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硕士学位论文甘蔗废糖蜜发酵生产2，3一丁二醇Fermentativeproductionof2,3--butanediolfromsugarcanemolasses学21118109完成日期：2014．05大连理工大学DalianUniversityofTechnology 大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：=篮筮垫盘窒坌毽红圣；二正三醚=作者签名：丞旦金日期：坐!望年jL月上一日 大连理工大学硕士学位论文摘要2，3一丁二醇是一种重要的绿色平台化合物，在化工、食品、医药化妆品及燃料等方面都有着广泛的用途和广阔的市场前景。甘蔗糖蜜是糖厂的副产物，含有50％左右的糖以及有机酸、无机盐等，可作为发酵的廉价原料，其含有的色素在医疗和保健食品方面应用价值。本课题以甘蔗废糖蜜为原料发酵生产2，3．丁二醇，结合其组成特点简化发酵培养基，通过探究发酵条件简化操作步骤，降低发酵成本，并结合2，3一丁二醇的分离，对色素的回收进行了初步尝试。糖蜜含有一定的金属离子及少量的微量元素，所以本实验中尽可能不添加或少添加微量元素，从而简化培养基组成。本实验首先选取8个因素进行Plackett—Burman设计实验，以目标产物(2，3．丁二醇与乙偶姻)的总浓度为响应值筛选出三个显著的因素，分别是酸预处理糖蜜、尿素和KEHP04；然后进行最陡爬坡实验，确定三个显著因素的大概范围；最后，在前两步的基础上对3个显著因素进行Box—BehnkenDesign实验，确定了培养基组成。对优化的培养基进行摇瓶验证实验，目标产物比对照组提高了40％。通过单因素考察培养基不灭菌、糖蜜不预处理和有机氮源不添加对目标产物浓度的影响，确定罐体发酵可以在培养基不灭菌、糖蜜不预处理和有机氮源不添加的条件下进行。批式发酵实验中，12h时目标产物浓度为45．6g／L；批式补料发酵实验中，60h时目标产物的浓度为99．50g／L，其中2，3一丁二醇为90．82∥L，乙偶姻为8．67g／L，转化率为0．39∥g糖蜜，生产强度为1．66∥(L．h)。本课题尝试采用磷酸氢二钾／乙醇和磷酸氢二钾／乙酸乙酯两步盐析萃取法分离目标产物，以期实现发酵液中色素和目标产物的分离。两步盐析萃取后的上相经减压蒸馏可获得浅粉色液体粗产品，经GC分析其中2，3．丁二醇含量为80．2％，乙偶姻为9．8％。采用大孔吸附树脂D．101对第一步盐析萃取的下相溶液(简称下相溶液)进行色素回收的探索实验，确定树脂吸附容量为25g树J]旨／100mL下相溶液，色素吸附率为72．02％；选择的洗脱剂体系为10mL20％7,醇儋树脂，在该体系下色素回收率为6】．33％。关键词：2，3一丁二醇；糖蜜；响应面分析法；色素回收 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3．丁二醇Fermentativeproductionof2,3·-butanediolfromsugarcanemolassesAbstract2，3一Butanediol(2，3-BD)isapromisingplatformchemical，whichhasawideapplicationinsolvent，liquidfuel，andsyntheticchemistry．Sugarcanemolassesistheby-productofsugarindustry，whichcontainsapproximately50％totalsugar，organicacidandinorganicsalts．Inaddition，thecoloringmattersinsugarcanemolassesisavaluableproductinpharmaceuticals．Inthisstudy，sugarcanemolassesWasusedascarbonsourcetoproduce2,3-BD．Duetoitsmulti—composition，thefermentationmediumandprocedureweresimplifiedtoreducethefermentationCost，andtherecoveryofcoloringmatterswereexplored．Firstly，ResponseSurfaceMethodology(RSM)Wasusedtooptimizethemediumfor2,3·BDproduction．Plackett-Burman(PB)designwasusedtopickupfactorsthatsignificantlyinfluenceddiol(2，3-BDandacetoin)production．nesignificantfactorswereacidifiedmolasses(a-molasses)，ureaandK2HP04．SteepestascentexperimentswereemployedtOapproachtheoptimalregionofthesethreefactorsandtheexperimentofBox-BehnkendesignWasappliedtodeterminetheiroptimallevels．Theresultsofsecond-orderpolynomialmodelindicateditwasreasonabletousetheregressionmodeltoanalyzethetrendsintheresponses．UsingtheoptimummediumtheconcentrationofdiolWas40．19虮byshakingflaskculture，whichincreased40％．Secondly，theeffectsofnon—sterilizationofmedium，non-pretreatmentofmolassesandtheshortageoforganicnitrogensourceontheformationofdiolwereinvestigated．Theresultsindicatedthatthosethreefactorsdidn’teffecttheproductionofdiolobviously．Sothebatchandfed—batchfermentationexperimentswereperformedviaanon-sterileprocess，molassesWasutilizedwithoutpretreatmentandnoorganicnitrogensourcewasaddedintofermentationmedium．Inbatchfermentation，45．6g／Ldiolwasobtainedafter12hculture．Infed-batchfermentation，theyieldofdiolWas99．50∥Lafter60hculture，inwhich2,3-BDWas90．82∥LandacetoinWas8．67egL，andtheproductivitydiolWas1．66g／(L．h)．Tbirdly，thetwo—stepsalting—outextractionsystem(ethanol／K2HP04andethylacetate／K2HP04)wastriedtoseparate2,3-BDandcoloringmattersfromfermentationbroth．Thepinkliquidproductwasobtainedafterreducedpressuredistillationofup—phasesolutionfromSOEsystem．GCanalysisshowedthecrudeproductcontained80．2％2,3-BDand9．8％acetoin．D一101macroporousresinWasusedtoadsorbcoloringmattersfromthebottomphasesolutioninthefirststep．Theadsorptioncapacitywas25∥100mLbottomphasesolution，andtheadsorptionrateofcoloringmattersWas72．02％．10mL20％ethanolwasappliedaseluentof1gmacroporousresintoharvestthecoloringmatters，andthedesorptionrateofcoloringmatterswas61．33％． 大连理工大学硕士学位论文Keywords：2,3一Butanediol，Sugarcanemolasses，ResponseSurfaceMethodology，Recoveryofcoloringmatters 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3．丁二醇目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lAbstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1I目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。IV弓I言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．12,3．丁二醇的概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．1．12，3．丁二醇的物理化学性质⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．31．1．22,3．丁二醇的主要用途⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．1．32．3．丁二醇的制备方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．2生产2,3．丁二醇的原料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．2．1生物转化2，3．丁二醇的非粮碳源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．2．2糖蜜的介绍及开发⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．2．3糖蜜发酵液的特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．3发酵液中2,3．丁二醇的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．4发酵液中色素的分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．4．1发酵液中色素的种类及成因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131．4．2发酵液中色素的分子量分布⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．4．3天然色素的稳定性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．4．4甘蔗糖蜜色素的回收⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．151．4．5大孔树脂的特点及应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．171．5本课题的研究内容及意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172响应面优化培养基发酵生产2,3．丁二醇⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一192．2实验材料及仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．1实验菌种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．192．2．2培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．192．2．3实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．202．2．4实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～212．3实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．3．1甘蔗糖的预处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22-IV- 大连理工大学硕士学位论文2．3．2甘蔗糖蜜中总糖的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．222．3．3菌种的驯化筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．232．3．4Plackett．Burman(PB)设计实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．242．3．5最陡爬坡实验(Steepestascent)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242．3．6Box·BehnkenDesign(BBD)实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．3．7批式发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．3．8批式补料发酵⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．3．9分析方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262．4实验结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯312．4．1Plackett—Burman(PB)设计确定培养基的显著因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯312．4．2最陡爬坡实验(Steepestascent)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．322．4．3Box．BehnkenDesign(BBD)实验确定最优培养基组成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．4．4发酵条件的探究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．372．4．5批式发酵实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．382．4．6批式补料发酵实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．412．5小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．423甘蔗糖蜜发酵液中色素的分离初步探究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯443．1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯443．2实验材料和仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．2．1实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．453．2．2实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯453．3实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯463．3．1两步盐析萃取体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．463．3．2大孔吸附树脂的预处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．473．3．3大孔吸附树脂吸附容量的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．473．3．4静态解吸剂浓度的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．473．3．5静态解吸剂体积的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．473．4实验结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯483．4．1两步盐析萃取体系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．483．4．2大孔吸附树脂D．101吸附容量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．483．4．3大孔树脂解吸剂浓度的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．493．4．4大孔树脂解吸剂体积的确定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．50．V． 甘蔗废糖蜜发酵生产2．3-丁二醇3．4．5大孔树脂吸附前后色值及色素解吸效果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．503．5小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．52展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．54攻读硕士期间发表论文情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．60大连理工大学学位论文版权使用授权书⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61-V卜 大连理工大学硕士学位论文引言2，3．丁二醇(2，3．Butanedi01)是一种重要的化工原料及液体燃料，经过脱氢、脱水、缩酮和酯化等化学反应，形成一系列的衍生物，在化工、食品、医药化妆品及燃料等方面都有着广泛的用途，有着广阔的应用前景。在生物制备过程中，通常使用的底物为高成本底物如淀粉或者葡萄糖等，底物是限制2，3．丁二醇发酵经济效益的重要因素，因此，价格廉价同时又能够获得较高目标产物的非粮作物和工业副产物成为研究的热点，用这些原料来代替或者部分代替高成本底物是研究生物制备2，3．丁二醇的重中之重。甘蔗废糖蜜是工业制糖的副产物，是一种宝贵的资源【l】，含有多种可利用的成份。其中，废糖蜜总糖含量大概在45～50％左右，主要包括蔗糖、果糖和葡萄糖，其中蔗糖含量占总糖份的30-40％。除此之外，还含有大量可以被微生物利用的无机盐和微量元素。甘蔗糖蜜经微生物发酵后的颜色多呈现黑棕色，是多种色素的复合颜色，这些色素主要是天然色素，对高温和光照敏感度不高，即使长期放置这些色素也不会发生褪色，废糖蜜发酵液中色素的种类主要包括焦糖色素、美拉德色素、酚类色素(具有抗氧化活性，但成分很复杂)等，这些色素普遍难以用物理、生物和化学方法去除，在医疗和保健领域都有较好的应用前景【2】。以甘蔗废糖蜜为底物，生物转化法主要用来生产乙醇【31，山梨醇H，2，3．T---醇【5】’琥珀酸【61，柠檬酸【7】等生物基化学品。在本课题研究过程中，Moo-YoungJung[5】也研究了以甘蔗废糖蜜为底物生物转化2，3．丁二醇，所用菌种为突变菌种(采用基因工程的手段，敲除Enterobacteraerogenes的蔗糖调控基因获得)，突变菌株的蔗糖利用率得到提高，蔗糖的利用率调高了60％左右，采用批式流加发酵方式，36h时2，3．丁二醇的浓度达到98．69∥L。在优化方面，传统上多采用单因素试验和正交实验的方法，其中单因素实验为完全实验，应用的过程中消耗大量的人力和物力，而且没有考虑因素与因素之间的交互作用，实验结果并不完全可信【8】；正交实验虽然考虑了因素与因素之间的交互作用，但它不能在一定的试验范围内确定变量间的相关关系及其相应的回归方程，所以本实验采用响应面分析法来优化培养基。Plackett．Burman(PB)[＆10】方法是通过对实验模型中的各个因素进行统计学设计和数据检验分析，筛选出对目标响应值影响显著的实验因素，同时该方法在考虑因素与因素之间交互作用的基础上，减少实验过程中的实验次数，节省了工作量和时间，广泛应用于微生物发酵培养成份的筛选和发酵工艺参数的优化。响应面分析法是一种现代实验设计及分析方法，英文名称为ResponseSurfaceMethodology(RSM)，这种实验方法的一般步骤为，首先要对影响实验结果的因素进行初步筛选，设计实验方案，建立适合实验的数学模型；接着检验建立的数学模型是．】． 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3一丁二醇否适合，拟合是否良好，对实验中的各个因素效应进行评估和考察；最后根据拟合的模型寻求最佳操作条件【111，该方法得到科研工作者的广泛应用。对于盐析萃取法分离发酵液中的2，3．丁二醇，本课题组已有良好的研究基础，并取得了一定成绩，盐析萃取方法不但能够实现固液分离还可以最大化的降低目标产物的损失，分离过程中使用的盐和溶剂价格低廉，操作简单，降低了下游的成本和能耗，具有较好的应用前景。但我们发现此盐析萃取体系大部分是以葡萄糖或者色素成份较少的非粮原料为底物的发酵液为研究对象，由于这些原料为底物的发酵液色素较浅，所以在分离目标产物的过程中很少考虑发酵液中色素的去除问题。本论文首先采用响应面分析法对发酵培养基进行了简化，通过发酵方式的探究简化了发酵过程中的操作步骤，实现了培养基和操作步骤的双重简化；接着初步尝试了两步盐析萃取体系实现甘蔗糖蜜发酵液中目标产物和色素分离的情况；最后对发酵液中的色素回收进行了初步探究。 大连理工大学硕士学位论文1文献综述1．12，3．丁二醇的概况1．1。12，3-丁二醇的物理化学性质在常温状态下，2，3．丁二醇是一种无色无味的液体或者晶状固体，在聚合体中用作单体，常用来制备树脂和作为溶剂使用。2，3．丁二醇本身具有一定的吸湿性【12】，能与水互溶，同时能够溶于乙醇、异丙醚和乙醚等有机溶剂【131。2，3．丁二醇的英文名称为2，3．Butanediol，可缩写为2，3．BD，分子式为c4H，002，其结构式为：CH3CHOHCHOHCH3，其中由于分子结构中有两个碳原子为手性碳，因此该物质具有三种旋光异构体，分别为：D．(．)．2，3．Butanediol，L．(+)．2，3．Butanediol和meso．2，3．Butanediol，其旋光异构体的结构如下图(图1．1)。OHoH“+Fg,0I-BODe姗∞谊Ia哆form滞，摹8l—oH—OH捆∞o-罨孓BO凸纠噎，s舶OpU删ty嘲啊forml筋帕蚰髓娜form(2R13R)图1．12,3．丁二醇旋光异构体‘14】Fig．1．1Thestereoisomersof2，3-butanedioltl4】表1．12，3．丁二醇异构体的物理化学性质Tab．1．1Thephysicalandchemicalpropertiesofthestereoisomersof2．3-Butanediol 甘蔗废糖蜜发酵生产2,3一丁二醇三种旋光异构体的物理化学性质列于如下表格中(表1．1)，由表格可以看出，2，3．丁二醇的燃烧值仅次于乙醇(39005J／g)，在生物燃料方面具有广阔的应用前景；三种异构体的熔沸点区别并不是很大，因此很难用传统上的分离方法将其进行分离(如蒸馏、结晶等方法)。1．1．22，3-丁二醇的主要用途2，3．丁二醇可进行脱氢、脱水、缩酮和酯化等化学反应，形成一系列的衍生物(图1．2)，在化工、食品、医药化妆品及燃料等方面都有着广泛的用途，是一种重要的绿色平台化合物，有着广阔的市场前景。针对2，3一丁二醇的用途做以下介绍：图1．22,3．丁二醇的衍生产品㈣Fig．1．2Derivativesofbiologicallyproduced2,3．Butanediol【15】首先，2，3一丁二醇脱水可形成甲乙酮和l，3．丁二烯。其中，丁二烯是合成生产橡胶的主要原料。甲乙酮是一种液体燃料添加剂【l61，其燃烧值高于乙醇，有着较高的应用价值；2，3．丁二醇还作为工业溶剂广泛用于涂料、润滑油脱蜡、粘合剂、磁带等【14】；与此同时，2，3一丁二醇还可作为炸药和药物的手性载体使用，在香水、熏蒸、油墨、增湿剂、软化剂等的制备过程中是不可或缺的原料【12"l71。其次，2，3．丁二醇脱氢形成乙偶姻和双乙酰两种化合物。乙偶姻又被称为3一羟基．2丁酮，是一种得到广泛应用的香味增强剂和香料【l引，具有强烈的奶油香味，有着较好的应用前景，广泛应用在奶制品的制作中，如奶酪、黄油和奶油等；双乙酰，是啤酒中风味物质的重要组成部分【14,19]，是一种高附加值的食品风味剂【191，同时该物质又具有抑制细菌生长的作用，可用来制备防腐剂【201。再次，2，3．丁二醇的酯化形式可以作为有效的增塑剂用于热塑性聚合物，如硝酸纤维素、纤维素三乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚酯和聚丙烯酸酯等【2¨， 大连理工大学硕士学位论文其经酯化形成的物质能够用于合成聚酯和聚氨酯，也可以被用作前体药物和化妆品【2l】，其广泛的应用于化妆品、洗涤液和药物等中【14测，例如，2，3．丁二醇具有很强的紫外吸收和抗氧化作用，能够清除活性氧自由基，阻断脂质过氧化作用，可以作为抗紫外辐射剂和抗氧化剂，应用于未来的化妆品行业【22】；在医学材料应用方面，用来治疗心血管疾病的聚亚氨酯-N丁烯二酰亚胺是由酯化形式的2，3．丁二醇与顺丁烯二酸合成得来的[231。D一(+)．2，3．丁二醇可作为抗冻剂，该构型2，3．丁二醇的凝固点为。600C，可用于在低温条件下用来保护移植的器管，在高寒等恶劣环境下，可作为燃料防冻剂【24】．o最后，2，3．丁二醇也可以与丙酮发生缩酮反应产生一种四甲基化合物，该化合物是潜在的汽油调和剂，类似于常用的甲基叔丁基醚(MTBE)【2l】。丙酮与2，3．丁二醇衍生的四甲基化合物与传统制备MTBE相比，其具备的优势在于，所需的两种底物都可以通过生物转化法获得【14,25】。1．1．32．3．丁二醇的制备方法2，3．丁二醇的制备主要可以通过化学合成法和微生物转化法两种方法，下面分别介绍一下两种方法的特点。化学合成法制备2，3一丁二醇：该方法是以石油为原材料，通过裂解形成四碳类碳氢化合物，该化合物可在高温、高压条件下发生水解反应，形成2，3．丁二醇【261。尽管2，3．丁二醇有着很好的应用前景，越来越多的得到大家的关注，但是2，3．丁二醇始终没有得到广泛应用，化学法制备不但过程繁琐，操作不易，而且成本高，能耗大，其中生产能力是限制其大规模生产和应用的主要因素，所以实现大规模的工业化生产很困难。微生物转化法制备2，3．丁二醇：该方法是以可再生的生物资源为原料，通过微生物生理代谢等生化作用，将生物质原料中的五碳糖或六碳糖转化为2，3．丁二醇【12】，获得所需要的生物基化学品，其中葡萄糖是最为常用的碳源。与化学合成法相比，微生物转化法制备2，3．丁二醇生产条件温和，设备的要求较低，可以避免化学合成法的困难，同时，利用可再生生物资源作为底物，很好的避免了对不可再生并日益枯竭的石油等化石燃料的依赖，实现了由石油炼制向生物炼制的转型，符合绿色化工的特点，成为当前发展可再生能源的一种趋势，该方法在技术上相对较为成熟，如果能充分开发出2,3．丁二醇的应用，将形成一个新的行业【261。生物转化法制备2,3．丁二醇最初于1906年由Harden和Walpole提出。该方法在发展的过程中，共呈现出了三个活跃的时期：一是19世纪40"--50年代的德国活跃期；二是19世纪70"--"80年代的美国活跃期；三是近几年的中国活跃期。德国之所以出现活跃期积极开发2，3．丁二醇是为了解决二战时期人工合成橡胶的原料问题，首次实现．5． 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3一丁二醇产业化生产，尽管战后因成本偏高而停产，但为生物转化法制备2，3一丁二醇积累了经验；美国活跃期是因为当时石油危机，也随石油价格平稳而止，这一时期的研究深入而广泛，筛选出许多产2，3一丁二醇新菌株，对多种底物的适用性进行了研究，完善了发酵工艺，开发了分离工艺；而中国活跃期既有石油涨价的外因，又有中国经济持续发展需要稳定资源的内在需求和走新型工业化道路的战略要求。1．2生产2，3．丁二醇的原料1．2。1生物转化2，3．丁二醇的非粮碳源在传统生物转化法获得2，3．丁二醇的过程中，使用的碳源通常为葡萄糖、果糖、核糖、木糖和阿拉伯糖，其中葡萄糖是最为常见的碳源【12,14,27-29]。由于生物质原料成本在微生物法生产2，3一丁二醇总成本中所占的比重较大，降低生物质的成本有助于降低发酵的总成本，传统的以葡萄糖为代表的高成本底物成为限制2，3．丁二醇生物转化经济效益的重要因素，寻找一种既廉价又有效的非粮原料替代或部分替代粮食作物是推进发酵生产2，3一丁二醇的必经之路，才能真正实现不与人争粮，不与粮争地的景愿。一般情况下，价格低廉的非粮碳源主要有两种：非纤维素和木质纤维素【l引，目前国内外关于非粮原料为底物的研究现状见表1．2。非纤维素原料主要包括3大类，第一种类为工业废弃物，如淀粉水解废液，它是最有前景的底物之一，含糖量很高，淀粉水解废液可能用于2，3．丁二醇的工业生产，并且无需额外生长因子的补充[30】；另外，乳制品行业的副产品乳清也是很好的发酵底物，它含有较高的糖并且作为副产物具有较高的产率，乳清作为底物生产2，3一丁二醇被广泛研究，多用于生产R，R．2，3一丁二醇，在细胞固定化技术的辅助之下，获得目标产物的产率较高[31,32]。糖蜜是制糖工业的副产物，能够以浓缩的形式被储存，含糖量大概在48～55％左右，是很好的碳源提供者，除此之外废糖蜜中还含有大量的微量元素和无机盐等，因此在废糖蜜的生物转化过程中通常不需要额外添加其他生长因子。许平畔】等以木糖母液为底物，采用基因工程菌KlebsiellapneumoniaeSDM发酵生产2，3一丁二醇，结果表明，批式补料发酵条件下，61h时，2，3一丁二醇的最大浓度为78．9∥L，此时2，3．丁二醇的生产强度为1．3∥(L．h)；第二类是富含六碳糖的非粮植物，如菊芋等。孙丽慧等【33】采用Klebsiella．Pneumoniae菌种进行同步糖化发酵，以菊芋为底物获得目标产物的浓度为91．63∥L，该研究过程中采用的发酵方式为批式流加，在40h时生产强度达到2．29趴L．h)。李丹【34】等采用同步糖化发酵，考察了KlebsiellapneumoniaCICC10011对菊芋块茎和秸秆中糖的转化能力，结果表明2，3．丁二醇和乙偶姻的总浓度可提高到80．5ev"L，低于QinJ等采用Klebsiellapneumoniae以葡萄糖和磷酸铵为底物的发酵结果目标产物的浓度为105．5g／Lt351。刘国兴等【46】以盾叶薯蓣糖化液为发酵底 大连理工大学硕士学位论文物，发酵生产2，3一丁二醇，采用批式流加发酵方式不断向发酵液中补加固体葡萄糖粉末，2，3．丁二醇最终浓度高达80．2g／L，此时的发酵时间为56h，生产强度为l。54g／(L．h)。第三类是生产生物柴油副产物甘油，Pe仃ovandPe仃ova[36,37]证明优化过的工艺条件下，以甘油为单一碳源进行发酵，2，3．丁二醇的浓度可达到70g／L。木质纤维素是地球上最为丰富的生物质资源，由于资源丰富、可再生能力强，越来越受到人们的关注，其中最受人关注的是利用生物技术手段生产生物基化学品【381。木质纤维素生物质的主要成份为木质素、纤维素和半纤维素，纤维素是由葡萄糖聚合而成，半纤维素是有五碳糖聚合而成，主要包括木糖、阿拉伯糖和核糖等[39,40】。在过去几十年里，利用价格低廉的木质纤维素为底物降低生产2，3．丁二醇的经济成本越来越受到重视【4l，34】。程可可【48】等人以玉米芯酸处理水解液为研究对象，采用批式发酵方式，通过对乙酸含量和发酵pH值的控制，在最佳发酵条件下，2，3．丁二醇的产量可达到35．7∥L，此时的发酵时间为60h，生产强度为0．59趴L．h)，转换率为O．5∥g还原糖；杨洋等【42J以稻草秸秆水解液为底物，考察Klebsiella．Pneumoniae菌种对木质纤维素的转化能力，结果表明2，3．丁二醇的最高转化率可达到17．92％，此时的发酵时间为72h，初始糖浓度为100g／L；司阳等【43】发酵玉米秸秆生产2，3．丁二醇，64h时糖的利用率为99．36％，2，3．丁二醇产率为0．468g／g，虽然利用纤维素和半纤维素是可行的，具有很好的应用前景，但两者的产量和前者的葡萄糖和木糖相比略低。因此寻找一种既廉价又有效的非粮碳源替代或部分替代粮食作物，是推进发酵生产2，3．丁二醇的必经之路，才能真正的实现不与人争粮，不与粮争地的可持续发展的愿景。 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3一丁二醇．8-一。巴一∞已F王【9王胃王一荨一守n一一nc】【9c】IIo_时q-它。目lu_母(1．吧Q函I；Iu苗∞IIQ苗∞I：【Q苗∞IIo_对q-勺D皿113对∞IIu_时q-它o‰‰∞∞二u_矗cI．它。陆函∞∞IIo_时q-勺Q‰lIo_母q．它o‰寸卜．N∞∞．0吼乜。吼to寸n．一n．一∞一．1一．N岭心n．0n节on．0No节on寸．o卜。冀。寸小N．o崎nn．o△崎．8A∞Q∞∞对_o—IIo口日b‘日Mj力k∞_u口ook∞_墨目∞．寸．【．寸．【Q_曙∞h—QJp^II口QQ≥时o∞避ou蕊《u℃舢《uh嗡△岔“寸N．c—NA．9n卜．nn．【节．【nqo∞N．9N吼．8卜n心崞o．寸∞N．6寸_Q对扫廷QIIIT虽o_对∞x一^专I：l口一。对Doo—薯ou毒葛《q避盈呈≮-o3时∞h一^量Z蚰l。∞害H叼斡乒一∞tl∞k∞皿一∞tl—N心∞’l。u∞。一Qo田∞对M胃cLQII时3J对∞暑∽∞o∞∞旦。量DouIuoUsJoo暑它_rB∞董墨∞是5《怠℃毽莛迫毽迄￡A，’矗它参o(I盘6《皇℃毽莲a，≈鼍￡心一20釜一o8uc^pll》roA∞暑一一_u岱∞心uo_》KoD1≮ts盛u一翻∞毽H譬QH≈，l∞≈A611∞甾oal鬣∞QoIIa_HQ-oZ一号1／s)Q勺o_II茸一≯召u；屯oJ山IIo口四_口QIIIJQ‘_o—f1一∞／s—pID一净10一QU《Q∞-c．N(1奄一IIo一_暑_8u口oJ3墨钫cITl力口一o_oo时勺II爵一。一它oII暑11∞．n．N-oIIo口oTl勺2山_II∞_II时眦．Ir、IIo召g口o_Iu盘}o—oIpo口墨t1∞-c．N铀oIIo召Qj勺oJ△Il一∞写IJ卫对g≥巴-o∞皇墨∞112时Q∞QgqH．q对卜葵舔妖奄S链¨卜-c‘N钆州燃甚辱毒霉州聪罄篥爿E去翟匦N．I懈 大连理工大学硕士学位论文1．2．2糖蜜的介绍及开发甘蔗糖蜜是制糖工业的副产物，其产量约占原料甘蔗的2．5～3．O％，是甘蔗汁经加热、中和、沉淀、过滤、浓缩、结晶等工序所剩下的浓稠液体，即为我们常提及的糖蜜，属于液体能量饲料，糖蜜广泛用做饲料、造纸助剂、发酵、减水剂、缓凝剂、水泥助磨剂等p1|。中国作为世界十大产糖国之一，2008年糖蜜产量达300多万吨，价格700-800元／吨，供应量稳定。糖厂副产物甘蔗糖蜜具有较大综合应用潜力，但同时在综合开发过程中也面临着一些挑战。表1．3糖蜜的组成Tab．1．3Thecomponentsofcanemolasses成份所占％水干固物干固物全糖分蔗糖还原糖非发酵性糖非糖有机物0．05，说明该因素不显著。Ji[81】的研究结果表明，以葡萄糖和木糖为碳源，以尿素和玉米浆干粉相结合为氮源，玉米浆干粉对响应值为显著因素，跟本实验的结果并不一致，可能原因是甘蔗废糖蜜中含有一些可以代替玉米浆干粉的有机氮源物质。表2．7PB实验结果的一次拟合模型的偏回归系数及影响因子。Tab．2．7EffectsandstaticanalysisofvariablesinPBdesignVariableCoefficientStandarderrort-valueP-valueIntercept29．4440．1542190．91<0．000la．Molasses6．0000．154238．90<0．0001Urea．1．8400．1542．11．930．00lCSL_0．2120．1542．1．380．263K2HP0441．6820．1542-4．420．02lSodiumcitrate0．0130．15420．080．939MgS040．2470．15421．600．208FeS04·7H20．0．0410．1542．0．260．809MnS04-H20—0．4050．1542．2．620．079注1)：R2=O．9982，R2(Adj)=0．9935；置信水平为O．95。以2，3．丁二醇和乙偶姻浓度为响应值的一次模型拟合方程为：Y=29．4+6．00AI一1．84A2—0．212A3．0．682A4+0．013A5+0．247A6-0．041A7—0．405As(4)其中，回归系数R2越接近于1．0，模型的回归性越好。R2=O．9982表示此回归方程线性良好，RE(Adj)=0．9935表示99．35％的实验数据变异性可用此线性方程解释，因此，此响应值回归方程为PB设计提供合适的模型。2．4．2最陡爬坡实验(Steepestascent)最陡爬坡实验是一种沿着响应值增大的路径移动到最佳区域的一种方法【8引，爬坡的方向是沿着响应值增加最快的方向，爬坡路径由PB设计中的所得的线性回归方程(2)来确定。根据PB设计中的所得的线性回归方程来确定爬坡的路径，通过增大a．Molasses(X1)的浓度，降低尿素(X2)和K2I-IP04(X3)来提高Diol的产量，以达到最大响应值。由线性回归方程可知Xl、X2、X3的系数为6．oo、．1．84、．0．682，其比例大概为1：．0．3：．0．1，即x】每增加1单位(即10g／L)，X2降低0．3个单位(每单位．．32·· 大连理工大学硕士学位论文为2g／L)，X3也随之降低O．1个单位(每单位为2g／L)，其余因素均按照PB设计中的最优设计，设计表格及响应值如表2．8。表2．8爬坡设计表格及对应的响应值Tab．2．8Experimentaldesignandresultsofthesteepestascent由爬坡实验结果可知，第三组目标产物产量最高，第三组以后2，3．丁二醇的产量明显下降，在三因素的共同作用下(三物质的组合方式为a-Molasses为l15g／L，尿素为8．8g／L，K2HP04为0．7g／L)，2,3一丁二醇和乙偶姻总和的最高产量为41．71g／L，该组合方式将会最终做为0水平应用于下一步的BBD的实验设计中。2．4．3Box．BehnkenDesign(BBD}实验确定最优培养基组成响应面设计适用于最佳响应值比较接近的情况【831。在爬坡实验的基础上，对三个较显著的因子a-Molasses、尿素、K2HP04用BBD做进一步的探究，确定最佳培养基成份比例，以Diol产量为响应值，关于三个因素的响应值结果如表2．9。采用多重分析的方法分析实验数据，所对应的二阶方程见方程式(5)(其中Y值为Diol的产量，XI、X2、X3分别对应的因素为a-Molasses、尿素、K2HP04)。对BBD设计二次拟合模型的回归系数进行显著性分析，结果如表2．10。BBD实验的二次拟合模型方程为：Y=41．8857+3．2038Xl+O．2491X2+1．8383X3．11．6144X12_3．0294X22-2．8311X32．1．1363XlX2—0．0101XIX3—1．7237X2X3(5)由该模型方程求的产物产量最高值为Y=42．42g／L。t检验和P值可用来检验每个系数的显著性，其中t值越大和P值越小，对应的系数就越显著。如表2．10所示，模型方程中常数项P为0，表明该模型是显著的，同时，在2次拟合方程式中，Xl、X3、Xl木Xl、X2*X2、x3宰X3在95％水平(p<0．05)显著，X2、Xl木X2、Xl木X3、Xz*X3响应值不显著即p>0．05，Xl(p<0．01)的线性和二次项显著性高于其他因素，这意味着a-Molasses的浓度与Diol的产量有密切的关系，说明a．Molasses浓度的稍微波动直接影响着Diol的浓度大小。由于Xl在二次项水平极显著(p=O．000<0．001)，a．Molasses在培养基中起限制作用，该物质的微量变化将会引起Diol的显著变化。．33． 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3．丁二醇表2．9BBD实验设计表格及响应值结果Tab．2．9Levelsofthefactors，experimentaldesignandresultsoftheBBDxl、x2、X3的交互作用对Doil的产量不显著。二次拟合方程的回归系数R2用来确定方程的拟合性，R2越接近于1．00，模型的回归性和预测性越好【841。本实验得到的二次拟合方程(5)的回归系数为0．9822，表明98．22％的产物产量可以用此模型来解释，回归系数R2的调整值为0．9502，说明该二次拟合模型方程拟合良好。表2．10BBD设计二次拟合模型的回归系数显著性分析结果Tab．2．10Significancetestofregressioncoe伍cientofBBDFactorCoefficientStandarderrort_ValueP．ValueIntercept41．88570．887947．1720．000X，3．20380．54375．8920．002x20．24910．54370．4580．666Xt1．83830．54373．38l0．020X1宰X】．11．61440．8004．14．5ll0．000XE*X，．3．02940．8004．3．7850．013X3木X，．2．83110．8004．3．5370．017X1木X2．1．13630．7690．1．4780．200Xl木X3．0．01010．7690．0．0130．990X2*Xt．1．72370．7690-2．2420．075注1)：《=0．9822，R2(adjusted)=0．9502；置信水平为0．95．—．34．- 大连理工大学硕士学位论文对该模型的二次拟合模型进行方差分析，结果如表2．10所示。失拟(Lack．of-fit)是用来表示模型预测值与实际值不拟合的概率，反应拟合出来的模型与实验数据的接近程度，一般情况下，以P=0．05为界限，若P值大于0．05则表示回归方程拟合良好，若P值小于O．05，则表示方程需要进一步的调整。表2．11可知：二次模型失拟检验的P值为O．147，大于0．05，因此，回归模型拟合良好，不需要对回归模型进行调整。表2．11二次拟合模型的方差分析Tab．2．1lAnalysisofvariance(ANOVA)forresponsesurfacequadraticmodel注1)：DF：degreeoffreedom．SS：Sumofsquare．MS：Meansquare．RE：residualerrors．培养基成份中三个显著因素两两之间交互作用的三维图形如图2．10。经PB实验设计筛选出显著因素，最陡爬坡实验确定大概范围，BBD实验模拟二次拟合方程可知，优化后的培养基组成为：a．Molasses：118g／L，Urea：8．7g／L，CSL：2g／L，K2HP04：0．77g／L，Sodiumcitrate：0．3g／L，MgS04：0．9g／L，FeS04‘7H20：0g／L，MnS04。H20：0g／L。为了验证培养基优化的适合性，我们采用摇瓶发酵的方式验证培养基结果，本实验采用的培养基为优化后的培养基(a-Molasses为118g／L、尿素为8．7∥L、CSL为2g／L、K2HP04为0．77g／L、柠檬酸钠为0．3g／L、MgS04为0．9g／L、FeS04·7H20为0g／L、MllS04"H20为0g／L)，来进行摇瓶实验，每个实验采用3组平行，实验结果为3组的平均值，培养条件：温度370C，起始pH为7．0-士o．5左右，转速200rmp，培养时间为50h。‘摇瓶发酵实验结果表明，对照组目标产物产量为28．71∥L，优化过的培养基产量为40．19∥L，提高了40％，与预测值42．42g／L相比误差为5．26％，有很好的相关性，验证了响应模型的正确性和最优培养基组成的可行性。．．35．． 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3一丁二醇4542393633302724214240Y38363432O．51．0X24542393633302724211．00．5X3图2．10a-Molasses，尿素，K2HP04之间的两两交互作用Fig．2．10Pairwiseinteractionofa-Molasses，Urea，K2HP04．-36．．0．51．O 大连理工大学硕士学位论文经过上述一系列的优化和验证实验，最后确定培养基的成份为：a．Molasses：118g／L，Urea：8．7g／L，CSL：2g：L，K2HP04：0．77g／L，Sodiumcitrate：0．3g／L，MgS04：0．9g／L，FeS04‘7H20：0g／L，MnS04·H20：0g／L，微量元素不需要添加，简化了培养基组份，该培养基组成会用于下一步的罐体发酵中。2．4．4发酵条件的探究在传统的生物法制备2，3．丁二醇过程中，发酵之前都会对培养基进行灭菌处理，碳源与其他成份需要分开灭菌，灭菌过程中会有大量的能耗，操作繁琐并且能耗较大，所以本实验旨在考察培养基不灭菌对目标产物的影响，探究能否省去发酵之前的灭菌工序。采用单因素分析的方法，本实验采用摇瓶发酵的方式，培养基分别为不灭菌和灭菌两组，培养基按照响应分析法优化过的培养基组份，起始pH为7．0-t0．5，温度控制在370C，转速200rmp，发酵时间为50h，每个实验采用3组平行，实验结果为3组的平均值。由表2．12可以看出，培养基灭菌和不灭菌两组的目标产物的浓度相差并不大，说明培养基的灭菌与否对目标产物并没有太大的影响，所以在以后的发酵过程中，培养基不再进行灭菌，简化发酵工艺流程。在以往的考察甘蔗废糖蜜作为底物生物转化生物基化学品的过程中，一般会采用酸预处理的方法来去除糖蜜中的部分杂质【851，但是酸预处理会增加实验过程中的人力和物力，同时也会需要消耗大量的时间，所以本实验旨在考察糖蜜不预处理对目标产物的影响，探究能否在发酵流程前省去预处理的过程。采用单因素分析的方法，本实验采用摇瓶发酵的方式，在培养基不灭菌的基础上，培养基的碳源分别为糖蜜经酸预处理和不进行预处理，其他组份与简化过的培养基相同，起始pH为7．0i-0．5，温度控制在370C，转速200rmp，发酵时间为50h，每个实验采用3组平行，实验结果为3组的平均值。由表2．12可以看出，预处理与不预处理两组的目标产物的浓度相近，表明发酵之前糖蜜的预处理与否对发酵产物的产量并没有太大的影响，所以在以后的实验中碳源则采用不进行预处理的甘蔗废糖蜜。在本实验之初，我们采用的是廉价的无机氮源尿素和有机氮源玉米浆干粉相结合的方式，但是在罐体发酵的过程中，产气泡现象严重，需要添加大量的消泡剂才能保证发酵的正常进行，过度的添加消泡剂不利于菌体生长。由PB设计拟合的一次方程系数可知，玉米浆干粉(CSL)与响应值呈现负相关，意味着CSL的浓度越大则目标产物的浓度越小，而且CSL因素的P值为0．263>0．05，为非显著因素，同时，JiI引J等研究结果显示，玉米浆干粉为显著因素，可能原因为甘蔗废糖蜜中含有某种有机氮源可以替代甘蔗废糖蜜，所以本实验考虑将有机氮源CSL是否能够去除，即可简化培养基组份又避免了罐体发酵过程中气泡的问题。本实验旨在研究有机氮源添加与否对目标产物的影响，探究能否通过不添加有机氮源的方式来保证发酵过程的顺利进行。采用单因．37． 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3．丁二醇素分析的方法，本实验采用摇瓶发酵的方式，在培养基不灭菌和糖蜜不进行预处理的基础上，氮源分别为不添加有机氮源、玉米浆干粉，其他组分与简化过的培养基相同；起始pH为7．0-士0．5，温度控制在370C，转速200rmp，发酵时间为50h，每个实验采用3组平行，实验结果为3组的平均值。由实验结果表2．12可以看出，不添加有机氮源和添加玉米浆干粉两目标产物的浓度差别并不是很大，因此有机氮源的添加与否并不影响目标产物的浓度，培养基中就不再进行添加有机氮源，表2．12不同发酵条件对产物产量的影响Tab．2．12Effectsofdifferentfermentationconditiofisonproductyield通过发酵条件的探索我们发现，在以后探究以甘蔗废糖蜜为底物的罐体发酵过程中，培养基的处理得到简化，甘蔗废糖蜜作为碳源不需要预处理、培养基不需要灭菌，省去大量的能耗，简化了罐体发酵的工艺流程，具有一定的应用价值；同时有机氮源在以后的罐体发酵过程中也不需要添加，使得甘蔗废糖蜜中的有效成份得到充分的利用，在一定的程度上也起到简化培养基成份的目的，在以后的罐体发酵过程中，我们只需要添加5种有效成份，分别为：a．Molasses：120g／L，Urea：8．7∥L，K2HP04：O．77g／L，Sodiumcitrate：0．3∥L，MgS04：0．9g／L。2．4．S批式发酵实验结果为了验证响应面优化后的培养基成份能否在突变菌EnterboctercloacaeDLM的作用下转化成更多的目标产物，本实验采用批式发酵方式。批式发酵实验起始甘蔗糖蜜的浓度为120g／L，其他的培养基成份分别为：尿素为8．7g／L，K2肿04为0．77g／L，柠檬酸钠0．3g／L，MgS04：0．9g／L。通气控制在O．1VVlTI，温度为37。C，pH控制在5．8，共计发酵发酵35h，图2．10．为批式发酵目标产物的实验结果。由图2．11可以看出微生物生物量在第10h时达到稳定，在以后的24h内OD都保持在20以上，说明以甘蔗糖蜜为原料进行批式发酵，菌体能够得到很好的生长，与程小龙【79】葡萄糖为底物，EnterboctercloacaeDLM生长的最大OD62嘶=27相比有所降．38． 大连理工大学硕士学位论文低，可能是由于甘蔗废糖蜜中含有大量的不利于微生物生长的成份，抑制微生物的代谢，从而抑制菌体的生长，使菌体数量有所下降，但是还是维持在一个较高的生物量范围内，说明该菌株在甘蔗糖蜜为底物的条件下可以进行生长代谢，能够达到一定的生物量水平。在12h时，2，3一丁二醇的浓度达到38．4g／L，此时乙偶姻的含量为7．2g／L，两者的总浓度为45．6g／L。12h以后随着的时间的推移，2，3．丁二醇和乙偶姻的总浓度并没有太大的变化，但是2，3．丁二醇的含量会出现降低的现象，而乙偶姻含量升高，说明随着时间的推移发酵液中2，3．丁二醇在相关酶的作用下转化成乙偶姻，此现象不易于2，3一丁二醇的生产。Fermentationtime(h)图2．11批式发酵实验结果Fig．2．11Theresultsoffedfermentation为了研究pH、溶氧(Dissolvedoxygen，DO)、氧化还原电位(Oxidoreduetionpotential，ORP)三者之间的偶联关系，分别进行两组批式实验，A组为批式发酵实验条件为：pH起始为5．8，整个批式发酵过程中pH不进行调控，T为370C，通气控制在0．1vvm，培养基成份为简化过的培养基；B组批式发酵条件为：除了pH在整个发酵过程控制在5．8左右，其余的条件都与第一组一致。所得到的实验结果如图2．12所示。氧化还原值是指溶液得失电子的能力，反映溶液得失电子的一种趋势，单位为mV，氧化还原值越高则溶液的得电子的能力越强，处于氧化状态，反之，氧化还原值．39．—J、tj—co；∞-I—c①ocoo 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3-丁二醇越低则溶液的给电子能力越强，处于还原状态，对于微生物而言，它代表微生物代谢的强弱。，_-、E△o’、工△，o、EQ、-／o、、、工QFermentationtime(h"l图2．12不同pH控制条件批式发酵pH，DO，ORP之间的关系Fig．2．12ThererationshipofpH，DOandORPindifferentbatchfermentation由2．12(A)可以看出在批式发酵过程中，对pH进行调控(pH控制在5．8左右波动)过程中，溶氧值和氧化还原电位总体呈现正相关，具体趋势为：前7h为正相关，都为下降趋势，在7h至16h维持在一个较小的范围内波动，16h到18h两者显著升高，18h后增长速度变缓。由2．12(B)为初始pH为5．8，整个发酵过程pH不进行调控，可以看出pH，DO，ORP三者之间的相关性，溶氧值和氧化还原电位总体呈现正相关，pH值与氧化还原电位密切负相关，0h至7hpH具有升高趋势，7h到13hpH值下降，13h至18h氧化还原值下降趋势，18h后氧化还原电位开始上升，在7h到18h之间虽呈现一定的趋势，但波动范围并不是很大；溶氧值在0h至7h呈下降趋势，变化比较明显，7h至18h在一定的范围内波动，18h以后呈现上升趋势，变化明显。两种pH调控方式中溶氧和氧化还原值的变化趋势情况的不同之处在于，pH恒定一40． 大连理工大学硕士学位论文情况下7h至18h时间段，氧化还原值基本无变化，保持在一个较低的水平，而pH不加调控状态下，7h至18h时间段氧化还原值呈现和pH值波动负相关的现象；整个时间段和pH并无明显的相关性。从两图可以看出pH在一定适当范围内(5．49“．74)的波动并不会对氧化还原电位的变化造成特别大的影响，因此，氧化还原电位能够近似的表征溶氧值。由图2．11和图2．12可以看出，氧化还原电位可以一定程度的反映微生物的活性和微生物的生长周期。O～2h氧化还原电位值降低缓慢，可能原因为，该时间段对应微生物的适应期，微生物从摇瓶接入罐体，有一个胞内调节适应阶段，代谢缓慢，产生的还原物较少；2～18h氧化还原电位急剧下降，下降到一定值后维持在较低水平，可能原因：此阶段对应为微生物的指数期和稳定期，微生物代谢旺盛，糖酵解产生大量的还原物；18h以后氧化还原值快速上升，可能原因为：此阶段对应微生物的衰亡期，微生物代谢缓慢，产生的还原物减少。由于目标产物产量与微生物细胞活性和微生物生长数量有一定的耦合关系，因此氧化还原电位值的大小能够影响发酵过程中目标产物的生产，氧化还原电位的控制可以控制目标产物的生产。在微生物发酵过程中产生一定的有机酸，EnterboctercloacaeDLM在发酵过程中产生的有机酸主要有甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸等，各个有机酸发酵终点的浓度分别为：1．65g／L，1．54g／L，10．54g／L，2．33g／L，4．54g／L。2．4．6批式补料发酵实验结果由批式发酵实验可以看出，响应面法优化过的培养基成份对于目标产物的提高是有效果的，至于以甘蔗糖蜜为底物，EnterboctercloacaeDLM在批式补料发酵方式下对底物的应用情况有待研究。本实验是以甘蔗糖蜜为底物，起始浓度控制在120g／L，通气量为0．1vvnl，温度控制在370C，pH控制在5．8(虽然在发酵前期pH的调控对目标产物并没有太大的影响，但随着发酵时间的延长，糖蜜原浆的补入，发酵环境的pH发生较大变化，消耗一定量的碱液，为了不影响菌体的代谢，整个批式补料发酵过程中进行pH的调控)，在发酵过程中的补加底物采用蠕动泵补料的方式，在发酵的9h、22h、35h和47h进行补料，补入的是甘蔗废糖蜜原浆。批式补料发酵过程中，微生物生物量、残糖、2，3．丁二醇、乙偶姻以及二醇含量随时间的变化趋势如图2．13。由图2．13可以看出在发酵的后期，菌体的OD都维持在20以上，与程小龙【79】以葡萄糖为底物的批式补料罐体发酵的OD相比有所降低，可能是由于糖蜜中含有不利于微生物生长代谢的物质，在该物质的作用下，菌体细胞的正常生长受到抑制，从而使微生物的生物量没达到与葡萄糖一样的水平，但是糖蜜为底物菌体OD保持在20以上，说明该菌种可以在甘蔗糖蜜为底物的条件下很好的生长。2，3．丁二醇与乙偶姻的总含量在60h是99．50g／L，此时2，3．丁二醇含量为90．82g／L，乙偶姻的浓度为8．67—4】． 甘蔗废糖蜜发酵生产2,3一丁二醇g／L。与以葡萄糖为底物【79】采用批式补料制备2，3．丁二醇的浓度110．90g／L相比降低了22．11％，原因可能有两点，首先，甘蔗糖蜜为底物菌体生物量低于葡萄糖为底物的生物量，影响了目标产物的总浓度；再者，甘蔗废糖蜜中有害成分抑制了微生物生产目标产物的能力，从而导致浓度低于葡萄糖为底物。从图2．13观察发酵液中残糖的变化趋势图，可以看出，在整个过程中，消耗的糖总共为256．2g，转化率为O．39g／g，生产强度为1．66∥(L．h)，说明甘蔗废糖蜜能够作为碳源在EnterboctercloacaeDLM的作用下，生物转化法制备2，3．丁二醇。2．S小结Fermentationtime(h)图2．13批式补料发酵实验结果Fig．2．13Theresultsoffed-batchfermentation1、本章通过Plackett—Burman实验设计、最陡爬坡实验以及Box．Behnken设计对以甘蔗糖蜜为底物的2，3．丁二醇发酵培养基进行了简化。通过Plackett．Burman实验设计，得到的培养基成份中显著的因素有三个，分别是a．Molasses、尿素、K2HP04，其中前两个为极显著因素，后一个为显著因素，a-Molasses为正相关因素，尿素和K2HP04为负相关因素；通过爬坡实验锁定三个因素的大概范围，确定的中心点组合方式为a-Molasses为115g／L，尿素为8．8g／L，K2I-IP04为0．7g／L；通过BBD实验设计，一J＼@一co；eJ_c①ocoo 大连理工大学硕士学位论文得到的培养基最优条件为：a-Molasses：118g／L，Urea：8．7g／L，CSL：2g／L，K2HP04：O．77g／L，Sodiumcitrate：0．3g／L，MgS04：0．9g／L，FeS04‘7H20：0g／L，MnS04"H20：0g／L，微量元素不需要进行添加，最后目标产物的预测值为42．42∥L。2、对于响应面优化的结果，本实验采用摇瓶发酵实验进行验证。在摇瓶验证中，对照组(2，3一丁二醇+乙偶姻)产量为28．71g／L，优化过的培养基产量为40．19g／L，目标产物浓度提高了40％。3、罐体发酵之前的培养基灭菌、糖蜜的预处理对发酵产物的产量并没有太大的影响，培养基中有机氮源的添加并不影响目标产物的浓度，所以在以后的罐体发酵过程中，培养基不再进行灭菌，甘蔗废糖蜜不进行预处理，有机氮源也不再进行添加，简化发酵工艺和培养基组份。4、罐体发酵考察了批式发酵实验和批式补料发酵实验，批式发酵实验结果为，微生物生物量在第10h时达到稳定，在以后的24h内OD都保持在20以上，在12h时，目标产物的浓度为45．6g／L；批式补料发酵实验最后得到的目标产物的浓度为99．50g／L，转化率为O．39∥g糖蜜，生产强度为1．66叭L．h)，说明可以以甘蔗糖蜜为底物用来生物法制备2，3．丁二醇。．．43．． 甘蔗废糖蜜发酵生产2,3一丁二醇3甘蔗糖蜜发酵液中色素的分离初步探究3．1前言经研究表明【611，甘蔗糖蜜发酵液中的大量天然食用色素，主要包括焦糖色素、美拉德色素、酚类色素等，具有广阔的应用空间，这些色素难以用物理、生物和化学等方法去除，且耐高温和光照，长期放置色素不会出现褪色现象12】。糖蜜发酵液的颜色之所以多呈现黑棕色，是多种色素复合的结果，这些色素主要包括甘蔗自身生长过程中形成的色素以及甘蔗糖蜜发酵过程中在微生物一系列氧化还原反应中形成的色素两种。甘蔗自身生长过程中形成的色素主要是植物色素黄酮类及酚类物质，是一种重要的色素源，成分复杂，当然还有一些高分子量的聚合物质如鞣质和单宁；发酵过程中形成的络合物及植物中的多酚发生变化形成的新色素等也是其色素的主要来源。通常情况下，甘蔗废糖蜜中的色素的回收主要采用膜分离、析出法回收色素、吸附法回收色素、浓缩渗析法和絮凝法等【681。其中吸附法回收色素是一种快速而又彻底的回收方法，但由于糖蜜中色素成份复杂，色素量较大，因此需要的吸附剂量很大，那么在应用过程中就不得不考虑吸附剂的循环使用问题，通常用到的吸附剂有活性炭和吸附树脂两种。有研究表明，在吸附制糖废蜜、精制糖废蜜或精糖洗糖蜜中色素的过程中，先用水将废糖蜜稀释，接着离心取上清液用于吸附，用树脂吸附上清液中的色素成分，采用乙醇水溶液做洗脱剂洗脱树脂中的色素，获得的洗脱液采用减压蒸发干燥的方式得到褐色粉末色素产品【6纠。甘蔗糖蜜色素在医疗和保健食品方面有着广阔的应用前景，甚至有人申请了关于提取粗糖中的糖色素作为用作化妆品的配料的专利。在传统上，色素主要采用粗糖或者黑砂糖溶解后用吸附的方法提取或者由糖质原料加工而成，因而成本很高，若能从甘蔗糖蜜或者其发酵液中提取色素，必将降低成本，有利于色素的推广应用。对于盐析萃取法分离发酵液中的2，3一丁二醇，本课题组已有良好的研究基础，并取得了一定成绩，为本课题提供了大量可借鉴经验见表1．4。从表1．4可以看出盐析萃取法可以直接的从发酵液中分离提取目标产物，目标产物的回收率在90％以上，同时又能够很好的去除发酵液中蛋白、残糖和细胞，说明盐析萃取方法不但能够实现固液分离还可以最大化的降低目标产物的损失，分离过程中使用的盐和溶剂价格低廉，操作简单，降低了下游的成本和能耗，具有较好的应用前景。尽管盐析萃取综合了盐析法和溶剂萃取的双重优点，但我们发现此盐析萃取体系大部分是以一些葡萄糖为底物或者色素成份较少的非粮原料为研究对象，所以很少考虑发酵液中色素的去除问题。本课题所用的原料甘蔗糖蜜含有大量的天然色素，很难用一般的物理和生物化学的方法去除，使得从糖蜜发酵液中获得目标产物的下游分离过程变得更加困难和复杂，对 大连理工大学硕士学位论文．于此类发酵液中分离2，3．丁二醇的较好的方法还没有报道，为了减少2，3一丁二醇的生产成本，寻找合适的方法实现目标产和天然色素的有效分离还在进一步的研究中。但是盐析萃取能否应用于在保证较高目标产物回收率和杂质去除率的基础上，有效的去除目标产物中的色素成份，因此，寻找合适的盐析萃取分离方法实现甘蔗糖蜜发酵液中的目标产物和天然色素的有效分离，具有很大的现实意义，成为本课题研究的内容之一。本章的色素分离部分，采用的是吸附法提取天然色素，研究了D．101型树脂的吸附容量，静态解吸洗脱液的浓度和体积，对甘蔗废糖蜜发酵液中天然色素的吸附和回收进行初步的探究。3．2实验材料和仪器3．2．1实验材料发酵液：以甘蔗废糖蜜为底物获得的发酵液，本实验是选取两步盐析萃取分离的第一步盐析萃取的下相溶液为研究对象，以下简称下相溶液。本章用过的实验试剂见表3．1。表3．1实验主要生化试剂Tab．3．1Thebiochemicalregentmainlyused3．2．2实验仪器本章用过的实验仪器见表3．2．。 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3-丁二醇表3．2实验仪器和设备Tab．3．2Instrumentsandequipmentsfortheexperiment3．3实验方法3．3．1两步盐析萃取体系取一定体积的发酵液，加入一定质量的无机盐，混合均匀，再加入等体积的有机溶剂，漩涡混匀器混匀1min，静置分相，记录上下体积，分别取样分析上、下相中2，3一丁二醇的浓度。计算相比R，分配系数K，回收率Y。分配系数(K)计算公式如下：／1忙_tFt(1)其中，C。、Cb分别是上、相比(R)计算公式如下：R--堡圪下相2，3．丁二醇和乙偶姻的质量浓度(g／L)(2)其中，V。、Vb分别是上、下相体积(mL)回收率(Y)计算公式如下：降竺(3)1+兄矿色素的分配系数Kc：色素在上下相的分配系数色素的去除率Rc：色素在上相的去除率本节实验用的发酵液是以糖蜜为底物发酵得到，发酵液经过12000rpm，10min离心处理得到发酵液上清液备用。在本节的两步盐析萃取实验采用如下方案来进行实验：发酵液按照24％乙醇／25％磷酸氢二钾(w／w)比例加入磷酸氢二钾和乙醇混匀， 大连理工大学硕士学位论文8000rpm，10min离心去除菌体和杂质，静置分相；取上相旋蒸蒸出乙醇得浓缩液，浓缩液按照0．6g／mL磷酸氢二钾和等体积乙酸乙酯加磷酸氢二钾和乙酸乙酯，混匀，静置分相。3．3．2大孔吸附树脂的预处理用95％的乙醇溶液1：2(V／V)浸泡，隔夜放置，用清水冲洗至无酒精；再用5％HCI(V／V)溶液浸泡3h，然后用清水冲洗至中性；接着用5％的氢氧化钠浸泡3h，最后用清水冲洗至中性，此时获得的大孔吸附树脂保存备用。3-3．3大孔吸附树脂吸附容量的确定有关研究表明【61】D．101型大孔吸附树脂对甘蔗废糖蜜发酵液中色素吸附效果较好，本实验所用的大孔吸附树脂为D一101型大孔吸附树脂。本实验是采用甘蔗废糖蜜发酵液为研究对象，在第一步的盐析萃取技术中，目标产物大量聚集在上相，上相会取出用于第二步盐析萃取，取第一步盐析萃取的下相溶液来探究大孔吸附树脂对甘蔗废糖蜜中色素的分离效果。有关研究表明【611，大孔吸附树脂D一101在吸附甘蔗汁酒精废液时，采用的pH为7．O，温度为500C，并且证明废液中的色素在该温度pH条件下具有很强的稳定性，本实验所选择的温度为500C，pH控制在7．0。选择3g／20mL发酵液，4g／20mL，5g／20mL，6g／20mL，7g／20mL下相溶液为研究对象，测定不同时间混合液在420n．tn处的吸光度，以OD420姗值为纵轴，以时间为横轴，绘制图表，选择最佳吸附容量。3．3．4静态解吸剂浓度的选择选择10％，20％，30％，40％，50％的乙醇水溶液为解吸剂，采用静态解吸的洗脱模式。定时测定洗脱液420nlll处的OD值，以OD420啪值为纵坐标，以时间为横坐标作图，选择最佳乙醇水溶液的浓度。3．3．5静态解吸剂体积的选择以上一步实验所选定的乙醇溶液浓度为实验条件，选择5mL／g树脂，10mL／g树脂，15mL／g树脂，20mL／g树脂进行实验，乙醇溶液为解吸剂。定时测定洗脱液420nrll处的吸光值值，以OD420咖值为纵坐标，以时间为横坐标作图，选择最佳乙醇水溶液的体积。 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3-丁二醇3．4实验结果与分析3．4．1两步盐析萃取体系考虑到糖蜜发酵液中色素含量较高，以往的盐析萃取并没有考虑发酵液中大量色素的去除问题，本节实验对糖蜜发酵液中目标产物和色素的分离做了初步尝试，试着寻找一种两步盐析萃取体系实现发酵液中目标产物的分离。为了能够有效的分离发酵液中的目标产物和天然色素，同时避免多步盐析萃取过程中目标产物的损失，我们需要选择目标产物在醇相中分配系数较大和目标产物回收率较高的体系，江波【57】等采用24％乙醇／25％磷酸氢二钾体系分离葡萄糖发酵液中2，3。丁二醇，目标产物的分配系数为28．3，回收率为98．1％，目标产物分离效果较好，所以本课题第一步盐析萃取体系采用24％乙醇／25％磷酸氢二钾体系；由于第一步盐析萃取体系获得的2，3．丁二醇中含有大量的色素，所以第二步盐析萃取需要考虑色素的去除问题，刘春娇等(文章待发表)研究了疏水性有机溶剂对色素的去除效果，研究表明，色素的去除率在95％以上，本课题以此为参考，选用0．6g／mL磷酸氢二钾和等体积乙酸乙酯的体系，该体系具有较好的色素分离效果。结果表明，第一步盐析萃取对色素的去除并没有明显效果，两相颜色相近，只有仔细分辨才能观察到两相的界面，第二步盐析萃取色素去除率为89．57％。发酵液颜色为黑褐色溶液，两步盐析萃取后获得的产品经减压浓缩蒸馏得到的粗产品颜色为浅粉色物质，盐析萃取分离前后颜色差别较大。经两步盐析萃取和检验蒸馏，2，3．丁二醇的总回收率为51．9％(本课题只是初步考察该体系对发酵液中的色素去除效果，至于提高目标产物回收率还需要进一步优化萃取体系)，得到的目标产物经GC分析可得，产品中2，3．丁二醇为80．2％，乙偶姻为9．8％。该体系能够用于糖蜜发酵液中目标产物和色素的分离，但是在回收率和每步的色素去除率上还有待进一步的优化研究。3．4．2大孔吸附树脂D．101吸附容量大孔吸附树脂的吸附容量实验结果见图3．1．。由图3．1可以看出，在25min内，第一步盐析萃取的下相溶液经过大孔树脂D．101的吸附基本达到平衡状态，其吸光光‘度值都有所下降。其中，3g／20ml在15min时就基本达到平衡状态，15min以后在420nln处的吸光光度值变化趋势不明显，5∥20ml、6g／20ml、7g／20ml三组的对色素的吸附能力相差并不是很大，25min时5g／20ml组吸光光度值下降了69．06％，吸附效果大于3g／20ml、4g／20ml两组，考虑到大孔吸附树脂的循环再利用和色素的回收成本问题，本实验选择5g／20ml的吸附容量用于天然色素的提取。 大连理工大学硕士学位论文Time(h)图3．1大孔吸附树脂D．101的吸附容量Fig．3．1AsorptioncapacityofmacroporousresinD·1013．4．3大孔树脂解吸剂浓度的确定大孔树脂洗脱液解吸浓度见图3．2．。Time(h)图3．2乙醇浓度对大孔吸附树脂D．101解吸效果的影响Fig．3．2EffectsofethanolconcentrationsondesorptionofmaeroporousresinD-101—．49．-Ⅲu0N，Qo 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3一丁二醇由图3．2可以看出，用不同浓度的乙醇溶液作洗脱溶剂解吸含有色素的树脂，35min时均可达到洗脱平衡状态，10％和20％的乙醇溶液在10min左右即达到平衡状态，10min以后，溶液在420nnl处的吸光光度值几乎不发生变化。洗脱时间5min以后，20％乙醇溶液对于特定的吸附一脱附体系有最佳的解吸效果，420m处的吸光光度值也最大。因此本实验选择20％乙醇水溶液作为最佳洗脱溶剂，用于下一步的回收色素，在该条件下能够实现色素的快速和彻底解吸。3．4．4大孑L树脂解吸剂体积的确定由图3．3可知，5mL，10mL，15mL乙醇溶液时，无论是平衡时间还是最大吸光值都相差不大，洗脱体积为20mL时，洗脱平衡时间延长，洗脱平衡后最大吸光值略低于前三个，考虑到乙醇成本及色素彻底回收等问题，本实验选择10mL、20％7,醇儋树脂对此体系进行静态解吸。Time(h)图3．3乙醇溶液体积对大孔吸附树脂D．101解吸效果的影响Fig．3．3EffectsofethanolvolumesOildesorptionofthemacroporousresinD．1013．4．5大孔树脂吸附前后色值及色素解吸效果由表3．3可以看出，经过大孔吸附树脂D一101的脱色处理，第一步盐析萃取的下相溶液在420nnl处的吸光光度值大幅度下降，色值下降了72．02％，即下相溶液中色素的提取率达到72．02％，说明了大孔吸附树脂D．101对下相溶液中的天然色素有很好的吸附效果，能够达到较好的色素分离效果，为下一步的天然色素的回收提供了一定一50·仃伯12¨侣侄”竹98765432 大连理工大学硕士学位论文的条件。通过10ml、20％乙醇／g树脂对色素进行静态解吸回收，结果表明色素回收率为65．33％，进一步通过动态洗脱的方式探究色素的回收，提高回收率有待进一步研究。3．S小结1、两步盐析萃取法能很好的实现发酵液中色素和目标产物的分离，两步盐析萃取后获得的产品经GC分析可得，产品中2，3．丁二醇为80．2％，乙偶姻为9．8％。2、在pH为7．0；温度为500C的条件下，研究大孔吸附树脂D．101的吸附容量，为了简化后续实验的操作步骤，降低甘蔗糖蜜发酵液中色素的分离成本，达到较好的天然色素吸附效果，大孔树脂的吸附容量为25g／100ml，色素吸附率为71．02％；3、通过对大孔吸附树脂D．101解吸条件的研究，以洗脱液的OD420姗为参考标准，降低分离提取色素的成本，解吸条件为：每克树脂使用洗脱剂20％乙醇溶液lOml，色素回收率为61．33％。一S1- 甘蔗废糖蜜发酵生产2，3．丁二醇结论本论文得到的结论如下：1、通过PB设计实验，筛选出3个对目标产物产量影响显著的因素，分别为a．Molasses,尿素和磷酸氢二钾，其中前两个因素为极显著因素，后一个为显著因素，只有a．Molasses与产物的产量呈正相关，余下的两个为负相关。在PB实验的基础上进行最陡爬坡实验，确定3个显著因素浓度的大概浓度范围；最后进行BBD实验，确定培养基组成。采用多重分析的方法分析实验数据，二次拟合方程的回归系数R2-0．9822，模型拟合良好，最后经回归拟合方程得到的培养基组份为：a-Molasses：118∥L，Urea．-8．7∥L，CSL：2g／L，K2HP04：0．77g／L，Sodiumcitrate：O．3g／L，MgS04：0．9g／L，FeS04．7H20：0g／L，MnS04-H20：0g／L。对于响应面优化的结果，本实验采用摇瓶发酵实验进行验证。在摇瓶验证中，对照组(2，3．丁二醇+乙偶姻)产量为28．7l∥L，优化过的培养基产量为40．19∥L，目标产物浓度提高了40％。3、摇瓶实验表明培养基不灭菌、糖蜜不预处理、培养基中不添加有机氮源对发酵产物的产量并没有太大的影响，确定配制培养基时糖蜜不预处理、不添加有机氮源，培养基不再进行灭菌。4、在5L发酵罐中进行批式发酵，生物量在第10h时达到最高，在以后的24h内OD都保持在20以上，在12h时目标产物的浓度为45．6g／L；批式补料发酵60h，目标产物的浓度为99．50g／L，转化率为0．39g／g糖蜜，生产强度为1．66g／(L．h)。5、两步盐析萃取法可实现发酵液中色素和目标产物的分离，两步盐析萃取后获得的粗产品经GC分析，其中2，3．丁二醇为80．2％，乙偶姻为9．8％。6、采用大孔树脂吸附的方法回收第一步盐析萃取下相溶液中的色素，在pH为7．0、温度500C的条件下大孔树脂的吸附容量为25g／100ml，色素吸附率为71．02％；解吸条件为：每克树脂使用洗脱剂20％乙醇溶液10ml，色素回收率为61．33％。．．52．． 大连理工大学硕士学位论文展望1、甘蔗废糖蜜成分丰富，是很宝贵的资源，既含有利于微生物利用的成份，又含有抑制菌体生长的成份。虽然EnterboctercloacaeDLM能够很好的利用甘蔗废糖蜜为碳源，但是其他成分的开发利用有待研究；糖蜜中抑制菌体生长的机制尚不清楚。2、本课题只是粗略的测定了发酵过程中氧化还原电位值，如通过控制发酵过程中的氧化还原电位来调控目标产物的生产还有待进一步的研究。3、本课题在研究大孔树脂吸附吸附色素和乙醇溶液洗脱回收色素时全部采用的是单因素的方法，具体的条件优化还有待研究。．．53．． 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大连理工大学硕士学位论文攻读硕士期间发表论文情况1．ZHAOPan，CHENGXiao—long，DAIJian-ying，XIUZhi-long．Simplifiedproductionof2，3-butanediolfi"omsugarcanemolasses．NetworkjournalofgraduateschoolofDUT．(硕士论文的第二章)．．59．- 致谢本论文从最开始课题的选择、方案的确定到论文的顺利完成都是在戴老师的精心指导下完成的。戴建英老师为人和善，科研态度严谨，为人正直，每次与戴老师的交流都使我受益匪浅，是我以后工作和学习的榜样。本课题是基于制糖工业副产物甘蔗废糖蜜的综合利用，甘蔗糖蜜成分复杂，有些杂质不利于微生物的生长。在实验过程中，戴老师多次为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，在实验遇到困难的时候给予热忱的鼓励，帮助我战胜科研中的困难，顺利完成论文的撰写，在此，向戴老师表示衷．心的感谢!本课题工作还得到了生物转化与分离课题组其他老师的大力支持。感谢修志龙老师、董悦生老师、李晓晖老师、孙亚琴老师、滕虎老师、牟英老师、胡婧婧老师在论文工作中给予的无私帮助，感谢张代佳老师在仪器设备维护等方面提供的帮助，你们为人师表的风范令我敬仰，严谨治学的态度令我敬佩。感谢多年以来课题组全体成员的帮助和支持。感谢张华师姐、王旭东师兄、刘文财师兄、郑伟龙师兄、刘丽娜、曹文静、张博崴、郭禹锡、孙文龙、刘春娇、程玲、王燕云、康凯、鄢凌、马林会、秦超等在课题研究及论文撰写过程中提供的帮助，使课题和论文工作得以顺利完成；感谢王诗淼师姐、杨娟、黄美玲、王丽等在生活和学习上给予的鼓励和帮助，与你们朝夕相处，共同成长，使我度过了一个愉快而又难忘的研究生生涯。另外，感谢我的家人及大连理工大学为我提供的良好学习环境，尤其是父母为我营造温馨的家庭环境，使我从小养成了良好的学习习惯和乐观向上的生活态度，对我的人生影响颇深；另外，母校为我提供了一个宽阔的学习平台，让我不断汲取新知，充实自己，受益匪浅。最后，祝愿本课题组的所有老师及同学身体健康，在科研领域屡创佳绩，捷报频传。 大连理工大学硕士学位论文大连理工大学学位论文版权使用授权书本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。学位论文题目：馏蔫、整谚嶝莨蘸时z哆’了二蕊作者签名：导师签名：趑闺兮日期：竺!笙年—鱼月上互E1日期：型f娑年』月止日