实验十五固定化酵母细胞发酵蜂蜜酒 6页

实验十五固定化酵母细胞发酵蜂蜜酒一、实验目的1.学习固定化酵母细胞的方法。2.掌握蔗糖酶活力的检测方法。二、实验原理固相酶又称为固定化酶，是通过物理及化学的处理方法，使水溶性酶和固态的水不溶性支持物(或载体)相结合而制备的。通过酶的固定化可以将酶转变成不溶物同时仍保留酶的活力，在催化反应中具有诸多水溶性酶所不具备的优点。常用的酶的固定化方法主要有：1.物理吸附法；2.载体偶联法(键结合法)；3.交联法；4.包埋法；就其应用技术而言，又分为固定化酶和固定化细胞二种。相对于水溶性酶，固定化酶的优点主要是机械强度增加，稳定性提高，可回收反复使用。三、仪器和试剂仪器试管、1毫升吸管4支、水浴锅、精密酒精计：分度值为0.1%vol、全玻璃蒸馏器：500mL、高精度恒温水浴：20.0±0.1℃。试剂1.海藻酸钠若干克；2.K号酵母液；3.10％蔗糖液：称取10克蔗糖用水定容至100毫升；4.斐林试剂。四、操作步骤l、称取海藻酸钠1克加入100毫升水中，微火加热溶解后冷却到30℃左右，将预先准备好的3克卡氏酵母(或K号酵母的培养液30毫升)的悬液加入混匀。然后倒入下边装有胶管与止血夹的漏斗中，让其慢慢滴入4％氯化钙溶液中，制成直径2－3毫米的球形固定化酵母。将此固定化酵母装入柱中，从柱上端加入10％的蜂蜜溶液，控制一定的流速，且注意室温要在25~28℃。2、24小时后测定流出液中的还原糖含量和酒精度。（1） 葡萄糖测定   空白液测定：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入150ml三角瓶中，加空白液5ml，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液在1ml以内，加热至沸，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min内完成。糖化液测定：准确吸取5ml糖化液代替5ml空白液，其余操作同上。 （2）酒精度的测定A蒸馏在20℃±5℃的工作条件下，进行该试验。用一洁净、干燥的100mL容量瓶准确量取100.0mL样品（液温20℃）于500mL蒸馏瓶中，用50mL水分三次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，再加几颗玻璃珠，连接冷凝器，以取样用的原容量瓶作接收器（外加冰浴）。开启冷却水，缓慢加热蒸馏。收集馏出液接近刻度，取下容量瓶，盖塞。于20℃水浴中保温30min，补加水至刻度，混匀，备用。B酒精度的测定将蒸馏液（注入洁净、干燥的量筒中，静置数分钟，待酒中气泡消失后，放入洁净、擦干的酒精计，再轻轻按一下，不应接触（文章来源：华夏酒报·中国酒业新闻网）量筒壁，同时插入温度计，平衡约5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查表，换算为20℃时样品的酒精度（所得结果应表示至一位小数）。五、思考题1.固定化细胞的方法有哪些？2.细胞固定化时选择哪一时期的细胞较好？附录一酵母原生质体融合试验用培养基(包括酵母单倍体原生质体融合及电场诱导酵母原生质体融合）1.完全培养基葡萄糖2g蛋白胨2g酵母膏1g蒸馏水100mLpH7.2100Pa灭菌20min。如需配成固体完全培养基时，则需在上述液体培养基中加入2％琼脂。2.基本培养基(用于单倍体酵母原生质体融合试验)(1)葡萄糖柠檬酸钠培养基葡萄糖0.5g(NH4)2SO40.2g柠檬酸钠0.1gMgSO4·7H2O0.02gK2HPO40.4gKH2PO40.6g纯化琼脂2g 蒸馏水100mLpH6.0100Pa灭菌20min。(2)YNB培养基葡萄糖2g酵母氨基(YNB)*0.67mL琼脂(经纯化处理)2.0g蒸馏水100mLpH6.0100Pa灭菌20min。3.再生完全培养基在固体完全培养基中加入0.5mol/L蔗糖（或0.8mol/L甘露醇或1mol/L山梨醇）。4.基本培养基（用于电场诱导酵母原生质体融合试验）葡萄糖2g酵母氨基(YNB)*0.67mL琼脂(经纯化处理)2.0g蒸馏水100mLpH6.0100Pa灭菌20min。*YNB培养基由以下A、B、C三种溶液混合而成，取A1mL，B1mL，C10mL，无离子水1000mL，pH6.5。A液维生素混合液VB11000mg，箊酸400mg，吡哆醇400mg，生物素20mg，泛酸钙2000mg，VB2200mg，肌醇10000mg，对氨基苯甲酸200mg，无离子水l000mL。B液微量元素混合液H3BO4500mg，MnSO4·7H2O200mg，ZnSO4·7H2O400mg，CuSO4·5H2O40mg，FeCl3·6H20100mg，Na2MnO4200mg，无离子水1000mL。C液其他无机盐KI0.1mg，CaCl2·2H2O0.1g，K2HPO4附录二白酒勾兑常用计算基本概念1.“容量%”即白酒（酒精）中纯酒精占容量百分数，亦即统称的酒度。例如：60度白酒，即100份（升或毫升）这种白酒内，含有60份纯酒精，如以计算式表示：则：容量%=×100%2.“密度”系一定体积（升或毫升）的白酒（酒精）所含之质量（克）。例如：60V/V白酒在20OC时的密度为0.90916g/ml，即说明60V/V白酒1ml其质量为0.90916g，如以计算式表示： 则：密度=×100%3.“重量”为各该不同酒度（容量%）的白酒（酒精）内，纯酒精的重量与总质量之比。例如：50度（容量%）的白酒100斤，其中纯酒精的重量为42.4252进，如以质量百分比表示，就是42.4252%（重量）。如以计算式表示：则：重量%=×100%4.折算率：需根据“酒精容量%、密度、重量%，对照表”有关数值所推算，其计算公式为：折算率=×100%例：原酒的酒度为75.8度，标准度为50度，求其折算率。根据“酒精容量%、密度、重量%，对照表”查得75.8度的酒精重量%，为68.7134，50度的酒精重量%为42.4252，按上式公式计算：折算率=×100%=161.9636所以，75.8度的原酒折算到50度标准量时的折算率为161.9636%。附录三一吨95％，53%，60%vol酒降度不同酒度加水表一吨95％酒精兑制不同酒度酒的加水数单位：kg酒度30o31o32o33o34o35o36o37o38o39o40o41o密度0.962240.961000.959720.958390.957040.955630.954190.952710.951190.949640.948060.94644加水数2755.22629.42511.22400.12295.52196.62103.12014.61930.61850.81774.91702.5总量(kg）3755.23629.43511.23400.13295.53196.63103.13014.62930.62850.82774.92702.5酒度42o43o44o45o46o47o48o49o50o51o52o53o密度0.944790.943090.941340.939560.937750.935910.934040.932130.930190.928220.926210.92418加水数1633.61567.71504.71444.41386.71331.31278.21227.11178.11130.81085.31041.5总量2633.62567.72504.72444.42386.72331.32278.22227.12178.12130.82085.32041.5 酒度54o55o56o57o58o59o60o61o62o63o64o65o密度0.922120.920030.917900.915760.913580.911380.909160.906910.904630.902320.899990.89764加水数999.2958.4918.9880.9844.1808.5774.0740.7708.2676.8646.4616.8总量1999.21958.41918.91880.91844.11808.51774.01740.71708.21676.81646.41616.81000kg60℃酒降度加水表酒度％V／V303235362S40424548505253555658加水量(kg)11179798027496525644853782842281751511048240总重量(kg)21171979180217491652]5641485137812841228117511511104108210401000kg53℃酒降度加水表酒度％V/V3032353638404245485052加水量(kg)8397205665204363592901971166722总重量(kg)18391720156615201436135912901197111610671022附录四500克不同酒度酒的体积表酒度%vol体积ml酒度%vol体积ml1501．6302502．3663503．0944503．8095504．5106505．1887505．8428506．4889507．12010507．73811508．35712508．96313509．56514510．15715510．74116511．31517511．88618512．44719513．00520513．558 21514．12322514．69523515．27324515．86325516．46526517.06827517．68928518．31729518．96330519．62131520．23732520．98533521．70834522．44435523．21536524．00537524．81938525．65739526．51540527．39341528．29642529．21843530．17244531．15845532．16446533．19147534．23948535．30949536．40650537．52551538．66552539．83453541．02054542．22955543．46156544．72257545．99558547．29759548．61960549．95861551．32362552．71263554．12764555．56265557．01666558．49767559．99868561．51469563．06970564．627