代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响 59页

山东农业大学硕士学位论文代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响姓名：李成成申请学位级别：硕士专业：动物营养与饲料科学指导教师：杨维仁20120614 山东农业大学硕士学位论文中文摘要饲料中的蛋白质供应对意大利蜜蜂的生长发育有重要意义。本研究旨在探讨代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段的生长发育指标及相关基因表达的影响：并在此基础上设定不同蛋白水平的代用花粉进行蜂群的大田试验(生产群状态)，且与天然花粉进行比较，探明了大田状态下意大利蜜蜂幼虫期和成蜂期的适宜蛋白质供给量，为意大利蜜蜂饲养标准的制定及代用花粉的配制提供理论支持。代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂生长发育的影响及影响工蜂寿命机理的研究。选用健康无病和蜂王繁育力一致的本地意大利蜜蜂15试验群，随机分为3组(每组5个重复，每个重复1群蜂)，分别饲喂低(15％)、中(25％)、高(35％)三种蛋白水平的代用花粉。研究了高、中、低三个代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段体重增长、体蛋白含量及与表皮发育相关基因_p阳P0基因表达的影响，且研究了幼虫期摄取不同蛋白水平代用花粉对羽化后工蜂存活率的影响，并对意大利蜜蜂各发育阶段体内抗氧化酶基因的ingNA表达量进行了测定。试验结果表明：(1)代用花粉蛋白水平显著影响了5日龄幼虫体重(尸<0．05)和0日龄工蜂(初生蜂)体重(尸<0．05)，且低蛋白水平(15％)代用花粉组蜜蜂个体体重显著低于高中蛋白水平组(P<0．05)。(2)代用花粉蛋白水平‘≮显著影响了幼虫、蛹和成蜂的体蛋白含量(P<0．05)，且均以低蛋白水平(15％)代用花粉组蜜蜂个体体蛋白含量最低(尸<0．05)，且工蜂在羽化后，前7天摄取的蛋白主要用于咽下腺的发育，血淋巴蛋白含量相对较低。(3)幼虫期取食了低蛋白水平(15％)，代用花粉的工蜂，在其各个发育阶段体内的的Cu／ZnSod，MnSod，C缸和Gst-1四种主要抗氧化酶基因的表达量均较低(P0．05)Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeshsignificantlydifferent(尸<0．05)．Valueswiths锄rleletl盯ornolettermeannosignificantdifference(P>O．05)．3．2代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂不同发育阶段体重的影响代用花粉蛋白水平对幼虫期、蛹期和成蜂期蜜蜂个体体重的影响见表10。由表10可以看出，代用花粉蛋白水平对幼虫、蛹以及羽化后工蜂的体重均有影响，且随着蛋白水平的升高，蜜蜂体重显著增加或表现出增加的趋势。幼虫期，蛋白水平显著影响5日龄幼虫体重(P0．05)，饲喂HP的幼虫体重显著高于饲喂LP的幼虫体重，饲喂MP的幼虫体重处于中间水平。蛹期，蛋白水平对9日龄蛹体重有显著影响(P0．05)，蜜蜂蛹体重以LP组最低，且显著低于HP组。成蜂期，蛋白水平显著影响了0日龄(初生蜂)和12日龄工蜂体重(P0．05)。‘．由此可见，蛋白水平较低的代用花粉限制了意大利蜜蜂个体体重的增长，无论是幼虫期、蛹期还是成蜂期，蛋白水平为25％或35％时，蜜蜂个体体重增长较快。表10蛋白水平对不同发育阶段蜂体重1的影响(rag)Table10EffectsofCPlevelOnaveragebodyweightofbeesofdifi"erentages。每一时期每试验箱中取15只蜜蜂个体，5只放于已知重量离心管中，取3次的平均值。：t15individualsWerecollectedfromeachcolonyateachtimepoint．FiveindividualsWCI"eweighedaeoumtely．ThesameprocedurewasrepeatedthriceandtheaveragevaluesWerereported．¨同行不同小写字母表示差异显著(尸0．05)．Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(尸<0．05)．Valueswithsameletterornolettermeanriosignificantdifference(P>0．05)．19 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响，一、∞E、-，_毛。舀≥1lⅢ|l蛙160140"20L4L5L6P3P6P9W0W4W7W12日龄Age图1意大利蜜蜂体重随日龄变化曲线FigurelTheweightofindividualinthedynamicchangesovertime图1为意大利蜜蜂体重随蜜蜂日龄的变化曲线。由图l可以看出，从幼虫期第4天到幼虫期第6天，蜜蜂幼虫的体重呈现急剧增长的状态；蛹期体重基本保持不变；刚羽化出房时，蜜蜂体重开始下降，从羽化后第4天到第12天，体重呈现先逐渐升高，随后又下降的现象。3．3代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂不同发育阶段体内总蛋白含量的影响代用花粉蛋白水平对不同发育阶段蜂体总蛋白含量的影响见表ll。表中数据表明，除12日龄工蜂外，蛋白水平对所测定时期的蜂体总蛋白含量具有显著的影响(PO．05)，对其他测定时期的蛹和工蜂的总蛋白质含量均有显著影响(尸<0．05)，且均表现为HP组的蜂体总蛋白含量最高，MP组次之，LP组最低，且HP组显著高于LP组。由以上分析可知，代用花粉蛋白水平较低时严重影响了蜂体的总蛋白含量，且幼虫期的需要的蛋白水平较高，蛋白含量在35％时，幼虫体蛋白含量最高；蛹期和成蜂期需要的蛋白水平稍低，蛋白质含量为25％以上时，蜂体内的蛋白含量较高。盯∞加。 山东农业大学硕士学位论文表ll蛋白水平对不同发育阶段蜂体总蛋白含量‘的影响emg，g)Tablel1EffectsofCPlevelonaverageproteincontentofbeesofdifferentages项目ItemLPMPHP1每试验箱中取lO只蜜蜂个体作为一个样本进行蜂体总蛋白含量的测定10individualsfromeachcolonywereusedforproteinconcentrationanalysis．¨同行不同小写字母表示差异显著(尸<0．05)，相同字母或不标表示差异不显著(JP>0．05)．Inthesalverow,valueswithdifferentlowercaseletterITl屺ansignificantlydifferent(PO．05)．180L4L5L6P3P6P9W0W4W7W12日龄Age图2意大利蜜蜂体蛋白含量随日龄的变化曲线Figure2Thebodyproteincontentinthedynamicchangesovertime∞加∞加一∞葡g一苫Q苫oQ口趸2乱苦o∞蛳如皿嗵趁鹫粕 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响图2为意大利蜜蜂体蛋白含量随蜜蜂日龄的变化曲线。由图2可以看出，从幼虫期第4天到幼虫期第6天，幼虫体蛋白逐步积累，呈逐渐升高趋势；蛹期体蛋白含量逐渐下降，直至羽化为新蜂时，蜂体蛋白含量降至最低；从羽化后到第12天，蜜蜂体蛋白含量呈逐渐增加的变化趋势。3．4代用花粉蛋白水平对哺育蜂血淋巴蛋白含量、咽下腺蛋白含量的影响代用花粉蛋白水平对4、7及12日龄工蜂(哺育蜂，O—12日龄成蜂)血淋巴和咽下腺蛋白含量的影响见图3。图3数据显示，代用花粉蛋白水平均显著影响4日龄、7日龄和12日龄哺育蜂血淋巴蛋白含量(尸0．05)。对7日龄和12日龄哺育蜂，增加代用花粉的蛋白水平显著提高了哺育蜂咽下腺蛋白质含量，均表现为MP组和HP组的咽下腺蛋白含量显著高于LP组(P<0．05)。12日龄哺育蜂血淋巴蛋白含量以MP组和HP组显著高于LP组(尸<0．05)，但代用花粉蛋白水平对7日龄哺育蜂的血淋巴蛋白含量影响不显著，但MP和HP组从数值上高于LP组(P=0．05)。另外，随着工蜂日龄的增长(4日龄．12日龄)，工蜂血淋巴蛋白含量呈现升高的趋势，而工蜂咽下腺蛋白含量为下降的变化规律。·以上分析可见，当代用花粉蛋白水平为25％或35％时，哺育蜂可以维持相对较高的血淋巴和咽下腺蛋白含量；工蜂羽化后的第4天到第12天，体内血淋巴蛋白含量和咽下腺蛋白质含量随工蜂日龄增长呈现相反的变化规律。 山东农业大学硕士学位论文Ⅵ盯W12日龄AgeofworkerW4VV7W12日龄Ageofworker图3代用花粉蛋白水平对哺育蜂血淋巴蛋白含量和咽下腺蛋白含量的影响Figure3EffectsofCPlevelonhemolymphproteinandhypopharyngealglandprotein3．5代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂proPO基因表达量影晌代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂不同发育阶段体内proPO基因rnRNA表达量的影响见图4。由图4可以看出，代用花粉的蛋白水平对6日龄蛹和12日龄工蜂的proPO基因mRNA表达量无显著影响(P>0．05)；但可以显著影响O日龄工蜂(初生蜂)体内proPO基因mRNA表达量(尸<0．05)，且随着代用花粉蛋白水平的升高，蜂体proPO 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响基因mRNA表达量逐渐增加，以LP组最低，HP组最高，MP组处于中间水平，且HP组显著高于LP组(P<0．05)。’"412o>旦，0t-o蛔＆8蝈答鬟薹6罂笔爹4葛Ug’P6W0W12日龄Age图4代用花粉蛋白水平对不同发育阶段蜂体proPOItfl对表达量的影响Figure4EffectofCPlevelonproPOmRNAexpressionlevel3．6幼虫期蛋白质营养对羽化后工蜂存活率的影响幼虫期取食不同蛋白水平的代用花粉对羽化出房后工蜂存活率的影响见图5。从图5可见，即使羽化后工蜂统一取食相同的饲料，·幼虫期摄取的蛋白质营养水平仍可以显著影响其羽化后工蜂的存活率(尸邑。重篓蚤始垂oo-0510"52025303540时间Daynumber(daysafteremergence)图5幼虫期蛋白质营养水平对工蜂存活率的影响(前35天)Figure5EffectofCPlevelonworkersurvivalduringthefirst35days3．7代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂体内抗氧化酶基因表达量影响代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂不同发育阶段体内4种抗氧化酶基因mRNA表达量的影响见图6。由图6可以看出，除Cu／ZnSod在6日龄蛹中的mRNA表达量未受到代用花粉蛋白水平的显著影响外(尸>O．05)，抗氧化酶基因的mRNA表达量均受代用花粉蛋白水平的显著影响(尸<0．05)。Cu／ZnSod的mRNA表达量，在L5和W0期均受到代用花粉蛋白水平的显著影响(尸<0．05)。饲喂LP的幼虫的Cu／ZnSod的mRNA表达量显著低于饲喂MP和HP的幼虫的该基因mRNA表达量(P<0．05)；饲喂LP的初生蜂的Cu／ZnSod的mRNA表达量显著低于HP组(P<0．05)，数值上低于MP组，但差异不显著(P>0．05)。MnSod的mRNA表达量，在L5、P6和W0时期均受到代用花粉蛋白水平的显著影响(尸0．05)；LP组的初生蜂的MnSod的mRNA表达量显著低于MP组和HP组(尸<0．05)。Cat的mRNA表达量，在L5、P6和W0时期均受到代用花粉蛋白水平的显著影响(尸0．05)。Gst．，的mRNA表达量，在L5、P6和W0时期均受到代用花粉蛋白水平的显著影响(P<0．05)。LP组的幼虫和蛹的Gst—J的mRNA表达量均显著低于HP组(P<0．05)，数值上低于MP组，但差异不显著(尸>0．05)；LP组的初生蜂的Gst-1的mRNA表达量显著低于MP组和HP组(尸<0．05)。对以上结果综合分析可得，低蛋白水平的代用花粉不利于蜜蜂体内该4种抗氧化酶基因的表达。无论是5日龄幼虫、6日龄蛹还是初生蜂，当取食的代用花粉蛋白水平为15％时均下调了检测基因的表达；当蛋白水平为25％或35％时，抗氧化酶基因的表达量较高。另外，除Cat外，其他3种抗氧化酶基因的表达均表现出时间特异性，即在蛹期的表达量偏低。LpMPHPLPMPHPLPMPHPLPMIP11PLPMPliPLPMPHPLPMPlipLPMPXPLIPMIPliPLPMPitPLPMPlipLPMPliPL5P6W0LSP6W0图6代用花粉蛋白水平对不同发育阶段蜜蜂体内抗氧化酶基因表达量的影响Figure6EffectsofCPlevelOilantioxidantgenemRNAexpressionlevel‘●2●‘●2●¨吣¨百誊Ino一翳￡dx-《吾昌-吾三￡_且u‘●2OI‘●2OLIlOnO一。}u一口。一臻￡ax_《丕暑。七；冒．IQ^豸皇NXG●‘ZOl‘2O¨“¨"¨奄誊IlIo一§dxo《，盈暑警譬t～‘g”“抽¨n¨一p≯u一口。一窃=直并o《Z蓝暑p^I等墨．1oo∞皇夏 山东农业大学硕士学位论文3．8大田状态下花粉或代用花粉取食量及其蛋白质消化程度饲料蛋白水平对蜂群代用花粉取食量、蛋白质摄入量和工蜂中肠蛋白酶活性的影响见表12。由表中数据可以看出，花粉的取食量最高(P<0．05)，可见花粉的适口性优于代用花粉；就蛋白摄入量而言，饲料蛋白水平对其具有显著影响(P<0．05)：7日龄工蜂中肠中的蛋白酶活性也受到饲料蛋白水平的显著影响(尸0．05)，即代用花粉之间的取食量差异不大，数值上以PSl5组的取食量稍高于其他代用花粉组。就蛋白质摄入量而言，各组之间存在显著差异(P<0．05)，以PS35组最高，PS30组和花粉组次之，再者为PS25组，然后为PS20组，以PSl5组最低。．以7日龄工蜂体内的蛋白酶活性而言，PS35组和PS30组的蛋白酶活性最高，且显著高于PS25、PS20、PSl5和花粉组(P<0．05)，但此四组之间差异不显著(P>0．05)；对代用花粉组，工蜂中肠蛋白酶活性随着蛋白水平的增加而线性显著增加(P<0．05)。由以上结果分析可得，花粉的适口性优于代用花粉，代用花粉之间彼此取食量没有明显差异，但有低蛋白组取食量偏高的变化趋势：即使花粉组的饲料取食量最高，但其蛋白质的摄入量和中肠蛋白酶活性却稍次于PS35组和PS30组，可见单纯的高饲料取食量并不代表较高的饲料蛋白利用量。，表12蛋白水平对饲料取食量、蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响Table12Effectsofdietarycrudeproteinlevelondietconsumption(air-drybasis),proteinintakeandmidgutproteolyticenzymeactivityofb∞s．项目ItemControlPSl5PS20PS25PS30PvaluePS35(1inear)诃料取食量(g，I-触m引127．43士2．“·109．3钍5．6lb104．90士6．04。105．62±7．1l。103．42士8．6lb102．93+4．80b0．1lDietconsumption蛋白质摄入量(g／i．frame)29．37+0．61b16．64-0．85。21．154-1．22426．774-1．80。31．IO"J：2．59“35．97±1．68‘<0．0lProteinintake·中肠蛋白酶活性(U／midgut)28．7l士4．69b26．27*6．21o30．31-4-4．59b31．245+2．23b39．1254-7．Ol‘45．17：1：5．80。<0．OlProteolyticenzymeactivity”。同行不同小写字母表示差异显著(JP<0．05)，相同字母或不标表示差异不显著(尸>O．05)Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(尸<0．05)．Valueswith,袋lnleletteror110lettermeanilosignificantdifference(P>0．05)．27 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响3．9大田状态下饲料蛋白水平对蜂群群势的影响饲料蛋白水平对蜂群群势的影响见表13。表13中数据显示，试验期间，蜂群群势总●体表现为先上升后下降的规律，且代用花粉的蛋白水平显著影响第11天的蜂群群势。第lI天的蜂群群势随饲料中蛋白水平的升高而显著升高(P<0．05)，PS30组蜂群群势与花粉组群势相当，但显著高于PSl5和PS20组；第22、33天的蜂群群势均开始下降，但各组之间差异不显著(尸>0．05)。33d试验结束时，最终群势以PSl5组最差，花粉组处于中间水平，PS30组和PS35组稍高，但彼此之间无显著差异(P>0．05)。可见，饲喂高蛋白水平的代用花粉，可一定程度上减缓秋后蜂群群势的下降。表13蛋白水平对蜂群群势的影响Table13EffectsofdietaryCPlevelonpopulationofbeecolony山同行不同小写字母表示差异显著(JP<0．05)，相同字母或不标表示差异不显著(JP>0．05)Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(尸<0．05)．Valueswith$amcletterornolettermeannosignificantdifference(尸>0．05)．3．10大田状态下饲料蛋白水平对蜂卵孵化率和幼虫化蛹率的影响饲料蛋白水平对蜂卵孵化率及幼虫化蛹率的影响见表14。表14中数据表明，代用花粉的蛋白水平对蜂卵孵化率和幼虫的化蛹率均有显著的影响(尸0．05)。 山东农业大学硕士学位论文幼虫化蛹率表现出与蜂卵孵化率相似的变化规律，PS35组的幼虫化蛹率与花粉组相当，但显著高于PSl5组(尸<0．05)。由以上分析可知，随着代用花粉蛋白水平的升高，蜂卵孵化率和幼虫的化蛹率均显著升高，且在本试验范围内，当蛋白水平为35％时，最有利于蜂卵的孵化和幼虫的顺利化蛹。表14蛋白水平对蜂卵孵化率及幼虫化蛹率的影响TableI4EffectsofdietaryCPlevelonpcra舶tageegghatch鲫dpupation讪同行不同小写字母表示差异显著(户<0．05)，相同字母或不标表示差异不显著(尸>0．05)IntIIcsamemW"vaIueswitIIdifferentIowercaseleRerme柚significantlydiff㈣t(P<0．05)．V甜u嚣withflal,lleIe“盯ornoleRermewnosignific鲫tdiffer沁沪>0．05)．3．1l大田状态下饲料蛋白水平对4日龄幼虫体重、体蛋白含量及抗氧化能力的影响饲料蛋白水平对4日龄幼虫体重、体蛋白含量及抗氧化活性的影响见表15。由表15可以看出，随着代用花粉蛋白水平的提高，幼虫体重、体蛋白含量及体内MDA含量随之出现显著变化(P<0．05)，T-SOD活性变化不显著(P>O．05)；花粉组该4项指标均处于中间水平。●幼虫体重以PS30组最高，显著高于PSl5组(P<0．05)，花粉组、PS20组、PS25组和PS35组均处于中间水平，彼此之间差异不显著(，>0．05)。幼虫体蛋白含量以PS30组最高，且显著高于花粉组、PSl5组和PS20组(尸O．05)，因此蛋白水平30％组比花粉组更能满足工蜂幼虫发育阶段对蛋白质的需要，更适合幼虫的生长发育。幼虫虫体T-SOD活性在各处理组之间未表现出显著差异(尸>O．05)；MDA含量的变化表现为PS25组、PS30组和PS35组的MDA含量与花粉组的相当，且前三组均显著低于PSl5组和PS20组(尸0．05)Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaseletterme,allsignificantlydifferent(P<0．05)．ValueswithsameletterOrnolettermeanflosignificantdiffcrcnoB俨>0．05)．3．12大田状态下饲料蛋白水平对初生蜂体重、体蛋白含量及抗氧化能力的影响饲料蛋白水平对初生蜂体重、体蛋白含量及抗氧化能力的影响见表16。由表16可以看出，随着代用花粉蛋白水平的提高，初生蜂体重、体蛋白含量及体内MDA含量随之出现显著变化(尸O．05)；花粉组该4项指标均处于中间水平，且数值上与PS20组或PS25组相当，但差异不显著(P>0．05)。初生蜂体重以PS30组最高，显著高于PSl5组(户<0．05)，花粉组、PS20组、PS25组和PS35组均处于中间水平，彼此之间差异不显著(尸>0．05)。初生蜂体蛋白含量以PS30组和PS35组最高，且显著高于PSl5(尸<0．05)，其它各组之间差异不显著(P>O．05)，因此蛋白水平为30％或35％时，更适合初生蜂的生长 山东农业大学硕士学位论文发育。幼虫虫体T-SOD活性在各处理组之间未表现出显著差异(尸>0．05)；初生蜂体内的丙二醛含量随代用花粉蛋白水平的升高而降低，PS25组、PS30组和PS35组的MDA含量数值上稍低于花粉组和PS20组(尸>0．05)，但显著低于PSl5组(尸0．05)。综合分析表明，代用花粉蛋白水平为30％或35％时，初生蜂体重、体蛋白含量和抗氧化能力均优于花粉组和其它代用花粉组，且适当提高代用花粉的蛋白水平，可显著提高初生蜂体重、体蛋白含量，降低体内的丙二醛含量。表16蛋白水平对初生蜂体重、体蛋白含量及抗氧化活性的影响Table16EffectsofdietaryCPlevelsonweight,proteincontentandantioxidantstatusofnewlyeme唱edworker项目ItemControIPSl5PS20PS25PS30PS35Pvalue(1inear)体重(mg)Weight体蛋白含量(mg／g)Proteincontent10734士8．69出105．41士10．00“106．46士0．57曲108．80-士7．07曲115．5l士3．47。109．79±4．38ab’0．0580．69d：6．93曲77．13．4-7．52b81．07：1：12．15曲86．05士16．16曲94．98-士8．92。93．37+12．64‘0．05)Inthesamerow,valueswithdifferentlowercaselettermeansignificantlydifferent(尸0．05)． 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响4讨论4．1代用花粉蛋白水平影响其取食量及蛋白质摄入量蜜蜂的生长发育需要摄取大量的蛋白质，本试验中，其蛋白质的来源则为人工配制的蛋白水平分别为15％、25％和35％的代用花粉。试验数据显示，随着代用花粉蛋白水平的升高，蜜蜂对其取食量降低。这可能有两方面原因：首先，三组代用花粉的含糖量不同(LP：38．77％，MP：25．35％，HP：16．37％)，蜜蜂易取食含糖量较高的中、低蛋白组(AsencotandLensky,1988)。其次，中蛋白水平组的代用花粉取食量虽然明显高于高蛋白水平组，但最终中蛋白水平组摄入的总蛋白量与高蛋白组相当，这表明蜜蜂有通过增加低蛋白水平代用花粉取食量来弥补蛋白质摄入不足的现象(KleinschmidtandKondos，1978；PemalandCurfie，2001)。虽然，低蛋白水平组具有显著高的代用花粉取食量，但其总蛋白取食量却显著低于中、高蛋白组。这可能正是该处理组各生长发育阶段体重、体蛋白含量以及羽化后工蜂寿命均差于中、高蛋白组的原因，正如Somerville(2005)提出的，对于一个蜂群来说，最主要的不是其饲料的取食量而是总蛋白的摄入量。4．2代用花粉蛋白水平影响意大利蜜蜂幼虫重、蛹重和成蜂体重蜜蜂是全变态昆虫，个体发育要经过卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段，在此过程中蜜蜂个体的体重发生着很大的变化。与其他昆虫一样，蜜蜂的幼虫期摄取的食物主要用于体内细胞地快速生长，是快速生长期(王荫长，2004)，从4日龄幼虫期到6日龄幼虫期，幼虫的体重呈显著增加的趋势，这与余林生和孟祥金(2001)的研究结果一致。‘从3日龄蛹期到9日龄蛹期，体重基本保持不变，这可能有两方面原因：第一，从6日龄幼虫后期开始封盖进入蛹期，环境相对封闭且蜂蛹即停止进食，因此体重变化较小；第二，．与其他昆虫的蛹期类似，蜜蜂进入蛹期之后，生长代谢活动减弱，消耗能量较少，因此体重变化较小。当新蜂开始羽化时，体重降到最低，这可能是由于新蜂在咬开巢房时需要消耗大量的能量；再者羽化出房后，蜂体水分散失且蛹期体内的废物排出(王荫长，2004)，因此体重明显下降。新蜂羽化出房后直至第12天，体重呈现为先上升后下降的变化规律，这可能与工蜂体内肠道中存有代用花粉的多少有很大的关系。工蜂羽化不久 山东农业大学硕士学位论文开始吃花粉，6日龄时消耗的花粉达到最高点，主要用于咽下腺、脂肪体以及体内器官发育，到10．14日龄时，在结束了哺育职能转移到野外职能以后，它们需要的蛋白质饲料急剧减少，主要的食物组成变成了碳水化合物(Maurizio，1954)。羽化出房后的蜜蜂直至lO日龄左右才开始离开蜂巢试飞并进行排泄，在此之前取食的代用花粉完全贮存于体内。可见，10日龄之前的体重与取食的代用花粉量有极大的关系。代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂幼虫期、蛹期以及成蜂期的体重均有影响，且显著影响了5日龄的幼虫、9日龄蛹、初生蜂和12日工蜂，低蛋白水平组的各发育阶段体重均最低。蛋白质摄入量不足严重地影响了蜜蜂幼虫的生长发育(Jay,1963)，此种营养不良现象将导致工蜂个体偏小(Jay,1964；Dalyeta1．，1995)，低蛋白组即使有着最高的代用花粉取食量，但摄入的总蛋白量明显低于其他两组，致使其少量的蛋白质供用不能满足蜜蜂正常体重增长的需要，因此蜜蜂个体偏小，与前人试验结果一致(Ribeiro，1994；Nguyen，1999；RoulstonandCane，2002)。4．3代用花粉蛋白水平影响意大利蜜蜂各发育阶段体内总蛋白含量以及哺育蜂血淋巴蛋白含量和咽下腺蛋白含量意大利蜜蜂不同发育阶段体内总蛋白含量也呈现出一定的变化规律：蜜蜂的幼虫期是营养物质不断积累的过程(王荫长，2004)，因此4日龄幼虫期至6日龄幼虫期，幼虫体蛋白水平呈现逐渐增加的趋势。进入蛹期之后，蜂蛹已停止了蛋白质的摄入，然而新表皮的产生和旧表皮的脱落都将消耗或损失体内的蛋白质(Wigglesworth，1933)，最终使得蜂蛹体蛋白含量下降。随着初生蜂羽化出房后对代用花粉的取食，即有了新的蛋白质供用，因此体内的蛋白水平也随之升高。蜜蜂幼虫期的前3天的蛋白质供应是通过哺育蜂饲喂的蜂王浆，3天之后的蛋白质则来自于蜂粮，无论是何种途径，其蛋白质的最终来源均为饲喂的代用花粉。蜜蜂摄取了代用花粉中的蛋白质，消化并吸收用于生长发育的需要。通过测定蜜蜂体内的蛋白质含量可有有效地用于评价蛋白质饲料的品质(Cremonezeta1．，1998；DeJongeta1．，2009)，且很多研究表明蜜蜂取食低蛋白含量的饲料将降低其体蛋白含量(SchmicklandCrailsheim，2001)或体内含氮(DuffandFurgala，1986)。与此一致，在幼虫期对代用花粉蛋白质的供给量要求较高，蛋白水平须高于25％才有利于幼虫体内蛋白质的沉积，这可能是由于幼虫期需要大量的蛋白质，以为成虫积累营养和建造器官奠定基础(王荫长， 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响2004)；低蛋白代用花粉组蜜蜂无论在蛹期还是羽化后，体蛋白含量均低于其他两组，．可见，代用花粉蛋白水平为15％时蜂蛹和工蜂的体蛋白含量下降。蜜蜂从羽化出房后即开始取食代用花粉，摄取的蛋白质被消化分解后，主要用于贮存于血淋巴中(Hatfield，1988；FishmanandZlotkin，1984)或是用于咽下腺的发育(Huangeta1．，1989；Mohammedieta1．，1996)。蜜蜂的血淋巴有运输营养物质的作用，其中含有大量的贮存蛋白(王荫长，2004)和运输至机体各处用于生长代谢的需要。工蜂的咽下腺是分泌蜂王浆的主要部位，其发育情况与食物蛋白质的供用息息相关。因此，通过测定工蜂的血淋巴蛋白含量和咽下腺蛋白含量，可以反映代用花粉的蛋白水平(CremonezP，a1．，1998；PemalandCurrie，2000；Maloneela1．，2004)。由于总蛋白摄入量最低，因此低蛋白代用花粉组的4日龄、7日龄还是12日龄工蜂均表现出低于其他两组的血淋巴蛋白含量和咽下腺蛋白含量。总体来看，从工蜂羽化后的第4天到第12天，咽下腺蛋白含量呈现由高到低的变化规律，而血淋巴蛋白含量则是由低到高的变化规律，这也与前人的许多研究相吻合(Gregory,2006)。这可能是与工蜂咽下腺的发育相关，工蜂羽化后第3天咽下腺开始迅速发育(CrailsheimandStolberg，1989)，到第11天左右开始衰退(RobertandChristine，2001)，因此在4日龄和7日龄时，摄取的蛋白质主要用于咽下腺的发育，而12目龄时，咽下腺发育退化，大部分蛋白质开始贮存于血淋巴，因此血淋巴含量升高。目前有研究表明，昆虫体内的营养在特定时期有再分配的现象(FellousandLazzaro，2010)，但本试验还需进一步试验证明是否是该原因影响工蜂血淋巴蛋白含量和咽下腺蛋白含量的变化。4．4代用花粉蛋白水平影响意大利蜜蜂体内proPO基因表达在蜜蜂体内，酚氧化酶参与其黑色素的形成，并在其免疫防御反应中起着重要的作用。酚氧化酶通常以无活性的酚氧化酶原(proPO)形式存在于蜜蜂的血淋巴和表皮中，可被特定的蛋白酶激活。Lourengo等(2005)研究证明蜜蜂体内的proPO基因在羽化后的工蜂体内和日龄较大的蛹体内的表达量较高，而在幼虫体内或是日龄较小的蛹体内的表达量低，从而证明proPO基因在羽化后工蜂的外骨骼黑化过程中起着重要的作用。因此本试验选取了6日龄蛹之后的蜜蜂进行proPO基因表达量的研究且得到了一致的结果。6日龄蛹体内的proPO转录水平仍然较低，到了工蜂羽化出房时，体内的proPO原基因表达量明显升高，且在12日龄工蜂体内的表达量仍处于较高的水平。在蜜蜂蛹期的后期到羽化后的一段时间，外表皮的颜色由透明柔软逐渐硬化和黑化，最终形成坚硬34 山东农业大学硕士学位论文的外表皮，这一过程要求黑色素的参与，且Lourenqo等(2005)已证明此时血淋巴中的PO含量较高，因此在此过程中proPO基因大量的表达用于供用大量的黑色素。Lee等(2008)以蝴蝶幼虫为试验材料研究饲料蛋白水平对其发育过程中外表皮黑化的影响，研究发现氮元素的供应与其表皮黑化密切相关，且取食高蛋白含量的幼虫，表皮颜色较深。Alaux等(2010)以意大利蜜蜂为研究对象，研究了饲料蛋白水平对蜜蜂体内PO活性的影响，结果发现，饲喂低蛋白质饲料组的蜜蜂体内的PO活性较低。本试验中，在6日龄蛹和12日龄工蜂体内的proPO基因表达量未表现出受代用花粉蛋白水平的影响，如之前分析的在6日龄蛹期，蜂蛹体内的还没开始大量的合成黑色素，因此proPO基因的表达量均处于较低的水平，差异性较小：刚羽化出房的工蜂表皮仍然较柔软颜色较浅，此时又是大量摄取代用花粉的时期，因此，代用花粉中蛋白水平在此时的影响较大，flproPD基因大量表达以产生更多的黑色素用于外骨骼的黑化；12日龄工蜂体内的proP喊达仍处在较高的水平，但由于此时外骨骼已基本硬化、黑化完全，产生的较多的PO可能是用于机体本身的免疫防御(庞秋香等，2008)，12日龄的工蜂已开始转入外勤采集，外界环境的影响增加，需要增强其机体的免疫防御反应，且高蛋白水平的代用花粉组具有相对较高的proPO基因表达量。4．5幼虫期蛋白质营养通过影响意大利蜜蜂各发育阶段体内抗氧化酶基因表达从而影响其羽化后的存活率。●Schmidt等(1987)通过研究几种不同花粉对蜜蜂寿命的影响发现，蜜蜂的寿命与其取食的花粉的蛋白质含量以及总蛋白摄入量显著相关。在本试验中，三组工蜂在幼虫期的蛋白质营养不同而羽化后均饲喂相同的食物。结果发现幼虫期的蛋白质营养影响了羽化后工蜂的存活率。低蛋白水平代用花粉组工蜂的存活率均显著低于其他两组，且取食低蛋白水平代用花粉组的蜜蜂的总蛋白摄入量也显著低于其他两组，可见低蛋白代用花粉限制了工蜂的寿命。目前，对于蛋白水平影响工蜂寿命机理的研究较少。氧化应激理论(Harman．1956)认为过多的氧化损伤是导致生物有机体寿命缩短的主要原因。与一开始的预测结果相似，幼虫期饲喂中、高蛋白水平代用花粉的蜜蜂，在5日龄幼虫期，6日龄蛹期和刚羽化出房时的Cu／ZnSod，MnSod，Cat和Gst-I的表达量均高于(有时差异不显著)饲喂低蛋白代用花粉组。总的来说，对于饲喂低蛋白代用花粉的蜜蜂个体的抗氧化酶基因表 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响达量在各个时期均较低。目前，对于饲料蛋白水平影响Cw"ZnSod，MnSod，Cat和Gst-1表达量的机理还不是很清楚，可能是较高蛋白水平代用花粉含有的某些营养物质可以促进该抗氧化酶基因的表达(Alauxeta1．，2011)。大豆异黄酮是一种抗氧化剂，并且可以有效地促进抗氧化酶MnSOD(Tschuggueleta1．，2001)和GST(Montanoela1．，2004)，低蛋白代用花粉组的大豆异黄酮含量较低因此下调了该四种抗氧化酶基因的表达。单独地分析每一种抗氧化酶基因，可以发现该四种基因均具有蛹期表达量相对较低的表达特异性(肖培新等，2010)，这可能是由于蜜蜂的蛹期和其他昆虫的蛹期一样，活动量较小，从而产生较少的ROS(Harrison，1986；YoungandRobinson，1983)，需要的抗氧化酶较少，抗氧化酶基因处于较低的表达水平。4．6大田状态下花粉或代用花粉的取食量、总蛋白摄入量及其蛋白质的消化程度由试验群已经得出，对于一个蜂群来说最重要的不是饲料的总取食量而是总蛋白摄入量。同样在本试验中对花粉和代用花粉的取食量进行了比较，发现花粉的取食量显著高于任何一代用花粉组(PemalandCurrie，2000；DeGrandi—Hoffmaneta1．，2010))，这可能是由于花粉中含有某些脂类物质(Dobson，1988)使其具有较好的适口性，更利于吸引蜜蜂采食。同时我们依然比较了各处理组的总饲料蛋白质摄入量，花粉组的总蛋白摄入量显著高于PS20组和PS25组，但是从之后测定指标的结果中发现，饲喂花粉组的蜜蜂的各个指标均与PS20组和PS25组差异不显著，且数值上与PS20组相当，稍差与PS25组，因此我们考虑可能是因为花粉外包被着坚硬的花粉壁(Piffanelliela1．，1998)，其中的蛋白质在短时间内不易被蜜蜂消化利用。蜜蜂中肠中存在着蛋白质水解酶用于对饲料中的蛋白质进行消化(Winston，1987；Maloneeta1．，1998，2000)，因此我们测定了工蜂中肠中的蛋白酶活性希望能证明之前的推断。对饲喂代用花粉组工蜂中肠中蛋白酶活性的比较发现，随着代用花粉蛋白摄入量的增加，蛋白酶活性显著的线性增加。若是如此，花粉组的蛋白质摄入量显著高于PS20组和PS25组，则需要更高的蛋白酶活性用于消化摄入的多量的蛋白质，然而，饲喂花粉组的工蜂中肠中的蛋白酶活性却与PS20组和PS25组相当，甚至数值上略低，可见饲喂花粉组工蜂中肠中仅有少量的饲料蛋白质需要消化。Moritz和Crailsheim(1987)指出由 山东农业大学硕士学位论文于花粉含有坚硬的花粉壁，因此中肠中含有的可用于被消化的蛋白质很少。4．7大田状态下饲料蛋白水平影响蜂群群势蜜蜂是典型的社会性昆虫，工蜂占蜂群数量的绝大多数，负责采集花粉、花蜜，是蜂群食物的提供者，因此群势是生产上衡量蜂群强弱的重要指标，并且定期对蜜蜂进行蜂群势测定，可用于估计蜜蜂的营养需要(李成成等，2010b)。从花粉或代用花粉对蜂群群势的影响来看，试验开始前调整群势一致，所有处理组群势均表现出一致的变化趋势，即先出现小程度的升高，后开始下降。蜂群群势呈现先上升后持续下降的原因可能是由于试验期开始于初秋结束于秋末。夏末秋初时蜂群都有较强的群势投入零星蜜源的采集生产，做到繁殖、采蜜双丰收(袁德雨，2007)。新蜂羽化率仍高于老蜂死亡率，因此第一次蜂群群势升高，且PS30组显著高于PSl5组和PS20组，可见增加代用花粉的蛋白水平，将会有更多的蛋白用于新蜂机体组织器官的生长发育，可有效地增强蜂群群势；到了后两次，气温下降，盛花期己过，r●之前的采集蜂大量死亡，蜂群繁殖能力降低，死亡率高于羽化率，因此蜂群群势开始下降，且越降越低，逐渐进入越冬期。秋天蜜蜂群势变衰是蜂群发展的必然，但也不能过弱，以致不能形成覆盖大部分箱体的蜂团，通常越冬期间总会有不少蜜蜂死亡，蜂团大#：一些才能确保越冬安全(KeithandDdaplane，1995)。后两次群势测定显示，各处理组蜂群群势均下降，最终以蛋白水平15％组的群势最低，30％组最高，但组间差异不显著。从整个试验期蜂群群势的变化情况来看，代用花粉蛋白水平15％．35％，未对蜂群群势产生显著的影响，这也与DeGrandi．Hoffman等(2008)经过5个月的研究结果一致，该结果可能有2个方面的原因：第一，试验周期较短，在短时间内各组的蜂群群势未来得及表现出显著的差异，但目前还未见蛋白水平对群势长期影响的报道：第二，满足蜜蜂蜂群群势发展的蛋白质需要水平范围较广，本试验所涉及的范围(15％．35％)相对较窄，未能发现显著变化。对于以上两个方面分析需要进一步试验证明，本试验所得结果可以表明，适宜地增加代用花粉蛋白水平有助于减缓蜂群群势的下降，为蜂群越冬及来年早春繁殖打下基础。4．8大田状态下饲料白水平影响蜂卯孵化率和幼虫化蛹率●蜜蜂是全变态昆虫，个体发育要经过卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段。蜜蜂的生长发37 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响育需要蛋白质的供用。蜜蜂组织器官的细胞通过新陈代谢进行更新与修补，要完成这一过程，就必须从饲料中或其它组织中获取新的蛋白质，作为更新与修补组织器官的原料。蜜蜂和其它动物一样，不能制造全部氨基酸，大都从食物中摄取蛋白质，用于蜜蜂幼虫发育所需要的较多的亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等(袁德雨，2007)。．通常，蜂卵在产下后72h孵化为幼虫，再经过120h进入封盖子期。蜂卵发育为幼虫的过程中需要大量的蛋白质供用，用于幼虫表皮的生成和生长；另外蜜蜂的幼虫期是个体的快速增长期(吴静，李建科，2010)，需要大量的蛋白质用于个体的增长，而且幼虫脱皮时，内表皮层中的蛋白质可转移入皮层细胞，用作分泌新表皮(袁德雨，2007)，也需要充足的蛋白质。代用花粉蛋白水平为35％时，最有利于蜜蜂的生长发育，代用花粉水平为15％时，蜜蜂的生长发育受阻。只有当蛋白水平达到20％或以上时(花粉组的蛋白水平为23％也包括在内)，处理问蜂卵孵化率和幼虫化蛹率才没有显著差异，这也正符合Somerville(2000)的观点，蛋白含量低于20％的花粉不能满足蜂群繁殖的需要．。另外，随着代用花粉蛋白水平的升高，蜂卵孵化率和幼虫化蛹率均呈增大的趋势，生产上适当增加代用花粉蛋白水平，则可更大地满足蜜蜂发育的需要，从而提高蜂卵的孵化率与幼虫的化蛹率。本试验由于是秋季进行的，蜂群中还没有存蜜，致使大量幼虫不能孵化(任付珍，2008)，使蜂卵的孵化率相对较低。4．9大田状态下饲料蛋白水平影响4日龄幼虫和初生蜂的体重、体蛋白含量及抗氧化能力．由试验群已经得出代用花粉的蛋白水平可以显著影响到5日龄幼虫的体重和体蛋白含量，且4日龄幼虫期至5日龄幼虫期为体重的快速增长期，因此取生产群中4．5日龄阶段幼虫进行大田状态下的研究。当代用花粉的蛋白水平为30％时，幼虫体重和体蛋白含量均处于最高水平，而蛋白水平15％组的幼虫个体最小且蛋白水平15％组、20％组和花粉组的体蛋白含量最低，可见当代用花粉蛋白水平达到25％时，才能更好地满足幼虫正常生长发育的需要。试验群中已经得出代用花粉的蛋白水平可以显著影响到初生蜂的体重和体蛋白含量，且很多研究表明工蜂的初生重是反映饲料蛋白水平的最快捷方法(Cremonezeta1．，1998；DeJongeta1．，2009)，因此依然选取初生蜂进行大田状态下的研究。当代用花粉的蛋白水平为30％时，初生蜂体重和体蛋白含量均处于最高水平，而蛋白水平15％组的初生蜂个体和体蛋白含量均最低，可见当代用花粉蛋白水平达到20％38 山东农业大学硕．上学位论文时，才能更好地满足初生蜂正常生长发育的需要。为了更直接地反映饲料蛋白水平对意大利蜜蜂抗氧化能力的影响，在试验群对蜂体内抗氧化酶基因表达的影响基础上又进行了关于幼虫和初生蜂体内抗氧化酶活性的测定。在正常生理情况下，机体内可产生少量氧自由基，但能被体内抗氧化酶或抗氧化剂迅速清除(Weieta1．，1996；Kondoheta1．，2003)。SOD能特异性捕捉和清除超氧阴离子等自由基(Aluletal．，2003)，通过氢原子供体的作用阻断或终止自由基连锁反应链，从而阻止和抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应的病理性加剧，起到抗氧化作用；MDA是由自由基引发的脂质过氧化作用的最终产物之一(谷春梅等，2010)，其含量可以间接反映机体的脂质过氧化水平。机体不能及时清除过多的自由基，导致脂质过氧化水平升高，MDA生成就会增多(翁锡全等，2007)。本试验结果显示，蜜蜂机体的抗氧化能力受到代用花粉蛋白水平的影响。提高蛋白水平，蜜蜂幼虫和初生蜂体内的T-SOD活性未受到影响；但虫体内MDA含量出现显著变化，即蛋白水平15％、20％组幼虫的MDA含量均显著高于25％、30％和35％组，可见代用花粉蛋白水平低于25％时严重影响了幼虫的抗氧化能力；对于初生蜂，代用花粉蛋白水平15％组初生蜂体内MDA含量均显著高于25％、30％和35％组，可见代用花粉蛋白水平低于20％时对初生蜂的抗氧化能力有不利影响。这可能是由于无论幼虫还是初生蜂采食了高蛋白水平的饲料后，即会有更多的蛋白质用于机体抗氧化酶系统和抗氧化非酶系统的组成，虽然处理组间SOD活性未表现出显著地差异，但可能更多的蛋白质用于了其它抗氧化酶的合成。含硫氨基酸作为GSH的前体起作用，如S．AA摄入充足则会合成大量的GSH，继而提高GPX的活力(HunterandGrimble，1994)，另外，张佃志和方允中(1990)在体外实验发现色氨酸有较强的抗氧化能力。因此，多种抗氧化酶的共同作用，降低了MDA含量，从而达到调节机体的氧化还原反应的目的。39 代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂各发育阶段生长发育状况的影响5总体结论及创新点5．1总体结论5．1．1代花用粉的蛋白水平影响意大利蜜蜂各发育阶段的体重、体蛋白含量及初生蜂体内的proPO基因的表达，且低蛋白水平(15％)代用花粉组蜜蜂的生长发育状况最差。5．1．2意大利蜜蜂幼虫期取食了蛋白水平较低(15％)的代用花粉，其各发育阶段蜂体内的Cu／ZnSod，MnSod，Cat和Gst—J4种主要抗氧化酶基因的表达均低于中、高蛋白水平代用花粉组，羽化后的工蜂存活率均显著下降，从一定程度上说明了“氧化胁迫理论"与寿命的相关性。5．1．3大田状态下(生产群状态)，意大利蜜蜂幼虫期对代用花粉的蛋白质含量要求较高，当代用花粉蛋白水平不足25％时严重影响了幼虫的生长发育；代用花粉蛋白水平为30％．35％时，该测定指标均最佳；羽化后工蜂对代用花粉的蛋白质含量要求较低，代用花粉蛋白水平为20％以上时即可满足基本的生长发育，且当蛋白水平为30％时最有利。5．2创新点5．2．1．本试验较为系统地研究了高、低蛋白水平对意大利蜜蜂幼虫期、蛹期和成蜂期各发育阶段体重和体蛋白含量的影响，并在此基础上进行大田试验，将代用花粉与天然花粉进行比较，基本得出了大田状态下意大利蜜蜂在幼虫期和羽化后对代用花粉的蛋白质需求范围，且得出幼虫期要求稍高，为养蜂业提供了理论支持。．5．2．2在对羽化后工蜂寿命的研究上，进行了单独的幼虫期蛋白质营养对羽化后工蜂寿命的影响，并联系“氧化胁迫理论”研究其影响机理。5．3存在不足及进一步解决的问题5．3．1本研究在进行大田试验过程中，设定的蛋白质梯度偏少，不足以准确地采用曲线拟合找出最佳的蛋白质供给量，在以后的试验中有必要增加蛋白质梯度。再者，过高的蛋白水平对工蜂寿命有不利的影响，希望今后的研究能得到该阈值。 山东农业大学硕士学位论文5．3．2本研究得到了意大利蜜蜂幼虫期和成蜂期的蛋白质供给量，但对氨基酸种类．、比例等缺乏深入的研究。5．3．3随着分子生物学研究方法的不断进步，昆虫体内各种信号通路的研究已迅速展开，希望能更深层的研究蛋白水平对抗氧化酶基因表达的影响机理。4l 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代用花粉蛋白水平对意大利蜜蜂备发育阶段生长发育状况的影响8攻读学位期间发表论文情况1)Li，C．，Xu，B．，Wang，Y．，Feng，Q．，Yang，W．Effectsofdietarycrudeproteinlevelsondevelopment，antioxidantstatus，andtotalmidgutproteaseactivityofhoneybee(Apismelliferaligustica)．Apidologie，2012，publishonline．DOI：10．1007／s13592—012-0126—0，ImpactFactor：2．23．第一作者2)李成成，胥保华，冯倩倩，杨维仁．意大利蜜蜂生长发育适宜蛋白供给水平及其对幼虫抗氧化活性的影响【J】．中国农业科学，2011,44(22)：4714-4720．第一作者3)Li，C．，Xu，B．，Wang，Y．，Feng，Q．，Yang，W．Larvalfoodqualityaffectsadultlongevityandrelativeantioxidantgeneexpression(ApismelliferaL．)．JournalofInsectPhysiology．Revised．第一作者4)李成成，胥保华，冯倩倩，杨维仁．蜜蜂的营养需要及研究方法【J】．中国蜂业，2010，62(2)：14—15．第一作者5)李成成，胥保华，肖培新，冯倩倩，杨维仁．我国蜜蜂饲料开发与利用现状分析【J】．蜜蜂杂志，2010，(1)：6-8．第一作者6)冯倩倩，胥保华，李成成，杨维仁．维生素A对意大利蜜蜂群势、封盖子量及抗氧化性的影响[J】．动物营养学报，201l，23(6)：971·975．第三作者获得奖励2010．2011学年度，硕士生中期考核专业第2名，获得“一等奖学金”。2012年，获得山东农业大学“优秀毕业生"。 山东农业大学硕士学位论文9基金资助本研究由国家蜂产业技术体系建设专项资金(CARS一45)和公益性行业(农业)科研专项“饲料营养价值与畜禽饲养标准研究与应用(200903006)”资助。