《诺贝尔化学奖》PPT课件 14页

1993年诺贝尔化学奖KarymullisandMichaelSmithPcr技术彭梦露制作 PressRelease:The1993NobelPrizeinChemistry13October1993TheRoyalSwedishAcademyofScienceshasdecidedtoawardthe1993NobelPrizeinChemistryforcontributionstothedevelopmentofmethodswithinDNA-basedchemistry,withhalftoDrKaryB.Mullis,LaJolla,California,U.S.A.,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method,andhalftoProfessorMichaelSmith,UniversityofBritishColumbia,Vancouver,Canada,forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentofoligonucleotide-based,site-directedmutagenesisanditsdevelopmentforproteinstudies. IntroductionPolymerasechainreaction(PCR)hasrapidlybecomeoneofthemostwidelyusedtechniquesinmolecularbiologyandforgoodreason:itisarapid,inexpensiveandsimplemeansofproducingrelativelylargenumbersofcopiesofDNAmoleculesfromminutequantitiesofsourceDNAmaterial--evenwhenthesourceDNAisofrelativelypoorquality.PCRinvolvespreparationofthesample,themastermixandtheprimers,followedbydetectionandanalysisofthereactionproducts TheapplicationsofMullis"PCRmethodarealreadymany.ItisforexamplepossibleusingsimpleequipmenttomultiplyagivenDNAsegmentfromacomplicatedgeneticmaterialmillionsoftimesinafewhours,whichisofverygreatsignificanceforbiochemicalandgeneticresearch.Themethodoffersnewpossibilitiesparticularlyinmedicaldiagnostics,andisused,forexample,fordiscoveringHIVvirusorfaultygenesinhereditarydiseases.ResearcherscanalsoproduceDNAfromanimalsthatbecameextinctmillionsofyearsagobyusingthePCRmethodonfossilmaterial. 原理简介：PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制。由于DNA复制是半保留的，两条链都可以作为模板。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。 何为Pcr技术？Pcr:Polymerasechainreaction就是反复进行包括热变性——退火——引物延伸三步骤的循环过程。1.热变性：基因组DNA在95度下加热5分，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。2.退火：将反应混合物降温至55摄氏度，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板——引物复合物。3.引物延伸：迅速加入TaqDNA聚合酶，混匀。置反应混合物于70摄氏度，一分钟，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从引物3’端开始，沿着5’—3’的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。经上述变性---退火---引物延伸这一循环，双链DNA拷贝数增加一倍。进行n次循环，拷贝数将增加2的n次方倍，如进行25—30个循环，拷贝数即扩增上百万倍。 ThePCRmethodcanbeusedforreduplicatingasegmentofaDNAmolecule,e.g.fromabloodsample.Theprocedureisrepeated20-60times,whichcangivemillionsofDNAcopiesinafewhours. PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。后来，从耐热菌株Thermusaquaticus纯化出耐热的DNA聚合酶TaqDNAPolymerase,具有极好的热稳定性。 操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10×PCRbuffer               5μldNTPmix（2mM）4μl引物1（10pM）2μl引物2（10pM）2μlTaq酶（2U/μl）1μl       DNA模板（50ng-1μg/μl）1μl加ddH2O至50μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1)生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)由少量mRNA生成cDNA文库；(3)从cDNA中克隆某些基因；(4)生成大量DNA以进行序列测定；(5)突变的分析；(6)染色体步移；(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。 toreallyworkinbiology,trainingisagoodthing.It"sadeepsubject,andinmanywaysquitedissimilartocomputerscienceorelectricalengineeringorsimilarfields.Ithasmanysurprises,andthewhole"wetlab"experimentalapproachishardtogetoutofbooks. 谢谢！