乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响-养殖专业毕业论文 41页

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目录中文摘要IAbstract．．．．．．．．．．．．．II1前言．：11．1益生菌的发展现状．11．1．1益生菌的概念。11．1．2饲用益生菌的作用机理11．1．2．1刺激免疫反应．11．1．2．2维持正常的肠道菌群11．1．2．3参与代谢，促进营养物质的吸收21．1．3枯草芽孢杆菌的研究概况。21．1．4乳酸杆菌的研究概况．．21．1．5益生菌在蜜蜂上的应用．．31．2蜜蜂的消化生理．41．2．1蜜蜂的消化道．41．2．2蜜蜂的消化酶．．41．2．3蜜蜂的肠道微生物．．51．2．3．1蜜蜂肠道正常菌群51．2．3．2蜜蜂肠道的致病菌51．3蜜蜂防御病原菌的机制。61．3．1体壁防御．．61-3．2活性氧防御．．61．3．3抗菌肽．．71．4本研究的目的和意义．．72材料与方法82．1试验材料．82．2试验设计与饲养管理．92-3测定指标及方法．92．3．1蜂群的采食量。92．3．2日粮中蛋白质的消化率一9万方数据 213．3蜜蜂消化酶活性的测定．102．3．4头胸部的蛋白质浓度102．3．5头胸部的抗氧化性102．3．6中肠形态学指标112．3．7基因表达定量检测112．3．7．1蜜蜂总RNA的提取和检测112．3．7．2eDNA的合成．．122．3．7-3实时荧光定量PCR分析132．3．6．3．1引物及反应条件的确定．．132．3．7．3．2实时荧光定量PCR检测基因表达水平132．4数据处理133结果与分析．．143．1不同益生菌对不同日龄蜜蜂采食量的影响143．2不同菌种对蜜蜂存活率的影响153．3不同菌种对不同日龄蜜蜂日粮蛋白质消化率的影响153．4不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响163．5不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部抗氧化能力的影响163．5．1不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸SOD活性的影响．．163．5．2不同日龄和不同菌种饲粮对蜜蜂头部MDA的影响．．173．5．3不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部T-AOC的影响173．6不同菌种和不同日龄对蜜蜂中肠胰蛋白酶活性的影响183．7不同菌种和不同日龄对蜜蜂中肠厚度和隐窝深度的影响193．8不同菌种对蜜蜂抗菌肽相关基因表达量的影响204讨论．．：!l4．1益生菌影响意蜂的采食量214．2益生菌影响意蜂的肠道发育224．3益生菌影响蜜蜂的寿命和抗氧化能力224．4益生菌制剂影响蜜蜂的消化酶活性和体蛋白浓度234．5益生菌制剂影响蜜蜂的蛋白消化率244．6益生菌影响免疫相关基因的表达24万方数据 5总体结论、创新点及展望．．255．1总体结论255．2本研究的创新点255．3存在的不足及进一步解决的问题256参考文献277致谢328基金资助33万方数据 山东农业大学全日制硕士专业学位论文中文摘要使用益生菌制剂对于维护蜜蜂肠道菌群平衡、保持蜜蜂健康具有重要作用。不同的益生菌对蜜蜂的肠道发育和饲料利用效果不同。本研究选用了两种具有代表性的益生菌制剂——乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌，探究饲喂益生菌制剂对意大利蜜蜂采食量、蛋白消化率、中肠围食膜厚度、组织抗氧化能力和免疫性能的影响，以期为蜂用益生菌制剂的选择提供参考。本试验从姐妹蜂王群中取新出房(1日龄)的意蜂3600只，随机分为3个处理组，每组4个重复，每个重复60只蜜蜂。试验I组为对照组，饲喂普通油菜花粉，试验II组和Ⅲ组饲喂分别添加了1x108cfu／kg,L酸杆菌制剂和lxl08cfu／kg枯草芽孢杆菌制剂的油菜花粉，为试验组。整个试验期30天，期间均保证糖浆(50％蔗糖溶液)和水的充足供应。于试验的第3、6、9天取样，测定存活率，采食量，蛋白消化率，中肠酶活性，抗氧化能力，免疫相关基因表达量等指标并进行分析。结果表明：(1)油菜花粉中添加乳酸杆菌制剂和枯草芽孢杆菌制剂对存活率无显著影响(P>0．05)，但饲喂添加了乳酸杆菌的花粉能显著提高工蜂在6日龄的采食量。(2)在第3、6、9日龄，试验组相较对照组蜜蜂头胸部蛋白浓度、T．SOD活性显著提升(P0．05)，提示饲料中添加益生菌对蛋白消化率没有影响。(4)肠壁厚度显著增加、隐窝深度降低、围食膜厚度增加(P>0．05)，试验组蜜蜂中肠发育情况优于对照组。(5)在第9日龄，油菜花粉中添加枯草芽孢杆菌制剂和乳酸杆菌制剂均能显著提高Abeacin和Defense两个抗菌肽基因的mRNA表达量(尸<0．05)，酚氧化酶原PPO基因的表达量降低(PO．05)，significantdifferencesinthe3，9daysofage(P<0．05)．(3)theexperimentalgroupcompared、Ⅳithcontrolgrouptheproteindigestionratehadnosignificantdifference伊>O．05)．(4)theexperimentalgroupcompared谢t11thecontrolgroupthemidgutdevelopmentbetter，bowelwallthicknessincreasedsignificantly，anddecreasethecryptdepth，theperitrophiII万方数据 山东农业大学全日制硕士专业学位论文cmembranethicknessincreased(P<0．05)．(5)atninthdaysofage，rapepollenaddingBacillUSsubtilisandLactobacilluscouldsignificantlyincreasetheAbeacin，DefenseoftwoantimicrobialpeptidegeneexpressionofmRNA俾<0．05)．ExpressionofprophenoloxidasegenePPOdecreased(P50I．tg，可以二次洗脱。第一次洗脱可能获得80％的RNA，二次洗脱可能降低RNA浓度。将水预热到70"C，加到柱子中后室温孵育5min可提高RNA产量。(13)取1uLRNA，加到仪器的探针内，于核酸蛋白检测仪下读取RNA浓度值和OD260／280值。2．3．7．2eDNA的合成(1)RNA经反转录反应合成eDNA的第一条链，反应体系如下：mRNA4uLgRNARemover19LMix49LRNase—freewaterupto20皿(2)上述反应物轻轻吸打混匀后，42。C水浴15min，85水浴5sec失活TransScript⑧12万方数据 山东农业大学全日制硕士专业学位论文RT和gDNARemover，微离心并于-20。C保存。2．3．7．3实时荧光定量PCR分析2．3．7．3．1引物及反应条件的确定(1)用Primer5．0软件设计基因Defensm，Abaeein和PPO的引物Abeacin-up，Abeacin-down，PPO-up，PPO—down，Defensin-up，Defensin-down(表1)。(2)所用的内参基因为意大利蜜蜂中的肌动蛋白基因(fl-acfin，GenBank注册号：HM640276)，所用内参引物为伊s和∥一x(表1)：(3)以反转录产物为模板，反应体系参照SYBR⑩PrimeScriptTMRT-PCRⅪt说明书，反应程序：兰薹cl4嗍环72℃10secI扫描(3)按5×浓度依次稀释模板，共稀释5个梯度，定量PCR反应构建相对标准曲线。验证引物的扩增效率，以及El的序列在此浓度范围内是否线性扩增，并根据融解曲线验证引物扩增的特异性，从而确定引物扩增条件。所用仪器为Bio—radCFX96实时荧光定量PCR仪。2．3．7．3．2实时荧光定量PCR检测基因表达水平(1)用试剂盒提取不同处理样品的总RNA；(2)以反转录产物为模板，∥．s和／％x为内参引物，进行实时荧光定量PCR分析，每个基因均有内参同时扩增，默认条件下读取Ct值；2．4数据处理(1)数据分析采用双标准曲线法，计算平均表达量和相对偏差，用Excel作图。同万方数据 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响时利用2。△△cT大致计算与内参的相对表达量，确定基因的表达丰度；(2)实验数据用SAS9．2软件进行统计学分析(SAShast．，Ine．，Cary,NC，USA)结果以平均值士标准误表示。方差分析使用One-wayANOVA，差异显著者进行Duncan氏多重比较，显著水平P<0．05。表1荧光定量所用引物Table．1TheprimersusedinthisstudyofqPCR3结果与分析3．1益生菌对不同日龄蜜蜂采食量的影响表2益生菌对369日龄意大利蜜蜂日粮采食量(m∥只)的影响Table2effectofprobioticsOndietaryconsumptionof4pfsmelliferaat3，6，9age日龄尸值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组第3日龄0．63士O．046b0．72士0．039b0．71士0．031b0．321l第6日龄0．85士o．041bO．92土O．033b2．16土0．067a*0．0014第9日龄1．77士0．31a1．98士0．024a2．01士0．029a0．5737P值0．00090．0006<0．0001注：同行数据右上角叶t表同日龄间各组日粮之间的差异显著性(尸<0．05)，字母代表相同日粮条件下不同日龄之间的差异显著性不同益生菌菌种对不同日龄意大利蜜蜂日粮的采食量的影响见表2。两组意蜂采食量均随日龄而增加，3和9日龄意蜂采食量均无显著差异(尸>O．05)在第6日龄乳酸杆菌组的采食量明显高于枯草芽孢杆菌组和对照组。同一菌种日粮不同日龄之间的采食量差异显著(P<0．05)。万方数据 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3．2益生菌对蜜蜂存活率的影响蕊{兰活辜图1蜜蜂存活率随时间的变化趋势Fig．1Percentageproportionoflivebeesinthedynamicchangesovertime不同菌种对意大利蜜蜂存活率的影响见图1。由图1可知，蜜蜂的存活率随日龄的增长而逐渐降低。实验前期以对照组和乳酸杆菌组降低最快；实验后期，枯草杆菌组和乳酸杆菌组的存活率差异不显著。由以上结果可见，饲喂枯草杆菌和乳酸杆菌对蜜蜂寿命没有显著影响。3．3益生菌对不同日龄蜜蜂日粮蛋白质消化率的影响表3益生菌对3、6、9日龄意蜂日粮中蛋白质消化率(％)的差异Table3effectofprobioticsonprodigestibilityofApismelliferaat3，6，9age注：l司行数据右上角叶℃表l司日龄间各组日粮之间的差异显著性(P<0．05)，字母代表相同日粮条件下不I司日龄之间的差异显著性不同菌种对不同日龄意大利蜜蜂饲粮蛋白质的消化率的影响见表3。由表3可以看出，在第3日龄，第6日龄和第9日龄，添加枯草杆菌组意蜂日粮蛋白质的消化率与乳酸杆菌组相比差异不显著(P>0．05)，第3日龄，第6日龄和第9日龄时枯草杆菌组和乳酸杆菌组组内意蜂日粮蛋白质的消化率无显著差异(P>0．05)。总体来看，乳酸杆菌组和枯草杆菌组意蜂对日粮蛋白质的消化率随日龄的增长呈下降趋势，在第3日龄和第15万方数据 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响6日龄意蜂对日粮蛋白质的消化率影响不大，9日龄后影响较大。3．4益生菌对蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响表4益生菌对意大利蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响Table4effectofprobioticsonApismelliferaheadandchestproteinconcentration日龄———————————————兰兰L——————————一尸值对照组枯草杆菌组乳酸杆菌组、第3日龄0．37士-0．017b0．85士0．020a*0．91士0．017a+0．0102第6日龄0．35士0．030b0．79-士-0．0lla·0．84i0．023a+0，0306第9日龄O．35士0．024b0．81：E0．033a*0．87士-0．03la+0．0009P值O．87920．54280．0643注：『司行数据右上角+代表同日龄间各组日粮之间的差异显著性，字母代表相同日粮剁牛下不I司日龄之l司的差异显著性不同日龄蜜蜂饲喂枯草杆菌和乳酸杆菌饲粮与对照组对蜜蜂头胸部蛋白质浓度的影响见表4。由表4可见，对照组与益生菌组的蜜蜂头胸部蛋白质浓度在第3、6、9日龄均有显著差异(尸<0．05)，试验组的头胸部体蛋白浓度明显高于对照组。对照组、枯草杆菌饲粮组、乳酸杆菌饲粮组在第3、6、9日龄蜜蜂的头胸部蛋白浓度的差异均不显著(尸>0．05)。3．5益生菌对蜜蜂头胸部抗氧化能力的影响3．5．1益生菌对蜜蜂头胸SOD活性的影响表5益生菌对意大利蜜蜂头胸SOD活性的影响Table5effectofprobioticsOil4P括melliferaheadandchestSODactivity注：同行数据右上角·代表同口龄间各组日粮之间的差异显著性(尸0．05)。在第3日龄，枯草杆菌组和乳酸杆菌组蜜蜂头部SOD的活性差异不显著(P>O．05)，但与对照组相比差异极显著(PO．05)；枯草杆菌组蜜蜂头胸部SOD的活性与对照组相比差异显著(P<0．05)。3．5．2益生菌饲粮对蜜蜂头部MDA的影晌表6益生菌对意大利蜜蜂头胸MDA活性的影响Table6effectofprobioficson4P括melliferaheadandchestMI)Aactivity注：I司行数据右上角+代表l—J日龄同各组日根之同的差异显著性，罕母代表相l司日根条件F不J一日龄之间的差异显著性。不同日龄蜜蜂饲喂枯草杆菌饲粮和乳酸杆菌饲粮与对照组对蜜蜂头胸MDA活性的影响见表6。由表6可知，在第3日龄，枯草杆菌日粮组和乳酸杆菌日粮组蜜蜂头部MDA的活性差异不显著(P>O．05)，但与对照组相比差异极显著(尸<0．01)。6日龄枯草杆菌日粮组蜜蜂头胸部MDA的活性与对照组相比差异极显著(P<0．01)，与乳酸杆菌日粮组相比差异不显著(尸>O．05)；9日龄，枯草杆菌日粮组与乳酸杆菌组蜜蜂头胸部MDA的活性与对照组相比差异显著(P<0．05)。3．5．3不同菌种和不同日龄对蜜蜂头胸部T-AOC的影响万方数据 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响注：I司行数据右上角叶℃表J司El龄问各组日粮之间的差异显著性，字母代表相同日粮条件F不同日龄之同的差异显著性。不同日龄蜜蜂饲喂枯草杆菌饲粮和乳酸杆菌饲粮与对照组对蜜蜂胸部T-AOC活性的影响见表15。由表15可知，在第3日龄，枯草杆菌日粮组和乳酸杆菌日粮组蜜蜂胸部T-AOC的活性差异不显著(尸>O．05)，但与对照组相比差异极显著(P<0．01)。6日龄枯草杆菌日粮组蜜蜂胸部T-AOC的活性与对照组相比差异极显著(尸<0．01)，与乳酸杆菌日粮组相比差异不显著(尸>0．05)：9日龄，枯草杆菌日粮组蜜蜂胸部T-AOC的活性与对照组相比差异显著(PO．05)。日龄因素对于蜜蜂中肠胰蛋白酶的活性影响极显著(P<0．01)，尤其以6日龄蜜蜂的中肠胰蛋白酶活性最高。18万方数据 山东农业大学全日制硕士专业学位论文3．7益生菌对蜜蜂中肠厚度和隐窝深度的影响不同日龄意大利蜜蜂饲喂枯草杆菌饲粮和乳酸杆菌饲粮与对照组对蜜蜂中肠厚度和隐窝深度的影响见图1-9。图中木表示中肠围食膜的位置。通过对不同日龄和饲粮的中肠的切片我们可以观察到：枯草杆菌组的中肠厚度比乳酸杆菌的厚，处理组蜜蜂的中肠厚度随着日龄增长也逐渐变厚。枯草杆菌组的中肠隐窝深度比乳酸杆菌的深。图3对照组6d中肠组织切片，H&E染色，10x图4对照组9d中肠组织切片，H&E染色，10×图5乳酸杆菌组3d中肠组织切片，H&E染色，10x图6乳酸杆菌组组6d中肠组织切片，H&E染色，10×图7乳酸杆菌组9d中肠组织切片，H&E染色，10xH&Estain，10xH＆Estain，10x万方数据 乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌对意大利蜜蜂生长发育和免疫指标的影响图8枯草芽孢杆菌组3d中肠组织切片，H&E染色，10×图9枯草芽孢杆菌组组6d中肠组织切片，H&E染色，10x图10枯草芽孢杆菌组组9d中肠组织切片，H&E染色，10×3．8益生菌对蜜蜂抗菌肽相关基因表达量的影响图11为不同菌种对蜜蜂抗菌肽相关基因表达量的影响。由图11A可看出，对于基因Abaecin，枯草杆菌组和乳酸杆菌组显著高于对照组俨