毒蕈碱型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂中定位的研究 64页

毒蕈碱型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂中的定位研究h翠萍摘要：昆虫脑内胆碱能系统在中枢神经系统中起着重要作用，参与感觉、运动、学习、记忆等生理活动，与昆虫的复杂行为密切相关，‘’直以来就是科学研究的热点问题。胆碱能系统中存在两类重要的受体，即烟碱型受体(nicotinicacetylcholinereceptor，nAChR)和毒蕈碱型受体(muscarinicacetylcholinereceptor，mAChR)。根据其药理学特点毒蕈碱型受体又分为两大类，M1类激活型受体和M2类抑制型受体。目前已发现的昆虫mAChR属于M1类受体。在昆虫中，M2类受体一直未见报道。社会性昆虫行为复杂，具有十分高级的神经系统。本实验选取社会性昆虫中两个代表种—拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂——为研究材料。拟黑多刺蚁(PlyhachisvicinaRogher)是一种群居生活而且分工明确的社会性昆虫，同时它也是具有极高药用价值的一类昆虫；意大利蜜蜂(ApismelliferaligusticaSpinola)是我国许多省区饲养的主要蜂种之一。采用石蜡组织包埋切片技术、链霉亲合素．生物素．过氧化物酶(SABC)免疫组织化学方法，研究毒蕈碱型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂不同组织中的分布；最后用生物信息学方法分析蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因并对其进行功能预测。研究结果如下：1．拟黑多刺蚁脑部存在毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物：且拟黑多刺蚁不同品级间毒蕈碱1I型乙酰胆碱受体类似物的表达明显不同，该受体类似物可能在拟黑多刺蚁不同品级蚂蚁的行为分化中起着一定的作用；毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁脑内的外触角神经通路、中触角神经通路、内触角神经通路上均有表达。2．用HE染色对意大利蜜蜂工蜂脑部结构进行显微观察，分出明显的三个部分，前脑、中脑、后脑。意大利蜜蜂工蜂脑部有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性表达，且表达区域与拟黑多刺蚁工蚁不同，主要分布在脑腹体与蕈形体冠相连的神经纤维通路上、侧前脑叶、腹后视连合、后脑食道下神经节。3．外围神经系统中，拟黑多刺蚁在神经末梢和肌肉结合处有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物表达。工蚁头部口器肌中的上颚肌(背展肌和背收肌)处神经末梢有毒蕈碱1I型乙酰胆碱受体类似物阳性反应；雄蚁胸部纵肌和背腹肌处神经末 梢有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应。另外意大利蜜蜂工蜂胸部肌肉处神经末梢也检测到毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应。4．利用生物信息学方法分析意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因(XM395760)，得到该基因的EST组成、染色体定位和氨基酸组成、等电点、疏水／亲水区、跨膜区等蛋白性质；并与其它物种的同源蛋白比较，分析保守序列的功能特点；结合已有实验结论和PROSITE数据库中的预测信息，推测出其功能位点。最后用Mega3．O分析获得了12个物种毒蕈碱型乙酰胆碱受体的遗传距离，建立系统发育树；本研究首次证实M2型乙酰胆碱受体类似物在社会性昆虫神经系统中普遍存在，研究了其在拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂神经系统的分布情况。但要详细阐明社会性昆虫中毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物的功能，还需要进一步从药理学方面和分子水平做深入研究。希望我们的工作能为今后深入研究社会性昆虫毒蕈碱型乙酰胆碱受体的结构和功能，提供理论依据。关键词：拟黑多刺蚁：意大利蜜蜂；毒蕈碱型乙酰胆碱受体；神经系统ll StudyonLike-MuscarinicAcetylcholinereceptorinPlyhachisvicinaRogherandApismelliferaligus行caSpinolaBuCui—pingAbstract：Thecholinergicsystemplaysanimportantroleinthecentralnervoussystemofinsectsandiscloselyrelatedtoacomplicatedbehaviorofinsects．Scientistsalwayspaycloseattentiontothecholinergicsystemwhichparticipatesinfeeling，movement，memory,learningandothercognitiveprocesses．Therearetwomaintypesofcholinergicreceptors—nicotinicandmuscarinicacetylcholinereceptors．Inmammal，muscarinicreceptorsarefurtherclassifiedintoM1·M5subtypes．M1，M3andM5receptorsubtypeshaveastimulatoryeffectonthetargettissue，whereastheM2andM4subtypesareinhibitory．Now,allofinsectmuscarinicacetylcholinereceptorscoupletostimulatoryG-proteins，andinducesadenylatecyclaseactivity．AndtheinsectsM2receptor(inhibitoryreceptor)hasn’tbeenreporteduptonow．Thesocialinsectswhosebehavioriscomplexowndevelopedneuralsystem．Asthetypicaleusocialinsects，bothPlyhachisvicmaRogherandApismellifera堍usticaSpinolahaveastricthierarchicaldivisionoflaborinthegroupwhichismostlydividedintothreecastes：male，female(queen)andworker,theyaredifferenteachotherinmorphologyandphysiology．Atthesametime，PlyhachisvicinaRogherisalsoanimportantmedicalinsectand4P括melliferaligusticaSpinolaisbredtoproducehoneywidelyinourcountry．Inthisstudy,wetookPlyhachisvicinaRcIgherandApismelliferaligusticaSpinolaasexperimentalanimals．Theimmunohistochemicaltechniqueandthebioinformaticsmethodwereperformedtostudytheexpressionoflike-muscarinicacetylcholinereceptorM2inthedifferenttissuesofant口vicina)andthebeea．m．1igustica)andpredictthefunctionoflike—muscarinicacetylcholinereceptorinsocialinsects．Themainresultsdescribeasfollows：1．Like-muscarinicacetylcholinereceptorM2isexpressedinthebrainofthedifferentcastePolyrhachisvicinaRogherandshowsthedifferentlocalizationinthedifferentcaste，whichsuggeststhatlike·M2receptorhadadifferenteffectonspecialbehaviorofdifferentcaste．Antermo—cerebraltracts，suchasinnerantenno—cerebraltracts，middleantenno-cerebraltractandouterantenno—cerebraltractexhibitlike-M2receptorimmunoreactivity．ⅡI 2．HEstainisperformedtoobservethebrainofworkerbee以．m．1igustica)．Theresultindicatedthatthebrainstmctureiscomposedofanterior,middleandhindbrain．Like—M2receptorisexpressedinthebrainofworkerbee翻．m．1igustica)，whichdiffersfromworkerant僻vicina)．Like·M2receptorimmunoreactivityisshowedinthenervefibertractbetweenlateralhornandmushroombody,lateralprotocerebrallobe，ventralposterioropticcommisureandsubesophagealganglion．3．Intheperipheralnervoussystem，especiallyneuromuscularjunction，like-M2receptoriswidelyexpressedinthemusculatureofPlyhachisvicinaRogher．Thesnodgrassofworkerant僻vicina)andthelongitudinalanddorsoventralofmaleant僻vicina)exhibitlike—M2receptorimmunoreactivity．Besides，theneuromuscularjunctionofthoraxintheworkerbee“．舰ligustica)showsthesameresults．4．ApismelliferasimilartomuscarinicacetylcholineReceptorgene(XM一395760)，whichwasregisteredinGenBank，wasanalyzedandpredictedbythetoolsofbioinformaticsinthefollowingaspects：thecompositionofESTsequences，theorientationofchromosome，thecompositionofaminoacidsequence，equipotential，transmembranetopologicalstructure，hydrophobicityorhydrophilicity,thecomparisonofhomologousproteinsinotherspeciesandSOon．CombinedexperimentconclusionwithpredictedinformationinthePROSITEdatabase，weanalyzedconservativesequencesandfoundthefunctionalregionsofthisprotein．Atlast,wereconstructedphylogenetictreesformAchRin12speciesusingMega3．0．Thisstudygivesthefirstaccountoftherepresentationoflike·muscarinicacetylcholinereceptorM2neuronalsystemsinthebrainofinsect．Theresultsshowthatlike-M2receptoriswidelydistributedinthebrainofPlyhachisvicinaRogherandApismelliferaligusticaSpinola．ButPeoplepaylessattentiontoinsectmuscarinicacetylcholinereceptor．Wefindthatlike-M2receptorexistsinthesocialinsectsinordertofurtherresearchthestructureandfunctionofinsectacetylcholinereceptorandaccumulatedatumaboutinsectneurophysiology．Keywords：PlyhachisvicinaRogher；Ap／smelliferaligusticaSpinola：muscarinicacetylcholinereceptor：neuralsystemIV 学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。作者签名：髀日期：互牡学位论文使用授权声明本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。作者虢避嗽脚正 第一章绪论21世纪是生命科学的世纪，而神经生物学则是21世纪一颗璀璨的明星。一直一来，人们十分关注动物神经系统的结构和生理功能，但研究主要集中在哺乳动物和个别模式生物。昆虫作为进化上的侧枝，是动物界发展历史中种类和数量最多的一类；其行为复杂、神经结构集中便于操作，材料易得十分经济。因此昆虫是神经生物学基础理论研究的优秀生物模型。膜翅目中的蚂蚁和蜜蜂都属于社会性昆虫，它们属群居性完全变态昆虫，有明确的社会分工和与之相适应的复杂行为。结构与功能相适应，社会性昆虫的复杂行为表明了其具有十分高级的神经系统。中枢神经系统中的胆碱能神经元系统控制着多种神经活动。乙酰胆碱己被证明是昆虫神经系统中重要的神经递质，它们起作用的脑区和相关的神经通路在昆虫中研究还很少，对它们受体的研究还不是很清楚。本文以拟黑刺蚁和意大利蜜蜂为材料，用免疫组织化学方法对类似M2型乙酰胆碱受体在拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂脑和其它组织进行定位研究；最后，用生物信息学方法对Gnomon预测的意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因(XM395760)进行结构分析和功能预测。这为昆虫神经系统中胆碱能系统的功能分析提供了直接有力的证据，同时也可为神经科学的研究提供基础资料。l社会性昆虫概述在集群生活的昆虫中，其集群的协调性和内部分化显著者，称为社会性昆虫。世界上的“社会性昆虫”包括白蚁类、蚁类、胡蜂类和部分花蜂类【”。人们给社会的定义是泛指由于共同物质条件而互相联系起来的人群。社会性昆虫晟大的特征是成员之间按照等级分化而建立分工。在群体中动物所拥有的维护个体和种族的能力是在等级之间分担进行的，从整个集群来说，具有超个体的行为，并且个体成员离开集群则难以生存。这个社会需要很好的指挥系统、很好的联络系统，而且个体与个体之间必须很好的配合，要有很好的组织纪律性，成员须有一定的牺牲精神12】。这一切对应了社会性昆虫更加复杂的行为。1．1膜翅目社会性昆虫分类地位、种类及其在生态系统中的作用1．1．1膜翅目社会性昆虫分类地位、种类膜翅目(Hymenoptera)昆虫纲中的第三大目，也有认为是仅次于鞘翅目的第二大目。体微小至中型。头大，复眼发达，具变形的咀嚼式口器。中胸发达，前胸退化，腹部第一节并入胸部。翅两对，膜质。雌虫有发达的产卵器，有时变为锯、钻或刺器。完全变态。幼虫有头或无头，无足或有足。蛹为裸蛹，居于以丝 或牛皮纸状物质织成的茧中。植食性或寄生性，也有肉食性的。部分种类营合群生活，是昆虫中最进化的类群pJ。该目有两大类群，即：广腰亚目Symphyta和细腰亚目Apocrita．。广腰亚目分为6总科，13科。细腰亚171包括了膜翅目的大部分种类，一般分为12—13个总科，其又可分为两类：寄生部Parasitica和真尾部Aculeata。寄生部除瘿蜂科外，多为寄生性种类，包括9个总科。真尾部分为4个总科，青蜂总科、胡蜂总科、泥蜂总科和蜜蜂总科；其中真尾部的大部分例如：胡蜂总科下的蚁科、胡蜂科和蜜蜂总科下的蜜蜂科都属于社会性昆虫14J。1．1．2膜翅目社会性昆虫蚁类和蜜蜂类在生态系统中的作用膜翅目蚁类是一种古老的社会性昆虫，起源于白垩纪，距今约有8千多万年的历史。全世界约有9000多种，隶属360多个属，实际种类则可能达到15ooo多种。蚂蚁是地球上最常见的昆虫，从干旱的沙漠到湿润的河滩、海边，从平原到高山，从热带到寒带地区，从裸地到茂密的森林，到处都有蚂蚁的分布。此外，种类多、行为多样也是蚂蚁个体数量惊人的原因之--15,61。蚂蚁对其生活的生态环境具有显著影响，它既是生态系统中的初级消费者，又是高级消费者。蚂蚁的取食行为和筑巢行为与生态系统有着密切的关系。大多数蚂蚁在地下筑巢并居住，通过建巢觅食的过程可使得土壤成分发生变化。有些蚂蚁种类还是其他昆虫和小动物的捕食者，可对这些昆虫或者小动物的种群造成一定的影响。另外，通过行为活动蚂蚁也可能对植物生长等造成一定的影响，比如蚂蚁的觅食过程可能起到帮助植物扩散的作用。此外，蚂蚁与许多动物存在着密切的互利共生关系，如隐翅甲、介壳虫、蚜虫和一些鳞翅目幼虫等。这些昆虫为蚂蚁提供自己的分泌物，蚂蚁则保护这些昆虫免遭天敌寄生或捕食，甚至搬迁或驱赶同翅目昆虫到营养丰富的部位取食，促进这些昆虫的生长发割”。当然，也有一些蚂蚁生活于城市、居民区，成为城市害虫之--181。膜翅目蜜蜂类也是一种非常古老的社会性昆虫。在1亿年前的白垩纪中期，在好几个地方发现了与现今蜜蜂有许多共同点的古蜜蜂化石；蜜蜂属起源于亚洲，只有4个社会性的种类19‘。除蜜蜂以外，还有印度巨蜂、花蜂和Apisc．erana，后两种蜂也栖息在印度。蜜蜂有不同的种类和亚种，它们都是人类驯养的家蜂。蜜蜂是重要的传粉昆虫，蜜蜂在植物生态系统中起了重要作用，蜜蜂传粉所带来的经济收益远不止产蜜【[0,llJ。高等植物繁殖的惟一途径是传粉，即雄蕊的花粉传授到雌蕊上。风媒植物是由风传粉的，然而80％的高等植物是虫媒植物，也就是说它们依靠昆虫传粉。家蜂承担了65％．95％的虫媒任务。蜜蜂的天敌有：食虫鸟类(燕子、蜂虎、山雀等)，一些节肢动物(蜘蛛、2 蜻蜒、泥蜂、胡蜂、蜂虱)，单细胞生物(蜜蜂孢子虫)，菌类等llel。1．2拟黑多刺蚁简介1．2．1拟黑多刺蚁外部形态和内部结构拟黑多刺蚁(Plyhachis订c胁ⅡRo·gller)属于节肢动物门(Arthropoda)，昆虫纲(Insecta)，膜翅目(Hymenoptera)，胡蜂总科(Vespoidea)，蚁科(Formicidae)，蚁亚科(Formicinae)，多刺蚁属(Polyrhachis)。形态描述：雌蚁：体粗壮，胸部特别发达。长7．5．8．5mm。头较小；具单眼；唇基前缘中央凹入。触角13节，前胸背板，并胸腹节及柄腹结节各有2对刺状突起，但不如工蚁明显。初羽化时具2对翅，交尾后翅脱落。雄蚁：体较纤细，胸部发达，腹部末端较尖。长6．7mm。头很小；具3个很大的单眼和2个复眼；触角14节；触角脊相距较窄，并腹胸和结节不具刺或突起。具2对翅，翅不脱落。工蚁：无翅，体较粗壮，胸部相对较小；体长5．5．6．5mm。体黑色，具光泽，密被古铜、金黄色刚毛。并腹胸、后腹密被金黄色柔毛被，头部柔毛较稀。头短而宽；唇基具中脊。并腹胸十分凸出；复眼圆形，触角膝形、12节，下唇须4节。胸部圆而突起，前胸背板前侧角、并胸腹节背板各具2个直的长刺。结节上缘两侧具2个向后弯曲并包围后腹的长刺，刺之间有2．3个齿状突起。足细长，胫节内方具1列短刺。柄腹的结节高，前面平截，后面凸出，左右剑角各具1根刺，随腹部体形而弯曲，二刺间中央具钝齿3个，一前二后成鼎足状排列，腹部第一节较第二节为长113,14]。拟黑多刺蚁可分为头、胸、腹三部分，其内部结构切面图见图1-1。头部(雄蚁的头部较小)有大脑、复眼、单眼、触角和起咀嚼作用的I=I器115,16】。蚂蚁的神经系统是记忆和本能行动的协调中枢。不同等级蚂蚁的大脑和神经节的发展程度是不一样的。雄蚁的生命短暂，大脑和神经节的功能只限于控制繁殖；其他蚂蚁的大脑和神经节的作用就广泛得多。蚂蚁同时具备单眼和复眼，因此它们能够利用接收的光线来指引方向和返回蚁巢【18,19]。工蚁的复眼由400．600个小眼构成；蚁后的复眼较大，由100—900个小眼构成；雄蚁的复眼最大，由200．2000个小眼构成，因此它们能够在交配飞行时准确地辨认雌蚁。同样，雄蚁的单眼也比雌蚁的大；不过，雌蚁的单眼比工蚁的明显。蚂蚁的色彩视觉不太好。一些研究表明，因为蚂蚁的色彩光谱偏向紫外光，所以它们基本上感觉不到红光。蚂蚁看不清楚景物，但它们对运动的物体很敏感，所以能清晰地感觉猎物或敌人的移动。此外，单眼有助于夜视。蚂蚁的头部、触角、胸部和前脚的胫节都含有听觉器官，可以感受声音振动。触角除有精确的味觉、嗅觉和听觉之外，其触觉更为出色。触角上密布短短的触毛，触毛的根部与非常发达的神经末梢相连。蚂蚁的大部分活动都因接收到化学物质而产生的，这些化学物质称之为外激素。蚂蚁能轻声尖叫发3 出吱吱嘎嘎的声音，人耳完全能听到120，21,22】。雄蚁的大颚已经退化，与此相反，雌蚁和工蚁的大颚强而有力。蚂蚁的舌头很短。蚂蚁的口器是舔物和清洁的工具。口器咀嚼．吸泵型附属口器亦称附舌，它柔软，用作舔吸和清洁。蚂蚁的舌头较短，有横向皱纹。工蚁的大颚非常有力，颚腺分泌物粘稠，用于搅拌坚硬的食物。口部还有唇须和颌须，起感受器的作用I”埘盈J。不同等级的蚂蚁胸部也不一样。带翅的雌蚁和脱翅的蚁后胸部的第一节非常发达，因为上面有翅膀关节。具有生殖能力的蚂蚁的翅膀是膜翅。雄蚁的胸部拱起，工蚁的胸部平坦，它们的胸部长着足，足由髋关节、股骨转子(股骨凸起，上面附着操纵大腿的肌肉)、股骨、胫节和跗骨构成。前足胫节的末端长着清洁触角的器官。足根部的胸问腺能喷射出一种气味强烈的物质，用于防御。雌蚁和工蚁长着6只长足，而雄蚁的足已经退化。胸部的咽管和食管，腹部的嗉囊、中肠和后肠，构成了蚂蚁的消化系统。嗉囊能够伸缩，而中肠狭窄而有力。肛门部位长着毒腺和杜氏腺：毒腺含有蚁酸，在紧急的关头，蚂蚁能将蚁酸喷出1米开外；杜氏腺能够分泌同类交流用的基本信息素126刀瑚．29】。蚁后的各种生殖器官(卵巢、子宫、含有雄蚁排出的精子的受精囊等)周围都包着强有力的横肌，这些横肌有助于排卵，也有利于精子进入卵母细胞。工蚁基本上没有受精囊，即便有也不发达。雄蚁的两粒睾丸将精子储入两个精囊，精囊连着一根共同的射精管，射精管的末端是阴茎【29，30)1卫331。蚂蚁依靠一套气管系统进行呼吸。气管通达身体各个部分，通过气孔向外。田1．1虹后剖面圈．示虹后神经系统、洧化系统、生殖系统及附肚(引白h卸舯忡w棚切一脚m舳^∞曲)1．2．2拟黑多刺蚁品级、发育和生境品级结构：拟黑多刺蚁和其他蚂蚁一样，为社会性昆虫，一般以一窝为一个家庭。一窝中有蚁王(雄蚁)，蚁后(雌蚁)有一个或数十个。工蚁专筑巢、觅食、4 育幼等，数量最多，兵蚁保卫群体安全，数量较少，一窝蚂蚁一般为500．2000只以上，一年可繁殖分出15．25窝。拟黑多刺蚁巢内一年四季均有卵、幼虫和蛹。每年9月上旬至10月下旬出现有翅蚁。其各日段发育历期随饲养条件的不同而异。根据伍建芬等(1986)的报道，发育历期为：卵期15．17d，幼虫期23．25d，蛹期13．16d；韦建盛等(1986)的观察显示，完成1个世代需40—60d；沈立荣(1995)的报道：卵期21．3．26．3d，幼虫：16．24．8d，工蚁蛹13．5．24．5d：翟新国(2000)的报道，卵期4．6d，幼虫期20．30d134筇’36．371。拟黑多刺蚁的活动主要在3．10月，日气温降至8一10℃时停止外出，日平均气温下降至7℃时，入土定居；气温越低，入土越深。蚂蚁一般在4到9月份交配，交配后8．21天产卵，卵期14天。如果室内温度能保持在15．30度，可常年交配。翌年春天3月上旬开始上树营巢，在纬度较高的地区，拟黑多刺蚁常在地面筑巢。该蚁活动距离一般在8-14m，最远可达40m。拟黑多刺蚁(又称鼎突多刺蚁)分布于我国长江以南地区；国外广泛分布于东南亚、澳大利亚。该蚁是亚热带、热带种类，野生拟黑多刺蚁主要分布于我国广西、广东、云南等省的亚热带地区，多数的高大的马尾松尖上建巢。小巢直径5．6咖，一般直径20cm左右，最大的直径达57锄。蚁巢由松针、松花及蚂蚁大幼虫分泌物粘结而成，内部呈蜂窝状，十分疏松，表面有孔3．5个或多达十几个【361。通常每巢有蚁数千至数万只个体，蚁后常有十多只。食性和繁殖：食性杂，可食米糠、麦麸、豆类、剩饭类、瓜果类等植物性饲料和产蛹、骨头、小干鱼、各种死活昆虫等动物性饲料【35l。食量一般每日每只为0．1皿g。营养价值及药用：在我国蚂蚁用药历史悠久，始载于《本草始遗》，李时珍在《本草纲目》中释蚁为玄驹。拟黑多刺蚁主要产于贵州、云南、广西等省。味咸性平，蚁卵味甘、入肝肾，是一种微型动物营养宝库和天然药物加工厂，既能健身又能治病。拟黑多刺蚁含有丰富的蛋白质，其含量高达40％．55％，少数可达67％以上。其所含19种氨基酸中，有8种是人体必需氨基酸即：苏氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、棘氨酸、蛋氨酸、色氨酸等。并含维生素A，维生素B1、B2、B12，维生素C、D、E和钙、铁、铬、镁、锌、碘、硒等28种微量元素，其中以锌的含量最多，达到每千克含锌230mg-280mg。最为特别的是拟黑多刺蚁含有多种酶类和辅酶、草体蚁酸、淄族类化合物、三萜类化合物、蚁酸，同时含有大量的高能磷化物ATP。药理研究表明，拟黑多刺蚁可以调节人体免疫功能，具有抗炎、镇痛、活血化瘀以及保肝、护肝、降低谷丙转氨酶的作用。动物实验还表明此种蚂蚁具有延缓衰老、增强性功能等多种生理功能I翊。研究现5 状：目Ij{『国内对拟黑多刺蚁的研究主要集中在其营养成分的药理研究和保健产品的开发。国外对拟黑多刺蚁的研究很少。1．3意大利蜜蜂简介1．3．1意大利蜜蜂外部形态和内部结构意大利蜜蜂(ApismelliferaligusticaSpinola)属于节肢动物门(Arthropoda)，昆虫纲(1nsecta)，膜翅目(Hymenoptera)，蜜蜂总科(Apidea)，蜜蜂科(Apidae)，西方蜜蜂(彳_口括mellifera)。形态特征【391：头部为三角形，与身子连为一体；眼睛长在头部两侧；胸部长3对足和2对翅膀；腹部有黑黄相间的圆环。个体比欧洲温蜂略小，腹部细长，背板几丁质黄色；第2-4腹节背板的前缘有黄色环带；第2腹节背板前缘的黄色环带宽度1．62．1．92mm(平均1．77mm)，第4腹节背板上的绒毛带宽度0．77．0．98mm(平均0．89mm)，第5腹节背板上的筱毛长度0．25-0．32mm(平均0．29mm)，嚎长6．22．6．86mm(平均6．47mm)，肘脉指数2．08．2．77(平均2．33)。蜂王腹部背板为桔黄色至淡棕色，有的第5．6节为黑色。雄蜂腹部背板为金黄色，有黑色斑；色淡黄色。工蜂腹部背板第2．5节为黄色，后缘有黑色带，尾节黑色；色淡黄色，体长12．14ram，吻长6．2．6．7ram，肘脉指数2．3。初生重：工蜂llOmg，蜂王233mg，雄峰259mg；成蜂体重107．5mg。蜜蜂是无脊椎昆虫，具有刚性而分节的外壳。成蜂的体表，由数百片几丁质的硬片构成，硬片上有许多浓密的毛。这些硬片成为外骨骼，能够保证内部机构、防止水分散失、内部的突起提供肌肉附着，并借着外骨骼及肌肉的结合，使蜜蜂能够运动。外骨骼向内突起，身体分为三个部分，即是头部、胸部及腹部，各部分之间皆有节间膜相连。头部有口气、复眼、单眼、触角及感觉毛是头上的重要器官。蜜蜂的感官非常发达，特别是视觉。头部既有3只由数千只单眼组成的复眼，又有3只呈三角形排列的单眼。每只复眼都是一个完整的视觉系统，包括一个起会聚透镜作用的透明角膜、一个锥形的玻璃体和一个由8个感光细胞组成的视网膜。单眼只有一个双凸透镜、一个玻璃体和一个视网膜。单眼能够测量光线强度，起光电管的作用岬J。蜜蜂的味觉十分敏锐，它们能够分辨甜、酸、苦、咸4种味道。蜜蜂的味觉与它身体的不同部位有关联。另外，蜜蜂的味觉能力取决于年龄、生理状态和营养状况，而后者是最主要的。因此，蜜蜂在饥饿状态下对微弱的甜昧浓度敏感，而在正常情况下它们对这种浓度根本没感觉。蜜蜂的触须同时起耳朵和鼻子的作用。蜜蜂的触须分为3段。第3段最长，有11节，每节上都有称为感受器的小板。有些感受器感受气味，另一些感受声音或者说感受振动更为确切。振动感受器是丝状的，每支触须有8500根。感受气味的有密布细孔的感受板(工蜂有3000-60006 块，蜂王有3000块，雄蜂有3万块)和触须第二、第三段上“锥底状”的感受器。蜜蜂似乎有能力感觉某一种特定的气味，即使这种气味与数种其他气味混杂在一起；但蜜蜂只有在相当近的距离才能闻到花的芳香。不过，在蜂巢门口站岗的哨兵却是凭借嗅觉才将同胞和闯入者区分开来。此外，在工蜂跳传递蜜源信息的舞蹈时，舞蹈者是不可能被同伴看见的，因为它们在黑暗处舞蹈，所以同伴们是凭借触觉、听觉和嗅觉才感知的。蜜蜂胸部有三个节构成，每节上有一对足，分别为前足、中足、后足。后两节上各有一对翅。腹部有数节构成，有蜡腺开口、蜇针。产卵的蜂王腹部约比工蜂长一倍，容易辨认。工蜂成蜂的身体表面有很精致的特殊结构、这些特殊构造使蜜蜂能够采集花蜜、花粉、蜂腰、以及花朵授粉，发挥了很多特殊功能。雄蜂体型较圆胖，复眼角较大成半球形，在头的上方相接，腹部末端较圆有很多毛，没有蜇针。蜜蜂的内部器官浸泡在起血液作用的液体一血性淋巴液中。血性淋巴液是无色的，借助于起心脏作用的背管在体内流动。在背管的推动下，血性淋巴液在体内自由流动，因为蜜蜂没有血管系统。蜜蜂的呼吸器官与其他昆虫是一样的。一个多分支的气管系统将空气送到所有的细胞。气管通过20个气门(胸部3对、腹部7对1与外界相连。消化器官是一根从口直通肛门的管子，即头部的咽部、胸部的食道、腹部的嗉囊(用于储存和运输食物)；随后是前室、胃室和肠道，前室就像一个单向阀门，只容许食物从嗉囊流向胃室而不容许反向流动；消化器官的末端是肛袋。在整个消化器官内，食物在消化液作用下消化。肛袋位于腹部末端，体积极大，可以储存蜜蜂一冬的排泄物。蜜蜂的内部有许多特殊结构。头部内有下咽头腺，是分泌蜂王乳的主要腺体．另有触角叶、视神经叶、前脑及唾液腺等。胸部内有器官、食道、及坚韧的肌肉，使蜜蜂能爬行及飞翔。腹部内有嗉囊、前肠、中肠、直肠、马氏管等消化器官及蜡腺、毒囊、蜇针。如下图1．2。 4c日nw_}，“目。∞一——"●*!!!!一～圈1-2,翟蜂内部结构图(引自httpW叭帆cm吲“∞叫)lbleedfoodglI叫咽腺．2brain脑-3esophagust管r4唧(hoeey‘砷胃．5m州枷姐tubek马氏管．6hiadgm后肠．7r鲥ltlm直肠．8sling蜇针．9Vt"BOmSaC毒重，10啪业州毒脾．11midgul中肠．12pmveatricuktiitW．13ventralIIf,ln"ecord腹神经节，34safivafygh．d唾液臃，15脚—蛔神经节-]6tthvmydaa唾液臂t17phalyax咽l_3．2意大利蜜蜂品级、发育和生境品级结构141J：蜜蜂是社会性昆虫，过着群体生活。蜂群是由3种形态和职能不同的许多蜜蜂组成的一个有机体，是蜜蜂赖以生存的生物单位。单只蜜蜂虽然也是一个独立的生物体一旦脱离蜂群就不能生存。意大利蜜蜂有3种成年蜂：蜂王、雄蜂和工蜂。它们的体形各不相同。蜂王个头比工蜂大，腹部更细长；蜂王生长发育的蜂房呈顶针状，是最高的。雄蜂有～对大复眼和方形的腹部，雄蜂的蜂房与工蜂一样，都是六角形的，但比较大，顶盖更为突出。蜂王以蜂王浆为食，雄蜂和工蜂只能享用3天，随后以花粉为食，最后以蜂蜜为食。蜂王，在群体中独一无二，起繁殖和调节的双重作用；雄蜂，大约2500只，其作用是在交配飞行时替新蜂王授精；工蜂，大约有5万只，夏天工蜂的寿命是38天，冬天的寿命是6个月，工蜂一生中要扮演保姆、主妇、建筑工、保管员、守卫的角色。采蜜工蜂听从蜂王指挥，蜂王通过分泌信息素向它们传达命令。蜂王能够让所有的工蜂都围绕在它周围。蜜蜂幼虫住在蜂巢的子脾里，子脾里大约有6000个卵，9000个幼虫和2万个蛹。但以上数字只是平均数．蜂巢里蜜蜂数量多寡取决于好几个因素，如蜂王的生育能力、气候条件、食物来源、疾病等。意大利蜜蜂是全变态昆虫，其个体发育要经过卵期、幼虫期、蛹期、成虫四个阶段。早春蜂王开始产卵后，气候、蜜源等自然条件对其影响不明显，在炎热的夏季直至深秋，也可保持较大面积的育虫区。分蜂性弱，易维持强大的群势。对大宗蜜源的采集力强，对零星蜜粉源的利用较差。食料消耗量大，在蜜源条件8 不良时，易出现食料短缺现象。分泌王浆和泌蜡造脾能力均强。对花粉的采集量大。在夏季和秋季，往往采集较多的树胶。性情温驯，不怕光，开箱检查时很安静，但定向力较差，易迷巢，易作盗。意大利蜜蜂原产于意大利的亚平宁半岛。原产地地中海气候和蜜源条件的特点是：冬季短、温暖而湿润；夏季炎热而干旱，花期长。在类似上述自然条件下，意大利蜂可表现出很好的经济性状，在冬季长而严寒、春季经常有寒潮袭击的地方，适应性较差。营养价值和药用“”：蜂产品具有众多疗效，古埃及人使用蜂蜜来配制香胶。蜂蜜含有很高的热量(每1009，300K)，非常容易被人体吸收。蜂蜜是一种深受运动员喜爱的高能量食品。它能开胃，还是镇静剂和轻泻剂。蜂蜜一般是口服的，但是在美国和德国，蜂蜜也能注射。单一花卉酿的蜂蜜具有蜜源的品质，因此桉树蜜用来治疗呼吸器官疾病，牛至蜜和风轮草蜜可以治疗风湿病和痛风病，树梅蜜则可以治疗喉咙痛。蜂蜡是皮肤科的常用原料，因为它能使药膏变稠。蜂胶是兽医的宝贵药品，它可以用作局部麻醉剂，可以促进伤口愈合，还能阻止出血。蜂胶在医学上用作抗真菌剂和抗菌剂。长久以来，蜂毒是某些治疗风湿病方法的基础材料。希腊和罗马的杰出学者塞尔苏斯、加伦和希波克拉底等人，都在著作中提及此事。直到现在一些国家还在使用这种治疗方法。治疗专家自然也很看重花粉和蜂王浆。花粉主要是一种强壮剂，因为它含有蛋白质、糖类、酯类、维生素、矿物质和微量元素。花粉有利于人体生长发育，也能调节肠胃功能。花粉和蜂蜜一样，单一花卉的花粉具有花粉源的特定功效。蜂王浆含有水、蛋白质、酯类、矿物质、微量元素和维生素，是一种极好的食品，能用作抗菌剂。蜂王浆是消除疲劳和开胃的良药，不少大夫建议给婴儿喂服蜂王浆。2毒草碱型乙酰胆碱受体概述受体作为细胞接受外界化学信号的原初部位，控制着细胞与环境间的信息交流：具有特殊的生物学意义，其始终受到生命科学工作者的高度重视。乙酰胆碱是动物神经传导中重要的神经递质。动物细胞中存在两类乙酰胆碱受体，即烟碱型受体和毒蕈碱型受体。乙酰胆碱受体的研究至今已有20多年的历史。(1)烟碱型乙酰胆碱受体：能被Ach所兴奋，同样也可被低浓度烟碱所激动(高浓度被阻断)。N受体主要分布在骨骼肌的神经肌肉接头、植物神经节和肾上腺髓质等突触后膜上。在中枢主要分布于脊髓闰绍氏细胞。据此可分为神经节型(N1-AchR)和神经肌肉接头型(N2-AchR)两种亚型。故其阻断剂或拮抗剂分神经节和神经肌肉接头两类：前者有美加明、五烃季铵、六烃季铵；后者有十烃季铵、d．简箭毒、a．银环蛇毒、眼镜蛇毒等。烟碱型受体的激活直接影响膜对离子的通透性。(2)9 毒蕈碱型乙酰胆碱受体：该受体能为Ach所兴奋，也能为毒蕈碱所激动。类似作用激动剂有毛果芸香碱、槟榔碱、氧化震颤素等。M受体主要分布在外周副交感节后纤维所支配的平滑肌和腺体包括汗腺上，在中枢则主要分布于大脑皮层锥体细胞：其在周围神经系统中的作用是介导平滑肌收缩、腺体分泌，以及心率、心肌收缩力的调节，在中枢神经系统参与运动控制、体温调节、心血管调节和记忆等过程143J。其典型特点是可被阿托品及其同类化合物东莨菪碱、樟柳碱及二苯羟乙酸一3。喹咛环酯所阻断。毒蕈碱型乙酰胆碱受体(mAChR)是膜受体家族的成员，在哺乳动物中M受体分M1、M2、M3、M4、M5五种亚型，其通过与异三聚体鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联介导信号转导过程，因此又称G蛋白偶联受体(GPCR)；该受体的激活通过G蛋白偶联激活质膜上的Ca2+通道或其他与第二信使产生有关的酶，进而引发特异的生理生化反应m,45,46，和。2．1毒草碱型乙酰胆碱受体的分子结构G蛋白偶联受体是由紧密相邻的七个跨膜螺旋所组成的三维结构构成，七个跨膜区(TM。)由三个胞外环(ol一3)和三个胞内环(i卜3)连接而成。见图1·3。M受体蛋白分子量约51．66kD，由460．590个氨基酸残基组成，N端在胞膜外，C端在胞质内，七次跨过细胞膜，形成七个跨膜疏水区(TM一)，三个膜外环(0¨)和三个膜内环(i¨)。M受体七个跨膜区在细胞膜上呈轮辐状排列，保守的氨基酸残基多位于中心，非保守的残基面向脂质居于外侧。这种结构使M受体形成一个位于中心、高度保守的亲水性凹陷，与相应配体结合。M受体各亚型间氨基酸序列很相似，其中TMI．7跨膜区的氨基酸序列最相近，01．03环及jl、i2环序列也比较保守，但N末端、c末端和i3环变异较大，特别是氨基酸序列最长的i3环(157．240个氨基酸)差异最大，是M受体与G蛋白结合并引起生物学效应的主要部位145J。oProtein-CoupledRecept081s‘_-■一●■·I-n●■oH_●_-■hPk■■岫‘-weis批40-“^B田1-3^示G蛋白儡联受体模式田．8示三维立体图(引自s∞dmL曲Pnb珏c岫)2．2毒草碱型乙酰胆碱受体在哺乳动物中的分型及其功能位点哺乳动物的M受体五个亚型可分为2个主要功能种类：M2和M4受体主要与10 G∥Go家族的G蛋白偶联，它们对百R咳毒素敏感，主要的生化反应是抑制腺苷酸环化酶：M1、M3和M5受体与G9／Gll家族的G蛋白相偶联，主要的生化反应是刺激PI水解I矧。研究表明，许多受体的细胞内区域(尤其是i2．i4环)与G蛋白相偶联，对MI受体和不同亚型的肾上腺素受体的突变分析表明，位于i2环的初始部分的一个高度保留的Asp残基(Aspl64)对有效的G蛋白偶联非常重要。尽管M受体的许多区域与受体．G蛋白复合物的形成有关，用嵌合的M1／M2和M2／M3受体进行的生理的和生化的研究表明，i3环能够决定M受体与G蛋白偶联的特异性。嵌合的M2／M3受体的功能研究表明，M受体与G蛋白偶联的特异性主要是由其分子中的i3环的前16．21个氨基酸决定，此外，根据嵌合的M2／M3受体和M1受体的缺失突变(deletionmutation)的研究表明，j3环羧基末端可能在G蛋白识别过程中起一定的作用。M受体和其它与G蛋白相偶联的受体的i3环的氨基和羧基末端的碱性和酸性氨基酸尤其多，对结构的研究表明，这些氨基酸形成的受体片段形成a螺旋延伸到相邻的其它TM区域。用M1受体和B2肾上腺素受体的点突变研究表明，在螺旋区域，这些带电的残基对有效的G蛋白偶联并不重要。因此，在这些区域内的不带电的(嗜水的)氨基酸很可能对G蛋白的识别和激活起着重要作用。M1类和M2类受体细胞内信号通路图见图14。田1．4A示MI娄受体细胞内信号通路·B不M2关受体缉胞内信号通路‘引白脚竹哪M皿s如眦】∞Ⅲ)目前对人类mAchR进行药理学研究表明：(1)在01和03环内各有一个保守的半胱氨酸残基(Cys)，二者形成二硫键，维持受体蛋白稳定的分子构象胛J。(2)配体与M受体的结合发生在7个跨膜区域环状排列形成的口袋里，所有M受体的配体都有一个带正电荷的氨基，它与TM3中天冬氨酸(A印)带负电荷的羧基形成离子键，是配体与受体结合的方式，另外对乙酰胆碱的结合特性起关键作用的Thr和Tyr残基都位于离膜表面1．2个环的螺旋区域(TMm、TMv、TMⅥ、TMⅡ)，在1Mm区域，这些氨基酸残基与Asp残基在同一水平，这些氨基酸可能和TMIII的ASp 氨基酸残基共同决定乙酰胆碱在M受体上的结合区域：同时位于TMru区域的一个Pro残基对于高亲和力的配体结合是必需的，Pro残基可能与配体识别没有直接关系．而是l’日J接地通过构象变化而参与高亲和力的配体结合【4””。(3)受体激活的构象变化中TM。环的Asp残基和位于TMv、TMw区域的Thr、Tyr起着重要作用，TMv和TM。区域将第3个细胞内环(i3环)连结，是G蛋白识别和激活的关键区域。TM。区域的Pro残基可能是另一个与受体激活有关的残基154,55J。(4)在TMm和j2相接的部位有一个保守的氨基酸残基三联体(Asp、Arg、Tyr)，对受体的表达和功能至关重要I删。(5)许多受体的细胞内区域(尤其是i2．i4环)与G蛋白相偶联，位于i2环的初始部分的一个高度保留的Asp残基对有效的G蛋白偶联非常重要一J。j3环能够决定M受体与G蛋白偶联的特异性。(6)胞外N末端有一个或多个糖基化部位，但糖基化并非受体表达和发挥功能所必需I删。(7)C末端的棕榈酰化发生在近胞膜处的Cys残基上，参与G蛋白的偶联14a]。2．3毒草碱型乙酰胆碱受体在昆虫中的研究现状乙酰胆碱是昆虫中枢神经系统重要的兴奋性神经递质。目前昆虫对乙酰胆碱受体的研究主要集中在N型乙酰胆碱受体。N型乙酰胆碱受体是药物／化学物质起作用的靶位点，对其的深入研究有利于人和动物的健康以及害虫防治。毒蕈碱型乙酰胆碱受体在昆虫的研究较少。mAChR也广泛存在于昆虫的中枢神经系统，已有实验证明果蝇、家蚕、蜚蠊等昆虫中存在分子量约75．80kD的多肽mAChR，且在神经系统中起着重要作用161,62,66,77,781。目前已发现的昆虫mAChR属于M1类受体，在果蝇的mAChR相关实验中已经证实，其药理特征与哺乳动物的M1类受体相同，且与鼠脑M1受体的单克隆受体有很强的交叉【⋯。昆虫毒蕈碱型乙酰胆碱受体研究发展史如下：1984年LammisSC等通过放射灭活估计昆虫乙酰胆碱受体的分子重量1571。1989年7月OnaiT等对果蝇毒蕈碱型受体进行克隆、测序和染色体定位15”。从果蝇头部cDNA中分离出编码果蝇毒草碱型受体的两条eDNA克隆；且果蝇毒蕈碱型受体由788个氨基酸编码，Mr为84807，显示了与哺乳动物该受体有60％的同源性；其定位在果蝇第二条染色体的右臂。1989年11月ShapiroRA等将编码果蝇毒蕈碱型受体的cDNA在哺乳动物细胞表达，验证其药理学特点[561。1991年OftGL等对蟑螂脑部的毒蕈碱型胆碱受体的分布和药理学特点进行研究1591。1993年BlakeAD等通过免疫组化方法对果蝇神经系统毒蕈碱型乙酰胆碱受体瞬间功能表达和定位。果蝇组织切片免疫组化显示mAChR出现在神经系统，在骨骼肌没有被发现。大多数阳性区域定位在触角叶，这个区域室是昆虫脑第一次嗅觉信息合成的区域160l。1995年HarrisonJB等用抗果蝇毒蕈碱型乙酰胆碱受体C末端的抗体在果蝇神经系统的定位。免疫组化结果显 示DmlmAChR基因被定位在触角叶和脑的其它区域和胸部神经系统。触角叶免疫阳性最强。果蝇脑间一组分散的神经分泌细胞也显示阳性。在胸部神经系统免疫阳性较弱I631。1997年AizonoY等在家蝉释放促前胸腺释放激素的神经分泌神经元发现了毒蕈碱型受体的表达I删。目前果蝇的M受体己发现有两个剪切体，但都是起激活G蛋白的作用。2003年Cordova等利用表达毒蕈碱型乙酰胆碱受体的果蝇细胞系研究钙信号的时空表达[681。2005年1月和2006年7月NCBI上分别提交了预测的按蚊和蜜蜂M型受体相关基因。2000年以来，有大量关于线虫G蛋白偶联受体基因gar可变剪接体与M受体有很大相关性的报道【胡，W1m，订，74，751。但至今未见到昆虫中有关类似M2受体的报道，2002年HsiehDJ等克隆了斑马鱼的M2受体，并对其药理学特点、表达模式和在胚胎心博缓慢中的作用进行了研究I“。斑马鱼是最近获得的比较低等动物存在M2受体的例子。 第二章毒蕈碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁不同品级脑中的表达社会性昆虫的一个重要特征就是品级分化，拟黑多刺蚁是一种典型的社会性昆虫，具有多念性。其群体不是简单的个体聚集，而是具有非常严密的组成和分工，在同一群体内，拟黑多刺蚁有不同的品级分化，由于品级不同，所处的地位不同，分工也就不同。社会性昆虫复杂的行为活动与感觉器官和脑的特殊结构密切相关，是由某些特定的神经元及其构成的神经网络所确定的。美国的亚利桑那州大学(theunivesityofarizona)的昆虫学研究中心，构建了木匠蚁(Camponotusocreatus)脑的三维图像，见图2-I。从图中我们可以看到，不同品级的蚂蚁脑的总体积不同，且各脑区所占的比例也不同。工蚁的嗅叶较大，雄蚁的嗅叶最小：雄蚁的视叶最大。这都与它们各自独特的行为相适应。图2--1示术匠蝗脑都三维构建图(引自hitp"．／Aveb．aeerobio．arizonacdIl扫呻向bcl￥7蚀目Id％加州即可以叫岫．h岫)工蚊(左)．婚飞前雎毂(中)．tl蛆(右)．第一捧正面观．第二捧上面观．簟形体冠(·)．It叶(b)J叶(c)。视神经节(d)。视外髓(c)．视内矗(f)．侧前脑(‘)r嗅叶(h)·后脑(t)．人们对昆虫脑神经递质的研究是从二十世纪六十年代开始的。1960年，Welsh等人发表了5．羟色胺在无脊椎动物的定量分布的研究【例。1972年，Kostowski等人研究了一些药物对蚂蚁中央神经系统中5．羟色胺含量的影响[sol。1976年Sanes等人研究了咽草蛾触角发育中乙酰胆碱和它的代谢酶【8”。由于免疫组化技术的发展，人们在80年代和90年代对昆虫神经递质做了大量的研究工作，涉及各种递质和许多昆虫的不同脑区。例如，Schafer等1986年研究了蜜蜂脑中GABA免疫阳性的分布情况IS21。Schttrraarm1989年研究了蜜蜂脑中多巴胺的阳性反应I删。1994年。徐智敏等进行了蜜蜂脑中5，HT，GnBA,ACh免疫阳性神经元分布的比较研究1841。Homberg等1995年研究了烟草蛾中脑乙酰胆碱脂酶的活性1851。但这都是14 对神经递质本身的研究，对相关受体的研究很少。乙酰胆碱作为昆虫中枢神经系统重要的神经递质，科学家们通过基因和分子生物学的方法研究果蝇的胆碱神经系统，乙酰胆碱相关蛋白的突变对于果蝇来说都是致死突变f甄s引。为了更迸一步了解其作用过程和它在昆虫脑中的神经通路，科学家们以对其受体做了一定的研究，主要集中在N型受体和M1型受体的研究。本实验首次在昆虫中发现毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁脑中有表达。由于社会性昆虫存在品级分化，不同品级问存在形态结构、行为和社会分工上的差异，毒蕈碱ll型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁不同品级脑部也出现了差异表达。本研究的目的是：1．检测拟黑多刺蚁脑部是否存在毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物；2．不同品级拟黑多刺蚁的毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物的表达是否不同；3．毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁不同品级蚂蚁的不同行为分化中的可能作用；4．毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁脑内各神经通路的表达情况。1．材科和研究方法：1．1实验材料拟黑多刺蚁购自河北邯郸华龙蚁力王开发有限公司，室内饲养。实验所用材料包括工蚁、婚飞前雌蚁和雄蚁、婚飞后雌蚁。适宜条件下，拟黑多刺蚁一年四季都产卵，幼虫可以随时取材。拟黑多刺蚁一般于4-10月份婚飞，因此繁殖蚁可在这个时间段采集到。工蚁常年可采集到。12实验试剂多聚甲醛固定液，酒精(购自西安化学试剂厂无水分析醇)，二甲苯，PBS，兔抗cHRM2(毒蕈碱II型乙酰胆碱受体)一抗(购自北京博奥森生物技术有限公司)，SA-1002免疫组化染色试剂盒(--抗)(购自武汉博士德生物工程有限公司)，多聚赖氨酸(购自武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色剂(购自华美生物公司)。1．3实验流程(1)固定：多聚甲醛固定液中固定眈，雌蚁由于脑部相比较大，固定时间稍有延长至9h-(2)脱水：70％，80％，90％，95％，100％梯度酒精脱水，每步2h(为脱水更彻底，中间换一次)：(3)透明：纯酒精二甲苯1：1混合液1．5h，二甲苯透明1h；(4)透蜡：在55．58℃恒温箱中进行，石蜡二甲苯1：1混合液过夜，纯蜡(软蜡，硬蜡)中透蜡，其中软腊12h，硬腊24h(为浸腊更彻底，中间换一次)： (5)包埋：纯石蜡(硬腊)中包埋；(6)切片：常规石蜡切片，厚度8um；(7)贴片：多聚赖氨酸贴片，60℃烘1h，37℃48h；(8)将石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯2次，每次15min；100％酒精2次，每次5mira95％，90％，80％，70％，三蒸水依次5min)；(9)10％H202去离子水孵育10．15min，以消除内源性过氧化物酶活性；(10)蒸馏水冲洗，PBS浸泡3min，2次；(11)抗原修复：热修复在配制的pH：5．0的枸盐酸缓冲液微波或电炉加热至沸腾，94．100℃保温10．15min，1-2次；(12)滴加5％BSA封闭液，室温孵育20rain，甩去，不洗；(13)滴加CHRM2一抗，4"C孵育20h，对照组滴加；(14)PBS冲洗，每次3min，3次：(15)滴加二抗lgG(抗兔)，37℃孵育30mira(16)PBS冲洗3次，每次3rain；(17)滴加三抗SABC复合物，37℃孵育30rain：(18)PBS冲洗4次，每次5rain；(19)DAB显色5—10rain，三蒸水充分冲洗；(20)80％，90％，95％，100％酒精逐级脱水，每级5min，二甲苯透明；(21)加拿大树胶进行封片，晾干，光镜观察。1．4对照处理用0．1mol／LPBS(pH7．2．7．4)缓冲液替代CHRM2(毒蕈碱11型乙酰胆碱受体)抗体，其他实验流程与正常实验处理组相同。这样可以避免假阳性以及非特异性染色。1．5图像分析用HPIAs2100高清晰度彩色图文分析系统，40倍物镜下不同品级蚁脑部阳性反应的平均灰度(灰度分级为0-255级，0级为最黑的灰度，255级为最浅的灰度，灰度值愈小表明染色强度愈强)进行定量分析，每类蚂蚁取5张组织切片，每张切片随机选取6个视野。各组实验数据以平均值±标准误(Mcan+_SEl表示，采用SPSSl3．0统计软件进行单因素方差分析(One．WayANOVA)。2结果观察拟黑多刺蚁不同品级脑部CHRM2免疫组化切片(见图版I)，结果显示：拟黑多刺蚁工蚁、雌蚁(婚飞前后)、雄蚁脑部均有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性颗粒的表达且表达区域有差异，其反应程度灰度分析显示反应强弱也有差16 异(表2—1)o2．1毒草碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物在工蚁脑中的分布前脑蕈形体侧冠和中冠连结纤维处(图版I-1：a)及a叶末端有毒蕈碱U型乙酰胆碱受体类似物阳性反应(图版Ij：b)，蕈形体的其他部位未见分布：蕈形体冠周围的kenyon细胞未见阳性细胞。毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在视叶区未见分布。中央上体(图版Il：c)和位于中央体两侧的内触角神经通路有明显的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性神经元分布(图版I1：d)。中脑在触角叶(图版I2：a)和通往前脑的中触角神经通路上有明显的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应(图版I．2：b)。位于其后背方的背叶未呈现毒荤碱lI型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应。后脑没有呈现毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应。2．2毒蕈碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物在婚飞前后雌蚁脑中的分布2．2．1婚飞前雌蚁前脑蕈形体侧冠和中冠内部分布的kenyon细胞都呈现明显的毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版I_4：a)；侧冠和中冠连结纤维(图版I-4：b)及a叶末端也呈现明显的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版I5：a)。在视叶内髓通往前脑的纤维通路上有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版I5：b)。中央体两侧的内触角神经通路有毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版I5：c)。中央体上未见明显的阳性反应。中脑和后脑末见阳性反应。2．2．2婚飞后雌蚁前脑蕈形体侧冠和中冠内部分布的kenyon细胞及侧冠和中冠连结纤维都未见阳性反应。蕈形体a叶末端有很弱的阳性反应(图版I一7；a)。在视叶内髓通往前脑的神经通路(图版I8：a)和外触角神经通路上均有毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版r-8：b)。中央体两侧内触角神经通路上有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版I-7：b)。中央体上未见明显的阳性反应。中脑触角叶有弱阳性反应(图版I9：a)．后脑未见阳性反应。2．3毒蕈碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物在婚飞前雄蚁脑中的分布前脑蕈形体两个冠中冠和侧冠内部分布的kenyon细胞未见阳性反应。a叶末端有强阳性反应(图版I11：a)。中央下体有明显的毒蕈碱11型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版I11：b)。咽的上方有一条神经通路把两个触角叶连接起来，这条通路显示了明显的毒蕈碱Il型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版I11：c)。中脑和后脑没有明显的阳性反应。17 2．4图像分析及统计结果拟黑多刺蚁不同品级，脑部切片阳性反应的厌度值经方差齐性检验后进行单因素方差分析，不同字母上标代表平均值之『BJ具有显著差异(均为Pc0．05)，见表2．1。襄2—1拟黑多刺蚁不问品缓脑部I．／ke-CHRM2阳性反应程度(n-30)Table2-1Like-MuscatinkAcetykholinere．,xlsofMY．positivereactioninihehramofthreeⅢcant(Po／yrhach／sv／c／ha"E异奉t．不剜上杯的平均僵Z同的差异显者(，‘0．05，单凼最万差升斩．职尾檀齄，LSD萱童比段)·_：轴皿pksize．Mcamwithdiff日em椰—幡aiPnglfed|tisIj龃Ⅱydiffereat(P<0．05．One-WayANOVA,Tw04tt虬LSD)3讨论根据对免疫组化实验切片的观察以及灰度分析结果显示了，毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁各个品级中是普遍存在的，且存在着差异表达(表2．1)。功能与结构相关联，这与蚂蚁的多型现象有着必然的联系。拟黑多刺蚁的三种品级雌蚁、雄蚁和工蚁。每一品级都有各自的分工，对应着不同的行为特征，其各自的脑部结构也各不相同I眠8”。另外，在哺乳动物中，毒蕈碱1I型乙酰胆碱受体广泛分布于中枢神经系统的脑组织，与其它神经递质类受体共同作用，参与动物的学习，记忆，视觉注意，反应速度，认知等过程I明,so·90l。拟黑多刺蚁的脑分为前脑、中脑、后脑三部分。前脑内部结构复杂，由蕈形体、中央复合体、视叶、侧前脑等结构组成，是昆虫一切活动及生长发育的控制协调中枢。蕈形体冠是蚂蚁感觉、学习、记忆和指令的中心。在蕈形体冠周围充满了大小相似的kenyon细胞，它们的树突分枝和外源性投射神经元的轴突末稍构成了蕈形体冠，kenyon细胞的轴突则穿过柄，在根部发生分枝，分别进入a叶和B叶I卵”。拟黑多刺蚁婚飞前雌蚁侧冠和中冠内的kenyon细胞都呈现毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应。毒草碱II型乙酰胆碱受体在哺乳动物中大多是位于神经突触前膜自身受体，调节传出信号[921。Kenyon细胞可能对婚飞前雌蚁的某些特殊行为起调节作用。来自视叶和中脑的神经纤维投射到蕈形体的侧冠和中冠， 在侧冠和中冠之间存在连结纤维。工蚁和婚飞前雌蚁侧冠和中冠连结纤维都呈毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应。这可能与工蚁和婚飞前雌蚁相对复杂的行为相关。a叶和B叶是蚂蚁脑中的信息整合区，来自视叶、嗅叶和侧前脑的神经纤维都和a叶、B叶相连，Kenyon细胞也发出轴突投射到a叶和B叶，它们在a叶和B叶中形成无数突触，实现了蕈形体冠和其它脑区的神经联系。在拟黑多刺蚁的各个品级中a叶都有明显的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应。只有婚飞后雌蚁反应较弱(表2．1)。这可能与婚飞后雌蚁的职能相关，其在蚁巢中只是繁殖产卵，不参加劳动。中央复合体由脑桥、中央体和腹瘤三部分组成，其是昆虫脑系统处理整合(上行、下行)信息的高级中枢，具有视觉整合功能。中央体是中央复合体中最明显的神经纤维网区，目前认为中央体也许与肢体协调性和灵活性的调控有关，或者通过偏振光的方式获取信息193,94J。工蚁的中央上体和婚飞前雄蚁的中央下体都有明显的毒蕈碱U型乙酰胆碱受体类似物阳性反应。这可能与工蚁、雄蚁的视觉系统相对发达有关。工蚁需要外出觅食，寻找路线；雄蚁在婚飞过程中需要对求偶点的定位以及对个体蚁后追踪。婚飞前后的雌蚁都在视叶内髓通往前脑的纤维通路有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应，而其它品级的蚂蚁此处未见阳性反应。拟黑多刺蚁的中脑主要包括嗅叶、背叶神经丛和一些触角叶中继神经元纤维的投射区。嗅叶是一对。肾小球状的神经纤维网区，包括神经元、神经纤维球和几条神经纤维通路。嗅叶是化学感受神经丛，也是触角上嗅觉感受器的第一个中继站，它把来自触角的各种信息进行化学编码、整合，再将信息发往前脑的重要场所1951。工蚁和婚飞后雌蚁嗅叶呈现毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物阳性反应，且表达强弱有差异(表2．1)，工蚁嗅叶阳性反应更明显，这与工蚁和雌蚁的行为特点相对应。嗅叶和前脑之间通过三条神经纤维通路相连，它们分别是内触角脑通路、中触角脑通路和外触角脑通路。工蚁和雌蚁(婚飞前后)内触角脑通路上都有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应；工蚊的中触角脑通路上有阳性反应；婚飞后雌蚁的外触角脑通路上有阳性反应，雄蚁的触角脑神经通路上未见阳性反应。由以上可知，毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁各个品级脑中普遍存在，我们对蜜蜂的实验也证实了它的存在；并且哺乳动物的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体可以成功的在昆虫细胞Sf9细胞膜上表达【蚓。目前，毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体在哺乳动物中已成为研究热点，它在动物的认知，注意、情绪等方面起着重要的作用【97l，并且毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体基因(CHRM2)是与酗酒相关的基因，与抑郁症、人的情绪等关系密切1981。在行为复杂的社会性昆虫中，毒蕈碱II19 型乙酰胆碱受体也可能起着重要作用，要详细阐明昆虫中毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物的功能，还需要进一步从药理学方面和分子水平做深入研究。 第三章毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在意大利蜜蜂工蜂脑中的表达在前一章对拟黑多刺蚁各个品级的研究中已经证明了毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物的存在，本章选取膜翅目西方蜜蜂的一个亚种意大利蜜蜂作为材料进一步验证其在膜翅目社会性昆虫中存在的普遍性和可靠性。蜜蜂由于其复杂行为和特殊的经济价值，更早更多的被人们关注，是人们研究最多的昆虫之一。蜜蜂的学习记忆能力惊人，学东西很快，它拥有5个记忆阶段。分子生物学已经证明，蜜蜂身上除了通常的短期、中期和长期记忆阶段外，还有早期和晚期记忆阶段【991。这表明，蜜蜂身上的许多分子演变过程与大型动物相似。人们已经在蜜蜂脑部神经网中找到了与这些记忆阶段相对应的控制区域。凭着出色的记忆，蜜蜂可以区分许多颜色、图案和香味。蜜蜂能利用两套固定的舞蹈通知同伴有关事物的来源、水及巢穴等信息1100,101,1021。蜜蜂的神经系统提供了一个研究昆虫复眼视觉信息加工的简单而良好的实验对象，也是研究动物行为与脑区和单个神经细胞之间关系的理想材料。已有学者对蜜蜂脑内Ach的分布做了研究，Ach对中枢神经元来说，其作用以兴奋为主【84．103】，本实验证明了起抑制作用的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物存在。实验首先对意大利蜜蜂脑部的显微结构进行了观察，为以后深入研究提供形态学依据；其次观察毒蕈碱Il型乙酰胆碱受体类似物在其脑部的分布，并推理其功能。1．材料和研究方法：1．1实验材料．2006年4月，意大利蜜蜂工蜂购自陕西省西安市长安区蜂农处。取回后快速断头，将工蜂头置于新鲜配置的4％多聚甲醛固定液中。1．2实验试剂多聚甲醛固定液，酒精(购自西安化学试剂厂无水分析醇)，二甲苯，PBS，兔抗CHRM2一抗(购自北京博奥森生物技术有限公司)，SA．1002免疫组化染色试剂盒(二抗)(购自武汉博士德生物工程有限公司)，多聚赖氨酸(购自武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色剂(购自华美生物公司)。13实验流程(1)固定：多聚甲醛固定液中固定6h：C2)脱水：70％，80％，90％，95％，100％梯度酒精脱水，每步1．5h(为脱水更彻底，中间换一次)；(3)透明：纯酒精二甲苯1：1混合液1h，二甲苯透明lh： (4)透蜡：在55．58℃恒温箱中进行，石蜡二甲苯1：1混合液6h，纯蜡(软蜡，硬蜡)中透蜡，其中软腊过夜，硬腊18h(为浸腊更彻底，中间换一次)：(5)包埋：纯石蜡(硬腊)中包埋；(6)切片：常规石蜡切片，厚度8urn；(7)贴片：多聚赖氨酸贴片，60℃烘1h，37℃48h；HE染色流程：(1)二甲苯脱蜡：2次，每次15．20min；(2)酒精复水：依次入100％，95％，80％，70％，蒸馏水复水：(3)苏木精染色：苏木精3min，流水冲洗，盐酸酒精2see，流水冲洗，0．3％氨水2see，流水冲洗，80％酒精3rain，90％酒精3rain；(4)伊红3min、95％酒精2see、100％酒精两次，每次3min、二甲苯10min透明：(5)加拿大树胶封片，风干后在光镜下观察不同组的实验效果，Sony显微数码相机。免疫组化流程：(1)将石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯2次，每次15rain；100％酒精2次，每次5mira95％，90％，80％，70％，三蒸水依次5rain)；(2)10％H202去离子水孵育10．15min，以消除内源性过氧化物酶活性；(3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡3rain，2次；(4)抗原修复：热修复在配制的pH：5．0的枸盐酸缓冲液微波或电炉加热至沸腾，94．100℃保温10-15min，1-2次；(5)滴加5％BSA封闭液，室温孵育20min，甩去，不洗；(6)滴加CHRM2一抗，4℃孵育20h，对照组滴加：(7)PBS冲洗，每次3rain，3次；(8)滴加二抗IgG(抗兔)，37℃孵育30rain；(9)PBS冲洗3次，每次3rain；(10)滴加三抗SABC复合物，37℃孵育30min；(11)PBS冲洗4次，每次5min；(12)DAB显色5．10rain，三蒸水充分冲洗；(13)80％，90％，95％，100％酒精逐级脱水，每级5rain，二甲苯透明；(14)加拿大树胶进行封片，晾干，光镜观察。1．4对照处理用0．1mol／LPBS(pH7．2-7．4)缓冲液替代CHRM2抗体，其他实验流程与正 常实验处理组相同。这样可以避免假阳性以及非特异性染色。1．5图像分析用HPlAS2100高清晰度彩色图文分析系统，20倍物镜下意大利蜜蜂工蜂不同脑区阳性反应的平均灰度(灰度分级为0-255级，0级为最黑的灰度，255级为最浅的灰度，灰度值愈小表明染色强度愈强)进行定量分析，意大利蜜蜂工蜂每个脑区取5张组织切片，每张切片随机选取6个视野。各组实验数据以平均值±标准误(Mean_+S日表示，采用SPSSl3．0统计软件进行单因素方差分析(One．WayANOVA)。2实验结果及讨论2．1实验结果2．1．1意大利蜜蜂工蜂脑部结构经HE染色，意大利蜜蜂工蜂的脑部纵切可分出明显的三个部分，前脑、中脑、后脑。前脑由前脑叶和视叶构成，前脑叶包括蕈形体和中央体(图版II．1，2，4)。一对蕈形体以左右对称的形式位于脑的上方，它主要由两个冠、柄及与柄相连的a叶和B叶组成(图版II1，2)。两个冠分别称为中冠和侧冠，中冠位于内侧。侧冠位于外侧，冠又分为唇区、领和基环，每个冠分别有一个柄与它相连，这两个柄在下行过程中愈合，连接a叶和B叶。a叶和B叶在位置上互相垂直，在额切片中，a叶是一个椭圆的结构，在基底分为四瓣，各瓣之间以包绕它们的神经纤维作为界限。两个B叶在前脑中部相接，但又未完全愈合，中间留有一条细小的缝隙。蕈形体冠周围分布有许多球形细胞，这些球形细胞就是kenyon细胞，这些细胞自上而下呈索状排列，与杯状髓质萼构成萼区。位于萼区的众多联络细胞的主轴突形成蕈形体的根。位于一对蕈形体正上方的是3只呈三角形排列的单眼(图版II-2)。神经节层位于视叶的最外层，接受复眼光感受器传来的信息。它分为细胞体层和神经纤维层，细胞体层主要包括单极细胞的胞体，神经纤维层又分为凡B，C三层(图版II3)。外交叉把神经节层和外髓连接起来，进入外髓之前，两侧的神经纤维束互相交叉，呈现明显的条状结构，它在水平切面上观察最明显(图版II5)。外髓是最复杂、体积最大的视觉纤维网，向内通过内交叉和内髓相连。内髓是第三个视觉纤维网，发出一些神经纤维束和前脑相连。中央复合体包括前脑桥、中央体和脑后桥。中央体是中央复合体中最明显的神经纤维区，它包括中央上体和中央下体(图版II4)15,911。脑后桥和前脑桥的结构相似，它们位于中央体的上方。脑腹体位于前脑的腹侧面，蕈状体根底下。 中脑包括触角叶、背叶神经丛和一些触角叶中继神经元纤维的投射区。触角叶是～对肾小球状的神经纤维网区，包括神经元、神经纤维球和几条神经纤维通路。它是化学感受神经丛，也是触角上嗅觉感受器的第一个中继站(图版lI一1)15’”。后脑位于前脑的腹下方，食道孔的两旁，它们之间的连接纤维正好位于食道孔的上方，其前方与Ij{『脑和背叶相连，向后与食道下神经节相连(图版II一1)。2．1．2意大利蜜蜂工蜂脑部毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物分布观察意大利蜜蜂工蜂脑部CHRM2免疫组化切片(见图版111)，结果显示：意大利蜜蜂工蜂脑部有毒蕈碱JI型乙酰胆碱受体类似物阳性表达，且表达区域与拟黑多刺蚁工蚁存在一定差异。前脑，蕈形体冠、柄及周围kenyon细胞未出现阳性反应；视叶和三个单眼区未见阳性反应。脑腹体(1ateralhorn)与蕈形体冠相连的神经纤维通路上有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性表达(图版IⅡ_1)。侧前脑叶(1ateralprotoccrebrallobe)上的Pel神经元及其发射出的树枝状的神经纤维上有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性表达(图版IⅡ一2)。位于咽上方的腹后视连合(ventralposterioropticcommisurevpoc)有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性表达(图版IⅡ-3)。中脑触角叶上有明显的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应(图版Ⅲ_4)。后脑食道下神经节(subesophagealganglionSOG)有明显的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应(图版IⅡ5)。2．2图像分析及统计结果意大利蜜蜂工蜂脑部切片阳性反应的灰度值经方差齐性检验后进行单因素方差分析，不同字母上标代表平均值之间具有显著差异(均为P<0．05)，见表3·1。襄3--1意大利蜜蜂工蜂不同脑区uhc腿M2阳性反应程度(日瑚，T曲,Ie3．1Like-MusarioicAvnyklaoliner∞呻M2p01idver翻嘶帆intkdifferem蛐7qj皿lofAp／J腓础F细妇毗却舳意太利蜜蜂工蜂瞄毒覃碱II型乙鲫目碱受体娄似物表达情况前譬中皇后脑1拍．17抛肿"175．6333J：t．3．6847212A8661+*_3j0647i1：样本量．不同上标的平均值之间的差异显著(，‘O肼，单囡蠢方差分析，双尾检验，LSD多重比较)·-：Sample觑MⅫW劬‘fiffHeat"rⅪ讪mamtkanydi血Ⅻ㈣m．‰№yAM‰Two-tailed·LSD)2．3讨论国外的学者利用共聚焦显微镜和3D重建软件，构建了蜜蜂脑的三维图像并标 记出相关的神经通路1104J。下图3-1，A示蕈形体的三维图像和对应的功能区。黄色表示视觉在蕈形体冠领(c0)上的投射区，红色表示嗅觉在是蕈形体冠唇(1p)上的投射区。B示视叶在领的分区投射。C示蜜蜂脑嗅叶(AL)，脑腹体(LH)向前脑蕈形体冠投射的神经通路。nlt3-i：一形伴和宣蜂脑的三维重建田(引自知咖Br柚由．dIL．2005)比较拟黑多刺蚁工蚁和意大利蜜蜂工蜂加!染色的脑切片，我们可以很明显的观察到，蚂蚁嗅叶在其整个脑中所占得比例较大，蜜蜂视叶在其整个脑中所占得比例较大。这与它们的行为相一致。蚂蚁外出觅食，寻找路线，个体之间信息相互交流，主要利用的是嗅觉系统。蜜蜂采集蜂蜜，寻找蜜源，回巢，相互之间信息交流，主要利用的是视觉系统。在上世纪80年代末和90年代初，国内外就有学者通过免疫组化的方法，检测Ach和AchE在蜜蜂脑组织的分布llas,1艏J。Ach阳性神经元在蜜蜂脑广泛分布，除蕈形体的萼和上中央体染色较浅外，在三个视叶和脑的其他区域都有ACh免疫阳性神经元胞体和纤维存在，并呈现出不同的染色模式而较强免疫阳性出现在下中央体及触角叶上。其中以触角叶中的ACh阳性中间神经元胞体及纤维的密集投射染色最浓重。触角叶内中继神经元的Ach阳性纤维，输出投射到同侧前脑和侧中脑神经丛区。在侧中脑神经丛区：一些密集的被染色的ACh阳性纤维丛联合了两个触角叶神经丛，少数阳性纤维连接了后脑和食道下神经节的通路。Ache的阳性区域基本上与Ach的相吻合。毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在意大利蜜蜂工蜂脑腹体与蕈形体冠相连的神经纤维通路上有阳性反应，脑腹体接受触角叶传来的神经冲动，中继后传到蕈形体冠部。毒蕈碱II型乙酰胆碱受体可能在突触神经传递中起了～定的调节作用。侧前脑叶上的Pcl神经元是一种独特的蕈形体输出神经元，与来自蕈形体冠的Kenoy细胞轴突形成突触；同时Pel神经元对各种视觉、机械觉、嗅觉刺 激都有反应。Pel神经元传递、整合各种不同的感觉信息【104】。在意大利蜜蜂工蜂脑部的Pel神经元及其发射出的树枝状的神经纤维上有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性表达。侧前脑叶上位于咽上方的腹后视连合有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性表达。这可能在工蜂视觉通路的形成中起了重要作用。中脑触角叶上也有明显的毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应，但与意大利蜜蜂工蜂其它脑区阳性反应相比较(表3．1)，范围较小，反应强度也较弱。这可能与蜜蜂的嗅觉相对退化有关。后脑食道下神经节毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物免疫阳性反应最强(表3．1)。在拟黑多刺蚁各品级中，SOG处均无阳性反应。我们也作了意大利蜜蜂其它品级脑部切片的免疫组化，但没有发现明显毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物的阳性反应。虽然拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂都是膜翅目的社会性昆虫，但神经系统还是存在着很大的差异。要想确定昆虫中毒蕈碱II型乙酰胆碱受体的存在，还需要在分子水平上更进一步证实。 第四章毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁神经肌肉结合处的表达肌肉系统(muscularsystem)是昆虫的动力系统，昆虫通过肌肉收缩为各种运动和行为提供动力。昆虫的飞行、觅食、择偶、避敌、选择越冬场所、产卵、结茧、化蛹及羽化等所有活动均需要肌肉提供动力。肌肉也是各内脏器官活动的动力源泉。如消化道和马氏管的蠕动、生殖道的运动、气门的开启和关闭等。此外，肌肉收缩时还可以产生大量的热能，这有时被用来增加体温。昆虫肌肉是中胚层发育和特化而成的组织，均为横纹肌，在功能和形态上与高等动物骨骼肌无明显差异。肌肉上分布着大量神经，表现出较强的感应性。昆虫表现出惊人的力量，速度和耐力，这与昆虫肌肉的比例，代谢特点，外骨骼及体型较小等适应性形态特征具有密切的关系。不同部位的肌肉具有不同的内部结构和生理特征。按肌肉所在的位置和作用范围不同可将其分为内脏肌和体壁肌两大类。内脏肌是包在内脏器官壁中的肌肉。有的是整齐的纵肌和环肌，如包围在消化道肠壁细胞外的肌肉；有的则是错综复杂不规则的网状肌肉层，如在嗉囊壁及卵巢膜上的肌肉。内脏肌的功能是司内脏器官的伸缩和蠕动。体壁肌由长形的平行肌纤维组成，着生在体壁下或体壁的内突上，具有按体节自然分节的现象。体壁肌的功能是司体节、附肢和翅的运动。如背纵肌、腹纵肌、背腹肌等。昆虫肌肉除极少部分外，大都有神经分布，并通过神经调节其兴奋收缩。昆虫的肌膜不像高等动物的肌膜那样具有良好的激应性，1个神经肌肉突触只能引起周围小范围肌膜的反应，昆虫的神经末梢具有大量的分支，并在肌纤维上形成多点式分布(图4．1)，以保证对肌纤维的整体控制。每条肌纤维都与运动神经末梢形成多个突触联结运动神经末梢与肌肉的联结点又称运动终板(terminallameUa)。神经元除了对每条肌纤维形成多点式分布以外，末端还产生大量分枝，与所控制的肌纤维，组成的一个能同时兴奋的运动单位。此外，昆虫的神经有快神经、慢神经和抑制神经之分，而昆虫的肌肉有的只接受1个运动神经元的控制，有的肌肉同时接受不同神经元控制。在这种情况下，1条肌肉可以形成不同的运动单元，中枢神经可以迥过调节参与收缩的运动单元数和种类，来控制收缩的强度和类型。昆虫肌肉除受神经的调节外，正常生理状况下还受其他因子的调控。尤其是一些没有神经分布的肌原性收缩肌肉，对神经分泌轴突所分泌的神经激素和肽类化合物非常敏感。另外，由于肌肉没有类似神经的血脑屏障，因而，血液中的离子变化也可以直接影响肌膜的兴奋性。昆虫肌肉的兴奋是由肌膜去极化引起的，大多由运动神经释放化学递质进行调控，也有一 些肌肉没有神经分布，它们能自发地产生兴奋。此外，昆虫肌肉的兴奋性，通常还受到激素、血淋巴的离子组成和机械张力的调节。^圈4-l肌内的神经分布．^单神经单点式，H单神经多点式．c多神经多点式·n快、慢神经轴窠在肌肉单位的分布模式(引白忻介六等，1987)昆虫肌肉在组织结构上不和体壁集合形成皮肌骨骼肌，其一端起点着生在固定的骨骼区，而另一端则着生在一可动的部分。呈索状、带状或板状结构的表皮内陷或表皮内突可为肌肉提供实在的附着点，因而介于肌肉和他所带动的主要结构之间。昆虫头部和胸部肌肉分布：头部肌肉头部肌肉主要可分为：(a)颈肌(cervicalmuscle)，(b)口器肌肉(musclesofmouthparts)，(c)触角肌(musclesofantennae)。(a)颈肌这类肌肉控制着头部的运动，按其功能可分为提肌、降肌、牵索肌和旋肌。它们起源于前胸和颈部，而插入幕骨和头盖。(b)口器肌，同上唇关连的有：1．上唇压肌(1abralcompressors)位于上唇的背面和腹面之间。2．后上唇肌(posterioriabralmuscle)由上唇根骨片至头壁。3．前上唇肌(anteriorlabralmuscle)牵索肌由上唇基部前缘至头壁。上颚肌(snodgrass)包括：4．背展肌(dorsalabductors)起源于头盖的上侧部，各插入一个同上颚外侧基部相连的表皮内突上。5．背收肌(dorsaladductor)背收肌在头部后背方有一个宽广的起源，并各插入同上颚内侧基部相连的表皮内突上。6．腹收肌(ventraladductor)仅存在于无翅亚纲和某些低等有翅亚纲。主要的下颚肌(maxillarymuscle)如下：7．背基肌(dorsalbasalmuscle)起源于头部背方，并构成轴节的前旋肌和后旋一 肌(anteriorandposteriorrotators)，以及内颚叶的颅屈肌(cranialflexorofthelacinia)。8．腹基肌(ventralbasalmuscle)着生于轴节和茎节，在大多数有翅亚纲昆虫中起源于幕骨，在无翅亚纲昆虫中起源于幕骨的表皮内突。9．茎节肌(stipitalmuscle)全部起源于茎节，包括下颚须的提肌(1ebator)和降肌(depressor)，外颚叶的屈肌(flexor)和内颚叶的茎节屈肌(stipitalflexor)。10．内下颚须肌(intrinsicpalpmuscle)。下唇的肌肉有：11．夕}下唇肌(extrinsiclabialmuscle)起源于幕骨或颅壁而着生于前额，它们相当于下颚的腹基肌。12冲下唇肌(midianlabialmuscle)如有此肌，则由前颏背面连接之后颏，下颚中没有与之同源的肌肉。13．下唇唾肌(1abialsalivarymuscle)通常有二对，起源于前颏，并在唾管开口附近唾窦的下唇壁上汇合。14．肢节内叶和下唇须的肌肉(musclesoftheenditesandpalps)，由前颏伸出下唇须的提肌和屈肌，以及每一中唇舌和侧唇舌的屈肌，这些都是下颚茎节肌的同源肌，但是应当注意，中唇舌并无相当于内颚叶颅屈肌的肌肉。15．内下唇须肌(intrinsicpalpmuscle)着生于舌悬骨的典型肌肉，有上颚的舌收肌(hypopharyngealadductorofthemandible)和二对额肌(frontalmuscle)(所谓口角牵缩肌)。(c)触角肌肉有：1．外触角肌(extrinsicantennalmuscles)在柄节基部着生一条提肌和二条降肌，它们起源于幕骨的背臂和前臂，或单独起源于背臂或起源于头壁。2．内触角肌(intrinsicantermalmuscles)所有具有正常触角的昆虫，都有一对肌肉起源于柄节而着生于梗节的基部。胸部肌肉(a)纵]1]],(10ngitudinal)它们可分为背板肌群(tergalgroup)和腹板肌群(sternalgroup)，前者是重要的间接飞行肌。(b)背腹肌(dorsoventral)在胸部有两个主要肌群，作为翅的主要是提肌(其作用与纵的背板肌相反)的背腹板肌(tergosternals)和作为足的背板推进肌(promotors)与远离肌(remotors)的背板基节肌(tergocoxalmuscles)。(c)侧板肌(pleural)侧板肌可分为三组。背侧板肌(tergopleural)包括腋肌，发达与否变化极大；腹侧板肌(pleurostemals)是连接侧板和腹板表皮突的短 肌纤维，而侧板基节肌(pleurocoxals)则是基节的展肌。(d)腹板肌(sternal)包括两个肌群。腹基节肌(sternocoxales)是足的腹板推进肌与远离肌，而侧节问肌(1ateralintersegmentalmuscle)是由腹板连接侧板、或下一体节的背板，在幼虫中最为发达。(e)内足肌(intrinsiclegmuscle)除上述各种外足肌(extrinsicleg-muscle)(其功能是使整个肢体运动)以外，在足的各节内也有肌肉。它们包括转节、蹬节和跗节的提肌和降肌，以及跗端节的提肌。除了这些肌肉，尚有气门肌(spiracularmuscle)和上侧片肌(epipleuralmuscle)，后者着生于后上侧片和前上侧片。1．材料和研究方法：1．1实验材料拟黑多刺蚁购自河北邯郸华龙蚁力王开发有限公司，室内饲养。实验所用材料工蚁头部、雄蚁胸部和雌蚁胸部。1．2实验试剂多聚甲醛固定液，酒精(购自西安化学试剂厂无水分析醇)，二甲苯，PBS，兔抗CHRM2一抗(购自北京博奥森生物技术有限公司)，SA．1002免疫组化染色试剂盒(二抗)(购自武汉博士德生物工程有限公司)，多聚赖氨酸(购自武汉博士德生物工程有限公司)，DAB显色剂(购自华美生物公司)。1．3实验流程(1)固定：多聚甲醛固定液中固定，蚂蚁为8h，蜜蜂时间适度缩短；(2)脱水：70％，80％，90％，95％，100％梯度酒精脱水，每步2h(为脱水更彻底，中间换一次)；(3)透明：纯酒精二甲苯1：1混合液1．5h，二甲苯透明1h；(4)透蜡：在55．58℃恒温箱中进行，石蜡二甲苯1：1混合液过夜，纯蜡(软蜡，硬蜡)中透蜡，其中软腊12h，硬腊24h(为浸腊更彻底，中间换一次)；(5)包埋：纯石蜡(硬腊)中包埋；(6)切片：常规石蜡切片，厚度8um；(7)贴片：多聚赖氨酸贴片，60℃烘1h，37℃48h；(8)将石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯2次，每次15min：100％酒精2次，每次5min；95％，90％，80％，70％，三蒸水依次5min)：(9)10％H202去离子水孵育10-15min，以消除内源性过氧化物酶活性；(10)蒸馏水冲洗，PBS浸泡3min，2次；(11)抗原修复：热修复在配制的pH：5．0的枸盐酸缓冲液微波或电炉加热 至沸腾，94．100℃保温10—15rain，1-2次；(12)滴加5％BSA封闭液，室温孵育20rain，甩去，不洗；(13)滴加CHRM2一抗，4"C孵育20h，对照组滴加；(14)PBS冲洗，每次3rain，3次；(15)滴加二抗IgG(抗兔)，37℃孵育30rain：(16)PBS冲洗3次，每次3min：(17)滴加三抗SABC复合物，37℃孵育30min；(18)PBS冲洗4次，每次5min：(19)DAB显色5．10rain，三蒸水充分冲洗；(20)80％，90％，95％，100％酒精逐级脱水，每级5min，二甲苯透明；(21)加拿大树胶进行封片，晾干，光镜观察。1．4对照处理用0．1moI／LPBS(pH7．2．7．4)缓冲液替代CHRM2抗体，其他实验流程与正常实验处理组相同。这样可以避免假阳性以及非特异性染色。1．5图像分析用HPIAS2100高清晰度彩色图文分析系统，40倍物镜下拟黑多刺蚁工蚁头部和胸部肌肉组织处神经末梢毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物阳性反应的平均灰度(灰度分级为0—255级，O级为最黑的灰度，255级为最浅的灰度，灰度值愈小表明染色强度愈强)进行定量分析，各部分取5张组织切片，每张切片随机选取6个视野。各组实验数据以平均值±标准误(Mean+SE)表示，采用SPSSl3．0统计软件进行单因素方差分析(One．WayANOVA)。2实验结果及讨论2．1实验结果观察拟黑多刺蚁工蚁头部和胸部CttRM2免疫组化切片(图版IV)，结果显示：拟黑多刺蚁工蚁头部和胸部肌肉组织处的神经末梢均有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应，其反应程度灰度分析显示反应强弱有差异。拟黑多刺蚁工蚁头部口器肌中的上颚肌(背展肌和背收肌)处神经末梢有毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物阳性反应(图版IV．1，2)；雄蚁胸部纵肌和背腹肌处神经末梢毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物阳性反应(图版Ⅳ3，4)。另外意大利蜜蜂工蜂胸部肌肉处神经末梢也检测到毒蕈碱JI型乙酰胆碱受体类似物阳性反应。2．2图像分析及统计结果拟黑多刺蚁工蚁头部、胸部肌肉组织处神经末梢毒蕈碱1I型乙酰胆碱受体类似物阳性反应的平均灰度值经方差齐性检验后进行单因素方差分析，不同字母上31 标代表平均值之J’日J具有显著差异(均为P<0．05)，见表4—1。袁tJ拟黑多刺蚊T蚁头部、雄蚁胸部肌肉组织神经术枇处Like—CHRM2阳性反应程度(Ⅱ=30)Table-1Like-MuscarinicAcetylchofinerear,orM2p惦n如creactionmtI．cneufomIl，伽l缸ju皿cIi0Ⅱofwc_katstsandmaleants(Polyrhachisvicina)拟黑多刺蚊T蚊头部、堆蚁毒草碱II型已酰胆碱受体共似物表达情况胸部神经肌肉结台处背屣肌处背收肌处纵肌背板肌群址腹扳肌娃l∞．4264‘+-2．0635589．2574b*_2fh487244A548。*_．320647勰m58I纽M5拈n：样本量·不同上标的平均值之问的差异显著(，《0．05，单园藁方差分析，职尾检验，LsD多重比较)·_：Samoesize．Meanswithdi．ffcreat∞"ⅪiPIsmm目hllydiffer"trot‘尸∞胚．One-WayANOVA,"lWo-ttiled，LsD)2．3讨论根据免疫组化结果显示，拟黑多刺蚁的神经肌肉结合处分布有毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物，意大利蜜蜂的神经肌肉结合处也有分布。在以往的实验中没有发现毒蕈碱型乙酰胆碱受体在昆虫肌肉组织存在，我们推测是分布在肌肉组织中的神经末梢上存在毒蕈碱型乙酰胆碱受体。对果蝇毒蕈碱型乙酰胆碱受体的研究表明，mAchR存在于果蝇神经系统，骨骼肌处没有出现156,107l。毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁肌肉组织分布，可能蚂蚁独特复杂的社会行为相关。昆虫被认为是世界上力气最大的动物。一种小黑工蚁能举起比自身重量重25倍的物体，昆虫的肌肉具有超强的能力。不同部位肌肉组织，神经肌肉结合处毒蕈碱Ⅱ型乙酰胆碱受体类似物表达强度有差异(表4．1)，这可能与各部位肌肉的功能有关。婚飞行为是社会性昆虫特有的行为，雄蚁在婚飞过程中占有主动地位，需要对求偶点的定位以及对个体蚁后追踪。雄蚁婚飞后死去，其一生中都具有飞行能力。工蚁没有飞行能力，蚁后在性成熟后飞行肌就发生退化，同时释放氨基酸以促进生殖的过程，这类氨基酸可作卵形成之用瓯昆虫的肌肉大多数是半透明、无色或灰色的，然而飞行肌常带淡黄色或棕色。骨骼肌和脏肌都有横纹。昆虫肌肉在组织结构上不和体壁集合形成皮肌管骼肌，其一端起点着生在固定的骨骼区，而另一端则着生在一可动的部分。胸部肌肉可分为纵肌、背腹肌、侧板肌、腹板肌、内足肌五部分四。其中纵肌背板肌群和腹板肌有毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物分布。昆虫的骨骼肌结构复杂，可看到的有：(1)纤维状收缩系统，(2)线粒体，(3)气管和神经配备，(4)膜系统。这些组 分在组织学和超微结构上的差异与不同类型肌肉的功能相关。昆虫肌肉在许多方面都和哺乳动物没有很大的差别，如绝对肌肉功率和简单收缩颤抽特征等特点在这两类群中都是相似的。大多数昆虫肌肉都能周相地做出反应(即迅速的收缩和松弛)，但是有的骨骼肌和全部脏肌都能持久地紧张收缩。有的肌肉兼有周相的与紧张的肌纤维。昆虫肌肉又和脊椎动物的肌肉不相似，其肌纤维数量较少。为达到平滑收缩，它们配备有相距30．80um的多分支神经末梢，每一末梢引起局部收缩。还有双重神经支配，快轴突支配着一条肌肉的全部或多数纤维，而慢轴突则支配着部分纤维。乙酰胆碱是重要的外周神经递质。在胆碱能系统中乙酰胆碱受体(AchR)识别和转换化学信号Ach，Ach短暂地与特异受体(AchR)结合，导致膜通透性改变，从而实现快速的、短促的、局部的兴奋或抑制性的突触传递和调控。在哺乳动物中胆碱能受体可分为M型和N型两种受体，M型受体主要分布在副交感神经节后纤维末梢支配的效应器细胞膜上，被激动后产生M样效应，表现为：支气管平滑肌、胃肠道平滑肌、膀胱逼尿肌、瞳孔括约肌收缩，消化腺分泌增加，心肌活动减弱；N受体又可分为N1和N2两型，N1受体分布在交感神经节和副交感神经节神经元突触后膜上，乙酰胆碱与N1受体结合产生兴奋性突触后电位；N2受体分布在神经肌接头的终板膜上，乙酰胆碱与N2受体结合产生终板电位【43,48,1(Ⅺ,1091。在昆虫中，以nAchR为主，研究较多。在昆虫肌肉组织发现了毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物，其可能在调节外围神经递质的释放，神经冲动的突触传递中起了重要作用。在对蝗虫本体感受传入神经纤维和后腿运动神经元之间的胆碱突触传递的研究中，发现毒蕈碱型受体的拮抗剂引起了运动神经元的极性变化1110l；蟑螂的运动神经元上也发现了毒蕈碱型受体的分布l“”。研究雄蚁与飞行相关的肌肉组织，对进一步阐明婚飞行为很有指导意义。社会性昆虫行为复杂，与运动相关的肌肉系统组织具有其自身的特点，国内外学者对其的研究相对较少。对蚂蚁肌肉组织的生理生化研究，有助于揭示蚂蚁运动的生理基础。我们目前的研究还只是处在初级阶段，以后我们不仅要在显微水平，而且要从亚细胞水平，突触水平乃至分子水平作进一步研究。 第五章意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因的生物信息学分析毒蕈碱型乙酰胆碱受体(roAChR)是膜受体家族的成员，在哺乳动物中M受体分ml、m2、m3、m4、m5五种亚型，其通过与异三聚体鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联介导信号转导过程，因此又称G蛋白偶联受体(GPCR)。GPCR是由紧密相邻的七个跨膜螺旋所组成的三维结构构成，七个跨膜区(TM-一Ⅶ)由三个胞外环(O卜3)和三个胞内环(i卜3)连接而成【45l。在昆虫中己证实普遍存在的是M1类受体，功能上是激活酰苷酸活化酶，在蟑螂、家蚕、蝗虫中都有报道【56,59,60,65】。随着生物信息学的高速发展和EST库的进一步完善，特别是2004年NCBI的科学家开发了预测基因的新方法：GNOMoN。利用GNOMON新方法NC珊上提交了按蚊(XM314486．2)、意大利蜜蜂(XM39570．3)、拟谷盗(XM中与_967564)毒蕈碱型乙酰胆碱受体相似的基卧“21。前面几章主要论述了毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在两种膜翅目社会性昆虫(拟黑多刺蚁、意大利蜜蜂)中的组织特异性表达。本章用生物信息学方法分析预测的意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因(xM395760．3)，推测其编码蛋白质的基本性质，并与其他物种的同源蛋白比较，进行同源序列和功能区相关保守序列特点分析，初步推测其功能。1材料与方法1．1重要数据库和软件主要数据库为美国国立生物技术信息中一L,(NationalCenterforBiotechnologyInformation．NCBl)GenBank数据库(http：／／www．ncbi．him．nih．gov／Database／index．html)、EST数据库和UniGene数据库以及美国休斯敦的贝勒医学院(BaylorCollegeofMedicine)HoneyBee数据库(hUp：／Avww．hgsc．bcm．tmc．edu／projects／honeybee／)；核酸序列同源性分析软件使用BLASTN2．2．2(http：／／www．ncbi．him．nih．gov／BLAST／，NCBI，USA)、megaBLAST(hap：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／genome／seq／BlastGen／BlastGen．cgi?taxid=7460)和BLASTV2．0(http：／／www．hgsc．bern．tmc．edu／blast／?organism=Amellifera)：蛋白质基本性质分析工具ExPASy数据库中的ProtParamTool，疏水性分析软件ProtScal程序；二级结构预测程序nnpredic(http：／／www．cmpharm．uesf．edu／nomi／nnpredict．html)；蛋白跨膜结构预测软件1MHMMServerv．2．0(http：／／www．cbs．dtu．dk／services／TMHMM／)；蛋白功能分析数据库Prosite数据库：序列匹配分析软件用ClustalWl．8(EMBLGermany)；系统进化分析软件：Mega3．0。 2结果与分析2．1预测基因定位分析目前NBCl上提交的意大利蜜蜂EST共78000条。利用NCBl／Blast软件的“BLASTN”程序分析(http：／／www．ncbi．him．nih．gov／genome／seq／BlastGen／BlastGen．cgi?taxid=7460)预测的意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因所包含的EST序列，从结果中我们得知该基因是由七条EST序列拼接获得。这七条EST的序列号分别为：B1505590．1；B1513593．1；B1517003．1；B1510489．1；B1506781．1；B1505520．1；BD03247．1。利用NCBI／Blast软件的“megaBLAST"’程序Blast意大利蜜蜂Genome，确定该基因在染色体和重叠群(Contigs)_kff"J定位。该预测基因定位在意大利蜜蜂第八条染色体、重叠群8上的12529“6．12522902之间。见图5．1。“垆删Q1}～崔!翳纽睦缝‘”妇■母睁㈣洲l④瓣ll烈㈣⋯。一蛐t睁嗍蕊秘㈣一l!嚣鬟⋯麓≯：篙：黧嚣JI融m瞌-m“l㈣m碱《{}一ll∞搋蟪zl、，脚《咖l@瞒∞搿魏《一}嬲￡．㈣l；3辣艇J．一；一|‘燃献燃黝“H嗍噶蝌埔燃㈣圈5．1．A示意大利蜜蜂预测霉覃碱型乙酰胆氍受体基因BLAST所得七条EST序列；B示该萋因帕架色体定位；C不_阪蓦凼氆丌序列的染色体定位．2．2意大利蜜蜂类似毒草碱型乙酰胆碱受体基因编码蛋白的基本性质分析2．2．1氨基酸组成、分子量、等电点分析意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因编码618个氨基酸，分子量：699065D，理论等电点：8．56；其中碱性氨基酸66个，酸性氨基酸59个，疏水性氨基酸222个，极性氨基酸181个；原子组成：Carbon(C)3154：Hydroge(H)4902：Nitrogen(N)830；Oxygen(O)904；Sulfur(S)31。如图2所示五种动物：意大利蜜蜂、果蝇、线虫、斑马鱼、人，该蛋白20种氨基酸组成，其中Ala，Ile，Leu，Lys，Ser，Thr在这几种动物中均含量丰富；Asp、lie、Trp、"ryr在意大瑗哪吨．C 利蜜蜂中比其他动物中含量丰富。表1是对这五种动物毒蕈碱型乙酰胆碱受体特殊氨基酸组成和理化性质的分析。这五种动物是选取的昆虫纲、线虫纲、鱼纲、哺乳纲的代表动物，从表5．1中我们可以看出，虽然在整体理化性质和特殊氨基酸组成上具有趋同性，但还是存在明显差异；其中意大利蜜蜂毒蕈碱型乙酰胆碱受体的等电点最低，酸性氨基酸含量晟高。f妇蜜蜂置果蝇口霸丽衲歪i习母5-2．五个物种(意大利蜜蜂、果蝇、线虫、斑马鱼、人)毒簟碱型乙酰胆碱璺件的20种氨基酸组成表5．1．五个物种(意太利蜜蜂、集蝇，线虫、斑马鱼、人)毒簟碱型乙酰胆碱受体特殊氨基酸组成和理化性质分析T捌k5’I^o咖芦蛔0f啪pc妇-ndphyIhl柚d曲向妇Ichan咖0f珊∞醯k蜘ld-0Iincr∞叫甜mgfivesp。d嚣‘tP妇mellifera．oroso#妇melanogaⅣer．o鼬劬belegam．m^函衲．胁啪sept)2．2．2疏水性和跨膜区分析利用位于ExPASy的ProtScal(http：／／www．exp勰y．org／cgi—bin／pmtscale．p1)程序计算意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体的疏水性图谱(图5．3)。从图中我们可以看出整个蛋白质中疏水性最大值是3．789，最小值是．3．611；大约有7个疏水区，第84-106位、第118-140位、第155．177位、第198．220位、第244-266位、第535·557位、第572-594位分别存在一个疏水区。用TMHMM一2．0软件黛嚣眦照m豳帅栅捌蛰m且阁躐湖嚣E；}鱼m因‰函№曲嚣m埔蝌圈嚣伽0‰圉mh‰aaananB，0乩豳m国m擒‰函娜嚣椰艮困‰●磨恤时刖嫡蹦阳蚋目o!|酗嚣m{2O8642011i (http：／／genome．cbs．dtu．dk／services／TMHMM·2．0)分析该蛋白跨膜区可知，意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体有7个跨膜区，分别位于第84-106位、第118．140位、第155．177位、第198—220位、第244．266位、第535．557位、第572．594位(图5-4)。与疏水性分析结果完全一致，这表明膜蛋白的跨膜区和高疏水性区的明显相关性。2．3意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因编码蛋白功能预测毒蕈碱型乙酰胆碱受体是膜受体家族的成员，属于G蛋白偶联受体，通过与异三聚体鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)偶联介导信号转导过程。GPCR是由紧密相邻的七个跨膜螺旋所组成的三维结构构成，七个跨膜区(TMI．TMu)由三个胞外环(0卜3)和三个胞内环(j卜3)连接而成1451。将意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体氨基酸序列与果蝇和人类的对应序列作序列匹配性分析(ClustalWl．83)，从意大利蜜蜂的氨基酸序列中找到目前已研究明确的mAchR功能位点(见图5．5)。Ach与M受体的结合发生在7个跨膜区域环状排列形成的口袋里，Ach有一个带正电荷的氨基，它与TM3中天冬氨酸(Asp)带负电荷的羧基形成离子键，是Ach与受体结合的方式，另外对乙酰胆碱的结合特性起关键作用的苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)残基都位于离膜表面1．2个环的螺旋区域(TMⅢ、TMv、TMⅥ、TMⅦ)，在TM。区域，这些氨基酸残基与Asp残基在同一水平，这些氨基酸可能和TMm的Asp氨基酸残基共同决定乙酰胆碱在M受体上的结合区域；同时位于TM一区域的一个Pro残基对于高亲和力的配体结合是必需的，Pro残基可能与配体识别没有直接关系，而是间接地通过构象变化而参与高亲和力的配体结合149．50,51j2j31。受体激活的构象变化中TM。．环的Asp残基和位于TMv、TMvl区域的11lr、Tyr起着重要作用，TM。和TM。区域将第3个细胞内环(i3环)连结，是G蛋白识别和激活的关键区域。TM。区域的Pro残基可能是另一个与受体激活有关的残基154,55J。在TMm 和i2相接的部位有一个保守的氨基酸残基三联体(Asp、Arg、Tyr)，对受体的表达和功能至关重要I“。许多受体的细胞内区域(尤其是i2一面环)与G蛋白相偶联，位于i2环的仞始部分的一个高度保留的Asp残基对有效的G蛋白偶联非常重要l州。j3环能够决定M受体与G蛋白偶联的特异性。胞外N末端有一个或多个糖基化部位，但糖基化并非受体表达和发挥功能所必需14”。C末端的棕桐酰化发生在近胞膜处的Cys残基上，参与G蛋白的偶联【45l。mAchR在01和03环内各有一个保守的半胱氨酸残基(Cys)，二者形成二硫键，维持受体蛋白稳定的分子构象【45l。DEo，ophxla—●ec蛐ogt5cer⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯—-一--^pi，—-e11i￡er^HISLCLATlIC6VL￡?ACLIIPEHI=；IDD州6sLDTGEKl口地^1^NSsD删50Ho¨一5aplenj⋯⋯⋯一耵L脚STT3PLFPNZ5SSuIHsPSDAOLPP6”rrHrGgY40TMIDEosophll^一-e‘●no归仕z⋯一PUtGHOT-NOTIGFE∞／GPP一一YSLAsHVVMGFVAAIL‘iTm^0盯V43Apl5一●elllft【aVTSDHFGWEs∞ⅣSHGI,DCGGELHS捧I骶VLIVIIALFL#L1-rWGHI100Holosspien5ⅣV0；AAGHFS一--5PDGmDPLGG}rTVuovvFI^FLTGILALvTll0HI87OKO$Ophilt一-e眦。口-，cez^pi5．．Ielllfe【alk-o一3卸ie"D￡osophila_mec曲o‘mce【Apisaelltfer●Ho-o一5卵ien5‘’。。。lrMIl⋯’。’’‘‘}硎IsRIDy0LOTzs}疗FLF3LAI^DFAIGTI9H4PLF^v1．rzL6YwPLG93HVMI=nIDPOLOTISNVFLF?LAVAOFAIGLISHPLrrr门VL6丫WpL6150LVIVSnm’0L}T吲WrLLsLACAL-LIIOVl#删LFlTYII肼}MALG137”“⋯”⋯：午“iff：⋯”。⋯⋯。_“·‘·”PI啊而赢面汽隋赢赢南两网r¨《L够∥mm冤万143PHI#乖wL^Loj。4^cIIASVLIILLII：SF"D甓YF：乖纂L鬻血，TT料^^I200HL“圈ouL^IDo电：：丛生塑型!坚!!璺鲤!!三Ir霉L’噻z越蕾T托E^GV1e7TMⅣ‘‘‘’。’’‘。Drosophila_-et蛳g●3terMIG-AMGI纠，LLMP蜘dlV绷PYIEGHDTvPrDECYl0FIElliO譬I栉二l钒192^pi5—■e11icer●HIACAUGl3LLLWP黝IYAuPYI￡60pwPI弛虻Y10FI￡nf}隍I耵。铷ZSOHomosapl咖H16L^wIsFvLV啦ILⅣoYFv6悖丁vPP6EcFIo几s吨P蓦I蓼。缸236‘TMV～。’‘’Dr050phil^—1et曲。归健rL^^FfFP盯IMfFLY骈’IWpEll口p0}卫LPwLOA6}jDs5}》sHssD芭N．r242^pismelli￡cr^I“F鸳VP矿rvHIILY诉I阶n)鬻0}bLP7LOAc}：or；Ag}孕swsSDE—-298Ho-o一5仲i曲5I从嘞pvTIHTIL-／ln-IYr工程ⅫtnzLAGLOA36TE^ETEN-⋯⋯279；⋯‘．⋯：’：⋯’8：：’8；⋯：。．⋯．：：，．．．Drooophila—-e铀岍。口05ter^pi5■ellt￡e【^lIo‘o-，”1¨jDKosophlla_-ec∞O口●jcer^pis—_正elliCer^HoIo一5印ienoDzo$ophll|．．-tc∞og-5ttrApx=_-elliCecaHoIosapiens0LCK^66¨^6C6C6枞L咖PN^Ⅳ口)蛳50E}孽0EsK^^，丁Lg^ILLS64ZALGS}：-⋯⋯⋯—-P^^Nrllwr，》wLOE}》：^Dh}㈦TL=^ILLA541R⋯⋯--⋯⋯一·F^L门15口111蕾}0饿5Lv耋，z}■“口TLsAILLA499。TMⅥ：：r。：。-=rMⅦ⋯⋯’：下方两百面瓦E磊嚣罐T骺DcImI面再甄面趸雨蓊五两两i两692FIIT盯PYwILVLI{：z球^群j孵IPoELVDF晰LC|IMsll计：P辨cY^LI591nITVTPYHI胛LvN’．霪F擎3cI，盯F删LG需饥c霪INsm妒CYAL譬547DtOSOphil&le锄Og-o‘erwⅣn．RFnrvRlLl謦Ⅵ订瑚D兀n¨s1．rR⋯⋯⋯⋯723^pismeIIice￡^N从nKl-mIL，璎伽肿“IDPG⋯⋯⋯⋯⋯一618Ho-o一，印ienjm可忍TTFFHLLL誊]cD}》xRⅫ00Y00R0svI唧1镰，E0^Ls90阳5-5示C]wtadWl,83比对果蝇、童大利奎蜂、人m^越氨基酸序列结果：I"MI．TMII．1砌、TMN、TMV，TMVI、1MⅦ为七个辟膜区；碉髟部分为该受体功能位点，方框蚝为G-蛋白耦联受体家族的标击区通过搜索PROSlTE数据库，获得意大利蜜蜂、果蝇、人mAchR多肽序列中可能包含的结构域和功能位点。结果显示它们都包括G-蛋白耦联受体家族的标志38 区：ASVLNLLlIsFDRYFSv。表5．2比较了其N一糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、cAMP／cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点。N．糖基化位点都有Asn—X．Ser／Thr(NXSfr)序列子(sequon)，其中X可以是Pro以外的任何氨基酸111引。蛋白激酶C磷酶化位点和cAMP／cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点都富含极性氨基r酸Ser、Thr、Arg、Lys。袁5．2童大利蜜蜂、果蝇，人i血^．JekR中N一糖基化位点、蛋白蠹酶c蕾酸化位点、cA／旧／cGMP依照蛋白激醢磷酸化位点分析I"1blc5-2A．compalis姐ofN叫y嘲yhtio_$ilc．Protein虹Ⅱ水C1,呐,ho,ylatioasitc．cAMP-and田Ⅶqcp．柚硎—佛抽kina龃phc印hofyhIi∞site舡吣og—Pbmellifera，Dm谢，km“州og删打andHomosepiensNO$I．(30一")，IqISSI)(45—48)，NVI"S(50—53)、NEsY(58—61)，NVSN(62—65)，NAS"V(166—169)，NSSD(294—297)．IHlA31t(320—323)．NK"I"lr(512—515)、blSTV(580-583)SYR(75—77)、S成(105—107)、nR(1鲳一190)．KIRIT(19"2-195)，TslK(195—197)、TLK(272—274)、SI(．R(290—292)，RRpS(484-487)SGR(3秘一360)，SSR(374—376)，S6x(429—431)．sTx(436—438)，S哌(468—470)，TfR(4∞一485)．1hK(5】5—517)NOTN(4·7)，NGTI(7-10)、NASV$1K(48-50)，qR(131·133)、TnR(138·140)、31tK(214(109—112)，煳(236一瑚)，．216)，h昭1．233)，S1tR(232．刎，T州Ⅻ．删、Ⅲ昭蚴1)’果NY驯(372—375)，m％(仍．渊拼．柳，s叫搠堋)．叫奶．307)．唧15R瞄(斯l孵)鼻缁)、N^sIf(437一枷)．顺D．317)，sgR026．四，m㈣．岣、s邴32．5蛳、‰邬W76)’KICKS(620-623)(“9—452)、I’lI(3SIQ(453-456)．TrR(556·558)，"rm(69s-697)、Tckf7略·707)、I,IA"lrlt(464—467)-／,ISTI(681-684．)，侧72l·7"／3)IhIATIF(693．96)Silk(92·94)，nR(175一177)、Tll【(181—183)．NN$"T(5-8)，I’lISTI"(6—9)．NlSS"rkR(182．184)、TcK(258-2砷)．S‘R(286．2秘)，(15·18)、NV疆(41一¨)，NFssSmx(299·加1)、s止(3∞一305)、TtK(316—318)，KIM(179-182)、^(48-51)、N／ugV(153·156)、N弧SwK(319—3"21)，StK(380·382)，"rIK(437．4．39)，船州479嘲(379．382)，NSsv(444·447)，SⅨ(457—459)，"l"kR(476-47S)、1弧(5蛐．552)、NSTV(536．5竹)，N-口T(548．弱1)"rflK(554．5靳)2．4意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因编码蛋白分子进化分析 用Blast软件与GenBank中己注册的mAchR序列进行比较，发现与意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体高度同源的序列，选取部分相似序列用Mega3．0软件建立N．J系统发育树(图5．6)。来源相同的物种在进化树上往往聚集成簇，序列问的遗传距离对应于进化树种连接两个物种水平线长度。结果显示，mAchR可归为三大类，包括哺乳纲、鱼纲、昆虫纲、线虫纲。罔5．67／gDrosoph／／ame／armgaster，曲啤蛐乒帕妇-／"r／ba／／g,nc曲^似_·4PⅡmd／／fera-Homosepm,ls·Pan枷蚋，16橱，釉mu．1culus．Rattusnorvegicas．Canisfamiliard．Galltogallas，Daniorerlo，Ca㈣ase／egansl2个物种的系统发育树(IqJtree)3讨论随着人类和多种模式生物基因组计划的实施，表达序列标签(expressedsequencetagEST)在基因结构与功能研究中的应用日益广泛11141，各种生物信息学技术也应运而生并不断完善，充分利用生物信息学资源和技术研究基因组结构与功能、发现新的功能基因、揭示基因起源与分子进化规律等已成为后基因组时代的核心任务，可以避免或减轻了采用传统实验室方法研究新基因及其功能的繁琐工作。自2002年美国国立卫生研究院把西方意大利蜜蜂(舢melliferaligusticaSpinola)列入了优先测序的物种名单以来，科学家们测定了这个拥有约2．36亿个碱基对的意大利蜜蜂基因组，共辨别出了超过I万个基因11“。蜜蜂的社会行为极为复杂，蜜蜂具有内聚力，能够成功应付许多社会生活面临的挑战，包括交流、衰老、社交机能不良以及传染性疾病等I儿6’117，“al。蜜蜂的认知能力非常复杂尽管其大脑只有果蝇大小的一半，但它有着很强的交流能力，是目前唯一已知的除人类之外具有符号语言的动物。可以认为科学家们研究蜜蜂基因组的终极目标就是希40 望能揭示其复杂行为产生的机理。目前对蜜蜂基因功能的研究还处于起步阶段。科学家们应用日益增长的蜜蜂EST数据库以及电子克隆(insilicocloning)、Gnomon等生物信息学技术预测基因，虽然准确性很高，但还是无法预测各种剪切体，并且序列中难免会有一些错误，需要进一步的分析和验证。我们将在以后的研究工作中，以该基因预测序列为基础，扩增蜜蜂mAchR基因，从药理学水平和电生理水平进一步验证其功能。用生物信息学的方法分析新基因，充分利用模式生物基因组研究成果，将成为新基因克隆的重要辅助手段而得到广泛应用。。mAchR作为胆碱能神经系统中重要的受体，已在人类和许多物种中得到了克隆并进行了较深入的生物学性质与功能研究，但在昆虫中研究很少，特别是对行为复杂的社会性昆虫的研究几乎为零。在社会性昆虫蜜蜂中展开对其的研究企图进一步揭示蜜蜂复杂行为的神经生理机理，具有重大意义。41 总结本实验用免疫组织化学方法研究了拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂神经系统中毒蕈碱型乙酰胆碱受体类似物的分柿，并用生物信息学方法对意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因(XM一395760)进行结构分析和功能预测。根据实验结果，可以得到以下结论：1．拟黑多刺蚁脑部存在毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物；且拟黑多刺蚁不同品级问毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物的表达明显不同，该受体类似物可能在拟黑多刺蚁不同品级蚂蚁的行为分化中起着一定的作用；毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物在拟黑多刺蚁脑内的外触角神经通路、中触角神经通路、内触角神经通路上均有表达。2．用HE染色对意大利蜜蜂工蜂脑部结构进行显微观察，分出明显的三个部分，前脑、中脑、后脑：意大利蜜蜂工蜂脑部有毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物阳性表达，且表达区域与拟黑多刺蚁工蚁不同。3．外围神经系统中，拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂在神经来梢和肌肉结合处都有毒蕈碱JI型乙酰胆碱受体类似物表达。4．利用生物信息学方法分析意大利蜜蜂类似毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因(XM395760)，得到该基因的EST组成、染色体定位和氮基酸组成、等电点、疏水／亲水区、跨膜区等蛋白性质；并与其它物种的同源蛋白比较，分析保守序列的功能特点；结合已有实验结论和PROSITE数据库中的预测信息，推测出其功能位点。最后用Mega3．0分析获得了12个物种毒蕈碱型乙酰胆碱受体的遗传距离，建立系统发育树。 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图版说明图版I拟黑多刺蚁各个品级脑部毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物的表达分布1．拟黑多刺蚁工蚁脑部，示毒蕈碱1l型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于蕈形体侧冠和中冠连结纤维(a)，a叶末端(b)，中央上体(c)，内触角神经通路(d)2．拟黑多刺蚁工蚁脑部，示毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于中脑触角叶(a)，中触角神经通路(b)3．拟黑多刺蚁工蚁脑部对照4．拟黑多刺蚁婚飞前雌蚁脑部，示毒蕈碱玎型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于蕈形体冠周围kenyon细胞(a)，侧冠和中冠连结纤维(b)5．拟黑多刺蚁婚飞前雌蚁脑部，示毒蕈碱ll型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于蕈形体a叶末端(a)，视叶内髓通往前脑的纤维通路(b)，内触角神经通路(c)6．拟黑多刺蚁婚飞前雌蚁脑部对照7．拟黑多刺蚁婚飞后雌蚁脑部，示毒蕈碱ll型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于蕈形体a叶末端(a)，内触角神经通路(b)8．拟黑多刺蚁婚飞后雌蚁脑部，示毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于视叶内髓通往前脑的纤维通路(a)，外触角神经通路(b)9．拟黑多刺蚁婚飞后雌蚁脑部，示毒蕈碱11型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于中脑触角叶(a)10．拟黑多刺蚁婚飞后雌蚁脑部对照11．拟黑多刺蚁婚飞后雄蚁脑部，示毒蕈碱Il型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于蕈形体a叶末端(a)，中央下体(b)，晒上方神经通路(c)12．拟黑多刺蚁婚飞后雄蚁脑部对照图版II意大利蜜蜂工蜂脑部HE染色示结构1．意大利蜜蜂工蜂脑部结构示意图，2．意大利蜜蜂工蜂脑部结构示意图，单眼柄(d)3．意大利蜜蜂工蜂脑部结构示意图，蕈形体柄(a)，中脑(b)，后脑(c)蕈形体冠(a)，蕈形体柄(b)，单眼(c)，视神经节(a)，视外髓(b)，视内髓(c) 4．意大利蜜蜂工蜂脑部结构示意图，脑桥(a)，中央体(b)，内触角神经通路(c)，中触角神经通路(d)5．意大利蜜蜂工蜂脑部结构示意图，6．意大利蜜蜂工蜂复眼结构示意图，外神经交叉(a)，内神经交叉(b)角膜(a)，小眼(b)图版IⅡ意大利蜜蜂工蜂脑部毒蕈碱lI型乙酰胆碱受体类似物的表达分布1．意大利蜜蜂工蜂脑部，示毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于前脑，脑腹体与蕈形体冠相连的神经纤维通路2．意大利蜜蜂工蜂脑部，示毒蕈碱JI型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于侧前脑叶上Pel神经元及其发射出的树枝状的神经纤维3．意大利蜜蜂工蜂脑部，示毒蕈碱11型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于咽上神经节4．意大利蜜蜂工蜂脑部，示毒蕈碱1I型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于中脑触角叶5．意大利蜜蜂工蜂脑部，示毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物脑部表达与分布，位于后脑食道下神经节6．意大利蜜蜂工蜂脑部对照图版Ⅳ拟黑多刺蚁神经肌肉结合处毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物的表达分布1．拟黑多刺蚁工蚁头部肌肉组织，处的表达与分布，位于背展肌2．拟黑多刺蚁工蚁头部肌肉组织，处的表达与分布，位于背收肌示毒蕈碱JI型乙酰胆碱受体类似物在神经末梢示毒蕈碱U型乙酰胆碱受体类似物在神经末梢3．拟黑多刺蚁工蚁头部肌肉组织对照4．拟黑多刺蚁雄蚁胸部纵肌背板肌群，示毒蕈碱1l型乙酰胆碱受体类似物在神经末梢处的表达与分布5．拟黑多刺蚁雄蚁胸部腹板肌，示毒蕈碱II型乙酰胆碱受体类似物在神经末梢处的表达与分布6．拟黑多刺蚁雄蚁肌肉组织对照58 致谢本论文的顺利完成得益于各位老师、学长、学友和亲人的支持、鼓励和帮助，他们的关心是我不断进取的动力。在这里，我向他们表示忠心的感谢!首先，感谢我的导师奚耕思教授，在三年的研究生学习生涯中，她不仅在学业上给予了悉心的指导，在生活上也给予了无微不至的关怀和照顾。恩师渊博的学识、严谨的治学态度、崇高的敬业精神和谦虚的处世态度，将使我受益终身!在论文的准备和完成阶段，得到了陕西师范大学生命科学学院黄原教授、许升全教授、尤平教授、魏朝明博士、张志勤老师的悉心指导和帮助。他们独特的学术视角，深邃的思想和为人之道，在无形中影响和改变着我的人生。在此，向他们表示由衷的感谢!同时，还要感谢师姐欧阳霞辉、吕淑敏，同学洪枫、王慧丽、詹光杰、马丽滨、王波、李培、何鹏兴、钱召强、张辰艳，师妹汪小会、张振宇、杨冰，师弟周继勇以及我同窗七载的舍友宋婕、李静、李月明、雷霓，他们在学习和生活上都给予我很大的支持和帮助。在此，我表示衷心的感谢!此外，我还要特别感谢我的家人多年来给予我物质和精神上的支持与帮助。没有他们的关怀、鼓励和支持，我将无法完成我的学业。谨此，向所有关心和帮助我的老师、亲人、朋友致以最诚挚的谢意!b翠萍2007年5月于陕西师范大学