基于DNA折纸技术复杂纳米限域环境构建及功能探索 110页

基于DNA折纸技术复杂纳米限域环境构建及功能探索(申请清华大学理学博士学位论文)培养单位：化学系学科：化学研究生：王殿铭指导教师：刘冬生教授二○一七年四月 ConstructionandFunctionalExplorationofComplexNano-confinedEnvironmentBasedonDNAOrigamiDissertationSubmitted toTsinghua Universityin partial fulfillment of the requirement for the degree of DoctorofPhilosophyinChemistrybyWangDianmingDissertation Supervisor:Professor Liu DongshengApril,2017 摘要摘要细胞内各种生化反应及新陈代谢过程均是在限域环境中进行的。细胞内限域环境包含细胞质中的大分子限域、生物膜结构为膜蛋白等提供的限域环境以及由膜围绕形成的各种细胞器组成的微纳尺寸局部限域环境。限域环境对于维持细胞正常生理功能意义重大，它们调节生物分子的组装和修饰、为生化反应及物质运输提供特异性环境以及精确调控着细胞内物质和能量的传输。体外构建模拟细胞内限域环境的策略主要分为两类，即宏观尺度构建及微纳尺度构建。目前科学家们已开发出多种在微纳尺度构建限域环境的体系，如囊泡、胶束、微凝胶等。然而，如何精确调节限域环境尺寸，调控限域环境中各分子的数目和位置仍然是该领域面临的重大问题。DNA折纸技术作为结构DNA纳米技术的重要分支，已被广泛的用于构筑各种微纳尺度精细组装结构。本文利用DNA折纸技术构建了尺寸精确可控的复杂纳米限域环境，并探究了纳米限域环境对物质传输、酶促反应、分子组装等行为的影响。首先，本论文利用DNA折纸技术构建了响应型纳米限域环境——可控开阖纳米孔道。通过控制孔道端口处单双链变化来实现孔道的可控开阖，并进一步对纳米尺度限域环境下物质传输进行调控。孔道内部精确固定级联反应两个酶，当孔道关闭时，可有效限制底物分子自由扩散进入孔道内，从而降低酶促反应效率。本论文还对孔道尺寸进行了扩展，开发了不同尺寸的响应型纳米限域孔道。其次，本论文利用DNA折纸技术与框架诱导自主装技术相结合，构建了纳米膜限域环境，膜由苄醚型树状分子（DDOEG）构成。在每个膜内精确定位四个脂肪酶，该纳米限域膜会对溶液中的疏水底物分子进行富集，从而提高膜内酶促反应效率。同时，本论文也证实了该限域膜对底物富集的选择性及对其内部酶具有保护作用。最后，本论文利用DNA折纸术与DDOEG分子结合构建限域疏水纳米孔道，利用该疏水限域环境诱导温敏性双亲分子DNA-b-PPO在孔道内部组装，并证明组装体为胶束结构。通过DNA折纸的可设计性，可精确调节组装体在孔道内位置。同时，我们还利用该限域环境中诱导组装体富集溶液中正硅酸乙酯，实现二氧化硅的原位可控生长。关键词：纳米限域环境；DNA折纸术；纳米孔道；纳米限域膜。I AbstractAbstractIntracellularconfinedenvironmentplaysanimportantroleinmaintainingthebasiccellularfunctionssuchasregulatingthepathwaysofbiomolecularassemblyandpost-modification,providingspecificconditionsforbiochemicalreactionsanddirectingprecisetransportofsubstances/enegy.Theintracellularconfinedenvironmentcanbedefinedasthemacromoleculesinthecytoplasmconfiningbiologicalreactions,membranesconfiningmembraneproteinsororganellesconfiningseriesrelatedmetabolicprocessestorealizecertainfunctions.Twostrategiestosimulatetheintracellularconfinedenvironmentinvitrohavebeenproposed:macro-scaleconstructionandmicro/nano-scaleconstruction.Avarietyofmimickingsystemsinmicro/nanoscalehavebeenwelldevelopedduringlastdecades,suchasvesicles,micellesandmicrogels.However,itisstillamajorchallengetoaccuratelycontrolthesizeoftheconfinedenvironmentandpreciselyregulatethenumberanddistributionofthemoleculesinit.BasedonthedevelopmentofstructuralDNAnanotechnology,DNAorigamihasbeenwidelyusedtobuildavarietyofnano-scalestructures.Inthisthesis,wehaveappliedDNAorigamitoconstructcomplexconfinedenvironmentwithprecisesize,andfurtherexploredthebehaviorofbothenzymaticreactionandmolecularassemblyinconfinedenvironment.Firstly,aswitchableDNAorigaminanochannelhasbeenconstructedwitharesponsivenano-confinedenvironment.TheDNAnanochannelwasdesignedwithashutteratoneend,whichcouldbereversiblyswitchedbetweenopenandclosestate,throughtheDNAchainexchangereactions.TheopeningandclosingoftheshutterinfluencedthetransportofmaterialsthroughthisnanochannelandtheprocesseshavebeenvisualizedbyaGOx-HRPenzymaticcascadereaction.Tofurtherrevealthemechanism,takingadvantageofthedesignabilityofDNAorigami,confinednanochannelswithdifferentchannelsizehavealsobeendesignedandinvestigated.Secondly,wehaveconstructedananomembrane-confinedenvironmentthroughtheframe-guidedassemblyonthebasisof2DDNAorigamitemplate.Thenanomembraneisconstitutedbythedendrimer-basedmolecule(DDOEG).Lipasesareembeddedinthemembrane,II AbstractwhosenumberandpositionarepreciselycontrolledbythedesignofDNAorigami.Thisconfinednanomebranecouldenrichthehydrophobicsubstratetotheenzymes,whichhasimprovedtheefficiency,comparingwiththefreeenzymes.Duetothecompositionofthemembrane,substrateselectivityhasbeenobserved:onlythosehydrophobicmoleculeswitharomaticgroupscouldbeenriched.Itwasalsobeenprovedthatthisconfinedmembranecouldprotecttheembeddedenzymesfromproteasedegradation.Atlast,wehaveconstructedhydrophobicconfinedtemplatethroughDNAorigamiandDDOEGtodirecttheassemblyofDNA-poly(propyleneoxide)withinit.Theassemblyexhibitsamicellarstructureintheconfinedenvironment,withasizethatmatchesthenanochannelport.ThroughtuningthedesignofDNAorigami,wecanaccuratelyadjustthepositionofassemblyinthenanochannel.Furthermore,ithasbeenobservedthattheassemblyintheconfinednanochannelcouldalsoenrichorthosilicateinsolutionandfurthercontrolsthegrowthofsilicainsitu.Keywords:nano-confinedenvironment;DNAorigami;nanochannel;nanomembrane.III 目录目录第1章引言................................................................................................................11.1生命体内的限域环境.......................................................................................11.1.1生命体中限域环境的分类........................................................................11.1.2生命体中限域环境的功能........................................................................21.2体外构建限域环境...........................................................................................61.2.1宏观尺度构建............................................................................................61.2.2微纳米尺度构建........................................................................................71.3结构DNA纳米技术.......................................................................................111.3.1DNAtile自组装......................................................................................121.3.2DNA折纸技术.........................................................................................151.4课题提出.........................................................................................................17第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控......182.1本章引言.........................................................................................................182.2实验部分.........................................................................................................192.2.1试剂与材料..............................................................................................192.2.2实验仪器..................................................................................................202.2.3实验操作..................................................................................................202.3结果与讨论.....................................................................................................222.3.1响应型可控开阖纳米孔道的设计与表征..............................................222.3.2酶-DNA缀合物的表征...........................................................................262.3.3DNA-酶缀合物与折纸孔道组装............................................................272.3.4比较孔道在打开和闭合状态下酶级联反应的效率..............................282.3.5探究孔道上门控位置对酶级联反应影响..............................................302.3.612nm直径可控开阖纳米孔道...............................................................322.4本章小结.........................................................................................................34第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响..............................................353.1本章引言..........................................................................................................353.2实验部分..........................................................................................................363.2.1试剂与材料..............................................................................................363.2.2实验仪器..................................................................................................373.2.3实验操作..................................................................................................37IV 目录3.3结果与讨论......................................................................................................403.3.1含酶纳米限域膜体系设计......................................................................403.3.2含酶纳米限域膜制备及表征..................................................................413.3.3探究纳米限域膜对其中酶促反应的影响..............................................453.4本章小结..........................................................................................................50第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装..............................514.1本章引言..........................................................................................................514.2实验部分..........................................................................................................524.2.1试剂与材料..............................................................................................524.2.2实验仪器..................................................................................................534.2.3实验操作..................................................................................................534.3结果与讨论......................................................................................................554.3.1DNA折纸孔道设计.................................................................................554.3.2DNA纳米限域环境构建及诱导双亲分子组装.....................................564.3.3伸链向外DNA折纸孔道构建及其诱导组装行为研究........................594.3.4诱导组装体结构确定..............................................................................604.3.5限域孔道内定位组装..............................................................................624.3.6利用孔道内诱导组装体原位富集水解正硅酸乙酯..............................654.4本章小结..........................................................................................................67第5章结论与展望..................................................................................................69参考文献......................................................................................................................71致谢..........................................................................................................................78声明..........................................................................................................................79附录A论文中合成双亲分子质谱表征...................................................................80附录BDNA折纸序列信息.......................................................................................82个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果................................................103V 第1章引言第1章引言1.1生命体内的限域环境1.1.1生命体中限域环境的分类限域环境在细胞内是无处不在的。一方面，细胞的内环境是拥挤环境（crowded3[1]environment）。例如，一个近似圆柱形的大肠杆菌细胞体积只约为0.6~0.7µm，[2]然而，却含有多达4288种不同的蛋白，其中足以被轻松检测到的蛋白就多达1000余种。除此之外，细胞中还含有大量的RNA和DNA。这些生物大分子的总[3]浓度在300~400mg/mL之间。在真核细胞中，由于还存在由大量蛋白纤维构成的细胞骨架，其中大分子的总浓度会更高。这些细胞骨架将细胞分隔成多个小室，使得细胞内结构高度的区室化。各种生物大分子及内质网、高尔基体、线粒体等细胞器在细胞内均有着特定的空间分布，这种各个区域的大分子间体积排阻[4]及细胞内区室化行为也被称作是大分子限域（macromolecularconfinement），如图1.1a所示。此外，生物膜结构也可视为一种限域环境（图1.1b）。生物膜包括细胞内的膜系统与细胞质膜，它们是由具有极性头和非极尾部结构的磷脂分子形成的封闭膜系统，其中镶嵌或结合有不同的蛋白质，即膜蛋白。这些蛋白处于生物膜限域-11-92-72环境中，其扩散速率约为5×10~5×10cm/s，远低于在水溶液中的10cm/s，[5]有些细胞甚至只有30%的膜蛋白处于流动状态。同时，膜限域环境起到了稳定膜蛋白结构、为膜蛋白提供特异性环境以及保障膜蛋白功能正常行使的作用。另一方面，由膜围绕而成的各种细胞器也组成了一个个微纳尺寸的局部限域环境（图1.1c）。这些限域空间内环境往往具有一定的特异性，例如溶酶体中的pH值只有4.5左右，远远低于细胞液中水平。这些限域微空间为其内部特异性生化反应提供所需环境。图1.1细胞内限域环境。a）细胞基质内大分子限域；b）膜蛋白处于细胞膜限域环境；c）细胞内囊泡及细胞器为物质转运和特异性生化反应提供限域环境。1 第1章引言1.1.2生命体中限域环境的功能细胞内限域环境对于维持细胞正常生理生化功能至关重要，其作用主要体现在以下三个层次：首先，限域环境可影响生物分子的组装、折叠、修饰等行为；其次，限域环境可以为生化反应和生物分子储存运输提供特异性环境；最后，限域环境可以调控物质和能量的传输。1.1.2.1细胞内限域对分子组装的影响细胞内蛋白质的折叠组装受限域环境影响很大，因而也表现出了与溶液中完全不同的状态。首先，多肽链在细胞限域环境中折叠和组装的速度明显加快，例如，纤维蛋白在细胞内的拥挤限域环境中，活度系数比在自由溶液中高出一个数[6]量级；限域环境中的细胞分裂蛋白FstZ单体的自聚能力也明显高于非限域环境；[7]还原溶菌酶在限域环境中也表现出更高的折叠速率。此外，细胞内拥挤限域环境也会引起部分折叠的多肽链发生聚集行为。同时，分子动力学模拟研究表明，在限域环境中蛋白的解折叠行为更难发生，平衡会向着折叠的方向进行。然而，[8]折叠出的蛋白质往往是更加紧致的非天然状态。为解决蛋白非正确折叠及聚集[9,10]问题，生命体采用分子伴侣辅助蛋白折叠，防止聚集行为的发生（图1.2a）。而分子伴侣也正是依靠其内部限域空腔来辅助蛋白质进行正确折叠，这也进一步[11]表明了限域环境对于蛋白质正确折叠的重要作用。蛋白质的修饰也离不开限域环境，例如，N-连接的糖基化（N-linkedglycosylation）过程就是发生在内质网膜上（图1.2b）。在内质网腔面上嵌有磷酸多萜醇载体，寡糖首先在其上组装，然后在糖基转移酶的催化下，将寡糖从多萜[5]醇载体转移到相应糖基化肽链的天冬酰胺残基上，完成整个糖基化过程。图1.2限域环境调控蛋白质组装及修饰。a）分子伴侣辅助蛋白正确折叠组装；b）内质网膜上N-连接糖基化过程。2 第1章引言限域环境对核酸的折叠组装同样有着至关重要的影响。染色体位于细胞核的限域环境中，细胞核的大小是染色体折叠行为的主要影响因素。随着核大小变化，染色体结构存在显著差异。在胚胎干细胞中，由于细胞核体积较大且具有一定弹性，因此其中染色体呈相对松散态堆积。而在分化细胞系中，细胞核的体积较小，[12]染色体也呈现出更加紧密的堆积状态。此外，科学研究表明，细胞内限域环境有助于G四链体的形成，G四链体普遍存在于人类染色体，例如端粒、致癌基因启动子和免疫球蛋白开关中，对于调节细胞基因表达发挥着重要的作用。对于富含G碱基的染色体DNA，存在双链和四链竞争的状况，Tan等人研究发现，限域[13]环境的存在有利于稳定四链构象（图1.3）。Suigimoto等人的研究表明，限域[14]环境也同样可以加速DNAi-motif的形成，并使其更加稳定（图1.3）。此外，限域环境也影响着RNA的折叠，理论模拟研究表明，钠镁离子可诱导RNA由广延态（extendedconformation）折叠为松懈态（relaxedconformation）。空间限域通过降低两种状态之间静电自由能的方式来促进钠离子和镁离子在RNA折叠过程[15]中的离子效应。图1.3限域环境促进G四链体及i-motif结构形成示意图1.1.2.2细胞内限域提供特异性环境人体内已知含有5000多种酶，它们共同作用保证生命体新陈代谢的有序进行。其中一些酶可在正常的生理条件下行使功能，另外一些酶则需要特殊的条件才能[16]保证活性。细胞内限域空间可以为这些酶提供所需的特异性环境。事实上，生3 第1章引言命体中绝大部分的酶促反应都是在限域环境中发生的，例如发生在膜表面上、膜[17]界面上或者发生在小的囊泡里。细胞限域环境可以为酶提供最适合的反应环境，使得酶促反应高效的进行。例如，细胞内的降解酶绝大部分都存在于溶酶体当中，这是因为降解酶具有pH敏感的特性，需要在酸性环境中才能发挥最大作用，而溶酶体可以为其内部的酶提供一个酸性环境（pH约4.5~5）。溶酶体通过质子泵和氯离子通道，不断的将细胞质中的质子泵入内腔中，以此来维持内部酸性环境。同时，溶酶体膜如一道屏障，将其内部的降解酶与外部细胞液（pH约7.2）分离[18]开来，为内部的降解酶提供一个稳定的环境，以供其高效的进行水解反应。再如，细胞所需的几乎全部膜脂均是在内质网中合成的。而合成磷脂所需的3种酶，酰基转移酶，磷酸酶和胆碱磷酸转移酶均定位在内质网膜上，协同完成磷脂合成。内质网膜为酶提供了特异性的两亲膜环境，在反应初始阶段，内质网膜通过增大[19]膜面积来富集更多的细胞质基质中底物，以促进反应发生。除了保障细胞内各种酶促反应顺利高效进行，细胞内限域也为生物分子运输和存储提供特异性环境。胞内体是动物细胞中负责运送胞吞摄入物质到溶酶体的细胞器，腔内pH为5~6，为被运输物质提供酸性环境。例如，细胞在摄入由蛋白质和磷脂形成的低密度脂蛋白（LDL）颗粒时，LDL首先会与细胞表面受体形成受体-LDL复合物，之后该复合物经由胞吞作用进入细胞，被胞内体运送至溶[5]酶体。胞内体酸性环境会引起受体与LDL分离，受体被胞内体以出芽小泡的形式运送回细胞膜重新利用，LDL被送至溶酶体，蛋白被水解，同时释放出脂肪酸和胆固醇以供细胞再利用（图1.4）。图1.4LDL通过受体介导胞吞作用进入细胞，在胞内体酸性环境下受体-LDL复合物发生分离。4 第1章引言1.1.2.3细胞内限域调节物质和能量传输细胞内高效有序的物质和能量传输是保证细胞正常新陈代谢的重要因素。细胞内限域环境在调节调控物质能量传输方面起到了重要的作用，在细胞限域环境中，物质能量传输链的各个分子或载体均有着严格的排列顺序、方向甚至距离，以保证传输高效有序进行。细胞内绝大部分的生化反应都是由一系列酶按一定顺序以级联方式协同完成的，这些酶所处限域环境，如细胞膜等，对固定的各个酶间的距离和方向起到了很好的调控作用。通过这种方式，保证了级联反应的中间产物可以从一个酶很快地扩散到下一个酶，从而有效减少了中间产物向细胞质中自由扩散及副反应发生。例如，过氧化物酶体中降解生物大分子的酶级联反应过程为底物被依赖黄素（FAD）的氧化酶氧化成过氧化氢，随后过氧化氢被过氧化氢酶分解，生成水和氧气，反应过程中两酶均处在过氧化物酶体的限域环境中，保证了反应中间产物过氧化氢[5]被高效分解，使得细胞免受其毒害。此外，如前文提到的在磷脂合成中所需的三种酶，酰基转移酶，磷酸酶和胆碱磷酸转移酶均定位在内质网膜上，以保障中间产物高效的从一个酶运送到另一个酶，提高合成效率，降低副反应发生。另外，细胞线粒体中电子传递链上各个载体也均在线粒体内膜上有着精确的排列顺序和方向（图1.5）。其排序方式为按照氧化还原电位自低向高排列，氧化还原电位越低，供电子能力越强，则越处在传递链的前端。每一个载体都是从前一个载体获得电子被还原，再将电子传递给后一个载体被氧化，电子沿着呼吸链有序传递，并伴随着能量的释放。电子最终受体为氧，氧接受电子后与氢离子生[5]成水。图1.5线粒体内膜中电子传递复合物排列及质子传递示意图5 第1章引言细胞中能量传递同样离不开限域环境。在叶绿体内环境中，约300个叶绿素分子一起组成一个光合单位进行光子吸收，其中只有一对特殊的叶绿素a分子可[5]以将光能转化成化学能，其他色素分子吸收光能并将能量传递给叶绿素a分子。在能量传递中遵循着从吸收高能短波长光波色素到吸收低能长波长色素的方向，最终传递给吸收波长最长的叶绿素a。1.2体外构建限域环境由于生物体内过于复杂的环境使得对各个基元的独立研究相对比较困难，对于大部分生物体内生化过程的研究都是在体外（invitro）进行。与体内（invivo）研究相比，体外研究可以更直接、更方便的将某一种元素特异性抽提出来进行分别探究，是将对象从生物环境背景中抽离出来进行研究的一种研究方式。目前，随着限域环境在生命体新陈代谢中的作用被不断发现和重视，越来越多的科学家开始关注如何在体外构建限域环境来探究其作用和影响。1.2.1宏观尺度构建细胞质环境为充满各种大分子的限域环境，体外模拟限域的一个重要方向就是模拟这种“拥挤”环境。其中最简单的构建方式是将细胞提取液直接加以利用，研究分子组装等过程在其中行为，例如颜灏等人就研究了DNA组装体在细胞裂[20]解液条件下的稳定性。此外，从高分子物理的角度来看，细胞质中限域环境可简化看做一种浓缩过的高分子溶液。因此科学家们在体外利用水溶性高分子，如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）[21][22][23]、聚丙烯酰胺（PAM）及聚乙二醇（PEG）等溶液来模拟细胞内限域环境。2013年，Wagner等人通过理论模拟研究表明，PEG限域环境可以有效提高eIF4AATP酶的活性（图1.6a）。其机理在于限域环境可以使酶呈现出一个更加紧致的[24]构象结构。Johansson等人的研究表明，限域环境的存在可以使得已经折叠好的蛋白中的两个被标记氨基酸距离变近，这也证明了限域环境会让蛋白呈现出一个[25]更加紧密的构象。他们利用荧光标记的办法，将蛋白上特定位点的氨基酸做荧光修饰，两种荧光分子会发生荧光共振能量转移现象。在PEG限域环境中，蛋白中荧光共振能量转移效应会比在自由溶液中有所增强，从而表明了蛋白质更加紧密的结构（图1.6b）。6 第1章引言图1.6高分子溶液限域环境影响蛋白质构象。a）PEG限域环境可提高ATP酶活性；b）PEG限域环境改变蛋白构象。在限域环境中，除了蛋白质的组装行为会产生差异，磷脂囊泡同样呈现出与在自由溶液中不同的组装行为。2015年，北京大学的梁德海等人发现当磷脂囊泡[26]所处环境从自由溶液转变为限域PEG环境时，其构象会从球形转变成棒状。同[21]年，他们以PVP构建限域环境，研究DNAdoublecrossover组装成纳米管行为。研究表明，限域环境对于DNA组装体的形成起着重要的作用：在较低的限域程度下，纳米管会更快的形成，同时具有更长的长度；而较高的限域环境则不利于纳米管的形成。一种合理的解释是，限域环境相当于提升了反应物的浓度，从而有利于组装体形成；而在高限域环境下，反应物的自由扩散严重受阻，不利于反应物在体系中彼此接触发生反应，从而组装效率不升反降。[27]水凝胶由于具有结构稳定，通透性良好等优点，也常被用作构建限域环境[28][29]材料。例如Nie等人利用DNA水凝胶构建限域环境，并在其内部包埋葡萄糖氧化酶和β-半乳糖苷酶，探究了酶级联反应在凝胶限域环境中行为。1.2.2微纳米尺度构建如前文所述，细胞内限域除细胞质的“拥挤”环境以外，细胞膜表面、各细胞器内部等均为生物分子组装输运、酶促反应等提供限域条件。与细胞质“拥挤”环境不同，这些限域空间往往是在局部微纳尺度上影响调控着生命过程。对这些微纳限域环境的模拟，也成为了体外模拟细胞内环境中极其重要的课题。对此，科学家们开发出了不同的模拟体系。7 第1章引言1.2.2.1胶束构建纳米限域环境胶束是两亲分子在溶液中浓度大于临界胶束浓度时自发组装形成的纳米结构。在水溶液中，胶束疏水部分聚集成核，亲水部分暴露在外。科学家们利用胶束构建了纳米限域环境体外研究了生物分子组装、酶促反应等在其中的行为。南开大学史林启等人利用两种嵌段聚合物聚己内酯-b-聚乙二醇和聚己内酯-b-聚异丙基丙烯酰胺自组装形成复合壳层胶束，该胶束可模拟分子伴侣调控蛋白质组装（图1.7a）。胶束表面具有纳米限域微区，该微区能够通过疏水相互作用吸附Aβ单体蛋白及其寡聚物，从而抑制蛋白聚集，并促进Aβ聚集体降解，减少[30]Aβ聚集体引起的神经细胞毒性。此外，胶束的限域环境还可以辅助卟啉等生物活性分子的组装。白锋等人通过四吡啶基锌卟啉在SDS胶束中限域组装来制备[31]卟啉纳米晶。他们首先将锌卟啉溶解在稀盐酸中，卟啉上的吡啶基团发生质子化，可溶于水溶液中。之后将该卟啉盐酸溶液加入到含SDS的水溶液中，并利用碱来提高溶液的pH值，使得卟啉分子去质子化并从溶液中析出，进而进入到SDS胶束当中进行限域组装。通过控制SDS与卟啉分子的浓度比及溶液pH值，可制备得到单分散卟啉二维片、卟啉纳米棒等结构（图1.7b）。图1.7胶束限域环境调控分子组装。a）胶束构建纳米限域环境抑制蛋白质聚集示意图；b）SDS胶束纳米限域环境辅助锌卟啉组装成片状结构示意图。1.2.2.2囊泡构建纳米限域环境囊泡是由双亲分子形成的封闭双层组装体，其尺寸分布可以从纳米级到微米级。与胶束不同，在水相中，囊泡具有双亲性的膜和亲水内腔。构成囊泡的分子[32]若为两亲性聚合物，则囊泡为聚合物囊泡（polymersome），若囊泡由磷脂分子[33]构成，则为磷脂囊泡（liposome）。囊泡在组织结构上与细胞及细胞器具有相似之处，它们均是由膜结构封闭形成的含有内腔的组装体，因此囊泡也常被用来构建模拟细胞内微纳尺度限域环境。特别是由于囊泡的亲水内腔和双亲分子膜均可分别包埋不同分子，因此囊泡也被广泛用做构建酶级联反应体系。8 第1章引言Way等人通过将磷酸三酯酶包埋进由磷脂、胆固醇及聚乙二醇组成的磷脂囊[34]泡内，探究了磷酸三酯酶在囊泡内部限域环境的酶促活性。其中胆固醇的引入可有效增加囊泡稳定性，而聚乙二醇可提高囊泡生物相容性。该富含酶的囊泡可以注射到血管中跟随血液循环，并水解神经毒剂对氧磷（图1.8a）。Baumler等人将级联反应的三个酶β-葡糖苷酶、葡萄糖氧化酶（GOx）及辣根过氧化物歧化酶（HRP）分别固定在同心多室囊泡的三个碳酸钙层中，层层之间由牛血清蛋白组[35]成的壳层结构分开，进而构建了多室囊泡限域环境来研究酶级联反应。2007年，Hest等人利用高分子囊泡构建了三酶反应体系，他们将HRP酶共组装在高分子囊泡的膜里，将GOx酶包埋在囊泡的内腔中，同时让南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）游离在溶液中，构建了基于高分子囊泡的三酶级联反应体系（图1.8b）[36]。之后，Hest等人又将这一体系进一步扩展，将CALB和GOx分别固定在囊[37]泡的膜和内腔中，将HRP酶共价连接到囊泡表面，构建三酶联体系。图1.8囊泡构建微纳尺度限域环境。a）囊泡内磷酸三酯酶酶促反应示意图；b）囊泡限域环境中CALB-GOx-HRP三酶级联反应示意图。囊泡除了可以在体外构筑限域环境研究酶促反应特别是酶级联反应，还可以如分子伴侣一般，来调控蛋白等生物分子的聚集。Tsubomura等人发现，甲酸脱氢酶在58ºC时会发生变性进而产生不可逆聚集，失去活性。但是当体系中存在卵磷脂囊泡时，变性的甲酸脱氢酶会和卵磷脂囊泡结合而不再聚集，当温度恢复[38]到25ºC时酶又可快速回复活性。9 第1章引言1.2.2.3微凝胶构建纳米限域环境微凝胶是指尺寸在1nm~1000nm之间，具有分子间交联结构的颗粒。由于其兼具稳定性与通透性等优点，也成为构建微纳限域环境的理想材料。Armitage等人通过DNA、生物素修饰的肽核酸及亲和素构建微凝胶限域环境，将修饰有生物素的β半乳糖苷酶通过与亲和素结合包埋在凝胶之中（图1.9a），[39]研究在微凝胶限域环境下的酶活性。他们发现微凝胶里酶活性在多次循环使用后基本保持不变，证明微凝胶限域环境对酶活保持的重要作用。史林启等人将级联反应的三个酶与三臂DNA分别耦联，使得每个三臂DNA骨架的三条臂分别特异性连接一种酶。之后通过N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺与酶表面活性氨基反应将丙烯酰基修饰到酶表面，再在酶表面原位进行丙烯酰胺聚合，形成微凝胶将酶包裹，从而构建了微凝胶限域环境下三酶连体系（图1.9b），并实现了体系中各个酶数[40]目的精确可控。图1.9微凝胶构建微纳限域环境。a）β-半乳糖苷酶在DNA-肽核酸微凝胶限域环境中示意图；b）利用丙烯酰胺微凝胶构建限域环境下三酶联体系。1.2.2.4纳米颗粒表面构建纳米限域环境近年来，纳米颗粒表面也常被用作构建纳米限域环境研究酶促反应、分子组装等过程。特别是纳米金颗粒，由于其具有易于修饰，同时又不影响所结合的生[41]物大分子活性等优点，受到了科学家们的广泛关注。本课题组董原辰等人曾利用修饰有两亲性树状分子的纳米金颗粒作为限域性疏水框架，来诱导溶液中的双[42]亲分子在其限域空间内组装（图1.10a），即框架诱导自组装。其中组装体形貌尺寸取决于框架，因此通过对框架的形状与尺寸调节，可实现可控限域组装。随后，董原辰等人又利用相似的策略，在金颗粒表面利用胆固醇分子构建疏水限[43]域环境，诱导了小分子十二烷基苯磺酸钠的限域组装（图1.10b）。除金纳米10 第1章引言[44][45][46]颗粒之外，磁性纳米颗粒、量子点、二氧化硅微球等表面也均可构建限域纳米环境。例如，Xia等人将可催化合成维生素K2级联反应的三个酶MenF、MenD[47]及MenH连接到量子点表面，构建限域条件下级联反应，提高酶级联反应效率。图1.10纳米颗粒表面构建限域环境调控分子组装。a）金纳米颗粒表面构建疏水限域环境诱导DNA-树状分子组装；b）金纳米颗粒表面构建疏水限域环境诱导小分子SDS组装。1.3结构DNA纳米技术核酸作为生命体内最重要的大分子之一，肩负着存储和传递遗传信息的功能。生命体内核酸可分为两大类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。其中由DNA组成的基因组，几乎记载着生命体所有的遗传信息。DNA分子能够精确储存遗传信息的功能，是由其结构特性所决定的：DNA分子是脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接形成的大分子，每个脱氧核苷酸又是由磷酸、脱氧核糖和碱基共同构成，不同核苷酸的磷酸和脱氧核糖结构相同，不同之处在于碱基部分，DNA[48]中共有腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（C）和胞嘧啶（G）四种不同碱基。两条DNA单链之间通过碱基形成氢键能够反向互补在一起形成双链结构，配对的原则为：A与T之间形成两重氢键配对；C与G之间形成三重氢键配对（图1.11）。在绝大多数生理条件下，双链DNA都会呈现出B型的右手双螺旋结构。在此结构中，亲水性磷酸与糖基在外侧构成DNA分子的骨架，两两配对的疏水碱基被包含在内，并且碱基平面垂直于螺旋轴。在B型DNA中，双螺旋直径为2nm，[49]每一个螺旋周期含有10.5对碱基，螺距为3.4nm。除此之外，DNA双螺旋结构还存在A型，Z型等构象。目前，在结构DNA纳米技术的研究中，双链DNA几乎均为B型。虽然DNA的碱基只有4种，但碱基的排列方式却近乎无穷，这就赋予了DNA强大的编码能力；同时，由于DNA分子严格遵守碱基互补配对原则，可以使得DNA分子被用作为自组装基元构建纳米尺度乃至宏观尺度的材料。1982年，纽约大学的Seeman教授利用DNA分子黏性末端互补配对拼接出二维有序网络结构，开辟了“结构DNA纳米技术”（StructuralDNANanotechnology）11 第1章引言[50,51]这一领域。目前，结构DNA纳米技术主要有如下两个分支：DNAtile自组装和DNA折纸术。图1.11DNA碱基互补配对及B型DNA双螺旋结构示意图1.3.1DNAtile自组装DNAtile自组装是指将预先设计好的DNA基元（DNAtile）如瓷砖铺地板一[50]样，有规律的组装成大的图形。如何设计和构建DNAtile，是DNAtile自组装的核心问题。其中有两个重要的原则：DNAtile自身需要有稳定的结构及每个DNAtile需要有多于两个的连接位点。Seeman教授最先提出了四臂分支的Holiday联接体，通过向四臂结构中引入粘性末端，可以使其通过DNA互补杂交形成几[52][53][54]何或拓扑学的超分子结构（图1.12a）。之后，三臂，五臂，六臂，八臂[55]甚至十二臂等DNAtile也相继被设计出来。此外，Seeman教授还进一步设计了结构更加刚性的DNAtile。他将两条DNA双链通过两个类似于holiday交叉的连接位点绑定在一起，得到一个更加稳定的双[56]交叉（DoubleCrossover）刚性DNA模块结构，即DXtile。DX中的两条DNA双链即可采取平行的排列方式，也可采取反平行的排列方式。此外，为了确保DX应力最小，两个交叉点间的距离须为半螺旋的整数倍。基于以上原则，在两个交叉点间距不超过2倍半螺旋的情况下共有5种可能结构，如图1.12b所示。而其中两种反平行tile，DAO（doublecrossover,antiparallel,oddspacing）和DAE12 第1章引言（doublecrossover,antiparallel,evenspacing）由于没有传统分支交联位点（conventionalbranchedjunctions）而稳定性更高，在之后的工作中被广泛的用作[57]复杂DNA纳米结构的构筑基元，如三维纳米管、谢尔宾斯基三角形（Sierpinski[58]Triangles）等。图1.12DNAtile示意图。a）四臂分支的Holiday联接体；b）五种double-crossover结构示意图。[59]颜灏等人在DX的基础上开发了PXtile（paranemiccrossover）及其拓扑异[60,61]构型JX2tile。PXtile和JX2tile可通过DNA链交换反应进行结构互变。在[62]此之后，更为复杂的DNAtile，如triplecrossover（TX）tile及十字形DNAtile[63]（图1.13a）等相继被Labean及颜灏等人开发出来。以十字形tile为基础，普[64][65]渡大学毛承德教授课题组又先后开发了三叉和六叉型DNAtile（图1.13a）。通过对三叉tile中柔性单链长度及tile浓度的调节，以在特定方向积累曲率的方[66]式，他们进一步构建了四面体、十二面体等结构。采取相似的策略，他们利用[67][68]多种tile组装出更为复杂精细的富勒烯、五角化十二面体、响应性DNA纳[69]米笼子等结构。此外，毛承德教授等在DNAtile上引入含有Teohold的链段，通过链置换反应，可以使tile发生异构形变，进而改变由tile形成的高级组装体[70]形状。通过这种方法，他们构建了具有可控形变能力的高级DNA组装体（图1.13b）。13 第1章引言图1.13复杂DNAtile及组装体示意图。a）十字形、三角形及六边形tile；b）可形变DNA组装体示意图及电镜表征图。2012年，哈佛大学尹鹏课题组开发了一种全新的DNAtile自组装技术，他们以经过精确设计的短链DNA为模块（single-strandedtile）组装出各种二维和三维[71-73]结构（图1.14）。这种将每一个短链作为一个tile如乐高积木一般搭建纳米结构的技术，使DNA自主装领域达到了一个全新的高度。图1.14短链DNA模块自组装形成三维组装体示意图及电镜表征图14 第1章引言1.3.2DNA折纸技术2006年，加州理工学院的科学家Rothemund首次提出了DNA折纸术（origami）[74]的概念，自此开启了DNA自组装领域的一个新纪元。如果说DNAtile自组装仿佛是在堆积木或者做拼图，那么DNA折纸术就更像是在编一根绳，或者如Rothemund所说，像是在折一张纸。其基本思路是，将一根上千碱基的长链DNA像编织一根绳子一样先编成预定的形状，再依据碱基互补配对原则，用上百条短链DNA将其形状固定住，从而能够得到我们设计好的稳定的结构。Rothemund所用的“绳”是M13mp18噬菌体单链环状DNA，共7249个碱基。该DNA不存在明显的序列重复及超过20bp茎环结构，又因为其序列已被获知且商业化成熟，因此是用来形成DNAorigami的理想成核链，也称为骨架链（scaffoldstrand）。Rothemund成功用DNA折纸术制备了多种纳米结构，如方形、矩形、五角星、笑脸及三角形等，它们分别代表普通多边形、有缝图形、尖角图形、有孔图形、以及分部图形（图1.15）。除了形成特定形状的组装体，他还在DNA折纸上进行了图案化。由于订书钉链都是由研究者事先设计好的，因此每个位置的订书钉链及序列都清晰可知并能进行进一步设计修饰。Rothemund利用哑铃型颈环结构修饰在origami上特定位点的订书钉链，从而呈现出设计好的图案，并可以用AFM表征出来。此外，他还利用已经组装好的折纸结构形成更大的图形。其设计思路是将一个origami上的订书钉链延长，将另一个origmai上的订书钉链留出空缺，使得延长部分能够恰好嵌入到空缺部分，通过序列设计使其能够与核心链互补，从而将两个图形连接起来。通过这种方法，Rothemund成功的构建了一些大的组合图形，如由六个三角形构成的六边形等等。图1.15DNA折纸结构示意图及原子力显微镜表征图15 第1章引言折纸术从06年概念的提出至今，短短十余年间已有长足的发展。非对称的纳[75][76][77]米图形，如纳米中国地图、纳米海豚及DNA分叉图形等相继被设计制备出来。2009年，Andersen等人利用DNA折纸术构建了一个三维六面体空心盒子，盒子每个面分别由成核链组装起来，再由订书钉链将其连接固定，有趣的是，该[78]盒子的一个面可以通过链置换反应来可控的打开和关闭。随后Ke等利用一个不同的整体化策略，即用成核链本身，而非订书钉链将各个面拉在一起构建了[79]DNAorigami空心四面体。同年，哈佛大学的Shih课题组提出“蜂窝褶状模型”（honeycomb-pleated），构建了诸多的三维DNA折纸结构，如方形螺帽（三维有孔结构）、桥式结构（细线连接结构）、细颈瓶（同向嵌套结构）、插槽交叉（垂直[80,81]向嵌套结构）、堆积交叉（垂直向堆积结构）等（图1.16a）。之后，颜灏课题组通过对DNA序列碱基数目的精确设计调控，开创性的构建了具有曲率的二[82]维和三维结构，如纳米铜钱，纳米花瓶等（图1.16b）。可以说，DNA折纸术的出现为DNA纳米结构的精度带来数量级般的提升，具有里程碑般的意义。图1.16三维DNA折纸技术。a）蜂窝褶状模型构建三维DNA折纸结构示意图；b）含有曲率三维DNA折纸结构示意图及其表征。16 第1章引言1.4课题提出限域环境在细胞内调控生物大分子的组装与修饰、为生命过程提供特异性环境及调节物质和能量的传输，对维持细胞正常新陈代谢起着至关重要的作用。体外构建微纳尺度限域环境对体内细胞膜或细胞器结构进行模拟是近年来科学家们关注的重点问题之一。然而目前的体系，如胶束、囊泡等，往往存在限域环境尺寸不精确可控，不能严格控制限域环境中各个分子如酶等的相对数目和距离等问题。由于DNA分子所具有严格碱基互补性、精确可设计性等优点，已成为构建精细纳米结构的理想材料。目前，已有利用DNA纳米结构构建限域环境的优秀工作被报道出来。耶鲁大学林晨翔等人利用修饰有磷脂分子的DNA折纸限域圆[83]环调控磷脂分子组装，DNA折纸限域环境可以精确控制形成磷脂囊泡的尺寸；上海应用物理研究所的樊春海、柳华杰等人利用DNA折纸术构建了纳米管，在[84]纳米管的内部引入了距离可控的酶级联反应来探究其在限域环境下的效率。基于DNA纳米结构的优良特性，纳米限域环境的尺寸、内部功能分子的数目及位置等均可被精确控制。然而，对于如何利用结构DNA纳米技术构建响应型限域环境来实现物质在纳米尺度的输运调控，以便更好地了解细胞内环境中的物质输运规律，却鲜有工作报道；此外，细胞内限域环境不仅为内部生化过程提供空间限制，同时也为其提供特异性环境，如膜环境等。如何利用结构DNA纳米技术构建特异性限域环境，也是该领域所面临的重大课题。针对以上问题，结合本课题组在DNA折纸技术及框架诱导自组装技术上的优势，本论文开展了如下三部分工作：第一部分工作是利用DNA折纸技术构建响应性纳米限域环境——可控开阖纳米通道。通过孔道开阖来调节纳米尺度限域环境下物质传输，并探究了孔道内部酶级联反应效率受孔道开阖的影响；第二部分工作是将DNA折纸技术与框架诱导自主装技术相结合，构建了特异性纳米限域膜环境。利用该纳米限域膜模拟了生物膜对分子的富集作用并研究了脂肪酶在该限域膜环境中的水解反应行为；第三部分工作是利用DNA折纸术与苄醚型树状分子（DDOEG）相结合，构建特异性限域疏水纳米孔道，并探究了该疏水限域孔道环境对温敏性双亲分子DNA-b-聚环氧丙烷（DNA-b-PPO）可控组装的影响。17 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控2.1本章引言细胞内限域环境对于细胞维持正常新陈代谢，增殖分化等功能发挥着重要的作用。细胞内生物分子的折叠组装修饰、酶促反应等生化过程均离不开限域环境。目前，在体外构建限域环境主要体现在两个层次，一是在宏观尺度构建限域环境，如利用高分子溶液模拟细胞内环境；二是在微纳尺度构建限域环境，来模拟细胞膜、细胞器的环境及功能。在微纳尺度构建限域环境的策略有很多，例如囊泡、胶束、微凝胶等均可在体外用来构筑限域环境。然而，这些体系目前尚做不到精确调控限域环境尺寸，亦很难实现对于限域环境内分子（如酶等）的数目和位置的精确控制。如何制备更为精细复杂的纳米限域环境成为了科学家们面临的重要问题。结构DNA纳米技术的出现为解决这一问题提供了可能。结构DNA纳米技术于1982年由美国纽约大学的Seeman教授首先提出。其基本设想是根据DNA的精确碱基识别互补配对性及可设计性，将DNA分子用作材料构建纳米结构或周期阵列。结构DNA纳米技术从提出至今，30多年间经历了飞速发展。特别是2006年DNA折纸术的出现，可以说将结构DNA纳米技术提高了一个全新的高度，几乎[85]任意二维及三维形状的纳米结构均可通过DNA折纸技术构建出来。目前，利用DNA折纸技术构建限域环境尚处于起步阶段。上海应用物理研究所的樊春海、柳华杰等人利用DNA折纸术构建了纳米管，在纳米管的内部引入了[84]距离可控的酶级联反应来探究其在限域环境下的效率。得益于DNA折纸术的优良特性，酶在限域孔道内位置和数目均可被精确调节。然而，如何利用DNA纳米技术构建更为复杂的限域环境，以实现对限域环境中物质传输、酶级联反应效率等的可控调节仍是一个重点问题。本章中，我们利用DNA折纸术构建了响应型可控开阖纳米限域孔道（图2.1）。孔道长100nm，直径22nm。在孔道内部通过DNA互补配对定位组装上一对级联反应酶GOx和HRP，孔道为酶促反应提供限域环境。同时，在孔道端口处构建含有11条垂直于孔道壁向内DNA单链，即门控链，通过DNA链段的杂交取代，可以可控实现孔道端口处单双链的变化。当为单链时，孔道为打开状态；当为双链[86,87]时，由于双链占据体积明显高于单链，因此会对孔道有效封堵，此时孔道处18 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控于闭合状态。本章通调整孔道的开阖来调控限域环境中反应物进入孔道的瞬时通量，以此来调节孔道内酶促反应效率。图2.1可控开阖纳米限域孔道示意图2.2实验部分2.2.1试剂与材料三羟甲基氨基甲烷（Tris），乙酸，乙二胺四乙酸（EDTA），乙酸镁，硼酸，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠等购于北京化学试剂公司。2+本章中所用1×TAE-Mg缓冲液的浓度为100mMTris，50mM乙酸，5mMEDTA，12.5mM乙酸镁，乙酸调pH值至8.0。+1×PB-Na缓冲液浓度为20mM，含150mMNaCl，pH值为7.4。1×TBE缓冲液的浓度为100mMTris，50mM硼酸，5mMEDTA，pH值为8.3。交联剂N-[(ε-maleimidocapropyloxy)sulphosuccinimideester]（sulfo-EMCS）购置于Pierce公司。葡萄糖氧化酶（GOx）、辣根过氧化物歧化酶（HRP）购置于Sigma公司。链霉亲和素（Streptavidin）购于欣经科公司。2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购置于Sigma公司。葡萄糖购于北京化学试剂公司。M13mp18单链DNA购置于NewEnglandBiolabs公司，货号N4040S，浓度为100nm。所有DNAorigami所需订书钉短链（其序列见附表B.1-B.6）、8个碱基锁链、15个碱基锁链、23个碱基锁链及钥链均购置于梓熙生物公司，序列见附表19 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控B.7。所有未经修饰DNA单链均为PAGE纯化。生物素修饰的DNA购于梓熙生物公司，经过高效液相色谱（HPLC）纯化，其序列为5’-biotin-GTGATGAGAGGATAG及5’-biotin-GTTAGTGAGTGATGGGAGGATAG。2.2.2实验仪器离心机（Centrifuge5415R）Eppendorf公司天平（Me104）梅特勒公司电泳仪（JY1600C）北京君意东方公司TM纯水仪（DirectQ）密理博公司PCR仪（EDC-810）东胜公司@pH计（InlabMicro）梅特勒公司紫外-可见光谱仪（VarianCary100）安捷伦公司凝胶成像仪（212PRO）柯达公司原子力显微镜（MultiModeVIII）布鲁克公司2.2.3实验操作2.2.3.1DNA折纸结构的制备2+将形成目标组装体的短链DNA和M13mp18模板链DNA在1×TAE-Mg缓冲液中混合，其中模板链DNA的浓度为5nM，相应的短链DNA过量10倍，经PCR仪程序退火，以-1ºC/100s的速度从95ºC降至15ºC。得到组装体经100K超滤管纯化三次去掉过量的短链DNA，离心条件为2000rcf，10min。纯化后的组装体通过测定其在260nm处紫外吸收值确定浓度。2.2.3.2酶-DNA缀合物的合成1）GOx-DNA缀合物合成+100µMGOx与10mMSulfo-EMCS混合，缓冲液为PB-Na缓冲液。25ºC反应6h，100K超滤离心管12,000rcf，30min离心纯化三次，去除过量的Sulfo-EMCS。之后，将得到的GOx-EMCS与10倍体积100µM巯基DNA（S1）混合，DNA序+列为5’HS-GTCGCTCTCTCAAGTAGAAT，缓冲液为PB-Na缓冲液。25ºC反应6h，100K超滤管12,000rcf，25min离心纯化三次，去除过量的巯基DNA，得到GOx-DNA缀合物。2）HRP-DNA缀合物合成+100µMHRP与10mMSulfo-EMCS混合，缓冲液为PB-Na缓冲液。25ºC反20 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控应6h，10K超滤离心管12,000rcf，30min离心纯化三次，去除过量的Sulfo-EMCS。之后，将得到的HRP-EMCS与10倍体积100µM巯基DNA（S2）混合，DNA序+列为5’HS-GAATGTCCGCGTCAGTAGTC，缓冲液为PB-Na缓冲液。25ºC反应6h，30K超滤管12,000rcf，25min离心纯化三次，去除过量的巯基DNA，得到HRP-DNA缀合物。2.2.3.3非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（NativePAGE）NativePAGE凝胶浓度为10%，其中丙烯酰胺与N,N-亚甲基二丙烯酰胺比例为19:1。凝胶缓冲液及电泳缓冲液均为1×TBE，电压15V/cm，电泳时间4h，电泳温度4ºC。电泳结束后用StainsAll溶液对凝胶染色，染色时长20min。凝胶成像仪上白光拍照。2.2.3.4酶-DNA缀合物与DNA折纸孔道结合将2nMDNA折纸与4nMHRP-DNA混合，37°C静置30min，之后向体系中加入4nMGOx-DNA缀合物，37°C静置30min。2.2.3.5DNA折纸孔道可控开阖自然状态下，DNA折纸孔道端口处门控链处于单链状态，孔道为开。向体系中加入10倍过量于门控链的锁链，37°C静置30min使其与门控链充分互补，孔道关闭。本章中共用到三种锁链，其长度分别为8mer，15mer和23mer。当锁链为23merDNA链时，可加入10倍过量于该锁链的钥链，37°C静置30min，钥链将锁链从门控链上竞争性取代下来，孔道再次打开。2.2.3.6紫外变温测定熔点2+将带测DNA用1×TAE-Mg缓冲液稀释至终浓度为1µM。测定样品随温度升高在260nm处紫外吸收的变化情况。温度扫描范围为10ºC到95ºC，升温速率1ºC/min，得到各样品升温曲线。利用Origin软件对曲线求导，得到熔点温度。2.2.3.7AFM表征2+本章中所有原子力显微镜表征均为液相扫描，buffer为1×TAE-Mg缓冲液，扫描模式为ScanAsystinFluid。该模式下，系统自动调整扫描参数，一般情况下，Setpoint值为0.02~0.03，FeedbackGain值为10~15，扫描速度为0.996Hz。扫描头为EScanner。扫描探针为Bruker公司的ScanAsyst-Fluid+探针，其共振频率为150kHz，弹性系数为0.7N/m。21 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控2.2.3.8酶级联反应效率检测将葡萄糖和ABTS与不同催化体系混合，最终所有体系中葡萄糖浓度为10mM,2+ABTS0.5mM，GOx1nM，HRP1nM，缓冲液为1×TAE-Mg。GOx将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，同时还原氧气生成过氧化氢，后者扩散至HRP表面进一步被还++原成水，同时将ABTS氧化成ABTS•，ABTS•在418nm处有紫外吸收，利用紫外光谱实时监测酶级联反应的效率。2.3结果与讨论2.3.1响应型可控开阖纳米孔道的设计与表征2.3.1.1响应型可控开阖纳米孔道设计本论文基于二维DNA折纸平板的卷曲构建DNA孔道。DNA折纸平板设计如图2.2a所示，遵循P.W.Rothemund提出的二维DNA折纸的设计原则，共使用216条短订书钉链将一条长的M13mp18模板链DNA绑定成矩形平板形状。其中共有20条上下边链（图2.2a中绿色链）可与折纸平板上下两条模板链同时互补配对，使得在退火过程中DNA折纸卷曲成管（图2.2b）。由于DNA折纸平板在溶液中并非严格平面结构，而是具有一定的曲率，因此其在成管过程中会沿着凹[84]面进行卷曲。孔道长约为100nm，孔径为22nm。我们将DNA折纸除去左右两列边链后分为16列，从A编号到P。在折纸上设计有两组可以分别将级联反应两个酶锚定在孔道内部的位点，如图2.2a所示。两组中的GOx酶均被锚定在C列，HRP酶均被锚定在F列。每组级联反应两个酶之间距离约为15nm。在A列中，我们设计11条含有15个碱基伸链的订书钉链，即门控链（Sg）。通过控制门控链伸出位置来控制其朝向，保证形成孔道后所有门控链均朝向其所在纵切面圆心，如图2.1所示。当我们向体系中加入门控链序列的互补序列，即锁链（Sl）时，其会与门控互补配对，管口处由单链结构变为双链结构。由于双链的位阻效应远大于单链，管口处被部分封端，DNA纳米孔道由打开变为闭合。当锁链上含有额外的Toehold序列（Sm）时还可向体系中加入锁链的全互补链，我们称之为钥链（CSm），钥链将锁链竞争性的从孔道门控链上取代下来，从而使管口处变回单链结构，孔道再次打开。用这种方法，我们可以通过锁链和钥链的交替加入来控制孔道的开阖。同时，在折纸的69、70、71、72、93和95位点，设计有六个相邻近颈环结构（序列见附表B.5），作为标记以便于在AFM下区分折纸左右两端。22 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控图2.2DNA折纸孔道设计示意图。a）折纸孔道平面展开示意图，其中订书钉链编号在5’端，箭头为3’端。折纸上A列红色链为含伸链订书钉链，黑色部分为该订书钉链上门控链部分。C、F两列各有两组伸链可分别与GOx-DNA及HRP-DNA缀合物互补杂交。折纸右下角红色圆圈标记处为颈环标记位置；b）上下边链辅助下折纸平板卷曲成孔道示意图。2.3.1.2可控开阖纳米孔道表征本论文利用AFM对孔道开阖进行表征。首先对自然状态下处于打开状态的孔道进行检测，如图2.3a所示。DNA组装体均形成了预期的孔道结构，孔道长约为100nm，高度为4nm，这是由于空心孔道结构在AFM制样和成像过程中发生塌缩，4nm为两层DNA双链高度。同时，可以在孔道一端端口附近清晰地看到由颈环标记引起的约0.5nm高凸起（白色箭头处），与设计相符。随后，我们向体系中加入Sl锁链，使孔道由打开状态变为闭合状态。由于单双链的变化在23 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控AFM下并不容易被检测到，因此本论文采用了链霉亲和素辅助的办法来检测闭合状态纳米孔道。在该方法中，锁链5’端修饰有生物素，当锁链与门控链结合后，再向体系中加入链霉亲和素，链霉亲和素会与孔道端口处锁链上的生物素发生特异性结合。这样，凡是结合了锁链而处于闭合状态的孔道就会结合有链霉亲和素，而链霉亲和素在AFM下很容易被探测到，因此，可以通过检测孔道端口处的链霉亲和素来确定孔道的闭合。结果如图2.3b所示，在闭合状态下，远离颈环标记的孔道一端端口处均有明显凸起，高度约为2nm（蓝色箭头处），与链霉亲和素高度相匹配，从而证明了纳米孔道由打开状态成功转变为闭合状态。图2.3响应型可控开阖纳米孔道AFM表征图。a）打开状态DNA折纸孔道；b）闭合状态DNA折纸孔道；c-e）折纸孔道打开-闭合-再打开循环。其中白色箭头表示颈环标记位置，蓝色箭头表示孔道闭合一端。24 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控当加入含有额外8个碱基Toehold锁链Sm时，Sm与门控链互补，孔道闭合。此时向体系中加入Sm全互补钥链CSm，可竞争性将锁链从门控链上取代下来，使DNA折纸孔道回到打开状态。为了避免链霉亲和素对链取代反应的影响，对于重新回到打开状态DNA折纸孔道的AFM表征，我们是在加入钥链将锁链取代下来后，再向体系中加入链霉亲和素。因含有生物素修饰的锁链已从折纸孔道上被取代下来，所以链霉亲和素不会再结合到孔道端口。AFM结果表征如图2.3e所示，在经过钥链取代后，DNA折纸孔道的端口处不再有因结合链霉亲和素而产生的凸起结构，和自然打开状态一致，从而证明了DNA折纸孔道由闭合状态又回到了打开状态。需要注意的是，这里用到的锁链Sm与门控链Sg互补的部分并非完全互补，而是在第九个碱基处存在一个碱基的错配，从而降低互补配对稳定性，便于钥链将其竞争性取代下来，如图2.4a所示。我们利用紫外变温实验分别测定了Sm与Sg，Sc与Sg，Sm与CSm，Sc与CSc的熔点，其中Sc为不含碱基错配的锁链，CSc为Sc全互补链。熔点结果如图2.3c，它们结合的熔点分别为51.8ºC，56.1ºC，69.0ºC和66.2ºC。由图可以看出，当锁链和门控链存在一个错配时，熔点较全互补时下降了4.3ºC，同时，该错配锁链与其全互补链的熔点又较之不含错配锁链时高2.8ºC。这说明与Sc相比，锁链Sm与门控链Sg结合稳定性更弱，同时与其全互补钥链结合稳定性更强，因此含有一个碱基错配锁链Sm结合到折纸孔道后更容易被钥链置换下来。同时，Sm与Sg熔点为51.8ºC，也足以保证其在不含钥链情况下可与折纸孔道上门控链稳定结合。图2.4两种锁链与门控链序列示意图及熔点测试结果。a）锁链与门控链含有一碱基错配示意图；b）紫外变温实验测定Sm与Sg，Sc与Sg，Sm与CSm，Sc与CSc熔点；c）b图求一阶导数结果。25 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控2.3.2酶-DNA缀合物的表征本论文以Sulfo-EMCS为耦联剂构建酶-DNA缀合物。Sulfo-EMCS分子一端为马来酰亚胺，另一端为琥珀酰亚胺活性酯，可分别与巯基DNA及蛋白质上活性[88]氨基进行反应，将DNA与蛋白耦联起来，如图2.5a所示。由于GOx及HRP上均含有多个活性氨基位点，因此每个GOx和HRP上也均可耦联多条DNA。其中与GOx耦联巯基DNA序列为S1，与HRP耦联巯基DNA序列为S2。我们利用NativePAGE对得到的DNA-酶缀合物进行了表征，结果如图2.5所示。第二道GOx-S1与第五道HRP-S2较第一道S1与第四道S2迁移率有明显下降，并存在多个条带及拖尾现象，说明两种酶表面均成功接枝了DNA，且平均每个酶上接枝不止一条DNA。图2.5酶与DNA通过EMCS耦联示意图及PAGE表征结果。a）GOx及HRP分别通过EMCS耦联S1及S2巯基DNA示意图；b）10%NativePAGE对酶-DNA缀合物检测。26 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控从凝胶电泳结果来看，GOx-DNA缀合物中过量DNA均已被完全除去，HRP-DNA缀合物中过量DNA也已几乎除去，只有微量占比很小剩余。我们利用紫外-可见光谱测定酶-缀合物浓度，如图2.6所示。GOx在450nm波-1-1长下有特征吸收，εGOx为28.2mM·cm，可通过A450值确定GOx-S1中蛋白浓度。考虑到GOx在280nm处也有吸收，会干扰缀合物中DNA浓度确定，在确定GOx-S1缀合物260nmDNA紫外吸收值时，我们将未接枝DNA的等浓度GOx在260nm处的吸收值扣掉，以准确得到缀合物中DNA的真实260nm吸光度，确定DNA浓度。最终结果为在GOx-S1缀合物中，每个蛋白上平均接枝2.9根DNA。HRP酶只在405nm波长下有特征吸收，εHRP-1-1为102mM·cm，可用A405值确定HRP-S2中HRP浓度。又因为HRP在280nm处无吸收，因此HRP-S2的260nm吸收即为其中DNA吸收值，可直接用来确定DNA浓度。最终得到结果为在HRP-S2缀合物中，每个蛋白上平均接枝5.9根DNA。图2.6紫外可见光谱检测酶-DNA缀合物。a）GOx-S1紫外可见光谱表征结果；b）HRP-S2紫外可见光谱表征结果。2.3.3DNA-酶缀合物与折纸孔道组装我们将HRP-S2和GOx-S1缀合物依次与DNA折纸孔道反应，通过DNA互补杂交配对将酶组装到孔道中。组装后孔道AFM表征如图2.7所示，我们发现在折纸孔道颈环标记的对侧端口附近有明显凸起结构，证明酶被成功组装到了孔道内部。通过高度分析可知，凸起结构由一高一矮两个峰组成，分别高约2.5nm和1nm。由于GOx分子量（160kDa）远大于HRP分子量（40kDa），在AFM下呈现出更高形貌，因此较高峰对应GOx，矮峰对应HRP。可以看出，GOx距离端口更近，HRP在GOx的内侧，两者间距约为15nm，均与设计相匹配。27 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控图2.7DNA-酶缀合物与折纸孔道组装AFM表征图2.3.4比较孔道在打开和闭合状态下酶级联反应的效率我们将反应物葡萄糖和ABTS与不同的催化体系混合，通过实时监测+产物ABTS•在418nm处的紫外吸收，来评估不同的催化体系下酶级联反应的效率。结果如图2.8所示，当级联反应发生在限域折纸孔道内时，其催化效率明显高于两酶游离在溶液中状态。一方面，在折纸孔道内两酶[88]之间距离只有15nm，远远低于溶液中的微米级水平，致使中间产物双氧水从GOx扩散到HRP表面的过程变得更为直接和容易；另一方面，折纸孔道内限域环境也限制了双氧水的自由扩散。两方面因素共同作用使得级联反应效率在限域孔道内有明显提升。从紫外实时检测结果中也可看出，与不含门控链的DNA折纸孔道相比，折纸孔道端口处的门控链处于单链状态时对孔道内酶级联反应几乎没有影响。这说明孔道端口处的单链并不会影响底物分子进入孔道。当加入15mer锁链与门控链完全互补配对后，孔道由打开状态转为闭合状态，此时酶促反应效率出现约28%的下降。这是由于孔道端口处由单链变为双链，后者刚性更强，占据体积更大，从而阻碍了底物分子自由扩散到孔道内部。此外，当所加入的锁链只含有8个碱基，即只能与门控链部分互补时，孔道处于半关闭状态，此时其内部酶促反应效率也有轻微下降，但下降幅度只有约8%，这进一步证明了双链的封端作用。28 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控图2.8紫外418nm处实时监测不同催化体系下酶级联反应效率当我们用锁链Sm对折纸孔道封端时，可以加入全互补的钥链CSm将其竞争性从折纸孔道上取代下来，使DNA折纸孔道解除封端重新打开。我们探究了一个打开-闭合-再打开循环过程中孔道内部酶级联反应效率，以2000s内紫外418nm处吸收值的变化作为评判酶级联反应效率依据。如图2.9a所示，当加入锁链后，级联反应效率明显下降，与图2.8结果相匹配。当加入钥链孔道再次打开时，酶促反应效率又回到和最初几乎相同的水平，从而证实了该可控开阖纳米限域孔道具有可逆调节内部酶级联反应效率的能力。如前文所述，这里我们用到的锁链对于门控链含有一个碱基错配以保证其可被钥链完全取代下来。当锁链不含错配时，在本论文实验条件下，只能部分的被钥链取代，从而不能让孔道完全回复到打开状态。如图2.9b所示，当锁链不含错配时，加入钥链后酶级联反应活性较孔道关闭状态有提高，但无法回复到最初完全打开时水平。图2.9通过孔道开阖可控调节酶级联反应效率。a）锁链与门控链含有一个碱基错配；b）锁链与门控链完全互补。29 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控2.3.5探究孔道上门控位置对酶级联反应影响在前文中，我们通过控制孔道近酶端的端口开阖来调节底物分子自由扩散进入孔道及酶级联反应效率。本小节探究了孔道远酶端端口开阖及两端孔道口均开阖对底物分子传输及内部酶级联反应的影响。2.3.5.1门控位置位于远酶端折纸孔道门控位置位于远酶端孔道设计与近酶端（图2.2）大致相同。变化之处在于将门控伸链从A列移至P列，其他设计均不变，如图2.10所示。该孔道打开及闭合状态的AFM表征方法均与前文相同，其闭合状态表征结果见图2.11a。在孔道端口处，有高约2nm凸起出现，证明该孔道处于闭合状态。由于远酶端端口与颈环标记紧邻，在AFM表征图中颈环结构峰被链霉亲和素峰所掩盖，不易看出。但从高度分析图中可看到紧邻高峰之后出现一个弱矮峰，约0.5nm，为孔道上颈环标记峰。这一结果表明了孔道上门控位置和颈环标记在同一侧，证实了门控位置位于远酶端孔道的成功构建和开阖控制。图2.10门控位置位于远酶端DNA折纸孔道平面展开设计示意图+我们同样采用检测产物ABTS•在418nm处紫外吸收的方法评估门控位置位于孔道远酶端时不同催化体系下酶级联反应效率，如图2.11b所示。可以看出当孔道闭合时酶级联反应效率较打开时只下降了约16%，与位于近酶端的门控相比，其封端效率明显降低。这表明溶液中大部分底物分子均是通过近酶端口扩散至孔道内酶表面，进而发生级联反应。30 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控图2.11门控位置位于远酶端DNA折纸孔道表征及对内部酶级联反应效率调控。a）折纸孔道闭合状态AFM表征图；b）紫外418nm处实时监测不同催化体系下酶级联反应效率。2.3.5.2两端口均含门控折纸孔道孔道本论文还设计了两端均含有门控链的DNA折纸孔道，其设计原理与图2.2和图2.10一致，即用图2.10中含门控链P列替换图2.2中不含门控链P列，其他设计均不变。我们利用AFM对该孔道的开阖做表征，方法与前文相同。闭合状态表征结果见图2.12a。在孔道两端，均有高约2nm凸起出现，证明该孔道被成功构+建且可被锁链互补关闭。随后，我们通过检测ABTS•在418nm处紫外吸收评估孔道内部酶级联反应效率。如图2.12b所示，当孔道两端均被封端时，内部酶级联反应效率较打开时下降达35%，表明在该种情况下，底物分子自由扩散进入孔道被最大程度限制。图2.12两端均含有门控链DNA折纸孔道表征及对内部酶级联反应效率调控。a）两端均含有门控链DNA折纸孔道闭合状态AFM表征图；b）紫外418nm处实时监测不同催化体系下酶级联反应效率。31 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控2.3.612nm直径可控开阖纳米孔道得益于DNA折纸结构良好的可设计性，本论文除了构建22nm直径DNA折纸孔道，还构建了孔径为12nm折纸孔道。其设计与22nm孔径孔道类似，如图2.13a所示。108条短订书钉链将M13mp18模板链绑定成矩形形状。DNA折纸平板上下边链共有20条可同时与矩形上下两处M13mp18主链互补的订书钉链，使得在退火过程中DNA折纸可卷曲成管。管长仍为100nm，但孔径变为12nm。在折纸上设计有一组可以锚定级联反应两个酶的位点，其中GOx酶锚定在C列，HRP酶锚定在F列。级联反应两个酶之间距离仍为15nm。此外，该折纸孔道近酶端口处A列5条订书钉链含有15个碱基的门控伸链。AFM表征结果如图2.13b所示，可以看出孔道长度仍为100nm左右，高约4nm，但宽度明显窄于22nm孔径折纸孔道。图2.1312nmDNA折纸孔道设计及表征。a）折纸孔道平面展开示意图；b）折纸孔道AFM表征图。12nm孔径折纸孔道的闭合过程与22nm折纸孔道相一致。闭合后AFM表征图如2.14a所示，在孔道端口处可见明显凸起，高度约为2nm，证明链霉亲和素成功结合到管口处锁链的生物素上。值得注意的是，12nm孔径孔道的凸起不如22nm孔径折纸孔道凸起明显，这是因为12nm孔径孔道端口只含有5根门控链，32 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控可结合的含有生物素锁链个数不如22nm折纸孔道（含有11根门控链）多；同时，又由于12nm孔道孔径小，可容纳链霉亲和素有限，两方面因素共同导致12nm折纸孔道端口处结合的链霉亲和素要少于22nm折纸孔道，因此管口处凸起不如后者明显。我们同样将葡萄糖和ABTS与已组装酶的不同开阖状态的折纸孔道混合，+通过实时监测产物ABTS•在418nm处的吸收，来评估在不同催化体系下酶级联反应的效率。结果如图2.14b所示，孔道闭合后反应效率较打开时下降了46%，证明12nm孔径折纸孔道同样可通过控制孔道开阖的方式来调节内部酶级联反应效率。可以看出，12nm孔道门控效率大于22nm孔道。本论文粗略估算了两种孔道中封端双链占孔道孔面积比例，过程如下：已知DNA双链中每组碱基对长度为0.34nm，15个碱基双链则为5.1nm。又因为DNA2双链直径约为2nm，估算出孔道处每条DNA双链面积约为10.2nm。12nm2孔径孔道面积约为113nm，含有五条双链，双链占孔道处面积比约为45%；222nm孔径孔道面积约为380nm，含有11条双链，此时双链占孔道处面积比约为29.6%。需要强调的是，以上结果只是粗略估算，实际情况中还需将双链的摆动、DNA分子表面带电荷等诸多因素考虑在内。然而从估算结果中也可看出，在12nm孔径尺寸下，门控链和锁链形成的双链在孔道口处所占面积比例更大，从而使得其封端效率更高。图2.1412nm孔径DNA折纸孔道表征及对内部酶级联反应效率调控。a）折纸孔道闭合状态AFM表征图；b）紫外418nm处实时监测不同催化体系下酶级联反应效率。33 第2章响应型可控开阖纳米限域孔道构建及其对纳米尺度物质传输调控2.4本章小结本章中利用DNA折纸技术构建了响应型可控开阖纳米限域孔道，通过控制孔道端口处单双链变化实现孔道的开阖。当孔道端口处为单链时，孔道为打开状态，而当加入单链的互补链使孔道端口处变为双链结构时，由于双链刚性更强，占据体积更大，会有效阻碍分子自由扩散进入孔道内部，孔道转为关闭状态。通过DNA链取代反应，孔道可再回复到单链打开状态，从而实现限域孔道的可控开阖。在限域孔道内部，我们构建有GOx-HRP酶级联反应，利用孔道开阖控制底物进入孔道通量，进而调节酶级联反应效率。通过比较孔道不同端口对内部酶级联反应的门控效率，可以知道绝大部分底物分子均是通过孔道近酶端口扩散至内部酶表面，进而发生级联反应。此外，本论文还利用DNA折纸术的精确可设计性对孔道尺寸进行了扩展，开发了不同尺寸的响应型纳米限域孔道。本章工作开辟了利用DNA纳米技术构建复杂响应型纳米限域环境的新方法，结合DNA折纸技术的优势，限域孔道的尺寸精确可调，限域环境内分子的数目及位置精确可控。该工作为体外构建复杂限域环境，调控物质在纳米尺度限域环境下的传输奠定了基础，同时也对更好的理解细胞内复杂限域条件下物质传输规律具有借鉴意义。34 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响3.1本章引言在上一章中，我们构建了响应型限域环境，实现了对于物质在纳米尺度输运的调控。在细胞中，限域环境除了为细胞内各种生命活动提供空间限制，也为其提供特异性环境，如酸性环境、膜环境等等。膜对于细胞维持生命活力，正常行使功能有着至关重要的作用。许多新陈代谢过程均离不开膜的限域作用。同时，膜对膜整合或膜结合蛋白的活性也起着重要的影响。例如，细胞中合成磷脂所需的3种酶，酰基转移酶，磷酸酶和胆碱磷酸转移酶均是在内质网膜上协同完成磷[19]脂合成，内质网膜为酶提供了特异性的两亲膜环境，富集更多的细胞质基质中底物来促进反应发生。为了更好地了解研究细胞内膜限域环境对酶促反应的影响，[89,90]科学家们开发了多种的体外膜结构来模拟生物膜，包括磷脂囊泡、聚合物囊[91][27][92,93][94]泡、凝胶化学、基于无机材料的膜及层层自组装膜等等。然而，在这些体系中，膜内酶均是随机分布在膜中，尚无法对于酶在膜中的位置和数量进行精确地调控，因此限制了对于酶促反应受限域膜环境影响的精确深入研究。框架诱导自组装是我们课题组开发的一种利用框架诱导溶液中双亲分子精确组装的策略，灵感来源于细胞骨架决定细胞形貌的原理。在框架诱导自组装策略中，框架上存在不连续的三维疏水点阵，该点阵会诱导溶液中双[42]亲分子在框架外围定向排列。若框架上为闭合疏水点阵，双亲分子最终组装成闭合囊泡结构；若框架上为非闭合疏水点阵，则双亲分子最终组装成膜[95]结构。诱导组装体形貌与骨架相匹配。我们课题组在之前的工作中，以修饰有苄醚型树状分子（DDOEG）的二维DNA折纸平板构建框架，成功诱导DDOEG分子自身在DNA折纸上组装成膜，膜尺寸、形状均与DNA折纸框架相一致。这一工作为构建纳米尺度限域膜提供了全新策略，结合DNA折纸技术优异的可设计性及可寻址性，我们可定位定量的将酶修饰在诱导组装纳米限域膜中，从而构建特异性的膜限域环境来探究其对酶促反应的影响。本章以二维DNA折纸平板为基底，利用框架诱导自组装技术构建纳米膜限域环境并探究限域膜对其中酶促反应的影响。我们利用DNA互补杂交，将南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）固定在二维DNA折纸平板上，得到结构A1。由于DNA折纸具有可寻址性，酶在DNA折纸上可被精确定位。随后，再将DDOEG分子杂交到DNA折纸上，形成疏水框架。利用该疏水框架诱导溶液中过量的DDOEG分35 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响子在DNA折纸上富集并组装成膜，而脂肪酶即被包埋限域在纳米膜中，得到结构A2，如图3.1所示。通过这种策略，我们构建了含有脂肪酶的纳米限域膜，并探究了在纳米限域膜环境中脂肪酶水解反应行为。图3.1可寻址纳米二维膜限域环境构建及其对酶促反应影响示意图3.2实验部分3.2.1试剂与材料三羟甲基氨基甲烷（Tris），乙酸，乙二胺四乙酸（EDTA），乙酸镁、盐酸，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，甘氨酸（Gly），十二烷基硫酸钠（SDS）等购于北京化学试剂公司。2+本章中所用1×TAE-Mg缓冲液的浓度为100mMTris，50mM乙酸，5mMEDTA，12.5mM乙酸镁，乙酸调pH值至7.0。+1×PB-Na缓冲液浓度为20mM，含150mMNaCl，pH值为7.4。Tris-HCl缓冲液的浓度为50mMTris，150mMNaCl，利用HCl调pH至6.8或8.8。1×Tris-Gly-SDS缓冲液的浓度为40mMTris，250mMGly，0.1%SDS（w/v）。对硝基苯酚乙酸酯（PNPA），2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖脂（GBz4）36 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响购置于梯希爱公司。南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）购于杭州创科生物。交联剂N-[(ε-maleimidocapropyloxy)sulphosuccinimideester]（sulfo-EMCS）购置于Pierce公司。葡萄糖氧化酶（GOx）、辣根过氧化物歧化酶（HRP）购置于Sigma公司。荧光分子尼罗红购于Acros公司。曲拉通x-100、胰蛋白酶购置于Gibco公司。BSA蛋白定浓试剂盒购与欣经科公司。2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购置于Sigma公司。葡萄糖购于北京化学试剂公司。[42]DDOEG中接枝有OEG的树状分子部分由本课题组张懿旸博士合成纯化，合成路线如附图A.1所示。DDOEG中DNA序列为5’-GTGATGAGAGGATA。[96]2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖脂（GAc4）及1-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖脂[97]（GAc）由本课题组张国梁助理研究员合成。M13mp18单链DNA购置于NewEnglandBiolabs公司，货号N4040S，浓度为100nM。所有DNAorigami所需订书钉短链（PAGE纯化）购置于梓熙生物公司，其序列见附表B.1、附表B.8及附表B.9。巯基修饰的DNA购于梓熙生物公司，经过高效液相色谱（HPLC）纯化，其序列为5’-SH-CTACCTGCTACGAAC。3.2.2实验仪器MALDI-TOF质谱（AXIMA）岛津公司天平（Me104）梅特勒公司离心机（Centrifuge5415R）Eppendorf公司电泳仪（JY1600C）北京君意东方公司TM纯水仪（DirectQ）密理博公司PCR仪（EDC-810）东胜公司@pH计（InlabMicro）梅特勒公司紫外-可见光谱仪（VarianCary100）安捷伦公司凝胶成像仪（212PRO）柯达公司动态光散射（ZetasizerNanoZS90）马尔文公司荧光光谱仪（HITACHIF-450）日本日立公司原子力显微镜（MultiModeVIII）布鲁克公司DNA固相合成仪（Mermaid）BioAutomation公司3.2.3实验操作3.2.3.1DNA折纸结构的制备2+将形成目标组装体的短链DNA和M13mp18模板链DNA在1×TAE-Mg缓37 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响冲液中混合，其中模板链DNA的浓度为5nM，相应的短链DNA过量10倍，经PCR仪以-1ºC/100s的速度从95ºC退火15ºC。得到组装体经100K超滤管纯化三次去掉过量的短链DNA，离心条件为2000rcf，10min。纯化后的组装体通过测定其在260nm处紫外吸收值确定浓度。3.2.3.2CALB-DNA缀合物的合成+将100µMCALB与10mMSulfo-EMCS混合，缓冲液为PB-Na缓冲液。于25ºC反应6h，10K超滤离心管12,000rcf，30min离心纯化三次，除去过量的Sulfo-EMCS。之后，将得到的CALB-EMCS与10倍体积100µM巯基DNA混合，+缓冲液为PB-Na缓冲液。25ºC反应6h，30K超滤管12,000rcf，25min离心纯化三次，去除过量的巯基DNA，得到CALB-DNA缀合物。对于CALB-DNA缀合物中CALB的浓度，采用BSA蛋白定浓试剂盒测定；DNA浓度通过测定260nm处紫外吸收值确定。3.2.3.3CALB-DNA缀合物的表征1）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表征聚丙烯酰胺浓缩胶浓度为5%，缓冲液为pH为6.8的Tris-HCl；分离胶浓度为12%，缓冲液为pH为8.8的Tris-HCl。凝胶电泳缓冲体系为1×Tris-Gly-SDS缓冲液，初始电压为80V，待蛋白样品到达分离胶后升高电压至120V，电泳1h。之后，用考马斯亮蓝染液对凝胶染色2h，随后用脱色液浸泡30min，反复脱色三次后在凝胶成像仪上白光拍照。2）琼脂糖凝胶电泳表征2+琼脂糖凝胶浓度为2%，缓冲液为1×TAE-Mg，电压为10V/cm，电泳时间为1h，电泳温度为4ºC。电泳后利用凝胶成像仪紫外光拍照。3.2.3.4DDOEG分子的合成DDOEG分子由三部分组成，分别是DNA、树状分子和OEG（图3.1）。OEG接枝树状分子（DOEG）的合成路线如附图A.1所示，具体合成方法可以参考本[42]课题组孙亚伟博士的博士毕业论文和相关参考文献。将DOEG分子经2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺活化后，通过DNA固相合成仪连接到单链DNA上，耦联时间30min。终产物通过MALDI-TOF进行表征，理论分子量8762，测定分子量为8730（附图A.2）。38 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响3.2.3.5含酶纳米限域膜构建将2nMDNA折纸与8nMCALB-DNA混合，4°C静置30min，得到含酶DNA折纸（A1），随后向体系中加入10µMDDOEG，4°C条件下静置24h，得到含酶纳米限域膜（A2）。3.2.3.6AFM对A1及A2表征本章中所有原子力显微镜表征均在液相扫描模式下进行，扫描所用buffer为2+1×TAE-Mg缓冲液，扫描模式为ScanAsystinFluid，该模式下，系统自动调整扫描参数，一般情况下，Setpoint值为0.02~0.03，FeedbackGain值为10~15，扫描速度为0.996Hz。扫描头为EScanner。扫描探针为Bruker公司的ScanAsyst-Fluid+探针，共振频率为150kHz，弹性系数为0.7N/m。3.2.3.7利用纳米限域膜富集尼罗红分子及表征三个EP管中各加入5µL0.036mM的尼罗红丙酮溶液，暗室放置过夜让溶剂2+完全挥发。向三管中分别加入20µL的1×TAE-Mg缓冲液、DNA折纸和纳米限2+域膜。暗室放置24h让尼罗红分子充分进入纳米膜疏水区域。之后用1×TAE-Mg缓冲液将三组样品体积补到200µL，再分别测定各样品荧光发射光谱，其中激发波长550nm，扫描范围为580nm至780nm。3.2.3.8对硝基苯酚乙酸酯（PNPA）酶促水解反应效率检测将PNPA溶于0.1%曲拉通水溶液，配制成1mMPNPA浊液。将该浊液加入到不同催化体系中，最终体系中PNPA0.1mM，CALB1nM，含0.01%曲拉通，2+缓冲液为1×TAE-Mg。CALB可以将PNPA水解成对硝基苯酚，后者在400nm波长处有紫外吸收，利用紫外光谱实时监测酶反应效率。反应温度控制在25°C。3.2.3.9三种葡萄糖酯酶促水解反应效率检测以GBz4为例，将GBz4溶于0.1%曲拉通水溶液，配制成40mMGBz4浊液。将该浊液加入到不同催化体系中，同时加入GOx、HRP及ABTS，使得最终体系中GBz44mM，CALB1nM，ABTS0.5mM，GOx2µM，HRP2µM，含0.01%曲2+拉通，缓冲液为1×TAE-Mg。CALB可水解GBz4生成葡萄糖，后者被GOx氧化为葡萄糖酸同时将氧气还原为H2O2，过氧化氢在HRP的表面可被进一步还原，+同时氧化ABTS，生成ABTS•，该分子在418nm处有紫外吸收。利用紫外光谱实时监测酶级联反应的效率。反应温度控制在25°C。39 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响对于GAc4和GAc的水解及检测，与GBz4完全一致。其中GAc4的曲拉通水溶液为浊液，GAc曲拉通水溶液为澄清溶液。3.2.3.10胰蛋白酶水解实验将胰蛋白酶加入到不同催化体系中，胰蛋白酶浓度为0.125%（w/v），缓冲液为2+1×TAE-Mg，37°C水解8h。以PNPA为底物进行酶催化水解活性检测。3.3结果与讨论3.3.1含酶纳米限域膜体系设计本课题利用二维DNA折纸平板作为模板构建含酶纳米限域膜。DNA折纸平板在设计中遵循P.W.Rothemund提出的二维DNA折纸的设计原则，共使用216条短订书钉链将一条长的M13mp18模板链DNA绑定。在216条订书钉链中，共有59条订书钉链含有伸链序列，该59条订书钉链在折纸上均匀排布，如图3.2所示。其中177、141、31、67四条订书钉链含有15个碱基的伸链，序列为5’-GTTCGTAGCAGGTAG，与CALB-DNA缀合物互补。另外55条订书钉链伸链序列为5’-CTATCCTCTCATCAC，与DDOEG互补。两种伸链在同一平面，且均为15个碱基，以保证CALB和DDOEG分子的疏水头在同一高度平面，当DDOEG分子诱导组装成膜后，CALB位于膜中。图3.2二维DNA折纸设计，蓝色链代表折纸上与酶互补伸链，绿色链代表折纸上与DDOEG互补伸链，所有订书钉链编号在5’端，箭头为3’端。40 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响二维DNA折纸平板与CALB-DNA缀合物按照1:4的比例反应，待CALB通过DNA互补配对杂交到DNA折纸平板上后，再向体系中加入10µMDDOEG分[42]子，由于该条件下DDOEG分子的CMC>10µM，DDOEG分子不会在溶液中发生组装，而是通过DNA互补配对与DNA折纸表面的伸链结合。当DDOEG分子杂交在DNA折纸上后，在DNA折纸的表面上形成了一个局部高DDOEG浓度区域，进而诱导溶液中游离的DDOEG分子在表面上通过疏水作用发生自组装，从而在DNA折纸上形成一个二维尺度的纳米膜，CALB酶被包裹在纳米膜中。3.3.2含酶纳米限域膜制备及表征3.3.2.1DNA折纸结构的表征2+将形成目标组装体的短链DNA和M13mp18模板链DNA在1×TAE-Mg缓冲液中混合，其中模板链DNA的浓度为5nM，相应的短链DNA过量10倍，经PCR仪以-1ºC/100s的速度从95ºC退火至15ºC。得到组装体经100K超滤管纯化去除过量短链。我们通过原子力显微镜（AFM）对组装体形貌进行表征，如图3.3所示。绝大部分DNA折纸均形成了预期长方形结构，长轴尺寸约为100nm，短轴尺寸约为70nm，高度约2nm，均与设计相符。图3.3二维DNA折纸AFM表征图41 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响3.3.2.2CALB-DNA缀合物表征与上一章采用相同策略，本章同样以Sulfo-EMCS为耦联剂构建CALB-DNA缀合物。Sulfo-EMCS分子一端为马来酰亚胺，另一端为琥珀酰亚胺活性酯，分别与巯基DNA及蛋白质上氨基进行反应，从而将DNA与蛋白耦联起来。我们首先采用SDS-PAGE对合成的CALB-DNA缀合物进行表征。SDS-PAGE结果如图3.4所示，其中第一道为CALB，第二道为CALB-DNA缀合物，第三道为DNA。由图可知，DNA不能被蛋白染料考马斯亮蓝染色；第二道CALB-DNA缀合物条带迁移率明显小于第一道中的CALB条带迁移率，说明DNA成功的修饰到了酶的表面。由于CALB表面活性氨基数目不只一个，因此平均一个酶上可以修饰多个DNA分子，第二道中的多条带及拖尾现象证实了这一点。为了确定平均每个CALB上接枝DNA的数目，我们对CALB-DNA缀合物进行了浓度测定。由于CALB在200~800nm波长范围内无紫外可见吸收，因此我们采用BSA蛋白定浓试剂盒测定CALB-DNA缀合物中CALB的浓度，通过测定缀合物在260nm处紫外吸收值确定其DNA浓度。通过计算发现平均每个蛋白上接枝有1.5条DNA。1
2
3
4

kDa
170#
130#
100#
70#
55#
40#
35#
25#
15#
10#
图3.4SDS-PAGE检测Calb-DNA缀合物42 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响此外，本课题还通过琼脂糖凝胶电泳对CALB-DNA缀合物做了进一步表征。在图3.5a中，第一道为DNA，第二道为CALB-DNA缀合物，第三道为CALB。CALB不能被核酸燃料Gelred染色。第二道CALB-DNA迁移率明显低于DNA迁移率，证明DNA成功的修饰到了酶上。在图3.5b中，第一道为CALB-DNA缀合物上DNA的互补序列，第二道为CALB-DNA缀合物与其互补序列的杂交条带，第三道为CALB-DNA缀合物，第四道为CALB。其中第二道和第三道CALB-DNA缀合物的上样量完全一致。由图3.5b可知，第二道条带强度明显强于第三道，说明第二道中CALB-DNA缀合物与其互补序列发生了杂交，由于双链DNA比单链DNA易于染色，且从单链变为双链DNA含量翻倍，因此条带强度增大。这一结果进一步证明了我们成功的将DNA接枝到CALB的表面，并且DNA仍具备互补配对能力。图3.5琼脂糖凝胶电泳检测CALB-DNA缀合物3.3.2.3含酶纳米限域膜表征将2nMDNA折纸与8nMCALB-DNA缀合物混合，4°C静置30min，构建含酶DNA折纸（A1），利用AFM对其进行表征。如图3.6a所示，在结合了CALB-DNA缀合物后，DNA折纸平板上出现四个高度突出的亮点，突出的位置与我们所设计的与CALB-DNA缀合物互补的伸链位置一致，从而证明了CALB-DNA缀合物通过DNA互补配对成功结合在了DNA折纸的特定位置。从图中可以看出绝大多数DNA折纸平板上均结合了4个酶。我们对DNA折纸上结合酶数目进行了统计，结果如图3.6b所示，经简单换算可知超过90%的CALB-DNA缀合物均结合到了DNA折纸上，结合效率非常高。43 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响图3.6AFM表征含酶DNA折纸（A1）及结合效率统计。a）A1结构AFM表征图；b）结合效率统计。随后，我们向体系中加入10µMDDOEG，4°C静置24h，构建含酶纳米限域膜（A2）。AFM表征结果如图3.7所示，在DNA组装体表面上出现一层高度更高的分子层，其形状较DNA折纸尺寸略小，高度约为6nm。这一结果清晰地表明DDOEG分子在DNA折纸上发生了自组装，生成二维纳米膜。同时，我们发现当形成DDOEG分子膜后，折纸上CALB酶被包埋在膜中不再能被AFM探测到，这也与预期相符。44 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响图3.7AFM对含酶纳米限域膜（A2）表征3.3.3探究纳米限域膜对其中酶促反应的影响3.3.3.1对PNPA水解的影响将PNPA浊液加入到不同催化体系中，保证所有催化体系最终PNPA浓度为2+0.1mM，CALB1nM，含0.01%曲拉通，缓冲液为1×TAE-Mg。CALB可以水解PNPA生成对硝基苯酚，后者在400nm波长处有紫外吸收，通过实时监测终产物在400nm处的紫外吸收值，可以评估酶级联反应的效率。本课题共研究了四种不同的催化体系，分别为：1、A2体系；2、CALB-DNA缀合物与DDOEG（10µM）共混体系；3、A1体系；4、只有CALB-DNA缀合物的对照体系。紫外实时监测结果如图3.8a所示，可以看出在各个体系中水解速率均较低，这是由于PNPA在水中极低溶解度所致。为使数据直观，我们将体系1、2、3的水解效率对体系4的效率作归一化，结果如图3.8b所示。可以看出体系3的水解效率与体系4几乎相同，只有极微弱的下降，这说明将酶通过DNA互补杂交配对的方式固定在折纸45 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响平板上几乎对底物分子与酶上活性位点相接触没有影响。我们推测在体系1中，即酶被包埋在纳米限域膜内，由于酶自由转动受限会使酶促反应效率下降。但是如图3.8所示，体系1的水解效率较体系4不降反升，提升幅度约为24%。同时，体系2表明DDOEG分子对于酶活性无影响，因此可以证明体系1中酶促反应效率的提升是由于双亲性的纳米膜富集溶液中溶解的痕量底物分子至膜内CALB周围，提高了酶周围反应物的浓度，从而促进反应效率的提升。从图3.8b中也可看到，A2体系的误差较大。这是由于CALB上有多个活性氨基位点，其接枝DNA的位置、数目有多种方式，因此，当CALB-DNA缀合物互补到DNA折纸上时，CALB会存在不同的取向。在A2体系中，由于有纳米限域膜的限制，酶的自由摆动旋转均受限，因此当酶上活性位点暴露在外侧时，水解效率较高，反之则较低。与之相对应，在A1体系中虽然酶也被固定在折纸平板上，但是由于没有纳米限域膜限制，酶仍然可以自由旋转摆动，因此A1体系误差相对较小。图3.8不同催化体系催化PNPA水解效率比较。a）紫外400nm处实时监测不同催化体系酶促反应；b）体系1、2、3水解效率对体系4效率作归一化结果图。其中，催化体系1为A2体系、催化体系2为CALB-DNA缀合物与DDOEG共混体系、催化体系3为A1体系、催化体系4为只含CALB-DNA缀合物的对照体系。3.3.3.2纳米限域膜对疏水荧光分子尼罗红的富集为了进一步证实A2体系可提高其中酶水解效率是由于膜对底物分子的富集作用，本章采用疏水尼罗红荧光分子作为探针进行富集实验的验证。结果如图3.9所示，当DNA折纸上形成了纳米限域膜时，其对于疏水尼罗红分子的富集作用较未形成纳米膜的DNA折纸及缓冲液体系均有明显的增强。这进一步证实了该纳米限域膜可以富集溶液中的疏水分子。46 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响图3.9纳米限域膜对疏水荧光分子尼罗红富集3.3.3.3纳米限域膜对底物选择性富集的研究本课题选取了两种不同的疏水葡萄糖酯来研究该纳米限域膜对底物富集作用的选择性。两种葡萄糖酯分别为含有苯环结构的2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖脂（GBz4）及不含苯环结构2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖酯（GAc4）。CALB可水解糖酯生成葡萄糖，后者被溶液中游离GOx氧化为葡萄糖酸同时将氧气还原为H2O2，H2O2在HRP的表面可被进一步还原，同时将ABTS氧化，生成+ABTS•，后者在418nm处有紫外吸收。由于糖酯水解生成葡萄糖速率是该级联[37]+反应的限速步骤，因此可以通过监测最终产物ABTS•的生成情况来评估水解反应效率。与PNPA水解相同，我们研究了每一种葡萄糖酯在四种不同的催化体系中水解效率。其中所有催化体系最终的葡萄糖酯浓度为4mM，CALB1nM，ABTS2+0.5mM，GOx2µM，HRP2µM，含0.01%曲拉通，缓冲液为1×TAE-Mg。图3.10a、3.10b表示了GBz4、GAc4两种底物分别被四种不同催化体系催化水解的紫外实时监测结果。同样地，我们将体系1、2、3的水解效率对体系4的效率作归一化，结果如图3.10c所示。从图中可以看出，在以GBz4为底物的四个水解体系中，体系1的水解效率明显高于体系2、3、4，证明纳米限域膜对底物GBz4具有富集作用。但当底物为GAc4时，体系1的水解效率与其他三个体系并无明显差异。结果表明纳米限域膜对疏水底物富集作用有选择性，并不是所有疏水性底物分子均有富集作用，只有当底物分子含有芳香环结构，方可被膜富集。我们推测这是由于纳米限域膜是由DDOEG分子构成的，而DDOEG分子又为富含苯环结构的分子，由于GBz4上同样含有苯环，可通过π-π相互作用被富集到纳米膜上。而GAc4分子不含芳香环结构，与膜无π-π相互作用，因此在膜上的富集效果不明显。本章中之前证明该纳米膜具有富集作用的分子，PNPA和尼罗红，均含有苯环结构，也进一步证实了π-π相互作用是该纳米限域膜富集分子的重要驱动力。47 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响在GAc4水解过程中，体系1与体系4并无明显差异，我们认为这是两方面原因中和作用的结果：一方面，虽然GAc4与纳米膜无特异性π-π相互作用而不能达到GBz4的富集程度，但是其上疏水基团与两亲性膜仍有疏水相互作用，使得膜周围底物分子浓度要高于溶液中水平，从而也会使得水解效率有所提高；另一方面，膜的限域性也会阻碍酶的自由旋转和摆动，使酶促反应效率下降。两种因素中和作用结果，使得在GAc4水解过程中，体系1和体系4效率差异并不明显。图3.10紫外418nm处实时监测不同体系催化a）GBz4；b）GAc4的水解反应。c）体系1、2、3的水解效率对体系4的效率作归一化结果图。其中，体系1为A2体系、体系2为CALB-DNA缀合物与DDOEG（10µM）共混体系、体系3为A1体系、体系4为只含CALB-DNA缀合物的对照体系。我们还探究了该纳米限域膜对亲水性底物的富集作用。这里所用底物分子为1-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖酯（GAc），与GBz4和GAc4相似，GAc同样可被CALB+水解生成葡萄糖，进而触发GOx-HRP酶级联反应，通过监测终产物ABTS•的生成情况评估水解反应效率。我们同样研究了GAc在四种不同的催化体系中水解效率，实验条件与水解GBz4和GAc4完全相同。结果如图3.11所示，可以看出四种催化体系中酶级联反应都在很短的时间内进行完全，证明GAc均以极快的速率被CALB水解。这是由于底物分子GAc为水溶性分子，在水溶液中即可很快地与CALB结合。此时纳米限域膜对底物GAc并未显现出明显的富集效果，这也进一48 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响步表明了纳米限域膜对底物富集作用具有选择性。图3.11紫外418nm处实时监测不同体系催化GAc的水解反应。体系1为A2体系、体系2为CALB-DNA缀合物与DDOEG（10µM）共混体系、体系3为A1体系、体系4为只含CALB-DNA缀合物的对照体系。3.3.3.4纳米限域膜对其内部酶保护性研究生物膜对于膜结合酶或膜整合酶具有一定的保护作用，本课题也探究了该纳米限域膜对内部酶的保护性。我们将胰蛋白酶加入到催化体系1、2、3中，37°C水解8h后，以PNPA为底物研究不同体系被胰蛋白酶处理后水解效率。体系4作为对照组未加入胰蛋白酶，但同样在37°C孵育8h，保证实验条件一致。我们将体系1、2、3的水解效率对体系4的效率作归一化，结果如图3.12所示。从图中可以看出，经胰蛋白酶处理后，体系2、3的水解效率有明显下降，但体系1并未受胰蛋白酶影响，证明该纳米限域膜也如细胞内膜结构一样，可以对其内部的酶起到保护作用。图3.12催化体系1、2、3经胰蛋白酶处理后与未经蛋白酶处理体系4水解PNPA效率比较。a）紫外400nm实时监测不同体系酶促反应；b）体系1、2、3水解效率对体系4效率作归一化图。体系1为A2体系、体系2为CALB-DNA缀合物与DDOEG共混体系、体系3为A1体系、体系4为CALB-DNA缀合物对照体系。49 第3章纳米限域膜构建及对其内部酶促反应影响3.4本章小结本章以二维DNA折纸为模板，利用框架诱导自组装策略，成功构建了含有脂肪酶的纳米膜限域环境，同时探究了膜限域环境对其内部酶促反应的影响。研究发现，纳米限域膜可富集溶液中的疏水底物分子，从而使其内部酶的周围底物分子浓度升高，提升酶促反应效率。此外，该纳米限域膜也表现出了对底物的选择性：只有当疏水底物含有芳香环结构时，膜才会对其富集。这是由于底物分子的芳香环和膜上DDOEG分子苯环间存在π-π相互作用。同时，该纳米膜也可以保护其内部酶不被蛋白酶降解。该工作为构建纳米膜限域环境，研究酶在纳米限域膜中行为提供了有效策略，有助于更好的理解膜限域环境在细胞内的功能，例如对于酶促反应的影响等。同时，本工作也为定量可控研究酶与膜相互作用奠定了基础，对于物质在纳米尺度限域膜中的传输研究，该工作也具有一定指导意义。50 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装4.1本章引言在上一章中，我们构建了特异性膜纳米限域环境来模拟生物膜限域环境并探究其对内部酶促反应的影响。在细胞中，限域环境除了具有可以调节物质传输、为酶促反应等生化过程提供特异性环境等功能外，还可精确调控生物分子的折叠、组装和修饰。例如分子伴侣可依靠内部纳米限域空腔来辅助蛋白质进行正确折叠。如何在体外构建尺寸精确可控限域环境来探究其对分子组装行为的影响，是体外模拟细胞限域环境的重点问题之一。DNA纳米材料由于DNA分子的可设计性、可识别性等优良特性，成为构建精确尺寸纳米限域环境的理想材料。哈佛大学尹鹏等人在DNA折纸限域空腔内进[98]行金属纳米颗粒的生长，得到的金属纳米颗粒尺寸形貌与DNA折纸框架相匹配。耶鲁大学林晨翔、杨洋等人利用DNA折纸技术构建了修饰有磷脂分子的纳米限域圆环。圆环内磷脂可诱导溶液中磷脂分子组装，使得组装后磷脂囊泡尺寸严格受限域圆环尺寸控制。他们均在这一领域做出了开拓性工作。在本章中，我们在构建尺寸可控限域环境并用于调控诱导分子组装领域做了进一步的尝试和拓展。我们利用DNA折纸技术构建了特异性疏水限域孔道，探究疏水限域孔道对基于DNA的两亲性嵌段聚合物DNA-b-聚环氧丙烷（DNA-b-PPO）自组装的影响。DNA所具有的可编程性、碱基识别性等特点赋予了两亲性DNA嵌段共聚物许多独特的性质，其在模板化和载药体系中的应用潜质已开始被科学家们所关注。对于基于DNA的两亲性嵌段聚合物在限域环境下组装行为的研究不仅有助于构建尺寸可控载药体系，并探究载药体系在体内限域环境中的稳定性，也可帮助我们更好的模拟和理解细胞内特异性限域环境辅助诱导分子组装折叠的功能。我们的设计方案如图4.1所示。DNA折纸孔道设计与第二章相似，通过在孔道内部引入DDOEG分子，构建特异性疏水纳米限域环境。随后向体系中加入温敏性双亲分子DNA-b-PPO，探究双亲分子在疏水限域孔道内的组装行为。此外，本章中还通过改变DNA折纸结构的设计，在孔道内部不同位置构建疏水环境，以实现双亲分子在孔道内部的定位组装。最后，我们以该限域环境中组装体为模板，进行了SiO2原位可控生长的探索。51 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装图4.1DNA折纸孔道构建疏水限域环境诱导双亲分子组装示意图4.2实验部分4.2.1试剂与材料三羟甲基氨基甲烷（Tris），乙酸，乙酸镁，乙二胺四乙酸（EDTA）等购于2+北京化学试剂公司，本章中所述1×TAE-Mg缓冲液的浓度为100mMTris，50mM乙酸，5mMEDTA，12.5mM乙酸镁，乙酸调pH值至8.0。二硫苏糖醇（DTT）购于Sigma公司，正硅酸乙酯（TEOS）购置于梯希爱公司。聚环氧丙烷（PPO）购于Sigma公司。DDOEG及含双硫键DDOEG分子（D-S-S-DOEG）中DOEG部分由本课题组张懿旸博士合成纯化，其上DNA序列为5’-GTGATGAGAGGATAG。M13mp18单链DNA购置于NewEnglandBiolabs公司，货号N4040S，浓度为100nM。所有DNAorigami所需订书钉短链购置于梓熙生物公司，购买时已经丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。双硫键修饰的DNA购于梓熙生物公司，序列为5’-S-S-GTGATGAGAGGATAG，经高效液相色谱（HPLC）纯化。云母片购于北京中镜科仪技术有限公司。AmiconUltra-0.5mL超滤离心管购于北京欣经科生物科技有限公司。52 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装4.2.2实验仪器MALDI-TOF质谱（AXIMA）岛津公司离心机（Centrifuge5415R）Eppendorf公司电泳仪（JY1600C）北京君意东方公司纯水仪（DirectQTM）密理博公司PCR仪（EDC-810）东胜公司pH计（Inlab@Micro）梅特勒公司天平（Me104）梅特勒公司紫外-可见光谱仪（VarianCary100安捷伦公司凝胶成像仪（212PRO）柯达公司动态光散射（ZetasizerNanoZS90）马尔文公司透射电子显微镜（JEM-1011TEM）日本电子原子力显微镜（MultiModeVIII）布鲁克公司DNA固相合成仪（Mermaid）BioAutomation公司荧光光谱仪（HITACHIF-450）日本日立公司4.2.3实验操作4.2.3.1DNA组装体的制备2+将形成目标组装体的短链DNA和M13mp18模板链DNA在1×TAE-Mg缓冲液中混合，其中模板链DNA的浓度为5nM，相应的短链DNA过量10倍，经PCR仪程序退火，以-1ºC/100s的速度从95ºC降至15ºC。得到组装体经100K超滤管纯化三次除去过量的短链DNA，条件为2000rcf，10min。纯化后的组装体通过测定其在260nm处紫外吸收值确定浓度。4.2.3.2DDOEG及D-S-S-DOEG分子的合成本章所用DDOEG分子与第三章DDOEG分子完全相同。其由三部分组成，分别是DNA、树状分子和OEG（图4.1）。OEG接枝树状分子（DOEG）的合成路线如附图A.1所示，具体合成方法可以参考本课题组孙亚伟博士的博士毕业论[42]文和相关参考文献。之后，DOEG分子经2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺活化后，通过DNA固相合成仪连接到单链DNA上，耦联时间30min。终产物通过MALDI-TOF进行表征，理论分子量8762，测定分子量为8730（附图A.2）。对于含双硫键的DDOEG分子，其DOEG部分不变，与之耦联DNA的5’末端为53 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装巯基单体，耦联时间也为30min。终产物通过MALDI-TOF进行表征，理论分子量8958，测定分子量为9057（附图A.3）。4.2.3.3DNA-b-PPO分子的合成DNA-b-PPO的具体合成方法可以参考本课题组赵志勇博士的毕业论文及相关[99]参考文献。首先令带羟基的PPO（Mn~2000g/mol）与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应，将其活化，再进一步通过DNA固相合成仪连接到单链DNA上，耦联时间30min。其DNA序列为5’-TGGTGAAGTAGATGTGTA。终产物通过MALDI-TOF进行表征，理论分子量7695，由于实验所用PPO分子具有一定分子量分布，因此测定分子量为7500~7800（附图A.4）。4.2.3.4折纸孔道内诱导组装体的形成首先，将DNA折纸与折纸上伸链等当量的DDOEG分子共混，37ºC静置2h。之后，加入在4ºC储存的DNA-b-PPO，使其终浓度为10µM，37ºC静置48h，通过透射电镜、原子力显微镜、琼脂糖凝胶电泳等对其进行表征。向体系中加入DNA修饰的纳米金颗粒，修饰的DNA与DNA-b-PPO上序列互补，金颗粒尺寸约为20nm，终浓度为10nM。30ºC静置10h，透射电镜表征。D-S-S-DOEG诱导组装体方法与DDOEG完全相同。在组装体形成之后，向体系中加入10mMDTT，37ºC反应24h。通过透射电镜、原子力显微镜、动态光散射等进行表征。纳米金颗粒互补实验与上文相同，金颗粒尺寸为5nm。4.2.3.5二氧化硅的可控生长将20µL，2nM已形成诱导组装体的折纸孔道与5µLTEOS混合，25ºC静置10h。4.2.3.6限域孔道内诱导组装体富集尼罗红分子及表征三个EP管中各加入5µL0.036mM的尼罗红丙酮溶液，暗室放置过夜让溶剂完全挥发。向三管中分别加入20µL的DNA折纸孔道，修饰有DDOEG的DNA折纸孔道和已形成诱导组装体DNA折纸孔道。暗室放置24h让尼罗红分子充分2+进入纳米膜疏水区域。之后用1×TAE-Mg缓冲液将三组样品体积补到200µL，再分别测定各样品荧光发射光谱，其中激发波长550nm，扫描范围为580nm至780nm。54 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装4.2.3.7原子力显微镜成像2+本章中所有原子力显微镜表征均为液相扫描结果，扫描buffer为1×TAE-Mg，扫描模式为ScanAsystinFluid，该模式下，系统自动调整扫描参数，一般情况下，Setpoint值约为0.02~0.03，FeedbackGain值约为10~15，扫描速度为0.996Hz。扫描头为EScanner。扫描探针为Bruker公司的ScanAsyst-Fluid+探针，其共振频率为150kHz，弹性系数为0.7N/m。4.2.3.8透射电子显微镜成像取5µL样品滴于等离子处理过碳支持膜的铜网上，2min后用滤纸从边缘吸去残留溶液，2.5µLH2O洗两次，第一次洗后立即用滤纸吸干，第二次停留30s。之后用2.5µL乙酸双氧铀染色两次，第一次染色后立即用滤纸吸干，第二次停留30s~45s后用滤纸吸干。待干燥完全后透射电镜观察。4.2.3.9动态光散射样品量20µL，测试温度为25ºC，每个样品扫描三次统计结果。4.2.3.10琼脂糖凝胶电泳2+本章中所用琼脂糖凝胶浓度为1%，缓冲液为1×TAE-Mg，电压为10V/cm，电泳时间为1h，室温。电泳后利用凝胶成像仪紫外光拍照。4.2.3.11变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳浓度为20%，其中丙烯酰胺：N,N-亚甲基二丙烯酰胺=19:1。凝胶缓冲液及电泳缓冲液均为1×TBE缓冲液，电压为15V/cm，电泳时间为6h，电泳温度为25ºC。电泳后利用StainsAll溶液染色20min，凝胶成像仪上通过白光拍照。4.3结果与讨论4.3.1DNA折纸孔道设计与第二章构建DNA折纸孔道策略相一致，本章同样基于二维DNA折纸平板的卷曲构建DNA折纸孔道。孔道长约为100nm，孔径为22nm。DNA折纸平板设计如图4.2所示，共使用216条短订书钉链将一条长的M13mp18模板链DNA55 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装绑定。订书钉链序列详见附表B.1及附表B.10。共有20条上下边链（图4.2中绿色链）可与折纸平板上下两条模板链同时互补配对，使得在退火过程中DNA折纸可卷曲成管（详见图2.2b）。由于DNA折纸平板在溶液中并非严格平面结构，[84]而是具有一定的曲率，因此其在成管过程中会沿着凹面走向进行卷曲。在设计中，除去左右两列边链我们将订书钉链共分为16列，编号从A到P。孔道的A、B两列各伸出11条可与DDOEG进行互补的伸链。根据P.W.Rothemund提出的[74]每八个碱基约旋转90°的原则，我们通过控制伸链伸出的位置来控制伸链朝向，保证在形成孔道后所有伸链均朝向其所在纵切面圆心。图4.2A、B两列含伸链DNA折纸孔道平面展开示意图。每条订书钉链编号在5’端，箭头为3’端。红色链为含伸链订书钉链，黑色部分为该订书钉链上伸链部分。绿色链为辅助折纸卷曲成孔道上下边链。4.3.2DNA纳米限域环境构建及诱导双亲分子组装2+将形成目标组装体的短链DNA和M13mp18模板链DNA在1×TAE-Mg缓冲液中混合，其中模板链DNA的浓度为5nM，相应的短链DNA过量10倍，经PCR以-1ºC/100s的速度从95ºC退火至15ºC。得到组装体经100K超滤管纯化去除过量短链。我们首先通过AFM对这一组装体的形貌进行了表征，结果如图4.3a所示。AFM图像表明，DNA组装体都形成了预期的孔道结构，孔道长约为100nm，高度为4nm，均与设计相符。此外，我们又利用TEM对该结构进行了进一步的确认，透射电镜下圆筒长度约为100nm，直径约为20nm，均符合设计。56 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装向DNA折纸孔道体系中加入与折纸上伸链等当量的DDOEG分子进行共混，37ºC静置2h。同样利用AFM和TEM对其进行表征，结果如图4.3b所示。可以看出，当DDOEG通过碱基配对互补到孔道端口A、B两列上时，AFM结果显示孔道端口处有约0.5nm的轻微高度增加，TEM图像上圆筒端口处有很窄的区域衬度变大，两方结果均表示了孔道端口处发生了结构变化，证明了DDOEG分子成功地互补到了孔道的端口处。自此，DNA折纸孔道内部疏水性限域环境被成功构建出来。图4.3DNA折纸疏水限域孔道构建及诱导双亲分子组装AFM及TEM表征图。a）DNA折纸孔道；b）DNA折纸疏水孔道；c）疏水孔道内形成诱导组装体。我们向疏水限域孔道体系中加入浓度为10µM的DNA-b-PPO，于37ºC静置48h，使其充分组装。随后，利用AFM和TEM对组装结果进行表征（图4.3c）。通过AFM结果可以发现，在引入DNA-b-PPO之后，孔道端口处出现一个明显的近似球形结构，高度约为2.5nm，直径约为26nm。由于体系中除了DNA-b-PPO外再无其他分子，可知该组装体只能由DNA-b-PPO构成；同时DNA-b-PPO上序列又均不能与DNA折纸或DDOEG进行互补，因此可知组装体并非通过DNA互补配对形成而是由DNA-b-PPO自组装而成。由于DNA-b-PPO在37ºC时的临界57 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装[99]胶束浓度（CMC）大于10µM，因此可知DNA折纸孔道内部DDOEG疏水环境起到了诱导DNA-b-PPO分子在孔道端口处聚集的作用，后者进而产生组装行为。TEM表征结果如图4.3c所示，在引入DNA-b-PPO后，折纸孔道管口处出现明显组装体，形貌位置均与AFM结果相匹配，也证明了诱导组装体的形成。为了进一步验证该组装体是由DNA-b-PPO通过疏水作用自组装而成，我们向体系中引入DNA修饰的纳米金颗粒，其中金颗粒尺寸约为20nm，其上修饰的DNA与DNA-b-PPO上DNA序列互补。假如该组装体确实为DNA-b-PPO通过疏水作用组装而成，其DNA序列会暴露在组装体外侧，金纳米颗粒表面的DNA应与其互补从而使得金颗粒与DNA折纸孔道耦联。从TEM表征结果中可以看出，在DNA折纸孔道的端口处确实耦联有金纳米颗粒。此外，还可以观察到一个金纳米颗粒同时耦联多个DNA折纸孔道及一个折纸孔道耦联多个金颗粒的结构（图4.4），这是由于无论是金颗粒表面，还是折纸孔道端口处诱导形成的DNA-b-PPO组装体，均含有多条DNA链，从而产生了这种多耦联的情况。这些结果有力证实了疏水限域孔道可诱导双亲分子在孔道内发生自组装行为。图4.4限域孔道内诱导组装体与金颗粒耦联示意图及TEM表征图此外，本课题中还通过琼脂糖凝胶电泳对诱导组装体进行了表征。可以看出随着DDOEG和DNA-b-PPO的引入，组装体迁移率逐步有轻微下降（图4.5），从而进一步证实了疏水限域孔道的成功构建和DNA-b-PPO组装体在折纸孔道内部的形成。58 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装图4.5限域孔道诱导双亲分子组装琼脂糖凝胶电泳表征图4.3.3伸链向外DNA折纸孔道构建及其诱导组装行为研究为了进一步证实组装体是由疏水限域孔道诱导形成，本论文还设计了如下对照试验：通过对订书钉伸链的设计，让DNA折纸孔道与DDOEG互补的伸链全部朝向孔道外侧，来探究其诱导双亲分子的行为。具体设计如图4.6所示。图4.6A、B两列伸链朝向孔道外侧折纸孔道平面展开示意图对照组折纸孔道与DDOEG互补杂交和实验组过程完全一致。经TEM表征可以发现，当折纸孔道的伸链朝向外部时，互补了DDOEG之后折纸孔道本身即发生了组装，几个折纸孔道端口处聚集在一起形成花状结构。经分析认为这是由于59 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装当伸链向外时，DDOEG互补在折纸外侧而暴露在溶液中，不同折纸上DDOEG分子之间由于疏水相互作用发生组装，进而使得折纸孔道以“碰头”形式聚集。我们也进一步证实该花状结构不再能诱导DNA-b-PPO分子组装（图4.7）。对照试验结果证明了前文疏水限域孔道的成功构建及其对诱导组装的必要性。图4.7伸链向外折纸孔道构建及其诱导DNA-b-PPO组装示意图及TEM表征4.3.4诱导组装体结构确定由于诱导组装体是在DNA折纸限域孔道内部形成，难以直接对组装体结构进行表征，因此本论文采取先将组装体释放到溶液中再进行表征的策略来确定诱导组装体结构。具体做法是利用含有双硫键的DDOEG分子，即D-S-S-DOEG分子代替DDOEG分子进行疏水环境构建，当形成DNA-b-PPO诱导组装体后，再向体系中加入还原剂二硫苏糖醇（DTT）还原双硫键，从而使疏水头DOEG部分与DNA断开，诱导组装体从孔道内释放出来，再对释放出的组装体进行表征。4.3.4.1D-S-S-DOEG的合成与表征D-S-S-DOEG的合成与DDOEG相类似，其DOEG部分不变，不同之处在于与之耦联DNA的5’末端为巯基单体。对于得到的D-S-S-DOEG，本论文中通过PAGE及MALDI-TOF进行了检测。PAGE结果如图4.8所示，可以看出D-S-S-DOEG与DDOEG迁移率几乎完全相同，明显低于DNA的迁移率。当D-S-S-DOEG与DTT反应后，原条带消失，出现新的与DNA迁移率相同的条带，证明D-S-S-DOEG被DTT还原，DNA与DOEG分离。此外我们还通过MALDI-TOF对D-S-S-DOEG进行表征，理论分子量8958，测定分子量为9057（附图A.3a）。由于双硫键在质谱过程中易断键，因此在对D-S-S-DOEG进行质谱表征时，也可观察到DNA特征峰，理论分子量为4917，测定分子量为4915（附图A.3b）。60 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装图4.8D-S-S-DOEGPAGE表征结果4.3.4.2组装体的形成与释放利用D-S-S-DOEG在折纸孔道内构建疏水限域环境诱导DNA-b-PPO双亲分子组装过程与DDOEG完全相同。首先将DNA折纸与折纸上伸链等当量的D-S-S-DOEG分子共混，37ºC静置2h。之后，加入在4ºC储存的DNA-b-PPO，使其终浓度为10µM，37ºC静置48h，得到诱导组装体。组装体AFM表征如图4.9a所示。可以看到孔道端口处均有明显组装体出现。随后，向体系中加入10mMDTT，37ºC反应24h。AFM结果显示，在DTT处理过后，DNA折纸孔道端口处组装体消失，体系中出现小球型结构（图2.10a），其尺寸与DNA折纸孔道直径相当。我们推测这是由于DTT将D-S-S-DOEG上二硫键切断，从而将组装体释放到溶液中的结果。为了验证这一假设，本论文使用了动态光散射（DLS）进一步对其进行表征。DLS结果显示，与DNA折纸孔道相比，在DTT处理之后，体系中在25nm左右出现一处新峰（图4.9b），由于DLS表示的是结构的水和直径，往往比真实值略大，因此，可以确定该处峰对应组装体尺寸与折纸孔道直径（22nm）相当，为从孔道内释放出的DNA-b-PPO组装体。随后，我们又利用TEM对组装体进行表征。如图4.9c所示，该组装体在TEM下成尺寸均一球形，直径约为20nm，与AFM及DLS结果相匹配。为进一步证实该组装体是由DNA-b-PPO形成，我们采取与之前相同的金颗粒互补验证策略，向体系中引入DNA修饰的5nm金颗粒。TEM结果显示，在组装体胶束周围耦联有金纳米颗粒（图4.9c），从而证实了该结构是从DNA折纸孔道内部释放出来，且由DNA-b-PPO形成，同时，也证明了限域孔道内诱导组装体为胶束结构。61 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装图4.9诱导组装体释放实验示意图及表征。a）孔道内形成及释放诱导组装体前后AFM对比图；b）孔道内形成及释放诱导组装体前后DLS对比结果；c）释放的组装体TEM表征及金颗粒互补实验TEM表征。4.3.5限域孔道内定位组装由于DNA折纸具有良好的可设计性及可寻址性，我们可以改变孔道内部伸链的位置进而实现限域环境中的定位组装。本论文设计了三种不同伸链位置的DNA折纸，其中伸链分别为C、D列，E、F列和A、C列（图4.10）。C、D列伸链DNA折纸及A、C列伸链DNA折纸组装纯化方法与A、B列伸链DNA折纸完全62 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装相同。对于E、F列伸链DNA折纸，我们发现直接退火折纸孔道产率很低，大部分组装体为平板形貌。本课题组之前曾报道过在DNA折纸退火组装过程中加入可与其互补的DDOEG分子会诱导DNA折纸结构发生折叠。受此工作启发，本论文采取将DNA与DDOEG共组装的办法来制备E、F列伸链DNA折纸。具体做法2+为将短链DNA、M13mp18模板链DNA及DDOEG在1×TAE-Mg缓冲液中混合，其中模板链DNA的浓度为5nM，相应的短链DNA过量10倍，DDOEG与伸链DNA浓度一致。经PCR以-1ºC/100s的速度从95ºC退火至15ºC。退火过程中多种组装行为同时发生，其中既有DNA模板链与订书钉链互相识别互补配对，又有C、D列伸链部分与DDOEG分子互补配对结合。虽然溶液中DDOEG分子浓度远未达到其临界胶束浓度，但是当DDOEG分子与未完全组装的折纸上C、D列伸链结合后，这一区域疏水分子局部浓度会远高于溶液中水平，致使DDOEG发生自身疏水聚集。DDOEG分子间这种疏水相互作用会辅助折纸平板卷曲成孔道，从而提升折纸孔道的产率。通过这种共组装策略，我们可成功制备互补有DDOEG分子的E、F列伸链DNA折纸孔道。随后，我们利用100K超滤管纯化去除孔道体系中过量短链及DDOEG分子。三种调整了疏水分子位置的DNA折纸孔道诱导双亲分子DNA-b-PPO的组装方法与A、B列伸链DNA折纸完全相同。值得注意的是，在C、D列伸链和E、F列伸链折纸孔道条件下，仍然是48h后即可观察到组装体。然而，在A、C列伸链折纸孔道条件下，需要96h诱导组装才可发生。我们认为这是由于当折纸上伸链处在A、C列时，两列间DDOEG分子距离较远，导致局部浓度有所下降，因而需要更长的时间才可使诱导组装发生。对折纸孔道内不同位置形成的诱导组装体同样采用AFM和TEM进行了表征，结果如图4.11所示。可以发现随着DDOEG分子在折纸孔道上的逐渐内移，诱导组装体的位置也从孔道端口处逐渐向内移动。实验结果表明，组装体形成位置与孔道内特异性疏水环境的位置相匹配，可通过DNA折纸孔道设计实现孔道内限域环境的可控定位组装。值得注意的是，当诱导组装体位于孔道靠内的位置时，在电镜下衬度会降低，这是由于组装体在孔道偏里位置更难被乙酸双氧铀染色所致。此外，从AFM表征图中也可以看出，折纸伸链处在A、C列时与伸链处于相邻两列时形成组装体大小相当，这也进一步证明了组装体为胶束结构。63 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装A######B#######C#######D######E#######F######G#######H#############I########J#######K#######L######M#####N######O######P










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图4.10不同伸链位置DNA折纸孔道平面展开示意图，每条订书钉链在5’端编号。红色链为含伸链订书钉链，黑色部分为该订书钉链上伸链部分。a）C、D列伸链DNA折纸；b）E、F列伸链DNA折纸；c）A、C列伸链DNA折纸。64 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装图4.11限域孔道内定位组装AFM及TEM表征结果。a）C、D列伸链折纸孔道诱导双亲分子组装；b）E、F列伸链折纸孔道诱导双亲分子组装；c）A、C列伸链折纸孔道诱导双亲分子组装。4.3.6利用孔道内诱导组装体原位富集水解正硅酸乙酯由本章前部分内容可知，基于DNA折纸孔道的疏水限域环境可用来诱导双亲分子在其中发生组装，在孔道内部形成一个内部为疏水环境的胶束。本小节中，我们初步探讨了该胶束对于溶液中疏水分子的富集作用。正硅酸乙酯（TEOS）在水中溶解度很小，水解缓慢，在酸碱存在的条件下可加速水解生成SiO2。本节中我们研究了在折纸孔道内诱导组装体存在的情况下正硅酸乙酯的水解行为。我们将10µL，2nM已形成诱导组装体的折纸与5µLTEOS混合，于25ºC静置10h，其中折纸伸链位于C、D列。对照组实验为TEOS在12+2+×TAE-Mg缓冲液中水解。TEM表征结果如图4.12a所示，TEOS在1×TAE-Mg缓冲液中发生水解，生成极不规则的水解产物，尺寸分布宽泛。而当水解体系中存在已形成组装体的DNA折纸孔道时，在折纸孔道组装体形成区域出现无机相，65 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装其尺寸、区域与组装体完全吻合（图4.12b）。为了验证其为TEOS水解产物，本课题对其进行了能谱（EDS）分析。从能谱结果来看，该处主要元素除了C外，有Si、O、N、P，而其中Si、O含量明显高于周围，从而证明TEOS可在孔道内组装体处进行了富集和水解，同时生成SiO2。图4.12TEOS在孔道内诱导组装体处富集水解原位生成SiO2。a）TEOS在1×2+TAE-Mg缓冲液中水解TEM表征图；b）TEOS在DNA折纸孔道诱导组装体体系中水解TEM表征图；c）原位生长SiO2折纸孔道EDS元素分析。为了验证诱导组装体可实现SiO2的定位可控生长，本论文还探究了孔道内不同位置的诱导组装体富集水解TEOS情况。我们分别探究TEOS在A、B列伸链折纸孔道，E、F列伸链折纸孔道和A、C列伸链折纸孔道内形成诱导组装体体系中的水解行为。TEM表征如图4.13所示，可以看到当调整诱导组装体在孔道上位置时，生成的SiO2位置也随之发生改变，并严格与组装体位置相匹配。实验结果证明了可以利用DNA折纸孔道内诱导组装体原位富集水解TEOS，并实SiO2定位可控生长。66 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装图4.13限域孔道诱导SiO2定位生长TEM表征结果。TEOS水解体系分别为a）A、B列伸链折纸孔道内形成诱导组装体体系；b）A、C列伸链折纸孔道内形成诱导组装体体系；c）E、F列伸链折纸孔道内形成诱导组装体体系。为了进一步证实该限域环境下生成的组装体可以对溶液中的疏水分子进行富集，本论文采取和上一章相同策略，利用了疏水荧光分子尼罗红作为探针进行了富集实验的验证。结果如图4.14所示，当孔道内部含有组装体时，其对于尼罗红分子的富集作用较不含组装体DNA折纸孔道有明显的增强，从而进一步证实了孔道内诱导组装体可以富集溶液中的疏水分子。图4.14折纸孔道内诱导组装体富集尼罗红分子荧光表征图4.4本章小结本章以DNA折纸孔道为骨架，通过在其内部互补两亲性树状分子DDOEG，构建了疏水限域环境，并研究了双亲分子DNA-b-PPO在该特异性疏水限域环境中的组装行为。我们发现，在双亲分子浓度低于其CMC时，疏水限域孔道即可诱导67 第4章疏水纳米限域孔道构建及调控双亲嵌段共聚物组装双亲分子在其内部发生组装。组装体的尺寸与限域孔道直径相匹配，组装体位置与孔道内疏水环境区域相一致。同时，本章还通过在DDOEG分子中引入双硫键来实现诱导组装体的可控释放，从而验证了诱导组装体为胶束结构。此外，我们初步探索了该限域环境内的诱导组装体在水溶液中对疏水分子的富集作用，发现其可以富集TEOS并使TEOS在限域环境中可控水解，实现SiO2的原位可控生长。该工作为纳米尺度下特异性限域环境的构建，探究双亲分子在纳米限域条件下的组装奠定了良好的基础。同时，该工作为SiO2定位可控生长提供了一种有效的方法，也提供了一种全新的可控生长纳米材料的策略。68 第5章结论与展望第5章结论与展望细胞内限域环境是细胞最重要的特性之一。体外构建越为精细、越为复杂的限域环境就越有助于我们理解细胞内各种复杂的生命过程是如何有序高效进行的。本论文中，我们利用DNA折纸技术构建复杂的响应型及特异性纳米限域体系。得益于DNA折纸技术精确可设计性，纳米限域结构的尺寸严格均一且精确可调；又由于DNA折纸技术具有可寻址性的优点，限域环境内功能分子，如酶、双亲分子等均被精确定量定位。首先，我们构筑了响应型可控开阖DNA折纸纳米限域孔道。通过孔道端口处单双链的变化，可控调节限域孔道的开阖，进而调节物质自由扩散进入孔道效率。在孔道内部构建有酶级联反应，当孔道打开时，底物分子进入孔道的瞬时通量大，级联反应效率高；当孔道闭合时，底物分子自由扩散进入孔道过程受阻，级联反应效率下降。通过改变孔道端口处双链的长度及门控位置，可以调节门控效率的高低。利用DNA折纸技术可设计性，我们对体系做进一步拓展，构筑了不同尺寸的响应型限域孔道。该工作为体外模拟构建复杂响应型纳米限域环境开辟了一条路径，同时也有助于我们更好的理解物质在纳米尺度限域环境中的传输规律。其次，本论文将DNA折纸技术与框架诱导自组装技术相结合，构建了纳米限域膜环境，并探究了限域膜对于脂肪酶水解反应的影响。我们发现，纳米限域膜具有富集溶液中疏水底物分子的能力，通过富集作用可以提高内部酶周围底物浓度进而提升酶促反应效率。同时，我们也发现膜对底物分子的富集作用也具有一定的选择性。此外，纳米限域膜还可保护其内部酶不被溶液中蛋白酶水解。该工作对于我们深入解密细胞内生物膜限域环境功能具有重要指导意义，也有助于加深对膜蛋白稳定高效运作机理的理解。与此同时，对于如何可控定量的研究膜与蛋白的相互作用，本工作也提供了一种全新的策略。本论文最后一部分工作是利用DNA折纸技术构建疏水限域纳米孔道，探究疏水限域环境对双亲性嵌段共聚物DNA-b-PPO组装的影响。我们发现，疏水限域环境可诱导在实验条件下不能组装的双亲分子发生定位可控组装。组装体尺寸受控于限域环境尺寸，其位置与孔道上特异性疏水区域相匹配。我们还证实了在疏水限域环境下形成的组装体为胶束。此外，我们发现该诱导组装体对溶液中疏水分子具有富集作用，本论文通过诱导组装体富集溶液中的正硅酸乙酯，实现了SiO2的原位可控生长。该工作首次构建了具有可设计性的疏水限域体系，有助于我们更好地了解细胞内复杂限域环境对于分子组装折叠的重要影响。此外，我们相信69 第5章结论与展望通过在折纸孔道内引入不同功能分子，该纳米限域孔道在分子可控组装、诱导难于组装分子进行组装及维持亚稳态组装体稳定性等领域也必将有所作为。本论文利用DNA折纸技术构建了三种复杂纳米限域环境，为如何在体外构建精细复杂纳米限域环境做了新方法的尝试和推进，并分别探讨了纳米限域环境对于物质传输、酶促反应和分子组装的影响。这些工作证明了结构DNA纳米技术在构建限域环境领域的可行性和优势。我们相信在此工作基础上，随着结构DNA纳米技术的进一步发展，更为精细复杂的纳米限域环境，如门控率更高的纳米限域孔道、含有酶级联的纳米限域膜及具有不同功能分子的纳米限域孔道等也将会被构建出来，实现对于限域环境在细胞内功能更为全面深入的模拟和研究。70 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致谢致谢文至此处，五年的博士生涯也已渐近尾声，在此对这五年来热心帮助我的老师同学表示最诚挚的谢意！我最要感谢我的导师刘冬生教授。本论文中工作开展及论文撰写均是在刘老师悉心指导下完成的。刘老师亦师亦友，在为学为人上都给予了我极大的指导和帮助。在我刚入组面对科研心有迷茫时，刘老师总是能在更高的维度上为我把握方向指点迷津；在我面对难题思路不清时，刘老师会睿智地帮助我找出问题梳理逻辑；当我有自己的想法时，刘老师也会最大程度的给予鼓励和支持。能在刘老师课题组完成博士学业，我倍感幸运。我要感谢杨忠强教授，杨老师为人和善体贴，在过去几年里杨老师无论在实验还是在生活均给予我很大的帮助。杨老师执着认真的工作态度，儒雅乐观的生活方式无不使我受益匪浅。同时我也要感谢上海应用物理研究所的柳华杰研究员，感谢柳老师在我实验过程中给予的帮助和支持，每次与柳老师的讨论都使我收获良多。我还要对实验室的周如冰老师，姜群老师，严寒同学、王建方老师及王银丽同学表示感谢，感谢她们为实验室正常运转所付出的努力。感谢清华大学董原辰师兄在实验和论文撰写上给予我的帮助；感谢清华大学大学王立颖、赵智勇、金娟、陈春、辛玲、吴芬、李妍、朱智超师姐；张涛、邢永政、周超、周涛、张国梁、李闯、马小舟师兄；感谢清华大学王一杰、邵昱、张懿旸、王硕、贾昊旸、王淼、周旭、曹天阳、卞博、王超、史杰中、李姝聪、杨博、周碧妮、张峻尔、王云鹏、田艺、廖威、张博涵、张冉、孙梓嘉、安小苹等同学；感谢上海应用物理研究所靳艳秋师姐、王建榜师兄；感谢人民大学张波、王瑶同学；感谢伦敦帝国学院笪自然、Mark同学，对于你们的帮助，深表谢意。最后，我要感谢我的父母家人在过去几年里给予我的支持，谢谢你们一路陪伴让我顺利完成学业。王殿铭2017年4月于北京78 声明声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人享有著作权的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。签名：日期：79 附录A论文中合成双亲分子质谱表征附录A论文中合成双亲分子质谱表征附图A.1DOEG分子合成路线图附图A.2DDOEGMALDI-TOF表征80 附录A论文中合成双亲分子质谱表征附图A.3D-S-S-DOEGMALDI-TOF表征。a）D-S-S-DOEG峰；b）DNA峰。附图A.4DNA-b-PPOMALDI-TOF表征81 附录BDNA折纸序列信息附录BDNA折纸序列信息本论文中用到DNA折纸结构，均是在颜灏组于2008年设计DNA折纸基础上演变而来，其最初设计如附图B.1所示，其中所用骨架链为M13mp18DNA，订书钉链序列见附表B.1。附图B.1DNA折纸原始设计示意图，其中订书钉链标号在5’端，箭头为3’端附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容1CAAGCCCAATAGGAACCCATGTACAAACAGTT2AATGCCCCGTAACAGTGCCCGTATCTCCCTCA3TGCCTTGACTGCCTATTTCGGAACAGGGATAG4GAGCCGCCCCACCACCGGAACCGCGACGGAAA5AACCAGAGACCCTCAGAACCGCCAGGGGTCAG6TTATTCATAGGGAAGGTAAATATTCATTCAGT7CATAACCCGAGGCATAGTAAGAGCTTTTTAAG8ATTGAGGGTAAAGGTGAATTATCAATCACCGG9AAAAGTAATATCTTACCGAAGCCCTTCCAGAG82 附录BDNA折纸序列信息附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容10GCAATAGCGCAGATAGCCGAACAATTCAACCG11CCTAATTTACGCTAACGAGCGTCTAATCAATA12TCTTACCAGCCAGTTACAAAATAAATGAAATA13ATCGGCTGCGAGCATGTAGAAACCTATCATAT14CTAATTTATCTTTCCTTATCATTCATCCTGAA15GCGTTATAGAAAAAGCCTGTTTAGAAGGCCGG16GCTCATTTTCGCATTAAATTTTTGAGCTTAGA17AATTACTACAAATTCTTACCAGTAATCCCATC18TTAAGACGTTGAAAACATAGCGATAACAGTAC19TAGAATCCCTGAGAAGAGTCAATAGGAATCAT20CTTTTACACAGATGAATATACAGTAAACAATT21TTTAACGTTCGGGAGAAACAATAATTTTCCCT22CGACAACTAAGTATTAGACTTTACAATACCGA23GGATTTAGCGTATTAAATCCTTTGTTTTCAGG24ACCCAAATCAAGTTTTTTGGGGTCAAAGAACG25GAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAACAAACTAT26TAGCCCTACCAGCAGAAGATAAAAACATTTGA27CGGCCTTGCTGGTAATATCCAGAACGAACTGA28CTCAGAGCCACCACCCTCATTTTCCTATTATT29CTGAAACAGGTAATAAGTTTTAACCCCTCAGA30AGTGTACTTGAAAGTATTAAGAGGCCGCCACC31GCCACCACTCTTTTCATAATCAAACCGTCACC32GTTTGCCACCTCAGAGCCGCCACCGATACAGG33GACTTGAGAGACAAAAGGGCGACAAGTTACCA34AGCGCCAACCATTTGGGAATTAGATTATTAGC35GAAGGAAAATAAGAGCAAGAAACAACAGCCAT36GCCCAATACCGAGGAAACGCAATAGGTTTACC37ATTATTTAACCCAGCTACAATTTTCAAGAACG83 附录BDNA折纸序列信息附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容38TATTTTGCTCCCAATCCAAATAAGTGAGTTAA39GGTATTAAGAACAAGAAAAATAATTAAAGCCA40TAAGTCCTACCAAGTACCGCACTCTTAGTTGC41ACGCTCAAAATAAGAATAAACACCGTGAATTT42AGGCGTTACAGTAGGGCTTAATTGACAATAGA43ATCAAAATCGTCGCTATTAATTAACGGATTCG44CTGTAAATCATAGGTCTGAGAGACGATAAATA45CCTGATTGAAAGAAATTGCGTAGACCCGAACG46ACAGAAATCTTTGAATACCAAGTTCCTTGCTT47TTATTAATGCCGTCAATAGATAATCAGAGGTG48AGATTAGATTTAAAAGTTTGAGTACACGTAAA49AGGCGGTCATTAGTCTTTAATGCGCAATATTA50GAATGGCTAGTATTAACACCGCCTCAACTAAT51CCGCCAGCCATTGCAACAGGAAAAATATTTTT52CCCTCAGAACCGCCACCCTCAGAACTGAGACT53CCTCAAGAATACATGGCTTTTGATAGAACCAC54TAAGCGTCGAAGGATTAGGATTAGTACCGCCA55CACCAGAGTTCGGTCATAGCCCCCGCCAGCAA56TCGGCATTCCGCCGCCAGCATTGACGTTCCAG57AATCACCAAATAGAAAATTCATATATAACGGA58TCACAATCGTAGCACCATTACCATCGTTTTCA59ATACCCAAGATAACCCACAAGAATAAACGATT60ATCAGAGAAAGAACTGGCATGATTTTATTTTG61TTTTGTTTAAGCCTTAAATCAAGAATCGAGAA62AGGTTTTGAACGTCAAAAATGAAAGCGCTAAT63CAAGCAAGACGCGCCTGTTTATCAAGAATCGC64AATGCAGACCGTTTTTATTTTCATCTTGCGGG65CATATTTAGAAATACCGACCGTGTTACCTTTT84 附录BDNA折纸序列信息附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容66AATGGTTTACAACGCCAACATGTAGTTCAGCT67TAACCTCCATATGTGAGTGAATAAACAAAATC68AAATCAATGGCTTAGGTTGGGTTACTAAATTT69GCGCAGAGATATCAAAATTATTTGACATTATC70AACCTACCGCGAATTATTCATTTCCAGTACAT71ATTTTGCGTCTTTAGGAGCACTAAGCAACAGT72CTAAAATAGAACAAAGAAACCACCAGGGTTAG73GCCACGCTATACGTGGCACAGACAACGCTCAT74GCGTAAGAGAGAGCCAGCAGCAAAAAGGTTAT75GGAAATACCTACATTTTGACGCTCACCTGAAA76TATCACCGTACTCAGGAGGTTTAGCGGGGTTT77TGCTCAGTCAGTCTCTGAATTTACCAGGAGGT78GGAAAGCGACCAGGCGGATAAGTGAATAGGTG79TGAGGCAGGCGTCAGACTGTAGCGTAGCAAGG80TGCCTTTAGTCAGACGATTGGCCTGCCAGAAT81CCGGAAACACACCACGGAATAAGTAAGACTCC82ACGCAAAGGTCACCAATGAAACCAATCAAGTT83TTATTACGGTCAGAGGGTAATTGAATAGCAGC84TGAACAAACAGTATGTTAGCAAACTAAAAGAA85CTTTACAGTTAGCGAACCTCCCGACGTAGGAA86GAGGCGTTAGAGAATAACATAAAAGAACACCC87TCATTACCCGACAATAAACAACATATTTAGGC88CCAGACGAGCGCCCAATAGCAAGCAAGAACGC89AGAGGCATAATTTCATCTTCTGACTATAACTA90TTTTAGTTTTTCGAGCCAGTAATAAATTCTGT91TATGTAAACCTTTTTTAATGGAAAAATTACCT92TTGAATTATGCTGATGCAAATCCACAAATATA93GAGCAAAAACTTCTGAATAATGGAAGAAGGAG85 附录BDNA折纸序列信息附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容94TGGATTATGAAGATGATGAAACAAAATTTCAT95CGGAATTATTGAAAGGAATTGAGGTGAAAAAT96ATCAACAGTCATCATATTCCTGATTGATTGTT97CTAAAGCAAGATAGAACCCTTCTGAATCGTCT98GCCAACAGTCACCTTGCTGAACCTGTTGGCAA99GAAATGGATTATTTACATTGGCAGACATTCTG100TTTTTATAAGTATAGCCCGGCCGTCGAG101AGGGTTGATTTTATAAATCCTCATTAAATGATATTC102ACAAACAATTTTAATCAGTAGCGACAGATCGATAGC103AGCACCGTTTTTTAAAGGTGGCAACATAGTAGAAAA104TACATACATTTTGACGGGAGAATTAACTACAGGGAA105GCGCATTATTTTGCTTATCCGGTATTCTAAATCAGA106TATAGAAGTTTTCGACAAAAGGTAAAGTAGAGAATA107TAAAGTACTTTTCGCGAGAAAACTTTTTATCGCAAG108ACAAAGAATTTTATTAATTACATTTAACACATCAAG109AAAACAAATTTTTTCATCAATATAATCCTATCAGAT110GATGGCAATTTTAATCAATATCTGGTCACAAATATC111AAACCCTCTTTTACCAGTAATAAAAGGGATTCACCAGTCACACGTTTT112CCGAAATCCGAAAATCCTGTTTGAAGCCGGAA113CCAGCAGGGGCAAAATCCCTTATAAAGCCGGC114GCATAAAGTTCCACACAACATACGAAGCGCCA115GCTCACAATGTAAAGCCTGGGGTGGGTTTGCC116TTCGCCATTGCCGGAAACCAGGCATTAAATCA117GCTTCTGGTCAGGCTGCGCAACTGTGTTATCC118GTTAAAATTTTAACCAATAGGAACCCGGCACC119AGACAGTCATTCAAAAGGGTGAGAAGCTATAT120AGGTAAAGAAATCACCATCAATATAATATTTT121TTTCATTTGGTCAATAACCTGTTTATATCGCG86 附录BDNA折纸序列信息附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容122TCGCAAATGGGGCGCGAGCTGAAATAATGTGT123TTTTAATTGCCCGAAAGACTTCAAAACACTAT124AAGAGGAACGAGCTTCAAAGCGAAGATACATT125GGAATTACTCGTTTACCAGACGACAAAAGATT126GAATAAGGACGTAACAAAGCTGCTCTAAAACA127CCAAATCACTTGCCCTGACGAGAACGCCAAAA128CTCATCTTGAGGCAAAAGAATACAGTGAATTT129AAACGAAATGACCCCCAGCGATTATTCATTAC130CTTAAACATCAGCTTGCTTTCGAGCGTAACAC131TCGGTTTAGCTTGATACCGATAGTCCAACCTA132TGAGTTTCGTCACCAGTACAAACTTAATTGTA133CCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAATCAAAA134GAATAGCCGCAAGCGGTCCACGCTCCTAATGA135GAGTTGCACGAGATAGGGTTGAGTAAGGGAGC136GTGAGCTAGTTTCCTGTGTGAAATTTGGGAAG137TCATAGCTACTCACATTAATTGCGCCCTGAGA138GGCGATCGCACTCCAGCCAGCTTTGCCATCAA139GAAGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCAATCATGG140AAATAATTTTAAATTGTAAACGTTGATATTCA141GCAAATATCGCGTCTGGCCTTCCTGGCCTCAG142ACCGTTCTAAATGCAATGCCTGAGAGGTGGCA143TATATTTTAGCTGATAAATTAATGTTGTATAA144TCAATTCTTTTAGTTTGACCATTACCAGACCG145CGAGTAGAACTAATAGTAGTAGCAAACCCTCA146GAAGCAAAAAAGCGGATTGCATCAGATAAAAA147TCAGAAGCCTCCAACAGGTCAGGATCTGCGAA148CCAAAATATAATGCAGATACATAAACACCAGA149CATTCAACGCGAGAGGCTTTTGCATATTATAG87 附录BDNA折纸序列信息附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容150ACGAGTAGTGACAAGAACCGGATATACCAAGC151AGTAATCTTAAATTGGGCTTGAGAGAATACCA152GCGAAACATGCCACTACGAAGGCATGCGCCGA153ATACGTAAAAGTACAACGGAGATTTCATCAAG154CAATGACACTCCAAAAGGAGCCTTACAACGCC155AAAAAAGGACAACCATCGCCCACGCGGGTAAA156TGTAGCATTCCACAGACAGCCCTCATCTCCAA157GTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAGTTGTTCC158AGTTTGGAGCCCTTCACCGCCTGGTTGCGCTC159AGCTGATTACAAGAGTCCACTATTGAGGTGCC160ACTGCCCGCCGAGCTCGAATTCGTTATTACGC161CCCGGGTACTTTCCAGTCGGGAAACGGGCAAC162CAGCTGGCGGACGACGACAGTATCGTAGCCAG163GTTTGAGGGAAAGGGGGATGTGCTAGAGGATC164CTTTCATCCCCAAAAACAGGAAGACCGGAGAG165AGAAAAGCAACATTAAATGTGAGCATCTGCCA166GGTAGCTAGGATAAAAATTTTTAGTTAACATC167CAACGCAATTTTTGAGAGATCTACTGATAATC168CAATAAATACAGTTGATTCCCAATTTAGAGAG169TCCATATACATACAGGCAAGGCAACTTTATTT170TACCTTTAAGGTCTTTACCCTGACAAAGAAGT171CAAAAATCATTGCTCCTTTTGATAAGTTTCAT172TTTGCCAGATCAGTTGAGATTTAGTGGTTTAA173AAAGATTCAGGGGGTAATAGTAAACCATAAAT174TTTCAACTATAGGCTGGCTGACCTTGTATCAT175CCAGGCGCTTAATCATTGTGAATTACAGGTAG176CGCCTGATGGAAGTTTCCATTAAACATAACCG177TTTCATGAAAATTGTGTCGAAATCTGTACAGA88 附录BDNA折纸序列信息附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容178ATATATTCTTTTTTCACGTTGAAAATAGTTAG179AATAATAAGGTCGCTGAGGCTTGCAAAGACTT180CGTAACGATCTAAAGTTTTGTCGTGAATTGCG181ACCCAAATCAAGTTTTTTGGGGTCAAAGAACG182TGGACTCCCTTTTCACCAGTGAGACCTGTCGT183TGGTTTTTAACGTCAAAGGGCGAAGAACCATC184GCCAGCTGCCTGCAGGTCGACTCTGCAAGGCG185CTTGCATGCATTAATGAATCGGCCCGCCAGGG186ATTAAGTTCGCATCGTAACCGTGCGAGTAACA187TAGATGGGGGGTAACGCCAGGGTTGTGCCAAG188ACCCGTCGTCATATGTACCCCGGTAAAGGCTA189CATGTCAAGATTCTCCGTGGGAACCGTTGGTG190TCAGGTCACTTTTGCGGGAGAAGCAGAATTAG191CTGTAATATTGCCTGAGAGTCTGGAAAACTAG192CAAAATTAAAGTACGGTGTCTGGAAGAGGTCA193TGCAACTAAGCAATAAAGCCTCAGTTATGACC194TTTTTGCGCAGAAAACGAGAATGAATGTTTAG195AAACAGTTGATGGCTTAGAGCTTATTTAAATA196ACTGGATAACGGAACAACATTATTACCTTATG197ACGAACTAGCGTCCAATACTGCGGAATGCTTT198CGATTTTAGAGGACAGATGAACGGCGCGACCT199CTTTGAAAAGAACTGGCTCATTATTTAATAAA200GCTCCATGAGAGGCTTTGAGGACTAGGGAGTT201ACGGCTACTTACTTAGCCGGAACGCTGACCAA202AAAGGCCGAAAGGAACAACTAAAGCTTTCCAG203GAGAATAGCTTTTGCGGGATCGTCGGGTAGCA204ACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTAAGCGGAGT205TTTTCGATGGCCCACTACGTAAACCGTC89 附录BDNA折纸序列信息附表B.1附图B.1中DNA折纸结构订书钉链序列序列编号序列内容206TATCAGGGTTTTCGGTTTGCGTATTGGGAACGCGCG207GGGAGAGGTTTTTGTAAAACGACGGCCATTCCCAGT208CACGACGTTTTTGTAATGGGATAGGTCAAAACGGCG209GATTGACCTTTTGATGAACGGTAATCGTAGCAAACA210AGAGAATCTTTTGGTTGTACCAAAAACAAGCATAAA211GCTAAATCTTTTCTGTAGCTCAACATGTATTGCTGA212ATATAATGTTTTCATTGAATCCCCCTCAAATCGTCA213TAAATATTTTTTGGAAGAAAAATCTACGACCAGTCA214GGACGTTGTTTTTCATAAGGGAACCGAAAGGCGCAG215ACGGTCAATTTTGACAGCATCGGAACGAACCCTCAG216CAGCGAAAATTTTACTTTCAACAGTTTCTGGGATTTTGCTAAACTTTT附表B.2DNA折纸孔道上下边链序列序列编号序列内容V-181ACGTTAGTCAAGTTTTTTGGGGTCAAAGAACGV-180GTAAAGCATCTAAAGTTTTGTCGTGAATTGCGV-157CGTAACGACTAAATCGGAACCCTAGTTGTTCCV-156CCCCGATTTCCACAGACAGCCCTCATCTCCAAV-133TGTAGCATTAGAGCTTGACGGGGAAATCAAAAV-132GAACGTGGGTCACCAGTACAAACTTAATTGTAV-100GTCACACGTTTTTATAAGTATAGCCCGGCCGTCGAGV-99TATCACCGTTATTTACATTGGCAGACATTCTGV-76GAAATGGATACTCAGGAGGTTTAGCGGGGTTTV-75CCCTCAGACTACATTTTGACGCTCACCTGAAAV-52GGAAATACACCGCCACCCTCAGAACTGAGACTV-51CTCAGAGCCATTGCAACAGGAAAAATATTTTTV-28CCGCCAGCCACCACCCTCATTTTCCTATTATTV-27CAAGCCCACTGGTAATATCCAGAACGAACTGA90 附录BDNA折纸序列信息附表B.2DNA折纸孔道上下边链序列序列编号序列内容V-25TGAGTTTCCGAGAAAGGAAGGGAACAAACTATV-1CGGCCTTGATAGGAACCCATGTACAAACAGTTV-204ACCCAAATAAATGAATTTTCTGTAAGCGGAGTV-205TGCTAAACTTTTCGATGGCCCACTACGTAAACCGTC附表B.3折纸孔道门控链序列序列编号序列内容g-203GAGAATAGCTTTTGCGCTATCCTCTCATCACGGATCGTCGGGTAGCAACGGCTACTTACTTAGg-201CTATCCTCTCATCACCCGGAACGCTGACCAACTTTGAAAAGAACTGGg-199CTATCCTCTCATCACCTCATTATTTAATAAAACGAACTAGCGTCCAAg-197CTATCCTCTCATCACTACTGCGGAATGCTTTAAACAGTTGATGGCTTg-195CTATCCTCTCATCACAGAGCTTATTTAAATATGCAACTAAGCAATAAg-193CTATCCTCTCATCACAGCCTCAGTTATGACCCTGTAATATTGCCTGAg-191CTATCCTCTCATCACGAGTCTGGAAAACTAGCATGTCAAGATTCTCCg-189CTATCCTCTCATCACGTGGGAACCGTTGGTGTAGATGGGGGGTAACGg-187CTATCCTCTCATCACCCAGGGTTGTGCCAAGCTTGCATGCATTAATGg-185CTATCCTCTCATCACAATCGGCCCGCCAGGGTGGTTTTTAACGTCAAg-183CTATCCTCTCATCACg’-183AGGGCGAAGAACCATCg-98GCCAACAGTCACCTTGCTATCCTCTCATCAC91 附录BDNA折纸序列信息附表B.3折纸孔道门控链序列序列编号序列内容g-96CTGAACCTGTTGGCAAATCAACAGTCATCATACTATCCTCTCATCACg-94TTCCTGATTGATTGTTTGGATTATGAAGATGACTATCCTCTCATCACg-92TGAAACAAAATTTCATTTGAATTATGCTGATGCTATCCTCTCATCACg-90CAAATCCACAAATATATTTTAGTTTTTCGAGCCTATCCTCTCATCACCAGTAATAAATTCTGTCCAGACGAGCGCCCAAg-88CTATCCTCTCATCACTAGCAAGCAAGAACGCGAGGCGTTAGAGAATAg-86CTATCCTCTCATCACACATAAAAGAACACCCTGAACAAACAGTATGTg-84CTATCCTCTCATCACTAGCAAACTAAAAGAAACGCAAAGGTCACCAAg-82CTATCCTCTCATCACTGAAACCAATCAAGTTTGCCTTTAGTCAGACGg-80CTATCCTCTCATCACATTGGCCTGCCAGAATGGAAAGCGACCAGGCGg-78CTATCCTCTCATCACg’-78GATAAGTGAATAGGTG92 附录BDNA折纸序列信息附表B.4折纸孔道颈环链序列序列编号序列内容颈环链93GAGCAAAAACTTCTGATCCTCTTTGAGGAACAAGTTTCTTGTATAATGGAAGAAGGAG颈环链95CGGAATTATTGAAAGGTCCTCTTTGAGGAACAAGTTTCTTGTAATTGAGGTGAAAAAT颈环链72CTAAAATAGAACAAAGTCCTCTTTGAGGAACAAGTTTCTTGTAAACCACCAGGGTTAG颈环链70AACCTACCGCGAATTATCCTCTTTGAGGAACAAGTTTCTTGTTTCATTTCCAGTACAT颈环链69GCGCAGAGATATCAAATCCTCTTTGAGGAACAAGTTTCTTGTATTATTTGACATTATC颈环链71ATTTTGCGTCTTTAGGTCCTCTTTGAGGAACAAGTTTCTTGTAGCACTAAGCAACAGT附表B.5第二章折纸孔道与酶互补链序列序列编号序列内容138-HGGCGATCGCACTCCAGTTTGACTACTGACGCGGACATTC138-H’CCAGCTTTGCCATCAA150-HACGAGTAGTGACAAGATTTGACTACTGACGCGGACATTC150-H’ACCGGATATACCAAGC163-GGTTTGAGGGAAAGGGGTTTATTCTACTTGAGAGAGCGA163-G’GATGTGCTAGAGGATC175-GCCAGGCGCTTAATCATTTTATTCTACTTGAGAGAGCGAC175-G’TGTGAATTACAGGTAG93 附录BDNA折纸序列信息附表B.612nm直径DNA折纸孔道上下边链序列序列编号序列内容V-12-181ACCCAAATAGCAATAAAGCCTCAGTTATGACCV-12-192CAAAATTACAAGTTTTTTGGGGTCAAAGAACGV-12-157GTAAAGCACATACAGGCAAGGCAACTTTATTTV-12-168CAATAAATCTAAATCGGAACCCTAGTTGTTCCV-12-133CCCCGATTACTAATAGTAGTAGCAAACCCTCAV-12-144TCAATTCTTAGAGCTTGACGGGGAAATCAAAAV-12-25GAACGTGGGGGGCGCGAGCTGAAATAATGTGTV-12-121TTTCATTTCGAGAAAGGAAGGGAACAAACTATV-12-27CGGCCTTGCGAGCATGTAGAAACCTATCATATV-12-14CTAATTTACTGGTAATATCCAGAACGAACTGAV-12-51CCGCCAGCGAACAAGAAAAATAATTAAAGCCAV-12-40TAAGTCCTCATTGCAACAGGAAAAATATTTTTV-12-75GGAAATACACGCGCCTGTTTATCAAGAATCGCV-12-64AATGCAGACTACATTTTGACGCTCACCTGAAAV-12-99GAAATGGACGACAATAAACAACATATTTAGGCV-12-88CCAGACGATTATTTACATTGGCAGACATTCTGV-12-106GTCACACGTTTTCGACAAAAGGTAAAGTAGAGAATA附表B.7控制DNA折纸孔道开阖锁链、钥链序列序列编号序列内容8mer锁链GAGGATAG15mer锁链（Sg）GTGATGAGAGGATAG23mer锁链（Sm）GTTAGTGAGTGATGGGAGGATAG钥链（CSm）CTATCCTCCCATCACTCACTAAC不含错配锁链（Sc）GTTAGTGAGTGATGAGAGGATAGSc全互补链CScCTATCCTCTCATCACTCACTAAC94 附录BDNA折纸序列信息附表B.8DNA折纸平板上与DDOEG互补订书钉链序列编号序列内容200-anchorGCTCCATGAGAGGCTTTGAGGACTAGGGAGTTCTATCCTCTCATCAC196-anchorACTGGATAACGGAACAACATTATTACCTTATGCTATCCTCTCATCAC192-anchorCAAAATTAAAGTACGGTGTCTGGAAGAGGTCACTATCCTCTCATCAC188-anchorACCCGTCGTCATATGTACCCCGGTAAAGGCTACTATCCTCTCATCAC184-anchorGCCAGCTGCCTGCAGGTCGACTCTGCAAGGCGCTATCCTCTCATCAC176-anchorCGCCTGATGGAAGTTTCCATTAAACATAACCGCTATCCTCTCATCAC172-anchorTTTGCCAGATCAGTTGAGATTTAGTGGTTTAACTATCCTCTCATCAC168-anchorCAATAAATACAGTTGATTCCCAATTTAGAGAGCTATCCTCTCATCAC164-anchorCTTTCATCCCCAAAAACAGGAAGACCGGAGAGCTATCCTCTCATCAC160-anchorACTGCCCGCCGAGCTCGAATTCGTTATTACGCCTATCCTCTCATCAC152-anchorGCGAAACATGCCACTACGAAGGCATGCGCCGACTATCCTCTCATCAC148-anchorCCAAAATATAATGCAGATACATAAACACCAGACTATCCTCTCATCAC144-anchorTCAATTCTTTTAGTTTGACCATTACCAGACCGCTATCCTCTCATCAC140-anchorAAATAATTTTAAATTGTAAACGTTGATATTCACTATCCTCTCATCAC136-anchorGTGAGCTAGTTTCCTGTGTGAAATTTGGGAAGCTATCCTCTCATCAC95 附录BDNA折纸序列信息附表B.8DNA折纸平板上与DDOEG互补订书钉链序列编号序列内容6-anchorTTATTCATAGGGAAGGTAAATATTCATTCAGTCTATCCTCTCATCAC121-anchorTTTCATTTGGTCAATAACCTGTTTATATCGCGCTATCCTCTCATCAC15-anchorGCGTTATAGAAAAAGCCTGTTTAGAAGGCCGGCTATCCTCTCATCAC114-anchorGCATAAAGTTCCACACAACATACGAAGCGCCACTATCCTCTCATCAC5-anchorAACCAGAGACCCTCAGAACCGCCAGGGGTCAGCTATCCTCTCATCAC10-anchorGCAATAGCGCAGATAGCCGAACAATTCAACCGTATCCTCTCATCAC14-anchorCTAATTTATCTTTCCTTATCATTCATCCTGAACTATCCTCTCATCAC19-anchorTAGAATCCCTGAGAAGAGTCAATAGGAATCATCTATCCTCTCATCAC23-anchorGGATTTAGCGTATTAAATCCTTTGTTTTCAGGCTATCCTCTCATCAC32-anchorGTTTGCCACCTCAGAGCCGCCACCGATACAGGCTATCCTCTCATCAC36-anchorGCCCAATACCGAGGAAACGCAATAGGTTTACCCTATCCTCTCATCAC40-anchorTAAGTCCTACCAAGTACCGCACTCTTAGTTGCCTATCCTCTCATCAC44-anchorCTGTAAATCATAGGTCTGAGAGACGATAAATACTATCCTCTCATCAC48-anchorAGATTAGATTTAAAAGTTTGAGTACACGTAAACTATCCTCTCATCAC56-anchorTCGGCATTCCGCCGCCAGCATTGACGTTCCAGCTATCCTCTCATCAC96 附录BDNA折纸序列信息附表B.8DNA折纸平板上与DDOEG互补订书钉链序列编号序列内容64-anchorAATGCAGACCGTTTTTATTTTCATCTTGCGGGCTATCCTCTCATCAC68-anchorAAATCAATGGCTTAGGTTGGGTTACTAAATTTCTATCCTCTCATCAC72-anchorCTAAAATAGAACAAAGAAACCACCAGGGTTAGCTATCCTCTCATCAC173-anchorAAAGATTCAGGGGGTAATAGTAAACCATAAATTAGCTATCCTCTCATCAC169-anchorTCCATATACATACAGGCAAGGCAACTTTATTTTAGCTATCCTCTCATCAC165-anchorAGAAAAGCAACATTAAATGTGAGCATCTGCCATAGCTATCCTCTCATCAC153-anchorATACGTAAAAGTACAACGGAGATTTCATCAAGTAGCTATCCTCTCATCAC149-anchorCATTCAACGCGAGAGGCTTTTGCATATTATAGTAGCTATCCTCTCATCAC145-anchorCGAGTAGAACTAATAGTAGTAGCAAACCCTCATAGCTATCCTCTCATCAC129-anchorAAACGAAATGACCCCCAGCGATTATTCATTACTAGCTATCCTCTCATCAC125-anchorGGAATTACTCGTTTACCAGACGACAAAAGATTTAGCTATCCTCTCATCAC121-anchorTCGCAAATGGGGCGCGAGCTGAAATAATGTGTTAGCTATCCTCTCATCAC117-anchorGCTTCTGGTCAGGCTGCGCAACTGTGTTATCCTAGCTATCCTCTCATCAC4-anchorGAGCCGCCCCACCACCGGAACCGCGACGGAAATAGCTATCCTCTCATCAC9-anchorAAAAGTAATATCTTACCGAAGCCCTTCCAGAGTAGCTATCCTCTCATCAC97 附录BDNA折纸序列信息附表B.8DNA折纸平板上与DDOEG互补订书钉链序列编号序列内容18-anchorTTAAGACGTTGAAAACATAGCGATAACAGTACTAGCTATCCTCTCATCAC35-anchorGAAGGAAAATAAGAGCAAGAAACAACAGCCATTAGCTATCCTCTCATCAC39-anchorGGTATTAAGAACAAGAAAAATAATTAAAGCCATAGCTATCCTCTCATCAC43-anchorATCAAAATCGTCGCTATTAATTAACGGATTCGTAGCTATCCTCTCATCAC55-anchorCACCAGAGTTCGGTCATAGCCCCCGCCAGCAATAGCTATCCTCTCATCAC59-anchorATACCCAAGATAACCCACAAGAATAAACGATTTAGCTATCCTCTCATCAC63-anchorCAAGCAAGACGCGCCTGTTTATCAAGAATCGCTAGCTATCCTCTCATCAC附表B.9DNA折纸平板上互补CALB-DNA缀合物订书钉链序列编号序列内容TTTCATGAAAATTGTGTCGAAATCTGTACAGAGTTCGTA177-anchorGCAGGTAG141-anchorGCAAATATCGCGTCTGGCCTTCCTGGCCTCAGGTTCGTAGCAGGTAG31-anchorTAACCTCCATATGTGAGTGAATAAACAAAATCGTTCGTAGCAGGTAG67-anchorGCCACCACTCTTTTCATAATCAAACCGTCACCGTTCGTAGCAGGTAG177-anchorTTTCATGAAAATTGTGTCGAAATCTGTACAGAGTTCGTAGCAGGTAG141-anchorGCAAATATCGCGTCTGGCCTTCCTGGCCTCAGGTTCGTAGCAGGTAG98 附录BDNA折纸序列信息附表B.10DNA折纸孔道与DDOEG互补订书钉链序列序列编号序列内容TTTTGATAAGTTTCATTCCATATACATACAGGg-169CTATCCTCTCATCACCAAGGCAACTTTATTTCAACGCAATTTTTGAGg-167CTATCCTCTCATCACAGATCTACTGATAATCAGAAAAGCAACATTAAg-165CTATCCTCTCATCACATGTGAGCATCTGCCAGTTTGAGGGAAAGGGGg-163CTATCCTCTCATCACGATGTGCTAGAGGATCCCCGGGTACTTTCCAGg-161CTATCCTCTCATCACTCGGGAAACGGGCAACAGCTGATTACAAGAGTg-159CTATCCTCTCATCACg’-159CCACTATTGAGGTGCCg-158AGTTTGGAGCCCTTCACTATCCTCTCATCACCCGCCTGGTTGCGCTCACTGCCCGCCGAGCTCg-160CTATCCTCTCATCACGAATTCGTTATTACGCCAGCTGGCGGACGACGg-162CTATCCTCTCATCACACAGTATCGTAGCCAGCTTTCATCCCCAAAAAg-164CTATCCTCTCATCACCAGGAAGACCGGAGAGGGTAGCTAGGATAAAAg-166CTATCCTCTCATCACATTTTTAGTTAACATCCAATAAATACAGTTGAg-168CTATCCTCTCATCACTTCCCAATTTAGAGAGTACCTTTAAGGTCTTTg-170CTATCCTCTCATCACACCCTGACAAAGAAGTTTTGCCAGATCAGTTGg-172CTATCCTCTCATCACAGATTTAGTGGTTTAATTTCAACTATAGGCTGg-174CTATCCTCTCATCACg-176GCTGACCTTGTATCATCGCCTGATGGAAGTTT99 附录BDNA折纸序列信息附表B.10DNA折纸孔道与DDOEG互补订书钉链序列序列编号序列内容CTATCCTCTCATCACg’-178CGTTGAAAATAGTTAGg-155AAAAAAGGACAACCATCTATCCTCTCATCACCGCCCACGCGGGTAAAATACGTAAAAGTACAAg-153CTATCCTCTCATCACCGGAGATTTCATCAAGAGTAATCTTAAATTGGg-151CTATCCTCTCATCACGCTTGAGAGAATACCACATTCAACGCGAGAGGg-149CTATCCTCTCATCACCTTTTGCATATTATAGTCAGAAGCCTCCAACAg-147CTATCCTCTCATCACGGTCAGGATCTGCGAACGAGTAGAACTAATAGg-145CTATCCTCTCATCACTAGTAGCAAACCCTCATATATTTTAGCTGATAg-143CTATCCTCTCATCACAATTAATGTTGTATAAGCAAATATCGCGTCTGg-141CTATCCTCTCATCACGCCTTCCTGGCCTCAGGAAGATCGGTGCGGGCg-139CTATCCTCTCATCACCTCTTCGCAATCATGGTCATAGCTACTCACATg-137CTATCCTCTCATCACTAATTGCGCCCTGAGAGAGTTGCACGAGATAGg-135CTATCCTCTCATCACg’-135GGTTGAGTAAGGGAGCg-134GAATAGCCGCAAGCGGCTATCCTCTCATCACTCCACGCTCCTAATGAGTGAGCTAGTTTCCTGg-136CTATCCTCTCATCACTGTGAAATTTGGGAAGGGCGATCGCACTCCAGg-138CTATCCTCTCATCACg-140CCAGCTTTGCCATCAAAAATAATTTTAAATTG100 附录BDNA折纸序列信息附表B.10DNA折纸孔道与DDOEG互补订书钉链序列序列编号序列内容CTATCCTCTCATCACTAAACGTTGATATTCAACCGTTCTAAATGCAAg-142CTATCCTCTCATCACTGCCTGAGAGGTGGCATCAATTCTTTTAGTTTg-144CTATCCTCTCATCACGACCATTACCAGACCGGAAGCAAAAAAGCGGAg-146CTATCCTCTCATCACTTGCATCAGATAAAAACCAAAATATAATGCAGg-148CTATCCTCTCATCACATACATAAACACCAGAACGAGTAGTGACAAGAg-150CTATCCTCTCATCACACCGGATATACCAAGCGCGAAACATGCCACTAg-152CTATCCTCTCATCACCGAAGGCATGCGCCGACAATGACACTCCAAAAg-154CTATCCTCTCATCACg’-154GGAGCCTTACAACGCCGAGAATAGCTTTTGCGGGATCGTCGGGTAGCAf-203CTATCCTCTCATCACACGGCTACTTACTTAGf-201CCGGAACGCTGACCAACTATCCTCTCATCACCTTTGAAAAGAACTGGf-199CTCATTATTTAATAAACTATCCTCTCATCACACGAACTAGCGTCCAAf-197TACTGCGGAATGCTTTCTATCCTCTCATCACAAACAGTTGATGGCTTf-195AGAGCTTATTTAAATACTATCCTCTCATCACTGCAACTAAGCAATAAf-193AGCCTCAGTTATGACCCTATCCTCTCATCACCTGTAATATTGCCTGAf-191GAGTCTGGAAAACTAGCTATCCTCTCATCACCATGTCAAGATTCTCCf-189GTGGGAACCGTTGGTGCTATCCTCTCATCACTAGATGGGGGGTAACGf-187CCAGGGTTGTGCCAAGCTATCCTCTCATCAC101 附录BDNA折纸序列信息附表B.10DNA折纸孔道与DDOEG互补订书钉链序列序列编号序列内容CTTGCATGCATTAATGf-185AATCGGCCCGCCAGGGCTATCCTCTCATCACTGGTTTTTAACGTCAAf-183AGGGCGAAGAACCATCCTATCCTCTCATCACACCCAAATCAAGTTTTf-181TTGGGGTCAAAGAACGCTATCCTCTCATCACAAAGGCCGAAAGGAACf-202AACTAAAGCTTTCCAGCTATCCTCTCATCACGCTCCATGAGAGGCTTf-200TGAGGACTAGGGAGTTCTATCCTCTCATCACCGATTTTAGAGGACAGf-198ATGAACGGCGCGACCTCTATCCTCTCATCACACTGGATAACGGAACAf-196ACATTATTACCTTATGCTATCCTCTCATCACTTTTTGCGCAGAAAACf-194GAGAATGAATGTTTAGCTATCCTCTCATCACCAAAATTAAAGTACGGf-192TGTCTGGAAGAGGTCACTATCCTCTCATCACTCAGGTCACTTTTGCGf-190GGAGAAGCAGAATTAGCTATCCTCTCATCACACCCGTCGTCATATGTf-188ACCCCGGTAAAGGCTACTATCCTCTCATCACATTAAGTTCGCATCGTf-186AACCGTGCGAGTAACACTATCCTCTCATCACGCCAGCTGCCTGCAGGf-184TCGACTCTGCAAGGCGCTATCCTCTCATCACTGGACTCCCTTTTCACf-182CAGTGAGACCTGTCGTCTATCCTCTCATCAC102 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果个人简历1990年1月22日出生于黑龙江省萝北县。2008年9月考入吉林大学理科实验班，2012年7月本科毕业并获得理学学士学位。2012年9月免试进入清华大学化学系攻读高分子化学与物理博士至今。发表的学术论文[1]WangDM,ZhangYY,WangM,DongYC,ZhouC,IsbellAM,YangZQ,LiuHJ,LiuDS.AswitchableDNAorigaminanochannelforregulatingmoleculartransportatthenanometerscale.Nanoscale,2016,8:3944-3948.(SCI收录，检索号：DE6RQ，影响因子：7.76)[2]WangDM,DaZR,ZhangBH,IsbellAM,DongYC,ZhouX,LiuHJ,HengYYJ,YangZQ.ThestabilitystudyoftubularDNAorigamiinthepresenceofproteincrystallisationbuffer.RSCAdv.,2015,5:58734-58737.(SCI收录，检索号：CM6KW，影响因子：3.29)[3]WangDM,ZhangYY,LiuDS.DNAnanochannels.F1000Research,2017,(doi:10.12688/f1000research.10464.1)[4]WangDM,ZhangGL,ZhangYY,XinL,DongYC,LiuY,LiuDS.An addressable two‐dimensional heterogeneous nanoreactor to study the enzyme‐catalyzed reaction at the interface.Small,Accepted.[5]ZhouC,WangDM,DongYC,XinL,SunYW,YangZQ,LiuDS.Preparationandself-foldingofamphiphilicDNAorigami.Small,2015,11:1161-1164.(SCI收录，检索号：CD3LW，影响因子：8.31)[6]DongYC,SunYW,WangLY,WangDM,ZhouT,YangZQ,ChenZ,WangQB,FanQH,LiuDS.Frame-guidedassemblyofvesicleswithprogrammedgeometryanddimensions.Angew.Chem.Int.Ed.,2014,53:2607-2610.(SCI收录，检索号：AB4QJ，影响因子：11.71)[7]DongYC,YangYH,ZhangYY,WangDM,WeiXX,BanerjeeS,LiuY,YangZQ,YanH,LiuDS.Cuboidvesiclesformedbyframe-guidedassemblyonDNAorigamiscaffolds.Angew.Chem.Int.Ed.,2017,56:1586-1589.(SCI收录，检索号：EM0HB，影响因子：11.71)103