聚乙交酯壳聚糖混编织物的制备与性能 90页

天津人学硕士学位论文摘要摘要为满足承载组织重建的需要，组织工程学要求人工支架既要具有良好的生物相容性以及分子响应性，又要具有优异的力学性能。因此，将人工合成生物材料与天然生物材料进行复合，并制备与待修复组织承载需要相匹配的人工支架，就成为支架材料研究的重要问题。本文以聚乙交酯(PGA)纤维为基材，采用壳聚糖纱线与之进行混编，以期达到调节PGA降解产物的酸性并引入活性位点的日的。通过体外降觯以及兔关节软骨缺损模型实验，评价了混编材料的降解性能以及生物相容性。体外降解结果表明，壳聚糖的存在可中和PGA降解产生的酸性产物，从而起到调节DH值的作用：动物实验表明，壳聚糖的引入使得PGA／壳聚糖混编材料具有较PGA更好的生物相容性。采用三维编织的方法制备三维支架，通过比较不同类型壳聚糖三维织物和小同比例PGA／壳聚糖混编三维织物的力学性能，来考察三维编织在组织_L程化肌腱／韧带中应用的可行性。结果表明对于PGA／壳聚糖混编三维织物，当其每束编织纱含2根壳聚糖纱线和4束PGA纤维时，其平均拉伸载荷为1467MPa，推测在体内条件下可以满足肌腱／韧带修复的力学要求。本文的工作表明，三维编织方法制备的PGA／壳聚糖混编织物具有良好的生物相容性和力学性能，适于承载组织的修复与重建。该三维混编织物在组织修复中将具有潜在的应用前景。关键词：聚乙变酯壳聚糖混编体外降解三维编织体内实验 天津火学硕士学位论文摘要AbstractTissueengineeringdemandsartificialscaffoldstohavegoodbiocompatibility，molecularactivityandexcellentmechanicalproperties，tosarisfytheneedoftissuereconstruction．Therefore，compoundingsyntheticbiomaterialswithnaturalbiomaterialsmadpreparingartificialscaffoldswhichhavethemechanicalproperficsmatchingwiththisdemandsofreconstructedtissuearethekeyproblemstoconceYflforthestudyofscaffoldsmaterialsInthisstudy，polyglycolide(PGA)fiberswereappliedasrawmaterials，whilechitosanfiberswereusedtohybridwiththemTheaimwastochangetheacidityproducedbydegradationproductsofPGAandtointroducetheactivegroup．ThedegradationpropertiesandbiocompatibilityofthePGA／chitosanhybridbraidswereestimatedbyinvitrodegradationandrabbitarticularcartilagedefbctmodel．TheresultsofinvitrodegradationsuggestedthatthePGAacidproductsmaybeneutralizedbythechitosanandthepHvaluewasregulatedTheanimaltestresultindicatedthatthebiocompatibilityofthePGA／chitosanhybridbraidsbecamebetterbecauseoftheintroductjonofchitosanThree—dimensional(3-D)scaffoldswerepreparedby3-Dbraidtechnology．Inthisstudy，themechanicalpropertiesofdifferentkindsofchitosanbraidswereexamined．Themechanicalpropertiesof3-DhybridPGA／chitosanbraidswerealsomeasured’fheresultsindicatedthatwhenthebraidedyarnof3-DhybridPGA／chitosanbraidswasmadefromfourPGAbundlesandtwochitosanbundles，theaveragetensileloadofPGAJchitosanhybridbraidswas146．7MPa．ItwassupposedtobesuitablelbrthemechanicaldemandsoftendonorligamentrepairAsaconclusion，3-DhybridPGA／chitosanbraidshavegoodbiocompatibilityandpropermechanicalproperties．These3-Dhybridbraidswouldbepotentiallysuitablefbrtherepairandreconstructionofloadingtissue．Keywords：polyglycolide，chitosan，hybridbraid，invitrodegradation，3-Dbrmd，invivotest 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得叁洼盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：名岳未胡眵签字日期：矗"乒年，月手日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解鑫盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特授权盘叠盘芏可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。(保密的学位论文在解密后适用本授权说明)学位论文作者签名：刍岳立棚杠新签名：觎签字日期：沙铲年，月弓日签字曰期：了脚4年f月7日 天津大学硕士学位论文第一章绪论1．1_前言第一章绪论生物材料，也称生物医用材料，它是指对生物体进行诊断、治l?-}11置换损伤组织、器官或增进其功能的材料【1]。近年来，对组织取代物的需要日益严■格，要求材料既要具有适宜的力学性能，又要具有很小的宿主反应，并且要求表面具有所需化学、物理和生物特性。这使得生物医用材料的设计与制各逐渐受到重视，生物材料的应用领域得到了扩展[2]。自从美国学者Langer提出了组织工程的再生医学概念[3]，生物可降解材料作为人工支架的研究便日益广泛起来。人工支架常以生物可降解羟基聚酯如聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、乙交酯与丙交酯的共聚物和天然生物可降解材判如壳聚糖、明胶、胶原、海藻酸盐等制备[4，5]。天然生物材料的优点是组织相容性好，蕴含丰富的生物信息，但是其力学性能差，不易大量制备且批量fuJ材料性能有差异；人工合成材料具有结构的多样性和性能的可调性，但是缺乏生物活性基团。由此可见，无论是天然生物材料还是合成生物材料都有其不足之处。生物医学中对人工支架的要求是既要具有优异的力学性能，又要具有良好的生物相容性以及分子响应性，还要求具有与应用时问相匹配的降解速率，这才能满足组织重建的需要。对生物材料进行改性是弥补现有生物材料性能上缺陷的一种重要手段。通过改性使材料既具有合成生物材料优异的力学性能，又具有天然材料所蕴含的生物信息，将是很理想的改性结果。目前的改性主要是通过化学改性或物理手段来实现。人工支架的选择除对材料有很严格的要求外，支架的制备也是其应用到生物医学中的一个重要环节，因为支架的形状及其力学性能将直接影响到其在生物医学中的应用。目前已经有很多制备人工支架的方法，尽管各有所长，但没有一种方法可以同时满足所有组织修复的要求。材料的选择以及支架的制备等因素构成了生物材料所面临的工程学挑战。1．2生物材料的选择 天津火学硕士学位论文第一章绪论组织工程概念的提出，使得可降解生物材料的应用同益广泛，因此对生物材料的选择也日臻严格和完善起来。组织工程的定义是利用生命科学与工程科学原理构建人工合成的生物替代物，以促进细胞和组织生长，从而使受损组织或器官的功能得以恢复的一门学科[2，3，6，7】。组织工程概念的提出标志着医学将走出组织器官移植的范畴，步入到“制造”组织和器官的新时代，因此，无论是在皮肤、骨、软骨、肌腱、韧带的修复，还是周围神经、血管等的重建领域中，组织工程均受到广泛关注f8．12]。作为～种新兴的生物医学技术，组织工程的主要目的是促进组织重建[13，14】。组织工程的基本方法是在体外将组织细胞吸附扩敲于一种丑i物相容性良好并可被人体逐步吸收的三维多孔支架材料上，形成细胞／生物材料复合物。然后将此活性复合体植入机体内组织病损部位。种植的细胞在支架逐步降解吸收过程中，继续增殖并分泌基质，形成新的具有与自身功能和形态相似的组织和器官，从而实现对病损组织的重建，并达到永久性替代的目的。组织工程的三大要素是细胞、生长因子和支架材料[15]，其中，构建由细胞和支架结合的复合体，是组织工程的核心『161。目前，组织工程面临的挑战包括两方面，一方面是生物学的挑战，主要关于细胞及其来源问题，涉及自体细J抱和异体细胞、培养细胞或十宝出胞以及绌胞，基质复合物的应用【17]；另一方面是工程学的挑战，讨论支架及支架材制的制备及选择[18】。因此，大力研究和丌发生物相容性良好并可被人体逐步降解吸收的生物医用材料，是生物材料发展的重要方向。目前，组织工程应用的支架材料主要有生物降解高分子材料、生物无机材料及其复合材料。对于软组织修复，如软骨、皮肤、肌腱、韧带等，大多采用生物降解高分子材料作为组织工程支架。这类材料又可分为天然和人上合成捌荆两大类。1．2．1天然高分子材料2 天津大学硕士学位论文第一章绪论来源于自然界的天然高分子材料，如天然成分胶原纤维、采用藻酸盐类制成的胶体以及壳聚糖等，保留了组织正常的网络结构，且组织相容性好，是一种较为理想的组织工程支架材料[19]。1．2．11壳聚糖壳聚糖(chitosan)是甲壳素(chitin)B一(1—4)一2一乙酰氨基一2脱氧一D一葡聚糖脱乙酰化后的产物，其结构式为：壳聚糖是一种生物学特性优良的天然聚阳离子多糖类化合物，它具有良好的组织相容性、生物可降解性，且具有止血和抑菌作用，可调节免疫功能、促进组织修复、抑制结缔组织增生、减少瘢痕粘、调节胆固醇代谢等。壳聚糖还具有独特的分子结构、化学性质以及多种生物活性，而且结构疏松，因此，壳聚糖作为一种新型的生物材料，在医学界具有广泛的应用价值，它多被应用于伤口愈合促进剂、透析膜、生物活性物质控释载体、可吸收缝线、人T皮肤以及其他组织器官的修复等方面120．231。壳聚糖中的乙酰胺基结构单元也是糖胺聚糖的主要成分，两者具有相似的结构。糖胺聚糖可与生长因子、细胞受体和粘连蛋白特异性相互作用，因此壳聚糖也具有相应的生物活性[241。许多研究组研究了基于壳聚糖材料在动物体内的组织反应，结果表明这些材料只会引起很小的排异反应[251。从物理和化学性能t-．看，壳聚糖是一种半结晶的白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体，因原料不同和制各方法不同，相对分子质量也从数十万至数百万不等。壳聚糖的两项主要性能指标是Ⅳ_脱乙酰度和与平均分子量相关的粘度。脱乙酰度是指脱除乙酰基的甲壳素的百分比，它直接影响壳聚糖的溶解性，并且与壳聚糖结晶度成反比关系[24]。壳聚糖大分子链上分布着许多羟3 天津大学硕士学位论文第一章绪论基、氨基阻及一些Ⅳ-乙酰氨基，它们使壳聚糖分子内和分子削形成氢键，如C3．OH可与相邻的糖苷基(一O一)形成分子内氢键，也可以与相邻的另一条壳聚糖分子链的糖苷基形成分子问氢键。此外，C2-NH2、C6．OH也可形成分子内和分子间的氢键。由于这些氢键的存在形成了壳聚糖大分子的二级结构，使得壳聚糖有较高的结晶度和稳定的物理化学性质。壳聚糖不溶于水而溶于稀酸如醋酸。因为壳聚糖分子链上所含的游离氨基的氮原子上具有一对未共用的电子，致使壳聚糖呈现弱碱性，于是便能从溶液中结合一个氢离子，从而使壳聚糖成为带正电荷的聚电解质(可看做是一种高分子盐)，破坏了壳聚糖分子间和分子内的氢键，使之溶于水。因此，实际r不是壳聚糖溶于稀酸中，而是带阳离子的壳聚糖电解质溶于水中。壳聚糖的溶解受脱乙酰度、相对分子质量和酸的种类的影响。脱乙酰度越高，游离胺基越多，越易溶于水；分子量越大，分子链缠绕越厉害，溶解度越小。壳聚糖分子链上含有大量的胺基和羟基，可以发生许多化学反应，从面可以对壳聚糖进行化学修饰。例如，可通过酰化、羧甲基化、氰化、醚化、烷基化、硫酸酯化、醛亚胺化、叠氮化、接枝以及交联等反应制备不同的衍生物。这些壳聚糖衍生物具有不同的物理化学性质，具有广阔的应用前景。1．2．1．2胶原／明胶胶原是人体和哺乳动物体内的主要结构蛋白，是支持组织的主要成分。胶原蛋白中含有大量的氨基酸、脯氨酸和羟脯氨酸。胶原蛋白的基本单位称为原胶原蛋白分子，该分子定向排列整齐，分子之问通过共价键交联，形成胶原微纤维，再聚集成胶原纤维。胶原由三条不同的多肽链作螺旋状缠绕而成的绳索状长分子(如图1—1所示)。按其氨基酸排列的‘级结构划分，共有18-20种在遗传方面独特的多肽链。根据这些肽链所构成的分子，可将胶原蛋白分为11种类型以及一些小胶原。如成纤维细胞的细胞外基质中胶原类型为I型，而关节软骨细胞的细胞外基质中则富含II型胶原[26，27]。胶原是应用最早和使用最成熟的生物材料之一，可用于皮肤、软骨、骨和神经等组织的修复重建。胶原基仿生材料，包括水溶性胶原以及胶原和聚丙烯酸、胶原和聚乙烯基磺酸钠等的杂化材料[281。4 天津大学硕十学位论文第一章绪论明胶是一种将胶原三螺旋结构化为无规则链而获得的蛋白质，冈而具有牛物可降解性以及良好的生物相容性。明胶没有非常严格的定义，一般认为是胶原经由如下两个步骤得到的产物，一是轻微加热，解除其三维螺旋结构，成为了单一的线形分子；二是使部分共价键水解断裂，破坏其肽链的完整。明胶无抗原性，易制备成浓溶液。明胶具有良好的生物相容性和低廉的价格，因而被广泛应用于组织工程领域[291。晰即，晰l咖／(a)氨基醯序勒鲭构(b)l缶a链砷左手螺谴结拇和3母口链形盏的右手三髓螺螳蛄构(c)原纤堆的泉集结构12．1．3海藻酸盐图1-1胶原的化学结构示意幽Fig．1-1Chemicalstructureofcollagen海藻酸盐的主要成分藻酸是D一甘露糖醛酸(M)5}11L一葡萄糖醛酸(G)的共聚物。因为海藻酸盐具有温和的凝胶条件和良好的生物相容性，因而在生物材料领域中得到广泛使用。海藻酸盐的主要来源是褐藻。出于对离子的选择性，海藻常以不溶的凝胶形式存在，系由存在的钙离子交联。来源不同，组成比例不同，物理和机械性质也就不同。同种单体单元的长度决定其性质，富含葡萄糖醛酸单元的海藻酸钙是硬质材料[30，31]。5 天津火学硕十学位论文第一章绪论海藻酸钠的敏感二价离子Ba2m，Sr”，Ca”。敏感性随葡萄糖醛酸单元含量增加而增大，聚甘露糖醛基本没有敏感性。可用海藻酸酶调整甘露糖醛酸／葡萄糖醛酸比例，达到改性效果。海藻酸盐可在温和条件下凝胶，加入Mg”凝胶化能避免细胞免疫性。这使得海藻酸钠成为十分有前途的可注入性生物材料。海藻酸盐被广泛用作细胞免疫隔离基质、软骨组织工程的可注入基质等[321。122合成高分子材料用化学方法合成的生物降解高分子，由于其结构的多样性和性能的a删d性，能够充分满足实际应用对其性能多方位的要求，因而在医药、农业及环境保护方面有广泛的应用前景，引起了研究者的极大兴趣。在过去几十年所卅：发研究的生物降解高分子中，主链上⋯般含有可水解的酯基、酰氨基或服基，其中脂肪族的聚酯更令人感兴趣。其主链上的酯基，很容易受到微生物分泌的酶的攻击，或者进行单纯的水解反应，因而具有很好的生物降解性和生物相容性。对于合成高分子材料来说，目前国内外使用较多的有聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、乙交酯和丙交酯的共聚物等。这些材料具有强度高、来源充足、易加工、降解速度可调等优点，因而被广泛应用于组织工程领域[33．34】。1．221聚乙交酯聚乙交酯(polyglycolide，PGA)又名聚羟基乙酸，是最简单的线形脂肪族聚酯，它可以由乙交酯开环聚合而成，如图1．2所示。与其他生物降解高分子相比，PGA是结晶度很高的聚酯，分子链能够进行紧密的堆积和排列，冈而它有许多独特的物化和力学。t生能[351。PGA是一种硬而且韧的聚合物，其熔点为224--228。C，玻璃化温度为36。C[36]。当分子量为20000到145000时，PGA可被纺丝成纤维[37]。PGA不溶于大部分有机溶剂，只溶于极少量溶剂，如六氟异丙醇。在较高的结晶状态下，PGA具有很好的力学强度，拉伸模量一般为7．0GPa，伸长率为15-20％f381。6 天津大学硕士学位论文第一章绪论一H￡6‘C／IIoOH+镍u—DH20——卡彳0呱。导0册七●l强醇磁敦弘图1-2聚乙交酯的合成过程Fig．1-2SynthesisprocessofPGA．PGA的降解是水解反应，主链上的酯基发生断裂，生成低聚物或小分子。降解速率主要取决于聚合物的分子量、结晶度、样品的几何形状和降解的环境等。与其他脂肪族聚酯相比，PGA尽管具有很高的结晶度，但由于其主链上存在酯基，使得PGA具有很好的亲水性，因而具有很快的降解速率。PGA具有很好的组织相容性，已经通过美国FDA验证，因而在医学领域获得了广泛的应用。1．2．2．2聚丙交酯聚丙交fl目(polylactide，PLA)是合成的生物可降解线性高分子材料。PLA分子中有一个不对称的碳原子(结构式1—2)，因此有两种光学异构体，可形成四种不同构型的聚合物：两种立体规整性构型，右旋聚乳酸和左旋聚乳酸fD构型和L构型)，可表示为D—PLA和L—PLA；一种外消旋构型的聚乳酸表示为DL．PLA；第四种是内消旋构型，在实际中很少使用[35]。O||10—q卜q茅cH3(1-2)7琏e、00C＼。 天津大学硕士学位论文第一章绪论由于PLLA分子中的不对称碳链为规整构型，因而形成半结晶聚合物，熔点约为185。C，具有优良的力学强度并且降解吸收时间很长(一般为3～35年1，可用于承载组织修复制作成内置骨固定装置。与此相反，PDLLA分子中的不对称碳链为非规整结构，是无定型聚合物，玻璃化温度约65oC，降解和吸收速度较快，一般为3～6个月。这种聚乳酸有利于药物均匀分相在基质中，因此非常适用于药物控释系统，主要做药物控释的载体和软组织修复材料『39，421。1．223聚r己内酯聚￡-己内酯(poly￡一caprolactone，PCL)是￡-己内酯开环聚合的高结晶型聚合物，结构式如f1．31所示。降解速度比PLA慢的多，时问为2～4年，因此适合做长期植入装罱。PCL无毒，生物相容性好，制成的避孕装置(Capronorl已通过FDA的检验标准。由于它具有良好的药物通透性，常用于药物释放载体。PCL具有低熔点(57。C左右)和超低的玻璃化温度(一62。C左右)，室温下呈橡胶态，这是其独特于其他合成材料的地方。PCL可与其它聚合物如聚氧化乙烯(PEO)进行嵌段和接枝共聚，形成具有多组份微观相分离结构特征的聚合物。PGA在加入PCL之后硬度显著降低，两者的嵌段共聚物还被生产为商业名Monocryl⑩的单丝缝线。PCL良好的溶解性，低熔点以及容易与其它的高分子共聚共混等特性，极大的促进了其作为生物医用材料的研究【43，44】。曰_fO弋CH击c}1．3生物材料的降解(1-3)对于生物可降解材料来讲，无沧其用于组织工程支架还是用于药物释放，它的一个重要性能指标就是其降解性能。材料的降解速率是否与应用中需要的8 天津大学硕十学位论文第一章绪论时问相匹配是选择材料时所要考虑的一个重要因素。因此，对生物材料的降解性能进行评估非常必要[45—49]。聚合物的降解，从物理角度考虑，存在均相和非均相降解两种机制。当降解反应仅发生在聚合物表面时，为非均相降解，即表面水解，而均相降解则是降解反应在整个聚合物内发生，即本体降解。从化学角度考虑，聚合物的降解存在下列三种机制：1．疏水性聚合物通过主链上不稳定键的水解变成低分子量、水溶性分子：2．不溶于水的聚合物通过侧链基团的水解、离子化或质子化，变成水溶性聚合物；3不溶于水的聚合物水解掉不稳定的交联链变成可溶于水的线型高分子[50]。聚合物的降解可分为两大类，一类是聚合物在降解过程中吸收能量，使聚合物原始共价键断裂而形成离子键，聚合物分子量下降而发生降解：第二类是聚合物受水解而发生逆聚合反应而降解。聚o【一羟基酸酯即PGA，PLA及其共聚物，属于第二类聚合物，其含有不稳定化学键，在体内细胞外液中极易发生降解，其降解过程中的降解产物可参与机体内代谢活动，故这类聚合物又称为生物降解聚合物。聚。一羟基酸酯的生物降解性主要取决于聚合物本身的化学构型，其降解性可通过力学测试、分子量测定、同位素追踪、直接测量以及显微观察等方法进行评价[51]。对于聚n一羟基酸酯，其在pH值为7．4的磷酸盐缓冲溶液中的降解主要经过以下过程：首先，溶剂分子渗入到该聚酯材料内部，使得材料吸水溶胀；之后，聚酯材料链段开始r6I_：解，产生带有酸性基团的低聚物和小分子，导致周嗣环境口H下降，即产生酸性降解产物[521。在此降解过程中，当溶剂分子扩散到聚合物基质的速率大于聚合物本身的水解速率时，主要发生本体降解；反之，若溶剂分子扩散到聚合物中的速度小于聚合物本身水解的速度，则以表面水解为主[53]。通常认为聚Ⅸ．羟基酸酯在磷酸盐缓冲溶液(pH=7．4)中的降解是一个本体降解过程，这个过程受材料的几何尺寸、形状、结晶度以及周围环境的pH值的影n1自][54—56]。14支架及其制备9 天津大学硕士学位论文第一章绪论对于组织工程来说，材料的选择及其降解性能的研究是其先决条件，构建由细胞和支架结合的复合体是其核，15,[161。支架将直接影响到组织工程化组织的形态，由此支架制备显得非常重要。支架的制各要考虑到两方面因素，一是该支架是甭适于组织细胞的粘附、增殖和分化，即其生物学方面是否能满足组织修复的需要：另一方面是支架的物理性能是否能满足组织修复的要求，这要考虑到形状、力学要求等方而，这是对支架工程学方面的要求。1．4．1生物材料的表面改性无论是天然生物材料还是合成生物材料都存在不足之处。而生物材料表面的物理化学性质对于材料的组织相容性有着重要的意义，它要求生物材料能产生所期望的细胞和分子响应，以满足组织修复与重建的需求。阕此，生物材料的表面修饰就成为组织工程发展的关键问题之--[58]。目前，高分子生物材料的表面修饰大致可通过r述几条途径来实现：等离子体改性、接枝改性、表面基团转变以及生物活性分子的表面固定等。141．1等离子改性等离子改性是指利用低温等离子体中的电子、离子和自由基的物理利化学作用是高聚物表面改性。目前常用02、N2、NH3等反应性气体以及带有官能团的单体的等离子体。材料表面的化学结构或组成在等离子体的作用下发生明显变化，从而达到表面改性的作用[58]。141．2接枝改·陛接枝改性是指用偶联的方法将一种聚合物接枝到另一种聚合物表面或者是将带反应性官能团单体通过聚合反应接枝到聚合物表面，从而增强细胞的粘附能力并促进组织生长【59]。10 天律大学硕十学位论文第一章绪论1．4．13表面基团转变聚合物表面的基团转变是指利用聚合物本体材料中已经存在的基团的反应或通过主链侧基上某些反应活性高的基团或原子的反应，使聚合物表面产生小分子功能性集团[60】。1414生物活性分子固定化将生物活性分子中的某些基团与基质表面的反应性基团化学键合使其牢固地固定在生物材料表面是获得长期组织相容性的有效办法。通常要求材料表面具有一OH、一COOH、-NH2等反应性基团，使之与生物活性分子产生化学键合，从而设计出具有生物活性表面的改性聚合物f61】。如Gao等人用氢氧化钠(NaOHl对PGA纤维进行化学表面改性，使得PGA纤维表面粗糙，并在陔表面产生生物活性基团，从而大大改善了平滑肌细胞在其表面粘附的数量[621。1．4．1．5物理共混除了上述方法外，也有学者通过物理共混的方法达到材料表面的改性目的。Wang等人将PGA和壳聚糖杂混成多孔支架材料用于组织工程，实验结果表明壳聚糖能够提供大量的胺基，该基团有利于细胞的粘附、增殖和分化，从而使得这种杂混支架在组织工程中有着广阔的应用前景[s3]。1．4．2支架的制备对于支架的工程学方面的要求，需要考虑到其制备问题。支架直接影响到工程化组织的形态，因而制备适宜的支架并构建细胞和支架结合的复合体成为组织修复的核心。通常来说，理想的组织工程支架材料应具有以下特点：(1)一定的生物降解速度，控制支架材料的降解速率与组织细胞再生速度相匹配，支架在组织形成过程中应逐渐被降解，在完成组织再生后能立即被机体吸收，并且不影响新 天津大学硕士学位论文第一章绪论生成组织的结构和功能[16]；(2)良好的生物相容性，在体外培养时无细胞毒性，植入体内后，高分子材料及其降解产物不会引起机体炎症和排斥反应[63】；(3)具有与组织再生过程相适应的力学强度和物理形态【64】；(4)支架材料的细胞亲和性和粘附能力好[65]，且具有良好的表面活性，能促进细胞的粘附生长并为细胞在其表面的增殖提供良好的微环境；(5)具有特定的三维多孔结构，以提供细胞迁移增殖和基因表达的场所[16]：(6)无毒性和致癌性，无抗原性[66]。此外，支架材料的可塑性、支架材料对生物活性物质的释放等，都是设司+研究中应该考虑的重要因素。近年来已经发展了很多制各和加工方法以获得组织工程支架。这些方法主要包括相分离法、冻干法、静电纺丝法以及溶液浇铸法等。1．421相分离法相分离法是一种制备多孔高分子支架直接而有效的方法。相分离法包括液、液相分离，液一固相分离等[67，681。液一液相分离可以通过浸入沉淀法、热诱导相分离法等方法来实现。其中，浸入沉淀法是工业上生产多孔膜的重要方法，它是将聚合物溶液铺在支撑物上，形成一个薄膜，然后将其浸入到不良溶剂中，溶剂间彼此交换而导致沉淀，从而形成多孔膜。热诱导相分离是根据热力学原理诱导聚合物溶液发生液．液相分离，使其中’一相富含聚合物，随后冷冻干燥，除去溶剂，获得多孔聚合物网络结构的方法。这种方法近年来被广泛用于制备微孔膜和多孔支架[69，70】。液一固相分离法是采用单溶剂体系进行的相分离方法。采用这种方法所得的三维支架孔隙率可高达95％以上。无论是液-液相分离法还是液．固相分离法，它们所获得的支架及其形态都受到很多参数影响，比如聚合物类型、聚合物溶液浓度、溶剂／非溶剂比率以及冷却过程等。通过调节各个参数，可以制各出不同要求的多孔支架。1．4．2．2冻干法12 天津火学硕士学位论文第一章绪论冻干法是借助于将深度冷冻下的溶剂真空升华从而获得三维支架的一种方法(如图1—3所示)。通过冻干法所得支架的孔隙率和孔径大小在很大程度上依赖于实验条件，因此通过调控如聚合物溶液浓度、连续相体积分数以及乳液粘度等实验参数，可以达到对支架孔径和形态的调节[71]。图1_3冰粒洗出法过程图172l№1-3Theprocessoficeparticulateleachingmethod．1．4．2．3静电纺丝法13 天津大学硕士学位论文第一章绪论静电纺丝法(如图1-4)的基本原理是给聚合物溶液或熔体施加几千至几万伏高压静电，使溶液与接收屏之间形成高压静电场。处于细管端的溶液液滴表面会诱发产生高压静电荷，电荷间的排斥力与液体表面张力正好相反而形成Taylor锥。当电场加大到一定值，排斥力足以克服表面张力时，形成喷射细流。细流在喷射过程中溶剂挥发或固化，由于喷射细流在向接收屏运动过程中的不稳定性，最终在静止的金属网上接收的纤维排布混乱，形成无纺布状纤维毡(如图1-5)[74]。F高压电源——图1．4静电纺丝装置1731Fig．1-4Theprocess0feIectrospinniⅡg．图1-5典型无纺毡支架[741瞻1-5町曲lnonwoveamesh．14收屏纤维 天津大学硕士学位论文第一章绪论通过静电纺丝法获得的三维支架有很高的孔隙率和极大的比面积，更有利于细胞粘附。14．24溶液浇铸法溶液浇铸法也叫粒子滤沥法，是继PGA无纺织物之后出现的一种多孔支架制备方法，因为使用了一定粒径分布的水溶性粒子如NaCI盐粒等作致孔剂，从而制得一定孔径分布和孔隙率的组织工程多孔支架[751。通过溶液浇铸法所得支架内部的孔是高度互通的，但是其缺点是只能制备一定厚度的膜，而不能形成三维结构。除了上述方法之外，还有许多其他方法可以制备组织工程支架。比如纤维增强法、熔融成型法、原位聚合法、气体致孔法、快速成型法、无纺毡／纤维粘结法等等。每种方法均有其特点，但没有一种方法能够同时满足所有组织的要求，这方面有待于进一步的研究和丌发。1425三维织物支架近年来，发展了更多的方法制备三位支架。有学者将工程上制备三维结构的方法应用到组织工程支架的制备过程中。获得这种结构的方法有三维编织、针织、机织以及无纺布等(如图I-6所示)[76]。1，4．2．5．1机织织物由两组或更多组的纱线成90。交织而成。它在经向和纬向都展示很好的稳定性，在织物厚度方向(相当纱线直径的两倍)具有很高的布面密满度或纱线聚集密度。当前用于复合材料单纯或混杂的机织织物是简单结构，例如平纹、斜纹等。机织适用于窄幅或宽幅，筒状或瓶状的多经纬结构以及带或不带纬纱f无交织)纱线体系。1．4252针织织物15 天津火学硕十学位论文第一章绪论由一根或多根纱线形成绒圈织成。针织织物结构可变化，提供所有方向的拉伸，因此适合用深拉模压的复合材料。1．42．53编织织物图1-6几种支架结构示意图Fig．1-6Structuraldemonstrationofsoiitetypicalscaffolds．三维编织技术是二维编织技术的扩展，由纱线交递或正交交织通过移位形成整体织物结构。三维编织结构是延厚度的增强件，其损伤容限高，工艺性良好，可制成多种形状复杂的构件[761。通过三维编织获得的织物是完全整体的连续纤维的织造结构，三维编织技术采用纤维的连续交织而形成紧密网状结构，具有多轴向面内和面外纤维的方向；在编织方向上具有较好的力学强度，并且具有适宜的孔隙率，是一种较为理想的组织修复支架结构。但是，相对丁其他方法来说三维编织工艺比较复杂。142．54无纺布16 天津大学硕士学位论文第一章绪论无纺布是指高聚物通过熔融挤出、取向、切梳、针刺等工艺加工成型而得到的毡状物。将无纺布中互不相连的纤维粘结起来，可以做成具有表面积较大并有利于细胞粘附和生长的支架[77，78]。在这几种编织工艺中，通过三维编织获得的织物是完全整体的连续纤维的织造结构，它采用纤维的连续交织而形成紧密网状结构，具有多轴向面内和面外纤维的方向：在编织方向上具有较好的力学强度，并且具有较高的孔隙率，是一种较为理想的复合材料结构[79]。1．5组织修复的主要对象据统计，美国整形外科植入物的市场规模随着社会的老化而不断增大，预计到2020年将达到180亿美元，其中技术市场占100亿美元，组织培养相关生物产品占80亿美元[1]。组织工程主要是针对软组织和硬组织的缺损和修复。软组织主要包括皮肤、软骨、肌腱、韧带、血管以及角膜等；硬组织修复主要是指骨修复。1．51软骨软骨(cartilage)由软骨组织及其周围的软骨膜构成。软骨是固态的结缔组织，略有弹性，能承受压力和而4磨擦，有一定的支持和保护作用。胎儿早期的躯干和四肢支架主要为软骨，至成体，软骨仅分布于关节面、椎间盘、某些骨连接部位、呼吸道及耳廓等处。软骨组织由软骨细胞、基质及纤维构成。根摒软骨组织所含纤维的不同，可将软骨分为透明软骨、纤维软骨和弹性软骨三种[80]。透明软骨(hyalinecartilage)分布较广，成体的关节软骨、肋软骨及呼吸道的一些软骨均属这种软骨。新鲜时呈半透明状，较脆，易折断。透明软骨间质中的纤维为胶原原纤维，含量较少，基质较丰富。纤维软骨(fibrouscartilage)分布于椎间盘、关节盘及耻骨联合等处。结构特点是有大量呈平行或交错排列的胶原纤维束，软骨细胞较小而且少，常成行17 天津大学硕士学位论文第一章绪论分布于纤维束之间。H&E(苏木一伊红)染色切片中，胶原纤维染成红色，纤维束间的基质很少，呈弱噬碱性，软骨囊则呈强噬碱性。弹性软骨(elasticcartilage)分布于耳廓及会厌等处。结构特点是间质中有大量交织分布的弹性纤维，软骨中部的纤维更为密集。弹性软骨具有较强的弹性。从软骨的组织结构来看，软骨细胞是分散在致密的胶原纤维之中。因此，它具有柔韧性。软骨的生理功能主要有两个，一是固形，二是提供关节的支承面。但是软骨所在的部位不同其功能各异。在肋骨端头的软骨给予肋骨所要求的活动度；椎问盘部位的软骨承受脊柱负载，具有弹性，并能使脊椎骨稳定。长骨端头的关节软骨’在滑膜关节中作为骨的衬里材料，表现出非凡的润滑性能。此外，它还具有吸收冲击和承受负载的功能[81]。软骨组织内无血管，其再生和自修复能力极其有限，一旦损伤很难自身修复[82，83]。因此组织工程方法被寄予厚望，目前，组织工程化软骨的研究已经取得了长足的进展。如Freed等将人或牛的关节软骨细胞种植到三维多孔支架上，经过体外培养后移植到体内，成功获得了亮白的软骨组织[83]。曹谊林等将牛肋软骨细胞接种于具有人耳形状的PGA多孔支架后埋植于裸鼠皮下，成功的再造了人耳廓形态的软骨组织[84】。1．5．2肌腱和韧带肌腱(tendon)是使肌肉和骨骼相连接的组织；韧带(1igament)是连接骨骼与骨骼的组织。肌腱和韧带都是由平行有序排列的胶原纤维构成，成纤维细胞排列在纤维束之间。新鲜的结缔组织呈银白色，质地坚硬，但在某种程度上，它也具有一定的柔韧性[851。从结缔组织的结构和功能角度来讲，肌腱和韧带都属于“致密结缔组织”。所谓致密结缔组织是指一种以纤维为主要成分的固有结缔组织，纤维粗大，排列致密，以支持和连接为其主要功能[80]。其中肌腱属于规则的致密结缔组织，大量密集的胶原纤维顺着受力的方向平行排列成束构成肌腱，少量的基质和成纤维细胞位于纤维之间[86】。作为骨骼系统周围的胶原组织，其功能18 天津人学硕十学11i7：论文第一章绪论是使肌肉附着于骨或筋膜，并保证系统正常运动。肌腱必须适应某一方向上的张力，承受很高的拉伸载荷，并产生关节运动[871。韧带是以弹性纤维为主的致密结缔组织，又称“弹性纤维”。粗大的弹性纤维或平行排列成柬构成韧带，以适应关节运动。韧带具有强度高、弹性好的特点，呈现非线性黏弹性能。韧带中的力学受体可传感关节的位置以及肌力和关节的运动量【86]。运动中用力过猛会使肌腱／韧带承受过大拉应力，容易导致肌腱／韧带撕脱：其他意外事故如刀割伤、压轧伤等，也会导致肌腱／韧带缺损；疲劳或疾病也是导致肌腱，韧带损伤的重要原因之一。然而，肌腱／韧带组织自身修复能力极其有限[88]，缺损后往往不能自行修复。现代外科的发展，使人类修复缺损肌腱／韧带成为可能[19]。目前临床上应用的修复方法主要包括自体移植、同种异体移植、异种移植和人工肌腱／韧带[19，88—92]。白体肌腱／韧带(autogenoustendon／ligament)移植须从患者本人的健康部位切取肌腱／韧带组织以修复病损组织。此法会使供区功能和力学稳定性有一定损失[88]，并会因为新的缺损而增加创伤[90】。且自体组织供区十分有限，术后会遗留不同程度的并发症，故自体肌腱／韧带移植不是最佳治疗方法。同种异体肌腱／韧带移植(homografltendon／ligament)是从与病患同类的生物体内切取肌腱组织以修复病损组织。这种移植虽在形态方面与自体肌腱／韧带相似，术后早期可被宿主短时间接受，但随后可能发生排斥反应f141。异种肌腱／韧带移植(heterografttendon／ligament)是用不同物种生物肌腱／韧带进行修复，术后会引起相当快速的排斥反应。同种异体肌腱移植利异种肌腱移植虽然克服了自体肌腱／韧带移植的缺点，但由于移植后的免疫排斥反应尚不能完全克服，需长期使用免疫抑制剂，而由此产生的并发症有时是致命的，再加上供体来源的限制，以及医学伦理学方面的障碍，至今尚未能广泛用于临床[901。人工肌腱／韧带(artificialtendon)是在体外将肌腱／韧带细胞种植到三维支架上进行分离培养，然后植入体内，使肌腱／韧带细胞借助支架和营养物分化增殖，并生成新的肌腱／韧带[851。但是，人工合成肌腱／韧带植入体内后易导致感染和免疫排斥反应[881。由此可见，目前的这些替代方法都还存在许多缺陷，亟待研究人员加以解决。19 天津大学硕士学位论文第一章绪论科研工作者们在组织工程化肌腱的构建和材料选取方面已经做了大量工作。曲彦隆等人采用聚二氧杂环己烷(polydioxanone，PDS)、PCL、PLGA85／]5编织成三维梯度降解支架，在体内微环境诱导下形成的组织工程化肌腱，不但组织楣容性好，而且具有良好的力学强度[931。Akiko等人将取自予牛身上的I型胶原与编织的PLA三维织物进行杂化，对韧带进行修复，植入后发现有大量的成纤维细胞移入，并有新的血管生成，而三维织物在韧带形成过程中提供力学支持，使新生肌腱具有较好的力学强度[681。Laitinen等人将编织的左旋PLA进行体内测试，结果证明该植入物可阱使新形成的肌腱具有与诈常肌腱接近的力学性能【94]。1．53骨骨(bone)由骨组织、骨膜以及骨髓等构成。骨组织是峰硬而有定韧性的结缔组织[801。骨组织是人体中最坚硬的组织，在维持基体功能时有不可替代的作用。骨功能主要包括以下几个方面：保护体内器官；运动时为肌肉提供附着部位；产生红细胞和白细胞，白细胞为其他组织提供免疫保护，而红细胞与氧结合，是C一+、P043-以及其他重要离子的存储器[95—97]。由于创伤、感染、肿瘤以及发育异常等使骨丧失了一些骨质，而形成骨缺损。对于骨组织的修复，科研人员已经做了大量的探索研究。目前应用的骨修复材料主要是金属、陶瓷、高分子材料以及复合材料。每种材料都有它们各自的优缺点[98—1021。理想的骨替代材料应该是在组成与结构上与自然骨类似的仿生材料。因此有学者将羟基磷灰石等无机材料引入聚合物基多孔支架形成复合翩料或杂混材料，在提高材料力学性能的基础上，无机填料还调整了聚合物基体的降解和吸收动力学。Shikinam等人用锻塑法制备了HA粒子增强聚乳酸骨修复材料，其强度约为270MPa，明显高于皮质骨强度；弹性模量12GPa，与皮质骨相当，它已经用作骨折内固定装置[103，104]。Kikuchi等人以Ca(OH)、H3P04和胶原共沉淀制备羟基磷灰石／胶原生物复合材料，其弯曲强度约40MPa，模量为2．5GPa，达到皮质骨水平f1051。1．6面临的问题及展望 天沣大学硕士学位论文第一章绪论近年来，随着组织工程研究的进展，研究者发现构建组织工程化组织的关键是寻找适于细胞粘附、生长及功能分化的支架材料[106]。虽然组织工程中支架材料的研究与应用已经取得了一些成功，但是目前应用的材料或者存在生物相容性问题和降解性问题，或者存在力学性能较差、加工成形性能差等缺陷[63，64】，与理想的支架材料还有很大的差距。因此，研制合成材料和改性天然材料，使其成为符合要求的较为理想的支架材料是从事组织工程研究工作者的一个重要方向。也就是说，在研究生物材料的过程中，不仅要从材料的力学强度、降解性能、生物相容性等方面考虑，更要从材料的生理反应等方面进行设计，使材料产生所期望的细胞和分子响应，从而满足组织修复与重建的需求。对生物材料进行表面修饰足使材料产生分子响应的方法之一[107]。材料的表面修饰包括聚合物表面的基团转化和生物活性分子固定化。其中，聚合物表面的基团转化是指利用聚合物本体材料中已存在的基团的反应或通过主链侧基上某些反应活性高的基团或原子的反应，可使聚合物表面产生小分子功能基团；生物活性分子固定化是指将生物活性分子中的某些基团与基质表面的反应性基团化学键合使其固定在生物材料表而，是获得长期组织相容性的有效方法『108，109]。除此以外，支架的拉伸强度、不规则的三维几何形状及支架对生物活性物质的释放，都是设计研究中应考虑的重要因素。1．7论文工作的提出组织工程生物材料不仅要求能够满足组织修复所需要的力学性能，而且还要具有良好的生物相容性，更要求其产生所期望的分子和细胞响应性，使之有利于细胞的粘附、增殖和分化。此外，组织工程化支架还要具有适宜的孔隙率，才能满足组织重建的需要。这就需要从材料本身的性质和支架的制备两个方面来分别考虑。本论文从材料和加工两个角度出发，探索用于软组织修复的生物材料以及三维支架的制备。主要涉及一下几个方面：(1)从材料的角度出发，由于PGA力学性能好，但对细胞粘阳能力弱，且降解产生酸性产物，又PGA纤维本身特点具有局限性，使得其表面化学改性非2I 丞津大学硕士学位论文第一章绪论常困难。因此本实验采用壳聚糖纤维与PGA纤维物理混编，并希望呈碱性的壳聚糖能够对PGA酸性降解产物起中和调节作用，从而可能减轻甚至消除炎性反应，达到改善PGA纤维生物相容性的目的。(2)运用不同的三维编织方法分别制备不同的壳聚糖三维织物，在不同直径的情况下考察其力学性能并进行力学性能比较。采用合理的编织工艺以及选取适宜的直径，测定不同配比的PGA／壳聚糖三维织物的力学性能，同正常肌腱的力学性能进行比较，考察在肌腱修复中三维编织混编支架材料对力学性能的满足程度。(3)通过运用制备的材料对动物软骨进行修复，考察不同配比的PGA和壳聚糖混编材料在软骨组织修复中的可行性。 天津大学硕士论文第二章聚乙交酯样品的表征2．1前言第二章聚乙交酯样品的表征聚乙交酯(polyglycolide，PGA)Y．．名聚羟基乙酸(结构式2-1)，是最简单的线形脂肪族聚酯，它可以由乙交酯开环聚合而成。PGA是结晶度很高的聚酯，分子链能够进行紧密的堆积和排列，因而它有许多独特的物化和力学性能【35】。PGA熔点为224--228。C，玻璃化温度为36。C【36]。当分子量为20，000到145，000时，PGA可被纺丝成纤维【37]。o-40—CHckr2—1、本章通过圆相核磁、红外光谱以及光电子能谱等分析手段，对该PGA纤维状样品进行了表征。2．2实验部分2．2．1原料及仪器PGA纤维核磁共振波谱仪(FT-NMR)红外光谱仪(FT—IR)光电子能谱仪()(Ps)2．2．2固相核磁共振测试熔融纺丝制得，中国纺织科学研究院VarianUNITYPlus400美国BIO—RADFTS3000美国PHI-t600Perkin—ElmerCo．(美国) 天津大学硕士论文第二章聚乙交酯样品的表征将PGA纤维状样品放入样品管，用VarianIJlmTYPlus400型核磁共振波谱仪对样品进行扫描并记录其13CNMR谱图。2．2，3红外光谱分析将PGA纤维状样品均匀铺在夹具上，用BIO．RADFTS3000型傅立叶红外光谱仪(FT—IR)直接进行测试。2．2．4X光电子能谱分析PGA纤维状样品的XPS测试在PHI．1600型x光电子能谱仪()(Ps)上进行，激发源为MgK。(能量为1253．6eV)，荷电位移校正取Cls=285．0eV。2．3结果与讨论2．3．1”C-NMR波谱分析图2-1PGA纤维状样品的”C—NTVIR谱图Fig．2-113C二NM吸spectrumofPGAfibers． 天津大学硕士论文第二章聚乙交酯样品的表征对PGA纤维样品进行13C-NMR波谱分析，测试结果如图2-1所示。图中化学位移(6。)在16．68ppm处出现，表明材料中存在C—C单键，而6。=62，31ppm及3e=69．80ppm出现的双峰，表明材料中存在一C-O键；6。一132．65ppm表明材料中有双键存在，这个双键有可能时C=O双键。至于168．16ppm处出现的化学位移，推断其可能是官能团的化学位移或是边带峰。2．3．2FT—IR分析图2-2为PGA纤维样品的FI．m谱图Wavenumber(cm‘)图2-2PGA纤维的FI．IR谱图Fig．2-2TheFT-IRspectrumofPGAfibers．在图中1750cm‘1处出现了较强的吸收峰，这是C=O的伸缩振动所引起的吸收：在1417cm4附近出现了较弱的吸收峰，这是一CH2对称弯曲振动所引起的吸收；并在1150cm。处出现了波浪状弱吸收峰，是．CH2一COO．和C．O伸缩振动以及一OH面内弯曲振动偶合而产生的特征吸收，表明原料中含有羧甲基(一CH2一COO-)。在2000cm’1以后没有出现吸收峰，这可能是因为实验过程中光线从纤维状样品中透过所致。258§_g∞i-_ 天律大学硕士论文第二章聚乙交酯样品的表征2．3．3XPS分析本章对PGA纤维样品表面进行了分析，以期得到该纤维表面组成更详尽的具体信息。图2-3是PGA纤维样品的XPS谱图。PGA纤维显示了两个特征峰，分别对应于Cls(结合能，285eV)年DOls(结合能，532eV)。Nls出现特征峰可能是由于空气中的气体混入，而Si2p出现特征峰可能是由于PGA纤维染色时搀杂了少量的Si原子。b图2-3PGA纤维样品的XPS总谱Fig．2-3XPSsurveyspectrumofPGAfibers．图2-4所示为PGA纤维样品的C1sXPS谱图。谱图中显示了归属于烷基上的碳(即C-C键)的Cls的峰位285．0eV和对应C=O键的谱峰峰值289．1eV。这说明材料表面含有C．C和C=O。26 天津大学硕士论文第二章聚乙交酯样品的表征2．4本章结论BindingEnergy(eV)图2-4PGA纤维样品的ClsXPS谱图Fig．2-4XPScarbodlscorelevelSCaBspectrumofPGAfibers．综上所述，本章通过固相核磁、红外光谱以及光电子能谱等手段对PGA纤维样品进行TN试，从”C-NMR结果中可以看出样品种含有C—C、C=O以及C—O键；FI—IR谱图表明材料中含一CH2一COO．基团；XPS谱图进一步确定了材料表面含有C．C和C=O。由此可以进一步确定该样品是PGA。27 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯，壳聚糖ilii编材料体外降解性能研究第三章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究3．1引言聚乙交酯(polyglicolicacid，PGA)是一种结晶度很高的聚0【一羟基酸酯，可以通过熔融纺丝制成纤维[107，108】。PGA及其共聚物因具有良好的生物相容性、生物可降解性以及优良的力学性能，因而在组织工程、药物释放等领域中得到同益广泛的应用【82，109]。但是，PGA在降解过程中会产生酸性降解产物，会引起组织炎性反应：并且PGA纤维表面光滑，不存在生物活性基团，不利于细胞和生长因子的粘附[110，111]。又由于PGA纤维易降解，使得其表面化学改性较为困难。壳聚糖是自然界广泛存在的天然碱性多糖，无毒、生物相容性良好且无抗原性『112，113]。其吡喃糖环碳二位置上带有胺基，该基团的生物活性可促进细胞粘附。由于壳聚糖具有特殊的生物学性能，使得它在药学和生物医学中的应用非常广泛。但其力学性能较差，限制了它应用于受力环境下的组织修复。因此，因此本章采用壳聚糖纤维与PGA纤维物理混编，一方面考虑到壳聚糖上的胺基可能会对PGA酸性降解产物一乙醇酸起到中和调节作用，另一方面期望壳聚糖带入活性位点。本章由两种不同质量配比的PGA／壳聚糖纤维混编织物，与PGA和壳聚糖编织物对比，通过测试样品在降解过程中的失重、热性能、表面形貌、力学性能以及降解液的pH值变化来考察壳聚糖对PGA降解过程的影响。3．2实验部分3．2．1原料PGA纤维熔融纺丝制得，中国纺织科学研究院 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯，壳聚糖混编材料体外降解性能研究壳聚糖纱线KClNa2HP04KH2P04NaCl3．2．2仪器电子天平真空烘箱医用级，20支’脱乙酰化度DD=90％，丽。=9．57x105分析纯SartoriusB$201S1400E一2水浴摇床WB／OB7—45WBU45酸度计METTLERTOLEDO320扫描电镜力学实验机差示扫描量热分析仪PhilipsXL-30TestmetricM350—20KNPerkin．ElmerDSC73．2．3PGA／壳聚糖混编织物的制备青岛海生生物工程有限公司天津市元立化工有限公司天津市化学试剂厂天津市南开化工厂天津市元立化工有限公司德国SheldonManufacturingIng．(美国)MEMMERTGmvH+CoKG(德国)Mettler．ToledoInstrumentsCo．，Ltd(上海)荷兰RochdNe(英国)美国本实验中制备了四种织物：PGA、壳聚糖以及晒种不同比例的混编织物(如图3-1所示1。将24束PGA纤维分成三股按照普通方法编成辫状织物，称之为PGA织物；用同样的方法将9根壳聚糖纱线制备成壳聚糖织物；将22束PGA纤维和3根壳聚糖纱线混合成一束，再将其分成3股，其中两股各含7柬PGA纤维和l根壳聚糖纱线，第三股含8束PGA纤维和1根壳聚糖纱线，按照前述+支指每1千克纱线的i墨堕 天津大学硕士学位论文第二章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究方法编织成PGA质量含量约为75％的织物，称作“P／C．I”；“P／C．II”是将6束PGA纤维和8根壳聚糖纱线分成三份，其中两份各含2束PGA纤维和3根壳聚糖纱线，第三份含2束PGA纤维和2根壳聚糖纱线，按照P／C—I的编织方法制成，其中PGA的质量含量约为25％。将上述织物截成10cm长，用于体外降解测试。PGAchitosanP／C—IP／C-Il图3—1织物和混编织物外形Fig．3-1Appearanceofbraidsandhybridbraids．3．2．4体外降解用精度为0．1mg的电子天平分别精确称量每个样品。将同种织物以四个为一组，分别置于盛有10mI磷酸盐缓冲溶液(PBS)(pH=7．4)缓冲溶液的玻璃瓶中。再将玻璃瓶置于温度恒定为37。C水浴摇床中，控制摇床的摆动速度50rpm。每种样品都进行了为期1，2，3，4和5周的体外降解测试。玻璃瓶中的PBS缓冲溶液每隔48小时更换一次，并用MettlerToledo320型pH计测定替换出来的PBS缓冲溶液的pH值。每到一定的时间点，取出样品，用去离子水冲洗3次后，用滤纸吸干表面的水分。此后将样品下詈入真空烘箱于室温下干燥48h，取出样品，称重，质量记为m。根据下式计算样品的剩余重量百分含量：Remainedmasspercentage=(m／mo)×100％(1)式中，m。为样品初始质量。30 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究根据大量文献所提出的壳聚糖在pH=7．4的PBS缓冲溶液f37。C1中，经很长时间(大约26周左右)基本不发生降解的结论[114】，作者认为P／C-I和P／C-II混编织物的质量损失主要是由PGA纤维贡献。因此，在对P／C．I和P／C．II的数据处理上，将f1)式作如下改动：Remainedmasspercentage=(m／mP)×100％(2)式中，m，是指P／C—I和P／C．II混编织物初始样品中所含PGA纤维的质量。325差示扫描量热(DS0)分析精确称量干燥后样品5～8mg置入铝坩锅中，在Perkin-ElmerDSC7型差示扫描量热分析仪上测量样品的热性能。试样由30。C以10。C／min的升温速率升温至250。C。以熔融峰的最高点计为样品的熔点(T。)；并以峰面积计为PGA的熔融焓(AH。)。将计算所得的熔融焓值与结晶度为100％的PGA的熔融焓值(139J／g)相比较[115]，得到此时PGA的结晶度(xc)。3．2．6表面形貌观察将样品表面喷金后在PhilipsXL-30型扫描电子显微镜(SEM)下观察其表面形貌，并于500×的SEM图片中，用Photoshop软件测量降解不同时问的PGA纤维的直径。3．2．7力学性能测试在室温下用TestmetricM350．20KN拉力机测试样品的拉伸性能。将每种样品剪裁至50mIil，使用2500N传感器，每个样品做3．4个平行实验，并取平均值。保持样品初始夹持距离为30mm，拉仲速率12mm／min。3．3结果与讨论3l 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯，壳聚糖混编材料体外降解性能研究在五周内的体外降解过程中，PGA、P／C—I以及P／C—II三种织物无论是在pH值、质量还是在热性能、表面形貌、力学性能等方面都有显著变化；而壳聚糖织物在此过程中各方面性能都几乎未发生变化。3．3．1pH值变化图3—2描述了体外降解过程中浸有PGA、P／C．I、P／C．II以及壳聚糖织物的PBS溶液在不同时期各自的pH值变化情况。由图可以看出，浸有壳聚糖织物的PBS溶液的pH值曲线图在五周内非常平缓，这说明壳聚糖在37。c下的PBS缓冲溶液中五周内几乎不降解。这个结论与文献中报导的结论一致[114]。Time(weeks)图3—2浸有PGA。P／C-I，P／C-II及壳聚糖织物的PBS溶液pll值随降解时间的变化曲线Fig．3-2ChangesofpHvalueofPBSafterincubationofPGA，P／C-1，P／C-IIandehitosanbraidsfordifferentperiods．对于PGA、P／C．I以及P／C一11织物所处的PBS溶液来说，在前两周，PBS溶液的pH值下降很缓慢；从第二周开始该pH值开始显著下降；到第三周后它32 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究们的口H值又重新趋于缓和。即在第二周到第三周之间，这三种织物的pH值变化最为显著。这说明PGA是从第二周开始降解的，到了第三周，浸泡PGA和P／C—I织物的PBS溶液的pH值降低至6．2左右，而同期浸泡P／C—II织物的PBS溶液的pH值为6．9。且在三周之后浸泡P／C—II织物的PBS溶液的pH值基本趋于平稳状态，这可能是因为PGA不但自身发生降解，并有一部分与壳聚糖上的胺基发生相互作用；少量存在的PGA纤维在第三周后用肉眼基本已很难观察到，因此后来的pH值由壳聚糖纱线主导，从而趋于平缓。对于P／C—I织物，其所处的PBS溶液的pH值变化趋势与PGA所处的变化基本一致，这可能是因为少量存在的壳聚糖未能改善溶液的pH值，当其中的壳聚糖与PGA作用完全后，溶液的pH值便由PGA纤维的降解产物来主导，使之呈显著下降趋势。山上面的分析可以推断，壳聚糖在PGA的降解过程中与之发生了相互作用(如式3所示)，其结果是在一定程度上缓和了PGA降解所产生的酸性。一NH2+,-COOH——手州H3+一。OOC～3．3．2剩余质量对降解前和经过不同时间降解后的PGA、P／C．I、P／C．II以及壳聚糖织物的剩余质量进行测量，并按照式2对数据进行处理，所得结果如图3-3所示。图3-3中的曲线表明壳聚糖在五周内的降解过程中，质量变化很小，这个结果进一步证明了3．3．1中所得的“壳聚糖在37oC下的PBS缓冲溶液中五周内几乎不降解”这一结论。PGA、P／C．I以及P／C—II织物的质量变化很明显，并且通过曲线可以看出，两周后PGA、P／C．I以及P／C．II织物的质量迅速下降，这也说明PGA从第二周开始降解。此外，图3-3中P／C一1I织物的剩余质量在四到五周之间下降非常迅速，P／C—I织物也有类似现象。这可能有两方面原因：一方面可能凶为PGA纤维与壳聚糖的活性端基发生了相互作用(如式3所示)，从而使得加速了PGA纤维在降解过程中低聚物及小分子的生成；另一方面可能是因为PGA纤维降解的小分子产物扩散到溶液中，并随着溶液的更换而流失，从而引起曲线所示的质量下降迅速之现象。33 天津人学硕士学位论文第二章聚乙交酯／壳聚糖澎编材料体外降解性能研究掌一兰E叱∞罩Time(weeks)图3-3PGA，P／C-1，P／C—II及壳聚糖织物在PBS(pH7．4，37。c)溶液中剩余质餐随降解时间的变化曲线Fig．3-3RemainedmasspercentageofPGA，P／C—I，P／C—IIandchitosanbraidsafterdegradationinPBSatpH7．4and37。Cfordifferentperiods．3．3．3热性能分析图3-4～3—6是PGA、P／C—I以及P／C．II织物降解前以及降解后的DSCf}f|线，该图显示出每组样品中PGA纤维的熔融峰，随降解时间的变化都明显地向低温方向移动，熔点显著下降。这可能因为PGA是结晶度很高的聚c【一羟基酸酯，其分子链能够进行紧密的堆积和排列。当PGA在PBS缓冲溶液中降解的时候，通常认为小分子水先渗入PGA的非晶区，使得该区首先降解。因此，随着降解时I可的延长，非品区的降解程度愈来愈彻底，并逐渐消失，PGA的结晶度逐渐提高。同时，PGA在降解过程晶区被不同程度的破坏，结晶程度越来越不完善，晶粒变小，从而使得熔融峰向低温方向移动，熔点也显著降低。仲∞5；∞加∞∞∞∞∞佃 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究80200220图3-4PGA织物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解1(b)’2(c)"3(d)，4(e)，5(f)周后的DSC曲线Fig．3-4DSCthermogramsofPGAbraidsbefore(a)andafter1(b)，2(c)，3(d)，4(e)and5weeks(f)of／nvitrodegradationinPBS．1罢岳图3-5P／C．I织物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解1(b)，2(c)，3(d)，4(e)，5(f)周后的DSC曲线Fig．3-5DSCthermogramsofPIC-Ibraidsbefore(a)andafter1weeks(b)"2weeks(c)，3weeks(d)，4weeks(e)and5weeks(f)of抽vitrodegradationinPBS．35fo口口Q≥o一‰苗星 天津火学硕士学位论文第二章聚乙交酯，壳聚糖混编材料体外降解性能研究图3-6P／C—II织物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解l(b)，2(c)，3(d)，4(e)"5(D周后的DSC曲线Fig．3-6DSCthermogramsofP／C—IIbraidsbefore(a)andafter1weeks(b)，2weeks(c)，3weeks(d)’4weeks(e)and5weeks(1)of／nvitrodegradationinPBS．将不同阶段下各织物中PGA纤维的熔点以及熔融焓列于表3．1中，从表巾可以明显看出PGA的结晶度显著上升，但是其熔点却呈下降趋势。由表3-1可知，PGA织物中PGA纤维的熔融焓逐渐上升，计算得到其最大结晶度为62％。但是P／C—I和P／C—II织物中PGA纤维的熔融焓值变化波动较大，尤其是第三周以后，这两种织物中PGA的熔融焓呈现下降趋势，这可能是因为壳聚糖存在所造成的影响以及低分子产物随溶液而流失所致。36}oDc∞；oZ苗∞王 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯，壳聚糖混编材料体外降解性能研究表3-1PGA、P／C—I、P／C—H织物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解1(b)，2(c)’3(d)，4(ek5(D周后的DSC分析Table3-1DSCanalysisofPGA，P／C—landP／C-HbraidsbeforeandafterofinvitrodegradationinPBSfordifferentperiods．33．4表面形貌经五周后，由于在PBS溶液中降解，各个样品在形貌上产生了显著的变化。SEM结果如图3-7～3．10。图3．7是壳聚糖织物的表面形貌图。整个过程中壳聚糖基本没有显著性变化，只是其表面的纤维更加无序，这可能是因为实验过程中环境因素所致。PGA织物在降解前以及降解后的微观形貌图如图3-8。由图中可以看出，在整个降解过程中，PGA纤维的表面基本保持平滑，但其直径有显著下降。P／C—I和P／C．II织物降解前以及降解后SEM微观形貌分别为图3-9和图3—10。由图3-9可以看出，降解前P／C—I中较为直挺的部分为PGA纤维，且其表面非常光滑。第四周时，P／C—I织物中的壳聚糖开始出现凝胶化现象，一些壳聚糖化作胶状粘附于PGA纤维表面；而其中一些PGA纤维也发生了断裂，且纤维直径呈现一定程度的下降。第五周时，该织物发生了显著的变化，大量的壳聚糖胶状物出现在织物的表面，并且织物四周出现了大量的碎片，PGA纤维的直径也有所下降。这可能是因为壳聚糖在大量PGA酸性降解产物的环境下发生了溶解，从而产生胶状物附着在PGA纤维表面。图3．10中，P／C．II织物在降解前纤维排列规则有序，PGA纤维表面也很光滑；第暇周时，织物的表观几乎没有什么显著性变化，只是PGA纤维很紧密地互相粘附，且纤维直径显著下降，37 天津火学硕士学位论文第三章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究但其表面仍旧保持平滑：五周后，在织物中已经很难找到完整的PGA纤维；从纤维形貌的放大图上可以看到，大量的PGA纤维已经断裂。从不同时间段的PGA、P／C，I以及P／C—II织物的SEM形貌图中随机测量其中5根PGA纤维的直径并取平均值。以PGA纤维平均直径与降解时间作图如图3-11所示。结果表明，对于各个织物中的PGA纤维，其直径在第一周以及三到五周之间变化显著俨<0．05)：而在第二周到第三周之间，其直径变化没有显著性差异(P>0．05)。d图3．7壳聚糖织物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解2(b)，4(c)"5(d)周后的微观形貌图f50×)Fig．3-7SEMmierographsofchRosanbraidsbefore(a)andafter2(b)，4(c)and5(d)weeksofinvitrodegradationinPBS．(50×)通过观察SEM形貌图，没有发现PGA纤维在整个降解过程中出现裂纹，而纤维直径有些变细。通常认为PGA在水解过程中会产生酸性降解产物，对于体积相对大的PGA样品，如直径为3mm的棒[116]，酸性产物会因为来不及扩散到外界环境而在样品中产生一个由内到外的酸性不均衡现象，称之为“酸度梯度”现象。38 天津大学硕十学位论文第三章聚乙交酯，壳聚糖混编材料体外降解性能研究酸度梯度现象所引起的直接后果是样品内部的羧酸基团含量比表面高很多，从而引起“自催化现象”，使大体积样品内部产生空腔；如果样品尺寸很小，则降解产物易于被扩散到外界环境中，自催化现象减弱。f罔3-8PGA织物在降解前(a，b)以及在PBS溶液中降解4(c，d)，5(e，f)周后的微观形貌图．(放人倍数：a，e，e：50x；b，d，f．500x)Fig．3-8SEMmierographsofPGAbraidsbefore(a，b)andafter4weeks幢d)and5weeks(e，f)of／nvitrodegradationinPBS．(originalmagnification：a，c，e：50x；b，d，￡500x)39 天津大学硕士学位论文第二章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究f图3-9P／C．I织物在降解前(a"b)以及在PBS溶液中降解4(c，d)，5(e，D周后的微观形貌幽．f放人倍数：a，e，e：50x；b，d，f：500x)Fig．3-9SEMmicrographsofP／C—Ibraidsbefore(a，b)andafter4weeks(c，d)and5weeks(e，f)ofdegradationin／nvitroPBS．(Originalmagnification：a，e，e：50x；b，d，f．500x)40 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究f图3—10P／C—II织物在降解前(a，b)以及在PBS溶液中降解4(c，d)，5(e，f)周后的微观形貌图．(放大倍数：a，c，e：50x；b，d，n500×)Fig．3-10SEMmierographsofP／C-IIbraidsbefore(a，b)andafter4weeks(e，d)and5weeks(e，0of／nvitrodegradationinPBS．(Originalmagnification：a，c，e：50x；b，d，f．500×)41 天津火学硕士学位论文第三章聚乙交酯，壳聚糖混编材料体外降解性能研究．图3-11PGA、P／C-I及P／C-II织物中PGA纤维直径随降解时问的变化Fig．3-11DiameterchangesofPGAfibersinPGA，P／C-IandP／C—lIbraidsduringdegradationinPBS．3．3．5力学·|生能测试力学性能是支架材料的性能指标之一。因此本实验系统地测量了各个织物在不同降解阶段的拉伸性能。图3-12～3—15分别是PGA，P／C．I，P／C．II以及壳聚糖织物在降解前和降解后样品典型的拉伸载荷一形变曲线图。由图3-13可以看出，P／C—I织物的载荷基本上是以PGA纤维为主导，因此在前两周，该拉伸曲线反映为明显的结晶高聚物的行为；并且从其最大拉伸形变逐渐减小的趋势上可以推测出，随着PGA纤维的不断降解，P／C．I织物的力学性能也在逐渐的下降。图3—14中的曲线表明了P／C．II织物的载荷一形变基本上是以壳聚糖纱线为主导，因此其力学性能变化不大。图3—15的壳聚糖载荷一形变曲线表明壳聚糖在整个五周的水解过程中，最大载荷和伸长率都变化很小。42 天津火学硕十学位论文第二章聚乙交酯，壳聚糖混编材料体外降解性能研究图3—12PGA纵物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解1(b)，2(c)，3(d)，4(e)"5(D周后的载荷一形变曲线Fig．3-12Typicalload-elongationcurvesofPGAbraidsbefore(a)andafter1(b)，2(c)，3(d)，4(e)and5weeks(oof／nvitrodegradationinPBS．善曼Elongation(mm)图3．13PIC。I织物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解1(b)，2(c)’3(d)，4(e)，5(D周后的载荷一形变曲线rig．3-13Typicalload—elongationCHIVESofP／C—Ibraidsbefore(a)andafter1(b)，2(c)，3(d)，4(e)and5weeks(f)of／nvitrodegradationinPBS．43一N)焉3 天津火学硕十学位论文第二章聚乙交酯，壳聚糖混编材料体外降解性能研究Elongation(mm)图3—14P／C—II织物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解1(b)，2(c)’3(d)，4(e)，5(f)周后的载荷一形变曲线Fig．3-14Typicalload—elongationCHIVesofP／C·IIbraidsbefore(a)andafter1(b)，2(c)，3(d)，4(e)and5weeks(f)ofinvitrodegradationinPBS．邑焉Elongation(ram)图3．15壳聚糖织物在降解前(a)以及在PBS溶液中降解1(b)，2(c)，3(d)"4(e)，5(f)周后的载荷·形变曲线Fig．3-15Typicalload—elongationcurvesofchitosanbraidsbefore(a)andafter1(b)，2(c)"3(d)，4(e)and5weeks∞ofinvitrodegradationinPBS． 天津大学硕士学位论文第三章聚乙交酯／壳聚糖混编材料体外降解性能研究PGA，P／C—I，P／C．II以及壳聚糖织物在降解前以及降解过程中的最大载荷比较如图3—16所示。其中，壳聚糖织物的最大拉伸载荷在五周内变化很小，相互之间比较没有显著性差异(胗0，05)，这个结果进一步证实了前面实验所得的结论，即这壳聚糖在37。C下的PBS缓冲溶液中五周内几乎不降解。该曲线表明，PGA和P／C．I织物开始降解后的最大拉伸载荷与降解前相比均具有显著性下降俨<0．05)。到第五周，这两种织物的最大载荷达到最低值，即几乎完全丧失其力学性能。与此同时，P／C．11织物在第‘+周、第二周和第三周之间以及第四周和第五周之间力学性能变化显著垆