分离自蜂蜜中的嗜渗酵母的实时荧光pcr法快速鉴定 8页

分离自蜂蜜中的嗜渗酵母的实时荧光PCR法快速鉴定陈世琼1蔡雪凤1逄波2韩玥3伊鋆1任岩1（1北京市海淀区产品质量监督检验所北京100094；2中国疾病预防控制中心北京102206；3北京市出入将检验检疫局北京100026）摘要：嗜渗酵母是导致蜂蜜腐败的主要微生物。鲁氏接合酵母是嗜渗酵母中最常见的种类。酵母的传统生化鉴定方法繁琐、耗时。为快速鉴定分离自蜂蜜的嗜渗酵母的种类，本研究建立了针对鲁氏接合酵母的实时荧光PCR快速鉴定方法。并用此方法对分离自蜂蜜的62株嗜渗酵母进行了快速鉴定，发现其中21株为鲁氏接合酵母。实时荧光PCR方法鉴定鲁氏接合酵母，全过程仅需约5小时，与常用的生化鉴定方法相比，简化了鉴定步骤，提高了鉴定准确性，缩短了鉴定时间。关键词：蜂蜜嗜渗酵母实时荧光PCR鉴定Rapididentificationofeosinophilsyeastisolatedfromhoneybyreal-timePCRmethodShiqiongChen1*XuefengCai1*BoPang2YueHan3JunYi1(1BeijingHaidianDistrictProductsQualitySupervisionandInspectionInstitute,Beijing,100094;2ChineseCenterforDiseaseControlandprevention,Beijing,102206;3BeijingEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Beijing,100026)Abstract:Osmophilicyeastisthemainmicroorganismwhichleadhoneytocorruption.Zygosaccharomycesrouxii(Z.rouxii)wasthemostcommontypeofosmophilicyeast.Thisstudyestablishedareal-timePCRforrapididentificationofZ.rouxii.SixtytwostrainsofosmophilicyeastisolatedfromhoneywererapidlyidentifiedbythisrealtimePCRmethod.Theresultsshowedthat21ofthemwereZ.rouxii.ToidentifiyZ.rouxiibyreal-timePCRmethod,thewholeprocessonlyneedsabout5hours.Comparedwiththecommonlyusedbiochemicalidentificationmethods,therealtimePCRmethodismoresimple,accurateandtimesaving.Keywords:honey;Osmophilicyeast;RealTimePCR;identification【中图分类号】TS255.1【文献识别码】A【文章编号】蜂蜜较其他食品而言，具有高糖、高渗透压等性质，因此具有一定的抑制微生物生长的作用，所以蜂蜜中所具有的微生物种类与数量是相对较少的[1,2] 。但是，酵母、霉菌，以及一些能够形成芽孢的细菌，能够在高糖、低水分活度的环境中生存，它们也经常给蜂蜜产业带来问题[3,4]。酵母能够影响蜂蜜产品的货架期和质量的稳定性[5]。蜂蜜中出现的酵母主要有两类：一类为嗜渗酵母（osmophilicyeast），另一类为耐高糖酵母（sugar-tolerantyeasts)，其中嗜渗酵母对蜂蜜品质影响较大[4,6,7]。嗜渗酵母中，已有的研究报道表明，有结合酵母（Zygosacchuromyces）、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、针孢酵母（Nematospora）和圆酵母（Torula）被从蜂蜜或其它高糖食品中分离出来[4,8-10]。鲁氏接合酵母是常见的嗜渗酵母，能引起蜂蜜及其加工产品变质。因此，2011，中华人民共和国卫生部发布并实施了《食品安全国家标准—蜂蜜》（GB14963-2011），代替了《蜂蜜卫生标准》（GB14963-2003）以及《蜂蜜》（GB18796-2005）标准[11]。新标准除了对蜂蜜的定义、蜜源要求等进行了增订、修改外，还增加了对嗜渗酵母的计数要求[12]。传统酵母菌鉴定，包括蜂蜜中的鲁氏酵母的鉴定，一般采用传统生化鉴定方法。此方法耗费时间长，且操作步骤繁琐[13,14]，一般需要1-2周才能完成[14]。分子生物学技术的发展，为分离自蜂蜜的接合酵母的快速鉴定提供了新的替代方法[15]。实时荧光PCR技术具有快速、灵敏、特异性强等优点，是一种极具优势的分子生物学技术[16]。本研究的目的是建立针对鲁氏接合酵母的实时荧光PCR快速鉴定方法，并对分离自蜂蜜的嗜渗酵母进行快速鉴定，以便为蜂蜜产品中嗜渗酵母的溯源，以及蜂蜜产品的质量控制提供技术支持。1材料与方法1.1菌株本研究使用的菌株见表1： 表1本研究使用的菌株Table1Microbialstrainsusedintheresearch编号菌名菌号123456789101112131415-77鲁氏接合酵母ZygosaccharomycesrouxiiZygosaccharomycesrouxiiZygosaccharomycesrouxii酿酒酵母Saccharomycescerevisiae粘红酵母Rhodotorulaglutinis粉状毕赤酵母Pichiacarsonii近平滑假丝酵母Candidaparasilosis汉逊德巴利酵母Zygosaccharomycesbisporus布鲁塞尔德克酵母Dekkerabruxellensis斯巴达毕赤酵母Pichiaspartinae黑曲霉Aspergillusniger大肠杆菌E.coli金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus未知酵母CGMCC2.1915CICC1417CICC31259CGMCC2.1882CGMCC2.0703CGMCC2.1908CGMCC2.1846CGMCC2.1595JCM11407JCM10741ATCC16404ATCC259225-3，分离自样品DSMZ3922分离自蜂蜜产品其中，编号为1、2和3为鲁氏接合酵母标准菌株；4-14为参比菌株，其中，4-10为其他食品中常见的其他腐败酵母，11为黑曲霉（ATCC16404），12-14为细菌。15-77为分离自蜂蜜样品的未知酵母。1.2仪器及试剂实时荧光PCR仪（ABI7300）；生化培养箱。反应预混液（2╳TaqManUniversalMasterMix，ABI）（Cat.No.：4427788）；酵母基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，以下简称天根公司）（Cat.No.：DP307-02）。1.3试验方法1.3.1菌株的培养及DNA提取将表1中的菌株用马铃薯-葡萄糖培养基培养基[16]28℃培养24h，取培养液用天根公司酵母基因组提取试剂盒提取DNA。详细操作过程见试剂盒说明书。提取的DNA于-20℃ 冰箱贮存备用。1.3.2鲁氏接合酵母实时荧光PCR鉴定方法的建立根据本实验设计的探针引物序列，从上海英骏生物技术有限公司合成引物探针。分别以表1中1-10目的菌株及参比菌株的DNA为模板，配置20μL实时荧光PCR反应体系，组成如下：含10μL2╳TaqManUniversalMasterMix，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探针（10μmol/L）1μL，模板50ng-100ng，用灭过菌的双蒸水补足20μL。在ABI7300扩增，扩增条件为：95℃，10min；95℃，15s;60℃，1min；40个循环。根据Ct值判断探针、引物的特异性。2结果与分析2.1引物、探针的特异性试验结果引物、探针的有效性、特异性试验结果详见图1及表2：从图1及表2可以看出，本研究使用的针对Zygosaccharomycesrouxii实时荧光PCR探针和引物对Z.rouxii属目的菌株有高度的特异性。在本研究所使用的扩增条件下，目的菌株CGMCC2.1915、CICC1417和CICC31259的的扩增曲线的Ct值分别为19.28、22.01和22.71，其他酵母、曲霉、细菌标准菌株或参比菌株扩增曲线的Ct值均显示为未扩出。空白对照BLANK未扩出，说明实验结果有效，不存在污染。 图1引物、探针的有效性实验Fig.1TheprobeandprimersofZ.rouxiiofrealtimePCR注：图1中，曲线1、2以及3分别表示以Z.rouxii标准菌株CGMCC2.1915、CICC1417和CICC31259的基因组DNA为模板时的扩增曲线；4-15表示以表2中其他参比菌株的基因组DNA或者DNAFREEWATER（见表2中的BLANK）作为模板的扩增曲线（曲线编号与表2中编号一一对应）。表2引物、探针的特异性试验结果编号标准或参比菌株名称及菌号扩增结果（Ct值）1ZygosaccharomycesrouxiiCGMCC2.19152ZygosaccharomycesrouxiiCICC14173ZygosaccharomycesrouxiiCICC312594SaccharomycescerevisiaeCGMCC2.18825RhodotorulaglutinisCGMCC2.07036PichiacarsoniiCGMCC2.19087CandidaparasilosisCGMCC2.18468ZygosaccharomycesbisporusCGMCC2.15959DekkerabruxellensisJCM1140710PichiaspartinaeJCM1074111AspergillusnigerATCC1640412E.coliATCC2592213Staphylococcusaureus5-3，分离自样品14AlicyclobacillusDSMZ392215BLANK**19.2822.0122.71N*NNNNNNNNNNN 注：*表中“N”表示“UNDETECT”；**表示以DNAFREEWATER为模板，即空白对照。2.2分离自蜂蜜样品的未知酵母实时荧光PCR方法快速鉴定结果使用针对Z.rouxii实时荧光PCR方法鉴定用的探针和引物，以分离自蜂蜜样品的62株未知酵母的DNA为模板，使用ABI公司生产的反应预混液（2╳TaqManUniversalMasterMix，ABI）（Cat.No.：4427788）配置20μl反应体系，使用1.3.2中的扩增条件，对分离自食品样品的62株未知酵母进行快速鉴定。鉴定结果发现，所有被鉴定的60株嗜渗酵母中，有21株Ct值与阳性对照鲁氏接合酵母标准菌株相近，判断其为鲁氏接合酵母；其他41株为与鲁氏接合酵母不同的酵母。进一步鉴定将继续进行。鉴定结果见图2。图2分离自蜂蜜中的嗜渗酵母实时荧光PCR快速鉴定Fig.1DetectionofOsmophilicyeastisolatedfromhoneybyrealtimePCRmethod注：图2中，曲线1为以Z.rouxii标准菌株CGMCC2.1915的DNA为模板的扩增曲线；2-22为本实验室分离自食品中的嗜渗酵母中的Z.rouxii 属的阳性菌株的扩增曲线；23-63：为本实验室分离自食品中的嗜渗酵母中的非Z.rouxii属的菌株的扩增曲线；64为空白对照的扩增曲线。3.讨论本研究建立了蜂蜜中鲁氏接合酵母的实时荧光PCR快速鉴定方法，全过程仅需要5小时时间。此方法与传统生化鉴定方法（一般需要1-2周）相比，大大节约了鉴定周期，提高了工作效率。为蜂蜜中鲁氏接合酵母的快速、准确鉴定及溯源，以及蜂蜜及其制品的质量控制检测，提供了技术手段。并且用所建立的方法从本所微生物室分离自食品的62株嗜渗酵母中，鉴定出21株Z.rouxii属的酵母。本方法及所分出的嗜渗酵母的相关研究，将继续进行。参考文献[1]AllenKL,MolanPC,ReidGM.AsurveyoftheantibacterialactivityofsomeNewZealandhoneys[J].JPharmPharmacol1991,43(12):817-822[2]AnthimidouE,MossialosD.AntibacterialactivityofGreekandCypriothoneysagainstStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosaincomparisontomanukahoney[J].JMedFood2013,16(1):42-47[3]OlaitanPB,AdelekeOE,OlaIO.Honey:areservoirformicroorganismsandaninhibitoryagentformicrobes[J].AfrHealthSci2007,7(3):159-165.[4]SnowdonJA,CliverDO.Microorganismsinhoney[J].IntJFoodMicrobiol1996,31(1-3):1-26[5]OlivieriC,MarotaI,RolloF,etal.Trackingplant,fungal,andbacterialDNAinhoneyspecimens[J].JForensicSci2012,57(1):222-227[6]ParkYK,KooMH,OliveiraIM.Biochemicalcharacteristicsofosmophilicyeastsisolatedfrompollensandhoney[J].BiosciBiotechnolBiochem1996, 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