTCCt酗垤At蝴TATTATTGTTGAACtACAATTAAATTCCTATCG髓诵CATTTAAAATTATTAT_AGTATTATTAAAGATGTGATGTAAT!ATATATTGTGAA嫩TTATTTCATTTTTTTTTCATGT_A，!ATTATTTTCATAACTACGT!AAATATAT_ATATATATATGT_A图3-23AccsHsp22．6基因的全长eDNA及蛋白质序列翻译起始密码子和终止密码子用下划线标出，谷氮酸和谷氨酰胺残基用黑色阴影标示。Fig．3-23Thefull·lengthcDNAandproteinsequencesoftheAccsHsp22．6geneThetranslationstartandstopcodonsaleunderlined．GluandGinresiduesaleshaded．3．2．2中华蜜蜂AccsHSP22．6蛋白一级结构分析多序列比对发现，AccsHSP22．6与其他昆虫sHSPs具有71．99％的序列同源性，这些sHSPs包括：意大利蜜蜂L2EFL(彳．mellifera，AmL2EFL)、小蜜蜂L2EFL(彳．florae，AfL2EFL)、大黄蜂L2EFL(B．impatiens，BiL2EFL)、苜蓿切叶蜂L2EFL(Megachilerotundata，MrL2EFL)、丽蝇蛹集金小蜂L2EFL(Ⅳvitripennis，NvL2EFL)及腰带长体茧蜂sHSP(Macrocentruscingulum，McsHSP)，表明sHSPs在膜翅目昆虫中有高度的保守性(图3-24A)。而且，AccsHSP22．6具有sHSP家族的典型特征：N．末端包含部分保守序列PSRLFDQXFGEXLL，C一末端存在IXI模序，中部有后生动物sHSPs典型的a-晶状体结构域(ACD)，它由80个氨基酸残基(75—153)组成的p．折叠层构成(132．135)。这些分析表明AccsHSP22．6属于典型的sHSP家族。此外，通过NCBI服务器还预测出8个参与二聚体构成的氨基酸残基，利用PROSITE数据库预测到保守的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点(Serl39和Thrl70)。74柏：2∞巧髓∞加巧仔∞∞巧晒矗}∞巧仔鲋∞皓N柏m伽巧猫∞||}巧；亭仰伽伪晒姗啪仍m埘瑚泓蚪 山东农业大学博士学位论文本研究还构建了不同昆虫sHSPs同源进化树以探究昆虫sHSPs的进化关系(图3-24B)。在已检测的四种昆虫物种sHSPs中，AccsHSP22．6归属于膜翅目类，且与意大利蜜蜂小分子热激同源蛋白AmL2EFL紧邻(Kurzik-DumkeandLohmann，1995)，依据其预测分子量命名其为AccsHSP22。6。本研究利用I-TASSER还预测了AccsHSP22．6的三维结构。所用模板是人衄．晶状体蛋白(PDB2yjdA)，它包含了AccsHSP22．6全部氨基酸序列，两个蛋白之间拥有39％序列同源性，是已知结构中自动匹配的最佳模板(图3-24C)。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析AC一麟|||C疆DiEEKK．．cKEⅨEⅨH．．．K"TEEEEEN．．．ccKC=EE“EEⅫ固Dn口cⅢ∞∞·№P226《KFI∞016HAasmelI劬L2EFL0p0011196841)A#sflormL征FL胛00369495011Borrlbu6impstlensL芷FL(舻0034928111]Megachi]erobJndataL2EFL(炉—p∞701703N茴∞B"JtnpemisL篷FL(妒—∞34253711】Mamtmsclngulurns惜P(^CF21815)Campondusflcfi由rust2EFt_fEFN06713．1)Acrornyrme0(echinat灯L疰FL(EG髓∞61)Ha晖egnathossaltatorL2EFL匹FN87098，)Apescerdri8cemnn5HSP23(AEH059∞l5⋯““gW“8惜”7非”哪o1鲫吣mLocus口migratariasHSP207髀BC84494)JLidomyzasalivaesHSP2"7(ABE57t39)1Lidomyza～Ⅺ由m惜baHSP20(ABE5713订DipteraDroso冲lamelanogasterL2EFL^(NP-523827)JCydlapommeltasHsPl98fAD；日0000)Danausd似ppus惜P∞4(EHJ63989)LoncmiaoUiqual-ISP2(^^v9136”Lcnomiaodl刊eHSP3以AWl3e习Bcmbyxmori5HSP226(A伽4354)SesarnMnona印adesHSP208(ABC8834刁Spodopterahturas卜BP(^DK555241】PierisrapeeHSP20《AETl0埘1)CtitosupomssaIis，}略P坞7{B^E轴864)图3．24AccsHSP22．6的分子特性(A)AccsHSP22．6与其他sHSPs的氨基酸序列比对。预测的二级结构已标示。相同的氨基酸序列用黑色表示。a·晶状体结构域(ACD)用下划线标出，IXI模序用黑框标出，二聚化位点和PKC磷酸化位点分别用(V)和(．．．)标出。(B)基于氨基酸序列的不同昆虫物种sHSPs的进化关系。四个昆虫家族已标示，AccsHSP22．6用黑框标出。(C)AccsHSP22．6的三级结构。推测的二聚化界面残基(Asp75、Val82、Asp¨、Glrt跖、Gin盯、Ar9124、Glyl45和Vall46)，PKC磷酸化位点残基(Serl39和Thrl70)，IXI模序(Ilel65和Ilel67)，N．末端和C．末端已标示。(D)AccsHSP22．6结构模型中表面电荷的分布。负、正电荷分别用蓝色和红色标示。图像的颜色基于二级结构不同而确定且用Swiss．PdbViewer编辑。Fig．3-24MolecularpropertiesofAccsHSP22．6㈧TheaminoacidsequencealignmentofAccsHSP22．6andothersHSPs．TheputativesecondarystructureofAccsHSP22．6isshown．Identicalaminoacidsareshadedinblack．Thea-crystallindomain(ACDlisunderlined．TheIXImotifisboxed．TheputativedimerinterfaceandPKCphosphorylationsitesaredenotedby(V)and(．．．)．(B)PhylogeneticrelationshipsonthebasisoftheaminoacidsequencesbetweensHSPsfromdifferentinsectspecies．Thefourinsectspeciesareshown,andAccsHSP22．6isboxed．(C)ThetertiarystructureofAccsHSP22．6．Theputativedimerinterfaceresidues(Asp75，Val跎，Asp¨，Gins6，Gins7，Ar9124，Glyl45andVall46)，PKCphosphorylationsiteresidues(Scr”9andThrl70)，IXImotif(Ilel65andIlel67)，N．terminus，andC．terminusareshown．(D)ThesurfaceelectrostaticpotentialdistributionsinthestructuremodelsofAccsHSP22．6．Negativeandpositivechargesarerepresentedinblueandred，respectively．TheseimageswerecolouredbysecondarystructuresuccessionandusingSwiss．PdbViewer．76霭飘蕊一拍一一：暑一一拍一需誉嚣薷嚣誉嚣鍪 山东农业大学博士学位论文3．2．3AccsHsp22．6基因组结构分析为进一步明确AccsHsp22．6的基因组结构，本研究以蜜蜂基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得该基因组DNA全长序列。结果发现AccsHsp22．6基因没有内含子。将AccsHsp22．6的基因组与已知基因组序列且同源性较高的意大利蜜蜂L2EFL(么．mellifera，AmL2EFL)、小蜜蜂L2EFL(彳．florae，AfL2EFL)、丽蝇蛹集金小蜂L2EFL(Ⅳvitripennis，NvL2EFL)、腰带长体茧蜂sHSP(肱cingulum，McsHSP)、美洲斑潜蝇sHSP21．7(Liriomyzasativae，LssHSP21．7)及中华蜜蜂sHsp23(彳．ceranacerana，AccsHsp23)进行比对后发现：它们都没有内含子，且5’非翻译区及开放阅读框架长度基本一致，但3’非翻译区长度不同(图3．25)。AccsHSP22．6AmL2EFLA见2EFLNvL2EFLMcsHSPLssHSP27-7AccsHSP23020040060080010001200网IaoRF|l·YUTR图3．25sHsps基因组结构示意图中华蜜蜂(KFl50018)、意大利蜜蜂(XP一001119884．1)、小蜜蜂(XP一003694950．1)、丽蝇蛹集金小蜂(XP003425371．1)、腰带长体茧蜂(ACF21815)、美洲斑潜蝇(ABE57139)及中华蜜蜂(AEH05930)sHsps基因组DNA长度根据下面比例尺确定。5’非翻译区、开放阅读框架及3’非翻译区分别用灰色、浅灰色和黑色框标出。Fig．3—25SchematicrepresentationofthegenomicstructurcsofsHspsThelengthsofgenomieDNAfromAccsHsp22．6(KFl50018),AmL2EFL(XP_001119884．1)，Afl,2EFLCXP_003694950．1)，NvL2EFL(XP_003425371．1)，McsHSP(ACF21815)，LssHSP21．7(ABE57139)andAccsHsp23(AEH05930)areshownaccordingtothescalebelow．TheY-untranslatedregion(UTR)，ORF,and3’UTRaredenotedbygrey,lightgreyandblack,respectively．3．2．4AccsHsp22．6启动子序列的分离及顺式作用元件的预测为明确AccsHsp22．6基因调控区域的构成，本研究分离了位于转录起始点上游、长度为2064bp的5’侧翼序列(KFl50016)。利用Matlnspector数据库，预测到许多顺式作用元件(图3-26)。除了与胚胎或组织发育有关的一些元件：CF2．II、Dfd、BR．C、NIT2、及CdxA之外(Ericssoneta1．，2006；Perth，1994；Stanojevieeta1．，1989；Yueta1．，2011)，几个涉及环境应激和免疫响应的转录因子结合位点也被发现(Wanetal．，2012)。如HSF、 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析AP一1、CREB、核因子KB(NFlcB)、p53及X．盒结合蛋白(XBP．1)。另外，还发现5个GATA模序，其参与了内胚层发育及晚期分化为内皮细胞的基因表达(Burmeisteretal．，2008)；一个乙醇脱氢酶调节子1(ADRl)，其是过氧化酶体蛋白质编码基因转录的正性调节子(Simoneta1．，1991)；一个核转录因子(Nrf2)，它是调控一系列应激反应关键基因表达的总开关，可增强细胞对亲电子毒物或活性氧族／活性氮族(ROS／I斟S)的防御能力(HayesandMcMahon，2009)。据此我们推测AccsHsp22．6基因不仅参与环境应激响应而且涉及发育调节。GCT爱AGAGGGATAATAAC-GTGTCTTCAAATCCTCTCCCCAATTAAGAAGTACCGGCAAAAAAGACATTGTTTTTTTTTAATTCAAAAATCREBAAATTCAATCTCTTGTCC4％ATACTTATTTTTTCACTTAAAATTTTCTTTTCTTTTGTAAAGCTTTTTTATTCACTC城GTATTAP一1GcTTGAccAcAATAAGATGTTTGGcTAAATGTTTGTGcAATAATTTcGTTTcAATTcTATTaT高矗TGA啾嘲cGcGcG从TADRlGⅪkHSFATA蝴TcATAcGcTATGAAAAG妻鹪够奄TA秘GATAATCAAGAAACATAT嘲TT鬟霉GGAAAT酾酗积赆妻墓AAATABR．C．1983．1901．1819．1737．1555．1573GAAAATAGAAAAATTTTAATTGCCAAAATATTAACTTTTAACTTTTGATTAATTATTTTAAATAAAATAAGAGCTATTTTAAA-1491HSFP53HSFATATTGTTTCTATCTGCTTAAAAACGCGAACATTCAATTAGCAACTAGCCCATGTAAATA3AATTATATAGTTTCGAKTCA她．1409蔓墨ECF2一HCREBCTATAAAATATATTGTATAATATATATACATATATTGAT睫TACAT麟TAATTCATTTTAAACACATT．1327CF2．IIAAAAAAATCTTATAAAATGTTATATATAAGATTTTTATTTTGTCATATTATATTATTTTTATACTATGACAATATATTGTAAA．1245Cd)【AAAATATATAAAAATTGTGTTTAAATGATTTAAAAAAATACTTAATGTTTTATATAATTTATATTTTAAATAATTTTAAAATTA．1163TTTAAAATATAAATTTTCAATATTGTTTTCAAAATTTCAATATTGTTTTAATTTAAAAAAAATAAAATAAAATTATATAGAAA一1081AP-1TAATAGAAATAATAGAATAGAAATAAAATTTGACTATTTCCATATCATTAATAATTTTGTTAAAATCAAATTTCAATAATTAC．999CREBAAACATATTTATTTAAAGAAATATTTCATTTCCAATATTTCTTGACTTTACGATAATGCTATTACATCAAACAAGAATAAATT．917ATTGAACTAAAATCAAAATTAAGTTAATCAAATAATTATTAAATTATTAATAGTTAATAATTTTAAATTTAGAAATTATATT．835AP一1CdxATTcTTAATAAAAA^ATATTAAATAATTGATA篱蠢茔GAATT篱ATTTTcTTGAAA礤蟹蓠强强AGAATTTATTTGAAATTTGTAATAT．753AP-1GATAATTCAATAATTGATTAATATTCATTTTTATATTTTTTATATATTTTTTGATTTACAATTTTAAATATTTTAAGATA砸TTATT．671NFrBTTTTTAATCTCTTTTAATCTGATTTTTTCAATCTGATCTAACTGAATATATTTCCAGTTA固蜥TTT赫rAcrGJurorrr．589XBP一1TAG∞煎燃圆蟛醐鹦纂臻霹确漆黔AATccATcAT埘GTAA弧TGT从TA强TAcATAA脚TTAcAT_ATTTAATAAAcAAT．507CF2一HCTATTATTATAAAAATCTTAAATTTAAATAAGTAAGATGAATGTTTATATATAAA．425SF2·IITGcTTTTTT”TA熙臻臻TAAAAACTTTTTTTTC．AAATAAATTATATGTAATATAAATATTATAGTATTAAATTTATTAATA．343AATTTTAAATAATATTATTATATAGTTTATTATAAACTATATTTAACTTGAATACTTAAGTATTACATATATTATATTTAAAT一261GAAAATACAAGTTATTTATTTAATTCTTATTATAGGTATTTGAAATATATATGTACATATTTTAAAATATGAAA驵TTTTAAT，179GA]_ATTCTCATACAATAAACTCTTTCTAACTGTTAACCTAGATATACATATGTATGTATTATACAGTGCCCACTCAATAGTTGCTCC．97TATA-box+1TGCGCAAACTCATG谯TAAATACAGC妇TAAGAACCGCTATCGTC．AGTATTT-15‘——一TranscriptionstartsiteTGTTAGCAACCAAACAGTGAAGATCGCAAGTTTGAGTGAATTTCACTCAATTTCACTAAATAAAAGCATTAGACATTAATACA+68TTTGTTAAATTAAATCGTCGCAAAATGTCATTGGTACC+129]彳TⅢl柏nsta㈣te图3-26AccsHsp22．6调控区域的核苷酸序列及预测的顺式作用元件翻译和转录起始位点用箭头标记，顺式作用元件均用黑色阴影或黑框标出。这些预测的转录因子结合位点的模型序列相似度大于85％(即错配率小于15％)，核心序列相似度为100％。Fig．3·26Thenucleotidesequenceandputativec／s-actingelementsoftheAccsHsp22．6regulatoryregionThetranslationandtranscriptionstartsitesaremarkedwitharrows．Thec捃．actingelementsareshadedinblackorboxed．Atleast85％matrixsimilarityfi．e．15％mismatches)and100％similaritytothecoresimilaritywereallowedintheidentificationofputativetranscriptionfactorbindingsites．78 山东农业大学博士学位论文3．2．5AccsHsp22．6的表达特性分析3．2．5．1AccsHsp22．6基因表达的时间和空间特异性本研究利用qRT-PCR和Westernblot分析了AccsHsp22．6基因在中华蜜蜂不同发育时期和不同组织中的表达模式。如图3-27A所示AccsHsp22．6基因表达水平在整个发育过程中波动很大。其最高的表达水平出现在新出房成虫期，其次在整个蛹期。有趣的是，我们发现AccsHsp22．6基因表达的增强总是与不同发育期的转换密切相关，包括卵．幼虫、幼虫．蛹、蛹．成虫的转换。在检测的成虫组织中，AccsHsp22．6基因在中肠组织中的表达量最高，其次是表皮(图3-27B)。中肠组织在外源性毒物的解毒和氧化应激的保护方面发挥重要作用(Enayatieta1．，2005)；作为外骨骼的表皮不仅能维持身体的稳定性，同时保护组织防御各种环境应激(Marionneteta1．，2003)。AccsHsp22．6基因的这种时间空间表达模式暗示着其可能参与了发育时期的转换以及保护蜜蜂免遭外源性毒物的损伤。本研究进一步检测AccsHsp22。6基因在蛋白水平上的时间空间表达特性，用抗AccsHSP22．6血清作为探针，4种组织(表皮、肌肉、脑和中肠)、3种发育时期(1日龄幼虫、粉眼蛹和1日龄成虫)蜜蜂的总蛋白被提取并进行Westernblot分析(图3-27C，D)。结果表明AccsHsp22．6在蛋白水平上的表达特性与其转录水平上的趋势基本一致。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析一4．圄2．521．510．50EEggL1L2L3L4L5PPPwPpPbPdA1A15A30LarvaePupaeAdultsDevelopmentstagesBRMSEPMGTissuesdistributionCDPpA1DevelopmentstagesBRMSEPMGTissuesdistribution图3·27qRT-PCR(A，B)和Westernblot分析(C，D)确定AccsHsp22．6的表达模式不同发育时期(A)和不同组织中(B)AccsHsp22．6的表达模式。(C)泳道1．3用等量的蛋白上样：泳道1是1日龄幼虫，泳道2是红眼蛹，泳道3是1日龄成虫。(D)泳道1-4用等量的的蛋白上样：BR表示脑，MS表示肌肉，EP表示表皮，MG表示中肠。Fig．3-27ExpressionprofileofAccsHsp22．6asdeterminedbyqRT-PCR(AB)andWesternblotanalysis(C，D)TherelativeexpressionofAccsHsp22．6atdifferentdevelopmentalstages(舢andindifferenttissues(B)isshown．(C)Lanes1-3wereloadedwithanequivalentamountofprotein：LI：day-1larvae，Pp：pink-eyedpupae，andAI：newlyemergedadults．(D)Lanes1-4wereloadedwithanequivalentamountofprotein：BR：brain，MS：muscle，EP：epidermis，MG：midgut．3．2．5．2AccsHsp22．6在不同非生物应激下的表达特性研究表明，sHsps能够参与热休克及其他非生物应激反应。例如紫外线、农药、氧化剂、化学毒物和微生物感染等(Lieta1．，2009，Liueta1．，2012，Reineke，2005)。然而并非所有的sHSPs在细胞内都是应激反应性分子。为了明确AccsHsp22．6可能具有的生物学功能，本研究利用qRT-PCR检测了AccsHsp22．6在不同非生物应激下的表达模式，包括温度(4℃、16"C、25。C和42。C)、农药(三氟氯氰菊酯、辛硫磷、哒螨灵和百草80柏弱∞巧加12佃50co一∞∞o-IQ×∞∞>；∞一orco一∞∞o．IQ×∞o>；母一or 中华蜜蜂谷胱甘肤S．车}移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析3-29B)。对中华蜜蜂和意大利蜜蜂幼虫感染蜂球囊菌后sHsp22．6表达的分析表明，意大利蜜蜂AmsHsp22．6和中华蜜蜂AccsHsp22．6的表达均被上调，最高表达量分别出现在意蜂感染后第3天和中蜂感染后第2天。另外，中华蜜蜂和意大利蜜蜂sHsp22．6的基本表达水平存在差异，AccsHsp22．6的相对表达量普遍低于AmsHsp22．6的表达量(图3-29C)。这些结果也为前述AccsHsp22．6参与蜜蜂免疫反应过程的推测提供了佐证。AQQ：望鱼!旦：鱼!坌：!120Etiter(IIg／m1)CCKBbaAfBtBboMicrobiaI．nfectionApismelliferaAp『scera／lac8rartaAscosphaeraapisinfeetion图3-29AccsHsp22．6在不同生物应激条件下的表达特性这些条件包括：(A)20E(20羟基蜕皮激素)，(B)病原微生物侵染，Bba表示白僵菌、Af表示黄曲霉菌、Bt表示苏云金芽孢杆菌、Bbo表示黑胸败血菌，(C)蜂球囊菌侵染。未处理蜜蜂幼虫作为对照(CK)。Fig．3—29ExpressionprofileofAccsHsp22．6underdifferentbioticstressconditionsTheseconditionsincluded：(A)20E，(B)Microbialinfection．Bba,且bassiana；Af,A．flauus；Bt,置thuringiensis；Bbo，丑bombysepticus，(C)A．ap／sinfection．Untreatedlarvaewereusedascontrol(CK)．82亡。一∞∞∞．IQ)(o∞>茹∞一oZ∞笛加侣伯0co一∞∞∞．JQ×oo>Il晒一∞r 山东农业大学博士学位论文3．2．6AcesHSP22．6重组蛋白的原核表达及功能分析3．2．6．1AccsHSP22．6重组蛋白诱导表达条件的优化为进一步研究AcesHSP22．6蛋白的功能特性，我们构建了原核表达载体pET-30a(+)-AccsHsp22．6并成功诱导表达出His．融合蛋白。为了得到更多可溶性蛋白，又进行了诱导表达条件的优化(图3-30A，B和C)，最后确定AccsHSP22．6最佳诱导条件是：6h，0．2mMIPTG和30℃。SDS．PAGE结果显示，此重组蛋白是可溶的且分子量约为30kDa，这与预测分子量29．505kDa基本一致(N．端和C．端包含分子量大约7kDa的His标签序列)。可溶的重组蛋白经HisTrapTMFF柱进一步纯化后，得到浓度为1．67mg／mL的AccsHSP22．6蛋白(图3-30D)。纯化蛋白经佐剂处理后免疫小白鼠，制备了AccsHSP22．6的多克隆抗体。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析(kDa)116．066．2扼。燮ji35．o彗豢t：譬i{酾舔+鼗．25。0j”霸群j。一潮鞠函萄汹潮陲确醪““_-‘‰。一12345678C(kDa)116．0“。66．245．035．025．0i夏w#耕#蔷i‰——¨*‘一图3．30AccsHSP22．6的表达和纯化这些SDS-PAGE分析是用来分离在大肠杆菌BL21细胞中表达的重组蛋白AccsHSP22．6。(A)不同诱导时间。泳道l是低分子量蛋白标志物；泳道2为未诱导的过表达重组蛋白；泳道3．8分别为诱导2、4、6、8、10、12h的重组蛋白。(B)不同IPTG浓度。泳道1是低分子量蛋白标志物：泳道9为过表达的空载体对照；泳道8为未诱导的过表达重组蛋白；泳道2．7分别用1．2、1．0、0．8、0．6、0．4、O．2mMIPTG诱导的过表达重组蛋白。(C)不同诱导温度。泳道5和6是低分子量蛋白标志物；泳道4和7为未诱导的过表达重组蛋白；泳道3和8、2和9、1和10分别是诱导的过表达重组蛋白超声破碎后的全液、上清和沉淀；泳道1．4是30"C下诱导，7．10为37℃下诱导。(D)AccsHSP22．6的纯化。泳道l是低分子量蛋白标志物：泳道2为过表达的空载体对照；泳道3和4分别是未诱导和诱导过表达重组蛋白；泳道5和6分别是超声破碎后的上清和沉淀；泳道7是纯化的重组蛋白。重组蛋白的位置用箭头标示。Fig．3-30ExpressionandpurificationofAceAccsHSP22．6TheseSDS-PAGEanalyseswereusedtoseparaterecombinantAccsHSP22．6expressedinEcoliBL21cells．㈧Differentinductivetimes．Lane1，low-molecule·weightproteinmarker；Lane2，non—inducedoverexpressionofpET-30a(+’)-AccsHsp22．6inBL21；Lanes3-8，inducedovcrexpressionofpET-30a(+)-AccsHsp22．6inBL21for2，4，6，8，10，and12h，respectively．(B)DifferentPTGconcentrations．Lane1，low-molecule-weightproteinmarker；Lane9，inducedoverexpressionofpET-30a(+)inBL21；Lane8．non-inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccsHsp22．6inBL21；Lanes2-7，inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccsHsp22．6inBL21by1．2，1．0，O．8，0．6，0．4，and0．2mMIPTG,respectively．(C)Differentinductivetemperatures．Lane5and6，low-molecule·weightproteinmarker；Lane4and7，non-inducedoverexpressionofpET．30a(+)-AccsHsp22．6inBL21；Lanes3and8，2and9，land10，inducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccsHsp22．6inBL21，suspensionandpelletofsonicatedrecombinantAccsHSP22．6，respectively；LanesI-4and7-10，overexpressionat30℃and3TC，respectively．(D)PurificationofAccsHSP22．6．Lane1，low-molecule-weightproteinmarker；Lane2，inducedoverexpressionofpET-30时)inBL21．Lanes3and4，non-inducedandinducedoverexpressionofpET-30a(+)-AccsHsp22．6inBL21，respectively；Lanes5and6，suspensionandpelletofsonicatedrecombinantAccsHSP22．6，respectively；Lane7，purifiedrecombinantAccsHSP22．6．TherecombinantAccsHSP22．6ismarkedwitharrow鬈黔麟籍瓣戮鬻i磬瓣燃雾宇O0204№侣{8钻弱筋伯似j02O0O4慨侣{g帖∞筋侣 山东农业大学博士学位论文3．2．6．2AccsHSP22．6重组蛋白的耐温性分析我们已经观察到蜜蜂在热或冷应激时AccsHsp22．6表达的上调(图3-28A)，为了提供AecsHSP22．6在体内保护细胞免遭极端温度损伤的直接证据，本研究进行了过表达AccsHsp22．6的大肠杆菌耐温性分析(图3．31)。当实验菌液放置于4"C、48h后，过表达空载体的大肠杆菌细胞成活率降到16．9％，而过表达重组体细菌细胞成活率为30．6％(图3-31A)；当实验菌液放置于50。C时，过表达空载体的大肠杆菌细胞其生存率随着处理时间的增加而急剧降低直到全部死亡，而过表达重组体细菌细胞在处理1h后生存率为42．7％(图3-31B)。过表达重组体AccGST02的菌液被作为非．HSP对照，在这个实验中该细菌细胞的生存率基本与表达空载体的菌液相同。这些结果表明AccsHSP22．6提高了大肠杆菌的对极端温度的耐受能力。图3．31极端温度对转化不同载体的大肠杆菌BL21细胞生存率的影响这些细胞包括转化pET-30a(+)-AccsHsp22．6、或pET-30a(+)、或pET-30a(+)-AccGST02的大肠杆菌BL21细胞。Fig．3—3lTheeffectofextremetemperaturesonthesurvivalrateofE．coilBL21(DE3)cellstransformedwithdifferentvectorsThesecellsincludedEcoilBL21∞E3)cellstransformedwithpET-30a(+)-AccsHsp22．反orpET030a(+)only,orpET-30a(+)．AccGST02．3．2．6．3过表达AccsHsp22．6大肠杆菌的纸盘扩散分析将浸有不同浓度异丙苯．过氧化氢的滤纸片，小心放置于涂布有过表达AccsHsp22．6大肠杆菌的琼脂板上，过夜生长后，其纸片周围的抑菌圈明显小于过表达空载体的对照菌板中的抑菌圈(图3-32)。这一结果表明AccsHsp22．6的过表达增强了大肠杆菌的对氧化损伤的保护能力。 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析pET一30a(+)pET-30a(+)-AccsHSP22．6Cumenehydroperoxide图3．32过表达AccsHsp22．6大肠杆菌的纸盘扩散分析LB琼脂板用含5x108个细胞的菌液涂板，浸有不同浓度异丙苯．过氧化氢(1表示0mM、2表示25mM、3表示50mM、4表示80mM、5表示100mM)的滤纸片放在琼脂板中。Fig．3·32DiscdiffusionassaysusingEcolioverexpressingAccsHsp22．6LBagarplateswereinoculatedwith5X108cells．Filterdiscssoakedwithdifferentconcentrationsofcumenehydroperoxide(1，0mM；2，25mM；3，50raM；4，80raM；5，lOOmM)wereplacedontheagarplates．3．2．6．4重组蛋白AccsHSP22．6的体外分子伴侣功能分子伴侣功能是热激蛋白具有的重要特性。近年来，几个小分子热激蛋白(sHSPs)被发现在体外能够抑制不同模式底物的热聚集，也具有分子伴侣功能(Liueta1．，2012；LiPfa1．，2012；Pdrez．Moraleseta1．，2009)。如图3．33所示，当苹果酸脱氢酶(MDH)放置于43"C时，其溶液A360nn。即开始升高，表明MDH开始发生热变性而聚集。加入等量牛血清白蛋白(BSA)或纯化的AccGST02都不能有效阻止MDH的聚集，而等量纯化的AccsHSP22．6蛋白的加入，却能够有效地保护苹果酸脱氢酶(MDH)避免发生热变性。O102030405060Time《min)图3．33苹果酸脱氢酶热聚集分析中AccsHSP22．6的分子伴侣活性Fig．3-33MolecularchaperoneactivityofAccsHSP22．6shownbythemalatedehydrogenasethermalaggregationassay8654535251SO¨融¨m啦玑¨乳呲一I．oco心n—ooc行cl_lo僻cl《 山东农业大学博士学位论文3．2．7RNAi介导的AccsHsp22．6基因沉默3．2．7．1AccsHsp22．6基因最佳沉默时间的确定为进一步探究AccsHsp22．6基因的功能，本研究对新出房成虫进行了RNAJ实验。新出房成虫采取注射dsAccsHsp22．6处理，并用qRT-PCR检测每日AccsHsp22．6基因的表达水平以确定其最佳沉默时间。结果表明：与未注射对照组成虫相比，水和dsGFP注射对照组成虫AccsHsp22．6基因表达水平先显著升高(考虑可能与注射损伤有关)，注射后第3天才与未注射对照组成虫的表达水平相一致；而dsAccsHsp22．6注射组成虫AccsHsp22．6基因表达水平却被显著抑制，尤其是注射后第1天(图3-34)。为了进一步明确AccsHsp22．6基因沉默在蛋白水平上的影响，本研究还选择注射后第3天成虫进行免疫组化分析。如图3．35所示，与对照组相比，dsAccsHsp22．6处理组石蜡切片的染色较轻，尤其是蜜蜂的马氏管(黑色箭头标示)、肌肉(白色中空箭头标示)和脂肪体细胞(白色实心箭头标示)。但是，未发现组织细胞有明显的形态改变。以上结果说明由dsAccsHsp22．6介导的基因沉默是成功的，最后确定注射后第3天成虫作进一步研究。图3-34注射dsRNA成虫的AccsHsp22．6基因转录分析Fig．3-34TranscriptionanalysesofAccsHsp22．6geneindsRNA-injectedadults642O8642O■!lCo一协协o’lQ×mp》一肖一。筮 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析noinjectionwateinjectiondsGFPinjectiondsAccsHSPinjection∥图3．35成虫AccsHsp22．6基因沉默的免疫组化分析(a-h)分别是(A-H)的阴性对照。(a-d)和(A-D)是中肠组织，马氏管(黑色箭头指示)；(c．h)和(E．H)是表皮，肌肉(白色中空箭头指示)，脂肪体细胞(白色实心箭头指示)。比例尺，20pro。Fig．3-35ImmunohistochcmistryanalysesforeffectsofAccsHsp22．6silenceinadults(a_”arenegativecontrolsfor(A-H)，respectively．(a-d)and(A·D)：midgut,tubamalpighii(blackarrows)；(e-h)and(E-H)：epidermis，muscle(whiteandhollowarrows)，andfatbody(whiteandsolidarrows)．Scalebar,201xm．3．2．7．2AccsHsp22．6基因沉默对蜜蜂耐温能力的影响在大肠杆菌耐温性实验中，我们发现过表达AccsHsp22．6的细胞有更高的生存率。那么，AccsHsp22．6基因沉默是否会影响蜜蜂的耐温能力?我们在注射dsAccsHsp22．6三天后的成虫中进行了耐温能力的测定(图3-36)。与对照组相比，在40C和50。C处理时，dsAccsHsp22．6注射组成虫生存率较低，表明AccsHsp22．6基因沉默的蜜蜂对极端温度的耐受能力降低，这可能与AccsHsp22．6的应激保护功能有关。 山东农业大学博士学位论文A1h2h3h4h5h4oC固仆2h3h4h5h50oC图3．36AccsHsp22．6RNAi的成虫与对照组成虫在4"C(A)和50。C(B)时的生存率分析Fig．3-36ThesurvivalrateofAccsHsp22．6RNAiadultscomparedwithcontrolsin4"C(A)and50"C(B)册∞约。一零一口甍|l府^l^J：∞∞o一霉一。肖JI糟^I^|：∞ 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析4讨论(1)AccGST02基因研究结果讨论Omega族谷胱甘肽S．转移酶(GSTOs)在内源及外源性毒物的解毒方面发挥重要作用。这个基因家族与一些人类疾病的发生有关、且广泛分布于多个物种，故而引起人们的高度关注(Board，2011)。然而，目前有关GSTO的研究工作主要集中于哺乳类动物，昆虫GSTO的研究十分有限(Kettermaneta1．，2011)。本研究从中华蜜蜂中克隆到一个新的GSTO基因，并对其分子特性进行了初步探究。我们发现，与大多数物种的GSTOs不同，重组的AccGST02不仅具有DHAR活性和GSH依赖的过氧化物酶活性，也能催化CDNB的结合反应。这一结果与Burmeistereta1．(2008)和Garceraeta1．(2006)的报道一致，但是，产生这一独特酶学特征的精确机制还不清楚。Waneta1．(2009)推测这些不同的酶活性可能与其具有非传统GST活性位点的氨基酸组成有关。目前已知氨基酸序列的GSTOs的GSH结合位点周围4个相邻氨基酸残基组成有以下类型：F⋯CPY、F⋯CPF、F⋯CPW、Y-C．P．Y等。AccGST02的这个四聚体序列是Y-C．P．F，不同于多数GSTOs，它的第一位是酪氨酸(Y)而不是苯丙氨酸(F)，酪氨酸的羟基能够与GSH的相互作用，这个取代可能增强了酶对底物GSH的结合力。然而这一解释还需要进一步的实验证实。在AccGST02的5’侧翼区预测到许多与早期发育有关的转录因子结合位点，为了验证其是否参与蜜蜂早期发育过程，本研究进行了AccGST02表达的阶段特异性分析。qRT-PCR结果表明AccGST02在幼虫期高水平表达(图3-5A)。Krishnan和Sehnal(KrishnanandSehnal，2006)研究发现，幼虫和成虫比蛹受到更多的氧化应激。因为蜜蜂蛹期及刚出房成虫处于静止的非喂养期，幼虫期和成虫出房后的前两周则处于喂养期，其食物来源于采集蜂提供的花蜜、花粉及腺体分泌物，这些食物的摄入或者消化过程可能会产生毒性的氧自由基，造成喂养期蜜蜂体内出现高的氧化应激水平。此外，蜜蜂在幼虫期时，其体内微粒体氧化酶活性较高(GilbertandWilkinson，1975)，但抗氧化体系和免疫防御系统的发育都不完善，因此对不利环境更加敏感。幼虫期AccGST02高水平表达预示着其在蜜蜂早期发育中可能参与外源性毒物的解毒过程。开展AccGST02表达的组织特异性研究有助于更好地理解它的生物学功能。实验表明，AccGST02在脑组织中表达量最高(图3-5B)，脑组织对氧化应激非常敏感(Amenteta1．，2008；Rivaleta1．，2004)。尽管这一结果与哺乳动物GSTO在脑组织中低表达不一 山东农业大学博士学位论文致(Boardeta1．，2000)，然而果蝇CG6781／se仅在脑组织中高表达，且参与红眼色素的生物合成和蝶啶的代谢(Waltersela1．，2009)。我们发现重组AccGST02具有显著的脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性，这一活性对于维持脑组织抗坏血酸(AsA)水平非常关键，因为AsA主要依赖于从食物中摄取以及体内脱氢抗坏血酸(DHA)的还原。AsA在清除自由基和活性氧族(I的S)中发挥重要作用(Freieta1．，1989)，脑组织是一个耗氧量较高的组织，AsA对其代谢中产生的ROS及其他毒物的清除和解毒十分必要。总之，AccGST02在脑组织中高水平表达暗示着其可能通过维持AsA的水平保护脑组织免受氧化损伤。此外，在AccGST02的57侧翼区还预测到几个氧化应激元件，如HSF和AP．1，暗示AccGST02可能参与蜜蜂的氧化应激过程。qRT-PCR结果表明，在所检测的非生物应激中，除HgCl2处理抑制AccGST02的表达外，其他条件均上调了AccGST02的表达(图3．7)。温度、H202、农药和紫外线均被证明可以诱导生物体产生氧化应激(Lushchak，2011；Kottuparambileta1．，2012)，我们也发现CdCl2可以诱导蜜蜂体内I-1202和丙二醛(MDA)积累。一般，胞内的镉离子并不发生电子得失，而是通过消耗抗氧化物质，尤其是GSH，进而导致ROS的积累(Stohseta1．，2000；OhandLim，2006)。重金属汞诱导ROS的产生及GSH的消耗也已经在BEAS．2B细胞中得到证实(ParkandPark，2007)。与我们的结果相一致，家蚕GSTO也能被一系列环境刺激而激活，包括细菌、紫外线．B和三种常用化学杀虫剂(Yamamotoetal．，2011)；镉也诱导了果蝇GST的表达(Yepiskoposyaneta1．，2006)，表明在昆虫中GSTOs的功能是相对保守的。但是，HgCl2对AccGST02表达的抑制与对AccGSTs4的调控相似(Yu8fa1．，2012)，却不同于AccGSTSl的研究结果(Yanetal．，2013)。这可能与HgCl2处理的浓度、时间以及蜜蜂的年龄等不同有关。总之，GSTO表达的上调总是与其确定的功能相关(Huangeta1．，2011．Yamamotoeta1．，2011；Waneta1．，2009)。在秀丽隐杆线虫中，其GST01．1通过RNAi而沉默后，这些蠕虫对几种促氧化剂、亚砷酸盐和热刺激更加敏感(Burmeistereta1．，2008)。这一观察也为理解AccGST02在防御响应中的保护作用提供了一些线索。研究发现，AccGST02还能响应一些生物因素的应激，包括20E(20羟基蜕皮激素)和不同的病原微生物(图3．8)。BR-C，一个蜕皮激素响应元件，在Acc傩亿)2的启动子区被预测(-873至．885)，能够调节昆虫变态期间3日龄幼虫和预蛹的发育(vonKalmeta1．，1994)。3日龄幼虫的AccGST02能够被20E诱导表达为其参与发育过程提供又一证据。另外，幼虫被不同病原微生物侵染后，AccGST02亦被不同程度诱导表达，但是91 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析在AccGST02的启动子区并没有发现免疫相关元件(如NF．1国)，通过测定感染幼虫体内的CAT活性，H202和MDA含量，发现感染幼虫体内氧化水平增高，我们推测这可能是其诱导AccGST02表达的直接原因。在蜂球囊菌引发的蜜蜂白垩病中，中华蜜蜂幼虫比意大利蜜蜂幼虫具有更强的抗病性。但是在蜜蜂被蜂球囊菌感染后，AccGST02表达被逐步抑制，而意大利蜜蜂AmGST02却表达增加，表明AccGST02可能并未参与蜂球囊菌的应激。GSH．依赖的过氧化物酶能够还原有机过氧化物为低毒的单羟基醇类，作为抗氧化剂保护脂膜及其他细胞内组分防御氧化损伤(MahmoudandEdens，2003)。但是，昆虫中缺乏硒．依赖的谷胱甘肽过氧化物酶(GPOXs)，GSTs具有硒．非依赖的过氧化物酶活性，因此在抗氧化防御中发挥重要作用(CoronaandRobinson，2006)。DHAR可以维持机体AsA的正常水平，在自由基和ROS的清除方面起关键作用(Freiet讲．，1989)。Yamamotoet讲．(2011)也证实家蚕bmGSTO具有过氧化物酶活性能够清除ROS，并通过DHAR活性提高家蚕对氧化应激的抗性。本研究发现，重组ACcGST02具有GSH．依赖DHAR活性和过氧化物酶活性，AccGST02的表达可以被H202和百草枯诱导；纸盘扩散分析也表明AccGST02的过表达能够增强大肠杆菌对不同环境刺激的抗性。此外，在混合功能氧化(MFO)系统中，重组AccGST02还能够保护超螺旋DNA免遭羟自由基的损伤。总之，这些研究表明AccGST02可能参与ROS的清除，有助于保护细胞免受氧化损伤。dsRNA介导的RNAi技术被认为是基因功能研究最有前景的策略之一，这对于转基因技术还不能成功应用的昆虫尤为重要(HuvenneandSmagghe，2010)。目前，dsRNA主要通过两种途径进入昆虫体内：人工饲喂法和显微注射法(WMsheet耐．，2009；Futahasllieta1．，2011)。人工饲喂法是一种无创技术，但很难精确控制个体摄入量；与之相反，可精确控制dsRNA剂量及微创的显微注射法已广泛应用于各种昆虫的研究中(Futah砌eta1．，2011；Elias-Netoeta1．，2010；Liueta1．，2010)。本研究根据成虫与幼虫的身体特征，分别采用显微注射与人工饲喂dsAccGST02进行RNAi实验并获得成功。无论成虫还是幼虫，与对照组相比，dsAccGST02处理组蜜蜂的生存率明显降低，这意味着它们可能对内外环境的变化更为敏感。进一步研究发现，dsAccGST02处理组蜜蜂中AccGSTD、AccGSTs4、AccSOD及AccCAT的表达水平出现不同程度的降低，而这些基因都属于重要的抗氧化酶类(Candaseta1．，2013；Maoeta1．，2013；Yanet讲．，2013；Yu甜a1．，2012)，且H202和MDA的积累增加。根据以上这些分析，我们推测AccGST0292 山东农业大学博士学位论文可以增强细胞氧化抗性有助于延长蜜蜂的寿命。此外，本研究利用定点突变的策略对AccGST02分子中3个Cys的功能进行了初步探讨。我们对3个单突变体(C28A、C124A、C217A)进行了动力学常数、抗氧化能力、荧光光谱以及三级结构模型的分析。结果表明，Cys-Ala的取代严重影响了突变体C28A的结构及功能特性，突变体C124A和C217A的催化活性及氧化抗性也出现不同程度的降低。究其原因，我们推测：Cys28是一个被预测为G．位点(GSH结合位点)氨基酸，能够与GSH中Cys形成混合二硫键而结合，它的取代直接影响了酶与底物GSH的结合，进而影响酶的其他功能特性。Cysl24和Cys2"是非活性位点氨基酸，它们的取代可能影响了蛋白质结构稳定性或蛋白质折叠过程，因而对功能产生影响。荧光光谱和三级结构模型分析为这些功能特性的改变提供了结构方面的证据。结构分析发现，Cysl24处于预测的H．位点(疏水性底物结合位点)附近，Cysl24．Alal24的取代改变了a7肽段的结构，Phel73(一个保守的H．位点氨基酸)正好位于其中，这可能就是突变体C124A较C217A在功能特性上发生更大改变的原因。(2)AccsHsp22．6基因研究结果讨论小分子热激蛋白(sHSPs)在保护组织对抗应激诱导的细胞损伤以及基本生理过程中发挥着重要作用。本研究从中华蜜蜂中分离出AccsHsp22．6基因，并初步探究了sHsp22．6在膜翅目昆虫中的功能。研究发现，AccsHsp22．6分子中谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)含量高达18％，这两种氨基酸能够在高温下提供额外的静电作用力而维持蛋白质结构稳定性(JacobsenandShaw,1989)。氨基酸同源比对显示，在AccsHsp22．6蛋白的N．末端，包含一个部分保守的序列(PSRLFDQXFGEXLL)，它对于调节sI-ISP的寡聚化和分子伴侣活性非常必要(KostenkoandMoens，2009)。中间具有B2．p5折叠层组成的p．折叠的三明治样结构，即G．晶状体结构域(ACD)，它是sHSP进行二聚化和寡聚化的基本单位(Hayeseta1．，2009；SunandMacRae，2005)；ACD表面分布着大量负电荷，这可能与底物的结合有关(Collineta1．，2003)。位于C．末端可变延伸区的IXI模体，可以驱动sHSP亚基发生更高层次的装配(Bagn6riseta1．，2009)。另外，Lieta1．(2009)根据家蚕中sHsps基因的染色体定位和内含子数目，将它们粗略地分成两种类型：直系同源簇和种属特异簇。直系同源簇sHsps基因通常参与大多数代谢过程且至少含有一个内含子，而种属特异簇sHsps基因一般与环境应激响应相关且没有内含子。基因组结构的分析表明，AccsHsp22．6基因不含内含子，应归属于种属特异簇sHsps基因。以上结果一方面表明93 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析本研究从中华蜜蜂中分离的AccsHsp22．6基因属于sHsps家族成员，另一方面暗示了AccsHsp22．6可能主要参与环境应激响应。尽管从AccsHsp22．6基因组结构方面推测其主要与环境应激相关，但是在AccsHsp22．6基因的5’侧翼区，我们预测到许多与组织发育有关的转录因子结合位点(如BR-C)。因此，本研究进行了AccsHsp22．6表达的阶段特异性分析。结果发现，AccsHsp22．6的高水平表达总是与不同发育时期的转换密切相关。在完全变态昆虫中，不同发育时期的转换总是伴随相关基因表达水平的剧烈波动。Galaeta1．(2013)报道，在意大利蜜蜂中，卵一幼虫的转换改变了65种蛋白和34种磷蛋白的表达水平，新孵化幼虫增强了蛋白质折叠、细胞骨架及代谢相关蛋白的表达以确保意大利工蜂的快速生长。在昆虫变态期间，主要受到两种激素的调节：保幼激素和蜕皮激素(主要成分是20E)。20E能够结合典型的蜕皮激素响应元件(EcI砸)调控昆虫的发育(Rebeccaeta1．，2009；Lieta1．，2007b)。值得注意的是，AccsHsp22．6的高水平表达与变态期间蜜蜂体内20E滴度的峰值也高度相关(Suneta1．，2013)，这种对20E的响应现象也在其他sHsps中存在(Shenetal．，2011；Huetetal．，1996)。另外，新出房成虫部分基因表达水平出现剧烈波动，是因为它们还需完成相当多的代谢、形态和神经系统的成熟，为今后的高强度集中飞行做准备(Skandaliseta1．，2011)。因此，AccsHsp22．6在不同发育时期转换时的高水平表达暗示着其可能通过调控蛋白质折叠来参与蜜蜂的发育过程。温度是一个重要的环境因素，它能诱导生物体发生相关生理变化进而产生氧化应激(AnandChoi，2010)。sHsps的热应激诱导表达已广泛得到证实，但是sHsps在昆虫冷应激中的表达模式仅有很少的研究。Colineteta1．(2010)发现成年果蝇中有5个sHsps被冷应激诱导；果蝇Hsp23和Hsp26是在冷应激后的恢复期转录增加(QiIletal。，2005)。最近，Waagneretal．(2013)发现快速冷驯化(RCH)显著上调了土壤弹尾目跳虫hsp40、hsp23和hsplO的表达，推测对寒冷敏感的弹尾目昆虫在RCH期间依赖sHSPs的保护作用。蜜蜂是一个变温动物，它的分布及生存深受环境温度的限制。研究发现当细胞遭受冷热刺激后，几个sHSPs的积累量超过细胞总蛋白的1％，可以维持大约1／3细胞质蛋白的可溶状态(Derochereta1．，1991；Pachecoeta1．，2009)。因此，AccsHsp22．6被4℃、16℃和42"C诱导表达、冷热刺激下过表达AccsHsp22．6的大肠杆菌具有更高的生存率、重组AccsHsp22．6的分子伴侣功能及冷热刺激下AccsHsp22．6-RNAi蜜蜂死亡率更高，这些实验结果意味着AccsHsp22．6可能在蜜蜂的冷热应激反应中，通过分子伴侣活性发挥重要的保护作用。 山东农业大学博士学位论文农药是普遍存在的环境污染物质，包括杀虫剂、杀菌剂、除草剂等等。研究表明，Hsps可用作生物标记探测无脊椎动物体内有害异物的影响(dePomerai，1996)。来自果蝇的研究也发现Hsp基因可被不同农药诱导表达(Mukhopadhyayeta1．，2002；Guptaeta1．，2005a；Guptaeta1．，2005b)。然而，有关农药与sHsps表达的研究却很有限。本研究检测了4种农药对AccsHsp22．6表达的影响，其中辛硫磷和百草枯的影响很小，而三氟氯氰菊酯和哒螨灵显著上调AccsHsp22．6的表达(图3-28)。辛硫磷是一种有机磷杀虫剂，能够抑制胆碱酯酶活性导致乙酰胆碱增加而影响神经信号的传递。但因其通过表皮很少被吸收而广泛用作哺乳动物的杀寄生虫药(Brimereta1．，1993)。百草枯是一种全世界广泛使用的除草剂，如果喂食动物则毒性很高，稀释后喷涂于动物表皮则毒性很低(Raghueta1．，2013)。本研究中采取涂抹于待试成虫的胸背板处的方法进行农药处理，因此我们推测：辛硫磷和百草枯通过表皮只有很少的吸收量不足以对AccsHsp22．6表达产生明显的影响。三氟氯氰菊酯是一种亲脂性杀虫剂，能够干扰磷脂的定位导致生物膜流动性的改变(VaalavirtaandTahti，1995)。哒螨灵是一种新的亲脂性杀螨剂(属于杀虫剂类)，能够抑制线粒体呼吸链中复合体I的电子传递(SugimotoandOsakabe，2013)。一般，亲脂性分子很容易穿过细胞膜进入细胞，因此涂抹的氯氰菊酯和哒螨灵能够有效进入蜜蜂体内。通常，Hsp对特定毒物的响应总是与这种毒物产生影响细胞完整性的细胞毒性事件相关联(Guptaeta1．，2005b)。因此，氯氰菊酯和哒螨灵显著诱导AccsHsp22．6表达，暗示着在这两种杀虫剂引发的生理损伤中，AccsHsp22．6发挥一定的保护作用。sHSPs是细胞氧化应激响应的重要调节子(Christianseta1．，2012)。研究表明，温度、农药、紫外线及重金属等环境因素都能诱导细胞产生氧化应激(Lushchak，2011；Kottuparambiletal．，2012)。在AccsHsp22．6的5’侧翼区也预测到一些抗氧化反应元件，如HSF、AP．1、ADRl、Nrf2等。为了明确该基因在氧化应激中的作用，我们检测了H202、UV、HgCl2和CdCh处理后AccsHsp22．6的表达方式。H202、Uv和CdCh处理都显著诱导该基因表达，而HgCl2处理后AccsHsp22．6的表达出现波动和抑制趋势。通常，重金属对细胞的损伤主要直接通过蛋白质变性或者间接诱导RoS生成而介导(BertinandAverbeck。2006)。在其他动物模型中的研究也表明，重金属镉能够强烈诱导sHSP表达(Choieta1．，2008；Zhangeta1．，2010)，这与我们的结果是一致的。不过，在鲍鱼中，汞以剂量依赖的方式诱导HdHSP20表达(Waneta1．，2012)，这与我们的结果相反，暗示着本研究使用的HgCl2剂量可能较低，不足以诱导AccsHsp22．6的表达。纸盘扩散分析的结果也为AccsHsp22．6的抗氧化作用提供了又一证据。 中华蜜蜂谷胱甘肽s．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析很多研究证实HSPs参与疾病的防御过程，但是sHSPs在微生物侵染中的作用还不十分清楚。PollaandCossarizza(1996)证实在病原体侵染过程中Hsps能够阻止过量产生的ROS所引起的蛋白质变性而发挥保护性作用。Wueta1．(2011)发现，家蚕感染细胞质多角体病毒(CPV)后，其中肠sHsp23．7的表达被上调，这可能与抗．BmCPV免疫功能有关。Waneta1．(2012)也发现当感染细菌和病毒后，HdHSP20表达被特征性诱导。尤其是，我们先前的研究表明，病原微生物侵染可以调节AccHsp27．6的表达，且提供了重组的AccHsp27．6抗病菌的直接证据(Liueta1．，2012)。在AccsHsp22．6的5’侧翼区也预测到几个免疫反应元件，如NFr,B、p53、XBP．1等。因此，本研究检测了5种病原微生物侵染对AccsHsp22．6表达的影响，其中黄曲霉菌的诱导作用最强。黄曲霉菌是一种引发蜜蜂幼虫黄曲霉病(又称结石病)的真菌性病害，主要危害蜜蜂大幼虫和蛹的健康，这一结果暗示着AccsHsp22．6在蜜蜂黄曲霉菌病的免疫中发挥重要作用。另外，在白垩病病原蜂球囊菌侵染后，中华蜜蜂和意大利蜜蜂sHsp22．6的表达均被诱导，但基本表达水平存在差异，AccsHsp22．6的相对表达量普遍低于AmsHsp22。6的表达量，尽管表达量的最大变化值出现在中华蜜蜂感染后的第2天。这说明AccsHsp22．6在蜜蜂白垩病的免疫响应中起着一定的作用，但是其在中华蜜蜂对白垩病的防御中可能不及意大利蜜蜂AmsHsp22．6的作用更为重要。总之，本研究结果分别从转录和翻译水平、体内RNAi实验、体外分子伴侣活性测定以及过表达AccsHsp22．6的大肠杆菌耐温性实验等方面，表明了AccsHsp22．6基因在中华蜜蜂发育时期转换和环境应激保护中的重要性。 山东农业大学博士学位论文5小结(1)本研究从中华蜜蜂中首次成功的分离出Omega族谷胱甘肽S．转移酶．2基因和小分子热激蛋白22．6基因，并分别命名为AccGST02和AccsHsp22．6。通过氨基酸同源比对、进化树分析及基因组结构比较，发现这两个基因都与其所在家族的其他物种保持很高的同源性，并存在各自家族的保守结构域，证明了本研究得到的两个基因是正确的中华蜜蜂基因。(2)通过对两个基因的5’侧翼区域顺式作用元件的预测、不同组织和发育阶段的表达特性、不同应激条件下的表达分析及原核表达蛋白的特性分析，表明了AccGST02主要通过维持AsA水平参与蜜蜂的氧化应激保护且与幼虫早期组织的发育有关，AccsHsp22．6可能利用分子伴侣活性直接参与蜜蜂不同发育时期的转换以及对多种生物和非生物不利因素的应激保护反应。(3)通过对两个基因进行RNAi分析，发现AccGST02基因沉默后，蜜蜂生存率明显下降；抗氧化基因AccGSTD，AccGS乃4，AccSOD，AccCAT的表达量呈现降低趋势；体内氧化水平升高。这些结果表明了AccGST02可能在降低蜜蜂氧化损伤、延长蜜蜂寿命方面发挥重要作用。AccsHsp22．6基因沉默后，蜜蜂对极端温度更加敏感，生存率下降，这说明AccsHsp22．6在保护蜜蜂降低极端温度损伤方面起着关键作用。(4)利用基因定点突变、酶的动力学分析及抗氧化功能分析，首次得出AccGST02分子中Cys28和Cysl24对酶的功能影响较大；通过内外源荧光光谱分析及空间结构模型分析发现，这些功能方面的影响是由于Cys．Ala突变改变了酶的空间结构所致。 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山东农业大学博士学位论文GuptaS．C．，SiddiqueH．R．，SaxenaD．K．，ChowdhuriD．K．．ComparativetoxicpotentialofmarketformulationoftwoorganophosphatepesticidesintransgemcDrosophilamelanogaster(hsp70-lacZ)．CellBi01．Toxic01．，2005a,21：149—162GuptaS．C．，SiddiqueH．R．，SaxenaD．K．，ChowdhuriD．K．．Hazardouseffectoforganophosphatecompound，dichlorvosintransgenicDrosophilamelanogaster(hsp70-lacZ)：inductionofhsp70，anti—oxidantenzymesandinhibitionofacetylcholinesterase．Biochim．Biophys．Acta．，2005b，1725：81·92HabigW．H．，PabstM．J．，JakobyW．B．．GlutathioneS-transferases．Thefirstenzymaticstepinmercapturicacidformation．，Bi01．Chem．，1974，249：7130-7139HaslbeckM．．sHspsandtheirroleinthechaperonenetwork．Ce／／MoLLifeSct，2002，59：1649．1657HayesD．，NapoliV．，MazurkieA．，StaffordW．F．，GraceffaP．．Phosphorylationdependenceofhsp27multimericsizeandmolecularchaperonefunction．』Bi01．Chem．，2009，284：18801．18807HayesJ．D．，McMahonM．．NRF2andKEAPlmutations：permanentactivationofanadaptiveresponseincancer．TrendsBiochem．Sci．，2009，34：176-188HuangL．H．，WangC．Z．，KangL．．Cloningandexpressionoffiveheatshockproteingenesinrelationtocoldhardeninganddevelopmentintheleafminer，Liriomyzasativa．JlnsectPhysi01．，2009，55：279-285HuangY．F．，XuZ．B．，LinX．Y．，FengQ．L．，ZhengS．C．．StructureandexpressionofglutathioneS-transferasegenesfromthemidgutoftheCommoncutworm，Spodopteralitura(Noctnidae)andtheirresponsetoxenobioticcompoundsandbacteria．一InsectPhysi01．，2011，57：1033—1044HuangP．Y．，KangS．T．，ChenW．Y．，HsuT．C．，LoC．F．，LiuK．F．，ChenL．L．．Identificationofthesmallheatshockprotein，HSP21，ofshrimpPenaeusmonodonandthegeneexpressionofHSP21isinactivatedafterwhitespotsyndromevirus(WSSV)infection．FishShellfishImmun01．，2008，25：250—257HuetF．，LageJ．L．，RuizC．，RichardsG．．Theroleofecdysoneintheinductionandmaintenanceofhsp27transcriptsduringlarvalandprepupaldevelopmentofDrosophila．Dev．GenesEv01．，1996，206：326-332HuvenneH．，SmaggheG．．MechanismsofdsRNAuptakeininsectsandpotentialofRNAiforpestcontrol：areview．zInsectPhysi01．，2010，56：227—235IshiclaM．，MitsuiT．，YamakawaK．，SugiyamaN．，TakahashiW．，ShimuraH．，EndoT．，KobayashiT．，AritaJ．．InvolvementofcA_MPresponseelement-bindingproteinintheregulationofcellproliferationandtheprolactinpromoteroflactotrophsinprimaryculture．Am．』Physi01．Endocrin01．Metab。，2007，293：E1529—1537JacobsenJ．V．，ShawD．C．．Heat-stableproteinsandabscisicAcidactioninbarleyaleurone101 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山东农业大学博士学位论文WanQ．，WhangI．，LeeJ．．MolecularandfunctionalcharacterizationofHdHSP20：abiomarkerofenvironmentalstressesindiskabaloneHaliotisdiscusdiscus．FishShellfishImmun01．，2012，33：48-59WatersE．R．．Theevolution,function，structure，andexpressionoftheplantsHSPs．』Exp．Bot．，2013，64：391-403WellsW．W．，XuD．P．，WashburnM．P。Glutathione：dehydroascorbateoxidoreductases．MethodsEnzym01．，1995，252：30-38WuP．，WangX．，QinG．X．，LiuT．，JiangY．F．，LiM．W．，GuoX．J。Microarrayanalysisofthegeneexpressionprofileinthemidgutofsilkworminfected、析mcytoplasmicpolyhedrosisvirus．M01．Bi01．Rep．，2011，38：333—341YamamotoK．，ZhangP．，MiakeF．，KashigeN．，AsoY．，BannoY．，FujiiH。Cloning，expressionandcharacterizationoftheta-classglutathioneS-transferasefromthesilkworm，Bombyxmori．Comp．Biochem．Physi01．BBiochem．M01．Bi01．，2005，141：340—346YamamotoK．，TeshibaS．，ShigeokaY．，AsoY．，BannoY．，FujikiT．，KatakuraY．．CharacterizationofanOmega·classglutathioneS-transferaseinthestressresponseofthesilkmoth．InsectM01．Bi01．，2011，20：379—386YanH．，JiaH．，GaoH．，GuoX．，XuB．．Identification，genomicorganization，andoxidativestressresponseofasigmaclassglutathioneS-transferasegene(AccGSTS1)inthehoneybee，Ap／sceranacerana．CellStressChaperones，2013，18：415-426YepiskoposyanH．，EgliD．，FergestadT．，SelvarajA．，TreiberC．，MulthaupG．，GeorgievO．，SchaffnerW．．TranscriptomeresponsetoheavymetalstressinDrosophilarevealsanewzinctransporterthatconfersresistancetozinc．NucleicAcidsRes．，2006，34：4866-4877YinS．，LiX．，MengY．，FinleyR．L．Jr．，SakrW．，YangH．，ReddyN．，ShengS．．Tumor-suppressivemaspinregulatescellresponsetooxidativestressbydirectinteractionwithglutathioneS-transferase．ZBi01．Chem．，2005，280：34985—34996YuF．，KangM．，MengF．，GuoX．，XuB．．MolecularcloningandcharacterizationofathioredoxinperoxidasegenefromAp／sceranacerana．InsectMoLBi01．，2011，20：367．378YuX．，SunR．，YanH．，GuoX．，XuB．．CharacterizationofasigmaclassglutathioneS-transferasegeneinthelarvaeofthehoneybee(Apisceranacerana)onexposuretomercury．Comp．Biochem．Physi01．BBiochem．M01．Bi01．，2012，161"356—364ZhangL．，WangL．，SongL．，ZhaoJ．，QiuL．，DongC．，LiF．，ZhangH．，YangG．．TheinvolvementofHSP22frombayscallopArgopectenirradiansinresponsetoheavymetalstress．MoLBi01．Rep．，2010，37：1763-1771ZhangY．，YanH．，LuW．，LiY．，GuoX．，XuB．．AnovelOmega-classglutathioneS-transferasegeneinApisceranacerana：molecularcharacterisationofGST02anditsprotectiveeffectsinoxidativestress．CellStressChaperones．，2013，18：503-516107 中华蜜蜂谷胱甘肽S．转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析本论文研究课题来源：国家自然科学基金项目(No．3172275)现代农业蜂产业技术体系建设专项资金(No．CARS．45)山东省农业良种工程“地方优良家禽及蜂业新品种选育”(No．2013LZ017．04)108 山东农业大学博士学位论文致谢本研究是在导师郭兴启教授的悉心指导下完成的。从选题、方案的制定和实施到研究结果的分析整理、论文的撰写，无一不凝聚着导师的心血和智慧。郭老师一丝不苟的工作作风，严谨求实的治学态度，诲人不倦的高尚师德，为我树立了一面行为规范的镜子，让我时时都有学习的模板。郭老师博我以文，约我以礼，虽历时三载，却给以终生受益无穷之道。对郭老师的感激之情是无法用言语表达的。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从课题选题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!特别感谢胥保华教授，他不仅在学业上给我以精心指导，更使我进一步明确了今后的学术研究方向，在此谨向胥老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意!我还要特别感谢王晓云教授在实验知识和技术方面给予的大力支持和无私的帮助。同时感谢实验室的同学们：于晓丽、孟飞、刘昭华、卢文静、闰慧茹、李玉真在实验及论文撰写中给予的指导；王颖、姚朋波、王秀玲、褚晓茜、李静、史伟娜、杨晓健、闰燕、郝利利、陈晓博、王芳、贾海红在实验中对我的帮助；感谢作物生物学重点实验室的所有给予我帮助的老师和同学们；感谢我的家人，是你们给我的巨大支持让我毫无顾虑的完成学业，在我迷茫无助的时候也是你们为我加油鼓劲，给了我前进的动力。感谢参加本论文评阅、答辩和对本论文提出宝贵建议的所有专家和同行12014年5月10日于泰安 一．主竺窒坚查些堇堕!：鲎整壁塑!：坌王垫塑至皇垩里塑生塑堂垫堕坌堑——__●_●__-_-_———_————__---__-l__-●—_—————————_——_-————-—————————_-____———_—————————————————一一一攻读学位期间发表论文情况ZhangY．，YanH．，LuW．，LiY．，GuoX．，XuB．．AnovelOmega-classglutathioneStransferasegeneinApisceranacerana：molecularcharacterisationofGST02anditsprotectiveeffectsinoxidativestress．Ce／／StressChaperones，2013，18：503-516MengF．，ZhangY．，LiuF。，GuoX．，XuB。．CharacterizationandMutationalAnalysisofOmega-ClassGST(GST01)from彳p括ceranacerana，aGeneInvolvedinResponsetoOxidativeStress．PLoSOne，2014，9：e93100．SunR．，ZhangY．，XuB．．CharacterizationoftheresponsetoecdysteroidofanovelcuticleproteinR&Rgeneinthehoneybee，Ap／sceranacerana．Comp．Biochem．Physi01．BBiochem．M01．Bi01．，2013，166：73—80YanY．，ZhangY．，HuaxiaY．，WangX．，YaoP．，GuoX．，XuB．．Identificationandcharacterisationofanovel1-Cysthioredoxinperoxidasegene(AccTpx5)fromAp／sceranacerana．Comp．Biochem．Physi01．BBiochem．M01．Bi01．，2014，pii：S1096．4959(14)00043—8．doi：10．1016／j．cbpb．2014．04．004．ChuX．，LuW．，ZhangY．，GuoX．，SunR．，XuB．．Cloning，expressionpatterns，andpreliminarycharacterizationofAccCPR24，anovelRR-1typecuticleproteingenefromAp／sceranacerana．Arch．InsectBiochem．Physi01．，2013，84：130—144YaoP．，ChenX．，YanY．，LiuF．，ZhangY．，GuoX．，XuB。Glutaredoxin1，glutaredoxin2，thioredoxin1，andthioredoxinpemxidase3playimportantrolesinantioxidantdefenseinApisceranacerana．FreeRadic．Bi01．Med．，2014，68：335—346110